KR101166256B1 - CDCA5 as a marker for the diagnosis of gastric cancer or colon cancer and as a therapeutic agent thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 위암 또는 대장암에 특이적인 바이오 마커 CDCA5(cell division cycle associated 5)에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 CDCA5의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 또는 대장암을 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커의 검출 방법 및 상기 마커를 이용한 위암 또는 대장암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 CDCA5 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암의 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker CDCA5 (cell division cycle associated 5) specific for gastric cancer or colorectal cancer, and more particularly, to a composition for diagnosing gastric cancer or colorectal cancer comprising an agent for measuring the expression level of CDCA5. A kit comprising a composition, a method for detecting the marker, and a method for screening a gastric or colorectal cancer therapeutic agent using the marker. The present invention also relates to a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of cancer comprising a substance that inhibits the expression or activity of CDCA5.

위암, 대장암, 진단 바이오마커, CDCA5, 암 치료제 Gastric Cancer, Colorectal Cancer, Diagnostic Biomarkers, CDCA5, Cancer Therapeutics

Description

위암 또는 대장암 진단 마커 및 치료제로서의 ＣＤＣＡ５{CDCA5 as a marker for the diagnosis of gastric cancer or colon cancer and as a therapeutic agent thereof}CDCA5 as a marker for the diagnosis of gastric cancer or colon cancer and as a therapeutic agent approximately}

본 발명은 위암 또는 대장암에 특이적인 바이오 마커 CDCA5(cell division cycle associated 5)에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 CDCA5의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 또는 대장암을 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커의 검출 방법 및 상기 마커를 이용한 위암 또는 대장암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 CDCA5 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암의 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker CDCA5 (cell division cycle associated 5) specific for gastric cancer or colorectal cancer, and more particularly, to a composition for diagnosing gastric cancer or colorectal cancer comprising an agent for measuring the expression level of CDCA5. A kit comprising a composition, a method for detecting the marker, and a method for screening a gastric or colorectal cancer therapeutic agent using the marker. The present invention also relates to a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of cancer comprising a substance that inhibits the expression or activity of CDCA5.

2005년에 암으로 사망한 사람은 총 65,479명으로 전체 사망자의 26.7%가 암으로 사망하였다. 사망이 가장 많은 암종은 폐암으로 인구 10만명당 28.4명(21.1%)이었으며, 다음으로는 위암 22.6명(16.8%), 간암 22.5명(16.7%), 대장암 12.5 명(9.3%)의 순이었다. 1996년에서 2006년 위암 사망률의 추이를 분석한 결과, 지난 10년간 위암이 차지하는 암 사망률은 24%에서 16%로 점점 줄어들고 있으나 여전히 위암은 한국인의 대표적인 3대 암의 하나로서 이는 간과할 수는 없는 수치이다 (표 1 참고).In 2005, 65,479 people died of cancer, with 26.7% of all deaths. The most common carcinoma was lung cancer with 28.4 (21.1%) per 100,000 population, followed by 22.6 (16.8%) of stomach cancer, 22.5 (16.7%) of liver cancer, and 12.5 (9.3%) of colon cancer. According to the analysis of gastric cancer mortality rate from 1996 to 2006, the cancer mortality rate of gastric cancer has decreased from 24% to 16% in the past 10 years, but gastric cancer is still one of the three major cancers of Koreans and cannot be overlooked. This is a number (see Table 1).

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또한, 한국이나 일본 남성의 16% 이상이 위암으로 사망하고 있는 것으로 나타나고 있다. 한국, 일본 등 아시아에 위암이 많은 것은 민족이나 인종의 차이로 보기는 어렵고, 암 발생에 제일 중요한 생활환경의 차이, 특히 식생활의 차이에서 오는 것으로 보고되고 있다. 한국인의 경우 하루 소금 섭취량은 약 20 g으로 서양인보다 두 배 가까이 많이 섭취하고 있으며, 특히 소금에 절인 생선을 먹는 습관이 있는 한국, 일본, 핀란드, 아이슬란드 등에서 위암의 발생률이 높은 것으로 보고되고 있다. 또한 위암의 발병원인으로 식습관만큼이나 유전적인 원인도 중요시 대두되고 있다. 위암 환자의 1세대 자손들에게 위암의 발생률이 높고 A형 혈액형을 가진 사람이 위암의 발생률이 높은 것으로 보고되고 있다. 세 번째 원인으로는 위암 의 발생에 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylory. H.P)의 감염 여부이다. 아직까지 헬리코박터 파일로리의 감염과 위암의 인과관계가 결정적인 것이라고 생각하기는 섣부른 판단일 수 있으나, 한국인의 소화기계 질환 및 위암 환자의 40~60 %에서 헬리코박터 파일로리가 검출되는 것으로 볼 때, 감염자는 비감염자와 비교할 때 상대적으로 위암에 걸릴 가능성이 높은 것만은 분명하다. 따라서 헬리코박터 파일로리의 제거는 위염 및 위암 예방의 한 방법으로 대두되고 있다. In addition, more than 16% of Korean and Japanese men are dying from stomach cancer. It is reported that a lot of gastric cancer in Asia, such as Korea and Japan, is hardly regarded as a difference between peoples and races, and it is reported that the difference in living environment, which is the most important for cancer occurrence, especially the difference in diet. Koreans consume about 20 grams of salt per day, nearly twice as much as Westerners, and the incidence of gastric cancer is reported in South Korea, Japan, Finland, and Iceland, which tend to eat salted fish. In addition, as a cause of gastric cancer, genetic causes are emerging as important as eating habits. First-generation offspring of gastric cancer patients have been reported to have high incidence of gastric cancer and those with type A blood type have high incidence of gastric cancer. The third cause is the presence of Helicobacter pylori (H.P) infection in the development of gastric cancer. Although the causal relationship between Helicobacter pylori infection and gastric cancer may not be decisive, it may be premature to conclude that the infection of the Helicobacter pylori is detected in 40-60% of Korean gastrointestinal disease and gastric cancer patients. Obviously, the relative risk of stomach cancer is relatively high compared to Therefore, elimination of Helicobacter pylori has emerged as a method of preventing gastritis and gastric cancer.

암세포가 어떠한 경로로 어떻게 생기게 되는가 하는 것은 아직 확실히 밝혀지지는 않고 있으나, 정상세포의 증식조절의 기능을 가진 유전자의 변형에 의해 증식조절이 되지 않는 세포가 생겨남으로써 암이 발생하는 것으로 보는 것이 일반적인 견해다. 따라서 위암 의 경우 초기에는 암세포가 점막 내에 국한 되어있는 상태를 조기위암으로 분류하고 있는데, 조기위암 상태에서 발견된 환자의 치료의 예후는 비교적 좋은 것으로 나타났다. 따라서 위암의 조기 진단 및 치료는 위암의 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것으로 평가되고 있다. It is not yet clear how and how cancer cells are produced. However, it is a general view that cancer is caused by the generation of cells that are not controlled by the alteration of genes that function to control the growth of normal cells. All. Therefore, in the early stages of gastric cancer, cancer cells are classified as early gastric cancer, and the prognosis of treatment for patients found in early gastric cancer was relatively good. Therefore, early diagnosis and treatment of gastric cancer is expected to contribute to lowering the mortality rate of gastric cancer and lowering the cost of treating cancer.

위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있다. 또한 위암의 증상이, 어떤 특성을 가지는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 나타낸다는 것이다. 일반적으로 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬어 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.Stomach cancer symptoms range from no symptoms to severe pain. In addition, the symptoms of gastric cancer, rather than having a certain characteristic is a general digestive symptoms. In general, the early stages of gastric cancer asymptomatic cases, even if the slightest indigestion or upper abdominal discomfort, so most people overlook it, causing the death rate of stomach cancer.

현재까지의 위암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 그 첫번째로는 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법, 점막촬영법 등이 있으며, 두번째로는 위내시경으로 위속을 직접 눈으로 들여다 볼 수 있게 하여, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변도 발견할 수 있을 뿐 아니라 위암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단률을 높이고 있다. 하지만 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다. Until now, most of the tests for gastric cancer are physical. The first is gastrointestinal X-ray imaging, which includes dual imaging, compression, and mucosal imaging. Second, gastroscopy allows direct visual observation of the stomach gland, and even the smallest lesions that do not appear on X-rays. Not only can it be done, but biopsy can be performed directly in places where stomach cancer is suspected, increasing the diagnosis rate. However, this method has the disadvantages of hygiene problems and patient suffering during the examination.

또한, 현재까지의 진행되고 있는 위암의 최선의 치료는 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 따라서 완치를 목표로 하는 치료로써는 외과적인 절제방법 밖에는 없다. 외과적인 절제방법에는 여러 가지 방법이 있겠으나 일단 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한 한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 이때는 위뿐만 아니라 주위 임파선을 포함한 여러 장기도 포함하게 되므로 상당히 큰 수술이 되기 때문에 환자의 예후를 장담하기 어려울 수도 있다. 또한 위암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는데 일시적 효과는 있지만, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.In addition, the best treatment of gastric cancer that has been advanced so far is to remove the lesion by surgery, and thus, the only treatment for the cure is surgical resection. Surgical excision can be done in various ways. However, in the case of surgery aiming at cure, it is a principle to make the resection as wide as possible, but the extent of resection may be determined in consideration of the sequelae after extensive resection. In this case, because it includes not only the stomach but also various organs including the surrounding lymph nodes, it may be difficult to guarantee the prognosis of the patient because the operation is quite large. In addition, when gastric cancer has metastasized to other organs, radical surgery is impossible. Therefore, other methods such as chemotherapy are taken. At this time, anti-cancer drugs that are on the market can be used to relieve temporary symptoms or to suppress recurrence and prolong survival. Although it has a temporary effect, the patient may suffer from double pain due to side effects and economic burdens caused by chemotherapy.

위암의 발병여부 및 진행단계의 정확한 판별이 가능하게 하는 위암의 진단제 및 외과적 절제술이나 항암제의 단점을 보완한 치료제의 개발을 위한 바이오 마커의 선별 및 진단 마커를 측정하는 제제의 개발은 난치병중의 하나인 위암을 정복하는 선두 과제라 할 수 있으며 본 연구의 수행 목적이라 하겠다.The development of biomarkers for the development of a diagnostic agent for gastric cancer and the development of a therapeutic agent that complements the shortcomings of surgical resections or anticancer agents, and the development of agents that measure the diagnostic markers are intractable disease. It is one of the leading tasks to conquer stomach cancer, which is one of the goals of this study.

한편, 대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 대장암의 발생률은 1995년 이후 2002년까지 420% 증가하여 암 중 발생률 1위를 나타내고 있다(2003 건강보험통계연보, 국민건강보험공단 발간). 대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관, 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생비는 결장암은 여자에게서, 직장암은 남자에게서 다소 높게 나타난다. 대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행하여 수행된다. 수술적 요법, 항암화학요법 및 방사선요법 등의 진보에도 불구하고 특정한 증상이 없이 진행되는 대장암의 특성으로 인해 다른 장기로 전이된 후 진단되어 수술 시점을 놓친 경우에는 사망률이 매우 높다. 5년 평균생존율은 1기의 경우 90% 이상, 2기의 경우 70% 이상, 3기의 경우 50% 이상이고 4기의 경우에는 5% 이하이지만, 대장암을 조기에 발견하고 치료할수록 생존율은 현저히 증가하는 것으로 나타났다(2004 암정보, 국립암센터 발간). 따라서, 대장암을 효과적으로 조기에 진단하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.On the other hand, most of the colorectal cancer is adenocarcinoma (adenocarcinoma) in pathology, and largely divided into colon cancer and rectal cancer. The incidence of site-specific incidence occurs most often in the lower colon, or rectum, at about 50%. Recent studies have shown that changes in dietary habits have significantly increased the incidence and mortality of colorectal cancer in Korea, and the incidence of colorectal cancer increased 420% from 1995 to 2002, making it the number one in cancer. (The 2003 Health Insurance Statistics Yearbook, published by the National Health Insurance Service). The cause of colorectal cancer is still unknown, but genetic factors, dietary habits associated with eating high-fat and low-fiber foods, and inflammatory bowel disease are being considered. Colorectal cancer can occur in all age groups, but as the age increases, the incidence increases and occurs frequently in the 50s and 60s. The incidence of men and women is higher in colon cancer in women and rectal cancer in men. Treatment of colorectal cancer is performed by chemotherapy and radiotherapy based on surgical resection. Despite advances in surgical therapies, chemotherapy and radiotherapy, mortality rates are very high when people miss the point of surgery because they are metastasized to other organs due to the characteristics of colorectal cancer that progress without specific symptoms. The 5-year average survival rate is at least 90% in stage 1, at least 70% in stage 2, at least 50% in stage 3 and below 5% in stage 4.However, the earlier the early detection and treatment of colorectal cancer, Significantly increased (2004 Cancer Information, published by the National Cancer Center). Therefore, the development of a method for effectively and early diagnosis of colorectal cancer is urgently required.

인체의 종양은 일종의 암표지 항원이라 일컬어지는 다양한 분자들을 발현시켜 분비한다. 현재 다양한 종류의 암환자들의 혈청을 분석하여 암의 발병과 전이의 진단 및 치료에 사용될 수 있는 항원들이 제시되고 있다. 지금까지 발견된 종양 마커는 약 60여종에 이르는데, 현재 상용화되고 있는 종양 마커로는 AFP(간 암), CEA(대장암, 위암, 췌장암, 유방암), HCG(융모상피암), PAP(전립선암), NSE(폐암), C15-3(유방암), CA19-9(대장암, 췌암)등을 들 수 있다. 그러나, 안타깝게도 위암 또는 대장암에 진단 및 치료에 대한 탁월한 효과가 있는 진단마커나 항암제는 개발되어 있지 않은 실정이다.Human tumors express and secrete a variety of molecules called cancer-labeled antigens. Currently, antigens that can be used for the diagnosis and treatment of cancer onset and metastasis have been suggested by analyzing the serum of various cancer patients. About 60 tumor markers discovered so far are currently available, including AFP (liver cancer), CEA (colon cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, breast cancer), HCG (choroid epithelial cancer), and PAP (prostate cancer). ), NSE (lung cancer), C15-3 (breast cancer), CA19-9 (colon cancer, pancreatic cancer), etc. are mentioned. Unfortunately, no diagnostic markers or anticancer drugs have been developed that have an excellent effect on the diagnosis and treatment of gastric or colorectal cancer.

이에 본 발명자들은 위암 또는 대장암과 관련이 있다고 예상되는 유전자들을 대상으로 DNA 칩을 제작하여 위암은 물론 대장암, 유방암, 췌장암 등에서의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, 위암 또는 대장암 조직에서만 특이적으로 과발현되는 유전자들을 선별할 수 있었고, 이러한 위암 또는 대장암 진단마커로서의 가능성 있는 CDCA5 유전자를 최종 선별하고, 이들을 통하여 위암 또는 대장암을 조기에 정확하게 진단할 수 있음은 물론 상기 유전자의 생성이나 분비를 억제하는 물질이 위암 또는 대장암의 치료에 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors prepared DNA chips for genes predicted to be related to gastric cancer or colorectal cancer, and compared expression levels in gastric cancer as well as colorectal cancer, breast cancer, and pancreatic cancer. As a result, it was possible to select genes that were specifically overexpressed only in gastric or colorectal cancer tissues, and to finally select potential CDCA5 genes as a diagnostic marker for gastric or colorectal cancer, thereby enabling early and accurate diagnosis of gastric or colorectal cancer. Of course, the present invention was completed by revealing that a substance that inhibits the production or secretion of the gene can be used for the treatment of gastric or colorectal cancer.

본 발명의 하나의 목적은 CDCA5 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 또는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention to provide a composition for diagnosing gastric cancer or colorectal cancer comprising an agent for measuring the level of mRNA of the CDCA5 gene or protein thereof.

본 발명의 다른 목적은 상기 위암 또는 대장암 진단용 조성물을 포함하는 위암 또는 대장암 진단 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a gastric or colorectal cancer diagnostic kit comprising the composition for diagnosing gastric or colorectal cancer.

본 발명의 또 다른 목적은 위암 또는 대장암 마커 CDCA5 를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting gastric or colorectal cancer marker CDCA5.

본 발명의 또 다른 목적은 위암 또는 대장암 마커 CDCA5 를 이용하여 위암 또는 대장암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for screening a gastric or colorectal cancer therapeutic agent using the gastric or colorectal cancer marker CDCA5.

본 발명의 또 다른 목적은 CDCA5 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암의 치료 및 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of cancer comprising a substance that inhibits the expression or activity of CDCA5.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 CDCA5(cell division cycle associated 5)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 또는 대장암 진단용 조성물에 관한 것이다. As one embodiment for achieving the above object, the present invention relates to a composition for diagnosing gastric cancer or colorectal cancer comprising an agent for measuring the expression level of the cell division cycle associated 5 (CDCA5).

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 위암 또는 대장암 발병 여부를 확인하는 것이 다. As used herein, the term "diagnostic" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether the cancer of the stomach or colorectal cancer.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 위암 또는 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 위암 또는 대장암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 위암 또는 대장암 진단 마커는 정상 위 또는 대장 조직의 세포에 비하여, 위암 또는 대장암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 CDCA5(cell division cycle associated 5) 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.As used herein, the term "diagnostic marker, diagnostic marker, or diagnostic marker" is a substance that can distinguish gastric cancer or colorectal cancer cells from normal cells, and has gastric cancer or colorectal cancer as compared to normal cells. Polypeptides or nucleic acids (eg, mRNA, etc.) that show an increase or decrease in cells, organic biomolecules such as lipids, glycolipids, glycoproteins or sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like. For the purposes of the present invention, the gastric cancer or colorectal cancer diagnostic markers of the present invention have a CDCA5 (cell division cycle associated 5) gene which exhibits a particularly high level of expression in gastric or colorectal cancer cells compared to cells of normal gastric or colorectal tissue. And proteins encoded thereby.

CDCA5(cell division cycle associated 5)는 염색체의 부착과 S기 혹은 G2기를 조절하는 인자로서, 그 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록되어 있다(NM_080668, NP_542399). CDCA5 는 염색체 간의 부착에 관여하는 것으로 알려져 있으나, CDCA5 의 기능 및 위암 또는 대장암과의 연관성은 전혀 알려지지 않았다.CDCA5 (cell division cycle associated 5) is a factor that regulates chromosome adhesion and S or G2 phase, and its gene and protein information is registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (NM_080668, NP_542399). CDCA5 is known to be involved in chromosomal adhesions, but the function of CDCA5 and its association with gastric or colorectal cancer are not known at all.

본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 CDCA5 가 위암 또는 대장암 진단을 위한 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.The present inventors have found that CDCA5 can be used as a marker for diagnosing gastric or colorectal cancer through the following verification.

구체적으로, DNA 칩을 이용하여 2,230개의 유전자의 발현도를 조사하여 정상 위 상피세포에 비하여 위암 세포에만 특이적으로 과발현하는 유전자 1,601 개를 1 차적으로 추출하였고, 군집화 분석을 이용하여 두 개의 군집으로 나눈 후(도 1) 60% 이상의 환자에 2배 이상의 발현 차이를 나타내는 유전자를 선별하고 (도 2), 이 중 대장암, 유방암 및 췌장암과 비교했을 때 위암 또는 대장암에서만 특이적으로 발현되는 유전자인 CDCA5를 최종 선별하였다 (도 3 내지 도 5). 또한, 면역조직 화학염색법을 통하여 대장암 환자로부터 얻은 위암 조직 또는 대장암 조직에서 CDCA5 의 과발현을 확인할 수 있었다(도 12).Specifically, 1,601 genes specifically overexpressed in gastric cancer cells were first extracted from DNA samples using DNA chips, and then divided into two clusters using clustering analysis. (FIG. 1), a gene expressing a doubling expression difference in more than 60% of patients (FIG. 2), which is a gene that is specifically expressed only in gastric cancer or colon cancer as compared with colorectal cancer, breast cancer and pancreatic cancer CDCA5 was finally screened (Figures 3-5). In addition, overexpression of CDCA5 was confirmed in gastric cancer tissue or colorectal cancer tissue obtained from colorectal cancer patients by immunohistochemistry (FIG. 12).

이와 같이 선별한 CDCA5 유전자를 본 발명자들이 고안한 프라이머를 사용하여 역전사 중합효소반응을 실시한 결과, 정상 조직과 위암 또는 대장암 조직 간의 CDCA5 발현의 차이를 확연히 구별할 수 있었고(도 6 및 도 8), 또한 정상 세포와 위암 세포주 또는 대장암 세포주 간에도 CDCA5 의 발현이 뚜렷하게 구별됨을 확인할 수 있었다(도 7 및 도 11). 또한, 실시간 중합효소반응 결과에서도 정상 조직과 위암 조직 또는 대장암 조직 간의 CDCA5 발현의 차이를 확연히 구별할 수 있었다 (도 9).As a result of the reverse transcriptase polymerase reaction using the primers devised by the inventors of the CDCA5 gene thus selected, it was possible to clearly distinguish the difference in CDCA5 expression between normal tissue and gastric cancer or colorectal cancer tissue (FIGS. 6 and 8). In addition, it was confirmed that the expression of CDCA5 was clearly distinguished between normal cells and gastric cancer cell lines or colon cancer cell lines (FIGS. 7 and 11). In addition, the real-time polymerase reaction result was able to clearly distinguish the difference in CDCA5 expression between normal tissue and gastric cancer tissue or colon cancer tissue (Fig. 9).

본 발명에서 용어, "CDCA5(cell division cycle associated 5)의 발현수준을 측정하는 제제" 란 상기와 같이 위암 또는 대장암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 CDCA5의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다.In the present invention, the term "agent measuring the expression level of cell division cycle associated 5 (CDCA5)" refers to the expression level of CDCA5, which is a marker for increasing expression in gastric or colorectal cancer cells, as described above. It refers to a molecule capable of, preferably refers to an antibody, primer or probe specific to the marker.

CDCA5 의 발현 수준은 CDCA5 유전자의 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 위암 또는 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 위암 또는 대장암 마 커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. The expression level of CDCA5 can be known by identifying the expression level of the mRNA of the CDCA5 gene or the protein encoded by the gene. In the present invention, "mRNA expression level measurement" is a process of confirming the presence and expression level of mRNA of gastric cancer or colon cancer marker gene in a biological sample in order to diagnose gastric cancer or colorectal cancer, and can be known by measuring the amount of mRNA. . Analytical methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting (Northern) blotting) and DNA chips, but are not limited thereto.

유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, CDCA5 유전자의 핵산 서열이 NM_080668 (NCBI) 에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.Agents for measuring mRNA levels of genes are preferably primer pairs or probes, and since the nucleic acid sequence of the CDCA5 gene is identified in NM_080668 (NCBI), those skilled in the art will appreciate primers that specifically amplify specific regions of these genes based on the sequence. Alternatively, the probe can be designed.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 CDCA5 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 위암 또는 대장암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, which can form complementary templates and base pairs and is the starting point for template strand copying. It refers to a short nucleic acid sequence that functions as. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures. In the present invention, PCR amplification using sense and antisense primers of CDCA5 polynucleotide can be used to diagnose gastric cancer or colorectal cancer through the generation of desired products. The PCR conditions, the lengths of the sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art.

본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염 기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 CDCA5 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 위암 또는 대장암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.In the present invention, the term "probe" refers to nucleic acid fragments such as RNA or DNA, which may correspond to mRNA, which may be specifically short-term to hundreds of bases, which are capable of specific binding with mRNA. You can check it. The probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe. In the present invention, hybridization may be performed using a probe complementary to a CDCA5 polynucleotide, and gastric cancer or colorectal cancer may be diagnosed through hybridization. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.Primers or probes of the invention can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, "capping ", replacement of natural nucleotides with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers, such as methylphosphonate, Phosphoamidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 위암 또는 대장암 진단 마커 검출용 조성물은 CDCA5 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. According to a specific embodiment of the present invention, the composition for detecting gastric or colorectal cancer diagnostic markers includes respective primer pairs specific for the CDCA5 gene.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 위암 또는 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 위암 또는 대장암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "measurement of protein expression level" refers to a process of confirming the presence and degree of expression of a protein expressed in a gastric or colorectal marker gene in a biological sample to diagnose gastric or colorectal cancer. Specific amounts of the antibodies are used to determine the amount of protein. Analysis methods for this include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and rocket immunoelectrophoresis. , Tissue immunity staining, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation Assay), complement fixation assay (Complement Fixation Assay), FACS and protein chips (protein chip) and the like, but are not limited thereto.

단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. Agents for measuring protein levels are preferably antibodies.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 CDCA5에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.As used herein, the term "antibody" refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as it is known in the art. For the purposes of the present invention, an antibody means an antibody that specifically binds to CDCA5, a marker of the present invention, which is encoded by the marker gene by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method. Proteins can be obtained and prepared from conventional proteins by conventional methods. Also included are partial peptides that may be made from such proteins, and the partial peptides of the present invention include at least seven amino acids, preferably nine amino acids, more preferably twelve or more amino acids. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited and a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included as long as they are polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding. Furthermore, the antibody of this invention also contains special antibodies, such as a humanized antibody.

본 발명의 위암 또는 대장암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.Antibodies used in the detection of gastric or colorectal cancer diagnostic markers of the invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 위암 또는 대장암 진단용 조성물을 포함하는 위암 또는 대장암 진단용 키트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a kit for diagnosing gastric or colorectal cancer comprising the composition for diagnosing gastric or colorectal cancer.

본 발명의 키트는 위암 또는 대장암 진단 마커인 CDCA5 의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 위암 또는 대장암 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. The kit of the present invention can detect markers by confirming the expression level of mRNA or protein with the expression level of CDCA5, which is a gastric or colorectal cancer diagnostic marker. The marker detection kit of the present invention includes one or more other component compositions, solutions or solutions suitable for analytical methods as well as primers, probes or optionally antibodies that detect the expression level of a gastric or colorectal diagnostic marker. Device may be included.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 CDCA5의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정 량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.As a specific example, the kit for measuring the mRNA expression level of CDCA5 in the present invention may be a kit containing the necessary elements necessary to perform RT-PCR. RT-PCR kits, in addition to each primer pair specific for the marker gene, RT-PCR kits can be used in test tubes or other appropriate containers, reaction buffers (variable pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymers. Enzymes such as lyase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. It may also include primer pairs specific for the genes used as quantitative controls. Also preferably, the kit of the present invention may be a diagnostic kit including essential elements necessary for performing a DNA chip. The DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and a reagent, an agent, an enzyme, or the like for preparing a fluorescent probe. In addition, the substrate may comprise cDNA corresponding to the quantitative control gene or fragment thereof.

또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 CDCA5 의 단밸질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.As another specific example, the kit for measuring the protein expression level of CDCA5 in the present invention includes a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a chromophore or a fluorescent substance, a chromogenic substrate, and the like for immunological detection of the antibody. can do. The substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from polystyrene resin, a slide glass made of glass, etc. The coloring enzyme may be peroxidase, Alkaline Phosphatase may be used as the fluorescent substance, FITC, RITC or the like may be used as the fluorescent substance, and ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ) Or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethylbenzidine) can be used.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 위암 또는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 CDCA5 의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 위암 또는 대장암 마커 CDCA5 를 검출하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method for detecting gastric cancer or colorectal cancer marker CDCA5 by comparing the expression level of CDCA5 from a sample of a patient with the expression level of normal cells to provide information necessary for diagnosing gastric or colorectal cancer. will be.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. More specifically, the expression level of the gene can be detected at the mRNA level or the protein level, and separation of the mRNA or protein from the biological sample can be performed using known processes.

본 발명에서 용어 환자의 시료란 위암 또는 대장암 마커 유전자인 CDCA5 의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term patient's sample includes but is not limited to tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine, which differ in expression level of CDCA5, which is a gastric or colon cancer marker gene. Do not.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 위암 또는 대장암 의심환자에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 위암 또는 대장암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다. 즉, 위암 또는 대장암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 위암 또는 대장암으로 추정되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 위암 또는 대장암으로 추정되는 세포를 위암 또는 대장암으로 예측할 수 있는 것이다.Through the above detection methods, it is possible to diagnose whether a cancer patient is suspected of cancer or colorectal cancer by comparing the gene expression level in a normal control group with the gene expression level in a gastric cancer or colorectal cancer suspected patient. That is, after measuring the expression level of the marker of the present invention from cells suspected of gastric cancer or colorectal cancer, and comparing the two by measuring the expression level of the marker of the present invention from normal cells, the expression level of the marker of the present invention is normal. If more expression is derived from a cell suspected of gastric or colorectal cancer than that of a cell, a cell suspected of gastric or colorectal cancer can be predicted as gastric cancer or colorectal cancer.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 위암 또는 대장암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 위암 또는 대장암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의 한 발현량의 증가여부를 판단하여 위암 또는 대장암 의심 환자의 실제 위암 또는 대장암발병 여부를 진단할 수 있다. Analytical methods for measuring mRNA levels include, but are not limited to, reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, northern blotting, and DNA chip. Through the above detection methods, the mRNA expression level in the normal control group and the mRNA expression level in the suspected gastric cancer or colorectal cancer can be compared, and the significant expression level of the gastric cancer or colorectal cancer marker gene to the mRNA can be judged to determine whether the gastric cancer or Patients suspected of having colorectal cancer can be diagnosed with actual gastric or colorectal cancer.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 위암 또는 대장암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다. mRNA expression level measurement is preferably by using a reverse transcriptase polymerase reaction method or a DNA chip using a primer specific for the gene used as a gastric or colon cancer marker.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 위암 또는 대장암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 위암 또는 대장암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다. The reverse transcriptase polymerase reaction is electrophoresis after the reaction to confirm the band pattern and the thickness of the band to determine the mRNA expression and degree of genes used as diagnostic markers for gastric or colorectal cancer, and compared with the control, stomach cancer or Colon cancer can be diagnosed easily.

한편, DNA 칩은 상기 위암 또는 대장암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 위암 또는 대장암의 발병 여부를 판독할 수 있다. On the other hand, the DNA chip is a DNA chip in which the nucleic acid corresponding to the gastric cancer or colorectal cancer marker gene or fragment thereof is attached to a glass-like substrate with high density, and isolates the mRNA from the sample, and the end or the inside of the DNA chip as a fluorescent material Labeled cDNA probes can be prepared, hybridized to DNA chips and read for the development of gastric or colorectal cancer.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 위암 또는 대장암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형 성량을 비교할 수 있고, 위암 또는 대장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 위암 또는 대장암 의심 환자의 실제 위암 또는 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다. Analytical methods for measuring protein levels include Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, Protein chips and the like, but is not limited thereto. Through the above assay methods, the amount of antigen-antibody complex formation in the normal control group and the amount of antigen-antibody complex formation in suspected gastric or colorectal cancer patients can be compared, and the significance of the gastric or colorectal marker marker gene to the protein can be compared. By determining whether the amount of expression is increased, it is possible to diagnose whether the actual gastric or colorectal cancer of the patient suspected of stomach or colorectal cancer.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 위암 또는 대장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. In the present invention, the term antigen-antibody complex means a combination of gastric cancer or colorectal cancer marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of antigen-antibody complex formation is quantitatively measured through the magnitude of a signal of a detection label. It is possible.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로 젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.Such a detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not necessarily limited thereto. When enzymes are used as detection labels, available enzymes include β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholinese Therapies, glucose oxidase, hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphphenolpyruvate deca Carboxylase, β-latamase, and the like, but are not limited thereto. Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like. Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives. Emitters include, but are not limited to, acridinium esters, luciferin, luciferase, and the like. Microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like. Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ions, Cs ions, diimides, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K 4 W (CN) 8 , [Os (bpy) 3 ] 2 + , [RU (bpy) 3 ] 2+ , [MO (CN) 8 ] 4-, and the like. Radioisotopes include, but are not limited to, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re, and the like. .

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 위암 또는 대장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 위암 또는 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.Protein expression level measurement is preferably by using an ELISA method. ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support, attached to a solid support Direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the antibody-antigen complex, a labeled antibody that recognizes the antibody after reacting with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antigen with the antibody attached to the solid support Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using secondary antibodies. More preferably, the antibody is enzymatically developed by attaching the antibody to the solid support, reacting the sample, and then attaching a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex, or to an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex. It is detected by the sandwich ELISA method which attaches a labeled secondary antibody and enzymatically develops. The degree of complex formation of gastric or colorectal marker protein and antibody can be checked to determine whether gastric or colorectal cancer develops.

또한, 바람직하게는, 상기 위암 또는 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용 한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 위암 또는 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 위암 또는 대장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다. Also preferably, Western blot using at least one antibody against the gastric or colorectal cancer marker. The whole protein is separated from the sample, and the protein is separated according to size by electrophoresis, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. By checking the amount of the generated antigen-antibody complexes using labeled antibodies, the amount of protein produced by the expression of genes can be confirmed to determine whether cancer or colorectal cancer develops. The detection method consists of a method for examining the expression level of the marker gene in the control group and the expression level of the marker gene in cells with gastric or colorectal cancer. mRNA or protein levels can be expressed as absolute (eg μg / ml) or relative (eg relative intensity of signals) differences of the marker proteins described above.

또한, 바람직하게는, 상기 위암 또는 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 대장 상피 조직 및 위암 또는 대장암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.Also, preferably, immunohistostaining is performed using one or more antibodies against the gastric or colorectal cancer markers. After collecting and fixing normal colon epithelial tissue and tissue suspected of gastric or colon cancer, paraffin embedding blocks are prepared by methods well known in the art. These are cut into slices of several μm thickness, adhered to glass slides, and reacted with one of the above antibodies by a known method. The unreacted antibody is then washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels to read whether or not the antibody is labeled on a microscope.

또한, 바람직하게는, 상기 위암 또는 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 위암 또는 대장 암 발병 여부를 확인할 수 있다.In addition, preferably, one or more antibodies against the gastric or colorectal cancer markers are arranged at a predetermined position on the substrate to be immobilized at a high density. In the method of analyzing a sample using a protein chip, the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which is read to confirm the presence or expression level of the protein, You can check whether you have gastric or colorectal cancer.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 위암 또는 대장암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 CDCA5 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 위암 또는 대장암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.In another embodiment, the present invention comprises measuring the level of expression of the CDCA5 gene or the level of protein encoded by administration of a substance expected to be able to treat gastric or colorectal cancer. It relates to a screening method of.

구체적으로, 위암 또는 대장암 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 CDCA5의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 위암 또는 대장암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. CDCA5의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 위암 또는 대장암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 위암 또는 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에 위암 또는 대장암 세포에서의 본 발명의 마커 CDCA5의 발현 수준을 측정하고, 또한 위암 또는 대장암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 CDCA5의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 위암 또는 대장암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 위암 또는 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 위암 또는 대장암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.Specifically, it can be usefully used for screening gastric cancer or colorectal cancer therapeutic agents by a method of comparing the increase or decrease in the expression of CDCA5 in the presence and absence of a candidate for treating gastric or colorectal cancer. Substances that directly or indirectly reduce the concentration of CDCA5 can be selected as therapeutic agents for gastric or colorectal cancer. That is, the expression level of the marker CDCA5 of the present invention in gastric cancer or colorectal cancer cells in the absence of a candidate for gastric or colorectal cancer treatment is measured, and also the expression level of the marker CDCA5 of the present invention in the presence of a candidate for gastric or colorectal cancer treatment After comparing the two by measuring the above, the substance which reduces the expression level of the marker of the present invention in the presence of a candidate for treating gastric or colorectal cancer is lower than the marker expression level in the absence of the candidate for treating gastric or colorectal cancer. It can be predicted as a therapeutic agent.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 CDCA5 의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 암 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 암은, 바람직하게는 대장암, 폐암, 간암 또는 위암이다. 또한, 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 CDCA5의 mRNA에 대한 siRNA, shRNA 또는 CDCA5 의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열이다.In another aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating and preventing cancer comprising oligonucleotides that inhibit the expression of CDCA5. The cancer is preferably colon cancer, lung cancer, liver cancer or stomach cancer. Also preferably the oligonucleotide is an antisense oligonucleotide sequence complementary to siRNA, shRNA or CDCA5 mRNA for CDCA5 mRNA.

본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다.As used herein, the term "siRNA" refers to a short double-chain RNA capable of inducing RNA interference (RNAi) through the cleavage of a particular mRNA. A sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of the target gene, and an antisense RNA strand having a complementary sequence. Since siRNA can inhibit expression of a target gene, it can be provided as an efficient gene knockdown method or as a method of gene therapy.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요 는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.siRNAs are not limited to completely paired double-stranded RNA moieties paired with RNA, but paired by mismatches (the corresponding bases are not complementary), bulges (there are no bases corresponding to one chain), and the like. May be included. The total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, more preferably 20 to 70 bases. The siRNA terminal structure is capable of blunt or cohesive termini as long as it can inhibit the expression of the target gene by the RNAi effect. The adhesive end structure can be a structure having a 3 'end protruding structure and a 5' end protruding structure. The number of protruding bases is not limited. The siRNA may be a small RNA (for example, a natural RNA molecule such as a tRNA, a rRNA, or a viral RNA, or an artificial RNA molecule) at a protruding portion at one end within a range that can maintain the effect of suppressing the expression of a target gene, . ≪ / RTI > The siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure at both sides, and may be a step loop structure in which the terminal portion of the double-stranded RNA is connected by linker RNA.

본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다. 일양태로서, 본 발명에서는 siRNA로서 5'-GAC AUG ACU CUC CCU GGA ATT-3' 또는 5'-GCA GGG AGC UUA CUA AGG ATT-3'을 사용하였다.The siRNA used in the present invention is itself a complete form with polynucleotide pairing, that is, a form introduced into a cell through two transformation processes in which the siRNA is directly synthesized in vitro, or one form to have such a form after administration in vivo. Single-chain oligonucleotide fragments and their reverse complements may be derived from single-chain polynucleotides separated by spacers, for example siRNA expression vectors or PCR-derived siRNAs prepared to be expressed in cells The expression cassette may be in a form introduced into a cell through a transformation or infection process. The determination of how to prepare siRNAs and introduce them into cells or animals may depend on the objective and the cellular biological function of the target gene product. In one embodiment, 5′-GAC AUG ACU CUC CCU GGA ATT-3 ′ or 5′-GCA GGG AGC UUA CUA AGG ATT-3 ′ was used as siRNA in the present invention.

본 발명에서 사용되는 용어, "shRNA" 는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다. As used herein, the term "shRNA" is intended to overcome the disadvantages of high cost biosynthetic cost of siRNA, short term maintenance of RNA interference effect due to low cell transfection efficiency, The siRNA can be expressed by introducing it into a cell using a virus and plasmid expression vector system. The shRNA is converted into an siRNA having a correct structure by the siRNA processing enzyme (Dicer or Rnase Ⅲ) Is widely known.

본 발명에서 사용되는 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 CDCA5 mRNA에 상보적이고 CDCA5 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, CDCA5 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.As used herein, the term "antisense oligonucleotide" means a DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to a sequence of a particular mRNA, and binds to the complementary sequence in the mRNA to a protein There is a feature that inhibits translation. Antisense sequences of the present invention refer to DNA or RNA sequences that are complementary to CDCA5 mRNA and capable of binding to CDCA5 mRNA, and are responsible for translation, translocation, maturation, or any other overall biological function of CDCA5 mRNA. May inhibit essential activity. The length of the antisense oligonucleotide is 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, more preferably 10 to 40 bases.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.In the case of antisense RNA, it can be synthesized in vitro in a conventional manner and administered in vivo, or the antisense RNA can be synthesized in vivo. One example of the synthesis of antisense RNA in vitro is the use of RNA polymerase I. One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector in which the origin of the recognition site (MCS) is in the opposite direction. Such antisense RNA is desirable to ensure that there is a translation stop codon in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence.

본 발명의 조성물은 CDCA5의 siRNA 또는 CDCA5 안티센스 올리고뉴클레오티드의 1종 이상을 포함하는 외에, 환자의 암 세포의 증식을 억제시키는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또는 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자의 유입을 촉진시키는 제제, 예를 들어 리포좀(미국 특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,23,871 호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270호)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩타이드 독소 등이 있다.The composition of the present invention may comprise an additional substance that inhibits the proliferation of cancer cells of a patient, in addition to including at least one of siRNA or CDCA5 antisense oligonucleotides of CDCA5, or may be used to prevent influx of siRNA or antisense oligonucleotide molecules. Promoting agents, for example liposomes (US Pat. Nos. 4,897,355, 4,394,448, 4,23,871, 4,231,877, 4,224,179, 4,753,788, 4,673,567, 4,247,411, 4,814,270). Or lipophilic carriers of one of many sterols, including cholesterol, cholate and deoxycholic acid. Antisense oligonucleotides can also be conjugated to peptides that are taken up by the cell. Examples of useful peptides include peptide hormones, antigens or antibodies and peptide toxins.

구체적인 실시예에서, 본원 발명에서는 CDCA5 에 대한 siRNA 를 각종 암세포에 형질감염하여 세포 성장 억제 정도를 분석한 결과, 대장암 세포주 Colo205, HCT116, 폐암 세포주 A549, 간암세포주 Huh7, Snu387, 위암세포주 Snu638 의 성장 억제를 유발할 수 있으므로 CDCA5 유전자가 암 치료 타겟으로 활용 가능함을 제시하였다 (도 10). In a specific embodiment, in the present invention, the growth of the colorectal cancer cell lines Colo205, HCT116, lung cancer cell line A549, liver cancer cell lines Huh7, Snu387, gastric cancer cell line Snu638 as a result of analyzing the cell growth inhibition level by transfecting various cancer cells siRNA against CDCA5 It was suggested that the CDCA5 gene could be used as a cancer therapeutic target because it may cause inhibition (FIG. 10).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 CDCA5 의 활성을 억제하는 CDCA5 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 암은, 바람직하게는 대장암, 폐암, 간암 또는 위암이다. As another aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating and preventing cancer, comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof specific for CDCA5 protein that inhibits CDCA5 activity. The cancer is preferably colon cancer, lung cancer, liver cancer or stomach cancer.

이러한 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. Such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies or antigen binding, some of which are included in the antibodies of the invention and all immunoglobulin antibodies. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies, and may include antibodies already known in the art in addition to novel antibodies.

상기 항체는 CDCA5 을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기 능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.Such antibodies include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having the full length of two heavy and two light chains, as long as they have the property of binding specifically to recognize CDCA5. The functional fragment of the molecule of an antibody means the fragment which has at least an antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 , Fv, etc.

본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법 또는 화학 요법(세포 성장 정지 또는 세포 독성 물질, 항생 물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제, 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 텔로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자 수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합체, 토포이소머라제Ⅰ 억제제, 토포이소머라제 Ⅱ 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.The compositions of the present invention can be used alone, but radiation therapy or chemotherapy (cell growth arrest or cytotoxic substances, antibiotic-like substances, alkylating agents, anti-metabolic substances, hormonal agents, immunizing agents, interferon type) to increase the treatment efficiency Substances, cyclooxygenase inhibitors, metallomatrix protease inhibitors, telomerase inhibitors, tyrosine kinase inhibitors, anti-growth factor receptor substances, anti-HER substances, anti-EGFR substances, anti-angiogenic substances, farnesyl transferase inhibitors , ras-raf signal conduction pathway inhibitors, cell cycle inhibitors, other cdk inhibitors, tubulin conjugates, topoisomerase I inhibitors, topoisomerase II inhibitors, etc.).

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있고, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.The composition of the present invention may be administered with a pharmaceutically acceptable carrier, and when used orally, a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a pigment, a perfume, and the like may be used. In the case of injections, buffers, preservatives, analgesic agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used. For topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used. Formulations of the compositions of the present invention may be prepared in a variety of ways by mixing with pharmaceutically acceptable carriers as described above. For example, in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, they may be prepared in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms.

본 발명에서 사용되는 용어, 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.As used herein, the term administration refers to introducing a composition of the invention to a patient in any suitable manner, and the route of administration of the composition of the invention may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue. have. Oral administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, intranasal administration, intraperitoneal administration, intradural administration, but are not limited thereto. Do not.

본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The range of effective dosages of the compositions of the present invention may range from sex, body surface area, type and severity of disease, age, sensitivity to drugs, route of administration and rate of release, time of administration, duration of treatment, target cells, expression levels, etc. It may vary according to various well-known factors, and can be easily determined by those skilled in the art.

본 발명은 위암 또는 대장암의 전이 및 예후를 판단할 수 있는 진단 마커를 발굴하고 제공함으로써, 위암 또는 대장암의 치료 및 예후관리에 유용한 자료의 지표로 사용될 수 있는 효과를 기대한다. 본 발명에 따른 위암 또는 대장암 마커 CDCA5를 사용하면 위암 또는 대장암의 유무를 정확하고 손쉽게 측정할 수 있으며, 위암 또는 대장암 특이적 항암제 개발연구에 있어 특정 타겟으로 활용할 수 있고, 나아가 위암 또는 대장암의 종양 형성의 연구에 활용될 수 있고, 간암의 조기 진단에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 따른 CDCA5의 발현 또 는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 조성물은 CDCA5의 발현 또는 활성을 억제함으로써 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention is expected to find an effect that can be used as an index of data useful for the treatment and prognosis of gastric cancer or colorectal cancer by discovering and providing a diagnostic marker that can determine the metastasis and prognosis of gastric cancer or colorectal cancer. Using the gastric cancer or colorectal cancer marker CDCA5 according to the present invention can accurately and easily determine the presence or absence of gastric cancer or colorectal cancer, can be used as a specific target in the development of gastric cancer or colorectal cancer-specific anticancer drugs, furthermore, It can be used for the study of tumor formation of cancer and is expected to contribute to the early diagnosis of liver cancer. In addition, the composition comprising a substance that inhibits the expression or activity of CDCA5 according to the present invention can be usefully used for the prevention and treatment of cancer by inhibiting the expression or activity of CDCA5.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1.  One. DNADNA 칩을 이용한 위암 과발현 유전자 발굴 Discovery of Genes Overexpressing Gastric Cancer Using Chips

정정상 위 상피세포 또는 정상 대장 상피세포에 비하여 위암 또는 대장암 세포에서만 특이적으로 과발현하는 유전자를 1차적으로 추출하고자 DNA 칩(일루미나에서 판매하는 48K 사람 마이크로어레이)을 이용하여 2,230개의 유전자에 대하여 그 발현도를 조사하였다.2,230 genes were extracted using a DNA chip (48K human microarray sold by Illumina) to primarily extract genes specifically overexpressed in gastric or colorectal cancer cells compared to normal gastric or normal colon epithelial cells. The expression level was examined.

우선, 정상 위 상피세포, 정상 대장 상피세포 및 위암 세포, 대장암 세포에서 total RNA를 추출하였다. total RNA의 추출은 RNeasy Mini Kit (QIAGEN사)를 이용하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 하이브리드화를 위해 상기 추출된 total RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion사)을 이용하였다. T7 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, 비오틴-UTP를 이용하여 인비트로 전사(in vitro transcription)를 실시하여 비오틴-표지된 cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 나노드롭을 이용하여 정량하였다. 정상 위 상피세포 및 위암 세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2 (Illumina사) 칩에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System Wash Buffer (Illumina사)를 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 스트렙타비딘-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너 (Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 quantile 기능을 이용하여 보정하였다.First, total RNA was extracted from normal gastric epithelial cells, normal colon epithelial cells and gastric cancer cells, and colon cancer cells. Total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (QIAGEN) and quantified using Experion RNA StdSens (Bio-Rad) chip. The total RNA extracted for hybridization was used with Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion). CDNA was synthesized using T7 oligo (dT) primers and in vitro transcribed using biotin-UTP. In vitro transcription was performed to prepare biotin-labeled cRNA. The prepared cRNA was quantified using nanodrop. CRNAs prepared from normal gastric epithelial and gastric cancer cells were hybridized to a Human-6 V2 (Illumina) chip. To remove nonspecific hybridization after hybridization, DNA chips were washed using Illumina Gene Expression System Wash Buffer (Illumina), and the washed DNA chips were labeled with streptavidin-Cy3 (Amersham) fluorescent dye. Fluorescently labeled DNA chips were scanned using a confocal laser scanner (Illumina) to obtain data of fluorescence present in each spot and stored as image files in TIFF format. TIFF image files were quantified with BeadStudio version 3 (Illumina) to quantify the fluorescence values of each spot. Quantified results were corrected using the quantile function with the Avadis Prophetic version 3.3 (Strand Genomics) program.

상기의 과정으로 얻어진 1,601개의 유전자 발현 정도 분석을 통하여 정상 위 상피세포와 위암 세포의 유전자 발현 양상을 비교 분석하였다. 이 때 군집화 분석(hierarchical clustering analysis)를 이용하였으며, 그 결과, 정상 위 상피세포(또는 정상 대장 상피세포)와 위암 세포(또는 대장암 세포)는 크게 두 개의 군집으로 나누어지는 것을 알 수 있었다(도 1).Gene expression patterns of normal gastric epithelial cells and gastric cancer cells were compared and analyzed by analyzing the expression levels of 1,601 genes obtained by the above process. At this time, hierarchical clustering analysis was used, and as a result, it was found that normal gastric epithelial cells (or normal colon epithelial cells) and gastric cancer cells (or colon cancer cells) are largely divided into two clusters (FIG. One).

또한, 정상 및 위 상피세포, 대장암 상피세포와 비교하여 60% 이상의 환자에서 2배 이상의 발현차이를 나타내는 유전자들을 발견할 수 있었는데(도 2), 이중 과발현과 저발현이 각각 281개 및 605개였으며, 대장암, 유방암, 췌장암에서도 동일한 유전자들의 발현을 비교한 결과, 위암 또는 대장암에서만 특이적으로 발현되는 유전자들을 최종 선발할 수 있었다(도 3 내지 도 5). 도 3 및 도 4는 마이크로 어레이 결과를 가지고 공개되어있는 여러 데이터 셋트를 비교분석(data mining)한 결과이다.In addition, genes showing more than two-fold differences in expression were found in more than 60% of patients compared with normal and gastric epithelial cells and colorectal cancer epithelial cells (FIG. 2), with 281 and 605 double overexpression and low expression, respectively. As a result of comparing the expression of the same genes in colorectal cancer, breast cancer, and pancreatic cancer, genes specifically expressed only in gastric cancer or colorectal cancer were finally selected (FIGS. 3 to 5). 3 and 4 show the results of data mining of several published data sets with microarray results.

실시예Example 2. 조직 및 세포에서의  2. in tissues and cells mRNAmRNA 분리 detach

역전사 중합효소 반응을 위하여 5명의 위암 또는 20명의 대장암 환자로부터 위 정상 상피세포 조직과 위암 또는 대장암 세포조직을 적출하여 총 10개의 조직 및 총 40개의 대장암 조직에서 mRNA를 분리하였다. 우선, 외과적 절제술로 적출된 조직들은 적출 즉시 멸균된 인산완충 식염수에서 혈액을 제거한후, 액화질소로 동결하였다. 이후, 구아니디움 법(Guanidinium Method)에 의하여 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리(Single-Step RNA Isolation)를 수행하였다. 상기와 같이 분리한 총 RNA는 스팩트로포토메터를 사용하여 정량한 후, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.For reverse transcriptase reaction, gastric normal epithelial tissue and gastric or colorectal cancer tissue were extracted from 5 gastric cancer or 20 colorectal cancer patients, and mRNA was isolated from 10 tissues and 40 colorectal cancer tissues. First, the tissues removed by surgical excision removed blood from sterile phosphate-buffered saline immediately after extraction and were frozen with liquid nitrogen. Thereafter, total RNA was isolated and single-step RNA isolation was performed by the Guaniidinium Method. Total RNA isolated as described above was quantified using a spectrophotometer, and stored in a -70 ℃ freezer until use.

위암 세포 7개 (SNU1, SNU16, SNU216, SNU484, SNU620, SNU638, AGS), 대장암 세포주 10개(Lane 1, DLD-1; Lane 2, HT29; Lane 3, HCT116; Lane 4, colo205; Lane 5, SW480; Lane 6, SW620; Lane 7, SNU C1; Lane 8, SNU C2A; Lane 9,KM 12C Lane 10, KM 12SM;) 및 정상세포인 (Lane 11, HS 683st.)를 선정하여 대한민국 서울시 종로구 연건동 28번지 소재 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받았다. 각각의 최적 배양배지인 DMEM(Invitrogen 사) 또는 RPMI1640(Invitrogen 사) 배지에 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclon사) 및 페니실린/스트렙토마이신(1mg/ml Penicillin/ Streptomycin, Sigma 사) 5-6 일간 배양시킨 후, 상기의 조직에서와 동일한 방법으로 구아니디움(Guanidinium Method)에 의해 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리를 수행하였다. 분리된 RNA는 상기와 같이 스팩트로포토메터를 사용하여 정량하였고, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에서 보관하였다.7 gastric cancer cells (SNU1, SNU16, SNU216, SNU484, SNU620, SNU638, AGS), 10 colon cancer cell lines (Lane 1, DLD-1; Lane 2, HT29; Lane 3, HCT116; Lane 4, colo205; Lane 5 , SW480; Lane 6, SW620; Lane 7, SNU C1; Lane 8, SNU C2A; Lane 9, KM 12C Lane 10, KM 12SM;) and normal cells (Lane 11, HS 683st.) It was sold by the Korean Cell Line Bank (KCLB) at 28 Yeon Gun-dong. 10% Fetal Bovine Serum (Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclon) and Penicillin / Streptomycin (1mg / ml Penicillin / Streptomycin, Sigma) in DMEM (Invitrogen) or RPMI1640 (Invitrogen) medium ) After incubation for 5-6 days, total RNA was isolated and single-step RNA was isolated by Guaniidinium Method in the same manner as in the above tissues. The isolated RNA was quantified using a spectrophotometer as described above, and stored in a -70 ℃ freezer until use.

실시예Example 3.  3. 역전사Reverse transcription 중합효소반응 및 실시간 중합효소반응을 이용한 유전자 발현 비교 Comparison of Gene Expression Using Polymerase Reaction and Real-Time Polymerase Reaction

상기 실시예 1의 결과 선발된 위암 또는 대장암 특이 과발현 유전자들 중에서 1개를 선정하여(데이터 마이닝) 중합효소 반응을 실시하였다.As a result of Example 1, one of the selected gastric or colorectal specific overexpression genes was selected (data mining) and subjected to a polymerase reaction.

프라이머의 제작을 위하여 각 유전자들의 전체 DNA 염기 서열을 NCBI의 CoreNucleotide(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻었으며, Primer3 프로그램을 통하여 이들 유전자들의 프라이머 서열을 디자인하였다. 상기와 같이 디자인된 프라이머를 이용하여, 중합효소 반응을 실시하여 각각의 유전자들의 발현 정도를 확인하였다(도 6 내지 도 9, 및 도 11). 각각의 프라이머 서열은 표 2와 같다.For the preparation of primers, the complete DNA sequence of each gene was obtained from NCBI's CoreNucleotide (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), and primer sequences of these genes were designed through the Primer3 program. Using the primers designed as described above, the degree of expression of each gene was confirmed by performing a polymerase reaction (FIGS. 6 to 9 and 11). Each primer sequence is shown in Table 2.

올리고 명Uploaded people 결과물의 크기(bp)Size of output (bp) 서열order 1
One
CDCA5-<L>CDCA5- <L> 375 bp375 bp ACG CCA GAG ACT TGG AAA TGACG CCA GAG ACT TGG AAA TG CDCA5-<R>CDCA5- <R> TGC ATC TCA TTC AAC CAG GATGC ATC TCA TTC AAC CAG GA

역전사 효소반응을 위하여 상기 실시예 2의 조직 및 세포주에서 추출한 mRNA로부터 역전사 반응을 통해 만든 cDNA를 제작하였다. cDNA제작은 AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE)를 이용하여 수행하였고, 상기의 반응 결과로 얻은 cDNA와 표 2의 프라이머들을 사용하여 역전사효소 반응 및 실시간 중합효소반응을 사용하였다. For reverse transcriptase reaction, cDNA prepared by reverse transcriptase was prepared from mRNA extracted from the tissue and cell line of Example 2. cDNA production was carried out using AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE), and the reverse transcriptase reaction and real-time polymerase reaction were performed using the cDNA obtained from the above reaction and the primers of Table 2.

역전사 중합효소반응 결과, 도 6과 같이 정상 위 조직와 위암 조직 간의 발현의 차이를 확인할 수 있었고, 도 7 에서와 같이 위암 세포주에서의 발현도 확인할 수 있었다. 또한, 도 8에서와 같이 정상 조직와 대장암 조직 간의 발현의 차이를 확인할 수 있었고, 도 11에서와 같이 대장암 세포주에서의 발현도 확인할 수 있었다. 또한, 실시간 중합효소반응 결과 도 9에서와 같이 정상 조직에 비하여 위암 및 대장암 조직에서 CDCA5 가 뚜렷하게 높게 발현함을 알 수 있었다.As a result of the reverse transcriptase reaction, as shown in FIG. 6, the difference in expression between normal gastric tissue and gastric cancer tissue was confirmed, and as shown in FIG. 7, expression in gastric cancer cell lines was also confirmed. In addition, as shown in FIG. 8, the difference in expression between normal tissue and colorectal cancer tissue was confirmed, and as in FIG. 11, expression in colorectal cancer cell lines was also confirmed. In addition, as a result of the real-time polymerase reaction as shown in Figure 9 it can be seen that the expression of CDCA5 is significantly higher in the gastric cancer and colorectal cancer tissue than the normal tissue.

실시예Example 4.  4. 암세포주로의Cancer cell lines CDCA5CDCA5 의 of siRNAsiRNA 도입에 따른 암세포주의 성장 억제 확인  Confirmation of growth inhibition of cancer cell line following introduction

암세포 조직 또는 암세포주에서 다량 발현되는 유전자의 경우 siRNA 기법을 통해 유전자 발현을 억제하여 세포의 증식 속도에 변화가 있는지를 관찰할 수 있다. 이에 본 발명에서는 CDCA5에 대한 siRNA를 디자인하여 각종 암세포에 도입한 후 해당유전자 mRNA 발현 저하에 따른 암세포주의 성장 속도의 변화를 관찰하였다. In the case of genes that are expressed in large amounts in cancer cell tissues or cancer cell lines, siRNA techniques can be used to observe whether there is a change in cell proliferation rate by inhibiting gene expression. In the present invention, the siRNA for CDCA5 was designed and introduced into various cancer cells, and the growth rate of the cancer cell line was observed according to the decrease in the expression of the corresponding gene mRNA.

먼저 CDCA5 및 scrambled의 siRNA를 삼천리 제약에서 2종류를 디자인하여 합성하였다 (1: GAC AUG ACU CUC CCU GGA ATT, 2: GCA GGG AGC UUA CUA AGG ATT). 합성된 siRNA는 유전자 염기서열을 바탕으로 디자인된 19개 올리고뉴클레오타이드의 이중 리보핵산쇄에 단쇄의 2 염기가 매달린 구조로 이루어져 있다. scrambled siRNA는 세포의 증식에 아무 영향을 미치지 않는 siRNA 실험의 음성 대조군으로 사용되었다. First, two kinds of siRNAs of CDCA5 and scrambled were designed and synthesized in Samchully Pharmaceutical (1: GAC AUG ACU CUC CCU GGA ATT, 2: GCA GGG AGC UUA CUA AGG ATT). The synthesized siRNA consists of a structure in which two bases of a single chain are suspended in a double ribonucleic acid chain of 19 oligonucleotides designed based on gene sequences. Scrambled siRNA was used as a negative control for siRNA experiments that had no effect on cell proliferation.

각종 암세포를 70% 컨플루언시로 배양 후 K-Max 방법으로 상기 siRNA 및 대조군 scrambled siRNA를 세포 내에 도입하여 72시간 동안 배양하며 형질 전환하였다. 각 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하여 해당 유전자 mRNA가 감소되었음을 확인하고 siRNA에 의한 유전자 발현 억제가 이루어졌음을 확인하였다. NT는 siRNA를 처리하지 않은 세포에서의 유전자 발현양을 나타내고, scrambled는 타겟하는 부분이 없는 것을 보여준다. Various cancer cells were cultured in 70% confluency and then transformed by incorporating the siRNA and the control scrambled siRNA into the cells by incubation for 72 hours by K-Max method. RT-PCR was performed by RNA extraction from each cell to confirm that the gene mRNA was reduced, and that the gene expression was suppressed by siRNA. NT represents the amount of gene expression in cells not treated with siRNA, and scrambled shows no target portion.

대장암 세포주 Colo205 (서울대 세포주은행), HCT116 (서울대 세포주은행), 폐암 세포주 A549, 간암세포주 Huh7(전남대학교 김대곤 박사에게서 분양), Snu387(서울대 세포주은행), 위암세포주 Snu638, 자궁경부암 Hela를 70% 컨플루언시로 배양 후 K-Max 방법으로 상기 siRNA 및 대조군 scrambled siRNA를 세포 내에 도입하여 72시간 동안 배양하며 siRNA에 의한 세포의 성장 억제 정도도 조사하였다. 각 세포를 SRB (Sulfur rhodamine, Sigma Co.)로 염색하고 현미경을 통해 세포 성장에 큰 변화가 없는 콘트롤인 scrambled siRNA를 처리한 세포주를 기준으로, SRB 분석하여 해당 유전자 siRNA를 도입한 세포의 성장 억제 정도를 비교하였다. 대부분의 암 세포주에서 CDCA5의 유전자 발현 억제가 세포 성장 억제를 유도하였다. 위 실험 결과, CDCA5유전자의 siRNA 처리를 통해 대장암 세포주 및 폐암, 간암 세포주의 성장 억제를 유발할 수 있으므로 CDCA5 유전자가 암 치료 타겟으로 활용 가능함을 제시하였다 (도 10). Colorectal cancer cell lines Colo205 (Seoul National University Cell Line Bank), HCT116 (Seoul National University Cell Line Bank), lung cancer cell line A549, liver cancer cell line Huh7 (pre-distribution from Chonnam National University), Snu387 (Seoul National University Cell Line Bank), gastric cancer cell line Snu638, cervical cancer Hela 70% After incubation with confluency, the siRNA and the control scrambled siRNA were introduced into the cells by the K-Max method, cultured for 72 hours, and the degree of growth inhibition of the cells by siRNA was also investigated. Each cell was stained with SRB (Sulfur rhodamine, Sigma Co.) and treated with scrambled siRNA, a control with no significant change in cell growth under a microscope. The degree was compared. In most cancer cell lines, inhibition of gene expression of CDCA5 induced cell growth inhibition. As a result of the above experiment, it was suggested that the CDCA5 gene can be used as a cancer treatment target because it can induce growth inhibition of colorectal cancer cell line, lung cancer and liver cancer cell line through siRNA treatment of CDCA5 gene (FIG. 10).

실시예 5. 면역조직 화학염색법을 통한 CDCA5 단백질의 검출 Example 5 Detection of CDCA5 Proteins by Immunohistochemical Staining

대장암 조직에서의 CDCA5 의 발현정도를 조사하기 위하여 면역조직 화학염색법을 실시하였다. 환자로부터 얻은 대장암 조직의 파라핀 절편에서 자일렌을 이용하여 파라핀을 제거하고 알코올을 이용하여 수화시킨 후 10 mM 시트르산염 완충액 (pH 6.0)에 넣어 5 분씩 3 회에 걸쳐 극초단파를 투사하였다. Immunohistochemical staining was performed to investigate the expression level of CDCA5 in colorectal cancer tissues. Paraffin sections from colon cancer tissues obtained from patients were removed with xylene, hydrated with alcohol, and then placed in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) to project microwaves three times for 5 minutes.

다음으로 3% 과산화수소가 들어있는 메탄올을 6분 동안 처리하여 내부에서 발생되는 퍼옥시다제 활성을 억제한 후에 비특이적인 단백질의 결합을 방지하기 위하여 Vector kit (Cat No. PK 6102)에 있는 작업(working) 용액을 30 분 동안 처리하여 차단하였다. 1X PBS에 희석된 CDCA5 IgG 항체를 상온에서 2시간동안 반응시킨 후 바이오티닐화된 항-마우스 Ig Ab (Vector kit)를 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. Next, working in the Vector kit (Cat No. PK 6102) to prevent the binding of nonspecific proteins after suppressing the internally generated peroxidase activity by treating methanol containing 3% hydrogen peroxide for 6 minutes. ) Solution was blocked for 30 minutes. After reacting the CDCA5 IgG antibody diluted in 1X PBS for 2 hours at room temperature, biotinylated anti-mouse Ig Ab (Vector kit) was reacted for 30 minutes at room temperature.

다음으로 ABC Elite kit (Vector kit)을 상온에서 30 분 동안 반응시킨 후 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 기질 (Vector kit)을 2분 동안 반응시켜 대장암 조직에서 CDCA5의 발현정도를 확인결과, 대장암 조직에서 CDCA5 의 발현이 높다는 것을 확인할 수 있었다 (도 12). Next, after reacting ABC Elite kit (Vector kit) for 30 minutes at room temperature, the reaction of diaminobenzidine tetrahydrochloride substrate (Vector kit) for 2 minutes to confirm the expression level of CDCA5 in colorectal cancer tissue, colorectal cancer tissue It was confirmed that the expression of CDCA5 is high (Fig. 12).

도 1은 48K 인간 마이크로 어레이 칩(Illumina사)을 사용하여 정상 위 조직과 위암 또는 대장암 조직에서의 유전자 발현을 비교한 결과이다. 1 is a result of comparing gene expression in normal gastric tissue and gastric cancer or colorectal cancer tissue using a 48K human micro array chip (Illumina).

도 2는 48K 인간 마이크로 어레이 칩(Illumina사) 분석 결과를 토대로 (a) 위암 또는 (b) 대장암 세포에서 특이적으로 과발현되는 유전자를 도표화한 것이다. FIG. 2 is a diagram of genes specifically overexpressed in (a) gastric cancer or (b) colorectal cancer cells based on 48K human micro array chip (Illumina) analysis results.

도 3은 위암과 관련한 CDCA5 유전자의 데이터 마이닝(data mining) 결과이다. 3 shows data mining results of the CDCA5 gene associated with gastric cancer.

도 4는 대장암과 관련한 CDCA5 유전자의 데이터 마이닝(data mining) 결과이다. 4 shows data mining results of the CDCA5 gene associated with colorectal cancer.

도 5는 위암, 대장암, 유방암, 전립선암 및 간암에서 동일한 유전자를 대상으로 DNA 칩 결과를 가지고, 데이터 마이닝을 하여 그 발현을 비교한 결과이다. FIG. 5 shows DNA chip results of the same genes in gastric cancer, colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer and liver cancer, and compares their expressions by data mining.

도 6은 CDCA5 유전자의 역전사 중합효소반응을 이용한 정상조직과 위암 조직에서의 CDCA5 의 발현 정도를 확인한 전기영동 사진으로서, 홀수 레인은 정상조직에서의 각 유전자의 발현 수준을, 짝수 레인에서는 암 조직에서의 각 유전자의 발현 수준을 나타낸다. FIG. 6 is an electrophoretic photograph confirming the expression level of CDCA5 in normal tissue and gastric cancer tissue using reverse transcriptase polymerase reaction of CDCA5 gene. In odd lanes, the expression level of each gene in normal tissues, Represents the expression level of each gene.

도 7은 7종의 위암 세포주(Lane 1, SNU1; Lane 2, SNU16; Lane 3, SNU216; Lane 4, SNU484; Lane 5, SNU620; Lane 6, SNU638; Lane 7, AGS) 및 정상세포(Lane 8, Hs.683)에서 본 발명의 위암 진단 마커의 발현정도를 역전사 중합효소반응을 통하여 나타낸 그림이다.7 shows seven gastric cancer cell lines (Lane 1, SNU1; Lane 2, SNU16; Lane 3, SNU216; Lane 4, SNU484; Lane 5, SNU620; Lane 6, SNU638; Lane 7, AGS) and normal cells (Lane 8). , Hs.683) shows the expression level of the gastric cancer diagnostic marker of the present invention through reverse transcriptase.

도 8은 CDCA5 유전자의 역전사 중합효소반응을 이용한 정상조직과 대장암 조 직에서의 CDCA5 의 발현 정도를 확인한 전기영동 사진으로서, 홀수 레인은 정상조직에서의 각 유전자의 발현 수준을, 짝수 레인에서는 암 조직에서의 각 유전자의 발현 수준을 나타낸다. FIG. 8 is an electrophoretic photograph confirming the expression level of CDCA5 in normal tissue and colorectal cancer tissue using reverse transcriptase polymerase reaction of CDCA5 gene, with odd lanes representing expression levels of each gene in normal tissues, and cancers in even lanes. The expression level of each gene in the tissue is shown.

도 9는 CDCA5 유전자의 실시간 중합효소반응을 이용한 정상조직과 (a) 위암 조직 및 (b) 대장암 조직에서의 CDCA5 의 발현 정도를 상대적으로 비교한 그래프이다.Figure 9 is a graph comparing the expression level of CDCA5 in normal tissues (a) gastric cancer tissue and (b) colorectal cancer tissue using real-time polymerase reaction of the CDCA5 gene.

도 10은 암세포주로의 CDCA5의 siRNA 도입에 따른 암세포주의 성장 억제 확인한 결과이다.10 is a result of confirming the growth inhibition of the cancer cell line according to the siRNA introduction of CDCA5 into the cancer cell line.

도 11은 10종의 대장암 세포주(Lane 1, DLD-1; Lane 2, HT29; Lane 3, HCT116; Lane 4, colo205; Lane 5, SW480; Lane 6, SW620; Lane 7, SNU C1; Lane 8, SNU C2A; Lane 9,KM 12C Lane 10, KM 12SM) 및 정상세포(Lane 11, Hs.683.st)에서 본 발명의 대장암 진단 마커의 발현정도를 역전사 중합효소반응을 통하여 나타낸 그림이다.11 shows 10 colon cancer cell lines (Lane 1, DLD-1; Lane 2, HT29; Lane 3, HCT116; Lane 4, colo205; Lane 5, SW480; Lane 6, SW620; Lane 7, SNU C1; Lane 8). , SNU C2A; Lane 9, KM 12C Lane 10, KM 12SM) and normal cells (Lane 11, Hs. 683.st) show the expression level of the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention by reverse transcriptase polymerase reaction.

도 12는 CDCA5 에 특이적인 항체를 이용하여 대장암 조직과 정상조직에서의 면역조직염색법을 이용하여 대장암 조직에서 CDCA5 가 특이적으로 많이 발현하고 있음을 나타낸 그림이다.FIG. 12 shows that CDCA5 is specifically expressed in colorectal cancer tissues using immunohistostaining in colorectal cancer tissues and normal tissues using CDCA5 specific antibodies.

Claims (18)

CDCA5(cell division cycle associated 5), ATAD2 (ATPase family, AAA domain containing 2) 및 ASB9 (ankyrin repeat and SOS box-containing 9) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물. For diagnosing colorectal cancer, which comprises an agent measuring the expression level of mRNA of the cell division cycle associated 5 (CDCA5), ATAD2 (ATPase family, AAA domain containing 2) and ASB9 (ankyrin repeat and SOS box-containing 9) genes or proteins thereof Composition. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 CDCA5, ATAD2 및 ASB9 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물. According to claim 1, wherein the agent for measuring the expression level of the gene mRNA composition for diagnosing colorectal cancer comprising a primer specifically binding to the CDCA5, ATAD2 and ASB9 gene. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 CDCA5, ATAD2 및 ASB9 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물. The composition for diagnosing colorectal cancer according to claim 1, wherein the agent for measuring the expression level of the gene mRNA comprises a probe that specifically binds CDCA5, ATAD2 and ASB9 genes. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 CDCA5, ATAD2 및 ASB9 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물. The composition for diagnosing colorectal cancer according to claim 1, wherein the agent for measuring the expression level of the protein comprises an antibody specific for CDCA5, ATAD2 and ASB9 proteins. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트. A kit for diagnosing colorectal cancer, comprising the composition of claim 1. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 키트. The kit for diagnosing colorectal cancer according to claim 5, wherein the kit is an RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit. 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대장암이 의심되는 환자의 시료로부터 CDCA5, ATAD2 및 ASB9 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 마커 CDCA5, ATAD2 및 ASB9를 검출하는 방법.Measuring the level of expression of the CDCA5, ATAD2 and ASB9 genes or the levels of the proteins encoded by the samples from patients suspected of having colorectal cancer to provide information necessary for diagnosing colorectal cancer; And comparing the expression level of the gene or the level of the protein encoded by the gene with the expression level or protein level of the corresponding gene in the normal control sample. 제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것인 방법. 8. The method of claim 7, wherein the expression level of the gene measures the mRNA expression level of the gene. 제8항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 방법. The method of claim 8, wherein the method of measuring mRNA levels is by reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting or DNA chip. 제9항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 프라이머를 이용한 역전사효소 중합반응에 의한 것인 방법. The method of claim 9, wherein the mRNA expression level is measured by reverse transcriptase polymerization using a primer. 제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 방법.8. The method of claim 7, wherein the protein expression level uses an antibody specific for that protein. 제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.The method of claim 7, wherein the method for measuring protein expression level is Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement Any one of a fixed assay, FACS or protein chip method. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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