KR101142582B1

KR101142582B1 - β-락타마제 효소에 저항성을 갖는 세팔로스포린 에스테르화합물 및 이의 염

Info

Publication number: KR101142582B1
Application number: KR1020067012853A
Authority: KR
Inventors: 펑치 예; 샹종 팡; 씨우웨이 류
Original assignee: 체지앙 용닝 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2012-05-03
Also published as: JP2007512261A; US7750148B2; CN1637002A; US8168622B2; US20100227843A1; US20070093464A1; WO2005051959A1; EP1702921A4; CN100384857C; EP1702921A1; KR20060111623A

Abstract

본 발명은 일종의 β-락타마제 효소에 저항성을 지니는 세팔로스포린 에스테르 화합물에 관한 것으로서, 상기 화합물의 구조식은 설박탐 할로겐화 메틸 에스테르의 메틸에스테르 잔여기와 반합성 세팔로스포린 또는 이의 염의 잔여기가 서로 연결되어 구성되는 것을 특징으로 하며, 하기 화학식 (I)로 표시된다:

(화학식 Ⅰ)

본 발명은 또한 상기 화합물의 약용 염 및 이들을 내복용 항생물질 제조에 사용하는 방법을 제공한다.

Description

β-락타마제 효소에 저항성을 갖는 세팔로스포린 에스테르 화합물 및 이의 염{β-LACTAMASE-RESISTANT CEPHALOSPORIN ESTER COMPOUNDS AND SALTS OF THEREOF}

본 발명은 일련의 β-락타마제 효소에 대하여 저항성을 갖는 세팔로스포린 화합물 및 이의 염, 및 항생제 조제에 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.

하기의 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물은 모두 반합성 세팔로스포린으로 알려져 있다:

예를 들어, 세페타메트(cefetamet, CAS 등록번호: 65052-63-3), 세퓨록심(cefuroxime, CAS 등록번호: 55268-75-2), 세프라딘(cefradine, CAS 등록번호: 38821-53-3), 세팔렉신(cefalexin, CAS 등록번호: 15686-71-2), 세팍로르(cefaclor, CAS 등록번호: 53994-73-3) 및 세파드록실(cefadroxil, 등록번호: 50370-12-2)이 있으며, 이 중 세페타메트의 (2, 2-디메틸기-1-1 옥시 디옥시) 메틸(cefetamet pivoxil, CAS 등록번호 65243-33-6), 세퓨록심의 1-(아세톡시) 에틸(cefuroxime axetil, CAS 등록번호 64544-07-6) 및 상기 나머지 네 개의 세팔로스포린은 모두 임상에서 내복용 항생제로 사용되고 있다.

하기 화학식 (Ⅲ)으로 표시되는 화합물은 설박탐(sulbactam, CAS 등록번호 68373-14-8) 할로겐화 메틸 에스테르이다:

설박탐은 일종의 β-락타마제 억제제로서, 금황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 여러 종류의 그람(Gram) 음성균이 생성시키는 β-락타마제에 대하여 매우 강력한 불가역적 억제작용을 한다. 2 ㎍/ml 농도로 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ형 β-락타마제에 대한 억제작용이 대단히 강력하다. 페니실린과 세팔로스포린류의 항생물질을 혼합 사용하면 상승 효과가 발생하게 되는데, 현재 임상에 이미 암피실린(ampicillin)을 사용하고 있고, 세포페라존(cefoperazone), 세프트라이악손(ceftriaxone)과 나트륨염의 혼합 주사제는 이러한 항생물질이 β-락타마제에 의해 가수분해되어 항균 활성을 상실하게 되는 것을 방지하고, 효소 발생으로 인하여 약물에 내성이 생긴 세균에 대한 이러한 항생물질의 최소 저지 농도(MIC)를 낮춘다.

알려진 바와 같이, 정맥용 약제는 복잡하게 많을 뿐만 아니라 B형 및 C형 간 염, 에이즈병 등과 같은 혈원성 전염병의 위협을 받고 있다. 또한 경미하거나 중간 정도의 염증환자 또는 정맥 항염 이후에 대한 연쇄치료(sequence treatment)는 종종 내복약만 필요하여 사용이 간편하고 안전할 뿐만 아니라, 많은 인력과 물력 및 재력을 절약할 수 있다. 그러나 β-락타마제 내복 항생물질 중 효소를 생성하는 약품에 대한 내성 현상이 매우 보편화되어 치료효과가 나빠지게 된다. 따라서 β-락타마제에 저항성을 지닌 내복 항생물질을 조제하는 것은 항생물질 제약 분야의 연구 과제이다.

현재 이미 화학식 (Ⅲ)과 암피실린을 화학적으로 합성한 디에스테르(di-esters)- 설타미실린(Sultamicillin, CAS 등록번호 76497-13-7)이 있으며, 이는 이미 임상적으로 널리 사용되는 내복 항균제의 하나로서, 내복 후 장벽의 에스테라제를 암피실린과 설박탐으로 가수분해하여 설박탐과 암피실린 혼합주사제와 동일한 치료효과를 얻는다. 그러나 현재 화학식 (Ⅲ)을 세팔로스포린과 화학적으로 합성하여 복용이 가능한 β-락타마제 효소에 저항성을 지닌 항생물질로 조제한 화합물은 없다.

본 발명의 목적은 상기 과제를 해결하기 위하여 일종의 β-락타마제 효소에 저항성을 지닌 세팔로스포린 화합물 및 이의 염을 제공하고자 하는데 있다.

본 발명의 목적은 다음과 같은 기술수단으로 실현된다.

일종의 β-락타마제 효소에 저항성을 지닌 세팔로스포린 화합물의 특징은 상기 화합물의 화학식이 설박탐 할로겐화 메틸 에스테르의 메틸 에스테르 잔여기와 반합성 세팔로스포린 또는 이의 염의 카르복실 잔여기가 서로 연결되어 구성된다는 점이다.

그 중 상기 반합성 세팔로스포린의 염은 무기염 또는 유기 알카리염이다.

상기 무기염은 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 또는 칼슘염이고, 상기 유기알칼리염은 트리에틸아민염, 트리부틸아민염, 1.8-디아자비시클로 (diazabicyclo)[5,4,0]운데크(undec)-7-엔(ene)염, 디시클로헥실아민염 또는 테트라부틸암모늄염이다.

상기 반합성 세팔로스포린은 세페타메트, 세퓨록심, 세프라딘, 세팔렉신, 세팍로르 또는 세파드록실로 이루어진 군으로부터 선택한다.

상기 설박탐 할로겐화 메틸 에스테르는 설박탐브로모메틸 에스테르 또는 설박탐요오드메틸 에스테르일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 화합물의 약용 염을 제공한다.

그 중 상기 약용 염은 무기염 또는 유기산염을 말한다.

상기 무기염 또는 유기산염은 염산염, 황산염, 파라톨루엔설포네이트, 주석산염, 말레산염 및 유산염일 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 이의 약용 염의 특징은 상기 화합물이 하기와 같은 화학식 (Ⅰ)로 표시된다는 점이다:

상기 화학식 (Ⅰ) 중 R 및 R₁은 구체적으로 다음 표와 같다:

상기 계열의 화합물 (Ⅰ)의 화학명칭은 각각 다음과 같다:

YR-1: 5-티아-1-아자비시클로[4,2,0]옥탄-2-에틸렌-2-카르복실산, 7-[[(2-아미노-4-티아졸일)(메톡시이민)아세틸]아미노]-3-메틸-8-옥소-, [[3,3-디메틸-4,4-디옥시-7-옥소-4-티아-1-아자비시클로[3,2,0]헵탄-2-기]카르보닐옥시]옥시]메틸에스테르 및 이의 염.

YR-2: 5-티아-1-아자비시클로[4,2,0]옥탄-2-에틸렌-2-카르복실산, 7-[[(2-퓨란(메톡시이민)아세틸)아미노]-3-[[(아미노카르보닐옥시)옥시]메틸]-8-옥소-, [[3, 3-디메틸-4,4-디옥시-7-옥소-4-티아-1-아자비시클로[3,2,0]헵탄-2-숙시네이트카르보닐옥시]옥시]메틸에스테르 및 이의 염.

YR-3: 5-티아-1-아자비시클로[4,2,0]옥탄-2-에틸렌-카르복실산, 7-[[아미노-1,4-시클로 헥사디엔-1-기-아세틸]아미노], 3-메틸-8-옥소-, [[3, 3-디메틸-4,4-디옥시-7-옥소-4-티아-1-아자비시클로[3,2,0]헵탄-2-기]카르보닐옥시]옥시]메틸에스테르 및 이의 염.

YR-4: 5-티아-1-아자비시클로[4,2,0]옥탄-2-에틸렌-2-카르복실산, 7-[[아미노페닐 아세틸]아미노], 3-메틸-8-옥소-, [[3,3-디메틸-4,4-디옥시-7-옥소-4-티아-1-아자비시클로[3,2,0]헵탄-2-기]카르보닐옥시]옥시]메틸에스테르 및 이의 염.

YR-5: 5-티아-1-아자비시클로[4,2,0]옥탄-2-에틸렌-2-카르복실산, 7-[[아미노(4-히드록실페닐)-아세틸]아미노]-8-옥소-, [[3,3-디메틸-4,4-디옥시-7-옥소-4-티아-1-아자비시클로[3,2,0]헵탄-2-기]카르보닐옥시]옥시]메틸에스테르 및 이의 염.

YR-6: 5-티아-1-아자비시클로[4,2,0]옥탄-2-에틸렌-2-카르복실산, 7-[[아미노페닐 아세틸]아미노], 3-클로로-8-옥소-, [[3,3-디메틸-4,4-디옥시-7-옥소-4-티아-1-아자비시클로[3,2,0]헵탄-2-기]카르보닐옥시]옥시]메틸에스테르 및 이의 염.

본 발명의 화합물 및 이의 염은 설타미실린과 동일한 체내대사 특징을 지니고 있어, 복용 후 장벽의 에스테라제에 의해 세팔로스포린과 설박탐으로 가수분해되며, 체내의 상승 효과로 이러한 세팔로스포린이 모종의 세균에 의해 생성되는 β-락타마제 효소의 가수분해 부족분을 보충해주어, 효소 생성으로 인하여 이러한 세팔로스포린에 대해 내약성을 지니게 된 세균들의 최저 저지 농도를 민감 범위 내로 낮출 수 있다.

그 가용 화합물 (Ⅱ), (Ⅲ)은 에스테르화 반응을 거쳐 합성된다. 화합물 (Ⅱ)는 이미 임상에 널리 사용되는 세팔로스포린 항생물질이고, 화합물(Ⅲ)은 Vytautas J. Jasys 등의 1984년 <USP4,444,686>과 쟝나이차이(姜乃才) 등의 <의약공업, 1985, 16(8), 346-9> 에 보도된 방법을 참고하여 합성할 수 있다.

본 발명의 화합물은 두 가지 방법으로 합성된다:

방법 1(YR1 내지 6의 합성에 적용)

방법 2(YR3 내지 6의 합성에 적용)

방법1:

방법1을 사용하여 화합물 (Ⅰ)을 합성할 때 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 트리에틸아민염, 트리부틸아민염, 1.8-디아자비시클로[5,4,0]운데크-7-엔(DBU) 염, 디시클로헥실아민염 또는 테트라부틸암모늄염과 같은 화합물 (Ⅱ)의 염을 사용하여야 한다. 실시예에서 소개된 것은 나트륨염, 칼륨염, 트리부틸아민염 및 DBU염이다.

화합물 (Ⅰ)을 합성할 때 사용되는 화합물 (Ⅱ)와 (Ⅲ)의 그램분자량비는 1:0.9~1:1.5이며, 그 중 1:0.98~1:1이 가장 이상적이다. 양자의 반응은 -15 ℃ ~ 30 ℃에서 진행되며, 반응시간은 일반적으로 30분 내지 15시간 동안으로, 반응과정 중 18 크라운에테르-6, 16 크라운에테르-4, 12 크라운에테르-2, 테트라부틸 암모늄 히드로겐 설파이트, 테트라부틸 암모늄 브로마이드 등을 첨가하면 반응이 진행되는데 유리하다.

반응용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 디클로로에탄 등과 같은 할로겐화 알칸 또는 아세톤, 시클로부타논, 시클로헥사논, 메틸이소부틸케톤 등과 같은 케톤류를 사용할 수 있고, 디메틸 아세타미드, 디메틸 포름아미드, 디메틸 설폭시드(sulfoxide) 등과 같은 극성 비양성자 용매도 사용 가능하다. 실시예에서는 용매로서 디메틸 아세타미드와 디메틸 포름아미드를 사용하는 반응 방법을 사용하였다. 본 발명의 화합물 및 이의 염은 모두 내복용 항균제로 조제할 수 있으며, 본 발명의 화합물은 염산염, 황산염, 파라톨루엔설포네이트, 주석산염, 말레산염과 유산염 등과 같은 여러 종류의 무기염과 유기산염으로 조제할 수 있다. 실시예에서는 본 발명의 화합물 중 파라톨루엔설포네이트와 염산 등 염의 조제 방법을 소개하였다.

방법 2:

방법 2는 YR3 내지 6에 적용되는 합성 방법으로서, 그 특징은 화합물 (Ⅱ)와 벤즈알데히드를 디메틸포름아미드, 디메틸아세타미드 등과 같은 극성 비양성자 용매 또는 메탄올, 에탄올 등 저급 알콜 속에 반응시켜, 측쇄 상의 α-아미노를 보호하여 쉬프베이스(shiff base)를 형성한 다음, 다시 방법 1을 이용하여 중간체-화합물 (Ⅳ)를 합성하고, 마지막으로 지라드 시약을 사용하여 보호기를 제거하고 화합물 Ⅰ(YR3-6) 및 이의 염을 조제하는 방법이다.

실시예 1

화합물(Ⅱ-1) 칼륨염 11.0 그램(0.025 몰)을 디메틸아세타민 100 ml에 현탁하여 고르게 교반한 후 18 크라운에테르-6을 0.5 g을 첨가하여 이를 완전히 녹인 다음, 용액을 0 ℃로 냉각하고, 화합물(Ⅲ)(X=I) 9.4 그램(0.025 몰)을 첨가하여 0 ℃에서 30 분 동안 교반한 후, 박층크로마토그래피^*로 반응을 제어한다. 원료의 반점이 사라진 후 반응액에 에틸아세테이트 200 ml와 물 200 ml를 첨가하여 충분히 교반한 다음 층을 나누어 수분 층을 가려내고, 에틸아세테이트 200 ml를 이용하여 에틸아세테이트층을 추출, 합병하여 순서대로 150 ml의 물에 5 ml의 탄산수소나트륨 포화수용액을 첨가한 혼합액 및 포화클로로나트륨 수용액으로 세척한 후, 활성 탄소와 무수황산마그네슘으로 탈색, 탈수시킨다. 감압증류를 이용하여 에틸아세테이트로 얻어진 기름 상태의 물질을 제거하고 이소프로판올 200 ml를 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 교반한 후 백색 침전 여과물을 석출하고, 침전찌꺼기를 소량의 이소프로판올로 세척하여, 실온에서 진공 건조시켜 12.9 그램의 백색 화합물 YR-1을 얻는다. 수율은 80 %이며, 고압액상 측정 순도는 98.5 %이다.

^* 실리카겔판 HSGF254, 전개제 이소프로판올: 초산에틸(2:1)

화합물(YR-1) Rf=0.8

화합물(Ⅰ)에서 IR과 ¹H NMR을 통하여 확인한다:

실시예 2

DBU 4.6 그램(0.03 몰)을 디메틸포름아미드 200 ml에 녹여 0 ℃까지 교반하여 냉각시키고, 화합물(Ⅱ-1) 13.1 그램(0.03 몰)과 화합물(Ⅲ)(X=I) 11.2 그램(0.03 몰)을 첨가하여 0 ℃ 이하에서 30 분 동안 반응시킨 다음, 박층 크로마토그래피를 이용하여 원료의 반점이 사라질 때까지 추종 반응한다. 반응이 완료되면 실시예 1과 동일한 방법으로 반응액을 처리하여 화합물 YR-1 15.4 g을 얻는다. 수율은 80 %이며, 고압액상 측정순도는 98.2 %이다. 생성물의 IR과 ¹H NMR 분석결과는 실시예1의 생성물과 일치한다.

실시예 3

화합물(Ⅱ-1) 칼륨염 11.0 그램(0.025 몰)을 디메틸아세타미드 150 ml에 현탁하고, 20 ℃ ~ 25 ℃로 제어하여 교반한 다음 테트라부틸암모늄히드로겐설파이트 2.1 g(0.006 몰)과 화합물(Ⅲ)(X=I) 9.4 그램(0.025 몰)을 첨가하여 동일한 온도에서 4~6 시간 동안 반응시키고, 박층 크로마토그래피를 이용하여 원료의 반점이 사라질 때까지 추종 반응시킨다. 반응이 완료된 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 반응액을 처리하여 YR-1 13.7 g을 얻는다. 수율은 85 %이며, 고압액상 측정순도는 98.7 %이다. 생성물의 IR과 ¹H NMR 분석결과는 실시예1의 생성물과 일치한다.

실시예 4

화합물(YR-1) 6.45 그램(0.01 몰)(실시예 2에 따라 제조한 것)을 실온 조건 하에서 교반하여, 에틸아세테이트 65 ml에 용해시킨 후, 파라톨루엔설포네이트 2.1 그램(0.012 몰)을 첨가하여 교반하면서 천천히 고체를 석출한다. 3 시간 동안 계속 교반하여 여과시킨 다음 고체를 소량의 에틸아세테이트로 세척하고 진공건조하여 7.2 g의 백색화합물(YR-1)인 파라톨루엔설포네이트를 얻는다. 수율은 88 %이며, 고압액상 측정순도는 98.5 %이다.

화합물 YR-1 파라톨루엔설포네이트는 IR과 ¹H NMR로 확인한다.

실시예 5

화합물(Ⅱ-2) 나트륨염 9.1 그램(0.025 몰)을 디메틸아세타미드 100 ml에 현탁한 다음 교반하여, 0.5 그램의 18 크라운에테르-6을 첨가하여 혼합물을 -15 ℃로 냉각하고, 화합물(Ⅲ)(X=I) 9.4 그램(0.025 몰)을 첨가하여 3 시간 동안 교반한다. 반응이 완료된 후, 반응액에 에틸아세테이트 200 ml와 물 200 ml를 첨가하여 1분 동안 충분히 교반한 다음 정지 상태에서 층을 분리하여 에틸아세테이트층을 분리해내고, 수분층은 다시 에틸아세테이트 200 ml로 추출하여 유기상으로 합병하고, 순서대로 묽은 탄산수소나트륨 수용액 150 ml, 물 150 ml와 포화식염수 100ml로 세척하고, 다시 활성탄소로 탈색시킨 다음 무수황산마그네슘으로 탈수시킨다. 감압증류법으로 에틸아세테이트를 제거하여 기름 상태의 물질을 얻으며, 기름 상태의 물질을 이소프로판올 200 ml에서 30분 동안 교반하고 여과한 후, 소량의 이소프로판올로 세척, 건조 후 YR-2 백색 고체 12.5 그램을 얻는다. 수율은 85 %이고, 고압액상 측정순도는 97.8 %이다.

화합물 YR-2를 IR과 ¹H NMR로 확인한다.

실시예 6

디메틸아세타미드 200 ml에 트리부틸아민 5.6 그램(0.03 몰)을 첨가하여 고르게 교반한 후 화합물(Ⅱ-2) 8.6 그램(0.025 몰)을 첨가하여 20 ℃로 제어하여 완전히 용해될 때까지 교반한 다음 -15 ℃로 냉각시켜 화합물(Ⅲ)(X=I) 9.4 그램(0.025 몰)을 첨가하고, -15 ℃에서 2 시간 동안 교반한다. 그런 다음 실시예 5에 따라 조작하여 YR-2 12.1 그램을 얻는다. 수율은 82 %이며, 고압액상 측정순도는 98.2 %이다. IR, ¹H NMR 측정결과를 거친 제품은 실시예 5의 생성물과 일치한다.

실시예 7

디메틸아세타미드 36.5 ml에 화합물(Ⅱ-3) 3.6 그램(0.01 몰)을 첨가하여, -10 ℃까지 교반하여 냉각시킨 다음 DBU 1.53 그램(0.01 몰)을 점적 첨가하여 용액으로 만들고, 화합물(Ⅲ)(X=Br) 3.25(0.01 몰)를 첨가하여, 12 시간 동안 교반 반응한 후, 반응액에 에틸아세테이트 100 ml, 3 %의 탄산수소나트륨 용액 30 ml와 15 %의 염화나트륨 수용액 50 ml를 첨가하여 10분 동안 교반한 다음, 정지 후 유기층을 분리해 내고, 다시 15 %의 염화나트륨 수용액으로 회 당 50 ml씩 2회 세척한다. 유기층은 활성탄소로 탈색시키고, 무수황산마그네슘으로 건조시킨 후, 0 ℃로 냉각시켜 건조된 염화수소가스를 주입하여 pH가 2.5에 이르도록 한다. 이 때 대량의 고체가 석출되며, 이를 여과하여 고체는 에틸에스테르로 3차례 세척하고, 진공 건조 후 YR-3 염산염 1.05 그램을 얻는다. 고압액상분석 순도는 97 %이다.

화합물 YR-3 염산염은 IR과 ¹H NMR로 확인한다.

실시예 8

디메틸아세타미드 36.5 ml에 화합물(Ⅱ-3) 3.6 그램(0.01 몰)을 첨가하여 -10 ℃로 교반하여 냉각시킨 다음 DBU 1.53 그램(0.01 몰)을 점적 첨가하여 청징(clarifying) 용액을 만든 후, 화합물(Ⅲ)(X=I) 3.36 그램(0.009 몰)을 첨가하여 12 시간 동안 교반 반응시킨 다음, 반응액에 에틸아세테이트 100 ml와 pH값이 1인 염산용액 150 ml를 첨가하여 교반하고 층을 분리하여, 수분층에 에틸아세테이트 100 ml를 첨가한 후 포화탄산수소나트륨 용액으로 pH를 7.5까지 조절하여 층을 분리한다. 유기층은 3 %의 탄산수소나트륨과 15 %의 염화나트륨 혼합액 50 ml로 3차례 세척하고, 유기층을 활성탄소로 탈색시켜, 무수황산마그네슘으로 건조시킨 후, 여과하여 0 ℃로 냉각시키고, 건조된 염화수소가스를 주입하여 pH를 2.5에 이르도록 한다. 이 때 대량의 고체가 석출되는데, 이를 여과하여 고체를 에틸에스테르로 3차례 세척하고, 진공 건조시킨 후 YR-3 염산염 0.9 그램을 얻는다. 고압액상 분석순도는 94.5 %이며, IR과 ¹H NMR 측정을 거친 제품은 실시예 7의 생성물과 일치한다.

실시예 9

디메틸아세타미드 36.5 ml에 화합물(Ⅱ-3) 3.6 그램(0.01 몰)을 첨가하여 -10 ℃까지 교반하여 냉각시킨 후 DBU 1.53 그램(0.01 몰)을 점적 첨가하여 청징액을 만든 후, 화합물(Ⅲ)(X=I) 5.6 그램(0.015 몰)을 첨가하여 12 시간 동안 교반 반응시키고, 반응액에 에틸아세테이트 100 ml와 pH값이 1인 염산용액 150 ml를 첨가, 교반하여 층을 분리한다. 수분층에 에틸아세테이트 100 ml를 첨가한 후 포화탄산수소나트륨 용액으로 pH가 7.5에 이를 때까지 조절하여 층을 분리하며, 유기층은 3 %의 탄산수소나트륨 용액과 15 %의 염화나트륨 혼합액 50 ml로 3차례 세척한다. 유기층을 활성탄소로 탈색시키고 무수황산마그네슘으로 건조시킨 후, 여과하여, 여과액을 0 ℃로 냉각시키고, 건조된 염화수소가스를 주입시켜 pH를 2.5에 이르도록 한다. 이 때 고체가 석출되는데, 고체를 에틸아세테이트로 3차례 세척하고, 진공 건조시켜 YR-3 염산염 0.95 그램을 얻는다. 고압액상 분석순도는 95.5 %이며, IR과 ¹H NMR 측정을 거친 제품은 실시예 7의 생성물과 일치한다.

실시예 10

실시예 7에 따라 조작하되, 0.01 몰의 디시클로헥실아민으로 DBU를 대체하고, 0.01 몰의 화합물(Ⅲ)(X=I)로 브로모메틸에스테르를 대체한다. 반응시간은 1.5 시간이며, YR-3 염산염 1.15 그램을 얻는다. 고압액상 분석순도는 96 %이며, IR과 ¹H NMR 측정을 거친 생성물은 실시예 7과 동일하다.

실시예 11

디메틸아세타미드 40 ml에 화합물(Ⅱ-3) 나트륨염 3.72 그램(0.01 몰)을 첨가하여 0 ℃까지 교반하여 냉각시킨 다음, 벤즈알데히드 1.062 그램(0.01 몰)을 첨가하여 0 ℃에서 10 시간 동안 반응한다. 반응액을 -20 ℃로 냉각하여 화합물(Ⅲ)(X=I) 3.73 그램(0.01 몰)을 첨가하고, 3 시간 동안 교반하여 반응시킨다. 디클로로메탄 110 ml와, 3 %의 탄산수소나트륨용액 50 ml, 15 %이 염화나트륨수용액 50 ml를 첨가하여 10분 동안 교반하고 정지시켜 층을 분리하여 유기상을 분리해낸 다음, pH 7.5의 인산완충액 100 ml로 2차례 세척하고 포화염화나트륨수용액 100 ml로 2차례 세척한다. 분리해낸 유기상은 활성탄소와 무수황산마그네슘으로 탈색 및 탈수시키고, 진공 농축하면 기름 상태의 물질이 되는데, 50 ml의 에틸에테르를 첨가한 후 교반하여 화합물 Ⅳ,

인 백색결정 6.12 그램을 얻는다.

파라톨루엔설포네이트 2.1 그램과 지라드 시약 2.1 그램을 메탄올 10 ml에 용해시켜 실온 상태에서 4.78 그램(0.01 몰)의 상기 생성물을 첨가하여 30분 동안 교반한 다음, 감압증류로 메탄올을 석출하고 잔류물질에 디클로로메탄 30 ml, pH 7.5 인산완충액 30 ml를 첨가하여 10분 간 교반하고, 정지 후 층을 분리하여 수분층을 분리해낸 후, 디클로로메탄 25 ml로 × 3차례 증류하여 추출한다. 유기층을 합병하여 포화염화나트륨수용액으로 2차례 세척하고 수분층을 분리하여, 유기상을 무수황산나트륨으로 건조시키고, 0 ℃로 냉각시켜 건조된 염화수소가스를 주입시켜 pH가 2.0에 이르도록 한다. 고체를 여과 수집하여 소량의 디클로로메탄으로 3차례 세척하고, 진공 건조시켜 YR-3 염산염 3.8 그램을 얻는다. 고압액상 분석순도는 96.5 %이며, IR과 ¹H NMR 측정을 거친 생성물은 실시예 7과 동일하다.

실시예 12

디메틸아세타미드 42 ml에 화합물(Ⅱ-4) 3.65 그램(0.01 몰)을 첨가하여 -15 ℃로 교반하여 냉각시키고, DBU 1.53 그램(0.01 몰)을 점적 첨가하여 30분 동안 교반한 다음 동일한 온도에서 화합물Ⅲ(X=Br) 3.25 그램(0.01 몰)을 첨가하여 13 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 디클로로메탄 100 ml, pH 7.5인 인산완충액 100 ml를 첨가하여 10분간 교반하고, 정지시켜 층을 분리한다. 유기상은 순서대로 pH 7.5인 인산완충액 50 ml로 × 2차례 세척하고, 포화염화나트륨수용액 50 ml로 × 2차례 세척한 다음 활성탄소로 탈색시키고, 무수황산마그네슘으로 건조시킨 후, 처리를 거친 유기상을 0 ℃로 냉각시키고, 건조 염화수소가스를 주입하여 pH 2.0에 이르도록 한 다음, 여과하여 고체를 수집하고, 디클로로메탄으로 3차례 세척하고 진공 건조시켜 YR-4 염산염 1.8 그램을 얻는다. 고압액상 크로마토그래피 측정순도는 97.2 %이다.

화합물 YR-4 염산염 구조는 IR과 ¹H NMR 측정을 거쳐 확인한다.

실시예 13

디메틸포름아미드 50 ml에 화합물(Ⅱ-4) 칼륨염 4.03 그램(0.01 몰)을 첨가하여, 0 ℃까지 교반하여 냉각시킨 후, 벤즈알데히드 1.062 그램(0.01 몰)을 첨가하여 0 ℃ ~ 5 ℃에서 8 시간 동안 반응시킨 다음, 반응액을 -15 ℃로 냉각시키고, 화합물(Ⅲ)(X=I) 3.37 그램(0.01 몰)을 첨가하여 2 시간 동안 교반하여 반응시킨다. 나머지 반응 조작은 실시예 9에 따르며, 중간생성 화합물 (Ⅳ),

인 백색결정 6.05 그램을 얻은 후, 최종적으로 YR-4 염산염 3.65 그램을 얻는다. 고압액상 분석순도는 95.6 %이며, IR과 ¹H NMR 측정을 거친 생성물은 실시예 10과 동일하다.

실시예 14

화합물(Ⅱ-5) 3.65 그램(0.01 몰)을 디메틸포름아미드 37 ml에 현탁하여 -20 ℃로 냉각시키고, DBU 1.51 그램(0.01 몰)을 첨가, 교반하여 용해시킨 후, 화합물(Ⅲ)(X=I) 3.73 그램(0.01 몰)을 첨가하여 30분 동안 교반한다. 반응액에 에틸아세테이트 37 ml와 15 %의 염화나트륨 및 5 %의 탄산수소나트륨을 함유한 수용액 80 ml를 첨가하여 10간 교반하여 층을 분리한다. 분리해낸 유기층을 상기 염의 혼합물 수용액으로 2차례 세척한 후 무수황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여, 여과액에 건조 염화수소가스를 주입하여 pH가 2~3에 이르도록 한다. 결정을 석출한 후, 계속 10분 동안 교반하고 여과하여 소량의 에틸아세테이트로 세척하고 진공건조시켜 3.7 그램의 YR-5 염산염 백색결정을 얻는다. HPLC 측정순도는 95.6 %이다.

화합물 YR-5 염산염은 IR과 ¹H NMR 측정을 거쳐 확인한다.

실시예 15

화합물(Ⅱ-5) 칼륨염 4.01 그램(0.01 몰)을 용액 15 ml의 디메틸포름아미드에 첨가하여, 0 ℃로 냉각하고 벤즈알데히드 1.27 그램(0.012 몰)을 첨가하여 8 시간 동안 교반하여 반응시킨 다음, 화합물(Ⅲ)(X=I) 3.73 그램(0.01 몰)을 첨가하여 30분 동안 교반하여 반응시킨 후, 에틸아세테이트 40 ml 및 15 %의 염화나트륨과 5 %의 탄산수소나트륨을 함유한 혼합수용액 80 ml를 첨가하여 10분간 교반한다. 유기층을 분리해내어 포화염화나트륨수용액으로 세척하고, 무수황산마그네슘으로 건조시켜 여과한 후, 감압증류로 유기용매를 제거한 후, 이소프로필에테르 50 ml를 첨가하고 교반하여 황색을 띠는 화합물(Ⅳ),

결정 6.1 그램을 얻으며, 나머지의 반응 조작은 실시예 9에 따라 YR-5 염산염 2.56 그램을 얻는다. HPLC 측정순도는 97.2 %이며, 생성물의 IR과 ¹H NMR 분석결과는 실시예 12와 동일하다.

다음은 YR-1, YR-2을 취하여 체외항균활성실험을 한 것으로서, 마우스에게 투약한 후 생체외(ex vivo) 항균활성 실험과 마우스의 최대 내수량 실험(이러한 실험은 상하이(上海) 의약공업연구원이 완성하였음)을 통하여 본 발명인 화합물의 항균효과 및 응용에 관하여 설명하고자 한다.

효과 실시예 1: 체외항균활성실험

1. 실험재료: 실험샘플 YR-1, YR-2를 각각 실시예 1과 실시예 5에 따라 조제하며, 대조실험샘플은 세페타메트 나트륨(CTM), 세퓨록심 나트륨(CRX), 세페타메트 나트륨+설박탐 나트륨(CTM+SBT) 1:1(몰비)과 세퓨록심+설박탐나트륨(CRX+SBT) 1:1(몰비)이다. 상기 샘플은 모두 저쟝(浙江) 영녕제약창(永寧製藥廠)(시중 판매제품)에서 제공하였다.

2. 실험균종:

금황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 26003, 폐렴쌍구균(Diplococcus lanceolatus) 31002, 대장간균(E coli) 44102, 소네이 이질간균(Shigella sonnet) 51081, 보이디이 이질간균(Shigella bogdii) 51313, 플렉스네리 이질간균(Shigella flexneri) 51573, 변형간균(Proteus mirabilis) 49005, 보통변형간균(Bacillus proteus) 49085, 모르가넬라 변형간균(Proteus morganii) 49086, 녹농간균(Pseudomonas aeruginosa) 10124, 폐렴간균(Bacillus pneumoniae) 46101, 장염살모넬라균(Salmonella enteritidis) 50041, 상한간균(Salmonella typhi) 50097, 구연산간균(Citrobacter) 48017, 점질 세라티아간균(Candida ciferii) 41002는 상하이시 위생방역소에서 제공하였다.

표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis) 26069, 에로박터간균(Bacillus aerogenes) 45102는 베이징 약품생물제품감정소에서 제공하였다.

폐렴쌍구균(Diplococcus lanceolatus) 0031은 상하이 제1인민의원에서 제공하였다.

3. 배양기: Mueller-Hinton Agar(M.H) 한천배양기, 로트번호(lot number) 20040528(중국설사병제어 상하이시약공급연구센터).

4. 실험 방법: 한천 2배 희석법을 이용하여, 다점(多点)접종기로 정량을 접종하며, 점당 10⁵CFU/ML을 접종한다. 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 실험결과를 관찰 및 기록한다. 항균약물로 세포 생장을 억제하는 최저농도를 최저저지농도(MIC)로 한다.

5. 실험 결과:

6. 결론:

YR-1과 YR-2는 체외에서 모두 항균활성을 지니고 있다. 그 항균 활성은 각각 CTM+SBT 및 CRX+SBT와 대체적으로 일치한다. β-락타마제 효소를 생성시키는 그람(Gram) 음성균에 대하여 양자는 모두 CTM과 CRX를 단독으로 사용했을 경우보다 항균활성이 큰 폭으로 증강되어, 예를 들어 모르가넬라변형간균 49086, CTM, CRX에 대한 MIC는 각각 ＞100 mg/ml, 100 mg/ml이었다. 그리고 YR-1과 YR-2의 MIC는 즉 0.78 mg/ml, 25 mg/ml로서, 양자의 항균활성은 각각 100배와 4배씩 증가되었다. CTM은 제3세대 세팔로스포린으로서, 어떤 그람 양성균과 녹농간균들에는 효과가 없었으며, CRX는 제2세대 세팔로스포린으로서, 어떤 그램 양성균들에 대한 작용은 미약하였고, 녹농간균에 대해서는 무효하였다. YR-1과 YR-2의 항균활성도 동일한 결과를 나타내었다. 효소를 생성시키지 않는 세균들에 대해서 YR-1과 YR-2는 CTM, CRX의 항균활성과 일치한다.

효과 실시예 2: 마우스 약제 투여 후 생체외(ex vivo) 항균활성 실험

1. 실험재료: 실험샘플은 YR-1, YR-2이고, 대조실험샘플은 CTM, CRX, CTM+SBT 1:1과 CRX+SBT 1;1이다. 상기 샘플의 출처는 위와 동일하다.

2. 실험균종:

보통변형간균 49085, 모르가넬라변형간균 49086. 각 페트리 접시마다의 균액은 10⁵CFU/ML이다.

3. 배양기: Mueller-Hinton Agar(M.H.) 한천배양기, 로트번호 000707(중국설사병제어 상하이시약공급연구센터).

4. 실험동물:

품계: 쿤밍(昆明)종 마우스:공급원: 상하이 의약공업연구원 동물실 공급: 합격증 번호: 여동합증자(濾動合證字) 제107호; 동물수: 120마리; 성별: 암수 각 절반; 체중: 18~21g; 금식시간: 16시간.

5: 실험방법:

제1 그룹: CTM, CRX, CTM+SBT(균등몰(mol)로 혼합), CRX+SBT(균등몰로 혼합) 4종 약물의 사용량은 500 mg/kg이고, 투여방법은 정맥주사이다. 채혈점은 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간으로 한다.

제2 그룹: YR-1, YR-2의 약제 사용량은 1000 mg/kg이며, 투약 방법은 위장관류이다. 채혈점은 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간이다.

실험동물을 공복 시의 체중, 성별에 따라 랜덤으로 그룹을 나눈다. 각 채혈점은 3마리의 동물을 취한다. 헤파린으로 응고를 막고, 채혈 후 원심분리로 혈장을 분리한다. 정량의 샘플을 가하여, 저지대(inhibition zone)의 크기를 근거로 반정량(semi-quantify) 항균활성을 테스트한다.

6. 실험결과

7. 결론

마우스에게 YR-1과 YR-2를 복용시킨 후, 혈중에서 항균활성을 검출할 수 있었다. YR-1과 YR-2 동물 위장관류 후 안정적이고 지속적인 혈중약물 농도를 유지하여, 투약 8시간 경과 시 혈중에는 여전히 항균활성이 측정되었다. 그리고 CTM, CRX, CTM+SBT, CRX+SBT는 복용 방법으로는 흡수되지 않기 때문에 모두 정맥주사로 투약하여 혈중약물 피크 농도에 쉽게 도달할 수 있었다. 생체외(ex vivo) 항균활성 테스트에서는 비교적 강한 항균활성이 나타났으나 대사가 비교적 빨라 투약 후 8시간 경과 시 혈중에 항균활성이 검측되지 않았다. 양자의 대조에서 알 수 있듯이, YR-1과 YR-2를 복용한 후 체내에는 비교적 긴 반감기로 긴 효과를 나타내는 작용을 지니고 있다.

효과 실시예 3: 마우스 최대 내수량 실험

1. 실험재료: YR-1, YR-2 실험샘플은 위와 같다.

2. 실험동물:

품계: 쿤밍종 마우스: 공급원: 상하이 의약공업연구원 동물실 공급: 합격증번호: 여동합증자 제107호; 동물 수: 20마리; 성별: 암수 각 반씩; 체중: 18~21g; 금식시간: 16시간

3. 약제량

샘플조제: 5 g/kg(5 %의 CMC, 즉 카르복시메틸셀룰로스나트륨으로 조제); 접종량: 0.6 ml/20g 체중/회; 투약 횟수: 1회; 약제량: 5 g/kg/24hr

4. 투약경로: 내복 위장관류

5. 실험방법:

실험 시, 합격된 마우스 각 20마리를 암수 절반씩 취하여, 위장관류주사기로 마우스에게 YR-1 또는 YR-2를 먹인다. 투약 후 즉각 동물 중독증상의 각종 표현을 관찰하고 사망동물 수를 기록한다.

6. 관찰지표:

마우스에게 YR-1, YR-2를 투여한 후, 즉각 동물의 각종 표현과 중독 증상을 관찰한다. 실험 기간은 매일 2회 관찰한다(오전, 오후)

사망: 관찰기간 내의 마우스 사망 수를 기록한다. 사망한 동물은 즉각 해부하여 주요 장기(심장, 간장, 비장, 폐, 신장 등)의 변화를 육안으로 관찰하여, 만약 육안으로 이상이 발견되면 병리 검사를 진행한다.

독성 반응: 관찰기 내의 암, 수 마우스의 행위 활동, 피부, 호흡, 대소변, 식욕, 코, 눈, 구강에 이상 분비물의 유무 등을 기록한다.

관찰기: 7일간이며, 관찰기가 완료된 후 살아있는 쥐들을 사망시켜, 해부하여 실험동물의 내장기관의 이상유무를 육안으로 검사한다.

7. 실험결과:

암수 마우스를 투약 전 16시간 동안 굶긴 후 YR-1, YR-2를 투여하였으며, 마우스에 뚜렷한 독성반응이 나타나는 이상현상이 없었고, 마우스의 활동에도 뚜렷한 변화가 없었으며, 사망 후 내장기관에도 이상이 발견되지 않았다.

8. 결론:

YR-1과 YR-2의 독성이 비교적 낮기 때문에 LD₅₀값을 측정할 수 없었으며, 따라서 최대 내수량 실험을 진행하였다. 실험결과를 통하여 그 LD₅₀＞5 g/kg인 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 YR-1과 YR-2가 복용 가능하며, 안전한 저독성 약물임을 나타내고 있다.

Claims

β-락타마제 효소에 내성을 지닌 세팔로스포린 에스테르 화합물로서,

상기 화합물의 구조는 설박탐 할로겐화 메틸 에스테르의 메틸 에스테르 잔여기와 반합성 세팔로스포린 또는 이의 염의 카르복실 잔여기가 서로 연결되어 구성되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 있어서,

상기 반합성 세팔로스포린의 염은 무기염 또는 유기 알칼리염인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 2 항에 있어서,

상기 무기염은 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 또는 칼슘염이고;

상기 유기 알칼리염은 트리에틸아민염, 트리부틸아민염, 1.8-디아자비시클로[5,4,0]운데크-7-엔염, 디시클로헥실아민염 또는 테트라부틸암모늄염인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 반합성 세팔로스포린은 세페타메트, 세퓨록심, 세프라딘, 세팔렉신, 세팍로르 또는 세파드록실인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 있어서,

상기 설박탐 할로겐화 메틸 에스테르는 설박탐 브로모메틸 에스테르 또는 설박탐 요오드메틸 에스테르인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 따른 화합물의 약용 염.
제 6 항에 있어서,

상기 약용 염은 무기염 또는 유기산염인 것을 특징으로 하는 약용 염.
제 7 항에 있어서,

상기 무기염 또는 유기산염은 염산염, 황산염, 파라톨루엔설포네이트염, 주석산염, 말레산염 및 유산염(乳酸鹽)인 것을 특징으로 하는 약용 염.
제 1 항 또는 제 6 항에 있어서,

화합물은 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약용 염:

(화학식 Ⅰ)
하기 화학식 (Ⅳ)로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물 중간체:

(화학식 Ⅳ)
제 1 항에 따른 화합물 또는 제 6 항에 따른 이의 약용 염을 항생 물질의 조제에 사용하는 방법.