KR101186227B1 - Growth factor immobilization method with natural chelating materials on biomaterials - Google Patents

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Abstract

본 발명은 임플란트의 코팅층 표면에 효과적으로 골형성 단백질을 고정시키기 위하여 천연 칼슘 킬레이팅제를 사용하는 방법에 관한 것으로서, 이식 후에 면역반응을 최소화할 수 있고, 생착율이 높으면서도 세포 적합성, 생체적합성, 그리고 친수성이 향상되어 빠른 골융합을 유도할 수 있는 생체재료를 제조하는 기술을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 천연 칼슘 킬레이팅제를 이용한 골형성 단백질 고정화 기술은, 골형성 단백질의 손실을 줄이고, 안정적인 고정(juxtacrine) 효과를 유지할 수 있다. 따라서 이식 후에 면역반응을 최소화하고 세포 적합성, 생체적합성, 그리고 골형성 단백질의 도입으로 무기질 생체재료의 친수성이 향상되어 세포의 부착과 분화를 향상시킴으로써 생착율이 높으면서도 빠른 골융합을 유도할 수 있는 생체재료를 제조하는 기술로 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a method of using a natural calcium chelating agent to effectively fix bone forming proteins on the surface of the coating layer of the implant, which can minimize the immune response after transplantation, high engraftment rate, cell compatibility, biocompatibility, and The hydrophilicity is improved to provide a technique for producing a biomaterial that can induce rapid bone fusion.
Bone-forming protein immobilization technology using a natural calcium chelating agent according to the present invention can reduce the loss of bone-forming protein, and maintain a stable juxtacrine effect. Therefore, biomaterials that can induce rapid bone fusion with high engraftment rate by minimizing immune response after transplantation and improving hydrophilicity of inorganic biomaterials by introducing cellular compatibility, biocompatibility, and bone morphogenetic protein improve cell adhesion and differentiation It can be usefully used as a technique for producing a.

Description

천연 칼슘 킬레이팅제를 이용한 골형성 단백질 고정화 방법 {GROWTH FACTOR IMMOBILIZATION METHOD WITH NATURAL CHELATING MATERIALS ON BIOMATERIALS}Method of immobilizing bone morphogenetic protein using natural calcium chelating agent {GROWTH FACTOR IMMOBILIZATION METHOD WITH NATURAL CHELATING MATERIALS ON BIOMATERIALS}

본 발명은 체내에 삽입되는 임플란트에 관한 것으로서, 골융합을 유도하는 골형성 단백질이 고정화된 치과용 또는 정형외과용 임플란트의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to an implant inserted into the body, and relates to a method for producing a dental or orthopedic implant in which bone morphogenic proteins that induce bone fusion are immobilized.

체내에 삽입되는 치과 및 정형외과용 임플란트가 오랜 기간 동안 유지되기 위해서는, 골과 생체재료의 접합면이 안정적으로 유지되어야 한다. 임플란트 시술부의 빠른 골융합과 생체적합성은 이러한 장기간의 임플란트 사용과 관련이 있다. 그러나 일반적으로 체내에 삽입되는 임플란트는 우수한 기계적 특성에도 불구하고, 골융합 및 생체적합성은 양호하지 않다. In order for the dental and orthopedic implants to be inserted into the body to be maintained for a long time, the joint surface of the bone and the biomaterial must be kept stable. Rapid bone fusion and biocompatibility of the implant procedure is associated with this long-term implant use. In general, implants that are inserted into the body, in spite of their good mechanical properties, do not have good bone fusion and biocompatibility.

최근에는 골 및 임플란트 표면간의 세포 작용을 자극하는 표면 처리법이 증가하고 있다. 임플란트를 보다 의학적으로 적용하는 데 있어서 중요한 것은 임플란트에 사용되는 생체재료 표면에 생체 활성물질을 고정하는 것이며, 이미 세포와 조직 반응을 조절하는 금속 표면처리에 대한 연구는 널리 진행되었다. 따라서 임플란트 코팅 기술에 의하여 골형성 단백질을 골-임플란트 접합면에 전달하는 방법이 임플란트의 효과적인 고정과 시술 부위 치유를 위해 많이 사용되어 왔다. 주로 하이드록시아파타이트로 구성된 칼슘 포스페이트는 임플란트 적용에 있어서 전형적이고도 매우 뛰어난 생체적합성이 우수한 세라믹 물질이다. 하이드록시아파타이트는 1926년에 DeJong 등에 의하여 처음으로 뼈의 무기성분이라는 것이 알려졌다. Recently, surface treatment methods for stimulating cellular action between bone and implant surfaces are increasing. In the medical application of implants, it is important to fix bioactive materials on the surface of biomaterials used in implants, and the research on metal surface treatments for controlling cell and tissue reactions has been widely conducted. Therefore, the method of delivering the bone morphogenetic protein to the bone-implant junction by implant coating technology has been widely used for effective fixation of the implant and healing of the treatment site. Calcium phosphate, consisting primarily of hydroxyapatite, is a ceramic material that is typical and very good in biocompatibility for implant applications. Hydroxyapatite was first discovered by DeJong et al. In 1926 as an inorganic component of bone.

그러나 하이드록시아파타이트는 골융합을 증가시키는 장점을 갖고 있는 반면, 취성이 강하여 임플란트로 사용하기 어렵다는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해서 하이드록시아파타이트를 플라즈마 스프레이법, 스퍼터링, 전기분해 졸겔법(sol-gel), 등을 이용하여 티타늄 위에 코팅하는 기술이 연구되었다. 물성이 강한 티타늄 위에 하이드록시아파타이트를 코팅하는 방법은 물리적으로 약한 하이드록시아파타이트의 단점을 보완해 줄 수 있었다. 그러나 하이드록시아파타이트 표면 위에는 작용기가 없기 때문에 골형성 단백질을 효과적으로 고정시키는 것과 생체 내에서 골형성 단백질을 제어하기가 쉽지 않다. 이에, 공유결합을 통하여 하이드록시아파타이트가 코팅된 생체재료 표면에 골형성 단백질을 고정함으로써 생체재료 표면에 골형성 단백질을 장기간 보유할 수 있게 된다. 이러한 고정법에 관한 문제는 공유결합을 통한 단백질 고정에 필요한 아민기를 형성하는 칼슘 킬레이팅 기술을 사용함으로써 해결이 가능하다.However, while hydroxyapatite has an advantage of increasing bone fusion, it has a disadvantage of being difficult to use as an implant due to its brittleness. In order to overcome this problem, a technique of coating hydroxyapatite on titanium using plasma spray, sputtering, electrolysis sol-gel, and the like has been studied. The method of coating hydroxyapatite on titanium with strong physical properties could compensate for the disadvantages of physically weak hydroxyapatite. However, because there are no functional groups on the surface of the hydroxyapatite, it is difficult to effectively fix the bone morphogenic protein and control the bone morphogenic protein in vivo. Thus, by fixing the bone morphogenetic protein on the surface of the hydroxyapatite-coated biomaterial through covalent bonding, it is possible to retain the bone morphogenetic protein on the surface of the biomaterial. This problem of fixation can be solved by using calcium chelating techniques to form amine groups necessary for protein fixation via covalent bonds.

키토산 또한 금속이온과 칼슘이온을 포집하는 능력이 있는데, 이 과정에서 키토산이 함유하고 있는 아민기가 함께 포집된다. 알지네이트는 비록 아민기를 갖고 있지 않지만, 뛰어난 칼슘 킬레이팅 효과를 나타내며 일반적으로 상용화되어 있는 시약이다.Chitosan also has the ability to trap metal ions and calcium ions, in which the amine groups contained in chitosan are captured together. Alginates, although not containing amine groups, exhibit excellent calcium chelating effects and are generally commercialized reagents.

본 발명은 임플란트의 코팅층 표면에 효과적으로 골형성 단백질을 고정시키기 위하여 천연 칼슘 킬레이팅제를 사용하는 방법에 관한 것으로서, 이식 후에 면역반응을 최소화할 수 있고, 생착율이 높으면서도 세포 적합성, 생체적합성, 그리고 친수성이 향상되어 빠른 골융합을 유도할 수 있는 골형성 단백질이 고정된 임플란트를 제조하는 기술을 제공하는 것이다.The present invention relates to a method of using a natural calcium chelating agent to effectively fix bone forming proteins on the surface of the coating layer of the implant, which can minimize the immune response after transplantation, high engraftment rate, cell compatibility, biocompatibility, and It is to provide a technique for preparing an implant in which bone morphogenetic proteins are immobilized to improve hydrophilicity and induce rapid bone fusion.

하기의 단계를 포함하는 골형성 단백질이 고정된 임플란트의 제조방법을 제공한다:Provided is a method for preparing an implant to which bone-forming protein is immobilized, comprising the following steps:

(a) 임플란트 표면에 세라믹 코팅층을 형성하는 단계;(a) forming a ceramic coating layer on the surface of the implant;

(b) 상기 코팅층에 천연 칼슘 킬레이팅제인 키토산 또는 알지네이트를 결합시키는 단계; 및(b) binding chitosan or alginate, a natural calcium chelating agent, to the coating layer; And

(c) 상기 킬라이팅제에 골형성 단백질을 고정시키는 단계.(c) immobilizing the osteogenic protein on the chelating agent.

본 발명은 천연 칼슘 킬레이팅제인 키토산 또는 알지네이트를 이용하여 골형성 단백질을 임플란트에 고정시킴으로써 임플란트의 생착율을 증가시키는 방법을 제공한다.The present invention provides a method of increasing the engraftment rate of an implant by immobilizing the bone morphogenic protein to the implant using a natural calcium chelating agent, chitosan or alginate.

본 발명에 따른 천연 칼슘 킬레이팅제를 이용한 골형성 단백질 고정화 기술은, 골형성 단백질의 손실을 줄이고, 안정적인 고정(juxtacrine) 효과를 유지할 수 있다. 따라서 이식 후에 면역반응을 최소화하고 세포 적합성, 생체적합성, 그리고 골형성 단백질의 도입으로 무기질 생체재료의 친수성이 향상되어 세포의 부착과 분화를 향상시킴으로써 생착율이 높으면서도 빠른 골융합을 유도할 수 있는 생체재료를 제조하는 기술로 유용하게 사용될 수 있다.Bone-forming protein immobilization technology using a natural calcium chelating agent according to the present invention can reduce the loss of bone-forming protein, and maintain a stable juxtacrine effect. Therefore, biomaterials that can induce rapid bone fusion with high engraftment rate by minimizing immune response after transplantation and improving hydrophilicity of inorganic biomaterials by introducing cellular compatibility, biocompatibility, and bone morphogenetic protein improve cell adhesion and differentiation It can be usefully used as a technique for producing a.

도 1은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산, 그리고 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 외형사진이다.
도 2는 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 아민기 검출 그래프이다.
도 3은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산, 그리고 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 각각의 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 골형성 단백질 검출 그래프이다.
도 4는 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산, 그리고 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 각각의 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 원자현미경 분석 이미지이다:
(A) 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 원자현미경 분석 이미지
(B) 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 원자현미경 분석 이미지
(C) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 원자현미경 분석 이미지
(D) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 원자현미경 분석 이미지
(E) 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 원자현미경 분석 이미지
(F) 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 원자현미경 분석 이미지
(G) 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크의 원자현미경 분석 이미지.
도 5는 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산, 그리고 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 각각의 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지이다:
(A) 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지
(B) 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지
(C) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지
(D) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지
(E) 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지
(F) 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지
(G) 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지.
도 6은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 각각의 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 저켓 셀라인 3일 배양 후, 세포 수를 분석한 그래프이다.
도 7은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 각각의 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 저켓 셀라인 3일 배양 후, 종양괴사인자의 량을 분석한 그래프이다.
도 8은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산, 그리고 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 각각의 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 골수유래 간엽줄기세포 3일 배양 후, 세포 수를 분석한 그래프이다.
도 9는 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산, 그리고 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 각각의 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 골수유래 간엽줄기세포 3일 배양 및 고정 후, 주사전자현미경 분석 이미지이다:
(A) 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(B) 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(C) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(D) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(E) 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(F) 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(G) 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지.
도 10은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 베타-트리칼슘포스페이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 키토산 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 이 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지이다:
(A) 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 베타-트리칼슘포스페이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지
(B) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지
(C) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 접촉각 분석 결과 이미지.
도 11은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 베타-트리칼슘포스페이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 키토산 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 이 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 골수유래 간엽줄기세포 3일 배양 및 고정 후, 주사전자현미경 분석 이미지이다:
(A) 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 베타-트리칼슘포스페이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(B) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(C) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지.
도 12는 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크와 이 표면에 각각 알렌드로네이트, 키토산, 그리고 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크, 그리고 각각의 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 골수유래 간엽줄기세포 3일 배양 후, western 분석 결과이다:
(A) 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면이 코팅된 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(B) 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(C) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(D) 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(E) 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(F) 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지
(G) 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 티타늄 디스크의 주사전자현미경 분석 이미지.1 is a view of a titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with a calcium chelating agent, and a titanium disk on which alendronate, chitosan, and alginate are used as calcium chelating agents and immobilized bone morphogenetic proteins, respectively. to be.
FIG. 2 is a graph showing the detection of amine groups of a titanium disk coated with a general hydroxyapatite surface not treated with a calcium chelating agent and a titanium disk using an alendronate and a chitosan as calcium chelating agents, respectively.
3 shows a titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with calcium chelating agent, a titanium disk using alendronate, chitosan, and alginate as calcium chelating agents, and bone forming proteins on each surface thereof. Bone forming protein detection graph of the fixed titanium disk.
4 is a titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with calcium chelating agent, a titanium disk using alendronate, chitosan, and alginate as calcium chelating agents, and bone forming proteins on each surface thereof. An AFM image of a fixed titanium disk:
(A) Atomic Force Microscope Image of Titanium Disk Using Alendronate as Calcium Chelating Agent
(B) Atomic image analysis of titanium disk using Alendronate as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenic protein
(C) Atomic image analysis of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent
(D) Atomic image analysis of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenetic protein
(E) Atomic image analysis of titanium disc using alginate as calcium chelating agent
(F) Atomic image analysis of titanium disc using alginate as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenetic protein
(G) Atomic Force Microscopy image of titanium disk coated with normal hydroxyapatite surface without calcium chelating agent treatment.
5 shows a titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with calcium chelating agent, a titanium disk using alendronate, chitosan, and alginate as calcium chelating agents, respectively, and bone forming proteins on each surface thereof. Here is an image of the contact angle analysis of a fixed titanium disk:
(A) Image of contact angle analysis of titanium disc using Alendronate as calcium chelating agent
(B) Image of contact angle analysis of titanium disk using Alendronate as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenetic protein
(C) Image of contact angle analysis of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent
(D) Contact angle analysis result of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenetic protein
(E) Image of contact angle analysis of titanium disc using alginate as calcium chelating agent
(F) Contact angle analysis image of titanium disc using alginate as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenetic protein
(G) Image of contact angle analysis results of titanium disk coated with normal hydroxyapatite surface without calcium chelating agent treatment.
6 is a titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with a calcium chelating agent, an alendronate on the surface, a titanium disk using chitosan as a calcium chelating agent, and titanium having bone morphogenetic proteins fixed on each surface thereof. It is a graph analyzing the cell number after 3 days culture of the jerk cell line of the disk.
7 is a titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with a calcium chelating agent, an alendronate on the surface, a titanium disk using chitosan as a calcium chelating agent, and titanium fixed with bone forming proteins on each surface thereof. It is a graph analyzing the amount of tumor necrosis factor after 3 days culture of the jerk cell line of the disk.
8 shows a titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with calcium chelating agent, a titanium disk using alendronate, chitosan, and alginate as calcium chelating agents, respectively, and bone forming proteins on each surface thereof. After 3 days culture of bone marrow-derived mesenchymal stem cells of the fixed titanium disk, the number of cells is analyzed.
9 shows a titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with calcium chelating agent, a titanium disk using alendronate, chitosan, and alginate as calcium chelating agents, and bone forming proteins on each surface thereof. After 3 days culture and fixation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells of immobilized titanium disk, scanning electron microscope analysis image:
(A) Scanning electron microscope image of titanium disk using Alendronate as calcium chelating agent
(B) Scanning electron microscopy image of titanium disk using Alendronate as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenic protein
(C) Scanning electron microscope image of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent
(D) Scanning electron microscope analysis image of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenetic protein
(E) Scanning electron microscope image of titanium disc using alginate as calcium chelating agent
(F) Scanning electron microscope image of titanium disc containing alginate as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenetic protein
(G) Scanning electron microscope analysis image of titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with calcium chelating agent.
10 is a contact angle of a titanium disk coated with a normal beta-tricalcium phosphate surface not treated with a calcium chelating agent, a titanium disk used as a chitosan calcium chelating agent on the surface, and a titanium disk fixed with bone forming proteins on the surface. The analysis result image is:
(A) Image of contact angle analysis of titanium disk coated with normal beta-tricalcium phosphate surface without calcium chelating agent
(B) Image of contact angle analysis of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent
(C) Image of contact angle analysis results of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenetic protein.
11 shows a bone marrow of a titanium disk coated with a normal beta-tricalcium phosphate surface not treated with a calcium chelating agent, a titanium disk used as a chitosan calcium chelating agent on the surface, and a titanium disk fixed with bone formation protein on the surface. After 3 days incubation and fixation of the derived mesenchymal stem cells, the scanning electron microscope analysis image:
(A) Scanning electron microscope image of titanium disk coated with normal beta-tricalcium phosphate surface without calcium chelating agent
(B) Scanning electron microscope image of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent
(C) Scanning electron microscope analysis image of titanium disk using chitosan as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenic protein.
12 shows a titanium disk coated with a normal hydroxyapatite surface not treated with calcium chelating agent, a titanium disk using alendronate, chitosan, and alginate as calcium chelating agents, respectively, and bone forming proteins on each surface thereof. After 3 days culture of bone marrow-derived mesenchymal stem cells of immobilized titanium disk, western analysis results:
(A) Scanning electron microscope image of titanium disk coated with normal hydroxyapatite surface without calcium chelating agent
(B) Scanning electron microscope image of titanium disc using Alendronate as calcium chelating agent
(C) Scanning electron microscope image of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent
(D) Scanning electron microscope image of titanium disc using alginate as calcium chelating agent
(E) Scanning electron microscope analysis image of titanium disk using Alendronate as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenic protein
(F) Scanning electron microscope analysis image of titanium disc using chitosan as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenetic protein
(G) Scanning electron microscope analysis image of titanium disk using alginate as calcium chelating agent and immobilized bone morphogenic protein.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 골형성 단백질이 고정된 임플란트의 제조방법을 제공한다:The present invention provides a method for preparing an implant to which bone-forming protein is immobilized, comprising the following steps:

(a) 임플란트 표면에 코팅층을 형성하는 단계;(a) forming a coating layer on the implant surface;

(b) 상기 코팅층에 천연 칼슘 킬레이팅제인 키토산 또는 알지네이트를 결합시키는 단계; 및(b) binding chitosan or alginate, a natural calcium chelating agent, to the coating layer; And

(c) 상기 킬라이팅제에 골형성 단백질을 고정시키는 단계.(c) immobilizing the osteogenic protein on the chelating agent.

상기 (a) 단계에서 형성된 임플란트 표면의 코팅층에는 티타늄 및 Ti-6Al-4V와 Ti-8Ta-3Nb 등과 같은 티타늄 합금, 코발트 합금, 스테인리스 스틸, 니티놀, 플래티늄, 이리듐, 니오븀, 탄탈륨, 금, 은 등의 금속재료와 UHMWPE(Ultra High Molecular Weight Poly Ethylene), PEEK(Poly Ether Ether Ketone), 폴리우레탄(polyurethane), 실리콘 엘라스토머(silicone elastomers), 그리고 생체흡수형 폴리머(PLA-poly lactic acid, PGA-poly glycolic acid, poly capro lactone, poly methyl metha acrylate) 등의 폴리머재료가 사용될 수 있으며, 또한 산화알루미늄, 지르코늄, 생리적 활성 유리섬유, 실리콘 질소화합물, 칼슘 인산염 및 카본 등의 세라믹재료도 사용이 가능하지만 이에 한정되는 것은 아니다.The coating layer of the implant surface formed in step (a) includes titanium and titanium alloys such as Ti-6Al-4V and Ti-8Ta-3Nb, cobalt alloys, stainless steel, nitinol, platinum, iridium, niobium, tantalum, gold, silver, and the like. Metal materials and UHMWPE (Ultra High Molecular Weight Poly Ethylene), Poly Ether Ether Ketone (PEEK), Polyurethane, Silicone Elastomers, and Bio-Absorbent Polymers (PLA-poly lactic acid, PGA-poly) Polymeric materials such as glycolic acid, poly capro lactone, poly methyl metha acrylate) may be used, and ceramic materials such as aluminum oxide, zirconium, physiologically active glass fiber, silicon nitrogen compound, calcium phosphate and carbon may be used. It is not limited.

임플란트 지지체 표면은 쓰이는 재료에 따라서 티타늄 분말이나 하이드록시아파타이트 분말을 표면에 부착시키는 방법(additive method)과 산화티타늄이나 CaP를 이용한 블라스팅(blasting), 염산이나 황산을 이용한 에칭(etching) 등을 이용하여 표면 자체의 거칠기를 형성하는 방법(Subtractive method) 등의 적용이 가능하지만 이에 한정되는 것은 아니다.The surface of the implant support may be prepared by using a method of attaching titanium powder or hydroxyapatite powder to the surface (additive method), blasting using titanium oxide or CaP, etching using hydrochloric acid or sulfuric acid, and the like. It is possible to apply a method of forming the roughness of the surface itself (Subtractive method) and the like, but is not limited thereto.

본 발명의 임플란트 코팅층은 티타늄 표면에 하이드록시아파타이트 또는 베타-트리칼슘포스페이트가 코팅되어 형성된 것 일 수 있다. The implant coating layer of the present invention may be formed by coating hydroxyapatite or beta-tricalcium phosphate on the titanium surface.

구체적으로, 임플란트 지지체 표면에는 하이드록시아파타이트, 칼슘 포스페이트, 베타-트리칼슘포스페이트(β-TCP) 등 칼슘기를 함유한 무기질 생체재료가 코팅될 수 있으며, 이 경우, 칼슘기를 함유한 무기질 생체재료는 임플란트 지지체 표면 위에 코팅되어 골수유래 간엽줄기세포(BM-MSCs) 및 골세포의 활성을 촉진하고 골세포분화를 촉진시킬 수 있다.Specifically, the surface of the implant support may be coated with inorganic biomaterials containing calcium groups such as hydroxyapatite, calcium phosphate, beta-tricalcium phosphate (β-TCP), and in this case, the inorganic biomaterials containing calcium groups may be implanted. Coating on the surface of the support can promote the activity of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) and osteocytes and promote osteoblast differentiation.

본 발명의 천연 칼슘 킬레이팅제는 키토산(chitosan) 또는 알지네이트(alginate)로써 코팅층 표면에 칼슘 킬레이팅 작용을 할 수 있다. 본 발명에 사용되는 키토산 또는 알지네이트의 유도체를 포함하는 것이며, 이에 한정되는 것은 아니나 일 구체예에 따르면, 키토산과 알지네이트는 각각 1mg/ml로 3차 증류수와 희석하여 제조된 칼슘기를 함유하는 무기질 생체재료 코팅 임플란트 재료를 빛으로부터 차단시킨 상태에서 4시간 동안 실온에서 20rpm으로 좌우로 교반하여 담지시킴으로써 실시할 수 있다. The natural calcium chelating agent of the present invention may act as calcium chelating on the surface of the coating layer with chitosan or alginate. It includes a derivative of chitosan or alginate used in the present invention, according to one embodiment, the chitosan and alginate are inorganic biomaterials containing calcium groups prepared by dilution with tertiary distilled water at 1 mg / ml, respectively It can be carried out by stirring and supporting the coating implant material at 20 rpm at room temperature for 4 hours while shielding it from light.

본 발명에 있어서 골형성 단백질은 골융합을 촉진하기 위해 사용되는 단백질을 의미하며, 본 발명의 골형성 단백질은 BMP-2, BMP-4 또는BMP-12 등일 수 있다.In the present invention, the osteogenic protein means a protein used to promote bone fusion, and the osteogenic protein of the present invention may be BMP-2, BMP-4 or BMP-12.

본 발명의 천연 칼슘 킬레이팅제에 골형성 단백질을 고정화 시키는 단계에서 디페닐포스포릴아자이드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드, 카보디이미드 글루타르알데하이드(glutarladehyde) 또는 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3- (3-dimethyl aminopropy) carbodiimide) 가교시약이 사용되어, 천연 칼슘 킬레이팅제의 골형성 단백질 고정 효과를 증가시켜줄 수 있다. 골형성 단백질의 고정 처리 후에는 3차 증류수 세척을 통하여 잔존하는 가교시약을 모두 제거할 수 있으며, 체내 또는 세포 배양 시에 가교시약으로 인하여 발생할 수 있는 염증반응과 같은 위험요소를 제거한다.Diphenylphosphoryl azide, hexamethylene isocyanate, succinimide, carbodiimide glutaraldehyde or ethyldimethylaminopropyl carbodiimide in the step of immobilizing the bone morphogenetic protein in the natural calcium chelating agent of the present invention ( A 1-ethyl-3- (3-dimethyl aminopropy) carbodiimide crosslinking reagent can be used to increase the osteogenic protein immobilization effect of natural calcium chelating agents. After fixation of the bone morphogenetic protein, all remaining crosslinking reagents can be removed by washing with distilled water, and the risk factors such as inflammatory reactions caused by the crosslinking reagents in the body or cell culture can be removed.

본 발명의 임플란트는 소실된 생물학적 조직을 대체하거나 조직으로서 동작하기 위해 만들어진 인공의 디바이스를 의미하며, 체내에 삽입되어 사용되는 치과용 또는 정형외과용 임플란트일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.The implant of the present invention refers to an artificial device made to replace lost biological tissue or to operate as a tissue, and may be a dental or orthopedic implant used in the body, but is not limited thereto.

또한 본 발명은 천연 칼슘 킬레이팅제인 키토산 또는 알지네이트를 이용하여 골형성 단백질을 임플란트에 고정시킴으로써 임플란트의 생착율을 증가시키는 방법을 제공한다.
In another aspect, the present invention provides a method for increasing the engraftment rate of the implant by immobilizing the bone-forming protein to the implant using a natural calcium chelating agent chitosan or alginate.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.

하기의 제조예는 본 발명에 따른 실시예에 공통적으로 적용되는 제조예를 제공하기 위한 것이다.
The following preparation examples are to provide a preparation example commonly applied to the embodiment according to the present invention.

제조예Manufacturing example 1. 코팅층의 형성 1. Formation of coating layer

3차 증류수의 의해 초음파 세척된 티타늄 디스크의 표면에 하이드록시아파타이트 솔루션을 스핀 코팅하여 박막을 형성하였다. 하이드록시아파타트 박막 제조에 사용되는 하이드록시아파타이트 솔루션은 프로피오닉산에 희석된 P(OC2H5)3 용액과 Ca(OC2H5)2 용액을 99.999%의 아르곤 가스(Ar)로 채워진 글러브박스 안에서 완전히 용해될 때까지 각각 교반시켜 보관할 수 있다. 각각 용해된 용액은 혼합되는데 1:1로 혼합하여 글러브박스 안에서 10분간 교반하였다. 6시간 동안 60℃로 워터베스 안에서 저어주며, 지름이 8mm와 14mm 정도인 디스크 타입의 티타늄을 3차 증류수로 초음파세척기를 통해 10분간 세척한 후, 티타늄 표면 위에 하이드록시아파타이트 솔루션을 4000rpm으로 20초간 스핀 코팅하여 500℃에서 2시간 동안 소결 처리하였다.A thin film was formed by spin coating a hydroxyapatite solution on the surface of the titanium disk ultrasonically washed with tertiary distilled water. The hydroxyapatite solution used to prepare the hydroxyapatite thin film is filled with 99.999% of argon gas (Ar) with a P (OC 2 H 5 ) 3 solution and Ca (OC 2 H 5 ) 2 solution diluted in propionic acid. Each can be stored by stirring until completely dissolved in the glovebox. The dissolved solutions were mixed in a 1: 1 mixture and stirred for 10 minutes in the glove box. Stir in a water bath at 60 ° C for 6 hours, wash disk type titanium with diameters of 8mm and 14mm for 10 minutes with an ultrasonic cleaner with 3 distilled water, and then apply hydroxyapatite solution at 4000rpm on the titanium surface for 20 seconds. Spin coating was sintered at 500 ° C. for 2 hours.

베타-트리칼슘포스페이트 박막 제조를 위하여 CaCO3 분말과 (NH4)2HPO4 분말을 1.5:1의 비율로 분산제와 함께 무수에탄올 환경에서 24시간 이상 볼 밀법을 실시하고, 균일하게 섞인 혼합액을 티타늄 표면 위에 도포한 뒤 가열하여 건조시킨 후 1100℃에서 2시간 정도 열처리를 하였다.
To prepare beta-tricalcium phosphate thin film, CaCO 3 powder and (NH 4 ) 2 HPO 4 powder were mixed with dispersant at a ratio of 1.5: 1 for at least 24 hours in anhydrous ethanol environment, and the mixed mixture was mixed with titanium After coating on the surface and dried by heating it was heat-treated for 2 hours at 1100 ℃.

제조예Manufacturing example 2. 천연 칼슘  2. Natural Calcium 킬레이팅제Chelating agents 고정화 Immobilization

제조예 1 에서 얻어진 하이드록시아파타이트 코팅된 임플란트 지지체 및 또는 베타-트리칼슘포스페이트가 코팅된 임플란트 지지체 표면 위에 칼슘기가 함유된 천연 칼슘 킬레이팅제인 키토산 및 알지네이트를 사용하였다. 하이드록시아파타이트 또는 베타-트리칼슘포스페이트 박막이 코팅된 티타늄 디스크를 12웰 플레이트에서 1mg/ml로 3차 증류수와 희석된 2ml의 칼슘 킬레이팅제로 완전히 담지시켜 빛으로부터 차단시킨 상태에서 4시간 동안 실온에서 20rpm으로 좌우로 교반하였다.Chitosan and alginate, a natural calcium chelating agent containing calcium groups, were used on the surface of the hydroxyapatite coated implant support and / or the beta-tricalcium phosphate coated implant support obtained in Preparation Example 1. Titanium disks coated with hydroxyapatite or beta-tricalcium phosphate thin films were completely immersed in distilled water and 2 ml of calcium chelating agent diluted at 1 mg / ml in 12-well plates and shielded from light for 4 hours at room temperature. Stir left and right at 20 rpm.

교반 후, 3차 증류수로 3회 세척을 실시하여 잔존하는 천연 칼슘 킬레이팅제를 모두 제거하고, 진공오븐에서 남은 습기를 완전히 건조시켰다.
After stirring, the mixture was washed three times with distilled water to remove all remaining natural calcium chelating agent, and the moisture remaining in the vacuum oven was completely dried.

제조예Manufacturing example 3.  3. 골형성Osteogenesis 단백질 고정화 Protein immobilization

골형성 단백질과 천연 칼슘 킬레이팅제가 도입된 하이드록시아파타이트 또는 베타-트리칼슘포스페이트 박막 사이의 결합은 아민기를 통한 공유결합 및 가교결합을 통하여 화학적으로 수행되었다. 화학적 가교결합의 경우에는 4 내지 25℃에서 디페닐포스포릴아자이드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드 또는 카보디이미드를 처리하여 수행하였으며, 이러한 가교결합은 12 내지 24시간 동안 수행되었다.Bonding between the bone forming protein and the hydroxyapatite or beta-tricalcium phosphate thin film into which the natural calcium chelating agent was introduced was chemically performed through covalent and crosslinking via an amine group. In the case of chemical crosslinking, diphenylphosphoryl azide, glutaraldehyde, hexamethylene isocyanate, succinimide or carbodiimide was treated at 4 to 25 ° C., and this crosslinking was carried out for 12 to 24 hours. .

골형성 단백질은 골융합을 촉진시키는 골형성 단백질 등이 사용될 수 있으며, 1μg/ml의 농도로 생리식염 인산 완충액(PBS)에 희석되었다. 상기 골형성 단백질 용액을 가교시약과 1:1로 5분 동안 혼합하여 천연 칼슘 킬레이팅제가 처리된 하이드록시아파타이트 또는 베타-트리칼슘포스페이트 박막에 적정하였다. 지름이 8mm인 티타늄 디스크 위에 10μl, 지름이 14mm인 티타늄 디스크 위에는 30ul를 각각 적정하여 실온에서 24시간 동안 수행하였다. 그 후, 3차 증류수로 3 내지 5회 세척을 실시하여 고정되지 않은 잔존하는 골형성 단백질을 모두 제거하고, 실온에서 남은 습기를 완전히 건조하였다.
As the bone morphogenetic protein, a bone morphogenetic protein or the like which promotes bone fusion may be used and diluted in physiological saline phosphate buffer (PBS) at a concentration of 1 μg / ml. The bone morphogenetic protein solution was mixed 1: 1 with the crosslinking reagent for 5 minutes and titrated to the hydroxyapatite or beta-tricalcium phosphate thin film treated with natural calcium chelating agent. 10 μl on a titanium disk with a diameter of 8 mm and 30 ul on a titanium disk with a diameter of 14 mm were respectively titrated for 24 hours at room temperature. Thereafter, washing was performed 3 to 5 times with tertiary distilled water to remove all of the remaining unfixed bone-forming protein and completely dried the remaining moisture at room temperature.

실시예Example 1.  One. 하이드록시아파타이트Hydroxyapatite 또는 베타- Or beta- 트리칼슘포스페이트Tricalcium phosphate 박막의 제조 Manufacture of thin film

티타늄 표면의 하이드록시아파타트 박막 제조에 사용되는 하이드록시아파타이트 솔루션을 제조하기 위하여 프로피오닉산에 희석된 P(OC2H5)3 용액과 Ca(OC2H5)2 용액을 99.999%의 아르곤 가스로 채워진 글러브박스 안에서 완전히 용해될 때까지 각각 교반시켜 보관하였다. 그 다음, 각각 용해된 용액을 1:1로 혼합하여 글러브박스 안에서 10분간 교반하였고, 6시간 동안 60℃로 워터베스 안에서 저어주었다. 지름이 8mm와 14mm 정도인 디스크 타입의 티타늄(grade 4)을 3차 증류수로 초음파세척기를 통해 10분간 세척한 후, 티타늄 표면 위에 하이드록시아파타이트 솔루션을 4000rpm으로 20초간 스핀 코팅하여 500℃에서 2시간 동안 소결하였다.To prepare a hydroxyapatite solution for the production of hydroxyapatite thin films on titanium surfaces, 99.999% of argon with a P (OC 2 H 5 ) 3 solution and Ca (OC 2 H 5 ) 2 solution diluted in propionic acid Each was stored by stirring until completely dissolved in a gas filled glovebox. Then, each dissolved solution was mixed 1: 1 and stirred in the glove box for 10 minutes, and stirred in a water bath at 60 ° C. for 6 hours. After washing the disc-type titanium (grade 4) with diameters of 8 mm and 14 mm for 10 minutes with an ultrasonic cleaner with 3 distilled water, spin coating the hydroxyapatite solution at 4000 rpm for 20 seconds on the titanium surface for 2 hours at 500 ° C. Sintered.

티타늄 표면에 베타-트리칼슘포스페이트 박막을 제조하기 위하여 CaCO3 분말과 (NH4)2HPO4 분말을 1.5:1의 비율로 분산제와 함께 무수에탄올 환경에서 24시간 이상 볼 밀법을 실시하였고, 균일하게 섞인 혼합액을 티타늄 표면 위에 500μl씩 도포한 뒤 가열하여 건조시킨 후에 1100℃에서 2시간 정도 열처리하였다.
In order to prepare beta-tricalcium phosphate thin film on the titanium surface, CaCO 3 powder and (NH 4 ) 2 HPO 4 powder were ball milled for more than 24 hours in anhydrous ethanol environment with a dispersant at a ratio of 1.5: 1 and uniformly 500 μl of the mixed solution was applied onto the titanium surface, heated and dried, and then heat-treated at 1100 ° C. for 2 hours.

실시예Example 2. 칼슘  2. Calcium 킬레이팅제Chelating agents 처리 표면의 제조 Manufacture of treated surfaces

실시예 1에서 제조된 하이드록시아파타이트 또는 베타-트리칼슘포스페이트 박막이 코팅된 티타늄 디스크를 12웰 플레이트에서 1mg/ml로 3차 증류수와 희석된 2ml의 칼슘 킬레이팅제로 완전히 담지시켜 빛으로부터 차단시킨 상태에서 4시간 동안 실온에서 20rpm으로 좌우로 교반하였다. 칼슘 킬레이팅제로는 1mg/ml의 알렌드로네이트 소듐 트리하이드레이트(Sigma Aldrich Chemical, 미국), 초순수 키토산(Novamatrix, 노르웨이), 초순수 알지네이트(Novamatrix, 노르웨이)를 각각 준비하였다. 교반이 끝난 다음, 3차 증류수로 3회 세척을 실시하여 잔존하는 칼슘 킬레이팅제를 모두 제거하였고, 진공오븐에서 남은 습기를 완전히 건조시켰다.
The titanium disk coated with the hydroxyapatite or beta-tricalcium phosphate thin film prepared in Example 1 was completely immersed in 3 mg of distilled water and 2 ml of calcium chelating agent diluted at 1 mg / ml in a 12-well plate and blocked from light. Stir left and right at 20 rpm at room temperature for 4 hours at. As a calcium chelating agent, 1 mg / ml of alendronate sodium trihydrate (Sigma Aldrich Chemical, USA), ultrapure chitosan (Novamatrix, Norway), and ultrapure alginate (Novamatrix, Norway) were prepared, respectively. After stirring, washing was performed three times with distilled water to remove all of the remaining calcium chelating agent, and the remaining moisture in the vacuum oven was completely dried.

실시예Example 3.  3. 골형성Osteogenesis 단백질 고정 표면의 제조 Preparation of Protein Fixation Surfaces

골융합을 촉진시키는 골형성 단백질을 1μg/ml의 농도로 생리식염 인산 완충액(PBS)에 희석하여 준비하였다. 이 골형성 단백질 용액을 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드 가교시약과 1:1로 5분 동안 혼합하여 실시예 2에서 제조된 지름이 8mm인 티타늄 디스크 위에 10μl, 지름이 14mm인 티타늄 디스크 위에는 30ul를 각각 적정하여 실온에서 24시간 동안 수행하였다. 10μl의 혼합액 안에는 5ng의 골형성 단백질이 함유되어 있다. 그 다음, 3차 증류수로 5회 세척을 실시하여 고정되지 않은 잔존하는 골형성 단백질을 모두 제거하였고, 실온에서 남은 습기를 완전히 건조시켰다. Osteogenic proteins that promote bone fusion were prepared by diluting in physiological saline phosphate buffer (PBS) at a concentration of 1 μg / ml. This bone-forming protein solution was mixed with ethyldimethylaminopropyl carbodiimide crosslinking reagent 1: 1 for 5 minutes and 10 μl on the 8 mm diameter titanium disk prepared in Example 2, and 30 μl on the titanium disk having a diameter of 14 mm, respectively. Titration was performed for 24 hours at room temperature. 10 ng of mixed solution contains 5 ng of bone-forming protein. Thereafter, washing with tertiary distilled water was performed five times to remove any remaining unfixed bone-forming protein, and the remaining moisture was completely dried at room temperature.

이처럼 하이드록시아파타이트 박막이 코팅된 티타늄 디스크를 이용한 골형성 단백질 처리 표면은 도1에 나타낸 바와 같이 소결 과정에 의해 푸른색의 표면을 갖는 형태를 가졌다.
Such hydroxyl apatite bone morphogenetic protein processing using the thin film-coated titanium disc surface had a shape with a surface of blue color by the sintering process, as shown in Fig.

실시예Example 4. 제조 표면의  4. Manufacture of surface 아민기와An amine group 골형성Osteogenesis 단백질의 정량분석 Quantitative Analysis of Proteins

골형성 단백질 고정 하이드록시아파타이트가 코팅된 티타늄 표면에 칼슘 킬레이팅제로 인하여 형성된 아민기와 이로 인하여 고정된 골형성 단백질의 정량분석을 실시하였다. Bone Formation Protein Immobilization Hydroxyapatite-coated titanium surface was subjected to quantitative analysis of amine groups formed by calcium chelating agents and thus immobilization of bone formation proteins.

아민기의 정량분석은 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산(TNBS)를 이용한 방법으로, 지름이 8mm인 칼슘 킬레이팅제가 처리된 하이드록시아파타이트 표면 코팅 티타늄 디스크들을 3% 소듐 보레이트에 0.1%의 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산을 희석시킨 용액에 완전히 담지시킨 후, 70℃로 5분간 인큐베이션을 시켰다. 그 다음, 3차 증류수로 3회 세척하고 1N NaOH 용액에 완전히 담지시켜 70℃로 10분간 가수분해를 실시하였다. 이 과정에서 아민기에 의해 형성된 트리니트로페닐기가 용출되어 정량에 따른 노란색이 발현되었으며, 색이 발현된 1N NaOH 용액을 410nm로 흡광도를 측정하였다. 스탠다드 곡선은 엘-도파(Sigma Aldrich Chemical, 미국)를 3% 소듐 보레이트에 0.1%의 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산을 희석시킨 용액에 직접 용해시켜 1N NaOH 용액에 가수분해를 실시하여 만들어졌다. Quantitative analysis of amine groups was carried out using 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS), in which hydroxyapatite surface-coated titanium discs treated with calcium chelating agents (8 mm in diameter) were treated with 0.1% of 3% sodium borate. After completely supporting the diluted solution of 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, it was incubated at 70 ° C for 5 minutes. Then, the mixture was washed three times with distilled water three times, completely immersed in 1N NaOH solution, and hydrolyzed at 70 ° C. for 10 minutes. In this process, the trinitrophenyl group formed by the amine group was eluted, and yellow color was expressed according to the quantitative measurement. The absorbance was measured at 410 nm of the 1N NaOH solution in which the color was expressed. The standard curve is made by directly dissolving El-Dopa (Sigma Aldrich Chemical, USA) in a solution of 0.1% 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid diluted in 3% sodium borate and hydrolyzing 1N NaOH solution. lost.

도2에서 나타낸 바와 같이, 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면에서 7μg으로 제일 많은 아민기가 검출이 되었으며, 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면에서 1.3μg 정도의 아민기가 검출되었다. As shown in FIG . 2 , the most amine group was detected at 7 μg on the surface using chitosan as the calcium chelating agent, and about 1.3 μg on the surface using allandronate as the calcium chelating agent.

골형성 단백질의 정량분석은 ‘Human BMP-2 Super X-ELISA’ 키트(Antigenix, 미국)를 이용한 방법으로, 지름이 8mm인 골형성 단백질 고정 하이드록시아파타이트가 코팅된 티타늄 디스크들과 비교군 티타늄 디스크들을 48웰 플레이트에 넣고 0.1mg/ml의 소 혈청 알부민(BSA)을 1ml씩 부어 완전히 담지시킨 후, 실온에서 2시간 동안 빛으로부터 차단한 상태에서 인큐베이션을 시켰다. 그 다음, 키트 안에 내재되어 있는 세척 용액으로 4회 세척하였다. 세척이 끝나고, 키트 안에 내재되어 있는 0.5μg/ml의 트레이서 안티바디(biotin-Labeled tracer)를 각각의 티타늄 표면 위에 20μl씩 적정한 후, 2시간 동안 빛으로부터 차단한 상태에서 실온에서 인큐베이션을 시켰다. 그 다음, 키트 안에 내재되어 있는 세척 용액으로 다시 4회 세척하였다. 세척이 끝나고, 키트 안에 내제되어 있는 컨쥬게이트 용액(streptavidin-HRP)을 0.1% 소 혈청 알부민에 0.05%의 트윈-20(Uniqema, 미국)을 희석시킨 용액과 1:500으로 희석시켜, 각각의 티타늄 표면 위에 20μl씩 적정한 후, 30분 동안 빛으로부터 차단한 상태에서 실온에서 인큐베이션을 시켰다. 그 다음, 키트 안에 내재되어 있는 세척 용액으로 다시 4회 세척하여, 다른 48웰 플레이트에 티타늄 코팅 표면을 바닥으로 향하게 하여 옮겼다. 키트 안에 내재되어 있는 티엠비 서브스트레이트 용액 에이와 티엠비 서브스트레이트 용액 비를 1:1로 혼합하여 웰당 100μl씩 넣어 주었으며, 30분 동안 빛으로부터 차단한 상태에서 실온에서 인큐베이션을 시켰다. 인큐베이션이 끝난 후, 스톱 솔루션(2N sulfuric acid)을 웰당 100μl씩 넣어 발색을 중지시키고 450nm로 흡광도를 측정하였다.Quantitative analysis of bone morphogenetic protein was carried out using the 'Human BMP-2 Super X-ELISA' kit (Antigenix, USA), which compared with titanium discs coated with 8mm diameter bone morphogenetic protein-fixed hydroxyapatite They were placed in 48-well plates and poured into 1 ml each of 0.1 mg / ml bovine serum albumin (BSA), and then completely incubated with incubation at room temperature for 2 hours. It was then washed four times with the wash solution inherent in the kit. After washing, 0.5 μg / ml of the biotin-Labeled tracer inherent in the kit was titrated 20 μl on each titanium surface, and then incubated at room temperature while shielded from light for 2 hours. It was then washed four more times with the wash solution inherent in the kit. After washing, the conjugate solution (streptavidin-HRP) contained in the kit was diluted 1: 500 with a solution of 0.05% Tween-20 (Uniqema, USA) diluted in 0.1% bovine serum albumin. After titration of 20 μl on the surface, the cells were incubated at room temperature while blocked from light for 30 minutes. It was then washed four more times with the wash solution inherent in the kit and transferred to another 48 well plate with the titanium coated surface facing the bottom. The TMB substrate solution A and the TMB substrate solution ratio inherent in the kit were mixed in a ratio of 100 μl per well and incubated at room temperature while being blocked from light for 30 minutes. After the incubation, the stop solution (2N sulfuric acid) was added 100μl per well to stop the color development and the absorbance was measured at 450nm.

도3에서 나타낸 바와 같이, 키토산을 이용한 칼슘 킬레이팅 처리 후 골형성 단백질 고정 티타늄 표면에서 4ng으로 제일 많은 골형성 단백질이 검출되었으며, 알렌드로네이트와 알지네이트를 이용한 칼슘 킬레이팅 처리 후 골형성 단백질 고정 티타늄 표면에서는 각각 2.3ng과 2.5ng으로 비슷한 량의 골형성 단백질이 검출되었다. 그 외의 칼슘 킬레이팅 처리 후 골형성 단백질을 처리하지 않은 표면에서는 1ng 이하로 골형성 단백질이 검출되지 않았음을 나타내었다.
As shown in FIG . 3 , the most bone-forming protein was detected at 4 ng on the bone-forming protein-fixed titanium surface after calcium chelating treatment with chitosan, and on the bone-forming protein-fixed titanium surface after calcium chelating treatment with alendronate and alginate. Similar amounts of bone morphogenetic proteins were detected at 2.3 ng and 2.5 ng, respectively. After the other calcium chelating treatment, the bone morphogenetic protein was not detected at less than 1 ng on the surface which was not treated with the bone morphogenetic protein.

실시예Example 5. 제조 표면의 특성 분석 5. Characterization of manufacturing surface

제조된 골형성 단백질 고정 하이드록시아파타이트가 코팅된 티타늄 표면의 특성을 알아보기 위하여 표면의 원자현미경(AFM) 분석 및 접촉각(contact angle) 측정을 실시하였다. In order to investigate the characteristics of the titanium surface coated with the bone-forming protein-fixed hydroxyapatite, atomic force microscopy (AFM) analysis and contact angle measurement were performed.

도4에서 나타낸 바와 같이, 원자현미경(Veeco, 미국)을 이용하여 1μm × 1μm의 스케일로 분석한 각각의 표면은 칼슘 킬레이팅제를 처리함으로써 표면이 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면보다는 부드러워졌음을 알 수 있었지만, 전반적으로 비교하였을 때 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.As shown in FIG . 4 , each surface analyzed on a scale of 1 μm × 1 μm using an atomic force microscope (Veeco, USA) was treated with calcium chelating agent so that the surface was not treated with calcium chelating agent. It was found to be smoother than the surface, but overall there was no significant difference.

도5에서 나타낸 바와 같이, 3차 증류수를 이용하여 접촉각 측정 장치(KRUSS, 독일)로 접촉각을 측정한 결과, 칼슘 킬레이팅제를 처리하였을 경우에는 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면보다는 접촉각이 전체적으로 6°에서 15° 정도 증가하였다. 그러나 칼슘 킬레이팅제를 처리한 표면 위에 골형성 단백질을 고정하였을 경우에는 알렌드로네이트를 이용한 표면을 제외하고는 키토산, 알지네이트를 이용한 표면에서 18°에서 32° 정도 크게 접촉각이 감소하였음을 확인함으로써 키토산과 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 표면이 친수성이 크게 증가하는 것을 알 수 있었다.
As shown in FIG . 5 , when the contact angle was measured by using a contact angle measuring device (KRUSS, Germany) using tertiary distilled water, when the calcium chelating agent was treated, the surface of the general hydroxyapatite not treated with the calcium chelating agent Rather, the contact angle increased from 6 ° to 15 ° overall. However, when the bone morphogenetic protein was immobilized on the surface treated with the calcium chelating agent, the contact angle was reduced by 18 ° to 32 ° from the surface using chitosan and alginate except for the surface using alendronate. Was used as a calcium chelating agent and the surface on which the bone morphogenetic protein was immobilized was found to greatly increase the hydrophilicity.

실시예Example 6. 제조 표면의 염증 반응 평가 6. Evaluation of Inflammatory Responses on Manufacturing Surfaces

제조된 골형성 단백질 고정 하이드록시아파타이트가 코팅된 티타늄 표면의 염증 반응을 알아보기 위하여 저켓 셀라인(T-lymphocyte) 배양하여 Brdu 분석법을 통해 세포 수를 분석하였고, 저켓 셀라인이 분비하는 종양괴사인자(TNF-α)를 검출하였다.In order to investigate the inflammatory response of the prepared titanium-fixed hydroxyapatite-coated titanium surface, the cell number was analyzed by Brdu assay in T-lymphocyte culture and tumor necrosis factor secreted by the jerker cell line. (TNF-α) was detected.

저켓 셀라인의 배양은 12웰 플레이트 안에 지름이 8mm인 각각의 티타늄 디스크를 넣고, 10%의 우태혈청(FBS)과 0.5%의 젠타마이신(gentamicin)을 함유한 RPMI1640 배지 1ml을 넣어 5 × 105의 세포농도로 티타늄 디스크가 배지에 잠긴 채로 온도가 37℃, 5%의 이산화탄소 분위기를 갖는 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. The culture of JACKET CELLIN was placed in a 12-well plate with each titanium disk of 8 mm diameter and 1 ml of RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 0.5% gentamicin (5 × 10 5). The cells were incubated for 3 days in an incubator having a carbon dioxide atmosphere of 37% and a carbon dioxide atmosphere while the titanium disk was immersed in the medium at a cell concentration of.

저켓 셀라인의 세포 수 분석은 ‘Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric)’ 키트(Roche, 독일)를 이용한 방법으로, 지름이 8mm인 티타늄 디스크를 제거한 후에, 키트 안에 내재되어 있는 Brdu 라벨링 용액을 1μl씩 각각의 웰에 넣고 37℃에서 빛으로부터 차단시킨 상태에서 2시간 동안 인큐베이션 시켰다. 그 다음, 1.5ml 바이얼 튜브를 이용하여 배지와 세포를 회수하여 300g의 원심력으로 10분간 원심분리를 하였고, 상등액을 모두 제거하였다. 그 다음, 키트 안에 내재되어 있는 1.2ml의 FixDenat 용액을 바이얼 튜브에 넣고 고루 섞어준 다음에 실온에서 30분 동안 인큐베이션 시켰다. 인큐베이션이 끝나면 다시 300g의 원심력으로 10분간 원심분리를 한 후, 다시 상등액을 모두 제거하였다. 그 다음, 키트 안에 내재되어 있는 안티바디 컨쥬게이트(anti-BrdU-POD working solution)와 안티바디 희석 용액을 1:100으로 희석시켜서 이 용액의 600μl를 바이얼 튜브에 넣고 고루 섞어준 다음에 실온에서 90분 동안 인큐베이션 시켰다. 인큐베이션이 끝나면 다시 원심분리를 한 후, 다시 상등액을 제거하고 원심분리와 1.2ml의 생리식염 인산 완충액 첨가를 반복하여 3회 세척을 실시하였다. 생리식염 인산 완충액을 제거하면 키트 안에 내재되어 있는 서브스트레이트 용액의 600μl를 세포가 있는 바이얼 튜브에 넣고 15분간 실온에서 인큐베이션 시켰다. 그 후, 즉시 370nm로 흡광도를 측정하였다. The cell number analysis of the jerk cell line was carried out using the 'Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric)' kit (Roche, Germany). After removing the 8 mm diameter titanium disc, 1 μl of Brdu labeling solution contained in the kit was added. Each well was placed and incubated for 2 hours while being shielded from light at 37 ° C. Then, the medium and cells were collected using a 1.5 ml vial tube, centrifuged for 10 minutes with a centrifugal force of 300 g, and all of the supernatant was removed. Then, 1.2 ml of FixDenat solution contained in the kit was added to the vial tube, mixed well, and incubated for 30 minutes at room temperature. After the incubation was again centrifuged for 10 minutes with a centrifugal force of 300g, all of the supernatant was removed again. Next, dilute the antibody conjugate (anti-BrdU-POD working solution) and antibody dilution solution in the kit to 1: 100, add 600 μl of this solution to the vial tube, mix well, and then at room temperature Incubate for 90 minutes. After the incubation, centrifugation was again performed, and then the supernatant was again removed, followed by centrifugation and addition of 1.2 ml of physiological saline phosphate buffer. When physiological saline phosphate buffer was removed, 600 μl of the substrate solution inherent in the kit was placed in a vial tube containing cells and incubated for 15 minutes at room temperature. Thereafter, the absorbance was immediately measured at 370 nm.

도6에서 나타낸 바와 같이, 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면에서 배양한 저켓 셀라인의 세포 수가 확연히 줄어드는 것을 확인함으로써, 알렌드로네이트가 염증을 유발할 수 있음을 보여주었다. 그러나 이에 골형성 단백질을 고정시키면 저켓 셀라인의 세포 수가 증가하는 것을 확인하였고, 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면과 이 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 조건에서는 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면과 비교하여 세포 수가 크게 줄어들지 않았음을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 6 , by confirming that the number of cells in the jerk cell line cultured on the surface using the alendronate as a calcium chelating agent, it showed that the alendronate can cause inflammation. However, the fixation of bone morphogenetic protein increased the number of cells in the jerk cell line, and the surface of the chitosan as calcium chelating agent and the condition that fixed the bone morphogenic protein on the surface were not treated with calcium chelating agent. It was confirmed that the number of cells did not decrease significantly compared with the surface of roxiapatite.

저켓 셀라인이 분비하는 종양괴사인자는 ‘TNF-α EASIA’ 키트(Biosource, 벨기에)를 이용한 방법으로, 세포 배양이 끝난 각각 조건의 200μl의 RPMI1640 배지와 키트 안의 스탠다드 용액을 50μl의 인큐베이션 버퍼와 함께 혼합하여 96웰의 마이크로티터 플레이트(anti-TNF-α coated wells)에서 2시간 동안 실온에서 쉐이커를 이용해 700±100rpm으로 좌우로 교반하였다. 교반이 끝나면 웰 안의 혼합액을 버리고, 키트 안의 세척 용액을 0.4ml씩 각각 웰에 넣어주어 3회 세척을 하였다. 그 다음, 컨쥬게이트 버퍼와 1:10으로 희석된 컨쥬게이트 용액(anti-TNF-α conjugate) 50μl와 스탠다드 0 용액 100μl를 각각 웰에 넣고, 2시간 동안 실온에서 쉐이커를 이용해 700±100rpm으로 좌우로 교반하였다. 교반이 끝나면 웰 안의 혼합액을 버리고, 키트 안의 세척 용액을 0.4ml씩 각각 웰에 넣어주어 3회 세척을 하였다. 그 다음, 키트 안에 내재되어 있는 200μl의 크로모제닉 용액(chromogenic solution)을 각각 웰에 넣고, 빛을 차단한 상태에서 30분 동안 실온에서 쉐이커를 이용해 700±100rpm으로 좌우로 교반하였다. 교반이 끝나면 웰 안에 50μl의 스톱 솔루션(1.8N H2SO4)을 넣고 450nm로 흡광도를 측정하였다. Tumor necrosis factor secreted by Jerck cell line is a method using the 'TNF-α EASIA' kit (Biosource, Belgium) .The cells are cultured with 200 μl of RPMI1640 medium and 50 μl of incubation buffer. The mixture was stirred at 700 ± 100 rpm in a 96 well microtiter plate (anti-TNF-α coated wells) using a shaker at room temperature for 2 hours. After stirring, the mixed solution in the well was discarded, and the washing solution in the kit was added to each well by 0.4ml, and washed three times. Next, add 50 μl of the conjugate buffer (anti-TNF-α conjugate) and 100 μl of the Standard 0 solution to the wells, respectively, at a temperature of 700 ± 100 rpm using a shaker at room temperature for 2 hours. Stirred. After stirring, the mixed solution in the well was discarded, and the washing solution in the kit was added to each well by 0.4ml, and washed three times. Then, 200 μl of chromogenic solution inherent in the kit was put into each well, and stirred left and right at 700 ± 100 rpm using a shaker at room temperature for 30 minutes while blocking light. After stirring, 50 μl of a stop solution (1.8NH 2 SO 4 ) was added to the well, and the absorbance was measured at 450 nm.

도7에서 나타낸 바와 같이, 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면에서 종양괴사인자가 확연히 증가하는 것을 확인함으로써, 알렌드로네이트가 염증을 유발할 수 있음을 보여주었다. 그러나 이에 골형성 단백질을 고정시키면 종양괴사인자가 줄어드는 것을 확인하였고, 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면과 이 표면에 골형성 단백질을 고정시킨 조건에서는 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면과 비교하여 종양괴사인자가 크게 증가하지 않았음을 확인할 수 있었다.
As shown in Figure 7 , by confirming that the tumor necrosis factor significantly increased on the surface using the alendronate as a calcium chelating agent, it was shown that the alendronate can cause inflammation. However, it was confirmed that the fixation of bone morphogenic protein reduced tumor necrosis factor. The surface of chitosan used as calcium chelating agent and the surface of general hydroxyapatite without calcium chelating agent under the condition of fixing bone morphogenic protein on this surface Compared with the tumor necrosis factor did not increase significantly.

실시예Example 7. 제조 표면의 세포 초기 부착 및 증식 평가 7. Evaluation of initial cell adhesion and proliferation of manufacturing surface

제조된 골형성 단백질 고정 하이드록시아파타이트가 코팅된 티타늄 표면의 세포 초기 부착 및 증식을 알아보기 위하여 골수유래 간엽줄기세포를 배양하여 MTT 분석법을 통해 초기 세포 수와 3일 배양 후의 세포수를 비교 분석하였고, 3일 배양 후의 세포를 고정시켜 주사전자현미경을 통해 세포 형태를 관찰하였다. In order to examine the initial cell adhesion and proliferation of the prepared bone-forming protein-fixed hydroxyapatite-coated titanium surface, bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured and compared with the initial cell number after 3 days of culture by MTT analysis. After culturing for 3 days, the cells were fixed and the cell morphology was observed through a scanning electron microscope.

골수유래 간엽줄기세포의 배양은 24웰 플레이트 안에 지름이 14mm인 각각의 티타늄 디스크를 넣고, 10%의 우태혈청(FBS)과 0.5%의 젠타마이신(gentamicin), 그리고 25μM의 아스코르빅산을 함유한 하이 글루코스 DMEM 배지로 2.5 × 104의 세포농도로 티타늄 표면 위에 온도가 37℃, 5%의 이산화탄소 분위기를 갖는 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in a 24-well plate with each titanium disk 14 mm in diameter, containing 10% fetal bovine serum (FBS), 0.5% gentamicin, and 25 μM of ascorbic acid. The cells were incubated with high glucose DMEM medium at a cell concentration of 2.5 × 10 4 for 3 days in an incubator having a carbon dioxide atmosphere of 37 ° C. and 5% on a titanium surface.

골수유래 간엽줄기세포의 초기 부착 및 증식 평가는 3-(4,5-디메틸티아졸-2- 일)-2,5-디페닐테트라조리움 브롬마이드(MTT)를 이용한 방법으로, 이 시약이 0.5mg/ml의 농도로 첨가된 하이 글루코스 DMEM 배지로 배지를 교체해 준 후, 온도가 37℃, 5%의 이산화탄소 분위기를 갖는 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션을 시켰다. 이 때, 포마잔(formazan)의 형성으로 세포는 보라색으로 변한다. 그 다음, 1ml의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 각각의 웰에 첨가하여 포마잔을 용출시킨 후에 540nm로 흡광도를 측정하였다. Initial adhesion and proliferation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells was evaluated using 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). After medium replacement with high glucose DMEM medium added at a concentration of 0.5 mg / ml, the temperature was incubated for 2 hours in an incubator having a carbon dioxide atmosphere of 37 ° C. and 5%. At this time, the cells turn purple due to the formation of formazan. Next, 1 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to each well to elute formazan, and the absorbance was measured at 540 nm.

도8에 나타낸 바와 같이, 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면에서 골수유래 간엽줄기세포가 초기 부착 및 증식이 제일 높은 것으로 보이지만, 실제로는 다른 조건의 초기 부착 및 증식과 큰 차이를 보이지 않음으로써, 실험한 모든 조건에서 골수유래 간엽줄기세포의 초기 부착 및 증식에는 서로 큰 차이를 보이지 않음을 알 수 있었다. As shown in FIG . 8 , the bone marrow-derived mesenchymal stem cells appeared to have the highest initial attachment and proliferation on the surface using the alendronate as a calcium chelating agent, but in fact, the experiment showed no significant difference from the initial attachment and proliferation under other conditions. Under all conditions, the initial adhesion and proliferation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells were not significantly different from each other.

골수유래 간엽줄기세포를 3일 배양 후에 주사전자현미경(Hitachi Instruments Inc., 일본)을 이용해 세포 형태를 관찰하기 위하여 생리식염 인산 완충액에 2.5%의 글루타라알데하이드를 희석시킨 용액에 실온에서 24시간 동안 담지시켜 세포를 고정시켰다. 그 다음, 2%의 오스뮴 테트록사이드(OsO4)와 0.2M의 포스페이트 버퍼를 1:1로 희석시킨 용액을 빛을 차단한 상태에서 실온으로 2시간 동안 고정시켰다. 고정이 끝난 후에는 생리식염 인산 완충액으로 10분간 2회 세척하고, 세포의 탈수를 위해 30%, 50%, 70%, 90%, 100%의 증류수 희석 에탄올을 차례대로 10분간 2회 처리하였다. 그 다음, 98%의 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔(HMDS)과 100% 에탄올을 1:1로 희석하여 5분간 처리하였다. 처리한 후, 98%의 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔으로 10분간 2회 처리하였으며, 처리가 모두 끝나면 상기 용액을 제거하고 실온에서 24시간 동안 완전히 건조시켰다. After 3 days incubation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, in order to observe the cell morphology using a scanning electron microscope (Hitachi Instruments Inc., Japan) in a solution diluted 2.5% glutaraldehyde in physiological saline phosphate buffer for 24 hours at room temperature The cells were fixed by loading. Then, a solution of 1: 1 diluted of 2% osmium tetroxide (OsO 4 ) and 0.2 M phosphate buffer was fixed at room temperature for 2 hours while blocking light. After fixing, the cells were washed twice with physiological saline phosphate buffer for 10 minutes, and treated with 30%, 50%, 70%, 90%, and 100% distilled water diluted ethanol twice for 10 minutes in order to dehydrate the cells. Then, 98% of 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane (HMDS) and 100% ethanol were diluted 1: 1 and treated for 5 minutes. After treatment, two treatments were performed for 10 minutes with 98% 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane. After the treatment was completed, the solution was removed and completely dried at room temperature for 24 hours.

도9에 나타낸 바와 같이, 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면에서의 세포 부착은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면과 다른 점이 없으나, 이에 골형성 단백질을 처리한 표면에서는 세포가 위족(filopodia)을 형성하며 티타늄 표면에 밀착된 형태로 넓게 자라는 것을 확인할 수 있었다. 또한 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면에서의 세포 부착은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면과는 다르게 세포가 위족을 형성하며 티타늄 표면에 밀착된 형태로 넓게 자라는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 골형성 단백질을 처리한 표면에서도 이와 같은 형태를 보였다. 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면에서의 세포 부착은 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 하이드록시아파타이트 표면보다 오히려 덜 부착되었으나, 이에 골형성 단백질을 처리한 표면에서는 세포가 위족을 형성하며 티타늄 표면에 더욱 밀착된 형태로 넓게 자라는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 키토산과 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 표면은 세포와의 부착에 효과가 있으며, 특히 키토산은 칼슘 킬레이팅제 처리만으로도 효과가 있음을 보여주었다.
As shown in Fig . 9 , the cell adhesion on the surface using the alendronate as the calcium chelating agent is not different from the surface of the normal hydroxyapatite without the treatment with the calcium chelating agent. Forming (filopodia) and was found to grow widely in the form close to the titanium surface. In addition, the cell adhesion on the surface using chitosan as a calcium chelating agent, unlike the normal hydroxyapatite surface without calcium chelating agent, was found to form a prosthesis and grow broadly in close contact with the titanium surface. In the surface treated with the bone morphogenetic protein, it showed the same shape. Cell adhesion on the surface using alginate as calcium chelating agent was less adherent than normal hydroxyapatite surface without calcium chelating agent, but on the surface treated with bone morphogenetic proteins, the cells formed a liposome and the titanium surface It could be confirmed that it grows in a more close form. The results show that chitosan and alginate are used as calcium chelating agents, and the surface on which bone morphogenetic proteins are immobilized is effective for adhesion with cells. In particular, chitosan is effective only with calcium chelating agent treatment.

실시예Example 8. 베타- 8. Beta- 트리칼슘포스페이트Tricalcium phosphate 제조 표면의 특성 및 세포 증식 분석 Characterization of manufacturing surface and cell proliferation

제조된 골형성 단백질 고정 베타-트리칼슘포스페이트가 코팅된 티타늄 표면의 특성을 알아보기 위하여 표면의 접촉각 측정 및 세포 증식 분석을 실시하였다. In order to investigate the characteristics of the prepared titanium-enzyme-fixed beta-tricalcium phosphate-coated titanium surface, the contact angle measurement and cell proliferation analysis were performed.

도10에서 나타낸 바와 같이, 베타-트리칼슘포스페이트가 코팅된 티타늄 표면에서도 하이드록시아파타이트 표면과 마찬가지로, 키토산 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 베타-트리칼슘포스페이트 표면보다는 접촉각이 전체적으로 6° 정도 증가하였다. 그러나 키토산 칼슘 킬레이팅제를 처리한 표면 위에 골형성 단백질을 고정하였을 경우에는 11° 정도 접촉각이 감소하였음을 확인함으로써 베타-트리칼슘포스페이트 박막에서도 천연 칼슘 킬레이팅제로 골형성 단백질을 고정시킨 표면이 친수성이 크게 증가하는 것을 알 수 있었다. As shown in FIG . 10 , the contact angle of the beta-tricalcium phosphate-coated titanium surface was increased by 6 ° as compared to the surface of the beta-tricalcium phosphate, which was not treated with the chitosan calcium chelating agent. . However, when the osteogenic protein was immobilized on the surface treated with the calcium chitosan chelating agent, the contact angle was decreased by about 11 °. Therefore, the surface of the beta-tricalcium phosphate thin film fixed with the osteogenic protein with the natural calcium chelating agent was hydrophilic. This increased significantly.

도11에 나타낸 바와 같이, 키토산 칼슘 킬레이팅제를 사용한 표면에서의 세포 부착은 하이드록시아파타이트 표면과 마찬가지로, 칼슘 킬레이팅제를 처리하지 않은 일반 베타-트리칼슘포스페이트가 코팅된 표면과 다르게 세포의 위족을 형성하며 티타늄 표면에 밀착된 형태로 넓게 자라는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 골형성 단백질을 처리한 표면에서도 이와 비슷한 형태를 보였다. 이로써 키토산 칼슘 킬레이팅제를 사용하고 골형성 단백질을 고정시킨 표면은 세포와의 부착에 효과가 있으며, 키토산은 베타-트리칼슘포스페이트 위에 칼슘 킬레이팅제 처리만으로도 효과가 있음을 보여주었다.
As shown in Fig . 11 , the cell adhesion at the surface using the calcium chitosan chelating agent is similar to the surface of the hydroxyapatite, unlike the beta-tricalcium phosphate-coated surface not treated with the calcium chelating agent. Forming and forming a close contact with the titanium surface was found to be wide, and showed a similar form on the surface treated with bone morphogenetic protein. As a result, the surface using the calcium chelating agent and the immobilized bone morphogenetic protein was effective for adhesion with the cells, and chitosan was shown to be effective only by the treatment with calcium chelating agent on beta-tricalcium phosphate.

실시예Example 9. 제조 표면의 세포 배양 후  9. After Cell Culture on Manufacture Surface westernwestern 분석 analysis

제조된 골형성 단백질 고정 하이드록시아파타이트가 코팅된 티타늄 표면의 골분화능을 알아보기 위하여, 골수유래 간엽줄기세포를 3일 동안 배양하여 오스테오프로테게린(osteoprotegerin)과 오스테오폰틴(osteopontin) 유전자의 발현을 western 분석을 통해 확인하였다. In order to examine the osteogenic differentiation ability of the prepared bone-forming protein-fixed hydroxyapatite-coated titanium surface, bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured for 3 days to express osteoprotegerin and osteopontin genes. It was confirmed through western analysis.

도12에 나타낸 바와 같이, 조골세포에서 만들어지는 단백질인 오스테오프로테게린은 일반 하이드록시아파타이트 표면, 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면, 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면, 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면, 그리고 알렌드로네이트 칼슘 킬레이팅 처리 후 골형성 단백질을 처리한 표면에서는 발현이 잘 되지 않았지만, 키토산 그리고 알지네이트 칼슘 킬레이팅 처리 후 골형성 단백질을 처리한 표면에서는 오스테오프로테게린의 발현이 증가하였으며, 특히 키토산 칼슘 킬레이팅 처리 표면에서 그 발현이 가장 높았다. 골형성에 중요한 유전자인 오스테오폰틴은 일반 하이드록시아파타이트 표면, 알렌드로네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면, 키토산을 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면, 그리고 알지네이트를 칼슘 킬레이팅제로 사용한 표면에서는 발현이 잘 되지 않았지만, 알렌드로네이트, 키토산, 그리고 알지네이트 칼슘 킬레이팅 처리 후 골형성 단백질을 처리한 표면에서는 오스테오폰틴의 발현이 증가하였다.
As shown in Fig . 12 , osteoprotegerin, a protein produced in osteoblasts, has a surface of a general hydroxyapatite, a surface using alendronate as a calcium chelating agent, a surface using chitosan as a calcium chelating agent, and an alginate as a calcium chelating agent. On the surface and the surface treated with bone morphogenetic protein after Alendronate calcium chelating treatment, the expression of osteoprotegerin increased on chitosan and the surface treated with bone morphogenic protein after alginate calcium chelating treatment. The expression was highest on the chitosan calcium chelating surface. Osteopontin, an important gene for bone formation, was poorly expressed on the surface of general hydroxyapatite, the surface using alendronate as a calcium chelating agent, the surface using chitosan as a calcium chelating agent, and the surface using alginate as a calcium chelating agent. Osteopontin expression increased on the surface treated with bone morphogenetic proteins after Alendronate, Chitosan, and Alginate calcium chelating.

Claims (6)

하기의 단계를 포함하는 골형성 단백질이 고정된 임플란트의 제조방법:
(a) 임플란트 표면에 코팅층을 형성하는 단계;
(b) 상기 코팅층에 천연 칼슘 킬레이팅제인 키토산 또는 알지네이트를 결합시키는 단계; 및
(c) 상기 킬라이팅제에 골형성 단백질을 고정시키는 단계.
A method for preparing an implant to which bone-forming protein is immobilized, comprising the following steps:
(a) forming a coating layer on the implant surface;
(b) binding chitosan or alginate, a natural calcium chelating agent, to the coating layer; And
(c) immobilizing the osteogenic protein on the chelating agent.
제 1항에 있어서, 상기 코팅층은 티타늄 표면에 하이드록시아파타이트 또는 베타-트리칼슘포스페이트가 코팅되어 형성된 것인 방법.
The method of claim 1, wherein the coating layer is formed by coating hydroxyapatite or beta-tricalcium phosphate on a titanium surface.
제1항에 있어서, 상기 골형성 단백질은 BMP-2, BMP-4 및 BMP-12로 이루어진 군으로부터 선택된 골형성 단백질인 방법.
The method of claim 1, wherein the osteogenic protein is a osteogenic protein selected from the group consisting of BMP-2, BMP-4 and BMP-12.
제 1 항에 있어서, 상기 (c)단계는 디페닐포스포릴아자이드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드, 카보디이미드 글루타르알데하이드 또는 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드 가교시약을 사용하여 고정시키는 것인 방법.
The method of claim 1, wherein step (c) is fixed using diphenylphosphoryl azide, hexamethylene isocyanate, succinimide, carbodiimide glutaraldehyde or ethyldimethylaminopropyl carbodiimide crosslinking reagent. Way.
제 1 항에 있어서, 상기 임플란트는 치과용 또는 정형외과용 임플란트인 방법.
The method of claim 1, wherein the implant is a dental or orthopedic implant.
천연 칼슘 킬레이팅제인 키토산 또는 알지네이트를 이용하여 골형성 단백질을 임플란트에 고정시킴으로써 임플란트의 생착율을 증가시키는 방법.

A method of increasing the engraftment rate of an implant by immobilizing a bone morphogenic protein to the implant using a natural calcium chelating agent, chitosan or alginate.

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