KR101174452B1 - Biomarkers Indicative of Colon Cancer and Metastasis and Diagnosis and Screening Therapeutics Using the Same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR 및 FCN3으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후 분석용 키트, 그리고 상술한 마커들을 이용하여 대장암 또는 대장암 전이의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 동일 대장암 환자로부터 채취한 정상 대장조직, 대장암 조직 및 전이 조직을 이용하여 발굴된 것으로서, 대장암 및/또는 대장암 전이에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커들이다. 본 발명의 마커를 이용하면 대장암 또는 전이를 정확하게 진단 및 예후를 할 수 있다.The present invention is FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5ARFCO, SLC3A9 And a cancer or aptamer specifically binding to at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of FCN3, a sequence complementary to the nucleotide sequence, a fragment of the nucleotide, or a protein encoded in the nucleotide sequence. Or a kit for diagnosing or prognosticting colon cancer metastasis, and a method for screening a substance for preventing or treating colorectal cancer or colorectal cancer metastasis using the aforementioned markers. These markers were excavated using normal colon tissue, colon cancer tissue and metastatic tissue taken from the same colorectal cancer patient of the present invention, and have significantly improved accuracy and reliability as markers for colorectal cancer and / or colorectal cancer metastasis. Using the marker of the present invention, it is possible to accurately diagnose and prognose colon cancer or metastasis.

대장암, 전이, 마커, 진단, 치료 Colorectal Cancer, Metastasis, Marker, Diagnosis, Treatment

Description

대장암 및 전이에 대한 바이오마커, 이를 이용한 대장암 진단 및 치료제 스크리닝{Biomarkers Indicative of Colon Cancer and Metastasis and Diagnosis and Screening Therapeutics Using the Same}Biomarkers Indicative of Colon Cancer and Metastasis and Diagnosis and Screening Therapeutics Using the Same}

본 발명은 대장암 및/또는 전이에 특이적인 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to biomarkers specific for colorectal cancer and / or metastasis and uses thereof.

대장은 소화, 흡수되고 잉여의 음식물이 머무르는 곳이며, 이곳에서 수분을 흡수하여 대변으로 만드는 곳임과 동시 여러 종류의 많은 세균이 서식하는 곳이지도 하다. 대장의 길이는 약 2m 정도이고, 결장, 직장 및 항문으로 구성되어 있다. 대장점막이 있는 곳이면 어디서나 암이 생기지만, 암이 생기기 쉬운 부위는 에스결장과 직장이라고 한다.The large intestine is a place where digestion, absorption and excess food stay, and it is the place where water is absorbed and made into feces, and at the same time it is a place where many kinds of bacteria live. The large intestine is about 2m long and consists of the colon, rectum and anus. Wherever there is a colon mucosa, cancer occurs, but cancer is likely to occur in the colon and rectum.

현재 우리나라에서 대장암 발생율은 매우 현저하게 증가하고 있다. 대장암에 의한 사망은, 남성의 경우 위암, 폐암 및 간암에 이어 네 번째를 차지하고 있으며, 여성의 경우 또한 유사하다. 대장암 빈도는 남성이 여성보다 많은 것으로 조 사되었다. 연령별로는 50대가 가장 많고, 60대가 그 뒤를 잇고 있다. 우리나라는 유럽이나 미국과 비교했을 때, 발생 연령이 10살 정도 어린 경향이 있다. 5-10%의 빈도로 30대의 젊은 사람에게서도 발생하며, 이처럼 젊은 층에서 나타나는 대장암은 가족 사이에서 많이 발생하는 경향이 있기도 하다.The incidence of colorectal cancer in Korea is increasing significantly. Death from colorectal cancer is fourth in men after gastric, lung and liver cancer, and similar in women. Colorectal cancer was found to be higher in males than in females. By age, the 50s are the most followed by the 60s. Korea has a tendency to be younger than 10 years of age when compared with Europe or the United States. It occurs in young people in their 30s with a frequency of 5-10%, and colon cancers in these younger groups tend to be more common among families.

대장암의 발생에 영향을 미치는 것으로는 유전인자보다도 환경인자의 비중이 크다고 여겨지고 있는데, 식생활의 급격한 서구화, 특히 동물성지방이나 단백질의 과다섭취가 원인이라고 인식되고 있다. 그러나 5% 전후의 대장암은 유전적 소인에 의해 발생한다고 알려져 있다.It is thought that environmental factors are more important than genetic factors in inducing colon cancer, and it is recognized that the rapid westernization of diet, in particular, excessive intake of animal fat or protein. However, about 5% of colon cancer is known to be caused by genetic predisposition.

대장암에 걸리기 쉬운 위험인자로서는, a) 대장용종에 걸린 경험이 있는 경우; b) 가족력이 있는 경우; c) 장기간 궤양성대장염에 시달리고 있는 경우; 및 4) 고치기 어려운 치루에 걸린 경우를 포함한다. Risk factors susceptible to colorectal cancer include: a) history of colorectal polyps; b) have a family history; c) have long-term ulcerative colitis; And 4) cases of difficult to repair.

대장암에는 Dukes분류법과 UICC의 stage 분류법이 대표적이다. 그 기준은 암의 크기에 의해서가 아니라, 대장벽 속으로 암이 들어간 깊이 정도 및 원격전이의 유무에 따라 진행도가 규정되어 있다(각 병기별 수술 후 5년 생존율을 괄호 속에 기재함).Dukes classification and UICC stage classification are representative of colorectal cancer. The criteria are defined not by the size of the cancer, but by the depth of cancer in the large intestine and the presence or absence of distant metastasis (indicated in parentheses is the five-year survival rate after each stage of surgery).

[Dukes분류] [Dukes Classification]

ㆍDukes A (90% 이상): 암이 대장벽 내에 머물러 있는 것Dukes A (90% or more): cancer stays in the large intestine

ㆍDukes B (60-80%): 암이 대장벽을 뚫었지만 림프절전이가 일어나지 않은 것Dukes B (60-80%): Cancer has penetrated the large intestine but no lymph node metastasis

ㆍDukes C (20-50%) : 림프절전이가 일어난 것Dukes C (20-50%): Lymph node metastasis

ㆍDukes D (20% 이하) : 복막, 간, 폐 등으로 원격전이가 일어난 것 ㆍ Dukes D (less than 20%): Remote metastasis to the peritoneum, liver, lung, etc.

[stage분류] [stage classification]

ㆍ0기 : 암이 점막에 머물러 있는 것ㆍ 0th stage: cancer stays in mucous membrane

ㆍ1기 : 암이 대장벽에 머물러 있는 것ㆍ 1st stage: cancer stays on the large wall

ㆍ2기 : 암이 대장벽을 넘어섰지만 인접장기까지 미치지 않은 것ㆍ 2nd stage: cancer has crossed the large intestine but not in the adjacent organ

ㆍ3기 : 암이 인접장기에 침윤하거나 림프절전이가 일어난 것ㆍ 3rd stage: cancer invades adjacent organs or lymph metastasis occurs

ㆍ4기 : 복막, 간, 폐 등으로 원격전이가 일어난 것 ㆍ 4th stage: Remote metastasis to peritoneum, liver, lung

상기 두 가지의 분류 방식에는 아주 작은 차이가 있을 뿐이기 때문에, Dukes A는 0기, 1기에, Dukes B는 2기에, Dukes C는 3기에, Dukes D는 4기에 해당하는 것이라고 현재 통용되고 있으며, 특히 Dukes 분류는 국제적으로 널리 쓰이고 있는 방법이다.Since there are only minor differences between the two classification schemes, Dukes A is currently in the 0th and 1st stage, Dukes B is the 2nd, Dukes C is the 3rd, and Dukes D is the 4th. In particular, the Dukes classification is a widely used method internationally.

대장암은 이른 시기에 발견되면 내시경 적절제나 외과요법에 의해 완전히 치유될 수 있다. 약간 진행되어 간이나 폐로 전이(원격전이)했다고 하더라도 수술이 가능한 시기라면 외과요법에 의한 완치를 기대할 수 있다. 다시 말해 현재의 치료법으로는 외과요법이 가장 효과적이라 하겠다. 그러나 발견이 늦어지면 폐, 간, 림프절이나 복막 등 절제하기 어려운 곳으로의 전이가 일어나기 때문에 조기 진단과 치료는 필수적이라 하겠다.Colon cancer can be completely cured by endoscopy or surgery if it is found early. Even with a slight progression to metastases to the liver or lungs (remote metastasis), surgery can be expected if the surgery is possible. In other words, the current treatment is the most effective surgical therapy. However, the late detection may cause metastasis to difficult places such as lungs, liver, lymph nodes or peritoneum, so early diagnosis and treatment are essential.

종종 수술을 받은 후에 재발하는 경우가 있는데, 수술 후에는 정기적으로 (3-4개월 간격) 재발유무를 점검하기 위한 검사를 받아야 한다. 간, 폐 및 복막 이 재발하기 쉬운 장기이며, 또 절제한 부위에서 국소적으로 재발하기도 한다. 대장암은 다른 암과는 달리 빠른 시기에 재발이 발견되면, 다시 재발한 병소를 절제하여 완전히 치료할 수도 있다. 재발의 80% 이상은 수술 후 3년 이내에 발견되므로, 수술 후 5년 이내에 재발하지 않는 것이 완치의 기준이 된다.Occasionally, a recurrence occurs after surgery. After surgery, you should be tested regularly to check for recurrence (every 3-4 months). The liver, lungs and peritoneum are organs that tend to recur, and may also recur locally at the site of resection. Unlike other cancers, colorectal cancer can be completely cured by resecting the lesion that recurs if it is found early. More than 80% of relapses are found within 3 years after surgery, so recurrence within 5 years after surgery is the cure criteria.

대장암은 조기인 경우라면 거의 100% 가까이 완치되지만, 일반적으로 자각증상이 없기 때문에 무증상인 시기에 발견하는 것은 매우 어려우므로, 주기적인 검사가 선행 되어야 한다.Colorectal cancer is almost 100% cured if it is early, but it is usually difficult to detect it at an asymptomatic period because there are no asymptomatic symptoms.

대장암의 선별검사(screening)로서 대표적인 것은 잠혈 검사로서, 이 검사에서 양성반응이 나왔다고 해서 대장암에 걸렸다는 것은 아니며, 또 역으로 음성반응이라고 해서 대장암에 걸리지 않았다라고 말할 수 있는 것도 아니다.A screening test for colon cancer is an occult blood test. A positive test does not indicate that colon cancer is present, and conversely, a negative reaction does not indicate that colon cancer is not.

현재 사용되고 있는 대장암 검사법은 아래와 같다.Current colorectal cancer screening methods are as follows.

(a) 대장조영검사 (a) colorectal examination

검사는 식사 제한 후에 장기를 충분히 비운 후 항문으로부터 바륨과 공기를 주입하여 X-ray 사진을 촬영하여 장의 모양을 검사한다.The test involves emptying the organs sufficiently after a dietary restriction, and then examining the shape of the intestine by taking an X-ray of the barium and air from the anus.

(b) 대장내시경 (b) colonoscopy

현재 대장내시경에는 S-결장까지를 관찰하는 짧은 내시경과, 맹장까지 모든 대장을 관찰할 수 있는 긴 내시경이 있다. 검사와 동시 바로 용종을 절제할 수도 있기 때문에, 대장조영검사보다 정밀도가 높은 방법이다. Currently, the colonoscopy has a short endoscope for observing the S-colon and a long endoscope for observing all the colon to the cecum. Polyps can be excised immediately at the same time as the test, which is a higher precision method than colon screening.

(c) 종양표지자 (c) tumor markers

혈액 검사를 통해 신체 어딘가에 숨어 있는 암을 진단해내는 방법이다. 그 러나 현재까지 대장암을 조기에 발견할 수 있는 종양 표지자는 아직 없다. CEA(Carcinoembryonic antigen)라고 불리는 표지자가 일반적이지만, 대장암이 있어도 약 반수가 양성을 나타낼 뿐이므로, 주로 대장암의 진행도와 치료효과를 판정하는 지표로서 사용되고 있다.A blood test can diagnose cancer hidden somewhere in your body. However, there are no tumor markers that can detect colon cancer early. Although a marker called CEA (Carcinoembryonic antigen) is common, it is mainly used as an index for judging the progress and treatment effect of colorectal cancer since only about half of it is positive even when colorectal cancer exists.

(4) CT, MRI, 초음파 검사(4) CT, MRI, Ultrasound

이 검사 방법들은 다른 부위의 암을 찾아내는데 매우 진보된 검사법이지만, 대장에 생긴 질환을 발견하는데 적합하지 않다. 대장암에 있어서는 원발 병소의 진전 정도와 간으로의 원격전이 여부를 알아보기 위해 사용되고 있다. These tests are very advanced tests for detecting cancer in other areas, but are not suitable for detecting diseases of the large intestine. In colorectal cancer, it is used to determine the extent of primary lesion progression and distant metastasis to the liver.

대장암의 분자마커로서 알려진 예는 다음과 같다: WO 2005/015224는 60S 산성 리보좀 단백질 P0(RLA-0)에 대한 항체를 이용하여 대장암을 진단하는 방법을 개시하고 있으며, WO 2004/079368는 HSP9O이 대장암 조직에서 발현이 증가됨을 개시하고 있다. WO 2004/071267은 NNMT(nicotinamide N-methyltransferase)를 이용하여 대장암을 조기에 진단하는 방법을 개시하고 있으며, WO 2005/015234는 SAHH(S-adenosylhomocysteine hydrolase) 단백질이 대장암의 진단에 이용될 수 있음을 개시하고 있다. 또한, 미국 특허 제7501243호는 대장암 마커로서 TTK(Tyrosine threonine kinase)를 제시하고 있다.Examples known as molecular markers of colorectal cancer are as follows: WO 2005/015224 discloses a method for diagnosing colorectal cancer using an antibody against 60S acidic ribosomal protein P0 (RLA-0), WO 2004/079368 HSP9O discloses increased expression in colorectal cancer tissues. WO 2004/071267 discloses a method for early diagnosis of colorectal cancer using nicotinamide N-methyltransferase (NNMT), and WO 2005/015234 discloses that S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH) protein can be used for the diagnosis of colorectal cancer. It is disclosed. U.S. Pat.No.7501243 discloses Tyrosine threonine kinase (TTK) as a colorectal cancer marker.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시된다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서 에 참조로 삽입됨으로써 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, numerous patent documents and articles are referred to and the citations are indicated in parentheses. The disclosures of cited patent documents and articles are incorporated herein by reference in their entirety, so that the level of the technical field to which the present invention belongs and the present invention are more clearly explained.

본 발명자들은 대장암 및/또는 대장암 전이를 신속하고 정확하게 분자진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 발굴된 바이오마커들이 대장암 및/또는 대장암 전이를 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made diligent research efforts to discover novel biomarkers that can rapidly and accurately molecularly diagnose colon cancer and / or colon cancer metastasis. As a result, the present invention has been completed by identifying that the biomarkers discovered are markers capable of early diagnosis of colon cancer and / or colon cancer metastasis and to determine prognosis.

따라서 본 발명의 목적은 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a kit for diagnosing or prognosticting colon cancer or colorectal cancer metastasis.

본 발명의 다른 목적은 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 대장암 또는 대장암 전이 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting a colorectal cancer or colorectal cancer metastasis marker to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of colorectal cancer or colorectal cancer metastasis.

본 발명의 또 다른 목적은 대장암 또는 대장암 전이의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a method for screening a substance for preventing or treating colorectal cancer or colorectal cancer metastasis.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR 및 FCN3으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.According to one aspect of the invention, the invention is FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, C19ORF59 , An antibody that specifically binds to at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR, and FCN3, a sequence complementary to the nucleotide sequence, a fragment of the nucleotide, or a protein encoded in the nucleotide sequence Or it provides a kit for the diagnosis or prognosis of colorectal cancer or colorectal cancer metastases comprising aptamers.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR 및 FCN3으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오티드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 대장암 또는 대장암 전이 마커를 검출하는 방법을 제공한다. According to another aspect of the invention, the invention provides FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, in human biological samples to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of colorectal cancer or colorectal cancer metastasis. Detects expression of at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR and FCN3 The method provides a method for detecting colorectal cancer or colorectal cancer metastasis markers.

본 발명자들은 대장암 및/또는 대장암 전이를 신속하고 정확하게 분자진단할 수 있는 신규한 분자 마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상술한 분자 마커들이 대장암 및/또는 대장암 전이를 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다. 특히, 본 발명의 마커들은 동일 대장암 환자로부터 채취한 정상 대장조직, 대장암 조직 및 전이 조직을 이용하여 발굴된 것으로서, 대장암 및/또는 대장암 전이에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커들이다.The present inventors have made diligent research efforts to discover novel molecular markers that can rapidly and accurately molecularly diagnose colorectal cancer and / or colorectal cancer metastasis. As a result, it was found that the above-described molecular markers are early markers for colorectal cancer and / or colorectal cancer metastasis and can be used to determine prognosis. In particular, the markers of the present invention were excavated using normal colorectal, colorectal and metastatic tissues taken from the same colorectal cancer patient, and have greatly improved accuracy and reliability as markers for colorectal cancer and / or colorectal cancer metastasis. Markers.

본 명세서에서 용어 “대장암(colon cancer)”은 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭하는 것을 의미한다.As used herein, the term "colon cancer" refers to the collective cancer, colon cancer and anal cancer.

본 발명의 분자 마커는 대장암의 발생, 발전 및/또는 전이에 대한 지표가 될 수 있으며, 대장암의 발생, 발전 및/또는 전이의 진단에 이용될 수 있다.The molecular markers of the present invention may be indicative of the development, development and / or metastasis of colorectal cancer, and may be used to diagnose the development, development and / or metastasis of colorectal cancer.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.As used herein, the term “diagnosis” refers to determining the susceptibility of an object to a particular disease or condition, determining whether an object currently has a particular disease or condition, or having a particular disease or condition. Determining the prognosis of a subject (eg, identifying a metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer or responsiveness of the cancer to treatment), or therametrics (eg, treating efficacy Monitoring the status of an object to provide information about it).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다.According to a preferred embodiment of the invention, the kit of the invention may be a microarray.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the kit of the present invention is a gene amplification kit.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.When the kit of the present invention is a microarray, the probe is immobilized on the solid surface of the microarray. When the kit of the present invention is a gene amplification kit, it includes a primer.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR 및 FCN3로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.Probes or primers used in the diagnostic kits of the present invention are FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19OR Have a complementary sequence to a nucleotide sequence selected from the group consisting of CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR and FCN3. As used herein, the term “complementary” means having complementarity enough to selectively hybridize to the above-described nucleotide sequence under certain specific hybridization or annealing conditions. Thus, the term “complementary” has a different meaning from the term perfectly complementary, and the primers or probes of the present invention may be capable of selectively hybridizing to the above-described nucleotide sequence so long as one or more mismatches ( mismatch) may have a nucleotide sequence.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.As used herein, the term “primer” refers to a single that can serve as a starting point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and polymerases) in a suitable buffer at a suitable temperature. -Refers to stranded oligonucleotides. Suitable lengths of primers are typically 15-30 nucleotides, although varying with various factors, such as temperature and the use of the primer. Short primer molecules generally require lower temperatures to form hybrid complexes that are sufficiently stable with the template.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전 자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.The sequence of the primer does not need to have a sequence completely complementary to a partial sequence of the template, and it is sufficient if the primer has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template and acting as a primer. Therefore, the primer in the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the above-described nucleotide sequence as a template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to the gene sequence and acting as a primer. The design of such primers can be easily carried out by those skilled in the art with reference to the above-described nucleotide sequence, for example, by using a program for primer design (eg, PRIMER 3 program).

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고 타깃 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오티드이다. As used herein, the term “probe” refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and capable of specific hybridization to a target nucleotide sequence, and naturally Present or artificially synthesized. Probes of the invention are preferably single chain and oligodioxyribonucleotides.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오티드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 마커 중 하나인 FOSL1(FOS-like antigen 1)은 GenBank 접근번호 NM_005438, MSLN(mesothelin)은 GenBank 접근번호 NM_005823, AQP9(aquaporin 9)은 GenBank 접근번호 NM_020980, CBX4(chromobox homolog 4)는 GenBank 접근번호 NM_003655, PDCD2L(programmed cell death 2-like)는 GenBank 접근번호 NM_032346, HRASLS3(phospholipase A2, group XVI)는 GenBank 접근번호 NM_007069, DUSP14(dual specificity phosphatase 14)는 GenBank 접근번호 NM_007026, OLR1(oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1)은 GenBank 접근번호 NM_002543, SLC3A2(solute carrier family 3 (activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2)는 GenBank 접근번호 NM_001012661, MYEOV(myeloma overexpressed (in a subset of t(11;14) positive multiple myelomas))는 GenBank 접근번호 NM_138768, DNTTIP1(deoxynucleotidyltransferase, terminal, interacting protein 1)은 GenBank 접근번호 NM_052951, LEMD1(LEM domain containing 1)은 GenBank 접근번호 NM_001001552, SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3)은 GenBank 접근번호 NM_001085, EEF1D(eukaryotic translation elongation factor 1 delta (guanine nucleotide exchange protein))은 GenBank 접근번호 NM_032378, REEP6(receptor accessory protein 6)는 GenBank 접근번호 NM_138393, TREM1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1)은 GenBank 접근번호 NM_018643, ANKRD22(ankyrin repeat domain 22)은 GenBank 접근번호 NM_144590, C19ORF59(chromosome 19 open reading frame 59)은 GenBank 접근번호 NM_174918, CLEC5A(C-type lectin domain family 5, member A)은 GenBank 접근번호 NM_013252, CTSL1(cathepsin L1)은 GenBank 접근번호 NM_001912, IRF9(interferon regulatory factor 9)는 GenBank 접근번호 NM_006084, 그리고 ATL3(atlastin GTPase 3)는 GenBank 접근번호 NM_015459, MARCO(macrophage receptor with collagenous structure)는 GenBank 접근번호 NM_006770, OSCAR(osteoclast associated, immunoglobulin-like receptor)는 GenBank 접근번호 NM_133169, 그리고 FCN3(ficolin (collagen/fibrinogen domain containing) 3 (Hakata antigen))은 GenBank 접근번호 NM_003665에 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.Nucleotide sequences of the markers of the present invention which should be referenced when making primers or probes can be found in GenBank. For example, one of the markers of the present invention, FOSL1 (FOS-like antigen 1) is GenBank accession number NM_005438, MSLN (mesothelin) is GenBank accession number NM_005823, AQP9 (aquaporin 9) is GenBank accession number NM_020980, CBX4 (chromobox homolog 4) GenBank accession number NM_003655, PDCD2L (programmed cell death 2-like) is GenBank accession number NM_032346, HRASLS3 (phospholipase A2, group XVI) is GenBank accession number NM_007069, DUSP14 (dual specificity phosphatase 14) is GenBank accession number NM_007026, OLR1 ( Oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1) is GenBank accession number NM_002543, SLC3A2 (solute carrier family 3 (activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2) is GenBank accession number NM_001012661, myeloma overexpressed (in a subset of t (11; 14) positive multiple myelomas)) accesses GenBank accession number NM_138768, DNTTIP1 (deoxynucleotidyltransferase, terminal, interacting protein 1) accesses GenBank accession number NM_052951, and LEMD1 (LEM domain containing 1) accesses GenBank accession NM_001001552, SERPINA3 (serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3) for GenBank accession number NM_001085, EEF1D (eukaryotic translation elongation factor 1 delta (guanine nucleotide exchange protein)) for GenBank accession number NM_032378, REEP6 (receptor accessory protein 6) is GenBank accession number NM_138393, TREM1 (triggering receptor expressed on myeloid cells 1) is GenBank accession number NM_018643, ANKRD22 (ankyrin repeat domain 22) is GenBank accession numbers NM_144590, C19ORF59 (chromosome 19 open reading frame 59) ) GenBank accession number NM_174918, CLEC5A (C-type lectin domain family 5, member A) GenBank accession number NM_013252, CTSL1 (cathepsin L1) is GenBank accession number NM_001912, IRF9 (interferon regulatory factor 9) GenBank accession number NM_006084, And ATL3 (atlastin GTPase 3) is GenBank accession number NM_015459, MARCO (macrophage receptor with collagenous structure) is GenBank accession number NM_006770, OSCAR (osteoclast associated, immunoglobu) lin-like receptors have a nucleotide sequence disclosed in GenBank accession number NM_133169 and FCN3 (ficolin (collagen / fibrinogen domain containing) 3 (Hakata antigen)) in GenBank accession number NM_003665. You can design.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.In the microarray of the present invention, the probe is used as a hybridizable array element and is immobilized on a substrate. Preferred gases include, for example, membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or non-magnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries, as suitable rigid or semi-rigid supports. The hybridization array elements are arranged and immobilized on the substrate. This immobilization is carried out by chemical bonding methods or by covalent binding methods such as UV. For example, the hybridization array element can be bonded to a glass surface modified to include an epoxy compound or an aldehyde group, and can also be bonded by UV at the polylysine coating surface. In addition, the hybridization array element may be coupled to the gas through a linker (e.g., ethylene glycol oligomer and diamine).

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.On the other hand, the sample DNA applied to the microarray of the present invention can be labeled and hybridized with array elements on the microarray. Hybridization conditions can vary. The detection and analysis of the hybridization degree can be variously carried out according to the labeling substance.

본 발명의 대장암 및/또는 전이 진단용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.The kit for diagnosing colorectal cancer and / or metastasis of the present invention can be carried out based on hybridization. In this case, a probe having a sequence complementary to the nucleotide sequence of the above-described markers of the present invention is used.

상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 장암 여부를 판단할 수 있다.Intestinal cancer may be determined by hybridization-based analysis using a probe hybridized to the nucleotide sequence of the above-described markers of the present invention.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.The label of the probe can provide a signal that allows detection of hybridization, which can be linked to an oligonucleotide. Suitable labels include fluorophores (e.g. fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia), chromophores, chemilumines, magnetic particles, radioisotopes Elements (P 32 and S 35 ), mass labels, electron dense particles, enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), cofactors, substrates for enzymes, heavy metals (eg gold) and antibodies, streptavidin Hapten with specific binding partners, such as, but not limited to, biotin, digoxigenin and chelating groups. Labeling can be performed in a variety of ways conventionally practiced in the art, such as nick translation methods, random priming methods (Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham" (1989)), and chination methods (Maxam & Gilbert, Methods). in Enzymology , 65: 499 (1986)). The label provides signals that can be detected by fluorescence, radioactivity, colorimetry, weighing, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, hybridization high frequency, and nanocrystals.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 대장 세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.The nucleic acid sample to be analyzed can be prepared using mRNA obtained from various biosamples. The raw sample is preferably colon cells. The hybridization reaction-based assay may be performed by labeling the cDNA to be analyzed instead of the probe.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오티드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.If a probe is used, the probe is hybridized with the cDNA molecule. In the present invention, suitable hybridization conditions can be determined in a series of procedures by an optimization procedure. This procedure is carried out by a person skilled in the art in order to establish a protocol for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, hybridization and wash times, buffer components and their pH and ionic strength depend on various factors such as probe length and GC amount and target nucleotide sequence. Detailed conditions for hybridization are described in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); And MLM Anderson, Nucleic Acid Hybridization , Springer-Verlag New York Inc. NY (1999). For example, high stringency conditions were hybridized at 65 ° C in 0.5 M NaHPO 4 , 7% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 1 mM EDTA, followed by addition of 0.1 x SSC / 0.1% SDS Lt; RTI ID = 0.0 > 68 C < / RTI > Alternatively, high stringency conditions means washing at < RTI ID = 0.0 > 48 C < / RTI > in 6 x SSC / 0.05% sodium pyrophosphate. Low stringency conditions mean, for example, washing in 0.2 x SSC / 0.1% SDS at 42 ° C.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 대장암 장암 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 대장암 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 대장 상피세포)보다 강하게 나오는 경우에는 대장암으로 진단된다.After the hybridization reaction, the hybridization signal coming out of the hybridization reaction is detected. The hybridization signal can be performed by various methods, for example, depending on the type of label bound to the probe. For example, if the probe is labeled by an enzyme, the substrate of the enzyme can be reacted with the hybridization product to confirm hybridization. Combinations of enzymes / substrates that can be used include peroxidase (eg horseradish peroxidase) and chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium). Nitrate), resorphin benzyl ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol (HYR), tetramethylbenzidine (TMB), ABTS (2 , 2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o -phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronine; Alkaline phosphatase with bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate and ECF substrates; Glucose oxidase, t-NBT (nitroblue tetrazolium) and m-PMS (phenzaine methosulfate). When the probe is labeled with gold particles, it can be detected by silver dyeing using silver nitrate. Therefore, when the method for detecting the colorectal cancer bowel cancer marker of the present invention is performed based on hybridization, specifically (i) hybridizing a probe having a sequence complementary to the nucleotide sequence of the marker of the present invention to a nucleic acid sample; (ii) detecting whether the hybridization reaction occurs. By analyzing the intensity of the hybridization signal due to the hybridization process, it is possible to determine whether colorectal cancer. That is, when the hybridization signal for the nucleotide sequence of the marker of the present invention in the sample is stronger than the normal sample (for example, normal colon epithelial cells), it is diagnosed as colon cancer.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 대장암 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the human colorectal cancer diagnostic kit of the present invention may be a gene amplification kit.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. As used herein, the term "amplification" refers to a reaction that amplifies a nucleic acid molecule. Various amplification reactions have been reported in the art, which include polymerase chain reaction (PCR) (US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159), reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (2001)), Miller, HI (WO 89/06700) and Davey, C. et al. (EP 329,822), ligase chain reaction (LCR) ( 17, 18), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA, WO 88/10315), self-maintaining sequence replication (self sustained sequence replication, WO 90/06995), selective amplification of target polynucleotide sequences (US Pat. No. 6,410,276), consensus sequence primed polymerase chain reaction ( CP-PCR), US Pat. No. 4,437,975), optional plastic Arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR), US Pat. Nos. 5,413,909 and 5,861,245, Nucleic acid sequence based amplification (NASBA), US Pat. No. 5,130,238, 5,409,818, 5,554,517, and 6,063,603), strand displacement amplification (21, 22) and loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 23, but is not limited thereto. Other amplification methods that can be used are described in US Pat. Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617 and US Pat. No. 09 / 854,317.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.PCR is the best known nucleic acid amplification method, and many modifications and applications thereof have been developed. For example, touchdown PCR, hot start PCR, nested PCR, and booster PCR have been developed by modifying traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR. In addition, real-time PCR, differential display PCR (DD-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), multiplex PCR, inverse polymerase chain reaction (inverse polymerase) chain reaction (IPCR), vectorette PCR and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) have been developed for specific applications. For more information on PCR, see McPherson, MJ, and Moller, SG PCR . BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin, Heidelberg, NY (2000), the teachings of which are incorporated herein by reference.

본 발명의 진단용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 대장 상피세포)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.When the diagnostic kit of the present invention is carried out using a primer, a gene amplification reaction is performed to examine the expression level of the nucleotide sequence of the marker of the present invention. Since the present invention analyzes the expression level of the nucleotide sequence of the marker of the present invention, the amount of mRNA of the nucleotide sequence of the marker of the present invention is examined in a sample to be analyzed (for example, colonic epithelial cells). Determine the degree of expression of the sequence.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.Therefore, in principle, the present invention uses a mRNA in a sample as a template and performs a gene amplification reaction using a primer that binds to mRNA or cDNA.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것 은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.To obtain mRNA, total RNA is isolated from the sample. Isolation of total RNA can be carried out according to conventional methods known in the art (see Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep. , 9: 242 (1991); Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology , John Willey & Sons (1987); and Chomczynski, P. et. al., Anal. Biochem. 162: 156 (1987)). For example, TRIzol can be used to easily isolate total RNA in a cell. Next, cDNA is synthesized from the separated mRNA, and this cDNA is amplified. Since the total RNA of the present invention is isolated from human samples, the end of the mRNA has a poly-A tail, and cDNA can be easily synthesized using oligo dT primers and reverse transcriptases using these sequence characteristics. PNAS USA , 85: 8998 (1988); Libert F, et al., Science , 244: 569 (1989); and Sambrook, J. et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual , 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (2001). Next, the synthesized cDNA is amplified through gene amplification reaction.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.Primers used in the present invention are hybridized or annealed to one site of the template to form a double chain structure. Conditions for nucleic acid hybridization suitable for forming such double chain structures are described by Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach , IRL Press, Washington, DC (1985).

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중 합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.Various DNA polymerases can be used for amplification of the present invention and include “Clenau” fragments of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase and bacteriophage T7 DNA polymerase. Preferably, the polymerase is a thermostable DNA polymerase obtainable from various bacterial species, which include Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis , and Pyrococcus furiosus (Pfu). Include.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.When performing the polymerization reaction, it is preferable to provide the reaction vessel with an excessive amount of the components necessary for the reaction. The excess amount of the components required for the amplification reaction means an amount such that the amplification reaction is not substantially restricted to the concentration of the component. It is desired to provide cofactors such as Mg 2+ , dATP, dCTP, dGTP and dTTP to the reaction mixture such that the desired degree of amplification can be achieved. All enzymes used in the amplification reaction may be active under the same reaction conditions. In fact, the buffer ensures that all enzymes are close to optimal reaction conditions. Thus, the amplification process of the present invention can be carried out in a single reactant without changing conditions such as addition of reactants.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오티드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.Annealing in the present invention is carried out under stringent conditions allowing specific binding between the target nucleotide sequence and the primer. Stringent conditions for annealing are sequence-dependent and vary depending on the surrounding environmental variables.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 높게 나오는 경우에는 대장암/전이로 진단된다.The cDNA of the nucleotide sequence of the marker of the present invention thus amplified is analyzed by a suitable method to investigate the expression level of the nucleotide sequence of the marker of the present invention. For example, the degree of expression of the nucleotide sequence of the marker of the present invention is examined by gel electrophoresis of the amplification reaction product described above, and by observing and analyzing the resulting band. Through this amplification reaction, colon cancer / metastasis is diagnosed when the expression of the nucleotide sequence of the marker of the present invention in the raw sample is higher than that of the normal sample (normal cell).

따라서 본 발명의 장암 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.Therefore, when the method of detecting the bowel cancer marker of the present invention is performed based on an amplification reaction using cDNA, specifically, (i) performing an amplification reaction using a primer annealed to the nucleotide sequence of the marker of the present invention; And (ii) analyzing the product of the amplification reaction to determine the expression level of the nucleotide sequence of the marker of the present invention.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 대장암 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.According to a preferred embodiment of the invention, the invention can be carried out in an immunoassay mode, ie, antigen-antibody response mode. In this case, the antibody or aptamer specifically binds to the colorectal cancer marker of the present invention described above.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.The antibody used in the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody. Antibodies can be commonly used in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816,56) Or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature , 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol. , 222: 58, 1-597 (1991)). General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques , CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY , Wiley / Greene, NY, 1991, which are incorporated herein by reference. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing an immortalized cell line with an antibody-producing lymphocyte, and the techniques necessary for this process are well known and readily practicable by those skilled in the art. Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a protein antigen into a suitable animal, collecting the antiserum from the animal, and then separating the antibody from the antiserum using a known affinity technique.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 대장암/전이를 진단하는 데 이용될 수 있다.When the method of the present invention is carried out using antibodies or aptamers, the present invention can be used to diagnose colon cancer / metastasis by carrying out according to conventional immunoassay methods.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.Such immunoassays can be performed according to various quantitative or qualitative immunoassay protocols developed in the prior art. The immunoassay format includes radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or hardwood analysis, sandwich analysis, flow cytometry, and immunoassay. Including but not limited to fluorescent staining and immunoaffinity purification. The immunoassay or method of immunostaining is described in Enzyme Immunoassay , ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology , Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ, 1984; And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, which is incorporated herein by reference.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.For example, if the method of the present invention is carried out according to the method radioactive immunoassay, radioactive isotope is an antibody labeled (e.g., C 14, I 125, P 32 and S 35) of detecting the marker molecules of the present invention .

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.When the method of the invention is carried out in an ELISA manner, certain embodiments of the invention comprise the steps of: (i) coating an unknown cell sample lysate to be analyzed on the surface of a solid substrate; (Ii) reacting said cell lysate with an antibody against a marker as a primary antibody; (Iii) reacting the result of step (ii) with an enzyme-conjugated secondary antibody; And (iii) measuring the activity of the enzyme.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. Suitable as the solid substrate are hydrocarbon polymers (eg polystyrene and polypropylene), glass, metal or gel, most preferably microtiter plates.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.Enzymes bound to the secondary antibody include, but are not limited to, enzymes catalyzing color reaction, fluorescence, luminescence or infrared reaction, for example, alkaline phosphatase, β-galactosidase, hose Radish peroxidase, luciferase and cytochrome P 450 . When alkaline phosphatase is used as the enzyme binding to the secondary antibody, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate (naphthol-AS) as a substrate Chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis) if colorimetric substrates such as -B1-phosphate) and enhanced chemifluorescence (ECF) are used, and horse radish peroxidase is used -N-methylacridinium nitrate), resorupin benzyl ether, luminol, Amflex Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol (HYR), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o -phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronine, glucose oxidase and t-NBT (nitroblue tetrazolium) and m-PMS substrates such as (phenzaine methosulfate) may be used. All.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, MLN 51 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.When the method of the invention is carried out in a capture-ELISA mode, certain embodiments of the invention comprise the steps of: (i) coating the surface of a solid substrate with an antibody against the marker of the invention as a capturing antibody; (Ii) reacting the capture antibody with the cell sample; (Iii) reacting the product of step (ii) with a detecting antibody that has a label that generates a signal and that specifically reacts with MLN 51 protein; And (iv) measuring a signal originating from said label.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.The detection antibody carries a label which generates a detectable signal. The label may include chemicals (eg biotin), enzymes (alkaline phosphatase, β-galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P 450 ), radioactive substances (eg C 14 , I 125 , P 32 and S 35 ), fluorescent materials (eg, fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent, and fluorescence resonance energy transfer (FRET). Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.Measurement of the final enzyme activity or signal in the ELISA method and the capture-ELISA method can be carried out according to various methods known in the art. Detection of these signals allows for qualitative or quantitative analysis of the markers of the invention. If biotin is used as a label, the signal can be easily detected with streptavidin and luciferin if luciferase is used.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.According to another variant of the present invention, an aptamer that specifically binds to the marker of the present invention may be used instead of the antibody. Aptamers are oligonucleic acid or peptide molecules, and the general contents of aptamers are described in Bock LC et al., Nature 355 (6360): 5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78 (8): 42630 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95 (24): 142727 (1998).

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 대장암/전이를 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 대장암/전이로 진단된다.Colon cancer / metastasis can be diagnosed by analyzing the final signal intensity by the above-described immunoassay. That is, if the signal for the marker of the present invention in the sample is stronger than the normal sample, it is diagnosed as colon cancer / metastasis.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.The kit of the present invention may further include other components in addition to the above components. For example, when the kit of the present invention is subjected to a PCR amplification process, the kit of the present invention may optionally contain reagents necessary for PCR amplification, such as buffers, DNA polymerases (eg, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus ). (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis or thermally stable DNA polymerase obtained from Pyrococcus furiosus (Pfu)), DNA polymerase cofactors and dNTPs. Kits of the invention can be prepared in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above.

본 발명의 마커들은 대장암/전이에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커들이 정상세포와 비교하여 2-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 대장암/전이로 판정한다.Markers of the invention are biomolecules that are highly expressed in colorectal cancer / metastasis. High expression of such markers can be measured at the mRNA or protein level. The term "high expression" as used herein refers to a case where the expression level of the nucleotide sequence of interest in the sample to be investigated is high compared to the normal sample. For example, expression analysis methods commonly used in the art, such as RT-PCR methods or ELISA methods (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)) In the case of expression analysis according to, it means a case where the expression is analyzed to be many. For example, as a result of analysis according to the above-described analysis method, when the markers of the present invention are expressed 2-10 times higher than normal cells, it is determined as "high expression" in the present invention and colon cancer / metastasis. Determine.

본 발명의 바이오마커들 중에서 FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1 및 LEMD1은 원발성 대장암을 진단하는 데 특히 유용하고, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR 및 FCN3는 대장암 전이(바람직하게는, 간 전이) 를 진단하는 데 특히 유용하다. 특히, IRF9, REEP6, CTSL1, MARCO 및 SERPINA3는 대장암 전이에서 매우 분별적으로 고발현 되어, 원발성 대장암과 전이를 구별할 수 있게 한다.Among the biomarkers of the present invention, FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1 and LEMD1 are particularly useful for diagnosing primary colorectal cancer, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1 ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR and FCN3 are particularly useful for diagnosing colorectal cancer metastasis (preferably liver metastasis). In particular, IRF9, REEP6, CTSL1, MARCO and SERPINA3 are highly discernible in colorectal cancer metastasis, making it possible to distinguish primary colorectal cancer from metastasis.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 대장암 또는 대장암 전이의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a substance for preventing or treating colorectal cancer or colorectal cancer metastasis, comprising the following steps:

(a) FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR 및 FCN3으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및(a) FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5ARFCO, ASLCO CT1 And contacting a sample to be analyzed with a cell comprising at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of FCN3; And

(b) 상기 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오티드서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 대장암 또는 대장암 전이의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.(b) measuring the expression level of the nucleotide sequence, when high expression of the nucleotide sequence is suppressed, the sample is determined as a substance for preventing or treating colorectal cancer or colorectal cancer metastasis.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 인간의 대장암 세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.According to the method of the present invention, first, a sample to be analyzed is contacted with a cell containing the nucleotide sequence of the marker of the present invention. Preferably, the cell comprising the nucleotide sequence of the marker of the invention is a human colorectal cancer cell. As used to refer to the screening method of the present invention, the term "sample" refers to an unknown substance used in screening to examine whether it affects the expression level of the marker of the present invention. The sample includes, but is not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNAs, small interference RNAs (siRNAs), and natural extracts.

이어, 시료가 처리된 세포에서 본 발명의 마커의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 대장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.Next, the expression level of the marker of the present invention is measured in the cells treated with the sample. The amount of expression can be measured as described above, and in the case where the high expression of the nucleotide sequence of the marker of the present invention is suppressed as a result of the measurement, the sample can be determined as a substance for preventing or treating colorectal cancer.

(a) 본 발명은 대장암 및/또는 전이에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다.(a) The present invention provides novel molecular markers for colorectal cancer and / or metastasis.

(b) 본 발명의 동일 대장암 환자로부터 채취한 정상 대장조직, 대장암 조직 및 전이 조직을 이용하여 발굴된 것으로서, 대장암 및/또는 대장암 전이에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커들이다.(b) A marker that was excavated using normal colorectal, colorectal and metastatic tissues obtained from the same colorectal cancer patient of the present invention, and has greatly improved accuracy and reliability as a marker for colorectal cancer and / or colorectal cancer metastasis. admit.

(c) 본 발명의 마커를 이용하면 대장암 또는 전이를 정확하게 진단 및 예후를 할 수 있다.(c) The marker of the present invention can be used to accurately diagnose and prognose colon cancer or metastasis.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실시예 1: 대장암 및 전이 특이 마커 발굴을 위한 DNA 칩 분석 및 데이터 마이닝Example 1 DNA Chip Analysis and Data Mining for Discovery of Colorectal Cancer and Metastasis Specific Markers

정상 대장 상피세포에 비하여 대장암 및/또는 전이 세포에서만 특이적으로 과발현하는 유전자를 1차적으로 추출하기 위하여, DNA 칩(48K 인간 마이크로어레이, Illumina사)을 이용하여 2,230개의 유전자에 대하여 그 발현도를 조사하였다. 우선, 정상 대장 상피조직 시료 및 대장암 조직 시료를 얻었다. 대장암 환자 조직 시료는, 동일한 대장암 환자로부터 대장암 원발성 종양(primary tumor) 조직 및 전이(metastasis) 조직(간 전이 조직)을 얻어, 대장암 원발성 종양뿐만 아니라 전이에 대한 분자 마커를 발굴하였다. In order to primarily extract genes specifically overexpressed in colon cancer and / or metastatic cells as compared to normal colon epithelial cells, the expression levels of 2,230 genes were expressed using DNA chips (48K human microarray, Illumina). Investigate. First, normal colon epithelial tissue samples and colon cancer tissue samples were obtained. Colorectal cancer patient tissue samples obtained colorectal cancer primary tumor tissues and metastasis tissues (liver metastatic tissues) from the same colorectal cancer patients to identify molecular markers for metastasis as well as colorectal cancer primary tumors.

상기 정상 대장 상피세포, 대장암 세포 및 전이세포(즉, 간 전이 세포)로부터 총 RNA를 RNeasy Mini Kit(QIAGEN사)를 이용하여 추출하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 혼성화 반응을 위하여, Illumina TotalPrep RNA Amplification 키트(Ambion사)를 이용하여 biotin-표지 cRNA를 다음과 같이 제조하였다. T7 Oligo(dT) 프라이머를 이용하여 상기 추출된 총 RNA의 cDNA를 합성하고, biotin-UTP를 이용하여 인 비트로 전사를 실시하여 biotin-표지 cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop을 이용하여 정량하였다. 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2(Illumina사) 칩에 혼성화 시켰다. 혼성화 반응 후 비특이적 혼성화를 제거하기 위하여, Illumina Gene Expression System Wash Buffer(Illumina사)를 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 streptavidin-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공초점 레이저 스캐너 (Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스 팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina 사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 ‘quantile’ 기능을 이용하여 보정하였다. 상기의 유전자 발현 정도를 분석하여, 정상 대장 상피세포와 대장암 세포의 유전자 발현 양상을 비교 분석하였다. 이 때 군집화 분석(hierarchical clustering analysis)을 이용하였다. DNA 칩 결과를 기초로 하여, 대장암 및 전이에 특이적으로 과발현되는 유전자들을 1차 선별하였다(참조: 도 1a-1b). 대장암 및/또는 전이조직에서 과발현 되는 유전자들의 발현 양상을 도 2a-3b에 나타내었다. 도 2a-2b에 기재된 유전자들은 그 발현 정도가 정상조직과 비교하여 대장암 조직에서 증가하고, 대장암 조직과 비교하여 전이 조직에서 증가하거나 또는 거의 유사한 정도의 발현을 나타낸다. 도 3a-3b에 기재된 유전자들은 그 발현 정도가 정상조직과 비교하여 대장암 조직에서 소폭 증가하거나 소폭 감소하고, 대장암 조직과 비교하여 전이 조직에서 증가한다.Total RNA was extracted from the normal colon epithelial cells, colon cancer cells, and metastatic cells (ie, liver metastasis cells) using an RNeasy Mini Kit (QIAGEN), and quantified using an Experion RNA StdSens (Bio-Rad) chip. It was. For hybridization reaction, biotin-labeled cRNA was prepared using Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion) as follows. The cDNA of the extracted total RNA was synthesized using a T7 Oligo (dT) primer, and the biotin-labeled cRNA was prepared by in vitro transcription using biotin-UTP. The prepared cRNA was quantified using NanoDrop. CRNAs prepared from normal colon epithelial cells and colon cancer cells were hybridized to a Human-6 V2 (Illumina) chip. In order to remove nonspecific hybridization after the hybridization reaction, the DNA chips were washed using Illumina Gene Expression System Wash Buffer (Illumina) and the washed DNA chips were labeled with streptavidin-Cy3 (Amersham) fluorescent dye. Fluorescently labeled DNA chips were scanned using a confocal laser scanner (Illumina, Inc.) to obtain data of fluorescence present in each spot and stored as TIFF image files. TIFF image files were quantified with BeadStudio version 3 (Illumina) to quantify the fluorescence values of each spot. Quantified results were corrected using the 'quantile' function with Avadis Prophetic version 3.3 (Strand Genomics) program. By analyzing the gene expression level, gene expression patterns of normal colon epithelial cells and colon cancer cells were compared and analyzed. At this time, hierarchical clustering analysis was used. Based on the DNA chip results, genes specifically overexpressed in colorectal cancer and metastasis were selected first (see FIGS. 1A-1B). Expression patterns of genes overexpressed in colorectal cancer and / or metastatic tissue are shown in FIGS. 2A-3B. The genes described in FIGS. 2A-2B show increased expression in colorectal cancer tissues compared to normal tissues and increased or nearly similar expression in metastatic tissues compared to colon cancer tissues. The genes described in FIGS. 3A-3B are slightly increased or decreased in colorectal cancer tissues compared to normal tissues, and increased in metastatic tissues compared to colon cancer tissues.

DNA 칩 분석을 통하여 대장암 또는 전이에서 특이적으로 고발현되는 것으로 1차 선별된 유전자들을 대상으로 하여, 데이터마이닝을 하였고 그 결과는 도 4a-4b에 나타나 있다.DNA mining was performed on the first selected genes to be specifically expressed in colorectal cancer or metastasis, and data mining was performed. The results are shown in FIGS. 4A and 4B.

실험 및 분석 결과, FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, OSCAR 및 FCN3 유전자들이 대장암 및/또는 전이암에 대하여 특이적으로 고발현 되는 유전자임을 알 수 있고, 신규한 대장암 및/또는 전이암 분자 마커로 사용될 수 있음을 알았다. 특히, FOSL1, SLC3A2, DNTTIP1, REEP6 및 FCN3은 대장암에 대한 특이성이 매우 높은 분자 마커임이 규명되었다.Experiment and analysis results, FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, TREM1, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5RF9, CLTL5RF9 It was found that the OSCAR and FCN3 genes are genes that are highly expressed for colorectal cancer and / or metastatic cancer and could be used as novel colorectal and / or metastatic cancer molecular markers. In particular, FOSL1, SLC3A2, DNTTIP1, REEP6 and FCN3 have been found to be molecular markers with high specificity for colorectal cancer.

실시예 2: 대장암/전이 특이 유전자들에 대한 RT-PCR 분석Example 2: RT-PCR Analysis of Colorectal Cancer / Metastasis Specific Genes

대장암 환자로부터 적출된 대장암 조직, 전이 조직(즉, 간 전이 조직) 및 대장암 주위 비대장암 조직 각각 4개, 총 12 조직 시료를 액체 질소에 동결하고, 구아니디늄 방법에 의하여 총 RNA를 분리하고 이소프로판올에 보관/사용하였다. RNA의 정량은 스펙트로포토미터를 이용하여 실시하였고, SDS-PAGE 젤 전기영동을 통해 RNA를 확인하였다. 데이터 마이닝을 통해 선발된 유전자들이 대장암/전이 특이적으로 고발현되는 지 여부를 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)로 확인하였다. 상기 조직들의 세포로부터 추출한 RNA로부터 역전사 반응을 통해 cDNA를 제작하였다. cDNA제작은 AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA 합성 키트(STRATAGENE)를 이용하여 실시하였고, 상기의 반응 결과로 얻은 cDNA와 표 1의 프라이머들을 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR 증폭에 사용한 프라이머는, NCBI의 CoreNucleotide에서 얻는 유전자 서열을 참조하여 Primer3 Program(http://frodo.wi.mit.edu/)을 이용하여 디자인하였다.A total of 12 tissue samples, each of four colorectal cancer tissues, metastatic tissues (ie, liver metastasized tissues) and colorectal cancer tissues from colon cancer patients and four non- colorectal cancer tissues surrounding colon cancer, were frozen in liquid nitrogen, and total RNA was purified by guanidinium method. Separate and store / use in isopropanol. Quantification of RNA was performed using a spectrophotometer, and RNA was confirmed by SDS-PAGE gel electrophoresis. Through data mining, it was confirmed by RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) whether the selected genes were highly expressed in colorectal cancer / metastasis. CDNA was prepared by reverse transcription from RNA extracted from cells of the tissues. cDNA production was carried out using AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE), and PCR was performed using the cDNA obtained from the above reaction and the primers of Table 1. Primers used for PCR amplification were designed using the Primer3 Program (http://frodo.wi.mit.edu/) with reference to gene sequences obtained from CoreNucleotide of NCBI.

　 프라이머명Primer Name 증폭산물 크기(bp) Amplification Product Size (bp) 서열order 1One FOSL1(L)FOSL1 (L) 307bp307bp AGG AGC TGC AGA AGC AGA AGAGG AGC TGC AGA AGC AGA AG FOSL1(R)FOSL1 (R) CTG CTG CTA CTC TTG CGA TGCTG CTG CTA CTC TTG CGA TG 22 MSLN(L)MSLN (L) 303bp303 bp GTC AAC AAA GGG CAC GAA ATGTC AAC AAA GGG CAC GAA AT MSLN(R)MSLN (R) GAA GTA TTC GGA CCC GTT CAGAA GTA TTC GGA CCC GTT CA 33 AQP9(L)AQP9 (L) 305bp305 bp GCC CAA GCT ATT CTC AGT CGGCC CAA GCT ATT CTC AGT CG AQP9(R)AQP9 (R) TGT GCT GTT GCA TTT TCT CCTGT GCT GTT GCA TTT TCT CC 44 CBX4(L)CBX4 (L) 312bp312bp ACC CCA AAA TGT ACG ACC TGACC CCA AAA TGT ACG ACC TG CBX4(R)CBX4 (R) ATT TGC TCA TCA CGA TCA CGATT TGC TCA TCA CGA TCA CG 55 PDCD2L(L)PDCD2L (L) 330bp330bp CAG CTG AGG ACT GGT GTG AACAG CTG AGG ACT GGT GTG AA PDCD2L(R)PDCD2L (R) TTT GGG AAA GCA ACT GAT CCTTT GGG AAA GCA ACT GAT CC 66 HRASLS3(L)HRASLS3 (L) 354bp354 bp AGA GCC TAA GCC TGG AGA CCAGA GCC TAA GCC TGG AGA CC HRASLS3(R)HRASLS3 (R) ACT CCA TAG CGC AGC TCA TTACT CCA TAG CGC AGC TCA TT 77 DUSP14(L)DUSP14 (L) 329bp329 bp GAT GAT TTC CGA GGG AGA CAGAT GAT TTC CGA GGG AGA CA DUSP14(R)DUSP14 (R) TCA GGT ACG CGA TAC ACA GCTCA GGT ACG CGA TAC ACA GC 88 OLR1(L)OLR1 (L) 313bp313 bp CCC AGG TGT CTG ACC TCC TACCC AGG TGT CTG ACC TCC TA OLR1(R)OLR1 (R) CAG TTA AAT GAG CCC GAG GACAG TTA AAT GAG CCC GAG GA 99 SLC3A2(L)SLC3A2 (L) 311bp311 bp CTC CCT CCT TTC CTT GTT CCCTC CCT CCT TTC CTT GTT CC SLC3A2(R)SLC3A2 (R) CTT CGT GAG GCT CCA GTT TCCTT CGT GAG GCT CCA GTT TC 1010 MYEOV(L)MYEOV (L) 392bp392 bp CTT TAG AGT GGG CGT TGA GCCTT TAG AGT GGG CGT TGA GC MYEOV(R)MYEOV (R) GGA GGA GAG GAG AAG CAC CTGGA GGA GAG GAG AAG CAC CT 1111 DNTTIP1(L)DNTTIP1 (L) 321bp321bp CCC ATG AGC TTC CAG GAA TACCC ATG AGC TTC CAG GAA TA DNTTIP1(R)DNTTIP1 (R) GGG GGT CAG CTG CAT ACT TAGGG GGT CAG CTG CAT ACT TA 1212 LEMD1(L)LEMD1 (L) 321bp321bp TGG TGG ATG TGA AGT GTC TGATGG TGG ATG TGA AGT GTC TGA LEMD1(R)LEMD1 (R) CCC ACT GGG AAA CCT TCT TCCCC ACT GGG AAA CCT TCT TC

　 프라이머명Primer Name 증폭산물 크기(bp) Amplification Product Size (bp) 서열order 1One SERPINA3(L)SERPINA3 (L) 301bp301 bp CGT GGT GGA GCT GAA GTA CACGT GGT GGA GCT GAA GTA CA SERPINA3(R)SERPINA3 (R) CAC AGC CTT ATG GAC CAC CTCAC AGC CTT ATG GAC CAC CT 22 EEF1D(L)EEF1D (L) 331bp331 bp TGT GGG AAG ACA AGC ACA AGTGT GGG AAG ACA AGC ACA AG EEF1D(R)EEF1D (R) TCT CTG CCT GGT CGA AAA GTTCT CTG CCT GGT CGA AAA GT 33 REEP6(L)REEP6 (L) 307bp307bp GAG CAC TTC CTG GAG CAA AGGAG CAC TTC CTG GAG CAA AG REEP6(R)REEP6 (R) AAG GGA ACC AGG ACA GGA GTAAG GGA ACC AGG ACA GGA GT 44 TREM1(L)TREM1 (L) 352bp352 bp TGC TGT GGA TGC TCT TTG TCTGC TGT GGA TGC TCT TTG TC TREM1(R)TREM1 (R) AAC AGC ATG TGA GGC TCC TTAAC AGC ATG TGA GGC TCC TT 55 ANKRD22(L)ANKRD22 (L) 381bp381 bp GAG GGC ATG TGA GAA TCG TTGAG GGC ATG TGA GAA TCG TT ANKRD22(R)ANKRD22 (R) TCC GTG CAA TAT CCA GTG AGTCC GTG CAA TAT CCA GTG AG 66 C19orf59(L)C19orf59 (L) 317bp317bp AGA GCC ATC CTG AGC CTG TAAGA GCC ATC CTG AGC CTG TA C19orf59(R)C19orf59 (R) GGT GAG GAC TGT GGC ATT TTGGT GAG GAC TGT GGC ATT TT 77 CLEC5A(L)CLEC5A (L) 324bp324bp TAA CGA TGG TTT CAC CAC CATAA CGA TGG TTT CAC CAC CA CLEC5A(R)CLEC5A (R) CAA CGC CAC CTT TTC TCT TCCAA CGC CAC CTT TTC TCT TC 88 CTSL1(L)CTSL1 (L) 341bp341 bp ACA GTG GAC CAA GTG GAA GGACA GTG GAC CAA GTG GAA GG CTSL1(R)CTSL1 (R) AAG CCC AAC AAG AAC CAC ACAAG CCC AAC AAG AAC CAC AC 99 IRF9(L)IRF9 (L) 322bp322 bp AGG TCC AGC TGT CTG GAA GAAGG TCC AGC TGT CTG GAA GA IRF9(R)IRF9 (R) GCT GCT CCC AAT GTC TGA ATGCT GCT CCC AAT GTC TGA AT 1010 ATL3(L)ATL3 (L) 319bp319bp GCT TTC GTT ACC AGC AGG AGGCT TTC GTT ACC AGC AGG AG ATL3(R)ATL3 (R) GAA GAA GCC TGC TCC AAC ACGAA GAA GCC TGC TCC AAC AC 1111 OSCAR(L)OSCAR (L) 398bp398 bp AGA TCG CTC CCC TTC TCT TCAGA TCG CTC CCC TTC TCT TC OSCAR(R)OSCAR (R) GGA GGG CGT GTG ATA GTA GCGGA GGG CGT GTG ATA GTA GC 1212 MARCO(L)MARCO (L) 382bp382 bp CAA CAA GCT GCT TTT CAC CACAA CAA GCT GCT TTT CAC CA MARCO(R)MARCO (R) ACA TCC CTG GGT TCT GAG TGACA TCC CTG GGT TCT GAG TG 1313 FCN3(L)FCN3 (L) 328bp328 bp GAA TTC TGG CTG GGA AAT GAGAA TTC TGG CTG GGA AAT GA FCN3(R)FCN3 (R) CTG CAT AGC GAC CAT TGA GACTG CAT AGC GAC CAT TGA GA

RT-PCR 결과는 도 2a 및 도 2b에 나타나 있다. 도 2a 및 도 2b에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 대장암/전이 마커는 대장암/전이에 대하여 특이적으로 고발현되는 것을 알 수 있다. 특히, EEF1D의 경우 전이 암세포에서만 매우 특이적으로 고발현 되어 대장암 전이 마커로서 매우 우수한 적용성을 갖는다.RT-PCR results are shown in FIGS. 2A and 2B. As can be seen in Figures 2a and 2b, it can be seen that the colorectal cancer / metastasis marker of the present invention is specifically expressed for colorectal cancer / metastasis. In particular, EEF1D is highly expressed only in metastatic cancer cells and has very good applicability as a colorectal cancer metastasis marker.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

도 1a-1b는 48K 인간 마이크로어레이 칩(Illumina사)을 사용하여 정상 대장 조직, 대장암조직 및 전이조직에서 2,230개의 유전자 발현을 비교한 결과이다(p value <0.05). 도면에서, 숫자가 뒤에 있는 “T"는 대장암조직, "LMT"는 전이조직(간으로 전이된 종양조직)에 대한 것이다. 유전자 발현이 높은 순서는, 적색, 밤색, 검정색, 황록색, 짙은 녹색, 녹색, 옅은 녹색 및 연두색 순이다.1A-1B show the results of comparing 2,230 gene expressions in normal colon tissue, colon cancer tissue and metastatic tissue using 48K human microarray chip (Illumina) (p value <0.05). In the figure, “T” followed by a number is for colorectal cancer tissue and “LMT” is for metastatic tissue (tumor tissue that has metastasized to the liver). In order of green, pale green and lime green.

도 2a-2b 및 3a-3b는 대장암조직 및/또는 전이조직에서 과발현 되는 유전자들의 발현 양상을 그래프로 나타낸 것이다.2a-2b and 3a-3b graphically show the expression of genes that are overexpressed in colorectal cancer tissues and / or metastatic tissues.

도 4a는 유전체/단백질체를 이용한 대장암, 위암, 유방암, 전립선암 및 간암에 대한 데이터 마이닝 결과이다. 도 1a에서, 유전자 발현이 높은 순서는, 적색, 밤색, 검정색, 황록색, 짙은 녹색, 녹색, 옅은 녹색 및 연두색 순이다.4A shows data mining results for colorectal cancer, gastric cancer, breast cancer, prostate cancer, and liver cancer using genome / protein. In FIG. 1A, the order of high gene expression is red, brown, black, yellow green, dark green, green, pale green and light green.

도 4b는 유전체/단백질체를 이용한 대장암, 위암, 유방암, 전립선암 및 간암에 대한 데이터 마이닝 결과이다. 도 1b에서, 유전자 발현이 높은 순서는, 적색, 밤색, 검정색, 황록색, 짙은 녹색, 녹색, 옅은 녹색 및 연두색 순이다.4b shows data mining results for colon cancer, gastric cancer, breast cancer, prostate cancer and liver cancer using genome / protein. In FIG. 1B, the order of high gene expression is red, brown, black, yellow green, dark green, green, pale green and light green.

도 5a는 본 발명의 대장암/전이 마커들이 정상조직, 대장암 조작 및 전이 조직에서의 발현 정도를 분석한 RT-PCR 결과이다. 레인 1, 4, 7 및 10은 정상조직; 레인 2, 5, 8 및 11은 대장암 조직; 레인 3, 6, 9 및 12는 전이 조직에 대한 RT-PCR 결과이다.FIG. 5A shows the results of RT-PCR analysis of the degree of expression of colorectal cancer / metastasis markers in normal tissues, colorectal cancer manipulation, and metastatic tissues. Lanes 1, 4, 7 and 10 are normal tissues; Lanes 2, 5, 8 and 11 are colorectal cancer tissues; Lanes 3, 6, 9 and 12 are RT-PCR results for metastatic tissues.

도 5b는 본 발명의 대장암/전이 마커들이 정상조직, 대장암 조작 및 전이 조직에서의 발현 정도를 분석한 RT-PCR 결과이다. 레인 1, 4, 7 및 10은 정상조직; 레인 2, 5, 8 및 11은 대장암 조직; 레인 3, 6, 9 및 12는 전이 조직에 대한 RT-PCR 결과이다.FIG. 5B shows the results of RT-PCR in which the colorectal cancer / metastasis markers of the present invention are analyzed in normal tissue, colorectal cancer manipulation, and metastatic tissue. Lanes 1, 4, 7 and 10 are normal tissues; Lanes 2, 5, 8 and 11 are colorectal cancer tissues; Lanes 3, 6, 9 and 12 are RT-PCR results for metastatic tissues.

<110> KRIBB <120> Biomarkers Indicative of Colon Cancer and Metastasis and Diagnosis and Screening Therapeutics Using the Same <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOSL1(L) <400> 1 aggagctgca gaagcagaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOSL1(R) <400> 2 ctgctgctac tcttgcgatg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSLN(L) <400> 3 gtcaacaaag ggcacgaaat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSLN(R) <400> 4 gaagtattcg gacccgttca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP9(L) <400> 5 gcccaagcta ttctcagtcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP9(R) <400> 6 tgtgctgttg cattttctcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBX4(L) <400> 7 accccaaaat gtacgacctg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBX4(R) <400> 8 atttgctcat cacgatcacg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD2L(L) <400> 9 cagctgagga ctggtgtgaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD2L(R) <400> 10 tttgggaaag caactgatcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRASLS33(L) <400> 11 agagcctaag cctggagacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRASLS33(R) <400> 12 actccatagc gcagctcatt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUSP14(L) <400> 13 gatgatttcc gagggagaca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUSP14(R) <400> 14 tcaggtacgc gatacacagc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OLR1(L) <400> 15 cccaggtgtc tgacctccta 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OLR1(R) <400> 16 cagttaaatg agcccgagga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC3A2(L) <400> 17 ctccctcctt tccttgttcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC3A2(R) <400> 18 cttcgtgagg ctccagtttc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYEOV(L) <400> 19 ctttagagtg ggcgttgagc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYEOV(R) <400> 20 ggaggagagg agaagcacct 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNTTIP1(L) <400> 21 cccatgagct tccaggaata 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNTTIP1(R) <400> 22 gggggtcagc tgcatactta 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEMD1(L) <400> 23 tggtggatgt gaagtgtctg a 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEMD1(R) <400> 24 cccactggga aaccttcttc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SERPINA3(L) <400> 25 cgtggtggag ctgaagtaca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SERPINA3(R) <400> 26 cacagcctta tggaccacct 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EEF1D(L) <400> 27 tgtgggaaga caagcacaag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EEF1D(R) <400> 28 tctctgcctg gtcgaaaagt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REEP6(L) <400> 29 gagcacttcc tggagcaaag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REEP6(R) <400> 30 aagggaacca ggacaggagt 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREM1(L) <400> 31 tgctgtggat gctctttgtc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREM1(R) <400> 32 aacagcatgt gaggctcctt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANKRD22(L) <400> 33 gagggcatgt gagaatcgtt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANKRD22(R) <400> 34 tccgtgcaat atccagtgag 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C19orf59(L) <400> 35 agagccatcc tgagcctgta 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C19orf59(R) <400> 36 ggtgaggact gtggcatttt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLEC5A(L) <400> 37 taacgatggt ttcaccacca 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLEC5A(R) <400> 38 caacgccacc ttttctcttc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTSL1(L) <400> 39 acagtggacc aagtggaagg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTSL1(R) <400> 40 aagcccaaca agaaccacac 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRF9(L) <400> 41 aggtccagct gtctggaaga 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRF9(R) <400> 42 gctgctccca atgtctgaat 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRF9(L) <400> 43 gctttcgtta ccagcaggag 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRF9(R) <400> 44 gaagaagcct gctccaacac 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSCAR(L) <400> 45 agatcgctcc ccttctcttc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSCAR(R) <400> 46 ggagggcgtg tgatagtagc 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MARCO(L) <400> 47 caacaagctg cttttcacca 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MARCO(R) <400> 48 acatccctgg gttctgagtg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCN3(L) <400> 49 gaattctggc tgggaaatga 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCN3(R) <400> 50 ctgcatagcg accattgaga 20 <110> KRIBB <120> Biomarkers Indicative of Colon Cancer and Metastasis and          Diagnosis and Screening Therapeutics Using the Same <160> 50 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOSL1 (L) <400> 1 aggagctgca gaagcagaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOSL1 (R) <400> 2 ctgctgctac tcttgcgatg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSLN (L) <400> 3 gtcaacaaag ggcacgaaat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSLN (R) <400> 4 gaagtattcg gacccgttca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP9 (L) <400> 5 gcccaagcta ttctcagtcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP9 (R) <400> 6 tgtgctgttg cattttctcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBX4 (L) <400> 7 accccaaaat gtacgacctg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBX4 (R) <400> 8 atttgctcat cacgatcacg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD2L (L) <400> 9 cagctgagga ctggtgtgaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD2L (R) <400> 10 tttgggaaag caactgatcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRASLS33 (L) <400> 11 agagcctaag cctggagacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRASLS33 (R) <400> 12 actccatagc gcagctcatt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUSP14 (L) <400> 13 gatgatttcc gagggagaca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUSP14 (R) <400> 14 tcaggtacgc gatacacagc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OLR1 (L) <400> 15 cccaggtgtc tgacctccta 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OLR1 (R) <400> 16 cagttaaatg agcccgagga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC3A2 (L) <400> 17 ctccctcctt tccttgttcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC3A2 (R) <400> 18 cttcgtgagg ctccagtttc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYEOV (L) <400> 19 ctttagagtg ggcgttgagc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYEOV (R) <400> 20 ggaggagagg agaagcacct 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNTTIP1 (L) <400> 21 cccatgagct tccaggaata 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNTTIP1 (R) <400> 22 gggggtcagc tgcatactta 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEMD1 (L) <400> 23 tggtggatgt gaagtgtctg a 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEMD1 (R) <400> 24 cccactggga aaccttcttc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SERPINA3 (L) <400> 25 cgtggtggag ctgaagtaca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SERPINA3 (R) <400> 26 cacagcctta tggaccacct 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EEF1D (L) <400> 27 tgtgggaaga caagcacaag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EEF1D (R) <400> 28 tctctgcctg gtcgaaaagt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REEP 6 (L) <400> 29 gagcacttcc tggagcaaag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REEP 6 (R) <400> 30 aagggaacca ggacaggagt 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREM1 (L) <400> 31 tgctgtggat gctctttgtc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREM1 (R) <400> 32 aacagcatgt gaggctcctt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANKRD22 (L) <400> 33 gagggcatgt gagaatcgtt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANKRD22 (R) <400> 34 tccgtgcaat atccagtgag 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C19orf59 (L) <400> 35 agagccatcc tgagcctgta 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C19orf59 (R) <400> 36 ggtgaggact gtggcatttt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLEC5A (L) <400> 37 taacgatggt ttcaccacca 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLEC5A (R) <400> 38 caacgccacc ttttctcttc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTSL1 (L) <400> 39 acagtggacc aagtggaagg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTSL1 (R) <400> 40 aagcccaaca agaaccacac 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRF9 (L) <400> 41 aggtccagct gtctggaaga 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRF9 (R) <400> 42 gctgctccca atgtctgaat 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRF9 (L) <400> 43 gctttcgtta ccagcaggag 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRF9 (R) <400> 44 gaagaagcct gctccaacac 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSCAR (L) <400> 45 agatcgctcc ccttctcttc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSCAR (R) <400> 46 ggagggcgtg tgatagtagc 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MARCO (L) <400> 47 caacaagctg cttttcacca 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MARCO (R) <400> 48 acatccctgg gttctgagtg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCN3 (L) <400> 49 gaattctggc tgggaaatga 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCN3 (R) <400> 50 ctgcatagcg accattgaga 20  

Claims (12)

TREM1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1; GenBank 접근번호 NM_018643) 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후 분석용 키트.Large intestine comprising a primer or probe that binds to a triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (GenBank Accession Number NM_018643) gene, or an antibody or aptamer that specifically binds to a protein encoded by the nucleotide sequence Kit for diagnosis or prognosis of cancer or colorectal cancer metastasis. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후 분석용 키트.The kit for diagnosing or prognosticting colon cancer or colorectal cancer metastasis according to claim 1, wherein the kit is a microarray. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후 분석용 키트.According to claim 1, wherein the kit is a kit for the diagnosis or prognosis of colorectal cancer or colorectal cancer metastasis, characterized in that the gene amplification kit. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징 으로 하는 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후 분석용 키트.The kit for diagnosing or prognosticting colon cancer or metastatic colorectal cancer according to claim 1, wherein the kit is a kit for immunoassay. 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 TREM1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1; GenBank 접근번호 NM_018643) 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 대장암 또는 대장암 전이 마커를 검출하는 방법.A method of detecting the expression of a nucleotide sequence encoding a triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (GenBank Accession No. NM_018643) gene in a biological sample of humans to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of colorectal cancer or colorectal cancer metastasis. How to detect colon cancer or colorectal cancer metastasis marker through. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 5, wherein the method is performed in a microarray manner. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 5, wherein the method is performed by gene amplification. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특 징으로 하는 방법.6. The method of claim 5, wherein the method is carried out in an antigen-antibody reaction mode. 다음의 단계를 포함하는 대장암 또는 대장암 전이의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:A method for screening a substance for preventing or treating colorectal cancer or colorectal cancer metastasis, comprising the following steps: (a) TREM1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1; GenBank 접근번호 NM_018643) 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및(a) contacting a sample to be analyzed with a cell comprising a nucleotide sequence encoding a triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (GenBank accession number NM_018643) gene; And (b) 상기 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오티드서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 대장암 또는 대장암 전이의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.(b) measuring the expression level of the nucleotide sequence, when high expression of the nucleotide sequence is suppressed, the sample is determined as a substance for preventing or treating colorectal cancer or colorectal cancer metastasis. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 FOSL1(FOS-like antigen 1; GenBank 접근번호 NM_005438), MSLN(mesothelin; GenBank 접근번호 NM_005823), AQP9(aquaporin 9; GenBank 접근번호 NM_020980), CBX4(chromobox homolog 4; GenBank 접근번호 NM_003655), PDCD2L(programmed cell death 2-like; GenBank 접근번호 NM_032346), HRASLS3(phospholipase A2, group XVI; GenBank 접근번호 NM_007069), DUSP14(dual specificity phosphatase 14; GenBank 접근번호 NM_007026), OLR1(oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1; GenBank 접근번호 NM_002543), SLC3A2(solute carrier family 3(activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2; GenBank 접근번호 NM_001012661), MYEOV(myeloma overexpressed (in a subset of t(11;14) positive multiple myelomas); GenBank 접근번호 NM_138768), DNTTIP1(deoxynucleotidyltransferase, terminal, interacting protein 1; GenBank 접근번호 NM_052951), LEMD1(LEM domain containing 1; GenBank 접근번호 NM_001001552), SERPINA3(serpin peptidase inhibitor, clade A(alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3; GenBank 접근번호 NM_001085), EEF1D(eukaryotic translation elongation factor 1 delta(guanine nucleotide exchange protein); GenBank 접근번호 NM_032378), REEP6(receptor accessory protein 6; GenBank 접근번호 NM_138393), ANKRD22(ankyrin repeat domain 22; GenBank 접근번호 NM_144590), C19ORF59(chromosome 19 open reading frame 59; GenBank 접근번호 NM_174918), CLEC5A(C-type lectin domain family 5, member A; GenBank 접근번호 NM_013252), CTSL1(cathepsin L1; GenBank 접근번호 NM_001912), IRF9(interferon regulatory factor 9; GenBank 접근번호 NM_006084), ATL3(atlastin GTPase 3; GenBank 접근번호 NM_015459), MARCO(macrophage receptor with collagenous structure; GenBank 접근번호 NM_006770) 및 OSCAR(osteoclast associated, immunoglobulin-like receptor; GenBank 접근번호 NM_133169)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오티드 서열에 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 코딩되는 단백질에 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.The kit of claim 1, wherein the kit comprises FOSL1 (FOS-like antigen 1; GenBank accession number NM_005438), MSLN (mesothelin; GenBank accession number NM_005823), AQP9 (aquaporin 9; GenBank accession number NM_020980). ), CBX4 (chromobox homolog 4; GenBank accession number NM_003655), PDCD2L (programmed cell death 2-like; GenBank accession number NM_032346), HRASLS3 (phospholipase A2, group XVI; GenBank accession number NM_007069), DUSP14 (dual specificity phosphatase 14; GenBank Accession Number NM_007026), OLR1 (oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1; GenBank Accession Number NM_002543), SLC3A2 (solute carrier family 3 (activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2; GenBank Accession number NM_001012661 ), MYEOV (myeloma overexpressed (in a subset of t (11; 14) positive multiple myelomas); GenBank accession number NM_138768), DNTTIP1 (deoxynucleotidyltransferase, terminal, interacting protein 1; GenBank accession number NM_052951), LEMD1 (LEM domain containing 1 GenBank fold Root number NM_001001552), SERPINA3 (serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3; GenBank accession number NM_001085), eukaryotic translation elongation factor 1 delta (guanine nucleotide exchange protein); GenBank accession number NM_032378), REEP6 (receptor accessory protein 6; GenBank accession number NM_138393), ANKRD22 (ankyrin repeat domain 22; GenBank accession number NM_144590), C19ORF59 (chromosome 19 open reading frame 59; GenBank accession number NM_174918), CLEC5A (C -type lectin domain family 5, member A; GenBank accession number NM_013252), CTSL1 (cathepsin L1; GenBank accession number NM_001912), IRF9 (interferon regulatory factor 9; GenBank accession number NM_006084), ATL3 (atlastin GTPase 3; GenBank accession number NM_015459) ), A primer or probe that binds to at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of macrophage receptor with collagenous structure (Gencoank accession number NM_006770) and OSCAR (osteoclast associated, immunoglobulin-like receptor; GenBank accession number NM_133169), Or an antibody or aptamer that binds to a protein encoded in the nucleotide sequence. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간의 생물학적 시료는 FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO 및 OSCAR로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오티드 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The biological sample according to any one of claims 5 to 8, wherein the human biological sample is FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, And at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, and OSCAR. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 세포는 FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, ANKRD22, C19ORF59, CLEC5A, CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO 및 OSCAR로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오티드 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.The method of claim 9, wherein the cells of step (a) are FOSL1, MSLN, AQP9, CBX4, PDCD2L, HRASLS3, DUSP14, OLR1, SLC3A2, MYEOV, DNTTIP1, LEMD1, SERPINA3, EEF1D, REEP6, ANKRD22, C19ORA59, And further comprising at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of CTSL1, IRF9, ATL3, MARCO, and OSCAR.
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