KR101215379B1

KR101215379B1 - Pharmaceutical composition comprising decursinol derivatives

Info

Publication number: KR101215379B1
Application number: KR1020100051645A
Authority: KR
Inventors: 원무호; 전종갑; 유기연; 황인구; 최정훈; 이충현; 이현주; 양덕모
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2012-12-26
Also published as: KR20110131942A

Abstract

본 발명은 신규한 데커시놀 유도체(decursinol derivative)를 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 규한 데커시놀 유도체(decursinol derivative)를 유효성분으로 포함하는 NF-κB 억제제에 관한 것이다. 상기 신규한 데커시놀 유도체는 세포독성이 낮고, 세포독성이 문제되지 아니하는 범위에서 NO 저해 활성이 뛰어날 뿐만 아니라, NF-κB 활성 저해능이 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 염증 예방 및 염증과 관련된 각종 질병의 치료, 개선 또는 예방의 목적 및 NF-κB와 관련된 질병, 구체적으로 다발성 골수종, 류마티스 관절염 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 질병의 치료, 개선 또는 예방의 목적으로 사용될 수 있다.The present invention relates to an anti-inflammatory composition comprising a novel decursinol derivative as an active ingredient. The present invention also relates to an NF-κB inhibitor comprising a decursinol derivative as an active ingredient. The novel decosinol derivatives are low in cytotoxicity, excellent in NO inhibitory activity in the range of which cytotoxicity is not a problem, and also have an ability to inhibit NF-κB activity. Can be used for the treatment, amelioration or prevention of various diseases associated with inflammation and for the treatment, amelioration or prevention of any one or more diseases selected from the group consisting of diseases associated with NF-κB, in particular multiple myeloma, rheumatoid arthritis and cancer have.

Description

데커시놀 유도체를 포함하는 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING DECURSINOL DERIVATIVES}Pharmaceutical composition containing a decosinol derivative {PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING DECURSINOL DERIVATIVES}

본 발명은 신규한 데커시놀 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a novel decosinol derivative as an active ingredient.

염증반응은 조직(세포)이 손상되거나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 노출되었을 때 국소 혈관과 체액에 존재하는 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴, 홍반, 부종 발열 통증 등이 나타나는 것을 말한다. 일반적으로 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 유도한다. 그러나 항원이 계속 제거되지 않거나 특정한 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 지속되면 과민성질환이나 만성 염증이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등의 치료과정에서도 장해요인이 된다.Inflammatory reactions involve the activation of enzymes, which involve various inflammatory mediators and immune cells present in local blood vessels and body fluids when tissues (cells) are damaged or exposed to external sources of infection (bacteria, fungi, viruses, and various types of allergens). Inflammatory mediator secretion, fluid infiltration, cell migration, tissue destruction, erythema, edema fever pain, etc. appear. In general, the inflammatory response removes the external source of infection and regenerates damaged tissues, leading to the recovery of function. However, if the inflammatory response continues because the antigen is not removed continuously or due to a specific internal substance, it becomes an irritable disease or chronic inflammation, and also becomes a obstacle in the treatment process such as blood transfusion, drug administration, and organ transplantation.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric oxide, NO, 매우 불안정하며 반응성이 강한 물질로서 생체 내에서 다양한 작용을 함)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제(nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 반해 헴옥시게나아제-1(HO-1)은 항산화제인 빌리베르딘(biliverdin)과 빌리루빈(bilirubin)을 생산해 염증을 억제하는 것으로 알려져 있다.Various biochemical phenomena are involved in the development of inflammation in the living body, especially nitric, an enzyme that generates nitric oxide (NO), a highly unstable and highly reactive substance that has various functions in the living body. Enzymes related to the biosynthesis of nitric oxide synthase (NOS) and prostaglandin are known to play an important role in mediating the inflammatory response. In contrast, hemeoxygenase-1 (HO-1) produces antioxidants biliverdin and bilirubin, which are known to inhibit inflammation.

최근의 연구 결과에 따르면, NOS로는 여러 종류가 존재한다. cNOS (constitutive NOS: 이미 세포내에서 존재하는 단백질로 어떤 자극에 의하여 활성을 갖게 되는 것)인 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있다. 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 반면 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와도 관련 있다(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4, pp 387-396, 1995: Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35, pp 27-28, 1996).According to recent research, there are several types of NOS. bNOS (brain NOS) present in the brain, which is a constitutive NOS (protein that is already present in the cell and activated by some stimulus), nNOS present in the nervous system, eNOS present in the vascular system endothelial NOS) is always expressed at a constant level in the body. NO produced by them plays an important role in maintaining normal homeostasis, such as inducing neurotransmission and vasodilation. On the other hand, NO, which is excessively generated by iNOS (inducible NOS) induced by various cytokines or external stimulants, is known to cause cytotoxicity and various inflammatory reactions. Chronic inflammation is also associated with increased iNOS activity (Miller MJ et al., Mediators of inflammation, 4, pp 387-396, 1995: Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35, pp 27-28, 1996).

현재까지 알려진 항염증 약물은 염증 감소 및 통증을 완화시켜 주기는 하나 위장 장애 등의 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하여 새로운 치료제를 개발하거나 기존 치료제를 개선하는 것이 필수적이다.The anti-inflammatory drugs known to date, while reducing inflammation and relieving pain, are difficult to use in the long term due to side effects such as gastrointestinal disorders, so it is essential to develop new treatments or improve existing ones.

또한, 대부분 인간의 질병은 병이 일어나는 시기 또는 진행과정에서 비정상적인 요소와 유전자 발현으로 생성된 물질이 연관되어 발생한다. 이와 같은 질병으로는 자가면역이상에 의한 관절염(autoimmune arthritis)을 포함하는 자가면역질환(autoimmune disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 천식(Asthma), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Disease: IBD), 패혈증성 쇼크(Septic shock), 폐섬유증(Lung Fibrosis), 발암기전(carcinogenesis) 즉, 각종 암(cancer), 그리고 후천성면역결핍증(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) 등이 있다.In addition, most human diseases are caused by abnormal elements and substances produced by gene expression in the course or progression of the disease. Such diseases include autoimmune disease including autoimmune arthritis, glomerulonephritis, asthma, inflammatory bowel disease (IBD), and sepsis. Septic shock, Lung Fibrosis, carcinogenesis, cancer, and Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS).

일반적으로 이러한 유전자 등은 생물학적이거나 물리학적 과정에서 활동이 없거나 매우 미미한 활동을 한다. 그러나 환경오염의 노출과 같은 명확한 조건에서 이런 유전자들의 발현은 미리 존재하고 있는 유전적 요소에 의해 기하급수적으로 증가한다. 이와 같은 유전적 요소는 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 성장인자(growth factor), 접착분자(adhesion molecule), 급성병기단백질(acute phase proteins)의 유전자 발현을 조절하는 필수적인 전사요소인 nuclear factor-κB(NF-κB)에 의해 조절된다.Generally, these genes are inactive or very insignificant in biological or physical processes. However, under certain conditions, such as exposure to environmental pollution, the expression of these genes increases exponentially with preexisting genetic elements. These genetic elements are nuclear, an essential transcription factor that regulates gene expression of cytokines, chemokines, growth factors, adhesion molecules, and acute phase proteins. regulated by factor-κB (NF-κB).

NF-κB는 면역 글로블린의 κ-light chain 유전자의 B 세포에 특이적인 전사 활성물질로 처음 확인되었다. 이후 NF-κB는 다양한 세포에서 확인되었으며 많은 요소들에 의해 활성화 되는 것으로 알려졌으며, 포유류 핵 전사 인자로 세포자살(apoptosis)의 조절을 포함하는 유전자 전사의 활성화와 관련된 다중-소단위의 복합체인 것으로 확인되었다(Baeuerle, Henkel, Ann. Rev. Immunol., 12:141-179(1994); Baldwin, Ann. Rev. Immunol. 14, 649-683(1996)). 이와 같은 NF-κB는 면역학, 분자생물학, 생화학, 유전학, 세포생물학 및 발생생물학 등 여러 분야에서 폭넓게 연구되고 있다.NF-κB was first identified as a transcriptional activator specific for B cells of the κ-light chain gene of immunoglobulins. NF-κB has since been identified in a variety of cells and is known to be activated by a number of factors and has been identified as a complex of multi-subunits involved in the activation of gene transcription, including regulation of apoptosis with mammalian nuclear transcription factors. (Baeuerle, Henkel, Ann. Rev. Immunol., 12: 141-179 (1994); Baldwin, Ann. Rev. Immunol. 14, 649-683 (1996)). Such NF-κB has been widely studied in various fields such as immunology, molecular biology, biochemistry, genetics, cell biology and developmental biology.

NF-κB는 다수의 사이토카인(cytokine; TNF, IL-1, IL-2, IL-6 및 IL iNOS 등), 케모카인(chemokine), 세포접착분자(adhesion molecule), 급성병기단백질(acute phase proteins), 면역조절 단백질, 항균 펩타이드(anti-microbial peptide), 세포 표면 수용체(cell surface receptor), 항-고사(anti-apoptotic) 유전자, inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase 2(COX-2) 등을 발현하는 유전자들의 전사단계를 활성화 한다(Barnes, P. J. et al ., N. Engl . J. Med . 366:1066-1071 (1997); Xie, Q et al ., J. Biol . Chem. 269:4705-4708 (1994); Yamamoto, K. et al ., J. Biol . Chem . 270:31315-31320 (1995)).NF-κB is a cytokine (TNF, IL-1, IL-2, IL-6 and IL iNOS, etc.), chemokines, adhesion molecules, acute phase proteins. ), Immunomodulatory proteins, anti-microbial peptides, cell surface receptors, anti-apoptotic genes, inducible nitric oxide synthase (iNOS), and cyclooxygenase 2 (COX-2) Activates the transcriptional stages of genes that express gene expression (Barnes, PJ et al . , N. Engl . J. Med . 366: 1066-1071 (1997); Xie, Q et al . , J. Biol . Chem . 269: 4705-4708 (1994); Yamamoto, K. et al . , J. Biol . Chem . 270: 31315-31320 (1995)).

비정상적인 NF-κB 활성화는 골수종을 포함한 각종 암, 관절염 등 각종 염증질환, 동맥협착증, 천식 등 염증반응이 동반되는 난치성 질환 및 암 질환의 원인이나 악성화에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다(Aradhya, S. et al ., Curr. Opin. Genet, Dev, 11:300-7 (2001); Orlowski, R. Z. et al ., Trnds Mol. Med., 8:385-9 (2002)).Abnormal NF-κB activation is known to be associated with the cause or malignancy of refractory diseases and cancer diseases accompanied by various inflammatory diseases such as myeloma, arthritis, arterial stenosis, and asthma (Aradhya, S. et. al . , Curr. Opin. Genet, Dev, 11: 300-7 (2001); Orlowski, RZ et al . , Trnds Mol. Med., 8: 385-9 (2002)).

또한, NF-κB 활성화는 염증성 질환에 상당한 역할을 한다. NF-κB는 TNF 및 다른 향 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인에 의하여 활성화된다. 또한, 천식에서 나타나는 것과 같은 만성 기도 염증은 사이토킨이라는 염증성 단백질의 과도한 발현과 관련되는 것으로 보고되어 있다. 또한, IL-1 및 TNF와 같은 다른 염증성 매개체는 류머티스성 관절염과 같은 관절 질환에 주요한 역할을 하는 것으로 보고 되어 있다. 이들 염증성 단백질 모두는 NF-κB에 의하여 고도로 조절된다(Yamamoto, Y., et al., J. Clin Invest 107 135-142(2001) 및 Hart, L. A., et al., Am J Respir Crit Care Med 158 1585-1592(1998)).In addition, NF-κB activation plays a significant role in inflammatory diseases. NF-κB is activated by TNF and other pro-inflammatory cytokines. In addition, chronic airway inflammation as seen in asthma is reported to be associated with excessive expression of an inflammatory protein called cytokines. In addition, other inflammatory mediators such as IL-1 and TNF have been reported to play a major role in joint diseases such as rheumatoid arthritis. All of these inflammatory proteins are highly regulated by NF-κB (Yamamoto, Y., et al ., J. Clin Invest 107 135-142 (2001) and Hart, LA, et al ., Am J Respir Crit Care Med 158 1585-1592 (1998).

따라서, 비-독성 억제제에 의한 NF-κB 활성화를 억제할 수 있는 성분은 많은 염증성 질환, 류마티스 관절염을 포함한 각종 관절염, 염증성 장 질환, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD) 골관절염, 골다공증 및 섬유화질환(fibrotic disease)의 치료에 임상적으로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 항-염증성 약물에 의한 이들 조절 단백질 또는 이들의 키나아제의 억제는 이들 질환의 치료에 효과적인 것으로 보고되어 있다.Thus, components that can inhibit NF-κB activation by non-toxic inhibitors include many inflammatory diseases, various arthritis including rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) osteoarthritis, osteoporosis and fibrotic diseases ( can be used clinically for the treatment of fibrotic disease). In addition, inhibition of these regulatory proteins or their kinases by anti-inflammatory drugs has been reported to be effective in the treatment of these diseases.

따라서, 천식, 관절염 등 각종 염증질환 등의 난치성 질환 및 다발성 골수종, 암 등을 치료하기 위하여, NF-κB의 활성화를 효과적으로 저해할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.Therefore, in order to treat refractory diseases such as various inflammatory diseases such as asthma and arthritis, multiple myeloma, cancer and the like, development of a substance capable of effectively inhibiting the activation of NF-κB is required.

상기와 같은 요구에 부응하기 위하여, 본 발명은 NO의 분비량을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 NF-κB의 활성화를 억제하여, 항염 효과 및 염증성 질환의 치료, 예방 또는 개선 효과가 있고, 나아가 NF-κB의 활성화로 인해 발병하는 것으로 알려진 천식, 다발성 골수종, 류마티스 관절염 및 암 등의 질병의 치료 또는 예방에 유용하고 부작용이 적은 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.In order to meet the above demands, the present invention not only effectively inhibits the secretion amount of NO, but also inhibits the activation of NF-κB, thereby having an anti-inflammatory effect and an effect of treating, preventing or improving inflammatory diseases, and further, It is an object of the present invention to provide compounds that are useful and have fewer side effects for the treatment or prevention of diseases such as asthma, multiple myeloma, rheumatoid arthritis and cancer known to occur due to activation.

또한, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물과 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 천식, 다발성 골수종, 류마티스 관절염 및 암으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 질병 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, to provide an anti-inflammatory composition comprising the compound as an active ingredient and at least one disease treatment or prevention composition selected from the group consisting of asthma, multiple myeloma, rheumatoid arthritis and cancer comprising the compound as an active ingredient. do.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 데커시놀 유도체(decursinol derivative)를 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an anti-inflammatory composition comprising a novel decursinol derivative (decursinol derivative) as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 신규한 데커시놀 유도체를 유효성분으로 포함하는 NF-κB 저해제를 제공한다.In addition, the present invention provides an NF-κB inhibitor comprising a novel decosinol derivative as an active ingredient in order to achieve the above object.

상기 NF-κB 저해제는 NF-κB와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명은 신규한 데커시놀 유도체를 유효성분으로 포함하는 천식, 다발성 골수종, 류마티스 관절염 및 암으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 질병 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.The NF-κB inhibitor may be used as a composition for preventing or treating a disease associated with NF-κB. In this aspect, the present invention provides a composition for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of asthma, multiple myeloma, rheumatoid arthritis and cancer comprising the new decosinol derivative as an active ingredient.

본 발명자들은 부작용이 적고, 항염 활성이 뛰어난 신규 화합물에 대해 연구하던 중, 세포독성이 낮고, 세포독성이 문제되지 아니하는 범위에서 NO 저해 활성이 뛰어난 화합물의 경우 항염 효과가 우수한 화합물의 경우 새로운 항염제로 응용될 수 있다는 점과 NF-κB 활성화를 저해하면 천식, 염증, 다발성 골수종 및 암 질환의 예방 및 치료할 수 있다는 점을 근거로 연구를 진행하던 중, 본 발명자들에 의해 새롭게 합성된 신규한 데커시놀 유도체(decursinol derivative)가 세포독성이 낮고, NO 저해 활성이 뛰어날 뿐만 아니라, 허혈을 유도한 경우에 NF-κB 활성화를 저해한다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors are studying new compounds with less side effects and excellent anti-inflammatory activity. In the case of compounds having low cytotoxicity and excellent NO inhibitory activity in a range where cytotoxicity is not a problem, a new anti-inflammatory agent for a compound having excellent anti-inflammatory effect A novel decker newly synthesized by the inventors of the present invention, while being researched on the basis of its application to NF-κB and the inhibition of NF-κB activation can prevent and treat asthma, inflammation, multiple myeloma and cancer diseases. The present invention was completed by confirming that the decursinol derivative has low cytotoxicity, excellent NO inhibitory activity, and inhibits NF-κB activation when ischemia is induced.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 신규한 데커시놀 유도체(decursinol derivative) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 일 예로, 항염 조성물, NF-κB 저해제 또는 천식, 다발성 골수종, 류마티스 관절염 및 암으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 질병 치료 또는 예방용 조성물일 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a novel decursinol derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. The pharmaceutical composition may be, for example, an anti-inflammatory composition, an NF-κB inhibitor or a composition for treating or preventing one or more diseases selected from the group consisting of asthma, multiple myeloma, rheumatoid arthritis and cancer.

본 발명은 신규한 데커시놀 유도체(decursinol derivative) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an anti-inflammatory composition comprising a novel decursinol derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

상기 신규한 데커시놀 유도체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것일 수 있다.The novel decosinol derivative may be one having a structure of Formula 1 below.

[화학식 1][Formula 1]

상기 화학식 1에서, 상기 n은 1 내지 4의 정수이고, 상기 R은 각각 독립적으로 알킬, 아릴, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 아미노 및 티올로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.In Formula 1, n is an integer of 1 to 4, and each R may be independently selected from the group consisting of alkyl, aryl, halogen, hydroxy, alkoxy, amino and thiol.

상기 알킬은 알킬 또는 시클로 알킬일 수 있고, 바람직하게는 탄소수 1(C1) 내지 탄소수 7(C5) 또는 탄수소 1(C1) 내지 탄소수 5(C5)인 직쇄 및 분쇄 알킬일 수 있으며, 상기 아릴은 페닐 또는 나프틸 등의 방향환계를 포함하고, 구체적으로 탄소수 6(C6) 내지 30(C30) 또는 탄소수 6(C6) 내지 12(C12)인 아릴일 수 있으며, 상기 알콕시는 탄소수 1(C1) 내지 탄소수 10(C10)인 알콕시일 수 있다. 상기 알킬, 아릴 및 알콕시는 치환 또는 비치환된 것일 수 있다.The alkyl may be alkyl or cyclo alkyl, preferably may be straight chain and ground alkyl having 1 (C1) to 7 carbon atoms (C5) or carbon atoms 1 (C1) to 5 (C5) carbon atoms, the aryl is It may be an aryl including an aromatic ring system such as phenyl or naphthyl, specifically, 6 (C6) to 30 (C30) or 6 (C6) to 12 (C12) carbon atoms, the alkoxy is 1 to (C1) to Or alkoxy having 10 (C10) carbon atoms. The alkyl, aryl and alkoxy may be substituted or unsubstituted.

상기 할로겐은 플루오르(F), 클로라이드(Cl), 브롬(Br) 또는 요오드(I)일 수 있다.The halogen may be fluorine (F), chloride (Cl), bromine (Br) or iodine (I).

상기 데커시놀 유도체 화합물은 바람직하게는 하기 화학식 2의 구조를 가진 화합물일 수 있다.The decosinol derivative compound may be preferably a compound having a structure of Formula 2 below.

[화학식 2][Formula 2]

상기 항염 조성물은 체내에서 비정상적인 염증이 발생되는 경우 이를 억제 또는 저해할 수 있는 물질을 의미하며, 그 억제 또는 저해 경로는 어떤 특정 경로에 의해 제한되는 것은 아니다.The anti-inflammatory composition means a substance capable of inhibiting or inhibiting abnormal inflammation in the body, and the inhibition or inhibition pathway is not limited by any specific route.

본 발명자들은 면역세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 NO의 분비량을 Griess reagent system을 이용하여 측정한 결과, 상기 화합물을 처리함으로써 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 유도된 NO의 분비를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.The present inventors measured the secretion of NO using a Griess reagent system using RAW 264.7 cells, which are immune cells, and confirmed that the compounds can effectively suppress the secretion of NO induced by LPS (lipopolysaccharide) by treating the compound. It was.

따라서, 상기 항염 조성물은 염증 예방과 관련된 다양한 용도의 피부외용제로 응용될 수 있다. 상기 피부외용제의 일 태양으로 화장료 조성물 등에 응용될 수 있다.Therefore, the anti-inflammatory composition may be applied as an external skin preparation for various uses related to the prevention of inflammation. One aspect of the external skin preparations may be applied to cosmetic compositions and the like.

보다 구체적으로, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 상기 항염 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체, 에어로졸 등의 제형을 가질 수 있다.More specifically, the skin external preparation including the compound having the structure of Formula 1 or the anti-inflammatory composition as an active ingredient may have a formulation such as powder, gel, ointment, cream, liquid, aerosol, and the like.

또한, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 상기 항염 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 피부염, 여드름 또는 아토피 피부염 개선 또는 예방 효과가 있는 화장료 조성물일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 화장료의 제형 또는 사용 목적 등에 맞게 임의로 선정된 부형제 등이 첨가될 수 있다. 상기 첨가가 가능한 물질은 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알콜, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH 조절제 또는 향료 등일 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등일 수 있다.In addition, the cosmetic composition comprising the compound having the structure of Formula 1 or the anti-inflammatory composition as an active ingredient may be a cosmetic composition having an dermatitis, acne or atopic dermatitis improvement or prevention effect. The cosmetic composition may be added an excipient and the like optionally selected according to the formulation or purpose of use of the cosmetic. The substance that can be added may be purified water, oil, surfactant, moisturizer, higher alcohol, chelating agent, colorant, fatty acid, antioxidant, preservative, wax, pH adjuster or flavoring. The formulation of the cosmetic composition is not particularly limited, and may be, for example, a nourishing cream, astringent lotion, a flexible lotion, a lotion, an essence, a nourishing gel or a massage cream.

또한, 본 발명은 상기 신규한 데커시놀 유도체를 유효성분으로 포함하는 NF-κB 저해제 즉, NF-κB 저해용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to an NF-κB inhibitor, that is, a composition for inhibiting NF-κB, comprising the novel decosinol derivative as an active ingredient.

[화학식 1][Formula 1]

[화학식 2][Formula 2]

상기 NF-κB 저해제는 상기 NF-κB의 발현(expression) 및/또는 활성화(activation)을 저해할 수 있는 물질을 의미하며, 그 저해 경로는 어떤 특정 경로에 의해 제한되는 것은 아니다.The NF-κB inhibitor refers to a substance capable of inhibiting the expression and / or activation of the NF-κB, the inhibition route is not limited by any specific route.

본 발명자들은 실험동물의 뇌허혈을 유도한 후, 뇌허혈이 유도된 실험동물의 신경세포에서 NF-κB의 변화를 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 통해 확인한 결과, 상기 화합물을 처리함으로써 뇌허혈의 유도에 의한 NF-κB 활성화를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.The inventors of the present invention confirmed the change of NF-κB in neurons of experimental animals induced by cerebral ischemia through immunohistochemistry staining after inducing cerebral ischemia of experimental animals. It was confirmed that NF-κB activation can be effectively inhibited.

NF-κB는 핵 안으로 전위하여 핵 안에서 전사과정을 유도하므로, NF-κB 활성화를 억제하는 본 발명의 약학 조성물은 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 접착분자(adhesion molecule), 급성병기단백질(acute phase proteins), 항균 펩타이드(anti-microbal peptide), 세포 표면 수용체(cell surface receptor), inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase 2(COX-2) 유전자들의 전사단계의 활성화를 억제함으로써, 상기 유전자들에 의하여 영향을 받을 수 있는 천식, 다발성 골수종, 류마티스 관절염 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 것으로 확인되었다.Since NF-κB transduces into the nucleus and induces a transcription process in the nucleus, the pharmaceutical composition of the present invention which inhibits NF-κB activation is cytokine, chemokine, adhesion molecule, acute stage protein. by inhibiting the transcriptional phase activation of acute phase proteins, anti-microbal peptides, cell surface receptors, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase 2 (COX-2) genes. It has been shown that it is possible to prevent or treat any one or more diseases selected from the group consisting of asthma, multiple myeloma, rheumatoid arthritis and cancer that may be affected by the genes.

따라서, 상기 신규한 데커시놀 유도체는 효과적으로 NF-κB를 저해할 수 있으므로, NF-κB와 관련된 다양한 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.Therefore, since the novel decosinol derivatives can effectively inhibit NF-κB, it can be used as an active ingredient of a composition for preventing or treating various diseases related to NF-κB.

이러한 측면에서, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 데커시놀 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 천식, 다발성 골수종, 류마티스 관절염 및 암으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 질병 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.In this aspect, the present invention is one or more diseases selected from the group consisting of asthma, multiple myeloma, rheumatoid arthritis and cancer comprising as an active ingredient a decosinol derivative having the structure of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof Provided are compositions for treatment or prophylaxis.

상기 항염 조성물, NF-κB 저해용 조성물 또는 상기 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하고, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하며, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.The anti-inflammatory composition, a composition for inhibiting NF-κB or a composition for preventing or treating the disease may be directly applied to an animal including a human. The animal is a biological group corresponding to plants, and mainly refers to the ingestion of organic matter as nutrients, digestion, excretion, and respiratory organs are differentiated, preferably mammals, and more preferably humans.

상기 화학식 1의 구조를 갖는 데커시놀 유도체는 상기 항염 조성물, NF-κB 저해용 조성물 또는 상기 질병의 예방 또는 치료용 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 데커시놀 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 조성물이 약제로 사용되거나, 의약 또는 약학적 용도로 사용되는 경우, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 데커시놀 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용될 수 있다.The decosinol derivative having the structure of Formula 1 may be used alone in the anti-inflammatory composition, the composition for inhibiting NF-κB or the composition for preventing or treating the disease, and other pharmacologically acceptable carriers, excipients, and diluents. Or additional ingredients may be included. More specifically, when a composition containing a decosinol derivative having the structure of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is used as a medicament, or used for medicament or pharmaceutical use, Formula 1 The decosinol derivative having the structure of or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be used by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient or diluting with a diluent according to a conventional method.

이 경우 상기 조성물 내 상기 화학식 1의 구조를 갖는 데커시놀 유도체 또는 그의 약학적으로 허영되는 염의 함량은 0.001 중량 % 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 20 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 화합물의 함량은 바람직한 함량으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.In this case, the content of the decosinol derivative having the structure of Formula 1 or a pharmaceutically vane salt thereof in the composition may be 0.001% by weight to 99.9% by weight, 0.1% by weight to 99% by weight or 1% by weight to 20% by weight. However, the present invention is not limited thereto, and the content of the compound may be appropriately adjusted to a desired content according to the use mode and method of use of the composition.

상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리시염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 또한, 상기 약학 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 상기 화학식 1의 구조를 갖는 데커시놀 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.Examples of the pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil , Dextrin, calcium carbonate, propylene glycol, liquid paraffin, and at least one selected from the group consisting of physiological saline, but is not limited thereto, and all common carriers, excipients or diluents can be used. In addition, the pharmaceutical composition may further comprise at least one selected from the group consisting of conventional fillers, extenders, binders, disintegrants, anticoagulants, lubricants, humectants, pH adjusters, nutrients, vitamins, electrolytes, alginic acid and its salts, pectic acid and its salts, , Fragrances, emulsifiers, preservatives, and the like. The components may be added independently or in combination with the decosinol derivative having the structure of Formula 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is the active ingredient.

또한, 본 발명의 항염 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 항염 효과가 인정되는 물질을 더욱 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 NF-κB 저해용 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 NF-κB의 저해제로 사용되는 물질을 더욱 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 질병의 치료 또는 예방용 조성물은 상기 유효성분 이외에 각각의 질병의 치료 또는 예방 효과가 인정되는 물질을 각 치료 목적이 되는 질병의 종류에 따라 더욱 포함될 수 있다.In addition, the anti-inflammatory composition of the present invention may further include a substance in which a known anti-inflammatory effect is recognized in addition to the active ingredient. In addition, the composition for inhibiting NF-κB of the present invention may further include a substance used as an inhibitor of a known NF-κB in addition to the active ingredient. In addition, the composition for the treatment or prevention of the disease of the present invention may further include a substance that is recognized for the treatment or prophylactic effect of each disease in addition to the active ingredient according to the type of the disease for the purpose of each treatment.

상기 항염 조성물, 상기 NF-κB 저해용 조성물 및 상기 질병의 치료 또는 예방용 조성물이 약제로 사용하는 경우 투여방법은 각각 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 일 예로는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.When the anti-inflammatory composition, the composition for inhibiting the NF-κB and the composition for treating or preventing the disease are used as a medicament, the administration method may be oral or parenteral, respectively. For example, oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular. It can be administered through several routes, including.

또한, 상기 항염 조성물, 상기 NF-κB 저해용 조성물 및 상기 질병의 치료 또는 예방용 조성물의 제형은 각각 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.In addition, the formulation of the anti-inflammatory composition, the NF-κB inhibitory composition and the composition for the treatment or prevention of the disease may vary depending on the method of use, respectively. It can be formulated using methods well known in the art to which it pertains. In general, solid dosage forms for oral administration include tablets, pills, soft or hard capsules, pills, powders and granules, which may contain one or more Excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Oral liquid preparations include suspending agents (SUSTESIONS), liquid solutions, emulsions (EMULSIONS) and syrups (SYRUPS) .Such as simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, Sweeteners, fragrances, preservatives and the like can be included.

비경구투여를 위한 형태는 크림(CREAM), 로션제(LOTIONS), 연고제(ONITMENTS), 경고제(PLASTERS), 액제(LIQUIDS AND SOULTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 유동엑스제(FRUIDEXTRACTS), 엘릭서(ELIXIR), 침제(INFUSIONS), 향낭(SACHET), 패취제(PATCH) 또는 주사제(INJECTIONS) 등의 형태일 수 있다.Forms for parenteral administration are CREAM, LOTIONS, ONITMENTS, PLASTERS, LIQUIDS AND SOULTIONS, AEROSOLS, FRUIDEXTRACTS, Elixir (ELIXIR), INFUSIONS, SACHET, PATCH or INJECTIONS.

더 나아가, 상기 항염 조성물, 상기 NF-κB 저해용 조성물 및 상기 질병의 치료 또는 예방용 조성물은 각각 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제형화될 수 있다.Furthermore, the anti-inflammatory composition, the composition for inhibiting NF-κB and the composition for treating or preventing the disease may be prepared using appropriate methods known in the art or by Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack, respectively. Publishing Company, Easton PA).

상기 항염 조성물, 상기 NF-κB 저해용 조성물 및 상기 질병의 치료 또는 예방용 조성물의 투여량은 각각 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 일 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.01 mg/kg(체중) 내지 100 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 50 mg/kg(체중) 또는 0.5 mg/kg(체중) 내지 10 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The dosage of the anti-inflammatory composition, the composition for inhibiting NF-κB and the composition for the treatment or prevention of the disease may be a method of administration, age, sex, severity, condition of the patient, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate, respectively. And may be determined in consideration of the drug used in combination, for example, 0.01 mg / kg (body weight) to 100 mg / kg (body weight), 0.1 mg / kg (body weight) to 50 mg / kg based on a day active ingredient (Body weight) or 0.5 mg / kg (body weight) to 10 mg / kg (body weight), and may be administered once or divided into several doses. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.

본 발명의 신규 데커시놀 유도체 화합물은 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 유발되는 면역세포 내의 NO 분비량을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 실험동물에서 뇌허혈에 의해 유발되는 NF-κB의 발현을 효과적으로 저해할 수 있는 것으로 확인되어, 항염증 효과 및 NF-κB 저해효과가 인정되므로, 상기 데커시놀 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 염증 저해 및 NF-κB 저해 효과가 인정되어, 항염 조성물, NF-κB 저해제 및 NF-κB와 관련된 질병인 다발성 골수종, 류마티스 관절염 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 사용될 수 있다.The novel decosinol derivative compounds of the present invention not only effectively inhibit NO secretion in immune cells induced by lipopolysaccharide (LPS), but also effectively inhibit the expression of NF-κB induced by cerebral ischemia in experimental animals. Since the anti-inflammatory effect and the NF-κB inhibitory effect are recognized, the pharmaceutical composition comprising the decosinol derivative compound and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is recognized to inhibit the inflammation and the NF-κB inhibitory effect. It can be used as a composition for the prevention, treatment or amelioration of any one or more diseases selected from the group consisting of anti-inflammatory compositions, NF-κB inhibitors and diseases associated with NF-κB, multiple myeloma, rheumatoid arthritis and cancer.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 HC-12의 세포독성을 확인하기 위하여, RAW264.7 세포주를 이용하여 MTT assay법을 수행한 결과를 나타낸 그래프로, 가로축의 수치는 HC-12의 투여량(μmol/L)량을 나타내는 수치이며, 가로축의 투여량 아래에 'LPS'로 표시된 실험군은 LPS(lipopolysaccharide, μg/mL)를 함께 처리하였다는 것을 의미하고, 세로축의 수치는 570nm에서 측정된 흡광도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 HC-12의 항염증 효과를 확인하기 위하여, RAW264.7 세포주에 LPS 처리 후, NO 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 가로축의 수치는 HC-12의 투여량(μmol/L)량을 나타내는 수치이며, 가로축의 투여량 아래에 'LPS'로 표시된 실험군은 LPS(lipopolysaccharide, μg/mL)를 함께 처리하였다는 것을 의미하고, 세로축의 수치는 NO 분비량(μmol/L)을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 HC-12의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 뇌졸중에서 매우 중요한 염증반응인자로 알려진 NF-kB에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 수행한 후 관찰한 사진으로, Sham(A)은 뇌허혈을 일으키지 않은 정상군을 의미하고, Vehicle(B)은 증류수만을 투여한 대조군을 의미하고, 20mg/kg(C) 및 40mg/kg(D)은 각각 실험동물의 체중 1kg당 HC-12를 각각 20mg 또는 40mg 투여한 실험군을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 도 1의 NF-kB에 대한 항체를 이용하여 나타낸 면역반응성을 O.D.(optical density)로 측정하여 나타낸 그래프로, 상기 NF-kB에 대한 면역반응성을 O.D.로 측정한 후, 상기 측정 결과를 뇌허혈을 일으키지 않은 정상군(Sham)을 기준으로 상대 값(%)으로 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the results of performing the MTT assay using a RAW264.7 cell line in order to confirm the cytotoxicity of HC-12 according to an embodiment of the present invention, the horizontal axis value is the administration of HC-12 The experimental group labeled 'LPS' under the dose on the horizontal axis means that LPS (lipopolysaccharide, μg / mL) was treated together, and the value on the vertical axis was measured at 570 nm. Absorbance is shown.
Figure 2 is a graph showing the result of measuring the amount of NO secretion after LPS treatment in RAW264.7 cell line, in order to confirm the anti-inflammatory effect of HC-12 according to an embodiment of the present invention, the horizontal axis number is HC-12 The experimental group labeled 'LPS' below the horizontal axis dose means that LPS (lipopolysaccharide, μg / mL) was treated together, and the vertical axis value indicates NO secretion amount. (μmol / L).
Figure 3 is observed after immunohistochemical staining using an antibody against NF-kB known as a very important inflammatory response factor in stroke in order to confirm the anti-inflammatory effect of HC-12 according to an embodiment of the present invention In one picture, Sham (A) refers to the normal group that did not cause cerebral ischemia, Vehicle (B) refers to the control group administered with distilled water only, and 20 mg / kg (C) and 40 mg / kg (D), respectively. The experimental group administered with 20 mg or 40 mg of HC-12, respectively, per kg of body weight.
FIG. 4 is a graph showing measured immunoreactivity using an antibody against NF-kB of FIG. 1 according to an embodiment of the present invention in terms of optical density (OD), and OD immunoreactivity against NF-kB is shown in FIG. After the measurement, the measurement result is a graph showing a relative value (%) based on the normal group (Sham) that did not cause cerebral ischemia.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명의 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention are described. However, the following examples are only preferred examples of the present invention, and are not limited to the following examples of the present invention.

실시예 1: 데커시놀로부터 HC -11의 제조. Example 1 From Deckersinol Preparation of HC- 11.

살리실산(Salicylic acid, 0.033 g, 0.243 mmol), DCC(0.053 g, 0.255 mmol)과 DMAP(0.003 g, 0.024 mmol)을 CH₂Cl₂(5 mL)에 녹인 후, 실온에서 30분 동안 질소 하에서 교반 한 뒤, (+)-decursinol(0.03 g, 0.121 mmol)을 넣어주었다. 상기 혼합물을 48시간 동안 질소기류 하에서 환류시키면서 반응시킨 후 실온으로 냉각한다. 상기 냉각한 반응액을 Celite filter로 여과 후 여과액을 감압 증류하고 CH₂Cl₂로 희석시켰다. 상기 유기층을 brine으로 씻어내고, MgSO₄로 건조시킨 후 감압 증류하여 남은 물질을 컬럼크로마토그래피 (EtOAc:Hexane=1:1)로 분리하여 하얀색 고체인 HC-11(7R-(2-hydroxybenzoate)-8,8-dimethyl-8-oxo-7,8-dihydro-6H- pyrano[3,2g]chromen-2-one) 0.041g을 수득하였다. 상기 HC-11의 수율은 93%이었다.Salicylic acid (0.033 g, 0.243 mmol), DCC (0.053 g, 0.255 mmol) and DMAP (0.003 g, 0.024 mmol) are dissolved in CH ₂ Cl ₂ (5 mL) and then stirred under nitrogen for 30 minutes at room temperature. After that, (+)-decursinol (0.03 g, 0.121 mmol) was added thereto. The mixture is reacted under reflux under a nitrogen stream for 48 hours and then cooled to room temperature. The cooled reaction solution was filtered through a Celite filter, and the filtrate was distilled under reduced pressure and diluted with CH ₂ Cl ₂ . The organic layer was washed with brine, dried over MgSO _4, and distilled under reduced pressure. The remaining material was separated by column chromatography (EtOAc: Hexane = 1: 1) to give a white solid, HC-11 (7 R- (2-hydroxybenzoate). 0.041 g of -8,8-dimethyl-8-oxo-7,8-dihydro-6 H -pyrano [3,2g] chromen-2-one) was obtained. The yield of HC-11 was 93%.

R _f 0.67 (EtOAc:Hexane=1:1); R _f 0.67 (EtOAc: Hexane = 1: 1);

m.p. 120-128℃;m.p. 120-128 ° C .;

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.43 (3H, s), 1.48 (3H, s), 3.01 (1H, dd, J=4.8, 17.1 Hz), 3.31 (1H, dd, J=4.8, 17.1 Hz), 5.31 (1H, t, J=5.4 Hz), 6.23 (1H, d, J=9.3 Hz), 6.80-6.85 (2H, m), 6.97 (1H, d, J=7.8 Hz), 7.17 (1H, s), 7.44 (1H, br t, J=7.8 Hz), 7.57 (1H, d, J=9.3 Hz), 7.68 (1H, dd, J=1.8, 7.8 Hz), 10.56 (1H, s). ¹ H NMR (300 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.43 (3H, s), 1.48 (3H, s), 3.01 (1H, dd, J = 4.8, 17.1 Hz), 3.31 (1H, dd, J = 4.8, 17.1 Hz), 5.31 (1H, t, J = 5.4 Hz), 6.23 (1H, d, J = 9.3 Hz), 6.80-6.85 (2H, m), 6.97 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.17 ( 1H, s), 7.44 (1H, brt, J = 7.8 Hz), 7.57 (1H, d, J = 9.3 Hz), 7.68 (1H, dd, J = 1.8, 7.8 Hz), 10.56 (1H, s) .

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 23.8 (Me), 25.3(Me), 28.2 , 71.5 , 76.9 , 105.1 , 112.1 , 113.3 , 113.8 , 115.4 , 117.9 , 119.6 , 128.9 , 130.1 , 136.4 , 143.2 , 154.4 , 156.3 , 161.3 , 161.9 , 169.4 (C=O).
¹³ C NMR (75 MHz, CDCl ₃ ) δ 23.8 (Me), 25.3 (Me), 28.2, 71.5, 76.9, 105.1, 112.1, 113.3, 113.8, 115.4, 117.9, 119.6, 128.9, 130.1, 136.4, 143.2, 154.4 , 156.3, 161.3, 161.9, 169.4 (C = O).

실시예 2: HC-11부터 HC-12의 제조. Example 2 Preparation of HC-11 to HC-12.

HC-11(0.033 g, 0.090 mmol)과 DMAP(0.002 g, 0.018 mmol)을 CH₂Cl₂(5 mL)에 녹인 후 Et₃N(0.06 mL, 0.450 mmol)을 넣어주고, 이 혼합물을 10분 동안 실온에서 교반시켰다. 상기 교분 후, 아세트산 무수물(Acetic anhydride, 0.04 mL, 0.360 mmol)을 넣어주고 실온에서 3시간동안 교반시키면서 반응시켰다. 반응 후, 상기 반응물에 에탄올을 넣어주고 물로 처리한 뒤 CH₂Cl₂로 추출하였다. 상기 추출물을 brine으로 씻어내고, MgSO₄로 건조시킨 후 감압 증류하여 남은 물질을 컬럼크로마토그래피(EtOAc:Hexane=1:1)로 분리하여 하얀색 고체인 7R-(2-acetosybenzoate)-8,8-dimethyl-8-oxo-7,8-dihydro-6H- pyrano[3,2g]chromen-2-one 0.03 g을 수득하였다. 상기 HC-12의 수율은 83%이었다.Dissolve HC-11 (0.033 g, 0.090 mmol) and DMAP (0.002 g, 0.018 mmol) in CH ₂ Cl ₂ (5 mL), add Et ₃ N (0.06 mL, 0.450 mmol), and mix the mixture for 10 minutes. Stirred at room temperature. After the mixing, acetic anhydride (0.04 mL, 0.360 mmol) was added thereto and reacted with stirring at room temperature for 3 hours. After the reaction, ethanol was added to the reaction, treated with water, and extracted with CH ₂ Cl ₂ . The extract was washed with brine, dried over MgSO _4, and distilled under reduced pressure. The remaining material was separated by column chromatography (EtOAc: Hexane = 1: 1) to give a white solid of 7 R- (2-acetosybenzoate) -8,8. 0.03 g of -dimethyl-8-oxo-7,8-dihydro-6 H -pyrano [3,2g] chromen-2-one was obtained. The yield of HC-12 was 83%.

R _f 0.41 (EtOAc:Hexane=1:1); R _f 0.41 (EtOAc: Hexane = 1: 1);

m.p. 78-82℃;m.p. 78-82 ° C .;

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.40 (3H, s), 1.46 (3H, s), 2.30 (3H, s), 2.97 (1H, dd, J=4.5, 17.1 Hz), 3.27 (1H, dd, J=4.5, 17.1 Hz), 5.26 (1H, t, J=4.5 Hz), 6.22 (1H, d, J=9.6 Hz), 6.82 (1H, s), 7.07 (1H, d, J=8.1 Hz), 7.16 (1H, s), 7.28 (1H, d, J=7.8 Hz), 7.54-7.58 (2H, m), 7.89 (1H, dd, J=1.8 8.1 Hz). ¹ H NMR (300 MHz, CDCl ₃ ) δ 1.40 (3H, s), 1.46 (3H, s), 2.30 (3H, s), 2.97 (1H, dd, J = 4.5, 17.1 Hz), 3.27 (1H, dd, J = 4.5, 17.1 Hz), 5.26 (1H, t, J = 4.5 Hz), 6.22 (1H, d, J = 9.6 Hz), 6.82 (1H, s), 7.07 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.16 (1H, s), 7.28 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.54-7.58 (2H, m), 7.89 (1H, dd, J = 1.8 8.1 Hz).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 21.4 , 24.0 (Me), 25.3(Me), 28.1 , 71.1 , 76.9 , 105.0 , 113.2 , 113.6 , 115.7 , 122.7 , 124.1 , 126.3 , 129.0 , 131.9 , 134.6 , 143.3, 151.0 , 154.3 , 156.4 , 161.4 , 163.8 , 169.8(C=O).
¹³ C NMR (75 MHz, CDCl ₃ ) δ 21.4, 24.0 (Me), 25.3 (Me), 28.1, 71.1, 76.9, 105.0, 113.2, 113.6, 115.7, 122.7, 124.1, 126.3, 129.0, 131.9, 134.6, 143.3 , 151.0, 154.3, 156.4, 161.4, 163.8, 169.8 (C = O).

실시예 3: 항염 효과 측정Example 3: Anti-inflammatory Effect Measurement

상기 실시예 2에서 제조한 HC-12의 항염 효과를 측정하기 위해, 우선 세포 독성이 나타나는 HC-12의 함량에 관한 실험을 수행하고, 세포 독성이 문제되지 아니하는 범위에서 항염 효과를 측정하였다.
In order to measure the anti-inflammatory effect of HC-12 prepared in Example 2, the experiment was first performed on the content of HC-12 showing cytotoxicity, and the anti-inflammatory effect was measured in a range where the cytotoxicity was not a problem.

실시예 3-1. 세포 독성 측정Example 3-1. Cytotoxicity measurement

상기 실시예 2에서 제조된 HC-12의 세포 독성을 측정하기 위하여, 쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 ATCC에서 구입하여 이용하였다. 상기 세포의 배양(Cell culture)에 사용된 DMEM/F12(Dulbecco's modified Eagle's medium/ Nutrient Mixture Ham's F12), FBS(fetal bovine serum), L-glutamine, 페니실린-스트렙토마이신 및 인슐린(Insulin)은 Gibco/BRL(USA)에서 구입하였다.In order to measure the cytotoxicity of HC-12 prepared in Example 2, RAW264.7 cells, which are mouse macrophages, were purchased from ATCC and used. DMEM / F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium / Nutrient Mixture Ham's F12), FBS (fetal bovine serum), L-glutamine, penicillin-streptomycin and Insulin used in the cell culture were Gibco / BRL. (USA).

상기 RAW264.7 세포는 DMEM/F12 배지에 10% FBS, 1% 페니실린 스트렙토마이신 1% L-글루타민 및 20 μg/mL 인슐린을 첨가한 배양액을 사용하여 배양하였고, 37℃ 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 상기 세포가 배양접시의 약 80%가 차게 배양된 후, PBS(pH 7.4)로 세포의 단층을 씻어낸 후세척하고, 0.25% 트립신 및 2.56 mmol/L EDTA를 처리하여 계대 배양하였다. 배지는 2일마다 교환하였다.The RAW264.7 cells were cultured using a medium containing 10% FBS, 1% penicillin streptomycin 1% L-glutamine, and 20 μg / mL insulin in DMEM / F12 medium, and a 37 ° C. CO 2 incubator (5% CO 2/95% air). After about 80% of the cells were incubated, the cells were washed with a layer of PBS (pH 7.4), washed, and subcultured with 0.25% trypsin and 2.56 mmol / L EDTA. Medium was changed every two days.

상기 배양한 세포는 50,000 cells/well의 밀도로 24 well-plate에 분주하여, 24시간 배양하였다. 상기 24시간 배양한 뒤, 1% charcoal stripped FBS가 포함된 serum-deprivation medium(SDM)으로 24시간동안 serum deprivation하였다. 24시간 경과 후, 배지를 아무런 처리를 하지 않은 대조군과 LPS 및 다양한 농도의 상기 실시예 2의 HC-12를 포함하는 SDM으로 교환한 후, 24시간에 MTT 분석(MTT assay) 방법으로 살아있는 세포의 수를 측정하였다.The cultured cells were aliquoted into 24 well-plates at a density of 50,000 cells / well and incubated for 24 hours. After 24 hours of incubation, serum deprivation was performed with serum-deprivation medium (SDM) containing 1% charcoal stripped FBS for 24 hours. After 24 hours, the medium was exchanged with the SDM containing the LPS and the various concentrations of the HC-12 of Example 2 above with the untreated control group, and then, after 24 hours, the MTT assay (MTT assay) of the living cells The number was measured.

상기 MTT 분석이란 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리움을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포르마잔 크리스탈로 환원시키는 세포내 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다.The MTT assay is a test method that utilizes the ability of intracellular mitochondria to reduce MTT tetrazolium, a yellow water-soluble substrate, to a water-soluble MTT formazan crystal with a blue violet color by dehydrogenase action.

상기 HC-12를 녹이기 위한 용매로는 세포 생존에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 확인된 DMSO를 사용하였다. 상기 MTT 분석을 위하여, 각 시간대 별로 세포배양 배지를 제거한 후 MTT를 1 mg/mL 포함하는 DMEM/F12 배지를 웰 당 1 mL씩 처리하고, 37℃ 습윤한 CO₂배양기에서 3시간 더 배양하였다. 이후 배지를 제거한 후, 0.5 mL 이소프로판올을 첨가하여 포르마잔 크리스탈을 용해시키고, 마이크로 플레이트리더(BIO-RAD)에서 570 ㎚파장으로 흡광도를 측정하여 세포생존율을 확인하였다. 24시간 동안 HC-12로 처리한 상기 결과를 도 1에 나타내었다.As a solvent for dissolving the HC-12, DMSO was confirmed to have little effect on cell survival. For the MTT assay, cell culture medium was removed at each time period, and then treated with 1 mL / well of DMEM / F12 medium containing 1 mg / mL of MTT, and further incubated for 3 hours in a 37 ° C. wet CO 2 incubator. After removing the medium, 0.5 mL isopropanol was added to dissolve the formazan crystal, and the cell viability was confirmed by measuring the absorbance at 570 nm wavelength in a micro plate reader (BIO-RAD). The results of treatment with HC-12 for 24 hours are shown in FIG. 1.

상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 24시간을 처리한 경우에도, 아무런 시료를 처리하지 않은 대조예와 LPS와 함께 제조된 HC-12을 다양한 농도로 처리한 경우 모두 세포의 증식에 별다른 영향을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, HC-12은 100 μmol/L까지는 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.
As shown in FIG. 1, even when treated for 24 hours, the control without any sample and the treatment of HC-12 prepared with LPS at various concentrations showed no significant effect on cell proliferation. It was confirmed. Thus, HC-12 was found to be cytotoxic up to 100 μmol / L.

실시예Example 3-2. 항염 효과 측정 - 3-2. Anti-inflammatory Effect Measurement- NONO 분비량 측정 Secretion measurement

상기 실시예 2에서 제조된 HC-12의 항염 효과를 측정하기 위하여, 상기 실시예 3-1의 RAW264.7 세포를 이용하였다. 상기 RAW264.7 세포의 배양에 필요한 배지 및 배양 방법은 상기 실시예 3-1에 기재된 사항에 의하였다.In order to measure the anti-inflammatory effect of HC-12 prepared in Example 2, RAW264.7 cells of Example 3-1 were used. The medium and the culturing method necessary for culturing the RAW264.7 cells were based on the details described in Example 3-1.

보다 구체적으로, 상기 항염 효과의 측정은 상기 RAW264.7 세포에 HC-12와 LPS를 함께 첨가한 후, 상기 실시예 3-1의 방법으로 24시간 배양한 뒤, 상기 24시간 배양한 후의 배양액을 수집하여, NO의 분비량을 Griess reagent system(Promega, USA)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 Griess reagent system을 이용한 측정법은 보다 상세하게는 상기 시스템의 제조사인 Promega에서 제공한 실험방법(protocol)에 의하였고, 상기 수집된 세포배양액에 Sulfanilamide solution을 먼저 넣고, NED solution을 넣은 후에, microplate reader를 이용하여 540nm에서 측정하는 방법으로 수행하였다.More specifically, the anti-inflammatory effect is measured by adding HC-12 and LPS together to the RAW264.7 cells, followed by culturing for 24 hours by the method of Example 3-1, and then culturing the culture solution after culturing for 24 hours. Collected, the amount of NO secretion was measured using a Griess reagent system (Promega, USA), the results are shown in FIG. More specifically, the measurement method using the Griess reagent system was based on an experimental method provided by Promega, a manufacturer of the system, a Sulfanilamide solution was added to the collected cell culture solution, and then a NED solution was added thereto. It was carried out by measuring at 540nm using.

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, LPS를 첨가하지 않은 대조군에 비하여 LPS를 첨가한 경우에 NO의 분비량이 현저하게 증가되는 것이 확인되었다. 이러한 결과에 의해 LPS의 첨가는 RAW264.7 세포에서 염증 반응을 유도하여 NO의 분비량을 현저하게 증가시키는 것으로 예상되었다. 한편, 상기 실시예 2에서 제조된 HC-12를 첨가시키는 경우 농도의존적으로 NO 분비량이 감소되었으며, HC-12를 세포 안전성이 확인된 100 μmol/L의 절반에 해당하는 50 μmol/L 첨가한 경우에는 HC-12 무첨가군에 비하여 약 40% 정도의 NO 함량이 측정되어 NO 분비의 억제를 통한 매우 우수한 항염 효과가 있는 것으로 확인되었다.
As shown in FIG. 2, it was confirmed that the secretion amount of NO was significantly increased when LPS was added as compared to the control group without LPS. From these results, the addition of LPS was expected to induce an inflammatory response in RAW264.7 cells to significantly increase the amount of NO secreted. On the other hand, when adding the HC-12 prepared in Example 2 concentration-dependent NO secretion was reduced, when the HC-12 added 50 μmol / L corresponding to half of the 100 μmol / L cell safety confirmed Compared to the HC-12 no addition group, about 40% of NO content was measured, and it was confirmed that there was a very good anti-inflammatory effect through inhibition of NO secretion.

실시예Example 4: 4: HCHC -12의 허혈 조건에서의 In ischemic condition of -12 NFNF -- kBkB 발현 억제 효과 Expression inhibitory effect

상기 제조방법으로부터 얻어진 목적 화합물인 HC-12의 생물학적 효능, 구체적으로 허혈 조건에서의 NF-κB 발현 억제 효능을 확인하였다.
The biological effect of HC-12, the target compound obtained from the preparation method, specifically, the effect of inhibiting NF-κB expression in ischemic conditions was confirmed.

실시예Example 4-1. 실험동물의 사육 4-1. Breeding of Experimental Animals

체중 65 내지 75g의 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus, Halan, USA) 40 마리를 오전 7시부터 오후 7시까지 빛을 가하는 일정한 명암주기 조건, 21℃ 내지 25℃의 온도 조건 및 45% 내지 65%의 상대습도 조건에서 사육하였다. 실험동물의 사료는 일반적인 펠렛 건조 사료(대한실험동물, 대한민국)를 사용하였고, 사료와 물은 상시로 섭취할 수 있게 하였다.
40 male Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus (Halan, USA), weighing between 65 and 75 grams, with constant contrast cycle conditions of light from 7 am to 7 pm, temperature conditions from 21 ° C. to 25 ° C., and 45% to It was bred at 65% relative humidity. For the feed of the experimental animals, general pellet dry feed (Korean experimental animals, Korea) was used, and the feed and water were always available.

실시예Example 4-2. 4-2. HCHC -12의 -12 NFNF -- kappaBkappaB 발현 억제 효과 측정 Expression inhibition effect measurement

상기 실시예 2에서 수득한 HC-12의 NF-κB 발현 억제능을 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1에서 사육한 실험동물을 마취시켜 온목동맥(common carotid artery)을 노출 후 결찰하여 뇌허혈을 유발시킨 후 동물의 해마조직을 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색법으로 염색하여 관찰하는 방법의 실험을 수행하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다.In order to confirm the NF-κB expression inhibitory ability of HC-12 obtained in Example 2, anesthetized the experimental animals bred in Example 4-1 and ligation after exposure to the common carotid artery to induce cerebral ischemia. After the experiment, the hippocampal tissues of the animals were stained by immunohistochemistry (immunohistochemistry) staining. The specific method is as follows.

우선, 상기 실험동물에 HC-12를 체중 1kg당 20mg 또는 40mg이 되도록 함량을 조절하여 증류수 500ul에 녹인 후, 이것을 수술 전 3일간 복강투여 하였다. 수술 당일에는 수술 30분 전에 HC-12를 동일한 용량 및 방법으로 투여하였다. 상기 실험동물의 전신마취는 질소와 산소가 7 : 3으로 혼합된 가스에 3% 이소플루란(isoflurane , Baxtor, USA)을 혼합한 가스를 이용하여 수행하였다.First, after adjusting the content of the HC-12 to 20mg or 40mg per kg body weight dissolved in 500ul of distilled water, it was intraperitoneally administered for 3 days before surgery. On the day of surgery, HC-12 was administered at the same dose and method 30 minutes prior to surgery. General anesthesia of the experimental animals was performed using a gas mixed with 3% isoflurane (isoflurane, Baxtor, USA) in a gas mixture of nitrogen and oxygen 7: 3.

상기의 질소와 산소 혼합가스에 3% 이소플루란을 혼합한 가스를 이용하여 실험동물의 마취상태를 유지하면서 실험동물에 대한 수술을 수행하였다. 상기 실험동물에 대한 수술은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.Surgery was performed on the experimental animals while maintaining the anesthesia state of the experimental animals using the gas of 3% isoflurane mixed with the nitrogen and oxygen mixed gas. Surgery for the experimental animals was performed in the following manner.

우선, 목 부위의 털을 깎고 소독한 다음, 상기 소독한 부위를 절개하여 양쪽 온목동맥을 노출시켰다. 상기 노출된 온목동맥을 동맥류 클립(aneurysm clip, Staelting, USA)을 이용하여 5분 동안 결찰하여 뇌허혈을 일으킨 후, 클립을 제거하여 재관류시키는 방법으로 수행하였다. 이 때, 각 실험군은 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 망막중심동맥(central artery of retina)의 혈액 순환 유무를 관찰함으로써, 완전한 온목동맥의 폐쇄여부를 확인하였다. 상기 뇌허혈을 유발시키는 동안 직장 내 체온계를 삽입하여 체온을 측정하였으며, 실험동물의 온도에 따라 자동으로 조절되는 온열 패드를 사용하여 체온을 정상 체온인 36.5℃ 내지 37.5℃로 일정하게 유지시켰다.First, the hair on the neck was cut and disinfected, and then the disinfected area was cut to expose both warm arteries. The exposed carotid artery was ligated for 5 minutes using an aneurysm clip (aneurysm clip, Staelting, USA) to cause cerebral ischemia, and then the clip was removed and reperfused. At this time, each experimental group confirmed the complete occlusion of the entire artery by observing the blood circulation of the central artery of retina using an ophthalmoscope. The body temperature was measured by inserting a rectal thermometer during the induction of the cerebral ischemia, and the body temperature was constantly maintained at a normal body temperature of 36.5 ° C. to 37.5 ° C. using a thermal pad automatically adjusted according to the temperature of the experimental animal.

대조군에 대한 실험은 HC-12를 녹이는데 이용된 증류수만을 투여한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 수행하였으며, 정상군에 대해서는 허혈-재관류 수술을 시행하지 아니하였을 뿐만 아니라 HC-12를 비롯한 어떠한 물질도 투여하지 않았다.Experiments on the control group were performed in the same manner as above except that only distilled water used to dissolve HC-12 was used. The normal group was not subjected to ischemia-reperfusion surgery, No substance was administered.

상기 실험 동물은 뇌허혈 유발 4일 후에 티오펜탈 소듐(thiopental sodium, 유한양행, 한국)을 체중 1㎏ 당 각각 30㎎ 의 용량으로 복강 내 주사하여 마취시킨 다음, 1,000㎖ 당 헤파린 1,000 IU를 함유한 4℃의 생리식염수를 좌심실로 주입하여 관류 세척하였다. 상기 관류 세척이 완료된 상기 동물에 대해 4℃의 4% 파라포름알데하이드(in 0.1M 인산완충액(PB), pH 7.4)를 이용하여 관류고정을 수행하였다.The experimental animals were anesthetized by intraperitoneal injection of thiopental sodium at 30 mg / kg body weight 4 days after induction of cerebral ischemia, and then containing 1,000 IU of heparin per 1,000 ml. Physiological saline at 4 ° C. was injected into the left ventricle and washed perfusion. Perfusion fixation was performed using 4% paraformaldehyde (in 0.1 M phosphate buffer (PB), pH 7.4) at 4 ° C. on the animals after the perfusion wash was completed.

상기 관류 고정이 끝난 실험동물의 머리뼈 공간을 뼈절단기를 이용하여 열고, 뇌를 적출하였다. 상기 적출된 실험동물의 뇌를 4℃의 4% 파라포름알데하이드(in 0.1M 인산완충액(PB), pH 7.4)를 이용하여 4시간 동안 후고정하였다. 상기 후고정이 끝난 뇌는 30% 수크로스 용액(in 0.1M 인산 완충액(PB), pH 7.4)에 넣어 바닥에 가라앉을 때까지 침강시킨 후, 상기 침강시킨 뇌의 조직을 슬라이드 마이크로톰(sliding microtome, Reichert-Jung, 독일)으로 30㎛ 두께로 잘라 조직절편을 만들었다. 상기의 조직절편을 보존액(storing solution)이 들어있는 6웰 플레이트에 넣어 염색을 수행할 때까지 4℃에서 보관하였다.The head bone space of the perfusion-fixed experimental animal was opened using a bone cutter, and the brain was extracted. The brains of the extracted experimental animals were post-fixed for 4 hours using 4% 4% paraformaldehyde (in 0.1 M phosphate buffer (PB), pH 7.4) at 4 ° C. The post-fixed brain is settled in a 30% sucrose solution (in 0.1M phosphate buffer (PB), pH 7.4) until it sinks to the bottom, and then the tissue of the settled brain is slide microtome (sliding microtome, Reichert-Jung, Germany) was cut into 30㎛ thickness to make a tissue section. The tissue sections were stored in 6-well plates containing a storage solution and stored at 4 ° C. until staining was performed.

상기 조직절편 중에서 해마형성체(hippocampal formation)가 잘 나와 있는 조직을 선택하고, 조직절편에 묻어있는 보존액을 없애기 위해 0.01M PBS로 10분씩 3회 세척하였다. 상기의 세척된 조직절편을 젤라틴을 입힌 슬라이드에 도말하여 37℃에서 충분히 건조시켰다. 충분히 건조시킨 상기 조직절편을 증류수에 잠시 담가 둔 후, 2% 크레실 바이오렛 아세테이트(cresyl violet acetate, Sigma, USA) 용액에 1분간 담가 조직절편의 염색을 수행하였다. 상기의 염색한 조직절편을 흐르는 물에 충분히 세척하여 슬라이드에 묻어 있는 과량의 염료를 제거하였다. 상기 과량의 염료를 제거한 조직절편을 증류수에 잠시 담근 후에 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100% 에탄올 용액으로 처리하여 탈수 및 과량의 크레실 바이올렛 세척을 수행하였다. 상기 조직절편에서 니슬소체(Nissle body)가 보이는 것을 확인한 후, 자일렌(Junsei, Japan)에 담가 투명화한 다음, 카나다 발삼(Canada Balsam, Kanto, 일본)으로 봉입하였다.Among the tissue sections, tissues with well-formed hippocampal formation were selected, and washed three times with 0.01 M PBS for 10 minutes to remove the preservatives from the tissue sections. The washed tissue sections were plated on gelatinized slides and dried sufficiently at 37 ° C. After sufficiently drying the tissue sections in distilled water, the tissue sections were stained for 1 minute in 2% cresyl violet acetate (Sigma, USA) solution. The stained tissue sections were sufficiently washed with running water to remove excess dye from the slides. The tissue sections from which the excess dye was removed were briefly immersed in distilled water and then treated with 50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100% ethanol solution to perform dehydration and excess cresyl violet washing. After confirming that the tissue section was visible in the Nissle body (Nissle body), it was immersed in xylene (Junsei, Japan) and made transparent, and then encapsulated in Canada Balsam (Kanto, Japan).

상기 봉입시킨 조직절편은 조직에 존재하는 내인성 페록시다아제(peroxidase)를 제거하기 위하여 0.3% H₂O₂(in 0.001M PBS)와 30분 동안 반응시켰다. 비특이적인 면역반응을 방지하기 위하여, 상기 반응된 조직절편을 3%의 정상 염소 혈청으로 30분간 반응시켰다. 상기 3%의 정상 염소 혈청과 반응한 조직절편과 1:00으로 희석한 1차 항체인 토끼 항-NF-κB (Vector, CA, USA)를 4℃에서 48시간 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 조직절편은 각각 1:200으로 희석한 2차 항체인 항 마우스 IgG(Vector)로 상온에서 2시간 반응시킨 후, 1:200으로 희석한 3차 항체인 ABC용액(Vector)으로 2시간 반응시켰으며, 3,3'-DAB(diaminobezidine)를 기질로 발색하였다. 상기 항체와 반응시키는 과정의 각 단계를 수행함에 있어서, 각 단계 별로 상기 조직절편을 0.01M PBS를 사용하여 10분씩 3회 세척하였다.The enclosed tissue sections were reacted with 0.3% H ₂ O ₂ (in 0.001 M PBS) for 30 minutes to remove endogenous peroxidase present in the tissue. To prevent nonspecific immune responses, the reacted tissue sections were reacted with 3% normal goat serum for 30 minutes. Tissue sections reacted with 3% normal goat serum and rabbit anti-NF-κB (Vector, CA, USA), a primary antibody diluted to 1:00, were reacted at 4 ° C. for 48 hours. After the reaction, the tissue sections were reacted with anti-mouse IgG (Vector), a secondary antibody diluted 1: 200, at room temperature for 2 hours, and then, with a ABC solution (Vector), a third antibody diluted 1: 200. The reaction was carried out for 3 hours, and 3,3'-DAB (diaminobezidine) was developed as a substrate. In performing each step of the reaction with the antibody, the tissue sections were washed three times for 10 minutes using 0.01M PBS for each step.

상기 3차 반응이 끝난 조직절편을 젤라틴 코팅된 슬라이드 글라스에 도말한 후, 실온에서 12시간 동안 건조하였고, 상기 건조된 조직절편은 통상적인 탈수투명화 과정을 거쳐 봉입하였다. 상기 봉입한 조직절편을 디지털 카메라(Axiocam, Cal Zeiss, 독일)가 부착되어 있는 악시오엠1 현미경(AxioM1 microscope, Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 관찰하였으며, 그 관찰결과를 촬영한 사진을 도 3에 나타내었다.After the tertiary reaction, the tissue sections were plated on a gelatin-coated slide glass, and dried at room temperature for 12 hours, and the dried tissue sections were enclosed through a conventional dehydration and transparency process. The encapsulated tissue sections were observed using an AxioM1 microscope (AxioM1 microscope, Carl Zeiss, Germany) attached with a digital camera (Axiocam, Cal Zeiss, Germany). Indicated.

상기 사진은 상기 현미경에 부착된 카메라를 통해 촬영하였고, 상기 관찰결과는 정상군, 대조군과 20mg/kg 또는 40mg/kg HC-12를 투여한 실험군으로 구분하여 도 3에 나타내었다. 상기 사진 촬영은 CA1 영역을 200배로 각각 확대하여 수행하였다. 상기 도 3의 A는 정상군, B는 대조군, C 및 D는 20mg/kg HC-12 투여군 및 40mg/kg HC-12를 투여한 것이며, 상기 사진은 해마의 CA1 영역을 나타낸 것으로 유의성의 검증을 위하여, 각 군 중에서 가장 일반적인 부분을 골라 촬영하였다.The photograph was taken through a camera attached to the microscope, the observation results are shown in Figure 3 divided into the normal group, the control group and the experimental group administered 20mg / kg or 40mg / kg HC-12. The photographing was performed by enlarging the CA1 area by 200 times. 3A is a normal group, B is a control group, C and D is a 20mg / kg HC-12 administration group and 40mg / kg HC-12 administration, the picture shows the CA1 region of the hippocampus to verify the significance For this purpose, the most common part of each group was taken and photographed.

또한, 상기 효능에 대한 평가를 정량적으로 분석하기 위하여, 이미지 분석기(Optimas 6.5, USA) 프로그램을 이용하여 면역조직화학 염색법으로 염색된 상기 조직절편의 신경세포를 계수하였다. 각 군에 대한 유의성의 검증을 위하여 일원분산분석(one-way ANOVA test)을 수행하였으며, 각 데이터, 구체적으로 조직절편의 신경세포를 계수한 결과의 평균값을 도 4에 나타내었다.In addition, in order to quantitatively analyze the evaluation of the efficacy, neurons of the tissue sections stained by immunohistochemical staining were counted using an image analyzer (Optimas 6.5, USA) program. One-way ANOVA test was performed to verify the significance of each group, and the average value of each data, specifically, the results of counting nerve cells of the tissue sections, is shown in FIG. 4.

상기 도 4는 상기 계수된 결과를 정상군에 대한 상대값(정상군을 100%로 설정하였을 때의 비교값)으로 구하여, 그 결과를 나타낸 그래프이다.4 is a graph showing the result of calculating the counted result as a relative value (comparison value when the normal group is set to 100%) with respect to the normal group.

상기 도 3 및 상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 정상군에서는 NF-κB의 발현이 거의 없었으나(도 3A 및 도 4), 대조군에서는 NF-κB의 발현이 급격히 증가하여 신경염증이 유발되었음이 확인되었다(도 3B 및 도 4). 또한, 본 발명의 HC-12를 투여한 실험군의 경우, 정상군과 거의 유사한 정도의 NF-κB의 발현량이 측정되어, 허혈에 의한 NF-κB의 추가발현이 없는 것으로 확인되었으며, 대조군에 비해 현저한 NF-κB의 발현 감소량이 측정되어, 상기 HC-12는 뇌허혈에 의한 신경염증을 억제 시킬 수 있으며, 상기 신경염증에 의한 추가적인 질환의 발생 및 질환의 심화를 효과적으로 저지할 수 있는 것으로 확인되였다 (도 3C, D 및 도 4).As shown in FIG. 3 and FIG. 4, in the normal group, there was almost no expression of NF-κB (FIGS. 3A and 4), but in the control group, the expression of NF-κB was rapidly increased to confirm that neuritis was induced. (FIG. 3B and FIG. 4). In addition, in the experimental group to which the HC-12 of the present invention was administered, the expression level of NF-κB was measured to be almost similar to that of the normal group, and it was confirmed that there was no further expression of NF-κB due to ischemia. The decrease in the expression of NF-κB was measured, and it was confirmed that the HC-12 can suppress neuroinflammation caused by cerebral ischemia, and can effectively prevent the occurrence and further deepening of the disease caused by the neuroinflammation (FIG. 3C, D and FIG. 4).

Claims

하기 화학식 2의 구조를 갖는 데커시놀 유도체(decursinol derivative) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 항염용 약학 조성물.
[화학식 2]

Decursinol derivative having a structure of Formula 2 (Decursinol derivative) or a pharmaceutical composition for anti-inflammatory comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
(2)

하기 화학식 2의 구조를 갖는 데커시놀 유도체(decursinol derivative) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 천식, 다발성 골수종 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 2]

A pharmaceutical composition for preventing or treating any one or more diseases selected from the group consisting of asthma, multiple myeloma, and cancer comprising a decursinol derivative having the structure of Formula 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. .
(2)

하기 화학식 2의 구조를 갖는 데커시놀 유도체(decursinol derivative) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 다발성 골수종의 예방 또는 치료용 약학 조성물
[화학식 2]

A pharmaceutical composition for preventing or treating multiple myeloma comprising a decursinol derivative having the structure of Formula 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
(2)

하기 화학식 2의 구조를 갖는 데커시놀 유도체(decursinol derivative) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물
[화학식 2]

A pharmaceutical composition for preventing or treating rheumatoid arthritis, comprising a decursinol derivative having the structure of Formula 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
(2)