KR101183770B1 - Ｅ1-불멸화된 세포의 배양물 및 이로부터 생성 수율을 증가시키기 위한 동일물의 배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아데노바이러스 E1 서열, 바람직하게는 PER. C6^TM세포에 의해 불멸화된 배아 망막아세포(retinoblast)로부터 유래된 세포를 배양하여 그러한 세포로부터 생성 수율을 개선시키는 방법을 제공한다. 그러한 세포를 위한 피드 전략과 매우 높은 세포 밀도를 가진 배양물이 제공되는데, 재조합 항체와 같은 생성물의 높은 수율을 이끈다.

불멸화, 배양물

Description

Ｅ1-불멸화된 세포의 배양물 및 이로부터 생성 수율을 증가시키기 위한 동일물의 배양 방법{Cultures of E1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom}

본 발명은 세포 배양 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 아데노바이러스로부터의 E1 서열로 불멸화된 세포로부터 유래된 세포를 배양하는 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 그러한 세포들로부터 높은 수준의 생성물을 얻기 위해 그러한 세포들을 배양하는 것에 관한 것이다.

아데노바이러스(Ad5) E1a 및 E1b 유전자로 불멸화에 의해 망막 세포로부터 유래된, ECACC 96022940로 기탁된 세포에 의해 예시된, 인간 PER.C6^® 세포주가 US 5,994,128에 개시되어 있다. E1이 제거된 아데노바이러스의 벡터(US 5,994,128; WO 01/005945)를 위한, 그리고 다른 바이러스(WO 01/38362)를 생성하기 위한 포장(packaging) 세포로써 기능하는 능력 이외에, PER. C6 세포와 같은 E1-불멸화된 세포들은 항체(WO 00/63403)와 같은 재조합 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다.

Xie et al(2002)이 E1-불멸화된 세포의 무혈청 현탁액 배양을 위한 방법을 개시했지만, E1-불멸화된 세포에 대해 당업계에 개시된 배양 방법을 이용하여 얻어 지는 생성 수율은 개선될 수 있다. 이 유형의 세포로부터 생성 수율을 증가시키기 위한 신규한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

본 발명의 요약

하나의 양상에서 본 발명은 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 세포의 페드-배치(fed-batch) 또는 페드-관류(fed-perfusion) 배양물에 대한 피드(feed) 전략을 제공한다. 그 하나의 구현예로, 본 발명은 다음과 같은 단계들을 포함하는 그러한 세포의 배양을 위한 방법을 제공하는데, 상기 세포는 현탁액에서 성장할 수 있다: 세포 배양 중에 포도당, 글루타민, 인산염, 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌, 시스틴, 발린, 라이신, 트레오닌 및 글리신으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지 성분의 농도를 한 번 이상 측정하는 단계, 이전 단계에서 농도가 측정된 하나 이상의 성분들의 고갈시에 또는 그 전에 세포 배양 중의 배지에 성분들을 첨가하는 단계, 여기서 첨가되는 성분들은 적어도 포도당, 글루타민, 인산염, 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌 및 시스틴을 포함한다. 본 발명에 따라 유익하게 첨가될 수 있는 다른 성분들, 성분들 첨가의 양 및 시간은 청구항에서 뿐만 아니라, 여기 하기에 제공되어 있다.

아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 세포로부터 유래되는 세포의 배양물을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 양상인데, 상기 배양물은 10×10⁶세포/ml 이상, 바람직하게는 12×10⁶세포/ml 이상, 더 바람직하게는 15×10⁶세포/ml 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 배양물은 20×10⁶, 25×10⁶, 30×10⁶ 또는 40×10⁶세포/ml 이상을 포함한다. 그런 배양물을 얻는 방법이 또한 여기에 제공되어 있다.

또 다른 양상에서, 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 세포의 배양물로부터 세포 밀도와 생성 수율을 증가시키기 위한 방법이 제공된다. 하나의 구현예로, 그런 세포를 배양하기 위한 방법이 제공되는데, 상기 방법은 0.8×10⁶ 내지 2.0×10⁶의 생육가능한 세포/ml, 바람직하게는 0.9×10⁶ 내지 1.5×10⁶의 생육가능한 세포/ml의 접종(seeding) 농도로 상기 세포를 하위배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 세포는 망막 세포로부터, 더 바람직하게는 ECACC 96022940로 기탁된 세포와 같은, 인간 배아 망막(HER) 세포로부터 유래된다. 하나의 구현예로, 상기 세포는 PER.C6 세포이다.

특정 구현예로, 상기 세포는 재조합 단백질, 바람직하게는 항체를 높은 수율로 생성할 수 있다. 다른 구현예로, 상기 세포는 E1-영역에 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터, 또는 다른 바이러스를 포함하는데, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 높은 수율로 상기 세포가 생성될 수 있다. 바람직한 구현예로, 세포는 무혈청 배지에 적어도 일부 시간에 배양된다.

본 발명의 상세한 설명

세포주의 생산성은 세포주의 특유한 생산성, 달성할 수 있는 생육가능한 세포의 최고 농도 및 가능한 생성 방법의 길이(length)라는 세 가지 기본 파라미터에 의해 주로 정의된다. 이러한 변수 중 어떤 것의 증가라도 최종 생성물 농도에 증가를 이끌 것이고 이것은 세포주에 큰 정도로 의존한다. 직선 배치 배양에서, CHO와 SP2/0과 같은 세포주는 4×10⁶/ml까지 세포 밀도를 달성할 수 있다. 페드-배치 또는 관류 방법에서 생육가능한 세포 농도는 증가되고, 전형적으로 SP2/0과 같은 하이브리도마 세포는 10×10⁶세포/ml까지 배양될 수 있으나, CHO는 6~10×10⁶세포/ml까지 배양될 수 있다. 본 발명은, 바람직하게는 배아 망막 세포로부터 유래되는, 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 세포의 배양물의 생육가능한 세포 밀도를 종래의 당업에 보고된 것을 초과하는 세포 밀도를 달성하도록 증가시키는 방법을 기술한다. 더욱이, 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 세포의 배양물로부터 더 높은 생성 수율을 얻는데 이용될 수 있다.

본 발명은 PER.C6 세포와 같은 E1-불멸화된 세포가 높은 수율의 모노클로날 항체의 생성을 위해 유리하게 이용될 수 있는 방법에서 개선을 개시한다. 이 세포들이 직선 배치 방법(14×10⁶의 생육가능한 세포/ml까지)에서 매우 높은 생육가능한 세포 농도로 배양되는 것이 개시된다.

더욱이, PER.C6 세포와 같은 E1-불멸화된 세포는, 이 세포들의 배양물이 예상치 않게 락테이트와 암모니아를 소모하고 영양이 제한된 조건하에서 장기간의 시간동안 생육가능성을 유지하므로 페드-배치 방법에 적합하다. 배양물에 피드 전략에 의해 상기 세포로부터 생성 수율을 증가시키는 방법이 여기에서 제공된다.

여기서 사용되는 것과 같은 `피드 전략'이라는 용어는 제한되지는 않지만, 설탕, 아미노산, 및 유사물과 같은 영양분을 포함하는 특정의 확인된 성분들의 첨가를 뜻한다. 확인된 성분들은, 그들이 여기서 제공되는 것과 같은 세포들로부터 생성 수율을 개선시키는 것이 요구될 때, 특정한 양과 특정한 시간에 바람직하게 첨가된다.

PER.C6 세포와 같은 E1-불멸화된 세포는 또한 장기간의 시간동안 그들이 우수한 최종 생성 농도로(85% 이상의 생육가능성을 가진 50×10⁶세포/ml까지) 매우 높은 생육가능한 세포 농도에서 유지될 수 있기 때문에 관류 방법에 적합하다.

배양 배지

본 발명의 방법은 일반적으로 본 발명에 따른 세포에 대해 당업에 기술된 방법으로 얻어지는 수율과 비교하여 세포로부터의 생성 수율을 증가시킨다. 바람직하게는, 무혈청 배양 배지가 본 발명에 따른 방법에 적어도 일부 시간에 사용된다. 바람직하게는, 배지는 동물에서 유래하지 않은 재조합으로 생성된 단백질만을 함유한다. 그런 배양 배지는 다양한 원천으로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, VPRO 배양 배지(JRH Biosciences)가 페드-배치나 (페드-) 관류 방법을 위해 사용된다.

생성물

본 발명의 방법은 본 발명의 세포에서 생성물을 생성하기 위해 바람직하게 사용된다. 본 발명의 방법은 다른 단백질(WO 00/63403) 뿐만 아니라 항체의 개선된 생성을 위해 사용될 수 있다. 단백질 생성을 위해, 본 발명의 세포는 상기 단백질이 발현하게 할 수 있는 요소들과 작동가능하게 조합하여 상기 단백질을 코드화한 핵산을 적절히 포함한다. 더욱이, 상기 방법은 E1-영역에 결실을 가지는 재조합 아데노바이러스 백터의 생성의 개선을 위해 사용될 수 있고, 그러한 경우에 세포는 보충화(complementing) 세포로써 사용되는데, 그 자체로 확립된 방법론에 따라 당업자에게 알려져 있다(예를 들면 US 5,994,128; WO 01/005945).

더욱이, 본 발명에 따른 방법은 세포에서 다른 (비-아데노바이러스) 바이러스의 증식을 위한 방법을 개선시키기 위해 사용될 수 있다(WO 01/38362). 따라서, 본 발명에 따른 생성물은 E1 영역에서 결실을 가지는 재조합 아데노바이러스 벡터, 또는 다른 바이러스 뿐만 아니라 항체, 에리트로포이에틴, 및 유사물과 같은 재조합 단백질이 될 수 있다.

세포

본 발명에 따른 세포는 아데노바이러스로부터 E1 서열로 불멸화된 세포인데, 상기 세포는 또한 E1-불멸화된 세포로써 여기에 언급되어 있다. 그런 세포는 아데노바이러스의 E1A 영역의 적어도 작용 부분을 발현하고, 바람직하게는 또한 E1B 영역의 적어도 작용 부분을 발현한다. E1B 단백질이 항-세포자멸사(anti-apoptotic) 활성을 가지는 반면에, E1A 단백질은 형질변환 활성을 가진다. 본 발명에 따른 세포는 폐 세포, 신장 세포, 암니오사이트(amniocytes)를 포함한 어떤 세포로부터 유래될 수 있지만, 바람직하게는 망막 세포로부터 유래된다. 그들은 배아의 망막 세포로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 세포는 인간의 세포이다. 배아 망막 세포의 불멸화에 대한 방법이 당업계에 기술되어왔다(US 5,994,128). 따라서, 아데노바이러스로부터의 E1 서열로 불멸화된 망막 세포가 그 방법에 의해 얻어질 수 있다. 바람직한 구현예로, 본 발명의 세포는 PER.C6 세포와 같은 E1-불멸화된 HER 세포로부터 유래된다. 본 출원의 목적을 위한 PER.C6 세포는 ECACC 96022940으로 기탁되었듯이 세포의 업스트림이나 다운스트림 계대 또는 업스트림이나 다운스트림 계대의 자손으로부터의 세포를 의미한다. 게다가, ts125 돌연변이를 가지는 E2A 영역이 또한 상기 세포에 존재할 수 있다(예를 들면 US 6,395,519 참조). PER. C6로부터 유래되는 세포는 재조합 아데노바이러스 또는 다른 바이러스로 감염된 PER. C6 세포일 수 있고 또한 재조합 핵산이 도입된 PER. C6 세포일 수 있는데, 예를 들면 관심의 단백질을 코드화하는 핵산이 그것을 발현할 수 있게 하는 프로모터 및 폴리 A 시그널과 같은 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 카세트를 포함하고, 여기서 바람직하게는 상기 세포가 당업자에게 알려진 표준 절차에 따라 선택될 수 있는 안정한 클론으로부터 유래한다. 그러한 클론의 배양물은 상기 재조합 핵산에 의해 코드화된 단백질을 생성할 수 있다.

피드 전략을 위한 성분들

하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 세포를 배양하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 본 발명에 따른 피드 방법에 의해 농도가 최적 방법과 생성 수율을 위해 제한되어졌거나 제한되어질 아미노산들을 보충하기 위해서 배양 방법 중에 특정 아미노산들이 첨가된다. D 및 L 입체 이성질체 형태에 모든 자연적으로 발생하는 알파 아미노산이 아미노산, 및 그들의 유도체가 의도된다. 유도체는 그것에 부착된 또 다른 분자나 원자를 가지는 아미노산으로써 정의된다. 유도체는, 예를 들면, 아미노기의 아세틸화, 카르복실기의 아민화, 또는 시스틴을 형성하기 위한 두 시스테인의 황 잔기의 산화를 포함한다. 또한, 아미노산 유도체는 수화물 뿐만 아니라 에스테르, 염화물, 황산염과 같은 염 및 유사물을 포함할 수 있다. 특이적 아미노산이 여기에 언급된 경우, 당업자에게 이해될 것이다. 유도체가 또한 사용될 수 있고 본 발명의 영역 내에 포함됨을 의미한다는 것이다. 당, 성장 인자, 비타민 등과 같은 다른 성분들도 본 발명에 따른 방법을 개선시키기 위해 또한 첨가될 수 있다.

피드 전략

하나의 양상으로, 본 발명은 배양 배지에서 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 세포에서 생성물을 생성하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 생성물은 재조합 단백질, 바이러스, 및 E1 영역에 결실이 있는 재조합 아데노바이러스로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 방법은 적어도 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌 및 시스틴이 배양 배지에 첨가되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 하나의 양상으로, 본 발명은 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 세포를 배양하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 세포는 현탁액에서 성장할 수 있고, 다음 단계를 포함한다: 세포 배양 중에 포도당, 글루타민, 인산염, 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌, 시스틴, 발린, 라이신, 트레오닌 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지 성분들의 농도를 한 번 이상 측정하는 단계, 이전 단계에서 농도가 측정된 하나 이상의 성분들의 고갈시 또는 그보다 앞서 세포 배양 중에 배지에 성분들을 첨가하는 단계, 여기서 첨가되는 성분들은 적어도 포도당, 글루타민, 인산염, 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌 및 시스틴을 포함한다. 여기서 사용되는 "고갈"은 성분이 배양 배지에서 시초(starting) 농도의 30% 이하의 농도를 가지는 시간으로써 정의된다. 이 양상들에서, 포도당, 글루타민, 인산염, 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌 또는 시스틴으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지 성분의 농도의 측정은 발린, 라이신, 트레오닌 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택된 성분들만의 측정보다 더 좋다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 2 이상의 배지 성분들의 농도는 첫 번째 단계에서 측정된다. 특정 구현예에서는, 첨가되는 성분들은 하나 이상의 발린, 라이신, 트레오닌, 글리신, 아스파라긴, 티로신, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 칼슘, LongR3 IGF-1(인슐린-유사 성장 인자-1; Insulin-like Growth Factor-1), Long EGF (상피 성장인자; Epidermal Growth Factor) 및 인슐린을 추가로 포함한다. 특이적 구현예에서, 성분들은 포도당에 대해 6.0, 글루타민에 대해 첫 피드에서는 2.60 그리고 그 후의 피드에서는 1.75, 인산염에 대해 0.70, 로이신에 대해 0.66, 세린에 대해 첫 피드에서는 1.10 그리고 그 후의 피드에서는 0.55, 이소로이신에 대해 0.50, 아르기닌에 대해 0.46, 메티오닌에 대해 0.23, 그리고 시스틴에 대해 0.25의 10×10⁶세포/ml 당 새롭게 첨가되는 성분의 mmoles/l의 최종 농도로 첨가된다. 또 추가의 구현예에서, 발린에 대해 0.45, 라이신에 대해 0.44, 그리고 트레오닌에 대해 0.30의 10×10⁶세포/ml 당 새롭게 첨가되는 성분의 mmoles/l의 최종 농도로 상기 성분들이 추가로 첨가된다. 또 하나의 구현예에서, 아스파라긴에 대해 0.10, 티로신에 대해 0.13, 히스티딘에 대해 0.10, 페닐알라닌에 대해 0.02, 및 트립토판에 대해 0.06의 10×10⁶세포/ml 당 새롭게 첨가되는 성분의 mmoles/l의 최종 농도로 상기 성분들이 추가로 첨가된다. 또한, 칼슘이 0.02의 10×10⁶세포/ml 당 새롭게 첨가되는 성분의 mmoles/l의 최종 농도로 첨가될 수 있다. IGF, EGF와 같은 성장 인자, 및 인슐린 또는 그들의 유도체가 또한 성장 배지에 적절히 주어질 수 있다. 상기 성분들의 첨가를 위한 양은 33% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하, 훨씬 더 바람직하게는 5% 이하의 성분 당 오차 허용 범위를 가질 수 있다. 그 양은 10×10⁶세포/ml 당으로 주어지고 세포/ml의 수에 선형적으로 의존한다. 바람직한 구현예에서, 상기 성분들은 이전 단계에서 농도가 측정된 하나 이상의 배지 성분들의 고갈 전 48시간과 고갈 순간 사이에 첨가된다. 어떤 구현예에서는, 상기 첨가는 24시간과 고갈 직전 사이의 시간에 있다. 특정 양상에서는, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 제공하는데, 여기서 상기 세포는 리터 당 500mg 이상, 바람직하게는 700mg/l 이상, 더 바람직하게는 850mg/l 이상, 훨씬 더 바람직하게는 1000mg/l 이상, 훨씬 더 바람직하게는 1250mg/l 이상, 훨씬 더 바람직하게는 1500mg/l 이상, 훨씬 더 바람직하게는 1750mg/l 이상 및 훨씬 더 바람직하게는 2000mg/l 이상의 수준으로 배양 배지로 분비되는 재조합 이뮤노글로블린을 발현한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 배지 성분들의 첨가는, 즉 예를 들면 페드-배치 방법에서, 어떠한 성분들도 첨가되지 않는 방법, 즉 배치 방법과 비교하여, 1.5×이상, 바람직하게는 2×이상, 더 바람직하게는 2.5×이상 및 훨씬 더 바람직하게는 약 3× 또는 훨씬 더 높은 정도로 생성된 생성물의 수율에 증가를 가져온다.

페드-배치 방법에서의 사용에 더하여, 본 발명의 피드 전략은 또한 실시예 5에 설명된 것과 같이 최적화된 배치 방법에서 유익하게 사용될 수 있다.

관류(perfusion)

대안으로서, 본 발명의 또 다른 양상으로 전체 배양 배지가 교환될 수 있다. 예상치 못한 높은 생육가능한 세포 밀도는, 이것이 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 망막 세포로부터 유래되는 세포에 적용될 때 달성될 수 있다고 보여진다. 제한되지는 않지만, 원심분리, 여과 등에 의해 세포의 수집을 포함하여, 배양 배지를 교환하는 것은 당업자에게 알려진 수단에 의해 수행될 수 있고, 신선한 배양 배지로 세포의 재-현탁액이 뒤따른다. 대안으로서, 관류 시스템이 사용될 수 있는데, 여기서 배양 배지는 센트리테크(cenritech) 원심 분리 또는 속이 빈 섬유 카트리지를 통한 통과 등과 같은 세포 분리 장치를 사용하여 연속적으로 또는 간헐적로 교환된다. 그러므로 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 배아 망막 세포로부터 유래되는 세포를 배양하기 위한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 양상인데, 여기서 배양 배지는 하루(24시간) 당 배양물 부피로, 0.2~3, 바람직하게는 0.5~3의 속도로 교환되는 것을 특징으로 한다. 이 방법을 사용하여 얻어진 배양물은 20×10⁶세포/ml보다 더 높은, 더 바람직하게는 30×10⁶세포/ml보다 더 높은 생육가능한 세포 밀도를 가진다. 특정 양상에서는, 그러한 배양물은 40×10⁶세포/ml보다 더 높은 세포 밀도를 가진다. 특정 양상에서는 그러한 배양물은 150mg/l/일 이상, 바람직하게는 200mg/l/일 이상, 더 바람직하게는 300, 400, 또는 500 mg/l/일의 수율로 재조합 항체를 생성하기 위해 사용된다. 물론, 본 발명에 따른 다른 생성물도 그런 방법에 의해 생성될 수 있다. 매일 배양 배지의 하나의 완전한 부피 교환은 500mg/L/일(750mg/l/일까지) 이상의 항체 수율을 가지는 30×10⁶ 이상의 생육가능한 세포/ml를 지원한다는 것이 여기에 보여진다(도 5). 하루에 하나의 완전한 배지 교환은 하루에 3 부피의 연속 관류 속도에 해당하는데, 연속 관류 시스템이 대략 150~200mg/L/일 이상을 수득할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 관류 속도를 감소시키고 따라서 항체 수율을 증가시키는(항체가 분비되는 부피를 감소시킴으로써) 한 가지 방법은 필수 성분들을 가진 신선한 배양 배지를 보충하는 것이다(페드-관류로써 알려짐). PER. C6 세포, 항체를 생성하는 E1-불멸화된 세포, 클론을 위한 이 성분들이 여기서 확인되고(실시예 2를 볼 것), 그러므로 그러한 페드-관류 시스템을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 양상인데, 여기서 본 발명에 따른 피드 전략이 이용된다. 페드-관류 방법의 일반적인 약점은 독소 대사 부산물의 누적인데(락테이트와 암모니아와 같은), 그것은 낮은 세포 생육가능성과 생성물 수율을 가져올 수 있다. 이런 부산물을 제거하기 위해서는 높은 관류 속도를 위한 높은 세포 농도의 요구성이 종종 있다. 본 발명에 따른 PER. C6 세포, E1-불멸화된 세포, 클론에 대해 증명된 한 장점은 농도가 미정이 되지 않도록(problematical) 그들이 락테이트와 암모니아를 이용할 수 있다는 것이다(도 3A 참조). 그러므로 하루 한 번 또는 두 번 배양 배지를 교환함으로써 500mg/l/일 이상의 항체 수율을 얻는 것이 가능하다. 대안으로, 이것은 예를 들어서 피드 농축물(페드-관류)을 가지는 배지의 보충과 조합하여 하루에 1 부피의 연속 관류 속도를 이용함으로써 달성될 수 있다. 이것은 세포 취출(bleed)과 유리하게 조합될 수 있다(세포 집단의 일정 비율을 제거함).

높은 세포 밀도를 가진 배양물이 높은 생성물 수율을 얻기 위해 유리하다. 그러므로 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 세포로부터 유래되는 세포의 배양물을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 양상인데, 상기 배양물은 10×10⁶세포/ml 이상을 포함한다. 배양물에 생육가능성은 80% 이상이다. 바람직하게는, 생육가능성은 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상이다. 본 발명에 따른 배양물은 바람직하게는 현탁액 배양물인데, 이것은 상기 배양물에 세포가 쉐이크 플라스크, 회전병, 교반 탱크, 에어 리프트 반응기, 등을 포함하는 생물반응장치와 같은 배양 배지에 현탁되어 있다는 것을 의미한다. 여기에 개시된 전략은 하지만 또한 Tanase et al(1997)에 의해 기술된 것과 같이, 속이 빈 섬유 반응기에서 세포 배양을 위해 그리고 마이크로캐리어 상의 세포와 같이, 점착성 배양물을 위해 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 배양물은 12×10⁶세포/ml 이상을 포함한다. 14×10⁶세포/ml 까지가 직선 배치 배양에 의해 얻어질 수 있다는 것이 여기에 개시되어 있다.

배지 관류를 사용하여, 훨씬 더 높은 세포 밀도, 즉 50×10⁶세포/ml가 달성될 수 있다는 것이 또한 입증된다. 종래의 당업계에서는 그러한 예상치 못한 높은 세포 밀도가 얻어질 수 있다는 것에 대해 어떤 제시도 제공하지 못한다. 그러므로 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 E1-불멸화된 세포로부터 유래되는, 바람직하게는 망막 세포로부터 유래되는 세포의 배양물을 제공하는데, 상기 배양물은 15×10⁶세포/ml 이상, 바람직하게는 20×10⁶세포/ml 이상, 더 바람직하게는 25×10⁶세포/ml 이상을 포함한다. 특이적 구현예에서, 상기 배양물은 30×10⁶세포/ml 이상, 또는 심지어 40×10⁶세포/ml 이상을 포함한다. 본 발명에 따른 15×10⁶세포/ml 이상을 가진 배양물은 관류 방법에 의해 얻을 수 있는데, 그것은 배양 배지가 배양 방법 중에 교환되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 배양물은 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상의 생육가능성을 가진다. 상기 배양물은 현탁액 배양물이다. 상기 배양물은 또한 성장 배지를 포함한다. 상기 성장 배지는 바람직하게는 무혈청이다. 배양물의 세포는 포맷으로, 이뮤노글로블린, 또는 그 일부 또는 유도체를 코드화하는 재조합 핵산 분자를 포함할 수 있다. 그런 세포는 높은 수율의 이뮤노글로불린을 생성할 수 있다. 특히, 배지가 매일 교환되고 30×10⁶세포/ml 이상이 주어지는 본 발명에 따른 세포 배양물은 500mg/l/일 이상의 재조합 항체 수율을 제공할 수 있다. 상기 배양물에 세포는 바람직하게는 10pg 단백질/세포/일 이상을 생성한다.

본 발명의 방법, 특히 재조합 단백질 생성을 위한 방법은 몇몇 경우에 생성물 수율을 개선시키는 당업계에 기술된 다른 수단과 함께 또한 조합될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 어떤 구현예에서 배양 배지는 생성 상(phase) 전 또는 그 중에, 예를 들면 30℃와 35℃ 사이의, 더 낮은 온도로 그 방법을 수용함으로써, 생성 상에서(재조합 단백질 생성을 위한 여러 파라미터에 대해 세포 배양물 온도를 낮추는 효과를 기술한 US 6,506,598, 및 거기에 인용된 문헌을 볼 것), 또는 세포가 하위배양될 때 또는 배양 방법 후반에 배양물에 찬 배양 배지의 첨가에 의해(여기서 차다는 것은 세포가 배양되는 온도보다 더 낮다는 것을 의미함, 바람직하게는 차가운 배양 배지는 2℃와 8℃ 사이에 온도를 가짐) 온도 변화를 겪게 된다. 다른 구현예에서, 특정 성장 인자가 생성 수율과 관련하여 본 발명에 따른 방법을 개선시키기 위해 첨가될 수 있다. 게다가 단백질 생성을 위한 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 전체 배양 단계 중이거나 단지 생성 상 중에, 알카노익산 또는 소디움 부티레이트와 같은 그 염의 첨가에 의해 개선될 수 있다(예를 들어서 세포 배양물에 단백질 생성에 대한 부티레이트의 첨가 효과를 기술한 US 6,413,746과 거기서 참조를 볼 것). 게다가 단백질 생성에 대한 다른 구현예에서, 배양 배지는 온도 또는 pH 변화를 겪는다(Weidemann et al 1994, Sauer et al 2000).

본 발명에 따른 여러 양상 및/또는 구현예는 특히 우수한 생성 수율을 이끄는 세포를 배양하기 위한 방법을 제공하기 위해 조합될 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 비-제한 실시예로써, 약 0.8×10⁶세포/ml~2.0×10⁶세포/ml로 E1-불멸화된 세포의 배양을 접종하는 것이 예를 들어서 가능하고, 피드 전략을 사용하는 것 및/또는 최종 생성물 수율을 개선시키기 위해 배양 방법 중에 성장 배지를 교환하는 것이 가능하다.

본 발명은 몇몇 실시예로 이제 예시될 것이나, 발명의 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니다.

도 1은 두개의 상이한 시초 세포 농도(0.3 및 1.0×10⁶ml^-1)로 쉐이크 플라스크에서 성장한 PER.C6 클론(클론 1)의 성장과 항체 생성을 도시하는 그래프이다. 좌측 수직축: 생육가능한 세포수(N_v). 우측 수직축: 항체 농도(Ab). 수평축: 시간(hours).

도 2는 항체를 생성하는 PER.C6 클론(클론 1)을 위한 증가된 생육가능한 세포 수를 가진 글루타민의 세포 특이적 이용에서 감소를 보여주는 그래프이다. N: 세포수.

도 3은 PER.C6 클론 1의 배치 배양을 위한 프로파일이다. A: 대사산물. Glc, 포도당; Lac, 락테이트; Gln, 글루타민; NH₃, 암모니아; P, 인산염. B-E: 아미노산(AA).

도 4는 포도당, 글루타민, 아미노산, 인산염, 칼슘 및 PER.C6 클론1에 대한 성장 인자를 함유하는 피드 성분 혼합물의 효과를 도시하는 그래프이다. A: 생육가능한 세포수(N_v). B: 항체(Ab) 농도. 원: 배치. 사각형: 페드-배치(fed-batch).

도 5는 배양 배지가 하루에 한 번 완전히 교환될 경우, PER.C6 클론의 생육가능한 세포수(Nv)와 항체(Ab) 수율을 도시하는 그래프이다. A: 클론 1. B: 클론 2.

도 6은 클론 1에 대한 변경된 피드(실시예 4)의 결과이다. A: 생육가능한 세포수(Nv). B: 항체(Ab) 농도. 개방된 원: 배치. 폐쇄된 원: 페드-배치.

도 7은 클론 1에 대한 다른 첫 번째 및 그 후의 피드 첨가물(실시예 4, 표 2)을 가진 추가 개선된 변형 피드의 결과이다. A: 생육가능한 세포수(Nv). B: 항체(Ab) 농도. 원: 배치. 사각형: 페드-배치.

도 8은 클론 2에 대한 다른 첫 번째 및 그 후의 피드 첨가물(실시예 4, 표 2)을 가진 추가 개선된 변형 피드의 결과이다. Nv: 생육가능한 세포수. Ab: 항체 농도.

도 9는 본 발명에 따른 방법에 따라 생성된 IgG의 갈락토실레이션 수준이다.

도 10은 클론 3에 대한 다른 첫 번째 및 그 후의 피드 첨가물(실시예 4, 표 2)을 가진 추가 개선된 변형 피드의 결과이다. Nv: 생육가능한 세포수. Ab: 항체 농도.

실험

관심 단백질을 발현하기 위한 세포 및/또는 세포주를 유전적으로 엔지니어링하기 위한 방법 및 벡터가 당업자에게 잘 알려져 있다; 예를 들면, 다양한 기술이 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds.(Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates)와 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press, 1989)에 기술되어 있다. 일반적이고 표준적인 세포 배양 기술은 당업자에게 알려져 있고 예를 들면 R. I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition(Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)에 기술되어 있다. 다른 방법으로 공지되지 않는 한 그런 표준 기술을 따랐다.

세포 배양 프로토콜

PER. C6 세포를 실시예에서 배양하였다. 세포를 10% FBS(Invitrogen)을 함유하는 DMEM 중의 점착성 배양물로부터 직접 옮김으로써 무혈청 배지에 적응시켰다. 간단하게, 서브컨플루언트(subconfluent), 대수(logarithmic) 세포는, 다른 방법으로 공지되지 않는 한, 트립신처리되어, 무혈청 배지로 한 번 세척되고 0.3~0.5×10⁶ml^-1의 시초 세포 농도로 25ml의 ExCell-525 무혈청 배지(JRH Biosciences)를 함유한, 0.2μ 필터(Corning)를 가진 250ml의 엘레마이어(Ehrlenmeyer) 플라스크로 직접 접종되었다. 배양물은 매 2~3일 마다 계대에 의해 엘레마이어 플라스크에서 대수 성장에 유지시켰다. 플라스크를 37℃와 5% CO₂에서 가습된 인큐베이터에서 100rpm으로 자석 쉐이커 플랫폼(Infors)에서 진탕하였다. 배양물을 5분동안 1000rpm으로 원심분리에 의해 계대하였다. 상청이 제거되고 남은 배지에서 펠렛을 재-현탁하였다. 새롭고, 차가운 배지(4℃)를 첨가하고 새로운 플라스크에 적절한 세포 농도로 접종하였다. 무혈청 배지에 옮긴 후, 배양물을 무혈청 세포 뱅크가 만들어진 후에 완전한 적응을 허용하기 위해 2~4주 동안 계대하였다. 모든 실험은 이 세포 뱅크에서 나온 세포를 사용하여 시작하였다.

생물반응장치

생물반응장치 배양물은 2L 작동 부피를 가진 3L 반응기에서 수행했다(Applikon). 온도는 가열 블랭킷(blanket)에 의해 37℃로 유지했다. 용존 산소 농도(dO₂)는 헤드스페이스를 통해 흡입 가스 조성을 조절함으로써 그리고 미세구멍(microporous) 스파저(sparger)를 통한 간헐적 스파징(sparging)에 의해 대기 포화의 50%로 조절했다. 시초 배양물 pH는 미세구멍 스파저를 통한 CO₂ 첨가에 의해 7.3으로 조절했다. 더 낮은 배양물 pH 한계는 배양물 pH가 하향으로 표류(drift)하는 것이 허용되도록 6.7로 설정되었다(더 낮은 한계는 도달되지 않음). 배양물은 75rpm으로 두 선박용 임펠러에 의해 교반되었다. 방법 데이터는 BioExpert 소프트웨어(Applikon)에 의해 얻어졌다.

분석 프로토콜

세포수와 생육가능성 측정은 CASY 자동 세포 계수기(Scharfe Systems)를 사용하여 수행되었다. 포도당, 락테이트, 암모니아 및 인산염 농도가 무-세포 배양물 상청을 가진 Ektachem Ⅱ 분석기(Kodak)를 사용해서 측정되었다. 아미노산 농도는 van Wandelen 과 Cohen(1997)에 의해 기술된 것과 같이 변형된 AccuTag HPLC 방법(Waters)을 사용하여 측정되었다. 원심분리된 배양물 상청의 분취량(200㎕)은 필요할 때까지 1ml 크라이오바이알(Nalgene)에서 -20℃로 저장되었다. 각 실험으로부터의 샘플은 실험상의 변동을 피하기 위해 동시에 분석되었다. 삼투몰농도(Osmolality)는 어느점내림 삼투압계(Osmomat 030-d, Gonotec)에 의해 측정되었다. 항체 농도는 샌드위치-형 ELISA에 의해 측정되었다. 요약하면, 플레이트는 카파 경쇄(Pharmingen)에 대한 마우스 항-인간 IgG 2㎍/ml로 코팅되었고 4℃로 밤새 배양되었다. 중쇄(Pharmingen; 1:500)에 대한 HRP-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 IgG가, 기질로써 OPD(Sigma)와 함께 37℃에서 1시간 동안 검출 항체로서 사용되었다. 배양 단계 사이에 세척이 PBS 중의 0.05% Tween 20으로 수행되었다. 샘플이 0.1% BSA로 보충된 세척 완충용액으로 희석되었다. 정량은 10~400ng/ml의 보정(calibration) 영역을 사용한 IgG1 참조 기준과 관련되었다. 단백질 A에 의해 정제된 항체 샘플은 등전집중(IEF)과 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)에 의한 품질 분석에 의존했다. 글리칸 분석을 위해, N-연결된 글리칸이 20mM 소디움 포스페이트(pH 7.2)에 IgG 샘플의 PNGase F 처리에 의해 제거되고 Applied Biosystems Voyager DE Pro 질량 분석기상에서 반사기 방식의 MALDI-MS로 분석되었다. 매트릭스는 50/50/0.1 아세토니트릴/물/트리플루오로아세트산 중의 2,5-디하이드록시벤조산(10mg/ml)이었다. 스펙트럼이 양이온 방식으로 얻어졌고 글리칸은 소디움 부산물, [M+Na]+로써 검출되었다.

세포 특이적 대사율의 계산

배치 및 페드-배치 배양물에서 대사산물 이용과 생성의 세포 비 속도(specific rate)는 하기 방정식에서 보여지는 것과 같은 세포 농도의 로그 평균을 사용하여 계산되었다:

q_s = (C₂-C₁)/ (t₂-t₁) × [(X₂-X₁)/ln(X₂-X₁)].

이 방정식에서, C는 대사산물 농도(μmoles/l), t는 시간(일) 그리고 X는 생 육가능한 세포 농도이다. 속도가 계산된(데이터는 나타내지 않음) 시점에서 분해가 상당하지 않았기 때문에 글루타민의 자발성 분해를 설명하는 속도 상수는 포함되지 않았다. 포도당 당 생성된 락테이트의 수율 계수(Y_lac/glc), 글루타민 당 생성된 암모니아(Y_amm/gln)와 글루타민 당 생성된 알라닌(Y_ala/gln)이 하기 등식으로부터 계산되었고 mole/mole로 표시된다:

Y_lac/glc=q_lac/q_glc

Y_amm/gln=q_amm/q_gln

Y_ala/gln=q_ala/_qgln

실시예 1: PER. C6 세포의 배치 배양에 최대 최종 세포 수율의 증가

가장 단순한 방법은 배치 배양이다. 그러나, 이것은 주로 영양 제한 때문에 생육가능한 세포 농도와 그에 따라서 달성가능한 생성수율에서 제한된다. PER. C6 또는 PER. C6 유도된 서브-클론의 배치 배양물의 최대 최종 세포 농도를 증가시키기 위한 방법이, 다른 세포 농도로 주요 영양의 이용의 세포 특이적 속도를 계산함으로써 그리고 세포 성장과 관련하여 영양의 최적 이용이 있는 세포 농도에서 배치 배양을 시작함으로써 제공된다.

상피 세포 부착 분자(EpCAM)를 인식하는 항체의 항원-결합영역을 코드화하는 DNA가 scFv 파지 디스플레이 라이브러리(Huls et al, 1999)로부터 최초로 분리되었다. CD46을 인식하는 항체의 항원-결합 영역을 코드화하는 DNA는 WO 02/018948에 개시된 것과 같이 분리되었다. IgG1형의 리더 서열과 불변 영역이 Boel et al, 2000에 기술된 것과 같이 필수적으로 첨가되었다. 경 및 중 쇄를 코드화하는 DNA가 그 후 발현 벡터 pcDNA3002(Neo)로 클론되었다. 국제특허출원 PCT/NL02-00841에 기술된 발현 벡터 pcDNA3002(Neo)는 2001년 12월 13일에 01121318로 European Collection of Cell Cultures(ECACC)로 기탁되었다. CMV 프로모터에 의해 조절된, 각각, EpCAM 또는 CD46을 인식하는 IgG1을 코드화하는, 결과의 발현 벡터가 표준 방법에 따라 PER. C6 세포에 접종되었다.

PER. C6 세포주의 모 집단으로부터 유래되는 재조합 항체-발현 클론이 이 실험에 사용되었다. 클론 발현 항-EpCAM은 또한 클론 1로서 여기에 언급되고, 클론 발현 항-CD46은 클론 2로서 여기에 또한 언급된다.

세포를 ExCell^TM 525 배지(JRH Bioscience)에 유지하였고(GTM-3 배지(Sigma)에 세포의 유지가 또한 작동함), 배치 생성이 ExCell^TM VPRO 배지(JRH Biosciences, Cat. No. 14560)에서 실행되었다. 세포는 배치 생성을 위해 ExCell^TM 525로부터 ExCell^TM VPRO로 직접 옮겨졌다.

도 1은 0.3×10⁶세포/ml로 시작하여 9일 후에 10×10⁶세포/ml에 도달하는 배양물과 비교하여, 1×10⁶세포/ml로 시작하여 6일 후에 거의 14×10⁶세포/ml에 도달하는 배양물의 최대 최종 생육가능한 세포 농도를 도시한다(대략 CHO 와 Sp2/0의 배치 배양물보다 3배 더 높음). 두 배양물의 최종 항체 적정에서의 차이는 거의 없다. 그러나, 0.3×10⁶세포/ml로 시작된 배양물에 대한 9일 후와 비교하여, 1×10⁶세포/ml로 시작된 배양물에서는 6일 후에 대략 600mg L^-1가 도달되었다.

0.3×10⁶세포/ml과 비교하여 1×10⁶세포/ml로 시작된 배양물에서 관찰되는 더 높은 세포 농도는 더 높은 세포 농도에서 영양 이용의 더 낮은 세포 비 속도때문이다. 하이브리도마 세포의 호흡 속도는 증가하는 세포 밀도로 감소되는 것이 보여졌다(Wohlpart et al 1990). 유사하게, 영양의 이용의 세포 비 속도는 또한 증가하는 세포 농도로 감소되는 것이 보여졌다(Portner et al 1994, Yallop and Svendsen 2001). 우리는 이제 배양물에 달성가능한 세포 밀도를 증가시키기 위한 개념을 형성하기 위해 신규하고 독창적인 방법에 이 정보를 사용했다.

배치 배양물에서 매일 주요 영양의 이용의 세포 비 속도를 계산함으로서 그리고 이 값들을 세포 농도에 대해 플랏팅함으로써, 글루타민에 대해 도 2에 도시되는 것과 같이 그래프가 얻어질 수 있다. 도 2는 글루타민 이용의 세포 비 속도 (q_Gln)와 세포 농도 사이에 관계를 보여준다. 이 그래프로부터, 최적 시초 세포 농도가 이용가능한 영양의 최적 이용을 토대로 선택될 수 있다. 예를 들면, 0.3×10⁶세포/ml로 시작하는 배양물은 대략 0.5×10⁶세포/ml에 24시간 안에 도달할 것이다(이 클론의 평균 집단 배가 시간(pdt)은 32h임). 0.5×10⁶세포/ml에 q_Gln값은 대략 2.5μmoles 10⁶세포^-1 24h^-1이다. 이 24시간 안에 소모되는 총 글루타민은 따라서 대략 1.25μmoles ml^-1(0.5×2.5)가 될 것이다. 그러나, 1×10⁶세포/ml로 시작하는 배양물은 24시간안에 대략 1.5×10⁶ ml^-1에 도달할 것이다. 이 세포 농도에서 q_Gln값은 대략 0.75μmoles 10⁶ 세포^-1 24h^-1이다. 소모된 총 글루타민은 따라서 대략 1.125μmoles ml^-1이 될 것이다. 두 배양물은 따라서 첫 24시간 안에 대략 동일한 양의 글루타민을 사용할 것이다.

따라서 세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이고 이 방법은 특정 영양 이용 수준이 최소 플래토(plateau) 수준에 가까운 세포 농도로 배양을 시작하는 것을 포함한다. 이것은 E1-불멸화된 망막 세포, 특히 PER. C6-유래 세포에 대해, 약 0.8~2.0×10⁶세포/ml, 바람직하게는 0.9~1.5×10⁶세포/ml와 동등하다. 따라서 0.8~2.0×10⁶세포/ml, 바람직하게는 0.9~1.5×10⁶세포/ml, 더 바람직하게는 0.95~1.25×10⁶세포/ml의 접종 농도로 세포를 하위배양하는 것이 본 발명의 하나의 구현예이다.

본 발명의 이 양상의 장점은 얻을 수 있는 생육가능한 세포의 수가 이 더 높은 접종 밀도에서 더 높다는 것이고 세포의 더 높은 수는 방법 중에 더 빠르게 도달된다. 본 발명의 이 양상은 따라서 배치 배양물에 대해 매우 유용하지만, 본 발 명의 것들과 같이, 페드-배치 배양물 또는 (페드-) 관류 배양물에 또한 유익하게 사용될 수 있다.

실시예 2: PER. C6 유래되는 서브-클론에서 항체 수율을 개선시키기 위한 피드 전략.

페드-배치 방법은 생육가능한 세포 농도를 증가시킴으로써 또는 소모되는 것들을 보충하기 위해 영양 농축물을 공급함에 의해 생성 기간을 연장함으로서 생성 수율을 증가시키는 것을 목표로 삼는다. 우리는 PER. C6 유래 서브-클론의 항체 수율을 개선시키기 위한 피드 전략을 여기에 제공한다. 피드 전략은 영양 피드 및 더 짧은 전체 생성 방법의 시작시에 더 높은 최종 세포 밀도를 얻기 위해서 더 높은 시작 세포 밀도와 조합될 수 있다.

포도당, 인산염, 글루타민 및 다른 15개의 아미노산으로 구성된 기초 영양 피드 농축물이 쉐이크-플라스크(도 3을 볼 것)에 클론 1의 6개의 복제 배치 배양물의 영양 이용 프로파일을 토대로 준비되었다. 유사한 이용 프로파일이 클론 2에서 관찰되었고, 따라서 클론 1에 대한 하기에 기술된 피드 전략은 또한 다른 클론으로부터의 수율을 개선시킬 것이라고 예상되며, 그것에 의해서 E1-불멸화된 세포, 바람직하게는 망막 세포, 바람직하게는 PER.C6 세포로부터 유래되는 세포의 페드-배치 또는 페드-관류 배양에 대한 더 일반적인 전략을 제공한다. 농축물은 표 1에 기재되어 있다. 대안으로, 칼슘과 세 개의 재조합 성장 인자, LongR3 IGF-1, Long EGF 및 인슐린이 또한 피드에 첨가되었다. 이 점에서, 칼슘과 성장 인자의 첨가는 얻어진 결과에 현저하게 영향을 끼치지 않았다. 글리신은 피드를 위해 필수적인 것 같지 않았고 더 이상 추후 실험에 첨가되지 않았다. 인슐린은 Sigma로부터 구매되었다. LongR3 IGF-1 및 Long EGF는 GroPep로부터 구매되었다. 모든 아미노산은 Sigma로부터 구매되었다. 피드 농축물의 첨가의 시기와 빈도는 변화시켰다. 첫 첨가 시간은 영양 고갈 전 0, 1 그리고 2일에 시험되었다. 포도당과 인산염은 피드의 시작을 위한 지표로써 사용되었다. 예견된 생육가능한 세포 농도를 토대로, 일련의 볼루스(bolus) 첨가가 매 2일 마다 행해졌다. 대개, 6의 피드가 제공되었다. 표 1에 제공된 것과 같이 첨가된 성분들의 농도는 첨가 전에 소모된 배지에 잔여 성분들을 고려하지 않았다(즉, 성분들이 세포에 의해 완전히 소모되기 전에 본 발명에 따른 첨가가 행해지므로, 첨가 전에 배양 배지는 이 성분들의 몇몇을 여전히 함유할 것이기 때문에, 배양 배지로의 첨가 후에 성분들의 농도는 표에 제공된 것보다 더 높을 것이다).

도 4는 PER. C6 발현 재조합 항체의 서브-클론에 농축물 혼합물을 공급하는 효과를 도시한다(클론 1). 3일 째에 피드를 시작하는 것(영양 고갈에 앞서 2일 및 이 후에 매 2일 마다 지속함)은 500mg L^-1 을 주었던 배치 방법의 대략 1.6배의 증가인 대략 800mg L^-1 의 최종 항체 수율을 가져왔다. 5일 째에 피드를 시작하고 이 후 2일마다 지속하는 것은 최종 항체 농도에 유사한 증가의 결과를 가져 왔다.

삼투몰농도(실시예 1)는 피드 배양물에서는, 그것이 증가해서, 결국 300~310 mOsm Kg^-1로 상승하는 반면, 배치 배양물에서는 280에서 240 mOsm Kg^-1로 감소하였다.

실시예 3: 30×10⁶세포/ml를 초과하고, 항체 수율을 500mg L^-1 일^-1 초과하는 생육가능한 세포수의 달성

페드-배치 방법은 락테이트와 암모니아와 같은 독성 대사물의 생성과 배지 삼투몰농도에 증가를 낳을 수 있는데 그것은 종국적으로 생육가능한 세포 농도와 방법의 길이를 제한하고 따라서 생성물 수율에 대해 영향을 끼친다. 페드-배치 방법에 가능한 대안이 관류 방법인데, 높은 세포 농도는 지속적 배지 교환과 세포 취출에 의해 유지될 수 있다(세포 집단의 일정 비율을 제거함). 그런 방법이 가진 가능한 결점은 요구되는 다량의 배지, 자주 맞부닥쳐지는 상대적으로 낮은 세포 생육가능성과 그런 시스템을 운영하기 위한 상대적으로 높은 수준의 복잡성에 기인한 상대적으로 낮은 생성 농도이다. 따라서 매우 높은 생육가능한 세포 농도 및/또는 특이적 생산성이 유지될 수 있다면 관류 방법을 운영하는 것이 단지 유리하다.

우리는 하루에 하나의 배지 부피 교환을 가지는 쉐이크 플라스크 배양물에서 30×10⁶세포/ml를 초과하는 생육가능한 세포 농도와 600mg L^-1 24h^-1을 초과하는 항체 수율의 달성을 여기에 제공한다.

ExCell^TM 525를 가진 쉐이크 플라스크에서 배양된 항체 생성 PER. C6 세포의 대수 배양물이 시작 세포수 1×10⁶세포/ml로 ExCell^TM VPRO를 함유한 쉐이크 플라스크로 옮겨졌다(다른 시작 세포 농도가 유사한 결과를 주었다). 원심분리에 의한 배지 대체(하루 당 하나의 부피)가 3~5일에 시작되었다. 어떤 세포 취출도 운영되지 않았다. 대사 분석, 항체 정량과 세포 계수를 위해 샘플이 매일 취해졌고 -20℃에 저장되었다.

도 5는 50×10⁶ml^-1까지의 생육가능한 세포수와 500~750mg L^-1 24h^-1의 항체 수율이 세포 취출 없이 두 독립적인 항체 생성 세포 클론에 대해 5일 이상 동안 유지되었다. 세포의 생육가능성은 약 80~90%였다. 이러한 높은 세포 밀도는 CHO 와 Sp2/0과 같은 다른 세포주로 일반적으로 달성할 수 있는 것보다 대략 3배 더 높고, 따라서 PER. C6 세포와 같은 아데노바이러스 E1 서열로 불멸화된 망막 세포는 관류 방법에 매우 적절하다. 세포 취출은 방법의 길이를 개선시킬 것이고, 그러므로 최적화된 시스템이 하나 이상의 세포 취출 단계를 포함할 수 있다.

약 80~90%의 생육가능성을 가지고서, ml 당 50×10⁶까지의 세포가 매 2일 마다 하나의 완전한 배지 교환으로 5일 이상 동안 유지될 수 있다. 이 전략으로, 많은 영양분이 2일째에 고갈되었다. 그러므로 바람직하게는 배지는 매일 교환된다. 관류 방법에서, 이것은 약 1~3 부피/일의 교환으로 해석될 수 있다. 이것은 표준 관류 시스템에서 배지가 0.5~2 부피/일로 교환되는 전형적인 영역 가까이에 있는 것이다. 본 발명에 따른 세포에 대한 다소 더 높은 값은 관류 시스템에 본 발명의 세포를 가진 매우 높은 세포 농도에 기인한다. 본 발명에 따른 30×10⁶세포/ml 이상의 세포 농도가 바람직할 때는, 배지 교환은 0.5 배양물 부피/일 이상, 바람직하게는 1 배양물 부피/일 이상이어야 한다. 충분한 농도에 영양(여기서 배양 배지를 경유함)공급에 실패는 세포 사멸을 이끈다. 날마다의 배지 교환은 더 높은 생육가능 한 세포 밀도가 된다(날마다의 배지 교환이 있는 50×10⁶세포/ml까지 대비(vs) 날마다의 배지 교환이 없는 10×10⁶세포/ml, 도 1과 4를 볼 것). 더욱이, 날마다의 배지 교환으로, 세포는 8~13일의 배치 방법에서 달성된 것과 유사한 생성물 수율을 하루에 제공한다.

실시예 4: PER. C6 유도 서브-클론에서 항체 수율을 더 개선시키기 위한 피드 전략.

균형잡힌 영양 피드의 제공에는 비타민, 미량 원소 및 지질과 같은 성분들까지 확대된다. ExCell VPRO 비타민, 무기염, 미량 원소, 성장 인자, 지질과 식물 가수분해물의 농축물(10x 또는 50x, 둘 다 운영됨)이 JRH Biosciences로부터 얻어졌고 실시예 2에 기술된 기초 피드 농축물(칼슘과 성장 인자를 뺌)과 함께 첨가되었다. ExCell VPRO 농축물은 0.25×의 최종 농도를 부여하도록 첨가되었다.

도 6은 배치 조절에 대비하여 쉐이크 플라스크에 클론 1의 성장(도 6A)과 항체 수율(도 6B)에 대한 이 변경된 피드의 결과를 도시한다. 결과는 3일째에 피드를 시작함으로써 얻어졌다(영양 고갈 48시간 전). 5일째에 피드를 시작하는 것(영양 고갈일)은 유사한 결과를 부여했다. 생육가능한 세포수가 배치 조절보다 상당히 더 오랫 동안 유지되었고 항체 수율은 배치에서의 0.5g L^-1로부터 페드-배치 방법에서 1.0g L^-1로 2배 증가했다.

이 피드 실험의 소모된 배지 분석은 아미노산의 일부의 이용의 세포 비 속도 에 변화를 확인했는데, VPRO 농축물의 첨가로부터인 것 같았다. 그러므로 실시예 2에 기재된 아미노산 농축물은 표 2에 보여지듯이 변경되었다. 피드는 영양 고갈 48시간 전에 시작되었고 첨가는 매 2일 마다 행해졌다. 보통, 6회의 피드가 제공되었다. 다시, 표에 나타난 것과 같이 첨가된 성분들의 농도는 첨가 전에 소모된 배지에 잔여 성분들을 고려하지 않는다.

첫 번째 피드 첨가를 위해, 글루타민과 세린의 증가된 농도가 차후의 피드와 비교하여 사용되었다(표 2를 볼 것). 인산염과 포도당은 피드의 시작을 결정하기 위한 마커로써 사용되었다. 클론 1과 2는 이 실험에서 사용되었다.

실험은 쉐이크-플라스크와 생물반응장치에서 실시되었다. 쉐이크 플라스크 실험은 기술된 것과 같이 실시되었다. 생물반응장치 실험은 3L 생물반응장치(Applikon, 2L 작동 부피)에 쉐이크 플라스크에서 성장한 대수 전-배양물로부터의 세포를 접종함으로써 시작되었다. 전-배양물과 생물반응장치 실험은 ExCell VPRO(JRH Biosciences)에서 수행되었다. 생물반응장치로의 접종을 위한 분할비는 1:6 이상이었고, 접종 세포 농도는 약 0.3×10⁶세포/ml이었다.

결과

도 7은 배치 조절에 대비하여 생물반응장치에 클론 1에 대해 변경된 피드의 결과를 도시한다. 최대 생육가능한 세포수는 10~12×10⁶세포/ml에 달했고 생육가능한 세포수는 19일째 배양의 최종시까지 8 내지 10×10⁶세포/ml로 유지되었다(도 7A). 항체 수율은 배치에서의 0.4g L^-1로부터 페드-배치 방법에서의 1.3g L^-1로 3배 증가했다(도 7B).

삼투몰농도와 암모니아는 이 피드 배양물에서 배양물 성능과 생성물 품질에 대해 부정적 효과를 가지게 하는 것으로써 보고된 수준인, 각각 430mOsm Kg^-1과 16mmoles L^-1에 달했다. 따라서 그것은 방법의 종료를 향해서 관찰된 생육가능한 세포수에 감소가 적어도 부분적으로는 이런 요인에 기인했다는 것일 수 있다.

도 8은 2L 생물반응장치에서 클론 2에 대한 피드 전략의 결과를 도시한다. 10~11×10⁶ml^-1과 7~9×10⁶ml^-1에 도달된 최대 생육가능한 세포수는 19일째 배양 종료시까지 유지되었다. 항체 수율은 0.5g L^-1에서 1.5gL^-1로 3배 증가되었다.

세 번째 클론을 표현하는 또 다른, 다시 관련되지 않은, 항체는 동일 배치 방법 및 동일한 피드 전략을 가진 페드-배치 방법을 겪게했다. 도 10은 쉐이크 플라스크에서 이 클론 3에 대한 피드 전략의 결과를 도시한다. 14×10⁶ml^-1 및 10~12×10⁶ml^-1에 도달된 최대 생육가능한 세포수가 17일째 배양 종료시까지 유지되었다. 항체 수율은 0.7g L^-1로부터 2.1g L^-1로 3배 증가되었다.

그러므로 피드 전략은 각각이 상이한 항체를 발현하는 상이한 클론에 대한 수율을 개선시키는데, 이것은 본 발명에 따른 방법을 일반적으로 적용할 수 있다는 것을 나타낸다.

그러므로 본 발명에 따른 피드 전략을 포함하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 양상인데, 여기서 생성되는 단백질의 수율은 배치 방법에서의 수율에 대해 1.5배, 바람직하게는 2배, 더 바람직하게는 2.5배, 훨씬 더 바람직하게는 3배 증가된다.

본 발명에서 사용되는 세포의 비 생산성(specific productivity)(q_Ab)은 대략 12~18 pg 항체/세포/일 사이에 있었다. 몇몇 예에서 q_Ab는 약 10pg 항체/세포/일이었고, 다른 예에서는 약 25pg 항체/세포/일까지의 값이 본 발명의 세포와 방법으로 관찰되었다. 배치 배양물에서 이것은 대략 7일 후인 영양의 고갈과 동시에 일어나는, 최대 세포수에 도달하기 전에 상당히 감소했다. 반면에 페드-배치 배양물에서 이 비 생산성은 본 발명의 방법에 따라, 약 16~18일째의 양인 최종 피드 첨가 후 2~3일까지 이 수준으로 유지되었다.

생성물 품질

상기에 기술된 실험에서, 생성물 품질은 등전집중(iso-eletric focusing), SDS-PAGE, MALDI-TOF 질량 분광 분석 및 HPAEC-PAD를 포함한 다양한 방법에 의해 검사되었다. 모든 경우에서 생성된 항체는 기본적으로 인간-형 글리코실화를 보여주였고 사용된 방법에 상관 없이, 생성된 항체의 구조적 통합성이 매우 우수했고, 세포수 및 생성 수율 모두가 더 낮았던 (Jones et al, 2003)에 보고된 것과 매우 유사했다. 그러므로, 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 증가된 수율은 생성물 품질에서 상당한 감소라는 대가로 얻어진 것이 아니었다.

배치와 페드-배치 배양물으로부터 생성되는 단백질 A 정제 IgG가 MALDI-MS에 의해 분석되었다. 배치 배양물로부터 PER. C6 세포에 의해 생성된 물질은 인간 혈청으로부터 정제된 IgG에 의해 보여지는 것과 유사한 갈락토오스화(galactosylation) 프로파일을 보여주었고 무잡종(no hybrid) 또는 고 만노오스 구조가 배치나 페드-배치에서 생성된 물질에서 확인되었다. 시험된 모든 배치 배양물에서 나오는 0, 1 및 2 갈락토오스 잔류물(G0:G1:G2)에 말단인 글리칸의 평균 백분율은 각각 29, 54 및 17%였다. 이것은 CHO 및 하이브리도마 생성 항체에 비교될 수 있는데, 그것은 G0 형태로 자주 우세하게 있다. 예를 들면, Hills et al(1999)은 NS0와 CHO 세포에서 생성된 항체에 대한 갈락토오스화 프로파일(G0:G1:G2)을 보고했다.

페드-배치 방법에서 생성된 항체는 배치와 비교하여 감소된 수준의 갈락토오스화를 보여주었다(도 9). G1과 G2 글리코폼(glycoform)이 54%와 17%에서 42%와 9%로 각각 감소하는 동안에, G0 글리콜폼의 백분율은 29에서 49%로 증가했다. 갈락토오스화에서 이 감소는 페드-배치 배양물의 종료시에 높은(16mM까지) 암모니아 농도로부터 아마도 기인했다. 그러나, PER. C6 세포에 페드-배치 방법에 의해 생성된 항체에서 갈락토오스화의 수준은 예를 들어서 (Hills et al 1999), CHO의 배치-생성된 항체에서 전형적으로 보여진 것보다 훨씬 더 높았다. 등전집중(IEF)과 SDS-PAGE는 배치나 페드-배치 배양물(데이터는 도시하지 않음)에 의해 생성된 물질간에 상당한 차이를 나타내지 않았고 모든 경우에, 응집은 3% 미만이었다.

상대적으로 낮은 Y_amm/gln값에도 불구하고, 높은 생육가능한 세포 농도는, 암모니아가 16mmoles L^-1까지 축적된 피드에 글루타민을 공급하게 했다. 이것은 생육가능한 세포 농도에 저하가 일어나게 하지는 않았지만, NH₄Cl의 존재에서 시작되는 배치 배양물은 9mmoles L^-1을 초과하는 농도는 성장 속도와 최대 세포 농도에 부정적 영향을 끼친다는 것을 보여주었다. 더욱이, 글리코실화 또한 약간 영향을 받았다(도 9를 볼 것). 그러므로 예를 들면 하기에 설명된 방법에 따라, 암모니아 축적을 감소시키는 것이 유익할 수 있다.

지금까지 설명된 방법에서 주목해야하는 두 영역이 암모니아와 삼투몰농도의 높은 수준이다. 삼투몰농도에 증가에 큰 기여자는 VPRO(배지) 농축물에서 왔다. 이 삼투몰농도를 감소시키기 위한 접근은 따라서 배지 성분들 군(비타민, 미량 원소, 무기염, 성장 인자 등) 중 어떤 것이 배양물 능력(performance)에 중요한지를 확인하고 중요하지 않은 것들을 제거하는 것이다. 이것은 피드의 삼투몰농도를 감소시킴으로써뿐만 아니라 어떤 잠재적으로 유해한 성분들을 제거하고 가장 중요한 성분들의 첨가의 최적화를 허용함으로써 그 방법에 이로워야 한다. 그것은 또한 피드의 비용을 감소시킬 것이다. 암모니아 축적에서 감소는 글루타민 첨가를 더 엄격하게 조절함으로써 달성될 수 있다. 이것은 상기에 설명되었듯이 특정한 소모와 세포수의 계산을 기초로 행해질 수 있다. 이것은 적절한 속도로 글루타민에 계속적으로 펌핑함으로써 달성될 수 있는데, 생육가능한 세포 농도와 세포 이용 비 속도에 부 합되어서 배지에 잔류 글루타민 농도가 0.2~1.5mM 사이, 바람직하게는 0.5와 1.0mM 사이와 같이 일정한 낮은 수준으로 유지된다. 본 발명에 따른 세포에 대해 가능할 수 있는 또 다른 접근법은, 세포가 암모니아 및 글루타메이트 및 글루타민 합성효소 경로를 사용하여 글루타민 합성을 바꾸도록 암모니아 농도가 어떤 점에 도달할 때 -예를 들면 첫 번째 피드에 이은 하나 이상의 피드- 피드로부터의 글루타민의 제거이다. 이 접근법은, 글루타민 고갈이 종종 급속하고 폭넓은 세포 사멸을 가져오고 무-글루타민 조건으로의 전환은 자주 적응 기간을 필요로 하기 때문에, 일반적으로 BHK와 CHO와 같은 세포 유형에 대해 가능하지 않다. 그러나, 본 발명에 따른 세포의 배치 배양물에서, 생육가능한 세포 농도는 글루타민의 고갈 후에 2일 동안 계속해서 증가했고 배양 생육가능성이 그다지 영향받지 않았는데, 이것은 적어도 배양물을 유지하기 위해서 글루타민 합성효소 경로를 통한 충분한 유량(flux)이 있을 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 가장 최적화된 페드-배치 배양물(도 7, 8에 실시예)의 소모된 배지 분석은 시스틴만이 방법 중에 고갈되었다는 것을 보여주었다. 본 발명에 따른 아미노산 피드의 추가 변경은 그러므로 예를 들면 모든 10×10⁶세포/ml에 대해 0.3~0.35mmole/l 또는 심지어 0.6mmoles/l 까지의 시스틴 농도의 증가이다.

실시예 5: 개선된 (페드-)배치 방법.

페드-배치 방법을 위해 개발된 피드 농축물이 개선된 배치 방법에서의 사용을 위한 배양물 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있다. 페드-배치 방법으로부터 하 나 이상의 피드 첨가를 가지는 배양물 배지를 보충하는 것이 배치 수율을 개선시키기 위해서 다른 것들에 의해 보여졌다. 피드 농축물로 배양물 배지를 보충하는 유사 접근법은 페드-배치 방법 중에 피드 첨가물의 수를 감소시키는데 또한 사용될 수 있는데, 또한 다른 것에 의해 보여지듯이, 그것에 의해서 방법을 단순화시킬 수 있다.

본 발명은 PER. C6 세포와 같은, 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 세포에 대한 피드 전략을 개시한다. 페드-배치 방법에서 어떤 성분들이 제한되는지가 여기 나타난다. 페드-배치 방법에 수율을 개선시키기 위해 첨가될 수 있는 성분들 사이에 속도 뿐만 아니라 양이 여기 개시된다. 이 정보는 개선된 배치 방법을 제공하기 위해 이 실시예에서 사용된다. 그러한 배양물은 약 10×10⁶세포/ml를 함유할 것이라고 가정되는데, 이것이 배치와 본 발명의 페드-배치 배양물에서 관찰되는 세포수 근처이기 때문이다. 페드-배치 실험에서, 표 1 또는 2에서와 같은 성분들의 농도로, 6회의 피드가 첨가되었다. 영양이 배양 중 후반에 고갈될 것이기 때문에, 전체 (예를 들면 모든 6회의 피드 전체) 피드의 10%~60%, 바람직하게는 전체 피드의 20%~40%의 첨가가 개선된 배치 방법을 초래하고, 따라서 배양 배지에 어떠한 첨가도 하지 않은, 상기에 개시된 직선 배치 방법과 비교되는 연장된 생산성 때문에 수율이 상승할 것이다. 성분들은 배지로부터 영양의 고갈에 앞선 단계에 배양 배지에 직접 첨가될 수 있지만, 바람직하게는 방법 중에(개선된 배치 방법) 다른 첨가가 행해지지 않도록 배양 시작에 앞서 첨가되는데, 그것이 그 방법을 매우 단순하게 만든다. 물론, 이는 방법(페드-배치 방법) 중 후반에 특정 성분들의 추가적 첨가와 조합될 수 있는데, 이 경우에 상기에 개시된 페드-배치 방법에서보다 방법을 위해 더 적은 첨가가 행해져야만하고, 그럼으로써 더 단순한 페드-배치 방법을 제공한다. 그러므로 아데노바이러스 E1 서열에 의해 불멸화된 세포에 생성물을 생성하기 위한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 구현예인데, 여기서 상기 세포는 하기와 같은 성분들이 다음과 같은 양으로 배양 배지에 첨가된 것을 특징으로 하는 배양 배지에서 배양된다: 포도당(3.6~21.6mmoles/l, 바람직하게는 7.2~14.4mmoles/l), 글루타민(6.8~40.9mmoles/l, 바람직하게는 13.6~27.2mmoles/l), 로이신(0.40~2.4mmoles/l, 바람직하게는 0.79~1.6mmoles/l), 세린(2.31~13.9mmoles/l, 바람직하게는 4.62~9.24mmoles/l), 이소로이신(0.3~1.8mmoles/l, 바람직하게는 0.6~1.2mmoles/l), 아르기닌(0.28~1.66mmoles/l, 바람직하게는 0.55~1.10mmoles/l), 메티오닌(0.14~0.83mmoles/l, 바람직하게는 0.28~0.55mmoles/l), 시스틴(0.15~0.9mmoles/l, 바람직하게는 0.3~0.6mmoles/l), 발린(0.27~1.62mmoles/l, 바람직하게는 0.54~1.08mmoles/l), 라이신(0.26~1.58mmoles/l, 바람직하게는 0.53~1.06mmoles/l), 트레오닌(0.18~1.08mmoles/l, 바람직하게는 0.36~0.72mmoles/l), 아스파라긴(0.06~0.36mmoles/l, 바람직하게는 0.12~0.24mmoles/l), 티로신(0.078~0.47mmoles/l, 바람직하게는 0.16~0.31mmoles/l), 히스티딘(0.06~0.36mmoles/l, 바람직하게는 0.12~0.24mmoles/l), 페닐알라닌(0.012~0.072mmoles/l, 바람직하게는 0.024~0.048mmoles/l), 트립토판(0.036~0.22mmoles/l, 바람직하게는 0.072~0.14mmoles/l) 및 인산염(0.45~2.7mmoles/l, 바람직하게는 0.9~1.8mmoles/l). 괄호의 양은 표 2의 피드의 6x에 해당하는 양의 10%~60%, 바람직하게는 20%~40%이다. 바람직하게는, 또한 배양 배지 농축물(10x, 50x, 또는 다른 적절한 농축물이 사용될 수 있음)이 0.15x~0.9x 사이, 바람직하게는 0.3x~0.6x의 최종 농도로 첨가된다. 바람직하게는 이 구현예에서 배양 배지는 ExCell VPRO 배지이다. 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 또는 4의 단일 피드(표 1 이나 2에 개시된 것과 동일한 양인 단일 피드)의 양이 이 배양 배지에 첨가되고, 성분들 첨가의 최적량을 결정할 수 있도록, 약 10×10⁶세포/ml로 세포를 배양하기 위한 단순한 배치 방법과 본 발명에 따른 생성한 생성물(예를 들면 항체)은 강화된 배지로 수행된다. 본 발명에 따른 페드-배치 방법의 전체 피드의 약 20%~40%가 즉 1~2.5의 단일 피드 사이 어떤 것인 배양 전에 배양 배지로 제공될 때 최고의 생성 수율을 부여하는 개선된 배치 방법이 기대된다. 물론, 첨가된 성분들의 이로운 영역이 이 실험에 의해 확립되면 양의 더 우수한-조정이 가능하다. 물론, 세포수가 다를 때, 성분들 첨가는 다시 적응될 수 있다. 예를 들면, 세포는 단지 5×10⁶세포/ml의 밀도로 배양되면, 당업자에게 명백하듯이, 상기 양의 단지 절반의 양의 첨가만이 필요로 될 것이다.

표 1

표 2

참조

Claims (41)

1. PER.C6 세포에서 유래된 세포의, 생성물 수율을 증가시키기 위한, 배양 방법으로, 상기 세포는 현탁액에서 성장할 수 있고, 상기 방법은

   a) 세포 배양 중에 포도당, 글루타민, 인산염, 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌, 시스틴, 발린, 라이신, 트레오닌 및 글리신으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지 성분들의 농도를 한 번 이상 측정하는 단계,

   b) 단계 a)에서 농도가 측정된 하나 이상의 성분들의 고갈시에 또는 그보다 앞서, 세포 배양 중에 상기 배지에 성분들을 첨가하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 첨가되는 성분들은 적어도 포도당, 글루타민, 인산염, 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌 및 시스틴을 포함하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 단계 a)에서 농도가 측정된 하나 이상의 배지 성분은 포도당, 글루타민, 인산염, 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌 및 시스틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 a)에서 농도는 2 이상의 상기 배지 성분들의 농도가 측정되는 방법.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 b)에서 첨가된 성분들은 추가로 발린, 라이신, 트레오닌, 글리신, 아스파라긴, 티로신, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 인산염, 칼슘, LongR3 IGF-1 (인슐린-유사 성장 인자-1; Insulin-like Growth Factor-1), Long EGF (상피 성장인자; Epidermal Growth Factor) 및 인슐린 중의 하나 이상을 포함하는 방법.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 b)에 상기 성분들은 포도당에 대해서 4.0 내지 8.0, 로이신에 대해 0.44 내지 0.88, 세린에 대해 0.37 내지 1.47, 이소로이신에 대해 0.33 내지 0.67, 아르기닌에 대해 0.31 내지 0.61, 메티오닌에 대해 0.15 내지 0.31, 그리고 시스틴에 대해 0.1 내지 0.6의 10×10⁶ 세포/ml 당 새롭게 첨가되는 성분들의 mmoles/l의 최종 농도로 첨가되는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 단계 b)에서 글루타민이 추가로 10×10⁶세포/ml 당 새롭게 첨가되는 글루타민의 1.17 내지 3.47mmoles/l의 최종 농도로 첨가되는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 단계 b)에서 상기 성분들은 한 번 이상 첨가되고, 추가로 첫 번째 첨가의 결과로서 새롭게 첨가되는 글루타민의 최종 농도가 그 후의 첨가의 결과보다 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 5항에 있어서, 글루타민이 배지에 글루타민 잔류 농도가 0.2~1.5 mM로 유지되도록 지속적이고 필수적으로 추가로 첨가되는 방법.
9. 제 5항에 있어서, 단계 b)에서 발린에 대해 0.3~0.6, 라이신에 대해 0.29~0.59, 트레오닌에 대해 0.2~0.4의 10×10⁶세포/ml 당 새롭게 첨가되는 성분들의 mmoles/l의 최종 농도로 상기 성분들이 추가로 첨가되는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 단계 b)에서 아스파라긴에 대해 0.067~0.13, 티로신에 대해 0.087~0.17, 히스티딘에 대해 0.067~0.13, 페닐알라닌에 대해 0.013~0.027, 그리고 트립토판에 대해 0.04~0.08의 10×10⁶세포/ml 당 새롭게 첨가되는 성분들의 mmoles/l의 최종 농도로 상기 성분들이 추가로 첨가되는 방법.
11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 b)에서 상기 성분들의 첨가는 이전 단계에서 농도가 측정된 하나 이상의 배지 성분들의 고갈 전 48시간과 고갈 직전 사이에 수행되는 방법.
12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단계들이 한 번 이상 반복되는 방법.
13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포는 망막 세포로부터 유래되는 방법.
14. 삭제
15. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포는 ml 당 9×10⁶의 세포 밀도로 성장되는 방법.
16. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포는 수확되는 생성물을 생성하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 생성물은 재조합 단백질인 방법.
18. 제 17항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 리터 당 500mg 이상의 수준으로 배양 배지로 분비되는 이뮤노글로블린인 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 리터 당 1000mg 이상의 수준으로 배양 배지로 분비되는 이뮤노글로블린인 방법.
20. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포는 배양 중에 현탁액에 있는 방법.
21. PER.C6 세포에서 유래된 세포에서 생성물을 생성하기 위한 방법으로, 상기 세포는 배양 배지에 존재하고, 상기 생성물은 재조합 단백질, 바이러스, 및 E1-영역에 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스로 구성된 군으로부터 선택되고, 배양 배지는 적어도 글루타민, 포도당, 인산염, 로이신, 세린, 이소로이신, 아르기닌, 메티오닌, 및 시스틴의 배양 배지로의 첨가에 의해 보충되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 21항에 있어서, 상기 세포는 과정 중 최소한 시간 일부에서 20×10⁶ 생육가능 세포/ml 이상의 세포 농도에 도달하는 방법.
23. PER.C6 세포에서 유래된 세포에서 생성물을 생성하기 위한 방법으로, 상기 세포는 배양 배지에서 배양되고, 배양 배지가 3.6~21.6mmoles 포도당, 6.8~40.9mmoles 글루타민, 0.40~2.4mmoles 로이신, 2.31~13.9mmoles 세린, 0.3~1.8mmoles 이소로이신, 0.28~1.66mmoles 아르기닌, 0.14~0.83mmoles 메티오닌, 0.15~0.9mmoles 시스틴, 0.27~1.62mmoles 발린, 0.26~1.58mmoles 라이신, 0.18~1.08mmoles 트레오닌, 0.06~0.36mmoles 아스파라긴, 0.078~0.47mmoles 티로신, 0.06~0.36mmoles 히스티딘, 0.012~0.072mmoles 페닐알라닌, 0.036~0.22mmoles 트립토판, 및 0.45~2.7mmoles 인산염의 성분들을 리터 당 배양 배지에 첨가함으로서 보충되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 23항에 있어서, 리터 당 배양 배지에 첨가되는 상기 성분들의 양은 7.2~14.4mmoles 포도당, 13.6~27.2mmoles 글루타민, 0.79~1.6mmoles 로이신, 4.62~9.24mmoles 세린, 0.6~1.2mmoles 이소로이신, 0.55~1.10mmoles 아르기닌, 0.28~0.55mmoles 메티오닌, 0.3~0.6mmoles 시스틴, 0.54~1.08mmoles 발린, 0.53~1.06mmoles 라이신, 0.36~0.72mmoles 트레오닌, 0.12~0.24mmoles 아스파라긴, 0.16~0.31mmoles 티로신, 0.12~0.24mmoles 히스티딘, 0.024~0.048mmoles 페닐알라닌, 0.072~0.14mmoles 트립토판 및 0.9~1.8mmoles 인산염인 방법.
25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 성분들의 추가 배양 배지 농축물이 0.15×~0.9×의 최종 농도로 첨가되는 방법.
26. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 성분들이 세포를 배양하기 전에 배양 배지로 첨가되는 방법.
27. PER.C6 세포에서 유래된 세포의 배양물로, 상기 배양물은 제1항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 10×10⁶세포/ml 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
28. 제 27항에 있어서, 상기 배양물은 12×10⁶세포/ml 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
29. 제 28항에 있어서, 상기 배양물은 15×10⁶세포/ml 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
30. 제 29항에 있어서, 상기 배양물은 20×10⁶세포/ml 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
31. 제 30항에 있어서, 상기 배양물은 30×10⁶세포/ml 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
32. 제 31항에 있어서, 상기 배양물은 40×10⁶세포/ml 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
33. 제 27항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 80% 이상이 생육가능한 세포 배양물.
34. 제 27항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지는 0.2~3 배양물 부피/일의 속도로 교환되는 세포 배양물.
35. 제 27항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 중의 세포는 재조합 단백질을 발현하는 세포 배양물.
36. 제 35항에 있어서, 상기 세포는 10pg 단백질/세포/일 이상을 생성하는 세포 배양물.
37. 제 27항에 있어서, 상기 배양물은 배치 배양물이고 상기 배양물 중의 세포는 500mg/l 이상의 수율을 가지는 재조합 이뮤노글로블린을 발현하는 세포 배양물.
38. 제 37항에 있어서, 상기 수율은 700mg/l 이상인 세포 배양물.
39. 제 35항에 있어서, 상기 배양물은 관류 또는 페드-관류(fed-perfusion) 배양물이고 상기 재조합 단백질은 150mg/l/일 이상의 수율로 발현되는 이뮤노글로블린인 세포 배양물.
40. 삭제
41. 제 27항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물은 현탁액 배양물인 세포 배양물.

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