KR101211957B1 - 유채 유래 종자 특이 발현 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유채 종자 특이 프로모터에 관한 것으로, 유채 식물의 종자에서만 프로모터의 하류에 위치한 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 및 상기 프로모터를 이용한 목적 단백질을 식물 종자에 다량 축적시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 식물 종자 특이성을 갖는 프로모터는 목적 단백질을 식물 종자에 특이적으로 발현시키는 용도로 사용할 수 있어, 의약적인 용도 또는 생리활성을 갖는 유용 단백질을 식물 종자에 과량 함유시킬 수 있을 뿐만 아니라, 지방산 개량 식물 품종을 육성하여 종자 기름을 산업적으로 이용할 수 있으며, 유채를 포함하는 종자식물의 생산성을 개선시킬 수 있다.

Description

유채 유래 종자 특이 발현 프로모터 및 이의 용도{The promoter from Brassica napus and method for using thereof}
본 발명은 유채 유래 종자 특이 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 유채 유래 종자 특이 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물 및 상기 프로모터를 이용하여 식물체의 형질전환 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
유채(Brassica napus)는 십자화과의 식물로서, 국내에서는 주로 남쪽 지방에서 재배되는데, 일반적으로 가을에 파종하고 이듬해 봄에 개화 및 결실을 이루며, 잎의 수확은 늦겨울 내지 초봄에 이루어지고 씨앗은 초여름에 수확이 이루어진다. 유채의 씨앗으로부터 추출하는 채종유(카놀라유)는 식용으로 널리 사용되고 있으며, 유채의 잎은 나물로서 요리에 사용된다.
프로모터(promoter)는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다.
식물의 형질전환시 사용되는 프로모터들은, 대체로 식물의 전체 조직 또는 세포에서 주로 발현되는 프로모터들이다. 이러한 프로모터들은 조직-선택성 또는 기관-선택성이 결여되어 있어, 형질전환시킨 선별마커 등이 전체 식물에서 발현됨으로써 식물체 생장을 지연시키는 결과를 초래한다. 또한 프로모터의 특성상 도입한 유전자의 발현을 목적하는 기관에 국한되어 충분히 발현시키지 못하므로 형질전환체의 경제성이 떨어지게 된다. 그러나, 현재 기관 특이적인 특성을 갖는 식물에서 분리된 프로모터에 대한 연구는 미비한 실정이다.
식물 조직 특이적 또는 기관 특이적 발현에 관여하는 것으로 보고된 프로모터로는, 한국 공개특허공보 제 2001-41129호의 옥수수 화분 특이 프로모터인 ZmC5 유전자의 프로모터가 있으며, 한국 공개특허공보 제 2001-66718호의 식물 공변세포 특이적 유전자 발현성을 갖는 아라비돕시스에서 분리된 트레할레이즈 유전자의 프로모터가 있으며, 한국 공개특허공보 제 2001-106119호의 벼의 꽃밥 및 화분 특이성을 갖는 카타라제A(CatA) 유전자의 프로모터가 있으며, 한국 공개특허공보 제2002-57950호의 아마 종자 특이성을 갖는 올레오신 유전자의 프로모터 및 레구민-유사 종자 저장 단백질의 프로모터가 있으며, 한국 공개특허공보 제 2002-93028호의 수박의 종피 특이성을 갖는 Cv20oxP 프로모터가 있으며, 한국 공개특허공보 제 2004-41483호의 참깨에서 유래된 식물체 종자 특이성을 갖는 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자의 프로모터가 있다.
본 발명은 유채 종자 특이 프로모터에 관한 것으로, 유채 식물의 종자에서만 프로모터의 하류에 위치한 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 및 상기 프로모터를 이용한 목적 단백질을 식물 종자에 다량 축적시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 식물 유전자 형질전환을 위한 유채 종자 특이 프로모터를 제공하며, 더욱 구체적으로 서열번호 1 의 염기 서열을 갖는 유채 종자 특이 프로모터를 제공한다.
본 발명은 유채 유래의 특정 프로모터에 관한 것으로서, 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1의 12S globulin 유전자의 프로모터이다.
또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1 의 염기 서열과 각각 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이거나, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 재조합 식물 발현 벡터의 일례로서, 실시예에 사용된 pBGWSF7.0 벡터를 예를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 개시된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.
본 발명의 한 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 식물 발현 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류(downstream)에 목적 유전자를 작동가능하게 연결시켜 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.
상기 목적 유전자는, 모든 종류의 유전자일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있는 단백질을 암호화하거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질을 암호화라는 유전자 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 목적 유전자는 재조합 식물 발현 벡터가 도입되는 숙주에 존재하는 유전자이거나 외래 유전자 일 수 있다.
본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 목적 유전자는 지방산 유도체 유전자 일 수 있으며, 예컨대, 목적 유전자는 아실-CoA 신타아제, 티오에스테라아제, 에스테르 신타아제, 알콜 아실트랜스퍼라아제, 알콜 데하이드로게나아제, 아실-CoA 리덕타아제 및 지방-알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제를 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 목적 유전자의 도입시, 지방산 유도체가 발현되어 종자의 지방산 함량이 증가되며, 이에 상기 종자로부터 다량의 식물성 오일 또는 식물성 왁스를 수득할 수 있으며, 이는 화장품 또는 의약에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 식물 종자에서 목적 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 또는 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al. 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다. 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환 식물은 오일 생산에 사용될 수 있다. 유채 종자 기름은 바이오디젤 원료로 사용될 수 있으며, 또한 식용유 및 화장품 원료 등으로 사용될 수 있다.
본 발명은 식물 종자에서 특이적으로 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 제공한다. 본 발명의 식물 종자 특이성을 갖는 프로모터는 목적 단백질을 식물 종자에 특이적으로 발현시키는 용도로 사용할 수 있어, 의약적인 용도 또는 생리활성을 갖는 유용 단백질을 식물 종자에 과량 함유시킬 수 있을 뿐만 아니라, 지방산 개량 식물 품종을 육성하여 종자 기름을 산업적으로 이용할 수 있으며, 유채를 포함하는 종자식물의 생산성을 개선시킬 수 있다.
도 1은 Northern blot hybridization으로 12S globulin 유전자의 종자특이 발현을 나타낸다.
도 2는 Genome Walking method 이용 12S globulin 유전자의 프로모터 부위를 분리한 결과를 나타낸다.
도 3은 12S globulin 유전자의 프로모터 부위 염기서열 및 Motif 분석한 것을 나타낸다.
도 4는 12S globulin 유전자의 프로모터 부위의 최적화를 위한 Motif 위치에 따른 deletion analysis용 운반체 제작을 나타낸다.
도 5는 애기장대 형질전환체에서 12S globulin 유전자의 프로모터의 부위의 deletion analysis 기능검정을 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시 예 1: 12S globulin 유전자의 종자에서만 특이적으로 발현 확인
국내 육성 영산품종의 다양한 조직부위 (잎, 줄기, 뿌리, 꽃잎, 미숙종자)에서 전체 RNA를 분리하였다. 영산 유채 종자 RNA를 driver로, 영산 유채 잎 RNA를 테스터로하여 Subtractive cDNA 라이브러리를 제작한 후 자체 제작한 유채 300K DNA chip을 이용하여 종자에서 다량 발현되는 유전자군을 확보하였다. 이 중 가장 발현양이 높은 12S globulin 유전자의 일부 유전정보를 토대로 프라이머 (BnLS484_S: 5'-CAGTGCTGCAACGAGCTCCACCAGGAA-3', BnLS484_AS: 5'-AGGAGGGTCCAGGCATGGTCTTCTGGA-3'를 제작하여 PCR로 증폭하여 얻어진 226bp의 유전자산물을 pGEM T-easy vector로 옮겨 염기서열 분석한 결과, 12S globulin 유전자의 일부임을 확인하였다. 이렇게 얻어진 12S globulin 유전자 일부를 probe로 이용하여 일반적으로 널리 알려져 있는 방법에 의해 Northern blot hybridization을 한 결과, 종자에서만 특이적으로 발현됨을 알 수 있었다 (도 1). 참고적으로 모든 조직에 존재하는 필수 유전자인 18S 리보좀의 유전자를 probe로 이용하여 동일한 방법에 의해 Northern blot hybridization을 한 결과, 모든 조직에서 발현됨을 알 수 있었고, 발현양도 거의 비슷한 것으로 보아 사용된 전체 RNA가 정상적으로 잘 추출되었으며, 실험에 사용된 전체 RNA양도 거의 동량이었음을 알 수 있었다.
실시 예 2: 12S globulin 유전자의 프로모터 부위 염기서열 확인 및 Motif 분석
Genome Walking method(clontech 회사제품; GenomeWalker Universal Kit)를 이용하여 12S globulin 유전자의 프로모터 부위를 분리하였고 (도 2), 분리된 약 1.5kb 크기의 프로모터 부위를 pCR2.1-topo vector로 옮겨 시퀀싱하여 염기서열을 확인하였으며, PlantCARE database (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)을 이용하여 Cis-acting element의 Motif를 분석하였다 (도 3).
실시 예 3: Motif 분석에 따른 12S globulin 유전자의 프로모터 최적화를 위한 deletion analysis 용 식물형질전환 운반체 제작
12S globulin 유전자의 프로모터 부위의 최적화를 위해 5' 방향에서 Motif가 한 개씩 차례대로 제거된 프로모터 부위 8종 (1.5kb, 1.0kb, 0.75kb, 0.6kb, 0.45kb, 0.3kb, 0.2kb, 0.1kb) 을 디자인하였고(도 4 의 A), 이를 근거로 하여 12S globulin 유전자의 프로모터 부위를 PCR로 증폭시켜 GateWay vector system을 이용하여 GUS 유전자 앞에 위치하도록 식물형질전환용 운반체를 8종 제작하였다(도 4 의 B).
실시 예 4: 12S globulin 유전자의 프로모터 부위의 deletion analysis 기능검정
유채 유래 12S globulin 유전자의 프로모터 부위의 최적화를 알아보기 위해 제 4도에서와 같이 식물형질전환용 운반체 8종을 제작하여 애기장대에 형질전환한 결과, 1.5kb 크기(A)에서는 모든 조직에서 GUS가 염색되었고, 0.45kb 크기(B)의 프로모터에서는 종자에서만 GUS가 염색됨이 관찰된 반면, 0.35kb 크기(C)의 프로모터에서는 종피에서 GUS가 염색됨이 관찰되었고, 0.2kb 크기(D)의 프로모터에서는 모든 부위에서 GUS가 염색되지 않음을 관찰할 수 있었다(도 5).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 서열번호 1 의 염기 서열을 갖는 12S globulin 유전자의 프로모터.
  2. 제1항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터.
  4. 삭제
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  6. 삭제
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  8. 삭제
  9. 삭제
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