KR101169903B1

KR101169903B1 - 아민 유도체를 포함하는 턱뼈괴사 억제제, 및 이를 유효성분으로 포함하는 턱뼈괴사 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101169903B1
Application number: KR1020120072817A
Authority: KR
Inventors: 박상열; 문명희; 서재숙; 이유진; 정재교
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2012-07-04
Filing date: 2012-07-04
Publication date: 2012-07-31
Also published as: KR20120082387A

Abstract

본 발명은 아민 유도체를 유효성분으로 포함하는 비스포스포네이트 제제의 부작용 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 아민유도체 조성물은 낮은 사용양으로 샤페론 단백질인 HIF-1α의 발현을 조절하고, 상기 HIF-1α는 BCL-xL 단백질의 발현을 조절하여 세포사멸을 억제할 수 있다. 이는 종래 사용되고 있는 골다공증 치료제인 비스포스포네이트 제제가 뼈 관련 세포인 조골세포 또는 파골세포의 세포사멸을 유도함으로서 발생되는 부작용인 턱뼈괴사를 예방 및 치료할 수 있다. 따라서, 골다공증 치료에 널리 쓰이는 비스포스포네이트 제제의 사용에는 제약을 가하지 않으면서, 본 발명의 조성물을 사용함에 따라 부작용만을 경감시킬 수 있는 장점이 있다.

Description

아민 유도체를 포함하는 턱뼈괴사 억제제, 및 이를 유효성분으로 포함하는 턱뼈괴사 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물{Osteonecrosis of jaw inhibitor comprising amine-derivatives, and pharmaceutical composition for osteonecrosis of jaw preventing or treating comprising thereof}

본 발명은 아민 유도체를 포함하는 턱뼈괴사 억제제, 및 이를 유효성분으로 포함하는 턱뼈괴사 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

골다공증은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 뼈의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 말한다. 상기 골다공증의 원인으로는 유전적 요인, 조기 폐경, 약제(스테로이드), 동반 질환, 흡연, 알코올 또는 류마티스 관절염 등이다.

이러한 골다공증은 대부분 증상이 없지만 골절이 생기면 통증이 생기고, 골절이 발생한 부위에 따라 다양한 증상이 나타날 수 있다. 모든 부위에서 골절이 일어날 수 있지만, 특히 손목뼈, 척추, 고관절(대퇴골)에서 골절이 자주 발생한다. 상기와 같은 질환을 치료하기 위하여 약물치료가 일반적인데, 약물치료에 사용되는 약제로는 전통적으로 폐경기 여성에게 많이 사용되는 여성호르몬 제제, 비스포스포네이트(bisphosphonate) 제제, 부갑상선호르몬 등이 있다. 이중에서 비스포스포네이트 제제는 가장 널리 사용되는 골다공증 치료제로, 파골세포(뼈 파괴세포)의 기능을 떨어드리고 그 수를 줄여 뼈의 파괴를 막는다.

그러나 최근 골흡수억제제인 비스포스포네이트 제제의 경우에 지나친 골흡수 억제로 턱뼈괴사(osteonecrosis of jaw) 등의 문제점이 제기되고 있다. 턱뼈괴사는 상악안면부에 괴사된 골조직이 밖으로 드러나 육안적으로도 관찰되는 병변이다. 서던캘리포니아대학 연구팀이 '미영양학회저널'에 밝힌 연구결과에 의하면, 비스포스포네이트 제제 중에 하나인 포사맥스를 단기간 사용할 경우에도 턱뼈괴사가 유발될 수 있는 것으로 나타났다. 포사맥스를 복용한 적이 있는 208명 환자를 대상으로 한 이번 연구결과 9명에서 턱 뼈의 골괴사가 유발됐다. 턱뼈괴사를 나타내는 환자들 중 94%가 고용량의 비스포스포네이트 정맥 주사제제(zoledronate, pamidronate)를 처방받은 적이 있는 것으로 나타났다. 특히, 발치 등의 치과치료를 한 경력이 있는 경우 그 위험성은 배가 되는 것으로 알려져 있다.

따라서, 당업계에서는 골다공증 치료에 효과적인 비스포스포네이트 제제에 의해 유발되는 부작용인 턱뼈괴사가 발생하지 않도록 하기 위한 비스포스포네이트의 부작용 억제제가 요구되고 있다.

상술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 비스포스포네이트 제제에 의해 유발되는 부작용인 턱뼈괴사를 예방 및 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

위와 같은 과제를 달성하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 약학적 조성물은 아민유도체를 유효성분으로 포함하고, 뼈 관련 세포의 세포사멸을 억제하여 턱뼈괴사를 예방 또는 치료하기 위한 것이다.

상기 뼈 관련 세포는 조골세포인 것이 바람직하다.

상기 세포사멸의 억제는 샤페론 단백질인 HIF-1α의 과발현에 의해 이루어지며, 상기 HIF-1α는 BCL-xL 단백질의 발현을 촉진할 수 있다.

상기 아민유도체는 데페록사민(deferoxamine)등이 바람직하다.

또한, 본 발명은 아민유도체를 유효성분으로 포함하는 턱뼈괴사 억제제를 제공한다.

상기 아민유도체는 데페록사민 등이 바람직하다.

본 발명의 아민유도체 조성물은 낮은 사용양으로 샤페론 단백질인 HIF-1α을 과발현시키고, 상기 과발현된 HIF-1α는 BCL-xL 단백질의 발현을 조절하여 세포사멸을 억제할 수 있다. 이는 종래 사용되고 있는 골다공증 치료제인 비스포스포네이트 제제가 뼈 관련 세포인 조골세포의 세포사멸을 유도함으로서 발생되는 부작용인 턱뼈괴사를 예방 및 치료할 수 있다. 따라서, 골다공증 치료에 널리 쓰이는 비스포스포네이트 제제의 사용에는 제약을 가하지 않으면서, 본 발명의 조성물을 사용함에 따라 부작용만을 경감시킬 수 있는 장점이 있다.

도 1은 저산소 조건에 따라 활성화되는 단백질을 나타낸 것이다(CON: 대조군, ALN: 알렌드로네이트, ALN+HYP:알렌드로네이트 및 저산소조건 처리, HYP:저산소조건 처리).
도 2은 저산소 조건과 본 발명에 따른 아민유도체를 처리하고, 시간이 경과됨에 따라 HIF-1α의 발현이 조절됨을 나타낸 것이다.
도 3는 데페록사민을 처리함으로서, 비스포스포네이트 제제 중에 하나인 알렌드로네이트에 의해 세포사멸이 억제될 수 있음을 보여주는 세포 현미경 사진이고, 도 4은 이를 MTT 분석을 통하여 세포 생존율을 확인한 것이다.

본 발명자는 골다공증 치료제인 비스포스포네이트 제제를 사용에 따른 부작용인 턱뼈괴사를 예방 및 치료하기 위한 조성물을 연구하던 중, 아민 유도체가 세포내에서 샤페론 단백질인 HIF-1α의 과발현을 유도하고, 이로 인해 세포 보호활성을 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

세포사멸이란, 세포가 그 필요성이 다하여, 조직내에서 사멸되는 것을 말한다. 일반적으로 세포사멸은 기관조직의 구성을 위하여 신체 내에서 일어나지만, 외부에서 도입된 성분들에 의해서 유도되는 경우가 있다. 신체에서 필요에 의해서 발생되는 세포사멸은 긍정적인 방향으로 이루어지지만, 외부에서 도입된 성분에 의해서 이루어지는 세포사멸은 부작용인 것이 대부분이다.

비스포스포네이트 제제는 폐경기 여성에게 주로 처방되는 골다공증 치료제로서, 널리 사용되고 있으나, 최근 상기 비스포스포네이트 제제가 턱에 존재하는 조골세포 의 세포사멸을 유도하여 턱뼈의 괴사를 촉진한다는 보고가 있다. 이는 골다공증 치료제로서 사용되고 있는 비스포스포네이트 제제의 사용상 제약을 주어, 골다공증 치료를 어렵게 한다.

본 발명의 아민유도체는 비스포스포네이트 제제에 의해 유발되는 뼈 관련 세포의 세포사멸을 억제하여 턱뼈괴사를 예방 또는 치료한다.

상기 아민유도체에 의해 세포사멸이 억제되는 메커니즘은 상기 아민유도체가 세포내에 존재하는 샤페론 단백질인 HIF-1α의 과발현을 유도한다. 샤페론 단백질이란, 세포내 주요의 파괴를 막기 위하여 생성되는 단백질로서, 세포 내부 또는 외부 요인들로 인해서 세포가 손상되는 것을 억제한다. 상기 HIF-1α는 여러 전사인자들을 조절하는 능력을 가지고 있으며, 그 조절되는 여러 전사인자 중 NF-κB는 BCL-xL과 같은 세포사멸억제 단백질의 발현을 조절할 수 있으며, 이로 인해서 발현이 조절된 BCL-xL는 미토콘드리아로부터 사이토크롬 c가 방출되어 이루어지는 일련의 caspase 활성을 막아 궁극적으로 세포사멸을 억제할 수 있는 효과가 있다.

그러므로, 상기 아민유도체는 세포보호 활성을 갖는 단백질의 발현을 촉진하여 뼈 관련 세포인 조골세포의 세포사멸을 억제하여 턱뼈괴사와 같은 비스포스포네이트 부작용을 예방 및 치료할 수 있다. 이때, 상기 아민유도체는 데페록사민(desferoxamine) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 아민유도체를 단독으로 포함하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함함으로써 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

또한, 상기와 같이 제형화된 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로로는 경구, 점안, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 선택된 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.

바람직하게는 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 슬러리제, 현탁액 등과 같은 경구 투여용 제제의 형태로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화할 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교 결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있으며 바람직하게는, 약 5 mg/kg/day～50 mg/kg/day이다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포사멸 억제용 용액의 제조

데페록사민 1.64 ㎎을 증류수 10㎖에 녹여, 세포사멸 억제용 조성물을 제조하였다. 이 용액을 세포에 처리시 0.1~1.0 μM 농도로 사용하였다.

실험예 1: 세포사멸 억제작용

1-1. 저산소 조건에 따른 세포보호

배양 접시에 배지 10 ㎖ 넣고 사람의 암세포화된 조골세포인 MG 63 세포(서울세포주은행)를 각각 1×10⁴개 심어 16 시간 배양한 후, 저산소 챔버를 이용하여 산소 1%, 이산화탄소 5%, 질소 94%의 혼합기체를 밀봉된 챔버에 넣어 주변 기체가 들어오지 못하게 했으며, 37℃에서 배양하였다. 12시간 후 증류수에 녹인 알렌드로네이트 용액을 50, 100 μM 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

1-2. 데페록사민 처리에 따른 세포사멸 억제

배양 접시에 배지 10 ㎖ 넣고 사람의 암세포화된 조골세포인 MG 63 세포를 각각 1×10⁴개 심어 28 시간 배양한 후, 실시예 1의 용액을 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

상기 실험예 1-1 및 1-2를 각각 12, 24, 48 및 72 시간 후 세포를 모아 용출액(25 mM HEPES; pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT, and protease inhibitor mixture)로 용해시켰다. 단백질을 8-15% SDS-PAGE 겔에 전기영동을 통해 분리시킨 후에 니트로셀룰로오스 막에 옮긴 후, 1차 항체(NF-κB, Bcl-xL, cleaved caspase-3, HIF-1α)(Thermo Fisher Scientific Inc.)와 2차 항체(horseradish peroxidase가 결합되어 있음)(Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 및 ECL 시약을 이용하여 면역반응을 통해 검출하였다. 그 결과를 이미지 분석장치를 통해 발현 정도를 이미지화시켰다.

그 결과를 하기 도 1 및 도 2((a) 및 (b))에 나타내었다.

도 1은 저산소 조건과 알렌드로네이트 처리에 따른 세포내 단백질의 변화를 나타낸 것으로서, 저산소 조건에 의해 NF-κB 및 Bcl-xL이 활성되고, 세포사멸 관련 단백질인 cleaved caspase-3의 활성은 감소시킴을 볼 수 있었다. 이는 저산소 조건이 NF-κB 및 Bcl-xL을 활성화시켜, cleaved caspase-3의 활성을 억제시킴으로서 세포사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 도 2(a)은 저산소 조건에서 시간에 따른 HIF-1α의 발현정도를 나타내는 것으로, HIF-1α 단백질 세포에서 샤페론 단백질로서, 과발현 세포의 보호작용을 나타낼 수 있다고 알려져 있다. 본 실험예의 저산소 조건에서 HIF-1α의 발현이 점차 증가됨을 볼 수 있어, MG-63 오스테오사르코마 세포에 보호작용을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다. 도 2(b)는 실시예 1의 용액을 처리한 것으로서, 세포에 데페록사민을 처리함에 따라 HIF-1α 단백질의 발현이 시간이 지남에 따라 증가될 수 있음을 볼 수 있었다. 따라서, 상기 데페록사민은 HIF-1α의 발현을 촉진할 수 있음을 간접적으로 알 수 있었다.

결론적으로, 데페록사민은 HIF-1α의 발현을 조절하여 NF-κB 및 Bcl-xL의 활성을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 2: 세포 생존율 실험

12-웰 플레이트에 배지 1 ㎖ 넣고 사람의 암세포화된 조골세포인 MG 63 세포를 각각 1×10⁴개 심어 16 시간 배양한 후, 증류수에 녹인 알렌드로네이트 용액을 50 및 100 μM 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 24 시간 후, 실시예 1의 화합물을 0.25 μM 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 72 시간 후 현미경을 이용하여 세포 사진을 찍고, 30% 에탄올, 3% 포름알데히드, 0.5% 크리스탈 바이올렛이 들어있는 염색 용액을 각 웰에 넣어 실온에서 10분간 정치하여 살아있는 세포를 염색한 후, 물로 4번 씻어낸 후 건조시켰다. 그 후, 1% SDS 용액으로 세포를 용해시킨 후, 엘라이자 판독기로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 상대적인 염색 강도에 기초하여, 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

그 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 알렌드로네이트의 첨가량이 증가함에 따라 세포의 생존율이 감소함을 육안으로 볼 수 있으며, 실시예 1은 알렌드로네이트의 처리에 따른 세포사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

도 4은 생존된 세포에 시약을 첨가할 경우, 생성되는 색소에 의해 세포의 생존율을 측정한 것으로, 본 발명의 실시예 1은 알렌드로네이트에 의한 세포사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims

데페록사민을 유효성분으로 포함하는, 비스포스포네이트 제제의 부작용으로 발생되는 턱뼈괴사를 억제하기 위한 약학적 조성물.