KR101145175B1 - 생분해성이 우수한 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리에틸렌글리콜로 구성된 친수성부와, 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트가 특정 비율로 동시에 함유된 생분해성 폴리에스터계 소수성부로 구성되는 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체로서, 온도 변화에 따라 친수성부와 소수성부로 구성된 고분자 마이셀의 응집 및 팽창에 의하여 상전이를 나타내어 신체 내에서 원하는 형태로 쉽게 젤을 형성하고, 생분해성이 우수하여 수술에 의한 제거 과정이 필요 없이 분해될 수 있어 약물전달체 또는 조직공학용 지지체로 응용할 수 있는 다기능성 고분자에 관한 것이다.

Description

생분해성이 우수한 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체{Biocompatible and temperature-sensitive polyethyleneglycol/polyester block copolymer with high biodegradable property}
본 발명은 폴리에틸렌글리콜로 구성된 친수성부와, 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트가 특정 비율로 동시에 함유된 생분해성 폴리에스터계 소수성부로 구성되는 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체로서, 온도 변화에 따라 친수성부와 소수성부로 구성된 고분자 마이셀의 응집 및 팽창에 의하여 상전이를 나타내어 신체 내에서 원하는 형태로 쉽게 젤을 형성하고, 생분해성이 우수하여 수술에 의한 제거 과정이 필요 없이 분해될 수 있어 약물전달체 또는 조직공학용 지지체로 응용할 수 있는 다기능성 고분자에 관한 것이다.
1960년 PHEMA(Polyhydroxyethyl Methacrylate)를 이용한 하이드로 젤을 처음 선보인 이후로 지속적으로 하이드로 젤을 이용한 다양한 연구가 진행되고 있으며, 1980년경 칼슘 알지네이트를 이용한 하이드로 젤의 제조는 생체 재료 분야에 큰 전기가 되었다. 그 후 천연 또는 합성 고분자를 이용한 생체재료용 하이드로 젤의 합성은 비약적인 발전을 이루었다. 하이드로 젤의 대표적인 특성은 물에 팽윤할 수 있는 친수기 고분자의 망상구조로서 많은 양의 물을 함유할 수 있다는 것이다. 하이드로 젤의 3차원적 망상구조는 공유결합, 수소결합, 반데르발스(van der Waals) 결합 또는 물리적 응집 등의 여러 요인에 의해 형성될 수 있다. 하이드로 젤은 장에서 효소 또는 pH 등으로부터 약물의 변성을 방지할 수 있고, 또한 여러 인체 내의 자극에 의해 약을 방출하는 특징적 성질을 부여할 수 있다. 이와 같이 자극 반응 가능 센서적 특성을 포함하는 하이드로 젤은 가역적 부피변화 또는 졸-젤 변화를 인체 내의 자극에 의해 단지 수분 이내에 만들 수 있다. bgtt(삭제)
외부 자극원으로는 온도, 전기, 용매 변화, 빛, 압력, 소리 및 자기력 등과 같은 물리적 자극과 이온, 특정 분자인식 등과 같은 화학적 자극으로 크게 구분할 수 있으며, 이러한 자극원을 이용한 자극 감응형 하이드로 젤의 개발은 약물의 부작용을 최소화할 수 있는 고효율 및 서방형 약물전달 시스템에 응용 가능할 것으로 전망된다. 또한, 요즘 재생의학 분야에서 관심의 집중을 받고 있는 줄기세포는 여러 가지 사이토카인류의 작용 및 기능 조절에 의해 이 줄기세포가 여러 조직으로 분화한다는 많은 연구가 보고되고 있다. 이러한 연구적 배경을 통해 세포, 유전자 및 줄기세포와 자극 감응형 하이드로 젤을 복합화하게 되면 다양한 연골, 뼈, 혈관 등의 인공장기의 형성이 가능할 것으로 기대되므로 이에 관한 연구가 중요시되고 있다.
특히 온도 자극 감응형 하이드로 젤은 조직재생용 세포전달체와 물전달시스템에서 가장 널리 연구되고 있다. 많은 고분자들이 온도 전이 특성을 나타내고 있기 때문이다. 일반적인 고분자를 물에 용해 또는 팽윤할 수 있는 친수기 그룹을 도입하게 되면 그 고분자는 물에 의해 용해 또는 팽윤되어 온도의 증가에 따라 물에 대한 용해성은 증가하나 친수성과 메틸, 에틸 및 프로필 등과 같은 소수성 부분으로 구성된 고분자는 온도 증가에 따라 물 용해성이 감소하는 저임계 용액온도(LCST)를 갖게 된다. 본 발명에 따른 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 공중합체와 같은 LCST를 갖는 고분자로 만들어진 하이드로 젤은 LCST 이상으로 온도가 증가할 때 응축하여 젤이 되는 승온 하이드로 젤이다.
친수성과 소수성 부분으로 구성된 고분자는 낮은 온도에서는 고분자의 친수기와 물 분자 사이의 수소 결합력이 우세하여 물에 용해되어 졸 상태가 되지만, 온도를 증가시키면 고분자의 소수기 부분의 결합력이 수소 결합력보다 우세하게 되므로 고분자의 소수기 부분이 응집하여 젤 상태로 상전이가 발생한다. 그러므로 고분자에서 소수기 부분의 증가는 LCST를 낮추게 되어 친수기와 소수기의 분자쇄의 조절을 통해 LCST는 변화된다. 이러한 고분자 용액이 일반적인 온도에서 졸 상태로 유체와 같이 흐르는 경우 약물의 포접은 단순한 혼합으로 가능하며 인체 온도 이상의 열이 가해질 경우 고분자 하이드로 젤은 젤이 되고 이 경우 약물은 젤로부터 서방형 방출 거동을 보이게 된다. 고분자가 가교되어 있을 경우는 팽윤과 수축의 거동을 보이나 가교되어 있지 않는 경우는 졸-젤 상전이 거동을 나타낸다. 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)는 체온부근의 LCST를 갖고 있기 때문에 가장 널리 사용되고 있으며, 부틸메타아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 등과 공중합 고분자는 다양한 온도 범위에서 졸-젤 변화를 통해 인체 내에서 사용되고 있다. 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드(PEO-PPO)의 공중합체 또한 졸-젤의 변화를 보이는 고분자로서 많은 공중합체가 플루로닉(Pluronic), 폴록사머(Poloxamers), 테트로닉(Tetronic) 등의 상품명으로 사용되고 있다[미국특허 제 4188373호].
한편, 상기 졸-젤 고분자는 인체 내에서 사용된 후 인체의 신진 대사에 의해 체외로 방출되어야 한다는 단점이 있어 소수기 부분에 생분해 고분자쇄로서 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 공중합체(PLGA) 등을 도입한 졸-젤 고분자 또한 많이 연구 보고되고 있다[미국특허 제 4,882,168호, 제 4,716,203호, 제 4,942,035호, 제 5,476,909호, 제 5,548,035호].
현재 외부 자극에 반응하는 고분자의 물리화학적 특성을 이용하여 약물전달시스템과 조직공학에 응용하기 위한 지능형 하이드로 젤에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 지능형 하이드로 젤을 주사제형의 약물전달체 및 조직재생용으로 응용하기 위해서는 낮은 점도와 빠른 젤의 형성 및 생분해성 그리고 신체 외부로 쉽게 배출되기 위한 낮은 분자량을 가지고 있어야 한다. 또한, 생체 재료에 이용되기 위해서 생체적합성을 가지고 있어야 하며 분해과정이나 배출 시 세포나 인체 대사 장기에 손상이 없어야 한다.
이에, 본 발명자들은 온도감응성 하이드로 젤을 생체 재료로서 조직공학용 다공성 지지체 등으로 응용하기 위하여, 친수성 고분자로 물과 유기용매에 높은 용해도를 가지며 비독성이고 면역 작용에 거부 반응이 없으며 소수성인 생분해성 에스터계열의 고분자와 화학적 결합을 하여 생체에 적용되었을 경우, 공중합체에 물의 유입을 증가시켜 분해 기간을 조절할 수 있는 폴리에틸렌글리콜을 사용하고, 카프로락톤 모노머와 락타이드 모노머를 특정 함량 비율로 중합하여 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체를 제조하면 상온에서 졸 상태에 있으나 쥐에 주사하면 신체 온도 부근에서 젤 형성을 확인할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 폴리에틸렌글리콜로 구성된 친수성부와, 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트가 동시에 함유된 생분해성 폴리에스터계 소수성부로 구성되며, 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트가 특정 몰 비율로 이루어진 생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜로 구성된 친수성부와, 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트가 동시에 함유된 생분해성 폴리에스터계 소수성부로 구성되며, 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트의 몰 비율이 94 : 6 ~ 99 : 1 범위에 있는 생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체를 그 특징으로 한다.
본 발명에 따른 생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체의 수용액은 온도 변화에 의해 상전이가 가능하여 체내에서 젤을 형성시킬 수 있다. 특히 생분해성과 생체적합성을 가지기 때문에 체내에서 세포와 조직배양을 위한 여러 형태의 기질로서 사용될 수 있으며, 세포가 부착, 이동 및 성장을 할 수 있는 장소를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명에 다른 생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체의 온도감응 특성을 이용하여 조직공학용 다공성 지지체등으로 널리 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL)-co-폴리락타이드(PLLA) 블록 공중합체의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 및 비교예에서 제조된 블록 공중합체의 온도 변화에 따른 점도 변화를 통하여 졸-젤 상전이를 측정한 것으로, 졸-젤 온도범위와 점도의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1, 2에서 제조된 블록 공중합체 수용액을 쥐의 피하에 주입하여 생체 내에서 젤화되는 것을 확인한 사진이다.
도 4는 실시예 1, 2 및 비교예 3의 블록 공중합체 수용액을 쥐의 피하에 주입한 뒤 시간의 경과에 따른 젤의 크기를 비교한 사진이다.
도 5는 실시예 1, 2 및 비교예 3의 블록 공중합체 수용액을 쥐의 피하에 주입한 뒤 시간의 경과에 따라 젤을 제거하고 이를 H&E 염색한 사진으로, 빨간색 화살표는 젤 내 형성된 혈관을 나타낸다.
도 6은 실시예 1, 2 및 비교예 3의 블록 공중합체 수용액을 쥐의 피하에 주입한 뒤 시간의 경과에 따라 젤을 제거하고 이를 ED1 면역 형광 염색한 사진으로, 파란색 부분과 빨간색 부분은 각각 DAPI 와 ED1 염색을 나타낸다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜로 구성된 친수성부와, 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트가 특정 비율로 동시에 함유된 생분해성 폴리에스터계 소수성부로 구성되는 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체로서, 온도 변화에 따라 친수성부와 소수성부로 구성된 고분자 마이셀의 응집 및 팽창에 의하여 상전이를 나타내어 신체 내에서 원하는 형태로 쉽게 젤을 형성하고, 생분해성이 우수하여 수술에 의한 제거 과정이 필요 없이 분해될 수 있어 약물전달체 또는 조직공학용 지지체로 응용할 수 있는 다기능성 고분자에 관한 것이다.
특히 상기 폴리에틸렌글리콜은 약물 전달 분야 및 조직공학에서 많은 장점을 가지고 있으며, 대표적으로 유기 용매에 높은 용해도를 가지며 비독성이고 면역 작용에 거부반응이 없어 뛰어난 생체적합성을 나타내며 약물 전달체로서 약물을 쉽게 포접, 방출할 수 있으며, 인체 내 사용에 있어서 미국 식품 의약 안전청에서 사용이 승인된 재료로서 제약 제제 산업에서 사용되고 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜은 친수성 고분자들 중에서 혈액 접촉에 사용되는 고분자의 생체적합성을 향상시키고 단백질 흡착 억제 효과가 가장 크기 때문에 생체 재료로서 많은 응용이 이루어지고 있다[J. H. Lee, J. Kopecek, and J. D. Andrade, J. Biomed. Mater. Res., 23, 351 (1989)].
본 발명에서 폴리알킬렌글리콜은 350 ~ 2,000 g/mole의 수평균 분자량, 바람직하게는 500 ~ 1,000 g/mole 의 분자량을 갖는 것을 사용하는 것이 좋다.
에스터계열의 생분해성 고분자는 분자량과 화학적 구성성분을 조절함으로써 분해기간을 조절할 수 있는 장점을 가지고 있다. 본 발명에 있어 기본 모델이 된 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 폴리카프로락톤(PCL)의 블록 공중합체는 이미 졸-젤 상전이 특성을 보이는 온도감응성 공중합체로서 생체 재료로 응용되고 있다. 그러나, 카프로락톤은 생분해성이면서 여러 고분자와 상용성을 가지며 쉽게 결정화하는 특징을 가지고 있으나 높은 결정성은 생체 적용 시 조직과의 적합성을 감소시키고 장기간의 분해 거동을 나타내는 단점이 있다.
이에, 본 발명에서는 카프로락톤에, 생분해성 에스터계열의 락타이드를 특정비율로 첨가하여 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트가 불규칙적으로 존재하며 이루어진 생분해성 폴리에스터계 소수성부를 갖도록 하여 결정성을 낮추고, 생분해 기간을 조절하였다. 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트의 몰 비율(몰분율)이 94 : 6 ~ 99 : 1 범위에 있도록 조절하였으며, 바람직하게는 95 : 5 ~ 98 : 2 범위에 있도록 하는 것이 좋다. 카프로락톤 세그먼트의 비율이 상기 범위를 초과하면 생분해성이 낮아져, 생체 주입 후 분해가 장시간 소요되는 문제가 있으며, 락타이드 세그먼트의 비율이 상기 범위를 초과하면 생체 온도에서 졸-젤 상전이가 나타나지 아니하는 문제가 있다.
본 발명에서 제조되는 중합체의 예시로 촉매를 사용하여 폴리에틸렌글리콜에 카프로락톤과 락타이드를 개환 중합하는 과정을 하기 반응식 1에 나타내었다.
[반응식 1]
Figure 112010009541576-pat00001

또한 본 발명의 공중합체는 수평균 분자량 350 ~ 2,000 g/mole인 폴리에틸렌글리콜을 친수성부로 에스터 계열의 카프로락톤과 락타이드 개환 공중합하여 합성한다. 합성 방법은 폴리에틸렌글리콜을 공비 증류하여 건조시킨 후 단량체를 첨가하고, 반응용매로는 메틸렌클로라이드 또는 톨루엔을 사용한다. 또한 개환 반응을 위한 촉매로는 Sn(Oct)2, 트리플로로메탄술폰산(trifluoromethanesulfonic acid), 트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid), TiO2, Zn(Oct)2, BF3O(CH3)2, Al(Acac)3 등이 사용될 수 있으며, 반응 온도는 90 ~ 150 ℃ 범위가 바람직하다.
합성된 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체의 수용액상은 실온에서는 흐름 특성을 갖는 졸 상태를 유지하나 일정 온도 범위(30 ~ 50 ℃)에 걸쳐 젤을 형성하며, 임계 온도 이상에서는 다시 흐름 특성을 보이는 새로운 졸-젤 상전이 거동을 나타낸다. 이는 시차주사열량계와 X-선 회절기를 이용하여 열적 특성 및 결정성을 분석하였고, 신체 온도 부근에서의 젤 형성을 확인하기 위해 쥐에 주입하여 젤의 형성 및 보전 특성을 확인하였다.
또한, 이러한 온도감응성 블록 공중합체를 주사제형의 약물 전달체나 조직재생용 기능성 지지체로 응용하기 위해서는 낮은 점도와 빠른 젤 형성, 그리고 신체 외부로 쉽게 배출되기 위한 낮은 분자량을 가지고 있어야 하므로 카프로락톤에 락타이드를 일정 함량 비율로 도입함으로써 결정성을 감소시켜 점도를 낮출 수 있었으며, 예상 값에 근접하는 분자량을 얻을 수 있어 낮은 점도와 낮은 분자량을 유지할 수 있었다.
이 때, 전체 수평균 분자량 2,000 ～ 3,000 g/mole의 범위의 생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체를 합성하는 것이 바람직한데, 전체 분자량이 2,000 g/mole 미만일 경우에는 본 발명의 사용 목적인 인체 온도 범위에서 졸-젤 상전이 거동이 일어나지 않고 계속 졸 상태로 유지가 되는 문제가 있고, 3,000 g/mole을 초과하면 분자량이 커서 생분해가 일어나는데 장기간이 소요되는 문제가 있기 때문이다.
상기 본 발명에 의한 생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체는 조직공학용 지지체나 약물을 함유한 약물 전달체로 적용될 수 있으며, 또한 염증, 창상, 마찰, 수술에 의한 창상 등 상처의 치유 과정에서 혈액이 유출되어 응고하고, 이에 의해 주변 장기 또는 조직과 결합되어 발생하는 유착을 방지할 수 있는 유착 방지제로서도 응용될 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤-co-폴리락타이드) 블록 공중합체의 합성 [MPEG-(PCL-co-PLLA)](카프로락톤 : 락타이드 = 95 : 5)
분자량 2,400 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL)-co-폴리락타이드(PLLA) 블록 공중합체를 합성하기 위하여 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(1.5 g, 2 mmol, Mn = 750 g/mole)과 톨루엔 80 ㎖을 잘 건조된 100 ㎖ 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 40 ㎖ 제거하고 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 25 ℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL)(4.51 g, 39.51 mmol)과 락타이드(LA)(0.30 g, 2.08 mmol) 넣고 반응용매로서 미리 정제된 톨루엔 40 ㎖을 넣은 다음, 중합 촉매로서 Sn(Oct)2를 2.4 ㎖ 넣고 24시간동안 110 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 800 ㎖의 헥산과 200 ㎖의 에테르에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.
상기에서 합성된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 1H-NMR을 이용하여 측정한 결과, 이론적인 예상 값과 유사한 수평균 분자량 2,380 g/mole을 얻을 수 있었고, 다분산도의 측정을 위해 젤 투과 크로마토그래피(GPC)를 이용하여 확인한 결과 1.41의 다분산도를 가짐을 확인하였다. 도 1 에는 제조된 블록 공중합체의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내었다.
실시예 2 : 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤-co-폴리락타이드) 블록 공중합체의 합성 [MPEG-(PCL-co-PLLA)](카프로락톤 : 락타이드 = 97 : 3)
분자량 2,400 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL)-co-폴리락타이드(PLLA) 블록 공중합체를 합성하기 위하여 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(1.5 g, 2 mmol, Mn = 750 g/mole)과 톨루엔 80 ㎖을 잘 건조된 100 ㎖ 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 40 ㎖ 제거하고 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 25 ℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL)(4.7 g, 40.8 mmol)과 락타이드(LA)(0.18 g, 1.26 mmol) 넣고 반응용매로서 미리 정제된 톨루엔 40 ㎖을 넣은 다음, 중합 촉매로서 Sn(Oct)2를 2.4 ㎖ 넣고 24시간동안 110 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 800 ㎖의 헥산과 200 ㎖의 에테르에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.
상기에서 합성된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 1H-NMR을 이용하여 측정한 결과, 이론적인 예상 값과 유사한 수평균 분자량 2,420 g/mole을 얻을 수 있었고, 다분산도의 측정을 위해 젤 투과 크로마토그래피(GPC)를 이용하여 확인한 결과 1.36의 다분산도를 가짐을 확인하였다.
비교예 1 : 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤-co-폴리락타이드) 블록 공중합체의 합성 [MPEG-(PCL-co-PLLA)](카프로락톤 : 락타이드 = 93 : 7)
분자량 2,400 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL)-co-폴리락타이드(PLLA) 블록 공중합체를 합성하기 위하여 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(1.5 g, 2 mmol, Mn = 750 g/mole)과 톨루엔 80 ㎖을 잘 건조된 100 ㎖ 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 40 ㎖ 제거하고 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 25 ℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL)(4.5 g, 39.1 mmol)과 락타이드(LA)(0.42 g, 2.94 mmol) 넣고 반응용매로서 미리 정제된 톨루엔 40 ㎖을 넣은 다음, 중합 촉매로서 Sn(Oct)2를 2.4 ㎖ 넣고 24시간동안 110 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 800 ㎖의 헥산과 200 ㎖의 에테르에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.
상기에서 합성된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 1H-NMR을 이용하여 측정한 결과, 이론적인 예상 값과 유사한 수평균 분자량 2,260 g/mole을 얻을 수 있었고, 다분산도의 측정을 위해 젤 투과 크로마토그래피(GPC)를 이용하여 확인한 결과 1.25의 다분산도를 가짐을 확인하였다.
비교예 2 : 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤-co-폴리락타이드) 블록 공중합체의 합성 [MPEG-(PCL-co-PLLA)](카프로락톤 : 락타이드 = 90 : 10)
분자량 2,400 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL)-co-폴리락타이드(PLLA) 블록 공중합체를 합성하기 위하여 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(1.5 g, 2 mmol, Mn = 750 g/mole)과 톨루엔 80 ㎖을 잘 건조된 100 ㎖ 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 40 ㎖ 제거하고 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 25 ℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL)(4.3 g, 37.8 mmol)과 락타이드(LA)(0.6 g, 4.2 mmol) 넣고 반응용매로서 미리 정제된 톨루엔 40 ㎖을 넣은 다음, 중합 촉매로서 Sn(Oct)2를 2.4 ㎖ 넣고 24시간동안 110 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 800 ㎖의 헥산과 200 ㎖의 에테르에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.
상기에서 합성된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 1H-NMR을 이용하여 측정한 결과, 이론적인 예상 값과 유사한 수평균 분자량 2,260 g/mole을 얻을 수 있었고, 다분산도의 측정을 위해 젤 투과 크로마토그래피(GPC)를 이용하여 확인한 결과 1.23의 다분산도를 가짐을 확인하였다.
비교예 3 : 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤 블록 공중합체의 합성 [MPEG-PCL](카프로락톤 : 락타이드 = 100 : 0)
분자량 2,400 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL) 블록 공중합체를 합성하기 위하여 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(1.5 g, 2 mmol, Mn = 750 g/mole)과 톨루엔 80 ㎖을 잘 건조된 100 ㎖ 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 40 ㎖ 제거하고 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 25 ℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL)(4.8 g, 42 mmol)을 넣고 반응용매로서 미리 정제된 톨루엔 40 ㎖을 넣은 다음, 중합 촉매로서 Sn(Oct)2를 2.4 ㎖ 넣고 24시간동안 110 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 800 ㎖의 헥산과 200 ㎖의 에테르에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.
상기에서 합성된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 1H-NMR을 이용하여 측정한 결과, 이론적인 예상 값과 유사한 수평균 분자량 2,430 g/mole을 얻을 수 있었고, 다분산도의 측정을 위해 젤 투과 크로마토그래피(GPC)를 이용하여 확인한 결과 1.26의 다분산도를 가짐을 확인하였다.
실험예 1 : 생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체의 수용액상에서의 온도에 따른 졸-젤 상전이 거동 측정
생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체의 온도에 따른 상전이 거동을 관찰하기 위하여 상기 실시예 및 비교예에 의하여 합성된 공중합체를 20 wt%의 농도로 증류수에 용해시킨 후 균일 분산된 고분자의 평형을 유지하기 위해 하루 동안 4 ℃에서 냉장 보관하였다. 제조된 고분자 용액을 점도 측정기를 이용하여 10 ℃부터 60 ℃의 범위로 2분당 1 ℃씩 증가시키면서 스핀 속도는 0.2 rpm으로 고정하여 각각의 온도에서 졸-젤 상전이 거동을 측정하였다(도 2).
상기 도 2에서 보는 바와 같이, 실시예 및 비교예 3의 블록 공중합체의 경우 상온에서는 점도가 낮은 졸 상태로 존재하나 30 ~ 50 ℃에서는 젤 상태로의 전이가 일어나나, 비교예 1 및 2의 경우에는 상 변화가 일어나지 않고 계속 졸 상태로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체가 체내 온도에서 상전이를 통하여 젤을 형성할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2 : 생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체의 in vivo 젤 형성 확인
신체 온도 부근에서의 졸-젤 상전이를 확인하기 위하여 실시예 및 비교예 3의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체 용액을 실온에서 졸 상태로 유지시킨 후 일회용 주사기를 사용하여 1 mL씩 쥐의 피하에 주입하였다. 24시간 후 주사부위를 절제하여 젤 형성을 확인하였다. 따라서, 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체 용액이 생체 내에서 빠르게 젤을 형성하고 유지되고 있음을 확인할 수 있었다(도 3).
또한 쥐의 피하에의 주입 후 1주, 2주, 4주 및 6주 경과한 시점에서 형성된 젤의 크기를 비교하였다(도 4). 상기 도 4에서 보는 바와 같이 실시예 1 및 2의 블록 공중합체는 6주 경과 후, 1주 때의 젤의 크기의 각각 25%, 50% 정도로 현저하게 감소하였으나, 비교예 3의 블록 공중합체는 6주 경과 후에도 젤의 크기의 변화가 거의 없는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 블록 공중합체는 생체 내에서 젤이 형성된 뒤 빠른 속도로 생분해가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3 : 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 젤의 조직학적 평가
상기 1주, 2주, 4주 및 6주 경과한 시점에서 쥐로부터 제거된 젤을 10% 포르말린에 고정하였고, 고정된 지지체를 파라핀 블록으로 제작하여 4 ㎛ 두께로 자른 후 슬라이드에 고정하고 조직학적 평가를 하기 위하여 H&E, ED1 염색을 실시하였다. H&E 염색은 가장 기본적인 염색법으로 세포의 핵에 특이적으로 염색되는 헤마톡실린(hematoxylin)과 세포질에 염색되는 에오신(eosin)을 이용한 염색법으로 핵과 세포질의 성상을 확인할 수 있는 염색법으로써 이식 체의 전체적인 세포 거동과 모폴로지를 확인하기 위하여 진행되었다. 상기 H&E 염색을 통하여 마크로파지, 호중구, 림프구가 젤 안에 존재하며, 새로운 혈관이 발생됨을 확인할 수 있었다(도 5). 또한 이식된 이식체의 염증 반응 확인을 위하여 ED1 (mouse anti-rat CD68; Serotec, UK) 발현을 확인하였다(도 6).
상기 실험은 통하여 본 발명의 젤이 생체적합성을 가지며 면역 염증 반응을 일으키지 아니함을 확인하여, 조직공학적 지지체로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 수평균 분자량이 350 ~ 2,000 g/mole인 폴리에틸렌글리콜로 구성된 친수성부와, 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트가 동시에 함유된 생분해성 폴리에스터계 소수성부로 구성된 공중합체로서, 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트의 몰 비율(몰분율)이 94 : 6 ~ 99 : 1 범위에 있고, 상온에서는 졸 상(sol phase)이나 30 ~ 50 ℃에서는 젤 상(gel phase)이며, 수평균 분자량이 2,000 ~ 3,000 g/mole 범위에 있는 것을 특징으로 하는 생분해성 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 2 항의 블록 공중합체로 이루어진 조직공학용 지지체.
  6. 제 2 항의 블록 공중합체로 이루어진 유착 방지제.
  7. 제 2 항의 블록 공중합체로 이루어진 약물 전달체.
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