KR101206318B1 - 자궁 내막증 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명에 의해, 인터류킨-5 앤타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 자궁 내막증 치료제가 제공된다.

Description

자궁 내막증 치료제{REMEDY FOR ENDOMETRIOSIS}

본 발명은, 인터류킨-5 (이하, IL-5 로 약기한다) 앤타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 자궁 내막증 치료제에 관한 것이다.

자궁 내막증을 치료하는 방법으로는 주로 약물 요법과 외과적 요법으로 분류된다.

약물 요법으로는, 진통제, 경구 피임약 등의 대증 요법, 호르몬 요법 등의 본증 치료약에 의한 투여를 들 수 있고, 외과적 요법으로는, 보존 수술, 근치 수술 등을 들 수 있다 (비특허 문헌 1). 그러나, 외과적 요법도 불충분한 증례가 있으며, 또한 자궁 내막증을 근치시키는 약제는 지금까지 개발되어 있지 않다.

인간 IL-5 (human interleukin-5) 에 특이적으로 반응하는 항체로는, SB-240563 (스미스 클라인 비첨사), Sch-55700 (CDP-835) (쉐링 푸라우/셀텍사) 등이 알려져 있다. SB-240563 은, 가벼운 정도의 천식 환자에 대하여 말초 혈중 호산구 수의 감소 작용을 나타낸다 (100th Annual Meetings of the American Society for Clinical Pharmacology and Therapeutics, March/1999). Sch-55700 도 원숭이의 알레르기 모델에 있어서 항원 자극에 의한 폐의 호산구 증다(增多)를 억제하는 것이 알려져 있다 (비특허 문헌 2).

또한 인간 IL-5 수용체 α 사슬에 반응하는 항체로는, 인간화 항체인 KM8399 (특허 문헌 1) 가 알려져 있다. KM8399 는, 만성 기관지 천식을 비롯한 알레르기 질환 치료제로서의 유용성이 기대되는 점, 인간 IgG1 서브클래스의 Fc 영역을 가지고 있어, 인간 호산구 특이적으로 아포토시스를 유도시키고, 아포토시스의 유도가 항체 의존성 세포 상해 활성에 의한 점 (특허 문헌 2) 등이 알려져 있다.

그러나, 상기 서술한 인간 IL-5 에 특이적으로 반응하는 항체 및 인간 IL-5 수용체에 특이적으로 반응하는 항체와 자궁 내막증과의 관련에 관해서는 알려져 있지 않다.

비특허 문헌 1 : 도우치 츠토무 (堂地勉) 외 : 자궁 내막증 치료법의 선택. 산부인과 치료 78 : 179-182, 1999

비특허 문헌 2 : Arzneimittel-Forschung, 49, 779 (1999)

특허 문헌 1 : WO97/10354

특허 문헌 2 : WO01/60405

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

자궁 내막증을 치료하기 위한 유용한 약제가 요구되고 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명은, 이하의 (1) ～ (13) 에 관한 것이다.

(1) 인터류킨-5 앤타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 자궁 내막증의 치료제.

(2) 인터류킨-5 앤타고니스트가 인터류킨-5 와 인터류킨-5 수용체의 결합을 저해하는 항체 또는 그 항체 단편인 상기 (1) 의 치료제.

(3) 인터류킨-5 와 인터류킨-5 수용체의 결합을 저해하는 항체가, 인터류킨-5 에 결합하는 항체인 상기 (2) 에 기재된 치료제.

(4) 인터류킨-5 가 인간 인터류킨-5 인 상기 (3) 에 기재된 치료제.

(5) 인터류킨-5 와 인터류킨-5 수용체의 결합을 저해하는 항체가, 인터류킨-5 수용체에 결합하는 항체인 상기 (2) 에 기재된 치료제.

(6) 인터류킨-5 수용체가 인터류킨-5 수용체 α 사슬인 상기 (5) 에 기재된 치료제.

(7) 인터류킨-5 수용체가 인간 인터류킨-5 수용체인 상기 (5) 또는 (6) 에 기재된 치료제.

(8) 항체가 모노클로날 항체인 상기 (2) ～ (7) 중 어느 한 항에 기재된 치료제.

(9) 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인, 상기 (8) 항에 기재된 치료제.

(10) 유전자 재조합 항체가, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 유전자 재조합 항체인, 상기 (9) 에 기재된 치료제.

(11) 항체 단편이, Fab, Fab', F(ab')₂, 1 본쇄 항체 (scFv), 이량체화 가변 영역 (Diabody), 디술파이드 안정화 가변 영역 (dsFv) 및 CDR 을 포함하는 펩티드에서 선택되는 항체 단편인 상기 (2) ～ (10) 중 어느 한 항에 기재된 치료제.

(12) 자궁 내막증 치료제의 제조를 위한 상기 (1) ～ (11) 중 어느 한 항에 기재된 인터류킨-5 앤타고니스트의 용도.

(13) 상기 (1) ～ (11) 중 어느 한 항에 기재된 인터류킨-5 앤타고니스트를 투여하는 것을 특징으로 하는 자궁 내막증의 치료 방법.

발명의 효과

본 발명에 의해, IL-5 앤타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 자궁 내막증 치료제가 제공된다.

도 1 은, 마우스 자궁 내막증 모델에 있어서의 항 마우스 IL-5 수용체 항체의 자궁 내막증 병변 형성 억제 작용을 나타낸 도면이다. 세로축은, 병변 사이즈 (㎟) 를 나타낸다.

도 2 는, 마우스 자궁 내막증 모델에 있어서의 항 마우스 IL-5 항체의 자궁 내막증 병변 형성 억제 작용을 나타낸 도면이다. 세로축은, 병변 사이즈 (㎟) 를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 있어서 사용되는 IL-5 앤타고니스트로서는, IL-5 와 IL-5 수용체 사이의 시그널 전달을 차단하여, IL-5 의 생물학적 활성을 저해하는 것이면 어떠한 것이나 가능하고, 저분자이거나 고분자이거나 상관없다. 예를 들어 IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 항체 또는 그 항체 단편 등을 들 수 있다.

IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 항체로는, IL-5 에 결합하며, 또한 IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 항체, IL-5 수용체에 결합하며, 또한 IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 항체 등을 들 수 있다. IL-5 수용체로서는, IL-5 수용체 α 사슬, IL-5 수용체 β 사슬 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 항체 또는 항체 단편은 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것이나 상관없지만, 바람직하게는 모노클로날 항체를 들 수 있다.

모노클로날 항체로는, 하이브리도마가 생성하는 항체, 유전자 재조합 항체 등을 들 수 있다.

하이브리도마란, 인간 이외의 포유 동물에 항원을 면역시켜 취득된 B 세포와 골수종 세포를 세포 융합시켜 얻어지는 원하는 항원 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 세포를 말한다.

유전자 재조합 항체로는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등을 들 수 있다.

인간형 키메라 항체란, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 과 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 항체를 말한다. 인간형 키메라 항체의 CH 로는, 인간 이뮤노글로빈 (이하, hIg 로 표기한다) 에 속하면 어떠한 것이라도 상관없지만, hIgG 클래스의 것이 바람직하며, 나아가 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4 와 같은 서브클래스 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 또, 인간형 키메라 항체의 CL 로는, hIg 에 속하면 어떠한 것이나 상관없고, κ 클래스 혹은 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.

또한, 인간 이외의 동물이란, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등을 말한다.

인간화 항체란, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 인간 항체의 VH 및 VL 의 적절한 위치에 이식한 항체를 말하고, 인간형 CDR 이식 항체라고도 한다.

본 발명의 인간화 항체는, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 임의의 인간 항체의 VH 및 VL 의 프레임 워크 (이하, FR 로 표기한다) 와 연결한 V 영역을 코딩하는 cDNA 를 설계, 구축하여, 인간 항체의 CH 및 CL 을 코딩하는 cDNA 를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입해서 인간화 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

인간화 항체의 CH 로는, hIg 에 속하면 어떠한 것이나 상관없지만, hIgG 클래스의 것이 바람직하고, 나아가 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4 와 같은 서브클래스 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 또, 인간화 항체의 CL 로는, hIg 에 속하면 어떠한 것이나 상관없고, κ 클래스 혹은 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.

인간 항체란 원래, 인간 체내에 천연적으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제조된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다. 인간 체내에 존재하는 항체는, 예를 들어, 인간 말초혈 림프구를 단리하여, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화하고, 클로닝함으로써, 그 항체를 생성하는 림프구를 단독으로 배양할 수 있고, 배양 상청 중에서 그 항체를 정제할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 그 라이브러리로부터, 항원을 고정화시킨 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이 표면에 발현되어 있는 파지를 회수할 수 있다. 그 항체 단편은, 또한, 유전자 공학적 수법에 의해 2 개의 완전한 H 사슬 및 2 개의 완전한 L 사슬로 이루어지는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다. 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 세포 내에 삽입된 동물을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들어, 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 그 ES 세포를 마우스의 초기 배 (胚) 에 이식 후, 발생시킴으로써 인간 항체 생성 트랜스제닉 마우스를 제조할 수 있다. 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제조 방법은, 통상의 인간 이외의 동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제조 방법에 의해 인간 항체 생성 하이브리도마를 취득하고, 배양시킴으로써 배양 상청 중에 인간 항체를 생성 축적시킬 수 있다.

본 발명에 있어서 바람직하게 사용할 수 있는 항체 또는 항체 단편으로서는, 하이브리도마 ATCC HB10959 (일본 공개특허공보 평2000-210097) 에 의해 생산된, IL-5 에 결합하며, 또한 IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 모노클로날 항체, 하이브리도마 KM1259 (FERM BP-5134, WO97/10354), 하이브리도마 KM1486 (FERM BP-5651, WO97/10354) 등에 의해 생산된, IL-5 수용체 α 사슬에 결합하며, 또한 IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 모노클로날 항체, 하이브리도마 BION-1 (ATCC HB-12525, WO00/09561) 에 의해 생산된, IL-5 수용체 β 사슬에 특이적으로 결합하며, IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 모노클로날 항체 및 그들의 항체 단편 등을 들 수 있다.

인간 IL-5 수용체에 결합하며, 또한 IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 인간형 키메라 항체의 구체예로는, 서열 번호 1, 2 및 3 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 VH 의 CDR1, CDR2, CDR3 및/또는 서열 번호 4, 5 및 6 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 VL 의 CDR1, CDR2, CDR3 을 포함하는 항 인간IL-5R α 사슬 키메라 항체, 항체의 VH 가 서열 번호 7 로 나타내는 아미노산 서열 및/또는 VL 이 서열 번호 8 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 항 인간 IL-5R α 사슬 키메라 항체, 항체의 VH 가 서열 번호 7 로 나타내는 아미노산 서열 및 인간 항체의 CH 가 hIgG1 서브클래스의 아미노산 서열로 이루어지고, 항체의 VL 이 서열 번호 8 로 나타내는 아미노산 서열 및 인간 항체의 CL 이 κ 클래스의 아미노산 서열로 이루어지는 항 인간 IL-5R α 사슬 키메라 항체 등을 들 수 있고, 구체적으로는 KM1399 (WO97/10354) 등을 들 수 있다.

IL-5 수용체 α 사슬에 결합하며, 또한 IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 인간화 항체로는, 각각 서열 번호 24, 25, 26 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 VH 의 CDR1, CDR2, CDR3 및/또는 각각 서열 번호 27, 28, 29 로 나타내 는 아미노산 서열로 이루어지는 VL 의 CDR1, CDR2, CDR3 을 포함하는 항체, 보다 바람직하게는, 각각 서열 번호 18, 19, 20 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 VH 의 CDR1, CDR2, CDR3 및/또는 각각 서열 번호 21, 22 및 23 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 VL 의 CDR1, CDR2, CDR3 을 포함하는 항체, 더욱 바람직하게는, 각각 서열 번호 1, 2, 3 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체 VH 의 CDR1, CDR2, CDR3 및/또는 각각 서열 번호 4, 5, 6 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 VL 의 CDR1, CDR2, CDR3 을 포함하는 인간화 항체 또는 그 항체 단편 등을 들 수 있다.

이들 인간화 항체 중에서도, 항체의 VH 가 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열 중, 40 번째의 Ala, 46 번째의 Glu, 67 번째의 Arg, 72 번째의 Ala, 74 번째의 Thr, 79 번째의 Ala, 95 번째의 Tyr 및 97 번째의 Ala 에서 선택되는 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VL 이 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열 또는 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열 중, 7 번째의 Ser, 8 번째의 Pro, 22 번째의 Thr, 37 번째의 Gln, 38 번째의 Gln, 44 번째의 Pro, 45 번째의 Lys, 71 번째의 Phe, 77 번째의 Ser, 87 번째의 Tyr 및 98 번째의 Phe 에서 선택되는 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체가 바람직하고, 항체의 VH 가 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열 중, 40 번째의 Ala, 46 번째의 Glu, 67 번째의 Arg, 72 번째의 Ala, 74 번째의 Thr, 79 번째의 Ala, 95 번째의 Tyr 및 97 번째의 Ala 에서 선택되는 적어도 1 개의 아미노산 잔기가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하며, 또한, 항체의 VL 이 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열 중, 7 번째의 Ser, 8 번째의 Pro, 22 번째의 Thr, 37 번째의 Gln, 38 번째의 Gln, 44 번째의 Pro, 45 번째의 Lys, 71 번째의 Phe, 77 번째의 Ser, 87 번째의 Tyr 및 98 번째의 Phe 에서 선택되는 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체가 보다 바람직하다.

구체적으로는, 항체의 VH 가 각각 서열 번호 9, 11, 12, 13 으로 나타내는 아미노산 서열, 및 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열 중, 40 번째의 Ala, 46 번째의 Glu, 67 번째의 Arg, 72 번째의 Ala, 74 번째의 Thr, 79 번째의 Ala, 95 번째의 Tyr 및 97 번째의 Ala 에서 선택되는 적어도 1 개의 아미노산 잔기가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열에서 선택되는 아미노산 서열, 및/또는 항체의 VL 이 각각 서열 번호 10, 14, 15, 16, 17 로 나타내는 아미노산 서열, 및 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열 중, 7 번째의 Ser, 8 번째의 Pro, 22 번째의 Thr, 37 번째의 Gln, 38 번째의 Gln, 44 번째의 Pro, 45 번째의 Lys, 71 번째의 Phe, 77 번째의 Ser, 87 번째의 Tyr 및 98 번째의 Phe 에서 선택되는 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 보다 구체적으로는 VH 가 서열 번호 13, VL 이 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 예를 들어, KM8399 (WO97/10354), KM7399 (WO97/10354) 등을 들 수 있다.

그리고, IL-5 에 결합하며, 또한 IL-5 와 IL-5 수용체의 결합을 저해하는 인간화 항체로는, 메폴리주맙 (mepolizumab) [SB-240563 ; 글락소 스미스클라인사 제조], 레슬리주맙 (reslizumab) [Sch-55700 ; 쉐링 프라우/셀텍사 제조] 등을 들 수 있다.

상기 서술한 항체 또는 항체 단편을 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 부가, 치환 또는 삽입되고, 또한 상기 서술한 항체 또는 항체 단편과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 항체 또는 항체 단편도 본 발명에서 사용되는 항체에 포함된다.

결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1 개 이상이고 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 몰레큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지된 기술에 의해, 결실, 치환 또는 부가할 수 있을 정도의 수이며, 예를 들어, 1 ～ 수 십개, 바람직하게는 1 ～ 20 개, 보다 바람직하게는 1 ～ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 ～ 5 개다.

상기 항체의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된이란, 동일 서열 중에서 임의이며 또한 1 또는 복수의 아미노산 서열 중에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있는 것을 의미하고, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 생겨도 되며, 치환, 삽 입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형에 상관하지 않는다. 천연형 아미노산 잔기로는, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루타민산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등을 들 수 있다.

이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 바람직한 예를 나타낸다. 동일 군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다.

A 군 : 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌

B 군 : 아스파르트산, 글루타민산, 이소아스파르트산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산

C 군 : 아스파라긴, 글루타민

D 군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산

E 군 : 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린

F 군 : 세린, 트레오닌, 호모세린

G 군 : 페닐알라닌, 티로신

본 발명에서 사용되는 항체 단편으로는, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, diabody, dsFv 및 CDR 을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.

Fab 는, IgG 형 항체 분자를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중 (H 사슬의 224 번째 아미노산 잔기에서 절단된다), H 사슬의 N 말단측 약 절반과 L 사슬 전체가 디술파이드 결합으로 결합한 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명에서 사용되는 Fab 는, 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 그 항체의 Fab 을 코딩하는 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.

F(ab')₂ 는, IgG 형 항체 분자를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중 (H 사슬의 234 번째 아미노산 잔기에서 절단된다), Fab 가 힌지 영역의 디술파이드 결합을 통하여 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명에서 사용되는 F(ab')₂ 는, 항체를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 하기의 Fab' 를 티오에테르 결합 또는 디술파이드 결합시켜 제조할 수 있다.

Fab' 는, 상기 F(ab')₂ 의 힌지 영역의 디술파이드 결합을 절단한 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명에서 사용되는 Fab' 는, F(ab')₂ 를 환원제 디티오트레이톨 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 그 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

scFv 는, 1 개의 VH 와 1 개의 VL 을 적당한 펩티드 링커 (이하, P 로 표기한다) 를 사용하여 연결한 VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명에서 사용되는 scFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를 취득하여, scFv 를 코딩하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입한 후, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

diabody 는, scFv 가 이량체화된 항체 단편으로, 2 가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2 가의 항원 결합 활성은, 동일한 것으로 할 수도 있고, 일방을 상이한 항원 결합 활성으로 할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 diabody 는, 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를 취득하여, scFv 를 코딩하는 DNA 를 링커의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입한 후, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

dsFv 는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 그 시스테인 잔기 간의 디술파이드 결합을 통하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는 Reiter 들에 의해 개시된 방법 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994) 에 따라서, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 dsFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를 취득하여, dsFv 를 코딩하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입한 후, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

CDR 을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL 의 CDR 의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR 을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해서 결합시킬 수 있다. 본 발명에서 사용되는 CDR 을 포함하는 펩티드는, 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 코딩하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입한 후, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다. 또한, CDR 을 포함하는 펩티드는, Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서 제조할 수도 있다.

이하에, 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체 단편의 제조 방법 및 활성 평가에 관해서 기재한다.

1. 모노클로날 항체의 제조

(1) 항원의 조제

항원인 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등에 도입, 발현시켜서, 재조합형 단백질을 얻어, 이것을 항 원으로 사용할 수 있다. 또는, 항원인 폴리펩티드의 부분 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드를 항원으로 사용할 수도 있다.

항원용 부분 펩티드로는, 5 ～ 30 잔기 정도의 단백질 부분 서열이 선택된다. 변성되지 않은 천연 구조를 갖고 있는 상태의 그 단백질을 인식하는 항체를 취득하기 위해서는, 단백질의 입체 구조에 있어서 표면에 존재하고 있는 부분 아미노산 서열을 항원 펩티드로서 선택한다. 단백질의 입체 구조를 해석하는 방법으로는, 제네틱 맥 (Genetyx Mac) 등 시판되는 단백질 서열 해석 소프트를 사용하여, 친수성이 높은 부분 아미노산 서열을 예측하는 방법을 예시할 수 있다. 단백질은, 일반적으로 친수성이 낮은 부분은 입체 구조상 단백질의 내부에 존재하는 경우가 많고, 친수성이 높은 부분은 단백질 표면에 존재하는 경우가 많다. 또, 단백질의 N 말단, C 말단은 단백질 표면에 존재하는 경우가 많다.

부분 펩티드에는 단백질과 가교시키기 위해서, 시스테인을 말단에 부가한다. 단백질의 내부 서열을 부분 펩티드로서 선택한 경우에는, 필요에 따라서 펩티드의 N 말단을 아세틸화, C 말단을 아미드화한다. 부분 펩티드는, 일반적인 액상, 고상 펩티드 합성법 및 그들을 적절히 조합한 방법, 또는 그들에 준하는 방법에 의해 합성할 수 있다 (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol.1, 1979 ; Vol.2, 1980 ; Vol.3, 1981, Academic Press ; 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠, 1985 ; 속 의약물의 개발, 제 14 권, 펩티드 합성, 히로카와 서점, 1991 ; International Journal of Peptide & Protein Research, 35, 161-214, 1990). 또한, 자동 펩티드 합성기를 사용할 수도 있다. 펩티드 합성기에 의한 펩티드 의 합성은, 시마즈 제작소 제조의 펩티드 합성기, Applied Biosystems, Inc. 사 (이하, ABI 사로 표기한다) 제조의 펩티드 합성기, Advanced ChemTech Inc. 사 (이하, ACT 사로 표기한다) 제조의 펩티드 합성기 등 시판되는 펩티드 합성기 상에서, 적당히 측사슬을 보호한 Nα-Fmoc-아미노산 또는 Nα-Boc-아미노산 등을 사용하여, 각각의 합성 프로그램에 따라서 합성할 수 있다.

원료가 되는 보호 아미노산 및 담체 수지는, ABI 사, 시마즈 제작소, 고꾸산 화학 (주), Nova Biochem 사, 와타나베 화학 (주), ACT 사 또는 펩티드 연구소 (주) 등으로부터 입수할 수 있다. 또한, 원료가 되는 보호 아미노산, 보호 유기산, 보호 유기 아민은 보고되어 있는 합성법에 따라서, 또는 거기에 준하여 합성할 수 있다 (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol.1, 1979 ; Vol.2, 1980 ; Vol.3, 1981, Academic Press ; 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠, 1985 ; 속 의약물의 개발, 제 14 권, 펩티드 합성, 히로카와 서점, 1991 ; International Journal of Peptide & Protein Research, 35, 161-214, 1990).

(2) 동물의 면역과 항체 생성 세포의 제조

면역에 사용하는 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등 하이브리도마를 제조하는 것이 가능하다면, 어떠한 것이라도 상관없다. 하기에, 마우스 및 래트를 사용하는 예에 관해서 설명한다.

3 ～ 20 주령의 마우스 또는 래트에, 상기 1(1) 에서 조제한 항원을 면역시키고, 그 동물의 비장, 림프절, 말초혈로부터 항체 생성 세포를 채취한다. 면역은, 동물의 피하, 정맥내 또는 복강내에 적당한 아주반트와 함께 항원을 수 회 투여함으로써 실시한다. 아주반트로는, 프로인드의 완전 아주반트 (Complete Freund's Adjuvant) 또는, 수산화 알루미늄 겔과 백일해균 백신 등을 들 수 있다. 또, 소 혈청 알부민 (이하, BSA 로 표기한다) 이나 Keyhole Limpet Hemocyanin (이하, KLH 로 표기한다) 등의 캐리어 단백질과 콘쥬게이트를 제조하여, 이것을 면역원으로서 사용할 수 있다. 각 항원의 투여 후 3 ～ 7 일째에 면역 동물의 안저 정맥총 또는 꼬리 정맥으로부터 채혈하고, 항원에 대한 반응성을 ELISA 등에 의해 확인하여, 그 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 마우스 또는 래트를 항체 생성 세포의 공급원으로 한다. 항원의 최종 투여 후 3 ～ 7 일째에, 면역시킨 마우스 또는 래트로부터 공지된 방법 (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 에 준하여 비장 등을 적출하여, 항체 생성 세포와 골수종 세포를 융합시킨다.

(3) 골수종 세포의 조제

골수종 세포로는, 마우스로부터 얻어진 주화 세포인 8-아자구아닌 내성 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) (European Journal of Immunology, 6, 511-519, 1976), SP2/0-Ag14 (SP-2) (Nature, 276, 269-270, 1978), P3-X63-Ag8653 (653) (Journal of Immunology, 123. 1548-1550, 1979), P3-X63-Ag8 (X63) (Nature, 256, 495-497, 1975) 등, 인비트로(in vitro) 에서 증식 가능한 골수종 세포이면 어떠한 것이라도 상관없다. 이들 세포주의 배양 및 계대에 관해서는 공지된 방법 (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 에 따라 서, 세포 융합시까지 2×10⁷ 개 이상의 세포수를 확보한다.

(4) 세포 융합

상기에서 얻어진 항체 생성 세포와 골수종 세포를 세정한 후, 폴리에틸렌글리콜-1000 (이하, PEG-1000 으로 표기한다) 등의 세포 응집성 매체를 첨가하여, 세포를 융합시키고, 배지 중에 현탁시킨다. 세포의 세정에는 Modified Eagle's Medium (이하, MEM 으로 표기한다) 또는 Phosphate Buffered Saline (이하, PBS 로 표기한다) 등을 사용한다. 또, 융합 세포를 현탁하는 배지로는, 목적하는 융합 세포만이 선택적으로 얻어지도록, HAT 배지 {통상 배지 [RPMI-1640 배지에 1.5mM 글루타민, 50μM 2-메르캅토에탄올, 10μg/mL 젠타마이신 및 10% 소 태아 혈청 (이하, FBS 로 표기한다) 를 첨가한 배지] 에 0.1mM 히포크산틴, 15μM 티미딘 및 0.4μM 아미노프테린을 첨가한 배지} 를 사용한다.

배양 후, 배양 상청의 일부를 취하여, ELISA 에 의해 항원 단백질에 반응시켜, 비항원 단백질에 반응하지 않는 샘플을 선택한다. 이어서, 한계 희석법에 의해 단일 세포화를 실시하고, ELISA 에 의해 안정적으로 높은 항체가가 인정된 것을 모노클로날 항체 생성 하이브리도마로서 선택한다.

(5) 하이브리도마의 선택

항원에 반응하는 항체를 생성하는 하이브리도마의 선택은, 공지된 방법 (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 에 따라서, 이하에 서술하는 ELISA 에 의해 선택할 수 있다. 본 방법에 의해, 후술하 는 인간형 키메라 항체, CDR 이식 항체 또는 그들의 항체 단편을 생성하는 형질 전환주의 배양 상청 중에 함유되는 항체 또는 배양 상청으로부터 정제된 항체의 항원에 대한 결합 활성을 측정할 수 있다.

ELISA

항원을 96 웰 ELISA 플레이트에 고정화시키고, 하이브리도마 등의 배양 상청 또는 정제 항체를 제 1 항체로서 반응시킨다. 제 1 항체 반응 후, 플레이트를 세정하여 제 2 항체를 첨가한다. 제 2 항체로는, 제 1 항체를 인식할 수 있는 항체를, 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사성 동위 원소 등으로 표지한 항체를 사용한다. 구체적으로는 하이브리도마 제조시에 마우스를 사용한 것이라면, 제 2 항체로는 마우스 항체를 인식할 수 있는 항체를 사용한다. 반응 후, 제 2 항체의 표지 물질에 따른 반응을 실시하여, 항원에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마로서 선택한다.

(6) 모노클로날 항체의 정제

0.5mL 의 프리스테인 (2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸) 을 복강내 투여하여, 2 주간 사육한 8 ～ 10 주령의 마우스 또는 누드 마우스에, 1(4) 에서 얻어진 모노클로날 항체 생성 하이브리도마 세포 5×10⁶ ～ 2×10⁷ 세포/마리를 복강내에 주사한다. 10 ～ 21 일 동안 하이브리도마는 복수암(腹水癌)화된다. 그 마우스 또는 누드 마우스로부터 복수를 채취하고, 원심 분리, 40 ～ 50% 포화 황산암모늄에 의한 염석, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로스 칼럼, 프로테인 A-칼럼 또는 셀룰 로파인 GSL2000 (세이카가쿠 공업사 제조) 의 칼럼 등을 사용해서, IgG 또는 IgM 획분을 회수하여, 정제 모노클로날 항체로 한다.

정제 모노클로날 항체의 서브클래스의 결정은, 마우스 모노클로날 항체 타이핑 키트 또는 래트 모노클로날 항체 타이핑 키트 등을 사용하여 실시할 수 있다. 단백질 농도는, 롤리법 또는 280㎚ 에서의 흡광도로부터 산출할 수 있다.

항체의 서브클래스란 클래스 내의 아이소타입을 말하며, 마우스에서는, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 인간에서는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 를 들 수 있다.

(7) 모노클로날 항체의 활성 평가

(7-1) 항원에 대한 결합 활성 평가

배양 상청 중 또는 배양 상청으로부터 정제된 모노클로날 항체의 항원에 대한 결합 활성은, 상기 1(5) 의 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명 (Journal of Immunological Methods, 145, 229-240, 1991) 등에 의해 측정할 수 있다. 또, 항원 펩티드 또는 그 부분 펩티드를 사용한 경합 ELISA 에 의해, 항원과의 반응성 및 항원 에피토프를 해석할 수 있다. 항체가 항원인 단백질의 입체 구조를 인식하고 있는지 여부는, 통상적으로 실시되는 입체 구조적 해석법, 또는 여러 가지 면역학적 측정법을 조합함으로써, 추측할 수 있다. 입체 구조 해석법으로는, 예를 들어, X 선 결정 해석, 핵자기 공명법 등을 들 수 있다. 여러 가지 면역학적 측정법을 조합하는 방법으로는, 예를 들어, 비변성 상태의 항원에 대한 ELISA 법과 변성 상태의 항원에 대한 ELISA 법을 조합하는 방법을 들 수 있다. 이 때, 비변성 상태의 항원에만 반응성을 나타내는 항체는, 항원의 입체 구조를 인식 하고 있을 가능성이 높은 것으로 추측할 수 있다. 비변성 상태의 항원에 대한 ELISA 법이란, 액층 중에서 비변성 항원과 항체를 반응시키는 ELISA 법 등을 들 수 있다. 변성 상태의 항원에 대한 ELISA 법으로는, 항원이 원래의 입체 구조를 유지하고 있지 않은 상태에서 항체를 반응시키는 ELISA 법이면 어느 것이라도 상관없고, 예를 들어, 소수성의 반응 플레이트 상에 직접 고정화시킨 항원이나, 적당한 길이로 소화된 부분 펩티드 등에 대한 ELISA 법을 들 수 있다.

2. 항원에 대한 인간 이외 동물의 폴리클로날 항체의 제조

폴리클로날 항체는, 상기 1.(2) 에 나타낸 방법으로 면역을 실시한 동물 중, 그 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 동물의 혈청으로부터 조제할 수 있다.

즉, 그 동물로부터 회수한 혈액으로부터 원심 분리법에 의해 분획한 혈청, 또는 그 혈청으로부터 통상적인 방법에 따라서 면역 글로블린 획분을 정제하여, 폴리클로날 항체를 조제할 수 있다. 그 폴리클로날 항체의 활성은, 상기 1.(7) 에 기재된 방법에 의해, 항원에 대한 결합 활성을 평가할 수 있다.

3. 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 제조

(1) 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체 발현용 벡터의 구축

인간형 키메라 항체 및 인간화 항체 발현용 벡터 (이하, 양자를 일괄하여 인간화 항체 발현용 벡터라고 한다) 로는, 인간 항체의 CH 및/또는 CL 을 코딩하는 유전자가 삽입된 동물 세포용 발현 벡터이면 어떠한 것이나 상관없다. 인간화 항체 발현용 벡터는, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL 을 코딩하는 유전자를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.

인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL 일 수 있고, 예를 들어, 인간 항체 H 사슬의 IgG1 서브클래스의 C 영역 (이하, hCγ1 로 표기한다) 및 인간 항체 L 사슬의 κ 클래스의 C 영역 (이하, hCκ 로 표기한다) 등을 들 수 있다. 인간 항체의 CH 및 CL 을 코딩하는 유전자로는 엑손과 인트론으로 이루어지는 염색체 DNA 를 사용할 수 있고, 또한, cDNA 를 사용할 수도 있다.

동물 세포용 발현 벡터로는, 인간 항체의 C 영역을 코딩하는 유전자를 재조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGEl07 (Cytotechnology, 3, 133-140, 1990), pAGE103 (Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987), pHSG274 (Gene, 27, 223-232, 1984), pKCR (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 1527-1531, 1981), pSG1βd2-4 (Cytotechnology, 4, 173-180, 1990) 등을 들 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용하는 프로모터와 인핸서로는, SV40 의 초기 프로모터와 인핸서 (Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터와 인핸서 (Biochemical & Biophysical Research Communications, 149, 960-968, 1987), 이뮤노글로블린 H 사슬의 프로모터 (Cell, 41, 479-487, 1985) 와 인핸서 (Cell, 33, 717-728, 1983) 등을 들 수 있다.

인간화 항체 발현용 벡터는, 항체 H 사슬 및 L 사슬이 별도의 벡터 상에 존재하는 타입 또는 동일 벡터 상에 존재하는 타입 (이하, 탠덤형으로 표기한다) 중 어느 쪽이라도 사용할 수 있지만, 인간형 키메라 항체 발현 벡터 및 인간화 항체 발현 벡터의 구축이 용이한 점, 동물 세포로의 도입이 용이한 점, 동물 세포 내에 서의 항체 H 사슬 및 L 사슬의 발현량 밸런스가 균형을 이루는 등의 점에서 탠덤형의 인간화 항체 발현용 벡터쪽이 바람직하다 (Journal of Immunological Methods, 167, 271-278, 1994). 탠덤형의 인간화 항체 발현용 벡터로는, pKANTEX93 (WO97/10354), pEE18 (Hybridoma, 17, 559-567, 1998) 등을 들 수 있다.

구축한 인간화 항체 발현용 벡터는, 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 동물 세포에서의 발현에 사용할 수 있다.

(2) 인간 이외 동물의 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA 의 취득 및 아미노산 서열의 해석

인간 이외 동물의 항체, 예를 들어, 마우스 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 는 다음과 같이 하여 취득할 수 있다.

하이브리도마로부터 mRNA 를 추출하여, cDNA 를 합성한다. 합성한 cDNA 를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제조한다. 그 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 프로브로서 사용하여, VH 를 코딩하는 cDNA 를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적하는 마우스 항체의 VH 및 VL 의 전체 염기 서열을 결정하여, 염기 서열로부터 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열을 추정한다.

인간 이외의 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마를 제조하는 것이 가능하다면, 어떠한 것도 사용할 수 있다.

하이브리도마로부터 전체 RNA 를 조제하는 방법으로는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법 (Methods in Enzymology, 154, 3-28, 1987), 또한 전체 RNA 로부터 mRNA 를 조제하는 방법으로는, 올리고 (dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989) 등을 들 수 있다. 또, 하이브리도마로부터 mRNA 를 조제하는 키트로는, Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia 사 제조) 등을 들 수 있다.

cDNA 의 합성 및 cDNA 라이브러리 제조법으로는, 통상적인 방법 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989 ; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34), 또는 시판되는 키트, 예를 들어, Super Script^TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL 사 제조) 이나 ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene 사 제조) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

cDNA 라이브러리의 제조시, 하이브리도마로부터 추출한 mRNA 를 주형으로 하여 합성한 cDNA 를 삽입한 벡터는, 그 cDNA 를 삽입할 수 있는 벡터이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP Express (Strategies, 5, 58-61, 1992), pBlue script II SK(+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494, 1989), λ ZAPII (Stratagene 사 제조), λgt10, λgt11 (DNA Cloning : A Practical Approach, I, 49, 1985), Lambda Blue Mid (Clontech 사 제조), λExCell, pT7T3 18U (Pharmacia 사 제조), pcD2 (Molecular & Cellular Biology, 3, 280-289, 1983) 및 pUC18 (Gene, 33, 103-119, 1985) 등의 파지 또는 플라스미드 벡터가 사용된다.

파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로는 그 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, XL1-Blue MRF' (Journal of Biotechnology, 23, 271-289, 1992), C600 (Genetics, 59, 177-190, 1968), Y1088, Y1090 (Science, 222, 778-782, 1983), NM522 (Journal of Molecular Biology, 166, 1-19, 1983), K802 (Journal of Molecular Biology, 16, 118-133, 1966) 및 JM105 (Gene, 38, 275-276, 1985) 등이 사용된다.

cDNA 라이브러리로부터의 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 클론의 선택법으로는, 방사성 동위 원소 또는 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니 하이브리다이제이션법 또는 플라크 하이브리다이제이션법 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989) 에 의해 선택할 수 있다. 또, 프라이머를 조제하고, mRNA 로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, Polymerase Chain Reaction (이하, PCR 법이라고 표기한다 ; Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989 ; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34) 에 의해 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를 조제할 수도 있다.

상기 방법에 의해 선택된 cDNA 를 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-) (Stratagene 사 제조) 등의 플라스미드 벡터에 클로닝하여, 통상적으로 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예를 들어, 디데옥시법 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 5463-5467, 1977) 등의 반응을 실시하고, 염기 서열 자동 분석 장치 ABI PRISM 377 (ABI 사 제조) 등을 사용하여 해석함으로써 그 cDNA 의 염기 서열을 결정할 수 있다.

결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열을 추정하고, 공지되어 있는 항체의 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) 과 비교함으로써, 취득한 cDNA 가 분비를 위한 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL 의 완전한 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 확인할 수 있다. 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL 의 완전한 아미노산 서열에 관해서는, 공지되어 있는 항체의 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) 과 비교함으로써, 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가서는 그들이 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또, VH 및 VL 의 각 CDR 의 아미노산 서열에 관해서도, 공지되어 있는 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) 과 비교함으로써 알아낼 수가 있다.

또한, VH 및 VL 의 완전한 아미노산 서열을 사용하여 임의의 데이터 베이스, 예를 들어, SW1SS-PROT 나 PIR-Protein 등에 대하여 BLAST 법 (Journal of Molecular Biology, 215, 403-410, 1990) 등과 같은 서열의 상동성 검색을 실시하여, 서열의 신규성을 검토할 수 있다.

(3) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축

상기 3(1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 을 코딩하는 유전자의 상류에, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예를 들어, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 의 3' 말단측 염기 서열과 인간 항체의 CH 및 CL 의 5' 말단측 염기 서열로 이루어지고, 또한 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA 와 각각 연결하여, 각각을 상기 3(1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 을 코딩하는 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현되도록 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 또한, 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고, 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를 증폭해서, 각각을 상기 3(1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 을 코딩하는 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현되도록 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.

(4) 인간화 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA 의 구축

인간화 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 는, 다음과 같이 하여 구축할 수 있다. 먼저, 목적으로 하는 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하는 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열을 선택한다. 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열로는, 인간 항체에서 유래하는 것이라면 어떠한 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, Protein Data Bank 등의 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) 등을 들 수 있지만, 그 중에서도, 충분한 활성을 갖는 인간화 항체를 제조하기 위해서는, 목적으로 하는 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성 (적어도 60% 이상) 을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다. 다음으로, 선택한 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열에 목적으로 하는 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하여, 인간화 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자 염기 서열에서 관찰되는 코돈의 사용 빈도 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) 를 고려해서 염기 서열로 변환하여, 인간화 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 설계한다. 설계한 염기 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 몇 개의 합성 DNA 를 합성하고, 그들을 사용해서 PCR 을 실시한다. 이 경우, PCR 에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA 의 길이로부터, VH, VL 모두 6 개의 합성 DNA 를 설계하는 것이 바람직하다.

또한, 양단에 위치하는 합성 DNA 의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 상기 3(1) 에서 구축한 인간화 항체 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-) (Stratagene 사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 상기 3(2) 에 기재된 방법에 의해서, 염기 서열을 결정하여, 원하는 인간화 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.

(5) 인간화 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변

인간화 항체는, 목적으로 하는 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 만을 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 에 이식한 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 인간 이외 동물의 항체와 비교하여 저하된다는 사실이 알려져 있다 (BlO/TECHNOLOCY, 9, 266-271, 1991). 이 원인으로는, 원래의 인간 이외 동물의 항체의 VH 및 VL 에서는, CDR 뿐만 아니라 FR 의 몇 개의 아미노산 잔기가 직접적 또는 간접적으로 항원 결합 활성에 관여하고 있고, 그들 아미노산 잔기가 CDR 의 이식에 수반하여, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 이 상이한 아미노산 잔기로 변화되어 버리기 때문인 것으로 생각되고 있다. 이 문제를 해결하기 위해서, 인간화 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기나 CDR 의 아미노산 잔기와 상호 작용하거나, 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하여, 그것들을 원래의 인간 이외 동물의 항체에서 발견되는 아미노산 잔기로 개변함으로써, 저하된 항원 결합 활성을 상승시키는 것이 실시되 고 있다 (BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991). 인간화 항체의 제조에 있어서는, 그들 항원 결합 활성에 관계되는 FR 의 아미노산 잔기를 어떻게 효율적으로 동정할까가 가장 중요한 점으로, 그 때문에 X 선 결정 해석 (Journal of Molecular Biology, 112, 535-542, 1977) 또는 컴퓨터 모델링 (Protein Engineering, 7, 1501-1507, 1994) 등에 의한 항체의 입체 구조의 구축 및 해석이 실시되고 있다. 이들 항체의 입체 구조의 정보는 인간화 항체의 제조에 많은 유익한 정보를 가져왔지만, 그 한편, 모든 항체에 적응 가능한 인간화 항체의 제조법은 아직 확립되어 있지 않아, 현 상황에서는 각각의 항체에 대해서 몇 종의 개변체를 제조하여, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 등의 여러 가지 시행 착오가 필요하다.

인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 잔기의 개변은, 개변용 합성 DNA 를 사용하여 상기 3(4) 에 기재된 PCR 법을 실시함으로써, 달성할 수 있다. PCR 후의 증폭 산물에 관해서 상기 3(2) 에 기재된 방법에 의해 염기 서열을 결정하여, 목적한 개변이 실시되었음을 확인한다.

(6) 인간화 항체 발현 벡터의 구축

상기 3(1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 을 코딩하는 유전자의 상류에, 상기 3(4) 및 (5) 에서 구축한 인간화 항체의 VH 및 VL 을 코딩하는 cDNA 를 클로닝하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.

예를 들어, 상기 3(4) 및 (5) 에서 인간화 항체의 VH 및 VL 을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA 의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 상기 3(1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인 간 항체의 CH 및 CL 을 코딩하는 유전자 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현되도록 클로닝할 수 있다.

(7) 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 일과성 발현

제조한 여러 종류의 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가하기 위해서, 상기 3(3) 및 (6) 에 기재된 인간형 키메라 항체 발현 벡터 및 인간화 항체 발현 벡터, 또는 그것들을 개변한 발현 벡터를 사용하여 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 일과성 발현을 실시할 수 있다. 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로는, 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포이면 어떠한 세포도 사용할 수 있지만, 그 발현량이 높다는 점에서 COS-7 세포 (ATCC CRL1651) 가 일반적으로 사용된다 (Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991). COS-7 세포로 발현 벡터를 도입하는 방법으로서는, DEAE-덱스트란법 (Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991), 리포펙션법 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 7413-7417, 1987) 등을 들 수 있다.

발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA (Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988 ; Monoclonal Antibodies ; Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996) 등에 의해 측정할 수 있다.

(8) 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 안정 발현

상기 3(3) 및 (6) 에 기재된 인간형 키메라 항체 발현 벡터 및 인간화 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환 세포를 얻을 수 있다. 숙주 세포로 발현 벡터를 도입하는 방법으로는, 일렉트로포레이션법 (Cytotechnology, 3, 133-140, 1990) 등을 들 수 있다. 인간형 키메라 항체 발현 벡터 및 인간화 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로는, 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포이면 어떠한 세포라도 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스 SP2/0-Ag14 세포 (ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포 (ATCC CRL1580), 디히드로엽산 환원 효소 유전자 (이하, dhfr 로 표기한다) 가 결손된 CHO 세포 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77, 4216-4220, 1980), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포 (ATCC CRL1662, 이하, YB2/0 세포로 표기한다) 등을 들 수 있다.

발현 벡터의 도입 후, 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환체는, 일본 공개특허공보 평2-257891호에 개시되어 있는 방법에 따라서, G418 sulfate (이하, G418 로 표기한다) 등의 약제를 함유하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택할 수 있다. 동물 세포 배양용 배지로는, RPMI 1640 배지 (닛스이 제약사 제조), GIT 배지 (닛폰 제약사 제조), EX-CELL 302 배지 (JRH 사 제조), IMDM (GIBCO BRL 사 제조), Hybridoma-SFM (GIBCO BRL 사 제조), 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 얻어진 형질 전환 세포를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 인간형 키 메라 항체 및 인간화 항체를 발현 축적시킬 수 있다. 배양 상청 중의 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은, ELISA 에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질 전환 세포는, 일본 공개특허공보 평2-257891호에 개시되어 있는 방법에 따라서, dhfr 증폭계 등을 이용하여 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 발현량을 상승시킬 수 있다.

인간형 키메라 항체 및 인간화 항체는, 형질 전환 세포의 배양 상청으로부터 프로테인 A 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다 (Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988 ; Monoclonal Antibodies ; Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996). 또한, 그밖에 통상, 단백질의 정제에서 사용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합하여 실시함으로써, 정제할 수 있다. 정제한 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 H 사슬, L 사슬 또는 항체 분자 전체의 분자량은, 폴리아크릴 아미드겔 전기 영동 (이하, PAGE 로 표기한다 : Nature, 227, 680-685, 1970) 이나 웨스턴 블롯팅법 (Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988 ; Monoclonal Antibodies ; Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996) 등에 의해 측정할 수 있다.

(9) 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체와 항원과의 결합 활성 평가

인간형 키메라 항체 및 인간화 항체와 항원과의 결합 활성 평가는, 상기에 기재된 ELISA 를 사용하여 실시할 수 있다.

4. 항체 단편의 제조

항체 단편은, 상기 1 및 3 에 기재된 항체를 바탕으로 유전자 공학적 수법 또는 단백질 화학적 수법에 의해 제조할 수 있다.

유전자 공학적 수법으로는, 원하는 항체 단편을 코딩하는 유전자를 구축하여, 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 대장균 등의 적당한 숙주를 사용해서 발현, 정제를 실시하는 등의 방법을 들 수 있다.

단백질 화학적 수법으로는, 펩신, 파파인 등의 단백질 분해 효소를 사용한 부위 특이적 절단, 정제 등의 방법을 들 수 있다.

항체 단편으로, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv, diabody, dsFv 및 CDR 을 포함하는 펩티드의 제조법에 대해 이하에서 구체적으로 설명한다.

(1) Fab 의 제조

Fab 은, 단백질 화학적으로는 IgG 를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리함으로써 제조할 수 있다. 파파인 처리 후에는, 원래의 항체가 프로테인 A 결합성을 갖는 IgG 서브클래스이면, 프로테인 A 칼럼에 통과시킴으로써, IgG 분자나 Fc 단편과 분리하여, 균일한 Fab 로서 회수할 수 있다 (Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, 1995). 프로테인 A 결합성을 갖지 않는 IgG 서브클래스의 항체인 경우에는, 이온 교환 크로마토그래피에 의해, Fab 은 저염 농도에서 용출되는 획분 중에서 회수할 수 있다 (Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, 1995).

또한, Fab 은 유전자 공학적으로는, 대부분의 경우 대장균을 사용하여, 또한, 곤충 세포나 동물 세포 등을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 3(2), 3(4) 및 3(5) 에 기재된 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA 를 Fab 발현용 벡터에 클로닝하여, Fab 발현 벡터를 제조할 수 있다. Fab 발현용 벡터로는, Fab 용의 DNA 를 재조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, pIT106 (Science, 240, 1041-1043, 1988) 등을 들 수 있다. Fab 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여, 봉입체 혹은 페리플라즘 (periplasm) 에 Fab 을 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 사용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 Fab 로 할 수 있고, 또한, 페리플라즘에 발현시킨 경우에는, 배양 상청 중에 활성을 가진 Fab 가 누출된다. 리폴딩 후 또는 배양 상청으로부터는, 항원을 결합시킨 칼럼을 사용함으로써 균일한 Fab 을 정제할 수 있다 (Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992).

(2) F(ab')₂ 의 제조

F(ab')₂ 는, 단백질 화학적으로는 IgG 를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리함으로써 제조할 수 있다. 펩신의 처리 후에는, Fab 과 동일한 정제 조작에 의해, 균일한 F(ab')₂ 로서 회수할 수 있다 (Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, Academic Press, 1995). 또, 하기 4(3) 에 기재된 Fab' 을 o-PDM 이나 비스말레이미드헥산 등과 같은 말레이미드로 처리하고, 티오에테르 결합시키는 방법이나, DTNB[5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)] 로 처리하 고, S-S 결합시키는 방법에 의해서도 제조할 수 있다 (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).

(3) Fab' 의 제조

Fab' 은, 상기 4(2) 에 기재된 F(ab')₂ 를 디티오트레이틀 등의 환원제로 처리하여 수득할 수 있다. 또한, Fab' 는 유전자 공학적으로는, 대부분의 경우 대장균, 또한, 곤충 세포나 동물 세포 등을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 3(2), 3(4) 및 3(5) 에 기재된 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA 를 Fab' 발현용 벡터에 클로닝하여, Fab' 발현 벡터를 제조할 수 있다. Fab' 발현용 벡터로는, Fab' 용의 DNA 를 재조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, pAK19 (BIO/TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992) 등을 들 수 있다. Fab' 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여, 봉입체 혹은 페리플라즘에 Fab' 를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 사용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 Fab' 로 할 수 있고, 또한, 페리플라즘에 발현시킨 경우에는, 리소자임에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 소니케이션 (sonication) 등의 처리에 의해 균을 파쇄하여, 균체 밖으로 회수시킬 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는, 프로테인 G 칼럼 등을 사용함으로써 균일한 Fab' 를 정제할 수 있다 (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).

(4) scFv 의 제조

scFv 는 유전자 공학적으로는, 파지 또는 대장균, 또한, 곤충 세포나 동물 세포 등을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 3(2), 3(4) 및 3(5) 에 기재된 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA 를 scFv 발현용 벡터에 클로닝하여, scFv 발현 벡터를 제조할 수 있다. scFv 발현용 벡터로는, scFv 의 DNA 를 재조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, pCANTAB5E (Pharmacia 사 제조), pHFA (Human Antibodies & Hybridomas, 5, 48-56, 1994) 등을 들 수 있다. scFv 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여, 헬퍼 파지를 감염시킴으로써, 파지 표면에 scFv 가 파지 표면 단백질과 융합한 형태로 발현되는 파지를 얻을 수 있다. 또, scFv 발현 벡터를 도입한 대장균의 봉입체 혹은 페리플라즘에 scFv 를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 사용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 scFv 로 할 수 있고, 또한, 페리플라즘에 발현시킨 경우에는, 리소자임에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 소니케이션 등의 처리에 의해 균을 파쇄하여, 균체 밖으로 회수시킬 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는, 양이온 교환 크로마토그래피 등을 사용함으로써 균일한 scFv 를 정제할 수 있다 (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).

(5) diabody 의 제조

diabody 는 유전자 공학적으로는, 대부분의 경우 대장균, 또한, 곤충 세포나 동물 세포 등을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 3(2), 3(4) 및 3(5) 에 기재된 항체의 VH 와 VL 을 링커가 코딩하는 아미노산 잔기가 8 잔기 이하가 되도록 연결한 DNA 를 제조해서, diabody 발현용 벡터에 클로닝하여, diabody 발현 벡터를 제조할 수 있다. diabody 발현용 벡터로는, diabody 의 DNA 를 재조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, pCANTAB5E (Pharmacia 사 제조), pHFA (Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994) 등을 들 수 있다. diabody 발현 벡터를 도입한 대장균의 봉입체 혹은 페리플라즘에 diabody 를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는 통상 단백질에서 사용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 diabody 로 할 수 있고, 또한, 페리플라즘에 발현시킨 경우에는, 리소자임에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 소니케이션 등의 처리에 의해 균을 파쇄하여, 균체 밖으로 회수시킬 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는, 양이온 교환 크로마토그래피 등을 사용함으로써 균일한 diabody 를 정제할 수 있다 (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).

(6) dsFv 의 제조

dsFv 는 유전자 공학적으로는, 대부분의 경우 대장균, 또한, 곤충 세포나 동물 세포 등을 사용하여 제조할 수 있다. 먼저, 상기 3(2), 3(4) 및 3(5) 에 기재된 항체의 VH 와 VL 을 코딩하는 DNA 의 적당한 위치에 변이를 도입하여, 코딩하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 DNA 를 제조한다. 제조한 각 DNA 를 dsFv 발현용 벡터에 클로닝하여, VH 및 VL 의 발현 벡터를 제조할 수 있다. dsFv 발현용 벡터로는, dsFv 용의 DNA 를 재조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, pULI9 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994) 등을 들 수 있다. VH 및 VL 의 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여, 봉입체 혹은 페리플라즘에 dsFv 를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체 혹은 페리플라즘으로부터 VH 및 VL 을 수득하고, 혼합하여, 통상 단백질에서 사용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 dsFv 로 할 수 있다. 리폴딩 후에는, 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 등에 의해서 추가로 정제할 수 있다 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).

(7) CDR 펩티드의 제조

CDR 을 포함하는 펩티드는, Fmoc 법 또는 tBoc 법 등의 화학 합성법에 의해서 제조할 수 있다. 또한, CDR 을 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA 를 제조하고, 제조한 DNA 를 적당한 발현용 벡터에 클로닝하여, CDR 펩티드 발현 벡터를 제조할 수 있다. 발현용 벡터로는, CDR 펩티드를 코딩하는 DNA 를 재조합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, pLEX (Invitrogen 사 제조), pAX4a+ (Invitrogen 사 제조) 등을 들 수 있다. 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하여, 봉입체 혹은 페리플라즘에 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체 혹은 페리플라즘으로부터 CDR 펩티드를 수득하고, 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 등에 의해 정제할 수 있다 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).

(8) 항체 단편과 항원과의 결합 활성 평가

정제한 항체 단편과 항원과의 결합 활성 평가는, 상기 1(7) 에 기재된 ELISA 를 사용하여 실시할 수 있다.

5. 본 발명의 치료제

본 발명의 자궁 내막증 치료제로는, IL-5 앤타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 의약이면 어떠한 것이나 상관없지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에 있어서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 물, 혹은 식염, 글리신, 글루코오스, 인간 알부민 등의 수용액 등과 같은 수성 담체에 용해한 무균적 용액이 사용된다. 또, 제제 용액을 생리적 조건에 근접하게 하기 위한 완충화제나 등장화제와 같은, 약리학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 락트산나트륨, 염화칼륨, 시트르산나트륨 등을 첨가할 수도 있다. 또한, 동결 건조시켜서 저장하고, 사용시에 적당한 용매에 용해시켜 사용할 수도 있다.

본 발명의 치료제의 투여 경로는, 치료시에 있어서 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있지만, 정맥내 투여가 바람직하다.

경구 투여에 적당한 제제로는, 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다. 예를 들어 유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은, 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 기름류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 스트로베리 플레이버, 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다. 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은, 유당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 탤크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면 활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.

비경구 투여에 적당한 제제로는, 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다. 예를 들어, 주사제는, 염 용액, 포도당 용액, 또는 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 사용하여 조제한다. 좌제는 카카오지(脂), 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 조제된다. 또, 분무제는 그 앤타고니스트 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 그 앤타고니스트를 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 조제한다. 담체로서 구체적으로는 유당, 글리세린 등을 예시할 수 있다. 그 앤타고니스트 및 사용하는 담체의 성질에 따라서, 에어로졸, 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.

본 발명의 치료제의 투여량 또는 투여 횟수는, 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 따라서 다르지만, 통상 성인 1 일당 10㎍/㎏ ～ 10㎎/㎏ 이다.

이하에 본 발명의 실시예를 나타낸다.

실시예 1

래트 자궁 내막증 자가 이식 모델에 대한 항 IL-5 수용체 항체 및 항 IL-5 항체의 억제 작용

래트 자궁 내막증 자가 이식 모델을 사용한 항 IL-5 수용체 항체 및 항 IL-5 항체의 억제 효과에 관해서, 이하의 실험을 실시하였다.

방법으로는, 공지된 방법 [임신과 불임 (Fertility and sterility), 44 권, 684 ～ 694 페이지 (1985년)] 을 개변하여 실시하였다.

래트에 있어서 성(性) 성숙된 8 주령 이상의 SD 계 암컷 래트 (일본 챨스 리버사 제조) 를 구입하여, 성 주기를 래트용 질 임피던스 체커 (MK-10B, 무로마치 기계사 제조) 를 사용해서 매일 측정하였다. 4 ～ 5 일 주기의 성 주기가 2 회 이상 관찰된 래트 중 발정 전기(前期)에 있는 래트를 선별하여, 다음과 같이 자궁 내막 조직을 자가 이식하였다.

피험약물을 래트에 정맥내 투여한 후, 펜토바르비탈 (소므노펜틸^(R), 다케다 쉐링 프라우 애니멀헬스사 제조) 의 복강내 투여에 의해 전신 마취한 래트의 복부를 털을 깎고, 정중선을 따라서 약 6 센티미터 개복하였다. 쌍각으로 존재하는 자궁 중, 오른쪽 자궁의 근원 부위로부터 약 1 센티미터 상부 및 난소로부터 약 2 센티미터 하부를 결삭(結索)하여, 그 사이에 있는 자궁을 적출하였다. 적출 자궁 (관형상) 은 페니실린 스트렙토마이신 (INVITROGEN 사 제조) 을 함유하는 둘베코 모디파이드 이글 미디움 (INVITROGEN 사 제조) 중에서 세척하면서, 세로로 개열하여 시트형상으로 하였다. 이 시트로부터 가로세로 약 2 밀리미터의 자궁 내막편을 제조하였다. 제조한 자궁 내막편은, 좌우 복막에 각각 멸균사가 장착된 봉합침 (외과용 약만각침 No.12 - 흑나일론 No.6-0, 나쓰메 제작소 제작) 을 사용 하여 자가 이식하였다. 이 때, 자궁 내막면이 복막에 접하도록 이식하였다. 또, 대조로서, 자궁 내막편과 동 사이즈의 지방 조직을 동일 개체로부터 적출하여, 복막에 동일하게 자가 이식하였다. 마지막으로, 이식 부위 및 자궁 적출 부위를 미크로노마이신 (사가미신^(R) 주사액, 쿄와 발효 공업사 제조) 을 함유하는 생리 식염수로 세척하고, 즉시 복막 및 피부를 멸균사가 장착된 봉합침에 의해 신중하게 봉합하였다.

자가 이식 1 주일 후에, 에테르 마취하에 방혈 치사시키고, 복부를 개복하여, 자궁 내막 병변을 육안으로 평가 (이식편의 사이즈 측정) 하였다. 이식편의 사이즈는 금형 노기스를 사용하여 가로 세로 각각의 직경을 측정하였다 (최소 눈금 0.5㎜). 시험은 1 군 5 마리로 실시하였다. 또한, 필요하다면, 이식 부위의 병리 표본을 정법에 따라서 제조하여, 병리 조직학적 해석을 실시하였다.

피험약물로서 1㎎/㎏ 항 마우스 IL-5 수용체 항체 및 항 마우스 IL-5 항체 (International Immunology, 3(2) ; 135-9, 1991) 를, 컨트롤 항체로서 1㎎/㎏ 래트 IgG 항체 (ICN 사 제조) 를 각각 사용하였다. 항체는 모두 멸균한 인산 완충액 (ICN 사 제조) 으로 희석하여 사용하였다.

이식편 사이즈에 대한 결과를 표 1 에 나타내었다. 이식편 사이즈는 세로 직경과 가로 직경을 곱하여 산출한 값으로 하여, 좌우 이식편 사이즈를 평균해서 나타내었다.

표 1 에 나타낸 바와 같이, 이식 1 주일 후에 증대되는 이식편의 사이즈가, 항 IL-5 항체 및 항 IL-5 수용체 항체를 투여함으로써 축소되었다 (억제율 ; 항 IL-5 항체 : 14%, 항 IL-5 수용체 항체 : 15%).

투여군	용량 (㎎/㎏)	투여 경로	투여 횟수	이식편 사이즈 (㎟)
컨트롤 항체	1	정맥내	이식 직전에 1 회	16.8±3.3
항 IL-5 수용체 항체	1	정맥내	이식 직전에 1 회	14.3±2.3
항 IL-5 항체	1	정맥내	이식 직전에 1 회	14.4±1.1

실시예 2

래트 자궁 내막증 자가 이식 모델에 대한 항 IL-5 수용체 항체의 유착 억제

래트 자궁 내막증 자가 이식 모델을 사용하여 항 IL-5 수용체 항체가 자궁 내막의 유착을 억제하고 있음을 확인하기 위해서, 이하의 실험을 실시하였다. 실험 방법은, 실시예 1 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.

래트에 있어서 성 성숙된 8 주령 이상의 SD 계 암컷 래트 (일본 챨스 리버사 제조) 를 구입하여, 성 주기를 래트용 질 임피던스 체커 (MK-10B, 무로마치 기계사 제조) 를 사용해서 매일 측정하였다. 4 ～ 5 일 주기의 성 주기가 2 회 이상 관찰된 래트 중 발정 전기에 있는 래트를 선별하여, 다음과 같이 해서 자궁 내막 조직을 자가 이식하였다.

피험약물을 래트에 정맥내 투여한 후, 펜토바르비탈 (소므노펜틸^(R), 다케다 쉐링 프라우 애니멀헬스사 제조) 의 복강내 투여에 의해 전신 마취한 래트의 복부를 털을 깎고, 정중선을 따라서 약 6 센티미터 개복하였다. 쌍각으로 존재하는 자궁 중, 오른쪽 자궁의 근원 부위로부터 약 1 센티미터 상부 및 난소로부터 약 2 센티미터 하부를 결삭하여, 그 사이에 있는 자궁을 적출하였다. 적출 자궁 (관형상) 은 페니실린 스트렙토마이신 (INVITROGEN 사 제조) 을 함유하는 둘베코 모디파이드 이글 미디움 (INVITROGEN 사 제조) 중에서 세척하면서, 세로로 개열하여 시트형상으로 하였다. 이 시트로부터 가로세로 약 2 밀리미터의 자궁 내막편을 제조하였다. 제조한 자궁 내막편은, 좌우 복막에 각각 멸균사가 장착된 봉합침 (외과용 약만각침 No.12 - 흑나일론 No.6-0, 나쓰메 제조소 제작) 을 사용하여 자가 이식하였다. 이 때, 자궁 내막면이 복막에 접하도록 이식하였다. 또, 대조로서, 자궁 내막편과 동 사이즈의 지방 조직을 동일 개체로부터 적출하여, 복막에 동일하게 자가 이식하였다. 마지막으로, 이식 부위 및 자궁 적출 부위를 미크로노마이신 (사가미신^(R) 주사액, 쿄와 발효 공업사 제조) 을 함유하는 생리 식염수로 세척하고, 즉시 복막 및 피부를 멸균사가 장착된 봉합침에 의해 신중하게 봉합하였다.

자가 이식 1 주일 후에, 에테르 마취하에 방혈 치사시키고, 복부를 개복하여, 자궁 내막 병변을 육안으로 평가 (유착 스코어) 하였다. 유착은 이하의 기준에 따라서 스코어화하였다.

유착이 인정되지 않은 것 ; 스코어 0

유착이 인정되지만 가벼운 정도인 것 ; 스코어 1

강한 유착이 인정되지만 박리성인 것 ; 스코어 2

강한 유착이 인정되며 비박리성인 것 ; 스코어 3

시험은 1 군 5 마리로 실시하였다. 또한, 필요하다면, 이식 부위의 병리 표본을 정법에 따라서 제조하여, 병리 조직학적 해석을 실시하였다.

피험약물로서 항 마우스 IL-5 수용체 항체 (International Immunology., 3(2) ; 135-9, 1991) 를 사용하였다. 래트 IgG 항체 (ICN 사 제조) 를 컨트롤 항체로서 사용하였다. 항체는 모두 멸균한 인산 완충액 (ICN 사 제조) 으로 희석하여 사용하였다.

병변 부위에 있어서의 유착 스코어에 관한 결과를 표 2 에 나타내었다. 유착 스코어는 각각을 점수로 하여, 좌우 이식편의 유착 스코어를 평균해서 나타내었다.

투여군	용량 (㎎/㎏)	투여 경로	투여 횟수	유착 스코어
컨트롤 항체	1	정맥내	이식 직전에 1 회	1.4±0.5
항 IL-5 수용체 항체	1	정맥내	이식 직전에 1 회	1.0±0.4

표 2 에 나타낸 바와 같이, 본 래트 자궁 내막 자가 이식 모델에서는 임상에서 관찰되는 자궁 내막증 환자 병변부에서 관찰되는 유착이 분명히 인정되었다. 그 유착 스코어에 대하여, 항 IL-5 수용체 항체 투여군에서 억제하는 경향이 나타났다 (억제율 29%). 또, 대조로서 지방 조직을 이식한 경우에는 유착은 거의 관찰되지 않았다.

실시예 3

마우스 자궁 내막증 모델에 있어서의 항 마우스 IL-5 수용체 항체의 자궁 내막증 병변 형성 억제 작용

항 IL-5 수용체 항체의 자궁 내막증에 대한 유효성을 검증하기 위해서, 이하의 실험을 실시하였다.

방법으로는, 공지된 방법 [휴먼 리프로덕션 (Human Reproduction), 14 권, 2944 ～ 2950 페이지 (1999년)] 을 개변하여 실시하였다.

마우스에 있어서 성 성숙된 8 주령 이상의 Balb/c 계 암컷 마우스 (일본 챨스 리버사 제조) 를 실험에 사용하였다. 구입 후 1 주일의 순화 기간 후, 성 호르몬 환경을 균일하게 하기 위해서, 모든 개체에서 좌우 난소 적출술을 실시한 후, 에스트로겐을 외인성으로 투여하였다. 즉, 펜토바르비탈 (소므노펜틸^(R), 다케다 쉐링 프라우 애니멀헬스사 제조) 50㎎/㎏ 의 복강내 투여에 의해 전신 마취한 마우스의 등부의 피부를 정중선을 따라서 약 1㎝ 절개하고, 거기서부터 좌우 난소가 있는 위치의 복막에 칼집 (약 3㎜) 을 넣었다. 그 칼집으로부터 양측 난소를 적출한 후, 빠르게 등부 피부를 봉합하여 사육 케이지로 되돌렸다. 그 후, 에스트로겐 (프로기논^(R)?데포 (Progynon-Depot) 10㎎, 일본 쉐링, 발레르산 에스트라디올 주사액) 100㎍/㎏ 을 왼쪽 뒷다리 근육내에 주사하였다. 이 처치에 의해, 마우스에서는 4 일 주기로 확인되는 성 주기 중 고에스트로겐기인 발정 전기의 마우스 자궁과 같은 정도의 중량까지 자궁이 팽대되는 것을 확인하였다.

이어서, 난소 적출 1 주일 후, 모든 개체를 도너 마우스와 레시피엔트 마우스로 1 : 2 의 구성비로 나눠서, 도너 마우스의 자궁을 적출하여 조제한 자궁 내막편을 레시피엔트 마우스의 복강내에 파종하였다. 즉, 방혈 치사시킨 도너 마우스로부터 적출한 좌우 자궁으로부터 주위의 지방 조직이나 자궁 경부를 제거하고, 내막이 포함되는 자궁체부를 소형 수술용 가위로 세절(細切)하여 조제하였다. 자궁 내막편은 항생 물질을 함유하는 멸균 HBSS 액 (Hank's Balanced Salt Solution, 시그마사 제조) 에 부유시키고, 전체 도너 마우스분을 풀(pool)하였다. 이, 자궁 내막편 부유액 0.8mL (자궁 내막편으로서 약 50㎎ 상당) 를 펜토바르비탈 40㎎/㎏ 으로 전신 마취한 레시피엔트 마우스에 19G 주사바늘 (테르모사 제조) 이 달린 시린지에 의해 복강내 투여하여 파종하였다. 자궁 내막편 부유액을 시린지로 충전 및 투여할 때에는, 부유액을 잘 교반하여 불균일해지지 않도록 실시하였다. 그 후, 양성 대조군 및 약물 평가군에는 에스트로겐 100㎍/㎏ 을, 음성 대조군에는 에스트로겐의 용매인 참기름을 주 1 회 근육내 투여하였다.

자궁 내막편을 파종한 지 3 주일 후, 방혈 치사시킨 후 개복하여, 자궁 내막 병변을 육안으로 평가 (형성되는 낭포 사이즈의 측정) 하였다. 병변 사이즈는 금형 노기스를 사용하여 가로 세로 각각의 직경을 측정하고 (최소 눈금 0.5㎜), 세로 직경과 가로 직경을 곱하여 산출한 면적으로서 평가하였다. 병변이 복수 형성되는 경우에는, 그 총합을 총면적으로서 평가하고, 시험은 1 군 10 마리로 실시하였다. 또한, 필요하다면, 병변 부위의 병리 표본을 정법에 따라서 제조하여, 병리 조직학적 해석을 실시하였다.

피험약물로서 항 마우스 IL-5 수용체 항체 (International Immunology, 3(2) ; 135-9, 1991, 10㎎/㎏, 주 1 회 투여) 를 사용하였다. 또 양성 대조군에는 컨트롤 항체로서 래트 IgG 항체 (ICN 사 제조, 10㎎/㎏, 주 1 회 투여) 를 사용하였다. 항체는 모두 멸균 생리 식염 주사액 (오오쓰카 제약 공업사 제조) 으로 희석하여 사용하였다.

병변 사이즈에 대한 결과를 도 1 에 나타내었다.

자궁 내막편 파종 3 주일 후에 있어서, 양성 대조군에서는 100% 의 병변 발증률이지만, 음성 대조군에서는 1 마리의 개체에서만 발증이 확인되었다. 또한, 형성된 병변은 모두 자궁 내막 상피에서 내측에 붙어 있는 낭포로, 자궁 내막증 병변임을 병리 조직학적으로 확인하였다. 즉, 본 실험 모델은 에스트로겐 의존성으로 성장하는 것으로 되어 있는 자궁 내막증을 반영하고 있는 유용한 모델로 생각되었다.

본 모델에 있어서, 항 마우스 IL-5 수용체 항체는, 도 1 에 나타내는 바와 같이, 양성 대조군에 비해 유의한 억제 작용을 나타내었다. 또, 자궁 내막편 대신에 동 중량의 소장 점막편을 파종한 경우에는, 에스트로겐의 투여에 의해서도 병변은 전혀 형성되지 않았다.

실시예 4

마우스 자궁 내막증 모델에 있어서의 항 마우스 IL-5 항체의 자궁 내막증 병변 형성 억제 작용

실시예 3 에 기재된 방법에 준하여, 항 IL-5 항체의 자궁 내막증에 대한 유효성을 검증하였다.

실험 방법은, 피험약물로서 항 마우스 IL-5 수용체 항체 대신에, 항 마우스 IL-5 항체 (International Immunology, 3(2) ; 135-9, 1991, 1 및 10㎎/㎏, 주 1 회 투여) 를 사용한 것 외에는 실시예 3 에 기재된 방법과 동일하게 실시하였다.

병변 사이즈에 관한 결과를 도 2 에 나타내었다.

항 마우스 IL-5 항체는 10㎎/㎏ 투여군에 있어서 양성 대조군에 비해 유의한 억제 작용을 나타내었다.

본 발명에 의해, 인터류킨-5 앤타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 자궁 내막증 치료제를 제공할 수 있다.

서열 프리텍스트

서열 번호 9-인공 서열의 설명 : 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열

서열 번호 10-인공 서열의 설명 : 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열

서열 번호 11-인공 서열의 설명 : 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열

서열 번호 12-인공 서열의 설명 : 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열

서열 번호 13-인공 서열의 설명 : 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열

서열 번호 14-인공 서열의 설명 : 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열

서열 번호 15-인공 서열의 설명 : 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열

서열 번호 16-인공 서열의 설명 : 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열

서열 번호 17-인공 서열의 설명 : 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> Therapeutic agent for endometriosis <130> 1726 <150> JP2004-314031 <151> 2004-10-28 <150> JP2005-169027 <151> 2005-06-09 <160> 29 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ser Tyr Val Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 His Thr Ser Arg Leu Gln Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Ala Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Arg Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Leu Cys Gly Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 8 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Asp Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Gly Thr Ser Glu Asp 35 40 45 Ile Ile Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Lys Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Glu Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asp Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 100 105 110 Thr Leu Pro Tyr Thr Val Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys 85 90 95 Gly Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Ala Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys 85 90 95 Gly Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Ala Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys 85 90 95 Gly Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Val Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Val Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Arg Lys Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Val Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Arg Lys Lys Pro Gly Lys Ala Val Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Val Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asp Thr Tyr Met His 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Ala <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Gly Leu Arg Leu Arg Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Asp Tyr Gly Met Ala 1 5 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile His Phe Pro Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Arg Gly Phe Tyr Gly Asn Tyr Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp His Asn Gly Val Asn Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Gln Gln Ser Lys Asp Val Pro Trp Thr 1 5

Claims (13)

1. 자궁 내막증 치료를 위한, 인터류킨-5 수용체 항체 또는 그 항체 단편을 포함하는 약학 조성물로서, 상기 항체 또는 그 항체 단편이 인터류킨-5 와 인터류킨-5 수용체의 결합을 저해하는 약학 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   인터류킨-5 수용체가 인터류킨-5 수용체 α 사슬인 약학 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   인터류킨-5 수용체가 인간 인터류킨-5 수용체인 약학 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   항체가 모노클로날 항체인 약학 조성물.
5. 제 4 항에 있어서,

   모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인 약학 조성물.
6. 제 5 항에 있어서,

   유전자 재조합 항체가, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 유전자 재조합 항체인 약학 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

   항체 단편이, Fab, Fab', F(ab')₂, 1 본쇄 항체 (scFv), 이량체화 가변 영역 (Diabody), 디술파이드 안정화 가변 영역 (dsFv) 및 CDR 을 포함하는 펩티드에서 선택되는 항체 단편인 약학 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제

Images