KR101208955B1

KR101208955B1 - 피페라진 다이티옥트산염 및 글리메피리드를 포함하는 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101208955B1
Application number: KR1020100051801A
Authority: KR
Inventors: 김경수; 신동성; 권혁진; 박영준; 조경석; 유기원; 이인숙; 노진형; 송현남; 김동연; 김준우
Original assignee: 주식회사 셀트리온제약; 주식회사 셀트리온화학연구소
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2012-12-06
Also published as: WO2011152658A3; KR20110132017A; WO2011152658A2

Abstract

본 발명은 신규 복합제인 피페라진 다이티옥트산염 및 글리메피리드를 포함하는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드를 함께 사용함으로써 혈당을 개선하는 효과 뿐만 아니라 당뇨환자의 근본적 대사장애 개선효과와 인슐린저항성 개선효과를 가지고, 특히 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드를 각각 단독으로 사용하거나 티옥트산염과 글리메피리드를 함께 사용할 때보다 세포에서 포도당 수송이 현저하게 증가되어 제2형 당뇨병의 치료에 강력한 시너지효과를 나타낸다.

Description

피페라진 다이티옥트산염 및 글리메피리드를 포함하는 약제학적 조성물 {Pharmaceutical composition comprising piperazine dithioctate and glimepiride}

본 발명은 피페라진 다이티옥트산염 및 글리메피리드를 포함하는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 제2형 당뇨병의 치료에 강력한 시너지 효과를 나타내는 신규 복합제인 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드를 포함하는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

제2형 당뇨병은 인슐린 비의존적 당뇨병으로 유전이나 자가면역질환이 아닌 생활습관 등에 기인한 질병이다. 이는 인슐린저항성, 베타세포부전에 의한 인슐린분비 결함, 간의 포도당 과잉생성에 기인한 것으로, 인슐린저항성과 인슐린분비 결함 중 한 가지가 주된 병인으로 작용하여 당대사 장애를 유발하고 이렇게 유발된 당대사 장애가 다른 한쪽의 이차적 기능이상을 유발하여 점차 당뇨병이 진행되는 것인지 두 가지 병인이 처음부터 공존하는지에 대해서는 아직 확실한 결론이 없다. 그러나 두 가지 병인 중 어느 한 가지만 존재하는 상태에서 제2형 당뇨병이 유발되는 극한 상황은 매우 드물며 대부분의 환자에서는 인슐린저항성 문제와 인슐린분비 결함이 공존하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 당뇨병을 효과적으로 치료하기 위해서는 인슐린의 분비를 촉진해 줄 뿐만 아니라 인슐린저항성을 함께 개선해 주어야 한다. 그리고 당뇨병의 경우 많은 후유증들이 환자에게 더욱 심각한 문제를 유발하고 있어 이러한 후유증도 함께 치료하거나 개선해야할 필요성이 있다.

그러나 현재까지 개발되어 있는 경구 혈당강하제는 각각의 기전이나 혈당상승의 원인에 대하여 부분적으로 효능을 나타낼 뿐 모든 요인들에 대해 효과를 나타내지는 못하기 때문에, 경구 혈당강하제 단일약물요법으로 혈당조절을 하는 데에는 한계가 있을 수 밖에 없다. 이러한 이유 때문에 당뇨병치료제의 경우 시너지효과를 나타낼 수 있는 두 가지 이상의 유효성분을 포함하는 복합제의 개발 필요성이 크게 증대되고 있다.

현재 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 글리메피리드는 인슐린 비의존성 당뇨병을 가진 환자들에게 가장 널리 사용되는 약물로써, 췌장에서의 인슐린 분비를 증가시켜 혈당을 감소시키는 역할을 하고 있다.

아마릴(AMARYL)이라는 상품명으로 시판되고 있는 글리메피리드는 췌장의 베타세포(β-cell)에서 인슐린의 분비를 자극하고, 간세포에서 당 신생을 저해하며, 췌장이외의 장기에 작용하여 말초 장기에서의 인슐린에 대한 감수성을 증가시키는 제2형 당뇨병치료제이다. 그러나 당뇨환자의 가장 큰 문제점인 인슐린 내성을 치료하지 못하여 표면적인 혈당의 수치만을 감소시키는 단점이 있다.

이러한 이유 때문에 글리메피리드와 함께 사용하여 단순히 혈당을 개선하는 효과뿐만이 아니라 당뇨환자의 근본적 대사장애 개선효과와 인슐린저항성 개선효과를 가짐으로써 제2형 당뇨병의 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있는 새로운 경구 혈당강하제의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

한편 티옥트산(알파-리포산, 6,8-다이티옥트산)은 피루베이트-디하이드로게나제(pyruvate-dehydrogenase) 복합체, 알파-케토글루타레이트-디하이드로게나제(alpha-ketoglutarate-dehydrogenase) 복합체 및 아미노산 하이드로게나제(amino acid hydrogenase) 복합체에서 조효소로 작용하는 생리활성물질로 항산화제 및 당뇨병성 다발성 신경염의 예방 또는 치료를 위한 약제로 사용되고 있다. 하기 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 티옥트산은 자유라디칼 포획작용과 지질과산화 억제작용을 통해 산화성 스트레스를 감소시키고, 고혈당에 의한 단백당화를 감소시킬 뿐만 아니라 포도당 이용률 개선을 통해 신경세포의 ATP 에너지 생성을 정상화하고, 신경의 전기전도도를 개선하는 약리작용을 가지고 있다.

이러한 티옥트산은 비만 또는 비만과 관련된 질환의 치료에 유용하게 사용되거나(국제특허공개 제2007-063095호 및 미국특허등록 제5650429호), 인슐린저항성(insulin resistance)을 개선하거나(미국특허등록 제6284787호), 간경변증이나 지방간을 개선하거나(미국특허등록 제5728735호), 편두통의 치료에 사용될 수 있는 것으로 보고되어 있다(미국특허등록 제6251935호).

그러나 티옥트산은 열에 대한 안정성이 떨어지고, 수용액에 대한 용해도가 낮아 약학적 제형으로 개발하는데 많은 어려움이 따르고 있다. 티옥트산 라세미형의 녹는점은 58 ~ 61 ℃이고, 티옥트산 이성질체의 녹는점은 이 보다 더 낮은 47 ~ 49 ℃인데, 이들은 융해시 빠르게 고분자화되어 활성을 상실하는 문제점이 있다. 또한 티옥트산이 액제로 제조되어 경구로 투여되는 경우에는 환자의 식도에 자극을 주는 문제점이 보고되고 있다.

따라서 티옥트산이 가지고 있는 당뇨병성 다발성 신경염을 완화시키고 인슐린저항성을 개선하며 당뇨병성 지방간을 회복시키는 효능에도 불구하고, 티옥트산과 글리메피리드를 복합제로 사용하거나 사용할 가능성에 대해 보고된 예는 전혀 없다.

본 발명자들은 글리메피리드와 함께 사용하여 단순히 혈당을 개선하는 효과뿐만이 아니라 당뇨환자의 근본적 대사장애 개선효과와 인슐린저항성 개선효과를 가짐으로써 제2형 당뇨병의 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있는 새로운 경구 혈당강하제를 개발하고자 예의 연구 검토한 결과, 놀랍게도 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드를 함께 사용할 경우 세포에서 포도당 수송이 현저하게 증가되어 제2형 당뇨병의 치료에 시너지효과를 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 피페라진 다이티옥트산염 및 글리메피리드를 포함하는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 신규 복합제인 피페라진 다이티옥트산염 및 글리메피리드를 포함하는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하는 피페라진 다이티옥트산염은 본 발명자들에 의해 개발되어 대한민국 특허출원 제2009-0056337호로 출원된 하기 화학식 (Ⅲ)으로 표시되는 티옥트산의 염기성 부가염으로서, 열과 수분에 대한 높은 안정성과 수용액에 대한 높은 용해도를 가지면서도, 염기의 부가로 인한 투여량의 증가가 작은 특성을 가지고 있다.

상기한 피페라진 다이티옥트산염에서 사용된 티옥트산은 라세미형의 티옥트산뿐만 아니라 R-(+)-티옥트산과 S-(-)-티옥트산과 같은 광학 활성을 갖는 티옥트산을 포함한다.

티옥트산이 라세미형인 경우, 본 발명의 피페라진 다이티옥트산염은 바람직하게는 X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 13.9±0.2, 16.3±0.2, 17.1±0.2, 17.3±0.2, 18.2±0.2, 18.9±0.2, 20.5±0.2, 22.2±0.2, 22.8±0.2, 24.2±0.2, 39.3±0.2 인 것을 특징으로 한다.

한편 티옥트산이 R-(+)-티옥트산인 경우, 본 발명의 피페라진 다이티옥트산염은 바람직하게는 X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 14.0±0.2, 19.1±0.2, 20.6±0.2, 22.2±0.2, 22.7±0.2 인 것을 특징으로 한다.

상기한 피페라진 다이티옥트산염은 종래의 티옥트산이나 그의 다른 염기성 부가염들에서 야기되는 열과 수분에 대한 불안정성과 용해도의 문제를 해결하였을 뿐만 아니라, 가장 안전한 유기염기 중 하나인 피페라진을 사용함으로써 약학적으로 매우 유리한 장점을 가진다. 특히 당뇨병용제와 같이 환자들이 장기간 경구 투여해야 하는 약물들은 환자들이 복용하기 전에 유통과 보관의 과정에서 오랜 시간이 소요될 수 있기 때문에, 이와 같이 열과 수분에 대한 높은 안정성을 가지는 피페라진 다이티옥트산염은 약제학적 조성물을 제조하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한 피페라진 다이티옥트산염 라세미형의 녹는점과 피페라진 다이티옥트산염 이성질체의 녹는점은 각기 105 ~ 106 ℃와 103 ~ 104 ℃로 티옥트산의 녹는점보다 훨씬 높기 때문에, 이들을 정제로 제형화하는 과정에서 활성성분이 융해되어 활성을 상실하는 문제점을 해소할 수 있다.

또한, 상기한 피페라진 다이티옥트산염에서 사용된 피페라진은 LD₅₀(랫트에 경구투여시 50% 치사량)의 값이 1,900 mg/Kg으로 매우 안전할 뿐만 아니라(Handbook of Pharmaceutical Salts, p321 (2008)), 분자량도 86.14 g/mol로서 상대적으로 작기 때문에 염기성 부가염의 제조에 매우 유리한 유기염기이다. 특히 본 발명에서 사용하는 피페라진 다이티옥트산염은 피페라진 1 분자에 티옥트산 2 분자가 염을 형성하므로 염기의 부가로 인한 투여량의 증가가 20.9%에 불과하여 고용량의 투여가 필요한 약제학적 조성물에 있어 매우 큰 장점을 가진다.

본 발명에 따른 피페라진 다이티옥트산염 및 글리메피리드를 포함하는 약제학적 조성물에 대해 근육세포(L6 세포)에서의 포도당 수송(glucose uptake)을 시험한 결과, 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드의 강력한 시너지효과를 확인할 수 있었다. 특히 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드의 병용투여 결과는 티옥트산과 글리메피리드의 병용투여 결과보다 월등히 우수한 효능을 보여주었다.

본 발명의 약제학적 조성물은 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드이외에 또 다른 생리활성물질을 함께 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 피페라진 다이티옥트산염 및 글리메피리드를 각각 단독으로 개개의 단위 투여형태로 또는 혼합하여 1 개의 단위 투여형태로 제조할 수 있으며, 이러한 단위 투여형태는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 유탁액제, 현탁액제, 시럽제 등 여러 형태로 제형화될 수 있다. 상기 여러 형태의 제형은 부형제, 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제(disintegrator), 활택제, 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제(isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 습윤제, 현탁제, 안정제, 착색제, 방향제 등 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 사용하여 공지 기술에 의해 제조될 수 있다.

상기 약제의 제조에 있어서 활성성분들의 함량은 약제의 형태에 따라 다르지만, 피페라진 다이티옥트산염은 바람직하게는 10 내지 80 중량%의 농도, 보다 바람직하게는 30 내지 60 중량%의 농도이고, 글리메피리드는 바람직하게는 0.05 내지 5 중량%의 농도, 보다 바람직하게는 0.2 내지 1 중량%의 농도이다. 또한 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드의 중량비는 활성성분을 기준으로 바람직하게는 10 : 1 내지 1000 : 1의 범위, 보다 바람직하게는 50 : 1 내지 600 : 1의 범위이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 치료받는 사람을 포함한 포유동물의 종류, 투여경로, 체중, 성별, 나이, 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 넓은 범위에서 다양하게 변화된다. 일반적으로 경구투여의 경우에 피페라진 다이티옥트산염은 체중 1 kg당 하루에 활성성분 0.5 내지 20 mg이 투여될 수 있고, 글리메피리드는 체중 1 kg당 하루에 활성성분 0.01 내지 0.3 mg이 투여될 수 있다. 상술한 일일 투여량은 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 한번에 또는 나누어서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드를 함께 사용함으로써 혈당을 개선하는 효과 뿐만 아니라 당뇨환자의 근본적 대사장애 개선효과와 인슐린저항성 개선효과를 가지고, 특히 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드를 각각 단독으로 사용하거나 티옥트산염과 글리메피리드를 함께 사용할 때보다 세포에서 포도당 수송이 현저하게 증가되어 제2형 당뇨병의 치료에 강력한 시너지효과를 나타낸다. 아울러, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 당뇨병성 다발성 신경염을 완화시키거나 당뇨병성 지방간을 회복시킴으로써 제2형 당뇨병의 후유증을 완화시킬 수 있는 약물로도 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 제조예 1에서 수득한 결정성 피페라진 다이티옥트산염의 X선 회절 분광도를 나타낸 도이다.
도 2는 제조예 1에서 수득한 결정성 피페라진 다이티옥트산염의 시차주사열량 분석도(Differential Scanning Calorimeter Thermogram)를 나타낸 도이다.
도 3은 제조예 2에서 수득한 결정성 피페라진 다이-R-(+)-티옥트산염의 X선 회절 분광도를 나타낸 도이다.
도 4는 제조예 2에서 수득한 결정성 피페라진 다이-R-(+)-티옥트산염의 시차주사열량 분석도를 나타낸 도이다.
도 5는 시험예 2-1에서 L6 세포에 대해 시료 처리농도에 따른 포도당 수송(glucose uptake)을 나타낸 도이다.
도 6은 시험예 2-2에서 L6 세포에 대해 1 μg/mL의 농도로 시료를 처리하였을 때 시료 처리시간에 따른 포도당 수송을 나타낸 도이다.
도 7은 시험예 2-2에서 L6 세포에 대해 10 μg/mL의 농도로 시료를 처리하였을 때 시료 처리시간에 따른 포도당 수송을 나타낸 도이다.
도 8은 시험예 2-3에서 L6 세포에 대해 1 μg/mL의 시료와 인슐린 처리농도에 따른 포도당 수송을 나타낸 도이다.
도 9는 시험예 2-3에서 L6 세포에 대해 10 μg/mL의 시료와 인슐린 처리농도에 따른 포도당 수송을 나타낸 도이다.
도 10은 시험예 2-4에서 L6 세포에 대해 1 μg/mL의 시료와 인슐린 처리시간에 따른 포도당 수송을 나타낸 도이다.
도 11은 시험예 2-4에서 L6 세포에 대해 10 μg/mL의 시료와 인슐린 처리시간에 따른 포도당 수송을 나타낸 도이다.
도 12는 시험예 2-5에서 L6 세포에 대해 글리메피리드와 티옥트산의 병용처리에 따른 포도당 수송을 나타낸 도이다.
도 13은 시험예 2-5에서 L6 세포에 대해 글리메피리드와 피페라진 다이티옥트산염의 병용처리에 따른 포도당 수송을 나타낸 도이다.
도 14는 시험예 2-5에서 각 시료의 처리 및 농도에 따른 포도당 수송을 나타낸 도이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

실시예 1: 정제 제형(직타용)

하기에 기재된 조성과 함량으로 정제 제형(직타용)을 제조하였다.

[제형 A]

피페라진 다이티옥트산염: 121 mg (티옥트산으로서 100 mg)

글리메피리드: 1 mg

미결정셀룰로오스: 50 mg

무수유당: 55 mg

히드록시프로필셀룰로오스: 5 mg

카복시메틸셀룰로오스칼슘: 10 mg

전분글리콘산나트륨: 10 mg

경질무수규산: 9 mg

탈크: 5 mg

스테아린산마그네슘: 4 mg

[제형 B]

피페라진 다이티옥트산염: 242 mg (티옥트산으로서 200 mg)

글리메피리드: 2 mg

미결정셀룰로오스: 60 mg

무수유당: 70 mg

히드록시프로필셀룰로오스: 8 mg

카복시메틸셀룰로오스칼슘: 12 mg

전분글리콘산나트륨: 15 mg

경질무수규산: 15 mg

탈크: 9 mg

스테아린산마그네슘: 7 mg

실시예 2: 정제 제형(습식용)

하기에 기재된 조성과 함량으로 정제 제형(습식용)을 제조하였다.

[제형 A]

피페라진 다이티옥트산염: 121 mg (티옥트산으로서 100 mg)

글리메피리드: 1 mg

미결정셀룰로오스: 73 mg

저치환도 히드록시프로필셀룰로오스: 35 mg

히드록시프로필셀룰로오스: 3 mg

전분글리콘산나트륨: 10 mg

스테아린산마그네슘: 7 mg

물: 적량

[제형 B]

피페라진 다이티옥트산염: 242 mg (티옥트산으로서 200 mg)

글리메피리드: 2 mg

미결정셀룰로오스: 100 mg

저치환도 히드록시프로필셀룰로오스: 64 mg

히드록시프로필셀룰로오스: 5 mg

전분글리콘산나트륨: 15 mg

스테아린산마그네슘: 12 mg

물: 적량

[제형 C]

피페라진 다이티옥트산염: 363 mg (티옥트산으로서 300 mg)

글리메피리드: 3 mg

미결정셀룰로오스: 37 mg

저치환도 히드록시프로필셀룰로오스: 60 mg

히드록시프로필셀룰로오스: 5 mg

전분글리콘산나트륨: 20 mg

스테아린산마그네슘: 12 mg

물: 적량

실시예 3: 캡슐 제형

하기에 기재된 조성과 함량으로 캡슐 제형을 제조하였다.

[제형 A]

피페라진 다이티옥트산염: 121 mg (티옥트산으로서 100 mg)

글리메피리드: 1 mg

미결정셀룰로오스: 50 mg

무수유당: 50 mg

크로스포비돈: 3 mg

경질무수규산: 10 mg

스테아린산마그네슘: 5 mg

[제형 B]

피페라진 다이티옥트산염: 242 mg (티옥트산으로서 200 mg)

글리메피리드: 2 mg

미결정셀룰로오스: 80 mg

무수유당: 85 mg

크로스포비돈: 5 mg

경질무수규산: 18 mg

제조예 1: 피페라진 다이티옥트산염의 제조

티옥트산 10.00 g (48.5 mmol)을 아세톤 100 ㎖에 가하여 완전히 용해시키고 반응용액의 온도를 10 내지 15 ℃로 낮추었다. 다른 반응용기에 피페라진 1.90 g (21.8 mmol)을 아세톤 100 ㎖에 완전히 용해시킨 후, 앞서 제조한 티옥트산의 용액에 1 시간 동안 서서히 적가하였다. 반응용액의 온도를 0 내지 5 ℃로 냉각하고 2 시간 동안 교반하였다. 생성된 흰색의 결정성 고체를 여과하고 냉각된 아세톤 50 ㎖로 세척한 후, 35 ℃ 진공 하에서 24 시간 동안 건조하여 피페라진 다이티옥트산염 10.52 g을 얻었다. 수율은 96.7%였다. 수득된 결정성 피페라진 다이티옥트산염의 X-선 회절분석 및 시차주사열량분석을 수행하여 그 결과를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.

융점 : 105 ~ 106 ℃

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) :δ= 3.57 ~ 3 .56 (m, 2 H), 3.15 ~ 3.06 (m, 4 H), 2.69 (s, 8 H), 2.40 ~ 2.35 (m, 2 H), 2.10 ~ 2.06 (m, 4 H), 1.85 ~ 1.80 (m, 2 H), 1.68 ~ 1.59 (m, 2 H), 1.55 ~ 1.44 (m, 6 H), 1.36 ~ 1.30 (m, 4 H)

제조예 2: 피페라진 다이-R-(+)-티옥트산염의 제조

R-(+)-티옥트산 10.00 g (48.5 mmol)을 아세톤 100 ㎖에 가하여 완전히 용해시키고 반응용액의 온도를 10 내지 15 ℃로 낮추었다. 다른 반응용기에 피페라진 1.90 g (21.8 mmol)을 아세톤 100 ㎖에 완전 용해시킨 후, 앞서 제조한 R-(+)-티옥트산의 용액에 1 시간 동안 서서히 적가하였다. 반응용액의 온도를 0 내지 5 ℃로 냉각하고 2 시간 동안 교반하였다. 생성된 흰색의 결정성 고체를 여과하고 냉각된 아세톤 50 ㎖로 세척한 후, 35 ℃ 진공 하에서 24 시간 동안 건조하여 피페라진 다이-R-(+)-티옥트산염 10.04 g을 얻었다. 수율은 92.3%였다. 수득된 결정성 피페라진 다이-R-(+)-티옥트산염의 X-선 회절분석 및 시차주사열량분석을 수행하여 그 결과를 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.

융점 : 103 ~ 104 ℃

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) :δ= 3.57 ~ 3.56 (m, 2 H), 3.15 ~ 3.06 (m, 4 H), 2.69 (s, 8 H), 2.40 ~ 2.35 (m, 2 H), 2.10 ~ 2.06 (m, 4 H), 1.85 ~ 1.80 (m, 2 H), 1.68 ~ 1.59 (m, 2 H), 1.55 ~ 1.44 (m, 6 H), 1.36 ~ 1.30 (m, 4 H)

[a]_D ²⁰ = + 73.5 ~ + 74.5^o(c = 1.0 in methanol)

시험예 1: 결정성 피페라진 다이티옥트산염 구조의 정성적 확인

도 1 및 도 3으로부터 상기 제조예 1 및 제조예 2에서 각각 제조된 결정성 피페라진 다이티옥트산염과 결정성 피페라진 다이-R-(+)-티옥트산염은 분말 X-선 회절분석에서 각기 특징적인 결정형태를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 도 1 및 도 3의 분말 X-선 회절분광도에 나타난 특징적인 피크(peak)를 하기 표 1과 표 2에 나타내었으며, 여기서 ‘2θ’는 회절각을, ‘d’는 결정면간의 거리를, ‘I/I₀'는 피크(peak)의 상대강도를 의미한다.

피페라진 다이티옥트산염의 X-선 회절분석

2θ	d	I/I₀	2θ	d	I/I₀
11.3355	7.80616	3.82	23.5118	3.78387	7.70
12.3478	7.16840	5.59	24.2192	3.67494	15.68
13.2829	6.66580	8.34	25.2658	3.52503	4.18
13.9230	6.36074	33.01	27.2458	3.27319	5.10
16.3309	5.42791	26.63	28.6022	3.12098	5.89
17.0523	5.19986	12.13	29.3948	3.03861	3.03
17.3023	5.12529	10.72	30.2641	2.95328	3.72
18.2115	4.87141	20.26	31.2762	2.85998	6.31
18.9359	4.68665	60.99	33.0783	2.70817	2.92
20.5050	4.33144	100.00	34.971	2.56582	5.86
22.1630	4.01101	94.49	37.0305	2.42771	6.68
22.7546	3.90806	31.40	39.2636	2.29463	11.67

피페라진 다이-R-(+)-티옥트산염의 X-선 회절분석

2θ	d	I/I₀	2θ	d	I/I₀
5.6892	15.53456	3.27	24.1467	3.6858	6.77
11.2961	7.83335	1.10	25.3538	3.51299	6.06
12.5019	7.08038	2.36	27.2567	3.27191	2.65
13.4612	6.5779	6.13	28.506	3.1313	5.71
14.0234	6.31541	15.7	29.6176	3.01626	3.58
16.4425	5.39131	9.18	30.4746	2.93336	1.51
17.0143	5.21139	8.65	31.3347	2.85477	2.54
17.3441	5.11303	5.33	33.1141	2.70533	1.25
18.3264	4.84114	4.68	35.0518	2.56009	2.84
19.1000	4.64678	19.25	35.5721	2.52383	2.04
20.5645	4.31904	100	36.8964	2.43622	2.62
22.1514	4.01309	31.05	38.6786	2.32798	1.03
22.6953	3.91812	15.86	39.4902	2.28198	5.25
23.3229	3.8141	3.99

시험예 2: 포도당 수송(glucose uptake) 시험

L6 세포를 12 웰의 플레이트에 1×10⁴cells/well로 접종하고 2 내지 3 일 동안 배양하였다. 2% FBS(소태아혈청; Fetal Bovine Serum)를 포함하는 배지로 교환하고 2 일 동안 배양한 후 다시 한 번 배지를 교환하였다. 매일 분화정도를 현미경으로 관찰하여 세포가 80 내지 90% 이상 분화하였을 때 (보통 7 ~ 8 일 후) 실험에 사용하였다. L6 근아세포(myoblast)는 가늘고 긴 모양의 전형적인 아세포(blast)의 형태를 가지고 있으며, 분화가 유도되어 근육대롱세포(myotubes)가 되면 근육섬유(muscle fiber)를 형성하는 것을 관찰할 수 있었다. L6 근아세포는 계대 할수록 분화되지 않는 돌연변이의 수가 증가하여 분화율이 현저하게 감소되므로 계대배양 횟수를 10 이하로 하였다.

분화가 완료된 후, 시료를 농도별로 세포 배양액에 가하고 일정시간 동안 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배지를 제거한 후, 미리 37 ℃로 가온한 KRPH(HEPES-buffered Krebs-Ringer phosphate, pH 7.4)로 2 회 세척하여 배지 안에 존재하는 포도당을 제거하였다. 각 웰에 0.5 μCi/mL의 [³H]2-데옥시글루코스(deoxyglucose)를 가하고 40 분 경과 후 [³H]2-데옥시글루코스를 포함하는 KRPH를 신속히 제거한 후, 빙냉한 FBS를 가하여 반응을 정지시켰다. 빙냉한 FBS로 2 회 더 세척한 후, 상온에서 잠시 방치하여 세포표면의 수분을 완전히 제거하였다. 세포용해 완충액(cell lysis buffer; 0.5 N NaOH)를 0.5 mL 가하고 12 시간 동안 처리하여 세포를 용혈시켰다. 여기에 액체섬광칵테일(liquid scintillation cocktail) 3 mL을 가하여 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)로 방사능(radioactivity)을 측정하였다.

시험예 2-1: 시료 처리농도에 따른 포도당 수송 시험

시료가 L6 세포의 포도당 수송에 미치는 영향을 시료 농도별 (0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 μg/mL)로 확인하였다. 상기한 바와 같이 시료를 세포 배양액에 가하고 18 시간 동안 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하여 얻은 방사능(radioactivity) 측정 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, 글리메피리드와 티옥트산을 처리한 경우의 포도당 수송은 비슷한 수준이었으며, 피페라진 다이티옥트산을 처리했을 때에는 포도당 수송능이 더 우수한 것으로 나타났다. 시료 처리농도는 1 μg/mL와 10 μg/mL에서 포도당 수송(glucose uptake)이 잘되는 것으로 확인되어, 이후부터는 1 μg/mL와 10 μg/mL의 농도로 실험을 진행하였다.

시험예 2-2: 시료 처리시간에 따른 포도당 수송 시험

시료가 L6 세포의 포도당 수송에 미치는 영향을 시료 처리시간별(0, 30 분, 60 분, 120 분, 6 시간, 18 시간)로 확인하였다. 이때 세포 배양액에 첨가하는 시료의 농도는 도 5의 결과에 따라 포도당 수송능이 높은 1 μg/mL과 10 μg/mL로 하였다. 상기한 바와 같이 시료를 세포 배양액에 가하고 각 시간별로 배양하여 얻은 방사능(radioactivity) 측정 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이 시료 처리시간이 짧을 때 보다 2 시간 이상 처리했을 때 포도당 수송능이 더 좋은 것으로 확인되었다. 시료 처리시간이 6 시간과 18 시간이었을 때 포도당 수송이 더 증가하였으나 6 시간 처리했을 때와 18 시간 처리했을 때 큰 차이가 없었다. 따라서 이후부터는 시료 처리시간을 18 시간으로 하였다.

시험예 2-3: 인슐린과 시료의 병용처리시 인슐린 처리농도에 따른 포도당 수송 시험

L6 세포 배양시 시료와 함께 첨가할 인슐린의 최적농도를 결정하기 위하여 인슐린과 시료의 병용처리에 따른 포도당 수송을 확인하였다. 1 μg/mL과 10 μg/mL의 농도로 시료 첨가 후 18 시간에서 최종 2 시간 전에 인슐린을 농도별(0.02, 0.2, 2 U/mL)로 첨가하고 얻은 방사능(radioactivity) 측정 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8 및 도 9에서 보는 바와 같이 1 μg/mL와 10 μg/mL의 시료 및 0.2 U/mL의 인슐린을 처리했을 때 포도당 수송능이 좋은 것으로 확인되었다. 따라서 이후부터는 인슐린 처리농도를 0.2 U/mL로 하였다.

시험예 2-4: 인슐린과 시료의 병용처리시 인슐린 처리시간에 따른 포도당 수송 시험

L6 세포 배양시 시료와 함께 첨가할 인슐린(0.2 U/mL)의 처리시간을 결정하기 위하여 인슐린과 시료의 병용처리에 따른 포도당 수송을 확인하였다. 1 μg/mL과 10 μg/mL의 농도로 시료 첨가 후 0.2 U/ mL의 인슐린을 시간별(0, 30 분, 60 분, 120 분, 6 시간, 18 시간)로 첨가하고 얻은 방사능(radioactivity) 측정 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

도 10 및 도 11에서 보는 바와 같이 세포에 0.2 U/mL의 인슐린을 120 분 이상 처리했을 때 포도당 수송능이 좋은 것으로 확인되었다. 따라서 이후부터는 인슐린 처리시간을 120 분으로 하였다.

시험예 2-5: 글리메피리드와 티옥트산 또는 피페라진 다이티옥트산염의 병용처리시 포도당 수송 시험

피페라진 다이티옥트산염을 글리메피리드와 병용처리했을 때 L6 세포의 포도당 수송에 미치는 영향을 티옥트산과 글리메피리드를 병용처리했을 때와 비교하였다. 세포를 완전히 분화시킨 후, 시료를 세포 배양액에 가하여 18 시간 동안 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 시료 첨가 후 18 시간에서 최종 2 시간 전에 0.2 U/mL의 인슐린을 첨가하고 얻은 방사능(radioactivity) 측정 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.

도 12 및 도 13에서 보는 바와 같이 L6 세포에 글리메피리드와 티옥트산을 병용처리했을 때 보다 글리메피리드와 피페라진 다이티옥트산염을 병용처리했을 때 포도당 수송이 더 많이 증가하는 것으로 확인되었다.

또한 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드의 병용처리시 유발되는 시너지 효과를 확인하기 위해, 상기한 바와 같이 얻어진 시료의 병용처리 및 농도에 따른 방사능(radioactivity) 측정 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에서 보는 바와 같이 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드의 병용투여시 강력한 시너지 효과를 확인할 수 있었다. 구체적으로 피페라진 다이티옥트산염 1 μg/mL과 글리메피리드 1 μg/mL를 병용투여 했을 때 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드를 각기 단독으로 10 μg/mL 투여 했을 때 보다 더 우수한 효과가 나타났다. 더욱이 피페라진 다이티옥트산염과 티옥트산이 모두 1 μg/mL의 농도에서 최적의 결과를 보여주고, 10 μg/mL에서는 오히려 포도당 수송능이 감소하고 있음에도 불구하고, 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드의 병용투여시에는 피페라진 다이티옥트산염이 10 μg/mL의 농도에서 더 큰 포도당 수송능을 보여주었다. 결론적으로 피페라진 다이티옥트산염은 글리메피리드와의 병용투여를 통해 약리학적 효능을 가지는 유효농도의 범위를 단독투여시 보다 10배 높은 10 μg/mL까지 확대할 수 있었고, 궁극적으로 더 우수한 항당뇨효능을 갖는 약물로의 가능성을 보여주었다. 이 또한 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드의 탁월한 시너지 효과로 해석되고 있다.

Claims

피페라진 다이티옥트산염 및 글리메피리드를 포함하는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 피페라진 다이티옥트산염에서 티옥트산이 라세미형인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 피페라진 다이티옥트산염에서 티옥트산이 R-(+)-티옥트산 또는 S-(-)-티옥트산인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 피페라진 다이티옥트산염이 X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 13.9±0.2, 16.3±0.2, 17.1±0.2, 17.3±0.2, 18.2±0.2, 18.9±0.2, 20.5±0.2, 22.2±0.2, 22.8±0.2, 24.2±0.2, 39.3±0.2 인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제3항에 있어서, 피페라진 다이-R-(+)-티옥트산염이 X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 5% 이상인 회절각(2θ)의 값이 13.5±0.2, 14.0±0.2, 16.4±0.2, 17.0±0.2, 17.3±0.2, 19.1±0.2, 20.6±0.2, 22.2±0.2, 22.7±0.2, 24.1±0.2, 25.4±0.2, 28.5±0.2, 39.5±0.2 인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 피페라진 다이티옥트산염을 10 내지 80 중량%의 농도로, 글리메피리드를 0.05 내지 5 중량%의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 피페라진 다이티옥트산염과 글리메피리드의 중량비가 피페라진 다이티옥트산염의 중량을 활성성분인 티옥트산의 중량으로 환산하였을 때 10 : 1 내지 1000 : 1의 범위인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.