KR101151795B1 - 관절염에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 관절염 진단 - Google Patents

Abstract

본 발명은 관절염 진단 또는 예후 분석용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명에서의 ECRG 4는 관절염에 대한 마커로서의 정확성 및 신뢰도가 크게 개선된 마커이다. 또한, 본 발명은 관절염 환자의 조직 또는 세포에서만 특이적으로 발현이 감소되는 ECRG 4를 이용하여 생물학적 시료(예컨대, 연골세포 또는 조직)로부터 매우 특이적으로 관절염의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

Description

관절염에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 관절염 진단{Biomarkers Indicative of Arthritis and Diagnosis Using the Same}

본 발명에 관절염에 특이적인 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.

관절염 환자 수는 미국의 경우 4,300만 명이 넘으며, 전 세계적으로 퇴행성관절염은 장애의 주원인으로서 여성에서는 4번째, 남성에서는 8번째의 순위를 차지하였다. 국내에서도 무릎의 관절질환은 정형외과 질환 중 단일 질환으로 외래 환자 보험 청구의 1순위를 차지하며, 외래 환자 요양 급여 총 비용의 1.3%를 차지하였다. 이를 치료하는데 소요되는 치료비와 질병에 걸림으로써 일을 못하게 되어 발생하는 손실을 추정할 때 매년 640억불 이상의 비용이 관절 연골 손상 혹은 질환으로 인하여 지출되고 있다.

우리나라에서는 방사선 소견상 55세 이상에서 80%, 70세 이상에서는 거의 전인구가 퇴행성관절염을 나타내는 대표적 퇴행성 질환이다. 발생빈도가 지속적으로 증가하고 있는 관절염의 시장규모는 세계적으로 2000년 약 95억 달러 규모이며 연 평균 14% 가량 성장하고 2005년 200억 달러 및 2010년에는 약 350억 달러의 규모가 예상되었으며, 국내시장의 경우 2009년에 약 4000억원으로 추정되었다. 이러한 추세는 향후 노령 인구와 스포츠 활동의 증가에 따른 퇴행성관절염과 외상으로 인한 연골 손상의 증가로 인하여 가속화될 것으로 추정되었다. 향후 10년 후 65세 이상의 노인인구가 전 세계인의 16.3%에 이를 것으로 전망되며 이러한 고령화로 인한 질병과 산업 및 자연 재해로 인하여 새로운 제약/세포/조직/장기가 계속 요구된다. 특히 근골격계의 기능 장애는 삶의 질을 심각하게 저하시킬 뿐만 아니라 개인 및 국가 경제의 손실과 직결된다.

연골조직의 파괴는 점진적이고 비가역적으로 일어나 삶의 질을 떨어뜨리는 난치성 질환인 관절염의 직접적인 원인이다. 여가 활동의 증가와 고령 인구의 증가로 인해 관절염의 치료법에 대한 중요성이 부각되고 있으나 아직 그 병리적 원인이나 근본적인 치료방법이 개발되지 않고 있다. 수술적 방법 이외에는 항염증제 등을 통한 통증완화 등에 그치고 있으며 연골보호제 (히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴) 등이 개발되었으나 이 역시 연골 퇴행과 연골생성 촉진 및 재생유도 등에는 그 효과가 확립되지 않았다. 따라서, 관절염의 조기 진단으로 악화되는 것을 막는 예방이 최선의 방법이다.

사람의 무릎관절 연골은 한번 손상이 되면 스스로 재생이 되지 않고, 관절연골의 손상에 대한 반응은 다른 조직과는 상이한데, 그 이유는 관절연골에는 혈관, 신경 및 임파 조직이 없기 때문에 섬유소의 응집이나 염증세포의 이전이 일어날 수 없어 손상된 관절 연골은 회복이 어려우며, 재생이 극히 제한적으로 이루어진다.

관절연골 결손의 원인으로 외상(trauma), 관절 인대손상(ligament injuries), 반월상 연골판 손상(meniscus injuries), 박리성 골연골염(osteochondritis dissecans), 퇴행성관절염(degenerative joint disease), 관절의 부정정렬(malalignment of joint), 무혈성 괴사증(osteonecrosis), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 감염(infection) 등이 있다. 관절연골의 손상은 동통, 운동제한 등을 동반하면서 결국 전형적인 퇴행성관절염으로 진행하게 된다. 연골조직 퇴행의 원인으로 세포외기질분해효소에 의한 연골조직 분해, 연골세포로서의 특성을 읽는 탈분화, 염증반응, 세포사멸 등이 있다. 연골세포에서 생성되는 세포외기질분해효소 (matrix metalloproteinase; MMP)는 MMP-1, -2, -3, -8, -9, -13, 아그리카나아제(aggrecanase), MT1- MMP (MMP-14), TIMP-1, -2, -3이며 연골조직의 퇴행은 대사적 불균형으로 인한 MMP의 과도한 발현 (활성)과 TIMP의 불충분한 합성 (불활성화)로 일어나는 비가역적인 연골조직의 파괴과정이다. 연골세포에서 생성된 다양한 MMP는 연골세포로부터 합성된 다양한 ECM 분자들 즉 콜라겐(collagen), 프로테오글리칸(proteoglycan), 링크 프로틴(link protein) 등을 분해하고 결과적으로 연골조직의 파괴와 연골조직 ECM (Extracellular matrix) 분자 구성을 변화시킨다.

연골조직내 연골세포는 IL-1β 등의 염증성 사이토카인이나 NO 등에 의해 분화된 특성을 소실하는 현상 즉 탈분화가 일어나는데, 연골세포의 생체외 계대배양시에도 동일한 현상이 유도되어 연골세포치료를 위한 세포의 대량생산의 주 저해요인이다. 연골세포의 탈분화는 type Ⅱ 콜라겐 및 프로테오글리칸 등과 같은 연골특이적 ECM 분자의 합성이 저하되어 새로운 ECM 분자의 보충이 중단되고 연골조직의 항상성이 파괴되어 긍극적으로 연골조직의 퇴행을 유발한다.

연골조직의 염증은 심한 통증을 동반하고 이로 인해 관절을 움직이지 않게 되며 동시에 깊은 곳에 있는 연골세포에 관절액이 도달하지 못하게 되어 최종적으로는 연골세포 고사를 유발시키게 된다. IL-1β 등의 염증성 사이토카인은 연골세포막 사이토카인 수용체의 발현을 증가시켜 사이토카인에 대한 연골세포의 민감성을 증폭시켜 포스포리파아제(phospholipase) A2의 활성화와 COX-2 발현, 이에 따른 PGE2의 생성으로부터 시작되는 활막염 등의 염증반응을 유도한다.

연골조직의 퇴행에서 연골세포의 세포사멸 또한 연골퇴행을 유발시키는 중요한 인자이다. 연골세포사멸은 궁극적으로 연골조직의 ECM 합성을 감소시켜 연골 ECM의 항상성을 파괴하여 퇴행을 유발한다.

EST(expressed sequence tags) 데이터베이스와 이를 이용한 새로운 유전자 동정은 전사체의 조각인 EST 데이터베이스의 정보를 바탕으로 새로운 유전자의 동정 및 정보를 얻는 방법으로 연골퇴행을 유발 또는 억제하는 유전자 동정을 위한 효과적인 동정 도구이다.

연골조직 퇴행을 조절하는 신규유전자의 발굴과 기능규명은 연골퇴행을 제어할 수 있는 직접적인 바이오마커로 사용할 수 있고 이러한 마커를 제어할 새로운 약물의 개발은 연골퇴행의 치료 및 연골재생을 위한 유전자 치료법의 개발과 더불어, 현재까지의 연골퇴행 치료방법의 한계를 극복하여 새로운 분자 의학적 관절염 치료제 개발의 실용화로 국민 보건 복지 향상에 크게 기여할 것이라 사료된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 관절염을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 발굴된 바이오마커들이 관절염을 진단할 수 있고 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 관절염의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 관절염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 관절염 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 관절염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 ECRG 4 단백질에 특이적인 결합제, ECRG 4 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 관절염 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 ECRG 4 단백질에 특이적인 결합제, ECRG 4 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 관절염 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 관절염 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 ECRG 4의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 관절염을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 관절염을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 분자 마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 기술한 분자 마커가 관절염을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다. 특히, 본 발명의 마커는 관절염에 대한 마커로서의 정확성과 신뢰도가 크게 개선된 마커이다.

ECRG 4 (esophageal cancer related gene 4) 단백질은 148개의 아미노산으로 구성된 17 kDa 분자량을 가진 단백질이다. 소(Bos taurus)의 ECRG 4 유전자의 핵산 서열은 접근번호 NM_001038113.1에 공지되어 있으며, 단백질에 대한 정보는 접근번호 NP_001033202.1에 각각 공지되어 있다. 인간 ECRG 4 유전자는 2번 염색체(2q14.1-q14.3) 상에 존재하며, mRNA 서열에 대한 정보는 접근번호 AF325503에 공지되어 있으며. 단백질에 대한 정보는 접근번호 AAG42321.1에 각각 공지되어 있다. 마우스에 대한 mRNA 서열 정보는 Unigene Mm.50109에 공지되어 있으며, 당백질에 대한 정보는 접근번호 NP_077245.1에 공지되어 있다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인체 나 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료, 예컨대, 연골(특히, 관절 연골)의 세포 또는 조직, 오줌, 타액, 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 의미하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 분자 마커 ECRG 4은 연골, 특히 관절연골 시료에 포함되어 있다.

본 발명의 명세서에서 “관절염(arthritis)”은 여러 가지 원인에 의해 관절에 염증이 생긴 질환을 의미한다.

본 발명의 분자 마커는 관절염의 발생 및 발전에 대한 지표가 될 수 있으며, 관절염의 발생 및 발전의 진단에 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 분자마커는 외상(trauma), 관절 인대손상(ligament injuries), 반월상 연골판 손상(meniscus injuries), 박리성 골연골염(osteochondritis dissecans), 퇴행성관절염(degenerative joint disease), 관절의 부정정렬(malalignment of joint), 무혈성 괴사증(osteonecrosis), 염증성 관절염(inflammatory arthritis) 또는 감염(infection)으로 인한 관절염을 예측 또는 진단하는데 이용되며, 보다 바람직하게는 염증성 관절염 또는 퇴행성 관절염을 예측 또는 진단하는데 이용되고, 가장 바람직하게는 퇴행성 관절염을 매우 정확하게 예측 또는 진단하는데 이용된다.

본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 관절염 상태의 동정, 관절염의 단계 결정 또는 치료에 대한 관절염의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "예후"는 질병의 진행 가능성 과정, 특히, 질병의 차도, 질병의 재생, 관절염 재발 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 예후는 관절염 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 관절염 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 관절염을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C₁₄, I₁₂₅, P₃₂ 및 S₃₅)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, ECRG 4 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355 (6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727 (1998) 에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 관절염을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 단백질이 저발현 되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 관절연골 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 약하게 나오는 경우에는 관절염으로 진단된다.

본 발명의 조성물은 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 조성물은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 포함된 키트를 제작하는 경우 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 마이크로어레이용 조성물일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물는 유전자 증폭용 조성물이다.

본 발명의 조성물이 마이크로어레이용 조성물인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 조성물이 유전자 증폭용 조성물인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 진단용 조성물에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 ECRG 4 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어“상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적 (perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 상술한 ECRG 4의 접근번호를 이용하여 GenBank에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 조성물이 포함된 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체 (substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물이 포함된 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 관절염 진단용 조성물이 포함된 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 관절염 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단 (예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 관절 연골(articular cartilage) 조직세포에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2‘-Azine-di[3-ethyl benzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 관절염 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 관절염 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 관절연골의 조직 또는 세포)보다 약하게 나오는 경우에는 관절염으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 관절염 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단용 키트가 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 관절 연골 조직 또는 세포, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생물학적 시료에서 본 발명 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(예컨대, 정상 관절 연골 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 낮게 나오는 경우에는 관절염으로 진단된다.

따라서 본 발명의 관절염 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 마커는 관절염에서 저발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 저발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “저발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 낮은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 낮은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상세포 또는 조직과 비교하여 2-10 배 정도 저발현 되는 경우, 본 발명에서의 “저발현”으로 판정하고 관절염으로 판정한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) ECRG 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오티드서열의 저발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 관절염의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 인간의 관절연골 세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시료가 처리된 세포에서 본 발명의 마커의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 저발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 관절염의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 관절염 진단 또는 예후 분석용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에서의 ECRG 4는 관절염에 대한 마커로서의 정확성 및 신뢰도가 크게 개선된 마커이다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 관절염 환자의 조직 또는 세포에서만 특이적으로 발현이 감소되는 ECRG 4를 이용하여 생물학적 시료(예컨대, 연골세포 또는 조직)로부터 매우 특이적으로 관절염의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

도 1a는 각 조직에서 mRNA를 분리 후 역전사효소 연쇄중합반응과 실시간 역전사효소 연쇄중합반응을 통해 ECRG4가 연골 조직에서 많이 발현함을 다른 조직과 비교한 결과이다. 도 1b는 ECRG4의 mRNA 양을 확인하기 위하여 노던 블랏팅으로 확인한 결과이다. 도 1c는 ECRG4의 발현된 단백질 위치를 확인하기 위해 myc 리포터유전자를 사용하여 연골세포에 과발현 시키고 세포질과 세포배양액에서 웨스턴 블랏팅으로 확인 한 결과이며, ECRG4는 세포 밖으로 분비되는 단백질임을 확인하였다. Cartilage: 연골, Brain: 뇌, Heart: 심장, Liver: 간, Lung: 폐, Kidney: 신장, Muscle 근육, Skin: 피부, cellular ECRG4: 세포내 ECRG4, secreted ECRG4: 분비된 ECRG4.
도 2a는 미분화된 줄기세포에서 연골세포로 분화되는 과정 동안 ECRG4의 발현을 확인한 것이다. 마우tm의 미분화된 간충직 줄기세포를 분리하여 미세배양하여 연골세포로 분화를 유도하면 ECRG4는 연골세포의 분화정도를 나타내는 타입 Ⅱ 콜라겐 및 어그리칸과 같은 발현패턴을 보였다. 도 2b는 같은 결과를 실시간 역전사효소 연쇄중합반응을 통해 정량화 한 결과이다. 도 2c는 미분화된 세포를 미세배양 방법으로 연골세포로 분화 시킨 후 절단하여 in situ 혼성화 방법으로 ECRG4 전사체를 확인한 결과이다. chondrogenesis: 연골세포분화, hypertrophic maturation: 연골세포비대화, Coll: 콜라겐, Aggrecan: 어그리캔, MMP (matrix metallopreoteinase) 세포외기질분해효소, GAPHD (Glyceraldehye-3-phosphate dehydrogenase) 3-인산 글리세르알데하이드 탈수소효소, MMP-13: 세포외기질분해효소-3.
도 3은 마우스 배아의 림(limb)으로부터 ECRG4의 발현을 확인한 결과이다. 도 3a 및 3b는 연골세포분화가 일어나기전인 E11.5부터 E15.5까지의 마우스배아 림에서 mRNA를 추출하여 역전사효소 연쇄중합반응과 실시간 역전사효소 연쇄중합반응을 통해 ECRG4발현을 조사한 결과이며, 분화한 연골세포의 표지 분자인 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현과 같은 패턴으로 발현하였다. 도 3c는 림 조직에서 확인하기 위해 E14.5 림을 절단하여 in situ 혼성화 방법으로 ECRG4를 검출한 결과이며, 타입 Ⅱ 콜라겐이 발현하는 곳에서 ECRG4가 발현함을 확인 할 수 있었다. 도 3d는 200배, 400배로 확대하여 관찰하여 타입 Ⅱ 콜라겐이 발현하는 분열중인 연골세포에서 ECRG4가 많이 발현함을 확인한 결과이다. PC (proliferatin chondrocyte) 분열중인 연골세포, HC (hypertrophic chondrocyte) 비대연골세포.
도 4는 연골세포의 퇴행조건에서 ECRG4의 발현 패턴을 확인 한 실험결과이다. 도 4a는 연골세포의 탈분화를 유도하는 염증성사이토카인 IL-1β를 처리한 결과이고, 도 4b는 계대배양을 하면 연골세포의 분화 마커인 타입 Ⅱ 콜라겐이 감소하는 결과이다. 이때 ECRG4의 발현도 감소함을 역전사효소 연쇄중합반응을 통해 확인 하였다. 도 4c는 ECGR4가 연골세포의 분화 마커 또는 퇴행관련 세포외기질분해효소 들의 발현을 조절할 수 있는지 확인한 실험결과이다. 정상 연골세포에 렌티바이러스로 ECRG4를 과발현 시키거나, 연골세포 퇴행조건에서 렌티바이러스로 ECRG4를 과발현 시켰을때 아무런 기능이 없음을 보여 준 결과이다. 도 4d는 연골세포의 분열이 ECRG4를 과발현 시켰을 때 감소된 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 관절염환자 연골조직 중 관절염이 진행되지 않은 정상 연골조직과 관절염이 많이 진행된 연골조직을 보여주며, 그 조직에서 ECRG4의 발현양을 확인하기 위해 역전사효소 연쇄중합반응과 실시간 역전사효소 연쇄중합반응을 수행한 결과이다. 흰색 그래프는 정상 연골조직을 검은색 그래프는 관절염 연골조직을 나타낸다. 도 5a는 연골퇴행이 진행 된 부분에선 type II 콜라젠과 함께 CERG4의 발현이 감소했음을 나타낸 결과이다. 도 5b는 마우스에 콜라게나아제(collagense)로 퇴행성관절염을 유도한 후 절단하여 연골조직의 퇴행을 사프라인 O 염색법으로 확인한 결과이며, 연골퇴행이 일어난 부분의 연골조직에서 mRNA를 분리후 역전사효소 연쇄중합반응과 실시간 역전사효소 연쇄중합반응을 수행한 결과 CERG4의 발현이 감소하였다. N (normal) 정상, OA (osteoarthritis 퇴행성관절염), [도5b] PBS (phosphate buffered saline).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.

재료 및 방법

In silico 분석

유니진(Unigene) 전사체 라이브러리 (www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene)로부터 신규유전자에 대한 cDNA 서열을 검색하였다. 유전자 온톨로지(Ontology)의 예측을 위해 Goblet (www.goblet.molgen.mpg.de)과 AmiGO (www.godatabase.org/cgi-bin/go.cgi) 프로그램을 사용하였으며, 다양한 단백질 도메인 부위 예측에 SMART 프로그램 (www.smart.embl-heidelberg.de)을 사용하였다. N-말단 부위의 신호 펩타이드의 존재를 확인하기 위해 SIgnalP (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)을 적용하였다.

사람 및 마우스로부터의 조직 확보

표시된 발달단계의 마우스 배아의 앞다리 및 뒷다리 림버드(limb bud)로부터 각각 림버드를 분리하였다. 분리된 림버드로부터 RNA를 추출하여 역전사효소 연쇄중합반응을 통해 Ⅱb형 콜라겐과 ECRG4의 발현을 확인하였다. Ⅱb형 콜라겐과 ECRG4의 전사체의 확인을 위한 in situ 혼성화를 실시하기 위하여 수정 후 14.5일 되는 마우스 배아의 앞다리 림버드에서 분리한 조직을 이용하였다(Kim et al. 2008). 갓 태어난 마우스로부터 연골 및 모든 다른 조직을 확보하였으며, 이들 조직을 이용한 역전사효소 연쇄중합반응을 통해 Ⅱb형 콜라겐과 ECRG4의 발현을 확인하였다. 퇴행성관절염 무릎관절에 대한 관절성형술을 시술받은 환자 (51-72세)로부터 인간 퇴행성관절염 연골조직을 확보하였다. 해당 인간 피험자 위원회 (Human Subjects Committees)로부터 인체조직의 전달에 관한 승인을 받았다. 모든 환자의 사례는 American College of Rheumatology의 무릎 퇴행성관절염의 분류 기준(Altman et al. 1986)에 적합하였다. 수술 후 60분 이내에 각 시료의 경골고평부(tibial plateau)로부터 연골하골(subchondral bone)부위까지의 연골조직을 채취하였다. 손상되지 않은 연골 조직은 대조군으로 사용하였으며, 심각하게 손상된 연골조직은 퇴행성관절염 연골조직으로 사용하였다. 정상, 퇴행성관절염 연골조직으로부터 RNA를 추출하여 역전사효소 연쇄중합반응을 통해 Ⅱb형 콜라겐과 ECRG4의 발현을 확인하였다.

ECRG4 재조합 마우스의 생산 및 배아 분석-도면에 관련 내용 없음

연골세포 특이적인 ECRG4 재조합 마우스의 생산을 위해 Ueta et al. (2001)에 서술된 바와 같이 생쥐 Col2a1 유전자의 프로모터 (Promoter) 및 인핸서 (enhancer)가 포함된 발현 벡터의 NotI 부위에 ECRG4 유전자를 삽입하였다. ECRG4 재조합 마우스는 마크로젠 사(서울, 대한민국)로부터 구입하였다. F1세대 잡종의 생산을 위해 시조(founder) 재조합 마우스와 야생형 C57BL/6 마우스의 교배를 진행하였다. 3-4주령 F1-F4세대의 유전형 확인을 위하여 5‘-TGGGTCCAGATGGCATAAGTGG-3' 및 5’-ATAGTTGACACTGGCCTCCATGCC-3'의 프라이머를 사용하였다. 발생 단계에서의 ECRG4의 기능규명을 위해, 염색 전에 14.5 및 16.5일의 배아의 피부 및 내장을 적출하고, 95% 에탄올로 4일 동안 고정한 뒤 아세톤에 3일 동안 담근 후, 알시안 블루(Alcian blue)/알리자린 레드(Alizarin red) 염색 시약(70% 에탄올 내 0.015% 알시안 블루, 95% 에탄올 내 0.05% 알리자린 레드, 70% 에탄올 내 5% 아세트산)으로 10일 동안 골격을 염색하였다. 염색 후 배아를 1% KOH로 2일 동안 세척하여 100% 글리세롤 내에 보관하였다.

콜라겐 분해효소-유도 연골 손상

4 유니트(units)의 콜라겐 분해효소 (Sigma, st.Louis, MO)를 10주령 C57BL/6 수컷 마우스(다물사이언스)의 관절 내부에 0일차 및 2일차에 각각 주입하여 무릎 퇴행성관절염을 실험적으로 유도하였다. 4주 후 무릎관절을 분리하여 하기에 기술된 바와 같이 조직학적 평가를 실시하였다.

5% 파라포름알데히드로 무릎관절 고정 후, 석회질 제거 (decalcification) 용액 (Merk, Darmstadt, Germany)을 14일 동안 처리하였다. 파라핀을 침투시킨 조직을 8 ㎛ 두께로 잘라 박편시킨 후 그 박편을 Superfrost 슬라이드 (Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany)위에 고정하였다. 박편으로부터 수분과 파라핀을 제거한 후 헤마톡실린 (Hematoxylin)으로 10분 동안 염색하였다. 흐르는 물에 10분 동안 세척한 후, 패스트 그린 (Fast Green) 용액으로 3분 염색한 뒤, 10초가 넘어가지 않는 범위에서 1% 아세트산 용액으로 빠르게 세척하였다. 마지막으로 슬라이드 위의 샘플을 0.1% 사프라닌-O(Safranin-O) 용액으로 5분 동안 염색한 후 흐르는 물에 3분 동안 세척하였다. 연골손상의 정도는 Mankin et al. (1971)의 방법에 의거하여 측정하였다. 생화학적인 분석을 위해, Blom et al. (2007)에 서술된 방법을 통해 정상 및 퇴행성관절염 연골조직을 채취한 뒤, 다양한 분자들의 발현정도를 측정하였다.

세포 배양

김 등(2008)에 서술한 바와 같이, 연골세포 분화를 유도하기 위해 수정 후 11.5일 되는 마우스 배아의 림 버드의 끝부분에서 유래한 미분화 중간엽 세포를 마이크로매스(micromass) 배양법을 이용하여 하기와 같이 배양하였다.

10% (v/v) 우태혈청 (Fetal bovine serum)이 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)에 4.0 x 10⁷개/㎖ 농도의 세포를 현탁시킨 후 현탁액을 방울 형태로 배양 접시상에서 배양하였다. Ⅱ형 콜라겐의 발현 및 황화 글리코사미노글리칸의 축적을 각각 역전사효소 연쇄중합반응 및 알시안 블루(Alcian blue) 염색을 통해 연골세포분화를 확인하였다. 마이크로매스 배양 6일째에 DMEM을 50 ㎍/㎖의 아스코빅산(Ascorbic acid) 및 5 mM의 β-인산화글리세롤(Glycerol phosphate)이 포함된 DMEM/F-12 (2:3) 배지로 교환한 뒤 21일까지 배양하여 연골세포의 비대성숙(Hypertrophic maturation)을 유도하였다(Mello and Tuan, 1999; Kim et al. 2008). 연골세포의 비대성숙은 김 등(2008)에 서술한 바와 같이 역전사효소 연쇄중합반응을 통해 X형 콜라겐 및 MMP-13의 발현을 확인하거나, 알리자린 레드염색을 통하여 연골세포의 석회질화 (Mineralization) 정도를 측정하여 확인하였다. 배양 5일째에 마이크로매스 배양 방울(Spot)을 떼어내어 파라핀 왁스 내 고정시키고, Ⅱ형 콜라겐 및 ECRG4에 대한 in situ 혼성화를 실시하였다. Yoon 등(2002)에 기술된 방법에 따라, 2주령 뉴질랜드 화이트 토끼(화인실험동물)의 연골절편을 효소로 분해하여 토끼 관절의 연골세포를 채취하였다. DMEM에 포함된 0.2%의 Ⅱ형 콜라겐 분해효소(381 units/mg; Sigma)로 4시간 동안 연골절편을 분해시켰다. 김 등(2008)에서 서술한 바와 같이, 늑골 연골세포를 생후 3일 된 마우스로부터 채취하였다. 0.2%의 콜라겐 분해효소 Ⅱ형으로 연골성 흉곽 (Cartilaginous rib cage)를 45분 동안 분해시켰다. 관절 및 늑골에서 분리한 세포를 10% (v/v) 우태혈청 (Fetal bovine serum) 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)과 50 units/㎖ 페니실린 (penicillin)이 포함된 DMEM에 재현탁하여 세포 5 x 10⁴개/㎝²의 농도로 배양하였다. 배지는 매 1.5일 마다 교환하였으며, 4-5일 사이에 세포의 농도가 최고에 도달하였다. 이를 패시지(passage 0; P0)으로 표시하며, P3까지 세포 5 x 10⁴개/㎝²의 농도로 계대 배양하였다(Yoon et al. 2002). 연골세포의 분화상태는 Ⅱ형 콜라겐의 발현을 통해 측정하였다. 일차 배양한 토끼 연골세포의 증식은 Ez-Cytox enhanced cell viability 분석 키트 (Itsbio 사, 서울, 대한민국)를 이용하여 측정하였다.

ECRG4 발현 벡터 및 렌티바이러스의 구조

마우스 늑골 연골세포에서 5‘ 및 3’ 말단에 각각 BamHI과 XbaI 인식서열이 추가되도록 고안된 ECRG4 프라이머를 이용한 역전사효소 연쇄중합반응을 수행하여 마우스 ECRG4 (Mm.50109) cDNA를 확보하였다. 확보한 cDNA는 pcDNA3.1/myc-His 벡터(Invitrogen 사, Carlsbad, CA)에 삽입시켰다. pCDNA-ECRG4-myc/his 벡터는 메타펙틴(Metafectene; Biotex 사, Martinsried, Germany)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 일차 연골세포 (Primary chondrocytes)에 도입시켰다. 도입 연골세포는 36시간 동안 배양시킨 뒤, 후속 실험에 사용하였다. ECRG4를 발현하는 렌티바이러스는 하기 기술된 방법으로 합성하였다(마크로젠 렌티벡터 연구소, 대한민국).

BamHI 및 XbaI 제한효소로 pCDNA-ECRG4-myc/his 벡터를 자른 후 렌티바이러스 벡터(Lenti-mCMV-IRES-puro)에 삽입한 후, 이를 리포펙타민 플러스(Lipofectamine Plus; Invitrogen 사)를 이용하여 293T 세포에 도입시켰다. 도입 후 48 시간 후에 바이러스 입자를 포함하는 배양액을 수거하였다. 바이러스의 역가는 I형 인간 후천성 면역결핍증 바이러스 p24 효소면역측정법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)를 이용하여 측정하였다. 미분화 중간엽 세포 및 토끼의 일차 연골세포에 모의 (Mock) 렌티바이러스와 ECRG4 렌티바이러스를 도입시킨 후 48시간 동안 배양하였다.

ECRG4-Conditioned media의 확보

토끼 일차 연골세포에 pCDNA-ECRG4 벡터를 도입시킨 뒤 대조군 및 ECRG4 발현 연골세포가 80%의 컨플루언시가 되면 각각을 세척한 후 48시간 동안 무혈청 DMEM (Serum-free DMEM)에서 배양시켰다. 배양액(conditioned media)을 0.2 ㎛ 크기의 필터를 통해 여과시킨 후, 5 kDa 분자량의 단백질을 거를 수 있는 YM 막과 아미콘 스터드 셀(Amicon stirred cells; Millipoer, Billerica, MA)을 이용하는 극미세여과(Ultrafiltration)를 이용하여 30배 농축시켰다. 중간엽줄기세포를 마이크로매스 배양법을 통해 배양시킨 후 배양된 중간엽줄기세포에 대조군 배양액 및 ECRG4를 포함하는 배양액을 각각 처리하여 5-13일 동안 배양하였다.

역전사효소 연쇄중합반을 분석과 실시간 역전사효소 연쇄중합반응

제조사 프로토콜에 따라 TRI-reagent (MRC, Inc., Cincinati, OH)를 사용하여 RNA를 추출하여 Improm-Ⅱ^TM 역전사 효소 (Promega)를 이용하여 역전사를 실시하여 cDNA를 수득하였다. cDNA는 Taq 중합효소(Intron, Gyeonggido, Korea)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭하였다. 사용한 프라이머는 표 1에 요약하였다. 실시간 역전사효소 연쇄중합반응은 chromo 4 cycler(Bio-Rad, Hercules, CA)와 SYBR Premix Ex Taq^TM (TaKaRa bio, Inc., Shiga, Japan)을 사용하여 수행하였다. 모든 실시간 역전사효소 연쇄중합반응은 두 번씩 수행하였으며 표적유전자의 증폭된 신호는 같은 반응 내의 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogrenase (GAPDH)의 신호로 보정하였다.

표 1

노던 블롯 및 웨스턴 블롯(Northern blot and western blot)

노던 및 웨스턴 블롯팅 방법은 이전 논문에서의 방법과 동일하게 실시하였다 (Huh et al., 2007 ; Kim et al., 2008). RNA는 포름알데하이드/아가로오스 젤에서 분류한 후 S 및 S Nytran N nylon membrane으로 옮겼다. 혼성화 전 반응(prehybridization)과 혼성화 반응을 진행하여, ECRG4 전사체(transcript)를 역전사 효소 연쇄중합반응을 통하여 제작된 부분 cDNA로 탐침하였다(probe). T7 Quick 프라이머 키트(Amersham Bioscience, Inc., Piscataway)를 이용하여 높은 특이 활성(specific activity)을 나타내는 랜덤(random) 프로브(probe)를 제조하였다. 필터는 0.2 X SSC/0.1% SDS 로 세번 세척하고 Kodac X OMAT 필름으로 -70℃에서 증감시켜 현상하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 세포 용해물을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)상에서의 전기영동을 통해 단백질의 크기에 따라 분류하였으며, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 옮겼다. Cell signaling Technology 사 (Beberly, MA)의 항-myc 항체(anti-myc antibody)를 이용하여 ECGR4 단백질을 검출하였다. 단백질 신호(Blots)를 퍼옥시다아제-컨쥬게이티드(peroxidase-conjugated) 2차 항체(SIGMA)와 케미루민-센스 시스템(chemilumines-cence system)을 이용하여 현상하였다.

In situ 혼성화

Ⅱb형 콜라겐과 ECGR4를 확인하기 위하여, 디곡시게닌 RNA 레이블링 믹스(Roche Diagonestics Corp., Indianapolice, IN)를 사용하여 디곡시게닌(Digoxigenin)이 붙은 리보핵산 탐침 (Riboprobes)을 하기에 기술된 방법을 이용하여 합성하였다(Ryu and Chun, 2006).

마우스의 Ⅱ형 콜라겐과 ECGR4 cDNA 절편은 5‘말단에 HindⅢ(sence)와 EcoRI(antisence) 인식서열을 포함된 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭하였다. Ⅱ형 콜라겐과 ECGR4 cDNA를 pSPT-18 벡터에 삽입하였으며, 안티센스(antisence) 탐침과 센스(sence) 프로브를 형성하기 위하여 SP6 또는 T7 RNA 중합효소를 이용하여 선형화 및 전사시켰다. 혼성화 시키기 위하여 수정 후 14.5일 되는 마우스 배아의 앞다리의 림프 버드와 마이크로매스 배양 방울(Spot)을 4% 파라포름알데하이드에서 4℃, 18시간동안 고정하고, 에탄올로 탈수시킨 후 파라핀을 침투시켜 4 ㎛ 두께로 잘라 박편을 제작하였다. 파라핀을 침투시킨 박편으로부터 파라핀을 제거시키기 위하여 0.2 N HCl에 10분간 처리한 후 침투성을 부여하기 위해 37℃에서 10분간 20 ㎍ 프로티나아제 K(peoteinase K)를 처리하였다. 박편에 10분간 0.25% 아세틱 안하이드리드(acetic anhydride)를 처리하여 아세틸화시킨 후 변성된(denatured) 센스 또는 안티센스 디곡시게닌이 레이블링된 리보프로브(riboprobe)가 포함된 혼성화 완충액(40% formaldehyde, 10% dextran sulfate, 1 X Denhardt's solution, 4 X SSC, 10 μM DTT, 1 ㎎g/㎖ yeast tRNA, 2 ㎎/㎖ salmon sperm DNA)에서 배양하였다. 박편에 10 ㎎/㎖ RNase A를 37℃에서 30분간 처리 후, 항-디곡시게닌 검출 키트(Roche Diagonetics Corp.)를 이용하여 검출하였다. 4-니트로 블루 데트라졸리움 클로라이드(4-nitro blue tetrazolium chloride)와 5-브로모-4-클로로-3-이오돌일-포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-iodolyl-phosphate)를 이용해 혼성화 신호를 시각화하였다.

실험 결과

연골세포에서의 ECRG4 발현

연골조직에서 많이 발현하는 유전자를 동정하기위해 본 연구자들은 NCBI에서 제공하는 Unigene 데이터베이스를 이용해 사람정상연골 라이브러리 (human normal cartilage library) Lib.8940을 분석하였다. Hs.43125을 SAGE (serial analysis of gene expression)/cDNA virtual Northern을 통해 연골 특이적이고 기능이 알려지지 않은 유전자로 분리하였다. 사람 유전자 Hs.43125의 전체 유전자서열은 생쥐에서 ECRG4 (Mm.50109)와 일치하였다. 처음 in silico 접근방법으로 마우스의 다양한 조직에서 ECRG4가 연골특이적임을 확인하였다. 역전사효소 연쇄중합반응 (RT-PCR) 및 실시간 역전사효소 연쇄중합반응(qRT-PCR)으로 ECRG4는 다른 조직에 비해 연골에서 많이 발현함을 확인하였다(도 1a). ECRG4의 전사체를 마우스 립(rib) 연골세포에서 노던 블롯으로 확인하였다(도 1b). ECRG4의 유전자 서열은 4개의 엑손, 3개의 인트론으로 구성되었으며, N-말단에 시그널 펩타이드를 포함하고 있고. 148 아미노산이 ORF (open reading frame)을 구성하는 것으로 확인되었다. 연골세포에 ECRG4를 인위적으로 과발현시키는 경우 대략 17 kDa의 크기로 검출되었으며, 연골세포를 배양한 배지에서 검출하는 경우 더 작은 14 kDa의 ECRG4가 검출 되었다(도 1c). 이러한 결과는 세포외로 분비 후 ‘단백질번역 후 (post-translation) 끊김’이 있음을 나타내는 것이다.

분열중인 연골세포 또는 비대화연골세포에서의 ECRG4 발현

미분화된 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 미세배양방법을 이용하여 연골세포의 연골세포분화와 연골세포비대화 과정에서의 연골세포특이적 ECRG4 발현을 추가적으로 확인하였다. 중간엽줄기세포를 미세배양법으로 배양하면 6일까지는 연골세포로 분화되었으며, 그 이후에는 배양배지를 바꾸어서 배양 후 15일에는 중간엽줄기세포가 뼈가 형성되는 전 단계인 비대연골세포로 분화하였다. 연골세포의 마커인 Ⅱb형 콜라겐 및 어그리칸은 3일부터 나타나기 시작하여 6일째 가장 많이 발현하고 연골비대화 과정에서는 감소하였다(도 2a 및 2b). ECRG4는 Ⅱb형 콜라겐과 매우 비슷하게 연골세포로 미분화된 줄기세포에서 매우 낮게 발현되는 반면 연골세포분화과정 중 발현이 많아지고 연골비대화 과정에서는 감소하였다(도2A,B). 비대화연골세포의 마커인 X형 콜라겐 및 MMP-13은 배양 후 12일부터 검출되었다(도 2a 및 2b). 또한, 미세배양하여 6일 동안 배양된 연골세포 스폿(spot)을 절단하여 in situ 혼성화 방법으로 확인한 결과, ECRG4는 분화된 연골세포가 형성하는 연골 노둘(nodule)에서만 발현하였다(도 2c).

발생중인 림 버드에서의 ECRG4 발현

생체 내에서 연골발생중 ECRG4의 발현을 확인하기위하여 연골발달이 일어나고 있는 수정 후 11.5-15.5일 된 마우스 태아에서 림 버드를 분리하여 RT-PCR과 qRT-PCR로 확인하였다. 분화된 연골세포의 표지분자인 Ⅱb형 콜라겐은 연골이 점진적으로 발생되는 손가락 형성 부분인 14.5 및 15.5 dps 림 버드에서 가장 높게 발현되었다(도 3a 및 3b). Ⅱb형 콜라겐과 비슷하게 14.5 및 15.5 림에서 ECRG4의 발현이 강하게 나타났다(도 3a 및 3b). In situ 혼성화 실험에서 ECRG4가 연골세포 표지 분자인 Ⅱb형 콜라겐이 발현하는 위치에서만 특이적으로 발현하는 것으로 나타내었다(도 3d).

탈분화된 연골세포에서의 ECRG4 발현 감소

분화된 연골세포는 IL-1β, 단층계대배양에서 분화된 성질을 잃었다. 분화된 성질을 잃는 것을 탈분화라 하고 퇴행성관절염의 중요한 원인이다. 도4A, B에서 보여주는 것처럼 연골세포에 IL-1β를 처리하거나 단층계대배양 (passage culture)를 하면 Ⅱ형 콜라겐이 감소하는 연골세포 탈분화가 유도되었다. Ⅱ형 콜라겐과 비슷하게 ECRG4도 IL-1β로 처리하거나 단층계대배양을 3회 실시한 연골세포에서 감소하였다(도 4a 및 4b). 이는 연골퇴행과정에서 일어나는 연골세포 탈분화 과정에서 ECRG4가 감소함을 명확하게 보여주었다. ECRG4의 연골세포 탈분화에서의 기능을 규명하기위해 IL-1β를 처리한 연골세포에 렌티바이러스를 사용해 ECRG4를 과발현 시켰다. IL-1β를 처리한 연골세포에 ECRG4의 과발현은 Ⅱ형 콜라겐, 전형적인 염증반응 분자인 COX-2, 연골퇴행에 중요한 역할을 하는 세포외기질분해효소 (MMPs)의 발현에 어떠한 역할도 하지 않았다(도 4c). 연골세포의 탈분화에 역할이 없는 것과는 대조적으로 매우 약하기는 하나 ECRG4의 렌티바이러스를 이용한 연골세포에의 과발현은 연골세포의 세포분열을 감소시켰다(도 4d).

퇴행성관절염 (Osteoarthritis; OA) 연골조직 및 연골세포에서의 ECRG 4 발현 감소

마지막으로 CERG4의 발현을 퇴행성관절염 관절조직에서 관찰하였다. 사람 퇴행성관절염 관절조직은 인공관절수술을 받은 환자로부터 채취하였고, 실험적 퇴행성관절염 관절 샘플은 콜라게네이즈를 무릎에 주사하여 마우스 무릎에 연골퇴행을 유도하여 채취하였다. 연골세포 표지 분자인 Ⅱ형 콜라겐과 비슷하게, ECRG4의 발현은 사람 퇴행성관절염 연골 중 퇴행이 일어난 부위에서 비교적 정상인 연골부위와 비교하여 감소하였다(도 5a). 콜라게나아제의 주입은 마우스 연골을 절단하여 사프라닌 O로 염색한 것과 같이 연골퇴행을 유발하였다(도 5b). 퇴행선관절염의 정도를 정량화하여 평가하는 Mankin 스코어는 대조군으로 사용한 PBS 주입 샘플에서는 0.4±0.9이고 콜라게네이즈를 주입한 샘플은 6.6±1.3이었다. RT-PCR 및 qRT-PCR분석은 ECRG4 뿐만이 아닌 연골세포표지 분자인 Ⅱ형 콜라겐이 감소했음을 나타내었다. 이러한 결과는 분명하게 생체 내에서 ECRG4 발현이 연골세포 탈분화 및 연골퇴행에서 감소함을 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (14)

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9. 관절염 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 ECRG 4 단백질 또는 ECRG 4 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현의 감소를 분석하는 방법을 통해 관절염 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 관절염은 외상, 관절 인대손상, 반월상 연골판 손상, 박리성 골연골염, 퇴행성관절염, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증, 염증성 관절염 또는 감염으로 인한 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
14. 다음의 단계를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
    (a) ECRG 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오티드서열의 저발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 관절염의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

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