KR101218086B1

KR101218086B1 - 양어사료 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101218086B1
Application number: KR1020090076476A
Authority: KR
Inventors: 이승완; 박대훈; 김나래; 유제숙
Original assignee: 이승완
Priority date: 2009-08-19
Filing date: 2009-08-19
Publication date: 2013-01-03
Also published as: KR20110018975A

Abstract

본 발명은 단백질원과, 지방원, 및 탄수화물원을 주 성분으로 한 양어사료 분말 96.5~99중량%에 무 알콜 수용성 프로폴리스1~3.5중량%을 첨가하되, 채집한 벌집에 물, C1 내지 C4 저급 알콜을 가하여 꿀과 프로폴리스를 분리하는 단계와, 상기 분리된 프로폴리스를 감압농축하여 프로폴리스 농축액을 수득하는 단계와, 상기 프로폴리스 농축액을 감압농축기를 이용하여 무 알콜 수용성으로 분리하는 단계와, 상기 무 알콜 수용성 프로폴리스1~3.5중량%을 단백질원과, 지방원, 및 탄수화물원을 주 성분으로 한 양어사료 분말 96.5~99중량%에 첨가하여 배합하는 단계와, 상기 배합된 사료를 1~3㎜ 크기로 압출 성형하는 단계, 및 상기 압출 성형된 사료를 자연건조 시키는 단계를 포함하는 양어사료 및 그 제조방법에 관한 것이다.

양어사료 및 그 제조방법, 프로폴리스(Propolis)

Description

양어사료 및 그 제조방법 {FEED FOR FISH CULTURE AND METHOD MAKING OF FEED FOR FISH CULTURE}

본 발명은 양어사료 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프로폴리스를 양어사료에 첨가하여 항균효과, 체중 증가, 체조성 변화, 면역증강과 내병원성 증가의 기능을 얻는 양어사료 및 그 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로, 가축이나 어류의 사료에는 성장을 촉진하고 질병을 예방하기 위해서 항생제를 첨가하고 있다.

하지만, 항생제가 첨가된 사료를 섭취한 가축과 어류를 사람이 섭취할 경우 인체에 항생제에 대한 내성이 생기는 문제점이 있었다.

따라서, 최근 화학제제가 아닌 친환경적인 양어 사료 첨가제에 대한 관심이 집중되고 있고, 양식 어류의 육질개선, 성장 촉진과 내병성을 향상시킴과 동시에 사료유실을 최소화하기 위한 첨가제의 필요성이 대두되고 있다.

상기한 종래 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 프로폴리스를 첨가하여 항균효과, 체중 증가, 체조성의 변화, 면역증강효과, 및 내병원성 증가 효과를 갖는 양어사료 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기한 종래 문제점을 해결하고 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 양어사료는 단백질원 70 ~ 75 중량%와, 지방원 8 ~ 10 중량%와, 탄수화물원 10 ~ 15 중량%, 및 비타민 또는 미네랄 4 ~ 6 중량%로 이루어지는 양어사료 분말 96.5~99중량%에 무 알콜 수용성 프로폴리스1~3.5중량%을 첨가하되, 상기 단백질원은 어분, 오징어 간분, 카제인 중 적어도 둘 이상을 사용하고, 상기 지방원은 어유, 대두유 중 적어도 어느 하나 이상을 사용하며, 상기 탄수화물원은 전분을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 양어사료 제조방법은 채집한 벌집에 물과 C1 내지 C4 저급 알콜을 벌집 중량의 2~10배로 첨가하여 꿀과 프로폴리스를 분리하는 단계와, 상기 분리된 프로폴리스를 35℃~55℃의 온도에서 감압농축하여 프로폴리스 농축액을 수득하는 단계와, 상기 프로폴리스 농축액을 감압농축기를 이용하여 무 알콜 수용성으로 분리하는 단계와, 상기 무 알콜 수용성 프로폴리스1~3.5중량%을 단백질원 70 ~ 75 중량%와, 지방원 8 ~ 10 중량%와, 탄수화물원 10 ~ 15 중량%, 및 비타민 또는 미네랄 4 ~ 6 중량%로 이루어지는 양어사료 분말 96.5~99중량%에 첨가하여 배합하는 단계와, 상기 배합된 사료를 1~3㎜ 크기로 압출 성형하는 단계, 및 상기 압출 성형된 사료를 직사광선을 피한 서늘한 곳에서 자연건조 시키는 단계로 이루어지되, 상기 양어사료 분말의 단백질원은 어분, 오징어 간분, 카제인 중 적어도 둘 이상을 사용하고, 지방원은 어유, 대두유 중 적어도 하나 이상을 사용하며, 탄수화물원은 전분을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 양어사료 제조방법에서, 상기 프로폴리스 농축액 수득단계는 30℃ 내지 100℃의 온도 범위 내에서 추출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 양어사료 제조방법에서, 상기 프로폴리스 농축액 수득단계는 1일 내지 5일 범위 내에서 추출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 양어사료 제조방법에서, 상기 프로폴리스 농축액 수득단계는 2회 내지 5회 반복하여 추출하는 것을 특징으로 한다.

삭제

상기한 바와 같이, 본 발명의 양어사료 및 그 제조방법은 프로폴리스를 유효성분으로 함유함으로써 항균, 체중 증가, 체조성의 변화, 면역증강, 및 내병원성을 향상시키는 효과가 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 양어사료 제조방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 사료 분말에 프로폴리스를 첨가하여 양어사료를 제조한다.

여기서, 상기 프로폴리스는 무 알콜 수용성인 것이 바람직하나 이에 한정되 지 않는다. 또한, 상기 양어사료는 뱀장어 양어용을 위한 것으로 사용되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 양어사료의 제조공정은 하기와 같은 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 양어사료는 단백질원과, 지방원, 및 탄수화물원을 주 성분으로 한 양어사료 분말 96.5~99중량%에 무 알콜 수용성 프로폴리스1~3.5중량%을 첨가한다.

여기서, 상기 양어사료 분말은 단백질원 70 ~ 75 중량%와, 지방원 8 ~ 10 중량%와, 탄수화물원 10 ~ 15 중량%, 및 비타민 또는 미네랄 4 ~ 6 중량%로 이루어진다.

이때, 상기 단백질원은 어분, 오징어 간분, 카제인 중 적어도 어느 하나 이상을 사용하고, 상기 지방원은 어유, 대두유 중 적어도 어느 하나 이상을 사용하며, 상기 탄수화물원은 전분을 사용한다.

도 1은 본 발명에 따른 양어사료 제조방법을 나타낸 순서도이다.

도 1에 도시한 바와 같이 본 발명에 따른 양어사료 제조방법은 채집한 벌집에 물, C1 내지 C4 저급 알콜을 가하여 꿀과 프로폴리스를 분리하는 단계(S110)와, 상기 분리된 프로폴리스를 감압농축하여 프로폴리스 농축액을 수득하는 단계(S120)와, 상기 프로폴리스 농축액을 감압농축기를 이용하여 무 알콜 수용성으로 분리하는 단계(S130)와, 상기 무 알콜 수용성 프로폴리스1~3.5중량%을 단백질원과, 지방원, 및 탄수화물원을 주 성분으로 한 양어사료 분말 96.5~99중량%에 첨가하여 배합 하는 단계(S140)와, 상기 배합된 사료를 1~3㎜ 크기로 압출 성형하는 단계(S150), 및 상기 압출 성형된 사료를 자연건조 시키는 단계(S160)를 포함한다.

여기에서, 상기 물, C1 내지 C4 저급 알콜은 상기 벌집 중량의 2~10배를 첨가하여 꿀과 프로폴리스를 분리하는 것이 바람직하며, 3배 내지 5배를 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 감압농축은 약 35℃ ~약 55℃의 온도에서 행해진다. 이때, 감압농축은 회전식 감압농축기(Rotary Vacuum Evaporator)을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

그리고, 상기 프로폴리스 농축액 수득단계는 30℃ 내지 100℃의 온도 범위 내에서 추출하는 것이 바람직하며, 50℃ 내지 80℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이때, 상기 프로폴리스 농축액 수득단계는 1일 내지 5일 범위 내에서 추출하는 것이 바람직하며, 2일 내지 3일인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 프로폴리스 농축액 수득단계는 2회 내지 5회 반복 추출하는 것이 바람직하며, 3회 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이때, 상기 단백질원은 어분, 오징어 간분, 카제인 중 적어도 어느 하나 이상을 사용하고, 상기 지방원은 어유, 대두유 중 적어도 어느 하나 이상을 사용하 며, 상기 탄수화물원은 전분을 사용한다.

또한, 상기 자연건조는 직사광선을 피한 서늘한 곳에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명은 프로폴리스를 첨가한 양어사료의 항균활성을 알아보기 위해 Edwardsiella tarda (KCTC 12267), Vibrio alginolyticus (KCTC 2472), Staphylococcus aureus subsp. aureus (KCTC 1621) 3종으로 한국생명공학연구원 유전자은행(KTCT)에서 분양 받아 실험에 사용하였으며, 각기 다른 배양액을 이용하여 incubator에서 하룻밤 배양하여 접종군주로 사용하였다(표 2 참조). 항균 활성측정은 Disc diffusion method (paper disc: Ø 6mm, Whatman)로 측정한 결과 Edwardsiella tarda (KCTC 12267)에 대해 가장 높고 Vibrio alginolyticus (KCTC 2472), Staphylococcus aureus subsp. aureus (KCTC 1621)의 순으로 나타났다 (표 3 참조).

또한, 본 발명은 프로폴리스를 첨가한 양어사료가 치어기 뱀장어 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 하기 표1에 표기된 성분을 함유한 양어사료를 이용하였다 (표 1 참조). 양어사료에 0%, 1.25%, 2.5%, 5%, 10%, 20%의 6가지 수준으로 설정하여 사료 내 각 수준별로 첨가한 결과 2.5% 첨가의 경우 유의하게 높았다 (표 4 참조).

또한, 본 발명은 프로폴리스를 첨가한 양어사료가 치어기 뱀장어의 체조성에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 하기 표1에 표기된 성분을 함유한 양어사료를 이용하였다 (표 1 참조). 양어사료에 0%, 1.25%, 2.5%, 5%, 10%, 20%의 6가지 수준 으로 설정하여 사료 내 각 수준별로 첨가한 결과 전어체의 수분 함량에 있어서, 사료 내 프로폴리스 10% 첨가군은 대조군을 포함한 나머지 모든 첨가구들에 비해 유의하게 높았고(P<0.05), 20% 첨가군은 10% 첨가군을 제외한 나머지 실험구들에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났다(P<0.05). 그리고, 프로폴리스 5% 첨가군은 1.25%와 2.5% 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면, 대조군과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(P>0.05)(표 5 참조).

또한, 본 발명은 프로폴리스를 첨가한 양어사료가 치어기 뱀장어의 면역기능에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 하기 표1에 표기된 성분을 함유한 양어사료를 이용하였다 (표 1 참조). 양어사료에 0%, 1.25%, 2.5%, 5%, 10%, 20%의 6가지 수준으로 설정하여 사료 내 각 수준별로 첨가한 결과 치어기 뱀장어의 혈장 내 헤마토크리트(Hematocrit)에 있어서, 사료 내 프로폴리스 0% ~ 5% 첨가군은 39.2% ~ 39.9%로 프로폴리스 10% 첨가군과 20% 첨가군의 25.6% ~ 30.8%에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 0% ~ 5% 첨가군들에 대한 유의한 차이는 없었다(P>0.05). 그리고, 사료 내 프로폴리스 10% 첨가군과 20% 첨가군간의 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다(P>0.05). 또한, 혈장 내 라이소자임 활성(Plasma lysozyme activity)에 있어서, 사료 내 프로폴리스 2.5%와 5% 첨가군의 활성(105.7~106.0 units/mL)은 0%, 1.25%, 10%, 20% 첨가군들의 활성(61.5~77.5 units/mL)에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 2.5%와 5% 첨가군에 대한 유의한 차이는 없었다(P>0.05). 그리고 사료 내 프로폴리스0%, 1.25%, 10%, 20% 첨가군간의 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다 (P>0.05). 체표면의 점액 라이소자임 활성(Mucos lysozyme activity)에 있어 서, 5% 첨가군의 활성(8.4 units/10 cm2)은 0%, 10% 그리고 20% 첨가군의 활성(4.9~6.0 units/10 cm2)에 비해 유의하게 높은 반면 (P<0.05), 1.25%와 2.5% 첨가군의 활성(7.1~7.4 units/10 cm2)과는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그리고, 사료 내 프로폴리스 2.5% 첨가군의 활성은 20% 첨가군의 활성에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 0%, 1.25%, 10% 첨가군과의 활성과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(P>0.05) (표 6 참조).

또한, 본 발명은 프로폴리스를 첨가한 양어사료가 치어기 뱀장어의 내병성에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 하기 표1에 표기된 성분을 함유한 양어사료를 이용하였다 (표 1 참조). 양어사료에 0%, 1.25%, 2.5%, 5%, 10%, 20%의 6가지 수준으로 설정하여 사료 내 각 수준별로 첨가하여 섭취한 치어기 뱀장어에 있어 Edwardsiella tarda FPC 799 균주로 복강 내 주사 후 각 실험구별 누적 생존율을 조사한 공격실험의 결과 프로폴리스 비첨가군인 대조군에서는 접종 1일 후부터 폐사 개체가 확인되어 68%의 누적 생존율을 나타내었고, 접종 2일 후 누적 생존율은 40.5%로 프로폴리스 1.25%, 2.5% 그리고 5% 첨가군에 비해 유의하게 낮은 반면(P<0.05), 고농도의 프로폴리스를 첨가한 10%와 20% 첨가군과 비교 시 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다(P>0.05). 또한, 접종 3일 후 22.5%, 4일 후 18%, 그리고 5일 후 13.6%의 누적 생존율을 나타내어 지속적으로 감소하는 경향을 나타내었고, 접종 10일 후까지 증감 없이 일정하게 유지되는 경향을 나타내었다. 누적 생존율에 있어서, 프로폴리스 1.25%, 2.5% 그리고 5%를 첨가한 군은 대조군과 고농도의 10%와 20%를 첨가한 군에 비해 접종 2일과 3일 후까지 유의하게 높은 것으로 나 타났으나(P<0.05), 접종 4일 이후부터 10일 이후까지는 유의한 차이 없이 높은 경향을 나타내었다(P>0.05).

그러므로, 본 발명의 프로폴리스를 첨가한 양어사료를 이용하여, 6가지 수준별로 프로폴리스를 첨가한 양어사료를 16주간 공급한 결과 성장과 체조성 및 면역반응에 영향을 미치는 것으로 나타났고, 성장실험 이후 공격실험을 통해 내병성 증대에도 효과가 있는 것으로 확인되어 프로폴리스가 양어사료의 첨가제로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 양어사료는 상기 프로폴리스 농축액에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 프로폴리스 농축액을 1 내지 3.5 중량 %로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 프로폴리스 농축액은 양어용 일반사료에 첨가도 가능하며 기타 단일형태로도 사용될 수 있다. 즉, 실제 양어사료 첨가물로 사용할 경우 액상의 형태로 일반사료로 첨가될 수 있으나 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 농축액에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등)를 섞어 조제된다. 또한, 단일 투여 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제(예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등)가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프로폴리스 농축액을 이용하여 양어사료 첨가물로 이 용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 항균활성 증가를 위한 사료첨가제로 이용하는 방법을 제공한다.

상기 항균활성 증가에 대한 대상균은 Edwardsiella tarda와 Vibrio alginolyticus, Staphylococcus aureus subsp. aureus 등을 대상으로 하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 뱀장어 치어의 성장 증가를 위한 양어사료로 이용하는 방법을 제공한다. 상기 뱀장어 치료의 성장 증가를 위한 양어사료로 이용되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 뱀장어의 면역기능 증가를 위한 양어사료로 이용하는 방법을 제공한다. 상기 뱀장어의 면역기능 증가를 위한 양어사료로 이용되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 면역기능 증가는 혈장 내 라이소자임 활성(Plasma lysozyme activity)의 증가와 체표면 점액 라이소자임 활성(Mucos lysozyme activity)의 증가를 통한 면역기능 증가 목적으로 이용되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 뱀장어의 내병성 증가를 위한 양어사료로 이용하는 방법을 제공한다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시 예, 실험 예 및 제조 예를 도면 또는 표를 통하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예, 실험 예 및 제조 예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시 예, 실험 예 및 제조 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

하기 표기된 알파벳 “P”는 프로폴리스(Propolis)를 나타낸다.

도 1은 본 발명에 따른 양어사료 제조방법을 나타낸 순서도이고, 도 2는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 체중의 증가를 나타내는 그래프이며, 도 3은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 일간성장율의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 4는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 단백질효율을 나타내는 그래프이며, 도 5는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 생존율의 변화를 나타내는 그래프이다.

먼저, 도 1 내지 도 5에 도시한 바와 같이 본 발명에 따른 실시 예, 실험 예 및 제조 예를 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1] 프로폴리스 첨가한 양어사료의 제조

양어사료 제조방법은 채집한 벌집에 물, C1 내지 C4 저급 알콜을 가하여 꿀과 프로폴리스를 분리하는 단계(S110)와, 상기 분리된 프로폴리스를 감압농축하여 프로폴리스 농축액을 수득하는 단계(S120)와, 상기 프로폴리스 농축액을 감압농축기를 이용하여 무 알콜 수용성으로 분리하는 단계(S130)와, 상기 무 알콜 수용성 프로폴리스1~3.5중량%을 단백질원과, 지방원, 및 탄수화물원을 주 성분으로 한 양어사료 분말 96.5~99중량%에 첨가하여 배합하는 단계(S140)와, 상기 배합된 사료를 1~3㎜ 크기로 압출 성형하는 단계(S150), 및 상기 압출 성형된 사료를 자연건조 시키는 단계(S160)로 이루어진다.

여기에서, 상기 물, C1 내지 C4 저급 알콜은 상기 벌집 중량의 2~10배를 첨가하여 꿀과 프로폴리스를 분리하는 것이 바람직하고, 3배 내지 5배를 첨가하여 분리하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 프로폴리스 농축액 수득단계는 2회 내지 5회 반복 추출하는 것이 바람직하며, 3번 내지 4번 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 자연건조는 직사광선을 피한 서늘한 곳에서 이루어지는 것이 바 람직하다.

[1-1] 프로폴리스의 에탄올 농축액의 제조

본 발명은 벌집을 브라질, 중국, 국내 등의 산지로부터 채집 혹은 구입하였다. 상기 프로폴리스(벌집)를 직사광선을 피한 서늘한 곳에서 완전히 건조한 후 시표 100 g을 에탄올 400㎖로 40℃, 500rpm로 8시간 방치하여 두 번 반복 추출하였다. 상기 농축액을 1㎛ (pore size)의 여과지로 여과한 후 상등액을 40 ℃ 감압 하에 농축시켜서 에탄올 농축액(20 g, 수득율: 20%)을 수득하였고 실험에 사용할 때까지 냉암소에 보관하였다.

[1-2] 수용성 프로폴리스의 제조

수용성 프로폴리스의 제조는 (주)서울 프로폴리스가 취득한 특허 “수용성 프로폴리스의 제조방법(국내, 등록번호 제0550165호, 출원일: 2006. 2. 1) 및 (일본, 등록번호 제 4113520호, 2008. 4. 18)”에 의해 제조되었으며 실험에 사용할 때까지 상온에 보관하였다.

[1-3] 실험어 및 사육설계

본 발명은 실험어를 전라남도에 소재한 P양만장으로부터 구입한 뱀장어 치어를 국립 군산대학교 수산과학연구소 내 실험실로 운반하여 500 L 수조에서 실험환경에 적응할 수 있도록 4주간 예비사육 후, 평균 어체중 7.7±0.22 g (mean±SD)인 치어기 뱀장어를 100 L 사각수조에 각 실험군별 30마리씩 3반복으로 무작위 배치하여 16주간 사육실험을 진행하였다. 각 실험 수조는 순환 여과식으로 유수량은 3~4 L/min으로 조절하였고, 에어레이션을 통해 충분한 산소를 공급하였으며, 평균수온 은 25±1℃를 유지하였다. 일일 사료공급량은 전 실험기간 동안 1일 2회 어체중의 3~4% (10:00,18:00)로 공급하였고, 사료공급 30~60분 후 남은 사료는 수거하여 -20℃에서 보관하였다.

[1-4] 실험사료 및 실험설계

본 발명은 하기의 [표 1]과 같은 조성의 실험사료를 사용하였다. 사료는 단백질원으로 어분, 오징어 간분 및 카제인을 사용하였고, 지방원으로는 어유와 대두유를 사용하였으며, 탄수화물원으로는 전분을 사용하여 단백질 약55%, 지방질 약15%, 회분 약30%, 및 가용에너지 약17.7 kJ/g로 조절하였다. 상기의 [실시예1]의 양어사료에 0%, 1.25%, 2.5%, 5%, 10%, 20%의 6가지 수준으로 설정하여 첨가하여 실험사료를 배합하였다. 모든 실험사료는 원료를 혼합하여 펠렛기로 압출 성형하여 제조하였고(diameter 1 mm), 자연건조 시킨 다음 밀봉하여 -20℃에서 보관하면서 실험어에 공급하였다.

[실험예 2] 양어용 프로폴리스 사료첨가제에 의한 항균효과 측정

[2-1] 균주의 구입 및 배양

본 발명은 한국생명공학연구원 유전자은행 (KTCT)로부터 Edwardsiella tarda (KCTC 12267), Vibrio alginolyticus (KCTC 2472), Staphylococcus aureus subsp. aureus (KCTC 1621) 등 3종을 분양 받아 하기 [표 2]의 생육조건에 따라 배양하였다.

[2-2] 프로폴리스의 항균 활성실험 (Antibacterial activity test)

본 발명은 상기 실험예 [2-1]에서 배양한 균주와 생육조건을 이용하여 배양기에서 하룻밤 배양하여 접종균주로 사용하였다. 항균 활성측정은 디스크확산법 (종이디스크: Ø 6mm, Whatman)로 측정하였다. 먼저 pour-plate method에 의해 45℃로 조제된 멸균배지 15mL에 전 배양액 0.1mL를 옮겨 잘 혼합시킨 후 지름이 8.8cm인 페트리디시에 넣고 굳혔다. 여기에 종이디스크를 올린 뒤 시료를 흡수시킨 다음 배양기에서 배양하여 종이디스크 주위의 억제영역의 크기로 항균 활성정도를 측정하였다.

그 결과, 하기 [표 3]에서 보는 바와 같이 수용성 프로폴리스에서 Edwardsiella tarda → Vibrio alginolyticus → Staphylococcus aureus의 순으로 항균활성을 나타내었다.

[실험예 3] 프로폴리스를 첨가한 양어사료의 체중증가 실험

본 발명은 16주간의 사육실험 종료 후, 어체 측정을 위해 실험어를 24시간 절식시킨 후 90% 에틸렌글라이콜 페닐에테르 (ethylene glycol phenyl ether, 200 ppm)로 마취시켜 수준별 실험어의 전체무게를 측정하였고, 이를 통해 증체율, 사료효율, 일간성장률, 단백질전환효율 및 생존율을 조사하였다. 상기 측정 항목들의 계산 [수학식 1]은 하기와 같다.

그 결과, 하기 [표 4]에서 보는 바와 같이 증체율에 있어서 치어기 뱀장어의 사료 내 프로폴리스 2.5% (P2.5) 첨가군은 대조군 (0%;P0)과 5%(P5), 10%(P10),그리고 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 1.25%(P1.25) 첨가군과는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그리고 1.25%(P1.25) 첨가군은 10%(P10)와 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 0%(P0)와 5%(P5) 첨가군과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(P>0.05).

일간성장률에 있어서 치어기 뱀장어의 사료 내 프로폴리스 2.5% (P2.5) 첨가군은 대조구(0%; P0)와 5%(P5), 10%(P10) 그리고 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 1.25% (P1.25) 첨가군과는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그리고 1.25% (P1.25) 첨가군은 5%(P5) 10%(P10), 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 0%(P0) 첨가군과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(P>0.05).

단백질전환효율에 있어서 치어기 뱀장어의 사료 내 프로폴리스 2.5% (P2.5) 첨가군은 대조군 (0%; P0)과 5%(P5), 10%(P10), 그리고 20% (P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 1.25%(P1.25) 첨가군과는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그리고, 1.25% (P1.25) 첨가군은 5% (P5), 10%(P10), 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 0% (P0)첨가군과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(P>0.05).

생존율에 있어서 치어기 뱀장어의 사료 내 프로폴리스의 첨가수준에 따른 각 실험군간의 유의한 차이는 없는 것(P>0.05)을 알 수 있다(표 4).

도 6은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 수분변화를 나타내는 그래프이고, 도 7은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 단백질조성의 변화를 나타내는 그래프이며, 도 8은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 지방질 조성의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 9는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 조회분의 변화를 나타내는 그래프이며, 도 10은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 포화지방산 조성의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 11은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 단순불포화지방산 조성의 변화를 나타내는 그래프이며, 도 12는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 다불포화지방산 조성의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 13은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 고도불포화지방산 조성의 변화를 나타내는 그래프이다.

[실험예 4] 프로폴리스를 첨가한 양어사료의 체조성 변화 실험

[4-1] 일반성분 분석

도 6 내지 도 13에 도시한 바와 같이, 본 발명은 16주간 실험종료 후, 체조성 변화를 확인하기 위하여 일반성분은 실험사료와 전어체에 대해서 실시하였고, 전어체 분석을 위해 수조별로 10마리씩 무작위로 추출하여 분쇄한 전어체를 사용하였다. AOAC (1995)에 의해 수분은 상압 가열 건조법(125℃, 3시간), 단백질은 Kjeldahl 질소 정량법(N×6.25), 그리고 회분질은 직접 회화법으로 각각 분석하였다. 또한, 지방질은 샘플을 12시간 동결 건조한 후 Soxtec system 1046 (Tacator AB, Sweden)을 사용하여 Soxhlet 추출법으로 분석하였다.

그 결과, 하기 [표 5]에서 보는 바와 같이 전어체의 수분 함량에 있어서 사료 내 프로폴리스 10%(P10) 첨가군은 대조군을 포함한 나머지 모든 첨가군들에 비해 유의하게 높았고(P<0.05), 20%(P20) 첨가군은 10%(P10) 첨가군을 제외한 나머지 실험군들에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났다(P<0.05). 그리고, 프로폴리스 5%(P5) 첨가군은 1.25%(P1.25)와 2.5%(P2.5) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면, 대조군(P0)과는 유의한 차이가 없는 것(P>0.05)을 알 수 있었다.

전어체의 단백질 함량에 있어서 사료 내 프로폴리스 1.25% ~ 5% (P1.25 - P5) 첨가군은 10%(P10)와 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 대조군(P0)과는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그리고 대조군(P0)은 프로폴리스20% (P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면, 10%(P10) 첨가군과는 유의한 차이가 없는 것(P>0.05)으로 나타났다.

전어체의 지방질 함량에 있어서 사료 내 프로폴리스 2.5% (P2.5) 첨가군 대조군(P0)을 포함한 나머지 모든 첨가군들(P1.25, P5, P10, P20)에 비해 유의하게 높았다(P<0.05). 그리고, 대조군(P0)과 1.25%(P1.25) 첨가군은 5% ~ 20% 첨가군(P5, P10, P20)들에 비해 유의하게 높았고(P<0.05), 5% 첨가군은 10%(P10)와 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높았으며(P<0.05), 20%(P20) 첨가군은 10%(P10) 첨가군에 비해 유의하게 높은 것(P<0.05)으로 나타났다.

전어체의 조회분 함량에 있어서 사료 내 프로폴리스 20%(P20) 첨가군은 대조군(P0)을 포함한 나머지 모든 첨가군들(P1.25, P2.5, P5, P10)에 비해 유의하게 높았다(P<0.05). 그리고, 프로폴리스 10%(P10) 첨가군은 20%(P20) 첨가군을 제외한 나머지 첨가군들(P0, P1.25, P2.5, P5)에 비해 유의하게 높았고(P<0.05), 프로폴리스0% ~ 5%의 4가지 첨가군들(P0, P1.25, P2.5, P5)에 대한 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다(P>0.05)(표 5).

[4-2] 지방산 분석

본 발명은 16주간 실험종료 후, 체조성변화를 확인하기 위하여 전어체의 지방산 분석에 있어 분쇄한 전어체에서 추출한 지방의 methylation은 Metcalfe et al. (1966)의 방법에 의해 feries silica capillary column을 장착한 gas chromatography (Trace GC)에 의해 분석하였다. 캐리어 기체는 질소를 사용하였고, detection은 FID 모드를 사용하였으며 분석조건은 다음과 같다(Instrument: Trace GC gas chromatograph, column: quadrex, 30M, bonded carbowax 0.25 mm I.D × 0.25 ㎛ film, cat. No.: 007-CW-30-0.25F, injector temperature: 250℃, Detector temperature: 250℃, flow (gas press): 65 psi. helium, splite: 1:50). 도출된 크로마토그램은 분석 프로그램인 peak sample (Maestro, Chrompack)에 의해 분석하였다.

그 결과, 하기 [표 6]에서 보는 바와 같이 프로폴리스의 첨가 수준별 6가지 실험사료를 섭취한 치어기 뱀장어의 전어체 내 포화지방산(Saturated fatty acid, Saturates) 함량은 30.12% ~ 32.05% (in fatty acid)로 사료 내 프로폴리스의 첨가수준에 따른 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다(P>0.05).

프로폴리스의 첨가 수준별 6가지 실험사료를 섭취한 치어기 뱀장어의 전어체 내 단순불포화지방산(Mono-unsaturated fatty acid, Monoenes) 함량에 있어서 사료 내 프로폴리스 20%(P20) 첨가군은 대조군(P0)을 포함한 나머지 모든 첨가군들(P1.25, P2.5, P5, P10)에 비해 유의하게 높았다(P<0.05). 그리고, 프로폴리스 10%(P10) 첨가군은 20%(P20) 첨가군을 제외한 나머지 첨가군들(P0, P1.25, P2.5, P5)에 비해 유의하게 높았고(P<0.05), 프로폴리스0% ~ 5%의 4가지 첨가군(P0, P1.25, P5, P10)들에 대한 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다(P>0.05).

프로폴리스의 첨가 수준별 6가지 실험사료를 섭취한 치어기 뱀장어의 전어체 내 다불포화지방산(Poly-unsaturated fatty acid, PUFA) 함량은 사료 내 프로폴리스 2.5%(P2.5) 첨가군은 나머지 모든 첨가군들(P0, P1.25, P5, P10, P20)에 비해 유의하게 높았다(P<0.05). 또한, 대조군(P0), 1.25%(P1.25), 5%(P5) 첨가군은 10%(P10)와 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 이들 3가지 첨가군간의 유의한 차이는 없었다(P>0.05). 그리고, 10%(P10) 첨가군은 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났다(P<0.05).

프로폴리스의 첨가 수준별 6가지 실험사료를 섭취한 치어기 뱀장어의 전어체 내 고도불포화지방산(Highly-unsaturated fatty acid, HUFA) 함량에 있어, 5%(P5) 첨가군은 대조군(P0), 10%(P10) 그리고 20% (P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 1.25%(P1.25)와 2.5%(P2.5) 첨가군과는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그리고 1.25%(P1.25)와 2.5%(P2.5) 첨가군은 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 대조군(P0)과 10%(P10)첨가군과는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 또한, 대조군(P0)과 10%(P10) 첨가군은 20%(P20) 첨가군에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 이들 두 가지 첨가 수준간의 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다(P>0.05)(표 6).

도 14는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 혈장 내 헤마토크리트치의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 15는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 혈장 내 라이소자임 활성의 변화를 나타내는 그래프이며, 도 16은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 체표면의 점액 라이소자임 활성의 변화를 나타내는 그래프이다.

[실험예 5] 프로폴리스를 첨가한 양어사료의 면역활성 실험

도 14 내지 도 16에 도시한 바와 같이, 본 발명은 사육실험 종료 후, 혈장 내 헤마토크리트분석을 위해 90% 에틸렌글라이콜 페닐에테르 (200 ppm)로 마취하고 두부를 절단하여 헤파린처리된 미세유리관 (Tomas)를 사용하여 혈액을 채취하였다. 헤마토크리트 원심분리기 (한일)를 사용하여 3,800×g로 5분간 원심분리한 후 헤마토크리트치를 측정하였다. 어류 당 2개의 tube를 사용하여 측정한 후 평균값을 각 개체의 값으로 하였다. 미세유리관에 분리된 혈장을 2-3개체씩 합하여 라이소자임활성의 측정에 사용하기 위해 -70℃에 보관하였다.

또한, 혈청 라이소자임활성 분석을 위해 Micrococcus lysodeikticus의 균체(Sigma)를 50 mM의 소디움포타슘버퍼 (sodium phosphate buffer, pH 6.2)에 0.2 mg/mL의 농도로 현탁하고, 이 균체에 함유된 버퍼 475 μL와 상기 혈장 25 μL를 스펙트로포토메터 측정용 큐빗에 넣고 25℃에서 스펙트로포토메터 (Shimadzu PC-1601 model)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도 변화를 10분간 측정하였다. 흡광도 0.001/min의 변화를 효소 1 unit으로 정의하여 혈장 mL당 활성을 표현하였다.

또한, 점액 라이소자임활성 분석을 위해 뱀장어의 등 부위에 플라스틱판으로 제작한 0.5×1.0 cm의 구멍을 통해 멸균면봉으로 점액을 채취하였다. 면봉의 팁을 잘라 1.5 mL centrifuge tube에 넣고 sodium phosphate buffer (pH 6.2) 0.5 mL를 가해 원심분리(2,000×g, 20min, 3℃)하여 점액을 유출시켰다. 이 점액 25 μL와 Micrococcus lysodeikticus의 균체(0.2 mg/mL, Sigma)를 함유한 소디움포타슘버퍼 (pH 6.2)를 475 μL를 스펙트로포토메터 측정용 큐빗에 가하였다. 25℃에서 스펙트로포토메터 (Shimadzu PC-1601 model)을 사용하여 450 nm에서의 흡광도 변화를 10분간 측정하였다. 흡광도 0.001/min의 변화를 효소 1 단위로 정의하여 피부 10 cm2당 활성을 표현하였다.

그 결과, 하기 [표 7]에서 보는 바와 같이 프로폴리스의 첨가 수준별 6가지 실험사료를 섭취한 치어기 뱀장어의 혈장 내 헤마토크리트에 있어서, 사료 내 프로폴리스 0% ~ 5% 첨가군(P0, P1.25, P2.5, P5)은 39.2% ~ 39.9%로 프로폴리스 10%(P10)와 20%(P20) 첨가군의 25.6% ~ 30.8%에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 이들 4개의 첨가군들(P0, P1.25, P2.5, P5)에 대한 유의한 차이는 없었다(P>0.05). 그리고 사료 내 프로폴리스 10%(P10)와 20%(P20) 첨가군간의 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다(P>0.05).

프로폴리스의 첨가 수준별 6가지 실험사료를 섭취한 치어기 뱀장어의 혈장 내 라이소자임활성에 있어서, 사료 내 프로폴리스 2.5%와 5% 첨가군(P2.5, P5)의 활성(105.7~106.0 units/mL)은 0%, 1.25%, 10%, 20% 첨가군들(P0, P1.25, P10, P20)의 활성(61.5~77.5 units/mL)에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 이들 두 가지 첨가군들(P2.5, P5)에 대한 유의한 차이는 없었다(P>0.05). 그리고, 사료 내 프로폴리스 0%, 1.25%, 10%, 20% 첨가군들(P0, P1.25, P10, P20)간의 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다(P>0.05).

프로폴리스의 첨가 수준별 6가지 실험사료를 섭취한 치어기 뱀장어 체표면의 점액 라이소자임 활성에 있어서 5%(P5) 첨가군의 활성(8.4 units/10 cm2)은 0%, 10% 그리고 20% 첨가군들(P0, P10, P20)의 활성(4.9~6.0 units/10 cm2)에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 1.25%(P1.25)와 2.5% 첨가군(P2.5)의 활성(7.1~7.4 units/10 cm2)과는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그리고 사료 내 프로폴리스 2.5% (P2.5)첨가군의 활성은 20%(P20) 첨가군의 활성에 비해 유의하게 높은 반면(P<0.05), 0%(P0), 1.25%(P1.25) 그리고 10%(P10)첨가군의 활성과는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(P>0.05) (표 7).

도 17은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 내병성평가를 나타내는 그래프이다.

[실험예 6] 공격실험에 의한 내병성 실험

도 17에 도시한 바와 같이, 본 발명은 내병성에 대한 효과를 확인하기 위해 Edwardsiella tarda FPC 799 균주의 복강주사에 의한 누적 생존율 조사는 Choi et al. (2004)의 방법에 따라 8주 동안의 사육실험 종료 후 24시간 동안 안정화 후, 어류에 독성을 미치는 E. tarda 부유액(1×106cfu/mL)을 1.5% NaCl이 첨가된 트립티케이스 단백질아가 (trypticase soy agar, TSA) 에 27℃에서 48시간 배양하여 준비하였다. 100 L 사각수조에 실험구별 각 10마리씩 3반복으로 배치하였고, 부유물을 실험어의 복강에 주사(0.1 mL/fish) 후 일별 폐사량을 기록하였다.

그 결과, 프로폴리스 비첨가구인 대조군(P0)에서는 접종 1일 후부터 폐사 개체가 확인되어 68%의 누적 생존율을 나타내었고, 접종 2일 후 누적 생존율은 40.5%로 프로폴리스 1.25%(P1.25), 2.5%(P2.5) 그리고 5%(P5) 첨가군들에 비해 유의하게 낮은 반면(P<0.05), 고농도의 프로폴리스를 첨가한 10%(P10)와 20%(P20) 실험군과 비교 시 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다(P>0.05). 또한, 접종 3일 후 22.5%, 4일 후 18%, 그리고 5일 후 13.6%의 누적 생존율을 나타내어 지속적으로 감소하는 경향을 나타내었고, 접종 10일 후까지 증감 없이 일정하게 유지되는 경향을 나타내었다.

누적 생존율에 있어서 프로폴리스 1.25%(P1.25), 2.5%(P2.5) 그리고 5%(P5)를 첨가한 실험군은 대조군과 고농도의 10%(P10)와 20%(P20)를 첨가한 실험군에 비해 접종 2일과 3일 후까지 유의하게 높은 것으로 나타났으나(P<0.05), 접종 4일 이후부터 10일 이후까지는 유의한 차이 없이 높은 경향을 나타내었다(P>0.05).

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 상세한 설명에서는 본 발명의 바람직한 실시 예에 관하여 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 따라서 본 발명의 권리 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 안되며, 후술하는 청구범위뿐만 아니라, 이와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

도 2는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 체중의 증가를 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 일간성장율의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 단백질효율을 나타내는 그래프이다.

도 5는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 생존율의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 6은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 수분변화를 나타내는 그래프이다.

도 7은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 단백질조성의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 8은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 지방질조성의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 9는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 조회분의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 10은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 포화지방산 조성의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 11은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 단순불포화지방산 조성의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 12는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 다불포화지방산 조성의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 13은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 전어체의 고도불포화지방산 조성의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 14는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 혈장 내 헤마토크리트치의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 15는 본 발명에 따른 양어사료를 통해 혈장 내 라이소자임 활성의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 16은 본 발명에 따른 양어사료를 통해 체표면의 점액 라이소자임 활성의 변화를 나타내는 그래프이다.

Claims

양어사료에 있어서,

단백질원 70 ~ 75 중량%와, 지방원 8 ~ 10 중량%와, 탄수화물원 10 ~ 15 중량%, 및 비타민 또는 미네랄 4 ~ 6 중량%로 이루어지는 양어사료 분말 96.5~99중량%에 무 알콜 수용성 프로폴리스1~3.5중량%을 첨가하되,

상기 단백질원은 어분, 오징어 간분, 카제인 중 적어도 둘 이상을 사용하고, 상기 지방원은 어유, 대두유 중 적어도 어느 하나 이상을 사용하며, 상기 탄수화물원은 전분을 사용하는 것을 특징으로 하는 양어사료.
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양어사료 제조방법에 있어서,

채집한 벌집에 물과 C1 내지 C4 저급 알콜을 벌집 중량의 2~10배로 첨가하여 꿀과 프로폴리스를 분리하는 단계와,

상기 분리된 프로폴리스를 35℃~55℃의 온도에서 감압농축하여 프로폴리스 농축액을 수득하는 단계와,

상기 프로폴리스 농축액을 감압농축기를 이용하여 무 알콜 수용성으로 분리하는 단계와,

상기 무 알콜 수용성 프로폴리스1~3.5중량%을 단백질원 70 ~ 75 중량%와, 지방원 8 ~ 10 중량%와, 탄수화물원 10 ~ 15 중량%, 및 비타민 또는 미네랄 4 ~ 6 중량%로 이루어지는 양어사료 분말 96.5~99중량%에 첨가하여 배합하는 단계와,

상기 배합된 사료를 1~3㎜ 크기로 압출 성형하는 단계, 및

상기 압출 성형된 사료를 직사광선을 피한 서늘한 곳에서 자연건조 시키는 단계로 이루어지되,

상기 양어사료 분말의 단백질원은 어분, 오징어 간분, 카제인 중 적어도 둘 이상을 사용하고, 지방원은 어유, 대두유 중 적어도 하나 이상을 사용하며, 탄수화물원은 전분을 사용하는 것을 특징으로 하는 양어사료 제조방법.
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