KR101105598B1 - 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀 및 이의 제조방법 - Google Patents

티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀은 기존의 에이코사펜타에노산을 약물전달체로의 적용에 대한 어려움을 근본적으로 개선한 것이며, 우수한 아토피 피부 개선 효과 및 면역증진 효과가 있어 아토피 치료를 위한 기능성 의약품의 발전에 크게 기여할 것이다.

Description

티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀 및 이의 제조방법 {Thiol-chitosan coated EPA liposome and method for preparing the same}
본 발명은 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 진드기나 꽃가루, 애완동물의 털 등이 자극 원으로 작용하는 만성 재발성 피부염으로 피부 건조화뿐 아니라 표피 과증식(hyperkeratosis), 염증 등 여러 증상을 동시에 수반하는 피부 질병이다. 아토피에 의한 알레르기 질환으로 알레르기 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 결막염, 아토피성 두드러기 등이 있으며 이들 질환은 단독 또는 여러 질환이 동시에 나타날 수 있다.
오메가-3는 불포화지방산(PUFAs; polyunsaturated fatty acids)이며 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA)와 도코사헥사에노산(docosahexaenoic acid, DHA) 등으로 구성된다. 에이코사펜타에노산은 5개의 이중결합을 가지며 DHA는 6개의 이중결합이 구조 내에 존재한다. 오메가-3는 항염증에 영향을 주는 효소와 관계되며 다양한 항염성 질병의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있을 뿐 아니라 심근경색, 동맥경화 및 고지혈증 등의 혈관장애를 예방하는 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 에이코사펜타에노산에는 항염증 작용, 면역조절 작용, 암 억제 등의 기능도 있다. 그러나 에이코사펜타에노산는 지용성 액체이므로 취급하기 불편하고 어취가 심하기 때문에 식품, 외용 피부치료제, 기능성 화장품 등으로 활용하기 어렵다. 이러한 단점을 극복하고 약물로서 효과를 증진시키기 위하여 에이코사펜타에노산의 피복 기술에 관심이 모이고 있다.
리포좀은 인지질이라는 생체 구성성분으로 이루어져 생체 내에서 분해가 가능하고 독성이 없다. 포집물질이 약물일 경우 특정 조직에 표적이 가능하여 약물의 치료 효과를 높이고 약물을 거의 모든 경로(경구, 피하, 정맥, 근육 주사 또는 복강주사)로 투여할 수 있는 등 많은 장점이 있다. 리포좀은 여러 약물을 함유할 수 있고 항원 제시 세포(antigen-presenting cell)에 의하여 효과적으로 흡수된다. 하지만 이러한 리포좀이 약물 전달체로 사용될 경우 표면이 견고하지 못하고 점막 부착성이 낮은 단점이 있다.
키토산은 점막 접착성이 우수하고 독성이 없다. 키토산은 세포를 활성화하여 노화를 억제하고 면역력을 강화시키며 질병을 예방해 주는 특성이 있다. 또한 생체의 자연적인 치유 능력을 활성화하는 기능과 함께 생체 리듬을 조절해주는 기능도 있는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 인체에는 세포를 이물질로부터 보호하는 수많은 방어물질들이 존재하는데 그 중의 하나가 세포 내 티올(intracellular thiols)이다. 티올은 핵 친화성을 띠고 있으며 전자 친화성을 가진 중금속이나 알킬화 약물(alkylating agents)을 비롯한 여러 가지 항암제, 그리고 유해한 화합물들과 결합하여 무해한 수용성 물질로 전환시키는 역할을 한다. 이는 약물전달체로 적용하는 다양한 연구가 지속적으로 계속 되고 있으나, 약물방출 효과 증진에는 한계가 있는 것이 현실이다.
본 발명자들은 에이코사펜타에노산의 안정성, 효능 및 흡수율을 극대화시키기 위하여 지속적인 연구를 수행한 결과, 티올 키토산으로 코팅하여 리포좀의 점막 부착성과 안정성을 향상시킨 에이코사펜타에노산 함유 리포좀을 제조하여 우수한 아토피 피부염에 대한 면역증진 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 에이코사펜타에노산의 안정성, 효능 및 흡수율을 극대화시킨 에이코사펜타에노산 함유 리포좀을 제공하고자 한다.
보다 상세하게는 리포좀의 점막 부착성과 안정성을 향상시키고, 에이코사펜타에노산의 안정성, 효능 및 흡수율을 극대화시킨 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 함유 리포좀의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 함유 리포좀 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 불포화이중결합을 지녀 산화가 잘 되는 에이코사펜타에노산을 리포좀에 적재하여 에이코사펜타에노산의 안정성, 효능 및 흡수율을 극대화시킨 것이 특징이다.
또한, 본 발명은 상기 에이코사펜타에노산이 적재된 리포좀을 티올 키토산을 코팅하여 점막 부착성과 안정성을 향상시켜 제조되는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀을 제공하는 것이 특징이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 함유 리포좀의 제조방법을 제공한다.
보다 상세하게는 상기 리포좀은 a) 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및 콜레스테롤의 혼합물에 휘발성 유기용매를 첨가하여 인지질 용액을 제조하는 단계; b) 상기 제조된 인지질 용액을 증발농축하여 박막을 제조하는 단계; c) 상기 제조된 박막에 티올 키토산 완충용액을 첨가하여 수화시키는 단계; 및 d) 상기 수화된 박막으로부터 리포좀을 제조하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
상기 a) 단계의 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및 콜레스테롤의 혼합물은 1 : 6.5 내지 7.5 : 2.5 내지 3.5의 몰 비율로 혼합되어 제조되고, 여기에 첨가되는 휘발성 유기용매는 메탄올 및 클로로포롬의 혼합용매인 것이다.
상기 b) 단계의 박막은 a) 단계에서 제조된 인지질 용액을 55 내지 65℃ 온도에서 1 내지 3시간 동안 회전증발농축하여 유기용매를 증발시켜 제조된다.
상기 제조된 박막에 첨가되는 티올 키토산 완충용액은 완충용액 1 ㎖ 내 티올 키토산이 0.025 내지 0.035 중량% 포함되어 제조된 것으로, 상기 제조된 완충용액을 박막에 첨가하여, 수화시키고 초음파분산하여 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 함유 리포좀을 제조한다.
본 발명의 상기 티올 키토산은 키토산 내 티올기의 함량이 0.5 내지 1.5 중량%인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 티올 키토산은 수산화나트륨 및 키토산 용액의 혼합물에 이미노티올렌산(2-iminothiolane HCl)을 첨가한 후, 완충용액으로 투석하여 제조되며, 상기 투석은 5 mM HCl, 5 mM HCl과 1% NaCl의 혼합물, 5 mM HCl 및 0.4 mM HCl 조성의 완충용액을 순차적으로 처리하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀을 제공한다.
상기 제공되는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀은 리포좀 내 에이코사펜타에노산의 함량이 3.5 내지 5.5 중량%이고, 입자의 크기가 225 내지 235 ㎚ 및 표면전하가 18 내지 28 ㎷인 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 형태를 투과전자현미경(TEM; JEM-200 FX JEOL Ltd., Japan)으로 확인한 결과, 에이코사펜타에노산 미함유 리포좀은 입자크기가 크며 불균일한 모양이었으나, 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀은 입자 크기가 작고 균일한 모습의 구형의 형태를 가지는 것을 확인하였다. 도 2를 참조한다.
또한, 표면전하 역시 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 경우는 전하의 값이 에이코사펜타에노산 미함유 리포좀에 비해 두 배 이상 높은 결과를 나타냈고, 더 균일한 분포를 가졌음을 확인하였다.
본 발명은 상기 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
보다 상세하게는 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 아토피 피부염에 대한 면역증진 효과를 조사하였다.
그 결과, 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀이 아토피 피부염이 유발된 마우스 피부 표면의 염증 부위가 털이 다시 나고 피부 손상이 개선되는 것을 육안으로도 확인할 수 있었고, 아토피 관련 면역인자인 IgE와 IL-4, IFN-등의 수치를 더욱 증감시켰으며 아토피 치료 약물전달체로의 효과가 큰 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법은 에이코사펜타에노산의 안정성, 효능 및 흡수율을 극대화시키고, 리포좀의 점막 부착성과 안정성을 향상시켜 제조할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀은 기존의 에이코사펜타에노산을 약물전달체로의 적용에 대한 어려움을 근본적으로 개선한 것이며, 우수한 아토피 피부 개선 효과 및 면역증진 효과가 있어 아토피 치료를 위한 기능성 의약품의 발전에 크게 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 티올 키토산의 티올화 정도를 Ellman's 시약을 이용하여 측정한 흡광도를 보여주는 결과이고,
도 2는 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산을 함유한 리포좀을 주사형 전자현미경으로 관찰한 사진을 보여주는 것이며,
(a: 에이코사펜타에노산 미함유 리포좀, b: 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀)
도 3은 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산을 함유한 리포좀의 에이코사펜타에노산 함유량을 시차주사열량계를 이용하여 확인한 결과이고,
도 4는 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 아토피성 피부염에 대한 효과를 확인한 결과이고,
도 5는 아토피 발명 마우스의 혈중에서, 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀에 따른 IgE 농도 변화를 확인한 결과이며,
도 6은 아토피 발명 마우스의 혈중에서, 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀에 따른 IL-4 농도 변화를 확인한 결과이고,
도 7은 아토피 발명 마우스의 혈중에서, 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀에 따른 IFN-γ 농도 변화를 확인한 결과이며,
도 8은 아토피 발명 마우스의 혈중에서, 본 발명에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀에 따른 TNF-α 농도 변화를 확인한 결과이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[제조예] 티올 키토산으로 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조
(1) 티올 키토산의 제조
1% 초산 용액 100 ㎖에 키토산(1 g)을 실온에서 충분히 녹여 키토산 용액을 제조하였다. 상기 제조된 키토산 용액에 1 M 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 6.5로 조절하였다. 키토산과 이미노티올렌산(2-iminothiolane HCl)의 비가 5 : 2가 되도록 이미노티올렌산을 0.4 g을 첨가한 후, 상온에서 12시간 교반 후, 5 mM HCl, 5 mM HCl과 1% NaCl의 혼합물, 5 mM HCl 및 0.4 mM HCl의 조성의 완충용액을 순차적으로 하루간격으로 5일간 투석을 시킨 다음, 동결 건조하여 티올 키토산을 제조하였으며, 이를 하기 리포좀 코팅에 사용하였다.(당업자가 재연가능 하도록 구체적으로 기재부탁드립니다.)
(2) 티올 키토산으로 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조
티올 키토산으로 코팅된 피복된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀은 하기의 방법으로 제조되었다.
포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 콜레스테롤 및 에이코사펜타에노산 혼합물(몰 비율 7:3:1)을 메탄올과 클로로포름의 혼합용매(몰 비율 1:9)에 녹여 인지질 용액을 제조하였다. 상기 인지질 용액을 각각 60℃에서 2시간 동안 회전증발농축기를 사용해 유기용매를 증발시켜 박막을 제조하였다. 둥근 바닥 플라스크에 상기 완전히 건조되어 층이 형성된 박막에 상기 제조된 티올 키토산을 0.1%를 첨가한 PBS 완충용액(pH 7.4) 3 ㎖를 첨가하여 수화시켰다. 상기 수화된 박막을 초음파 분산기(Sonics & Material Inc. USA)를 이용하여 4℃에서 90초 동안 초음파를 가하여 티올 키토산으로 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀을 제조하였다.
[ 실험예 1] 티올 키토산에 함유된 티올기의 양의 측정
상기 제조 예에서 제조한 티올 키토산으로 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀을 Ellman's reagent를 사용하여 티올 키토산에 함유된 티올기의 양을 측정하였다.
2.5 ㎖의 증류수을 사용하여 시료 5 mg을 용해시킨 후, pH 8의 5 M phosphate buffer를 준비하였다. 3 mg의 Ellman's reagent(5-5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid); DTNB)를 pH가 8인 0.5 M phosphate buffer 용액 10 ㎖에 녹이고 각 시료를 1:1:2 비율로 섞은 다음, 실온에서 2시간 방치한 후 UV/VIS spectrometer(Shimatzu, Japan)로 흡광도를 측정하였다.
상기 실험에 사용한 키토산은 자체가 약간 노란빛을 띄고 있어 흡광도를 측정할 때 대조군을 첨가시켰다. 이때 표준물질로 L-cystein hydrochloride hydrate를 이용하여 검량선을 구한 후, 이 검량선에 티올 키토산 용액의 흡광도를 적용하여 티올기 함량을 구하였다.
시차주사열량계(DSC; 2920, TA Instruments, Delaware, NC, USA)를 이용하여 리포좀에 함유된 에이코사펜타에노산의 함량을 확인하였다. 시차주사열량계는 질소조건아래 -40℃ 내지 300℃에서 10 ℃/min의 승온 속도로 측정되었다.
L-cystein hydrochloride hydrate를 표준물질로 UV/VIS 스펙트럼을 사용하여 키토산 내 티올기 함량을 구하기 위해 Ellman’s reagent의 흡광도가 가장 높은 470 nm를 기준 파장으로 정하여 티올 키토산의 흡광도를 측정한 후 티올기의 함량을 계산한 결과 약 1 중량%인 것을 확인하였다.
[ 실험예 2] 티올 키토산으로 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 특성 조사
상기 제조예에서 제조한 티올 키토산으로 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 형태는 투과전자현미경(TEM; JEM-200 FX Ⅱ JEOL Ltd., Japan)으로 확인하였으며, 입자크기 분포와 표면 전하는 입도분포측정기(ELS-8000, Photal, OTUSUKA Electronics, Japan)을 이용하여 측정하였다.
에이코사펜타에노산이 함유된 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및 콜레스테롤로 제조된 리포좀의 형성에 미치는 영향을 TEM을 통해 관찰하였다.
그 결과 도 2에서도 확인할 수 있듯이, 티올 키토산에 의한 리포좀의 변형 없이 양호하게 리포좀이 형성된 것을 확인 할 수 있었다. 보다 구체적으로 도 2의 a의 결과에서는 에이코사펜타에노산이 함유되지 않은 리포좀은 입자크기가 크며 불균일한 모양으로 관찰되었으며, 도 2의 b의 결과에서는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산가 함유된 리포좀의 경우, 입자 크기가 에이코사펜타에노산가 함유되지 않은 리포좀에 비해 작고 균일한 모습이었고, 음성 염색법(negative staining)을 통하여 입자의 형태가 구형을 가지는 것을 확인하였다. 이는 에이코사펜타에노산가 친유성이므로 에이코사펜타에노산를 첨가하여 리포좀을 제조하면 입자크기가 더 작고 균일하게 되는 것을 확인한 결과이다.
또한, 보다 정확한 특성을 조사하기 위하여 Zeta-PSA를 이용하여 평균 입자의 크기, 표면전하 및 제조된 리포좀 내 에이코사펜타에노산의 함유량을 측정하였으며 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112010006320983-pat00001
상기 표 1에서도 확인할 수 있듯이, 에이코사펜타에노산 미함유 리포좀의 평균 입자 크기는 각각 약 574.2 ±10.8 nm 와 231.8 ±2.3 nm이었으며, 표면 전하는 약 -10.6 mV와 -23.33 mV이었다. 그러나 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 경우는 전하의 값이 두 배 이상 높은 결과를 나타냈고 더 균일한 분포를 가졌음을 확인할 수 있었다. 또한 시차주사열량계를 이용하여 리포좀 내의 에이코사펜타에노산 함유율을 측정한 결과 리포좀 내의 에이코사펜타에노산 함유량은 약 4.7%인 것을 확인할 수 있었다. 이는 리포좀 내 에이코사펜타에노산의 안전성, 효능 및 흡수율을 극대화 시킨 결과이기도 하다.
[실시예 3] 리포좀의 마우스를 이용한 in vivo 실험
상기 제조예에서 제조된 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 아토피 관련 면역인자에 대한 반응을 이용하여 아토피 치료제로의 가능성을 검증하고자 하였다.
마우스의 아토피 유발 촉진을 위해 6주령(20g, body weight)인 아토피 피부염 모델 NC/Nga mice를 (주)오리엔트 바이오(Korea)로부터 공급 받아 1주일 동안 주위 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
마우스의 아토피 유발을 위해 디니트로클로로벤젠(dinitrochlorobenzene, DNCB) 200 ㎕를 일주일에 2번, 2주간 마우스의 등 부위에 도포하였다. 상기 디니트로클로로벤젠(DNCB)용액은 아세톤과 올리브유를 3:1(v/v)의 비율로, 총 20 ㎖을 만든 후, 디니트로클로로벤젠 0.2 g을 첨가하여 제조하였다. NC/Nga 마우스는 무균(specific pathogen free, SPF) 환경에서는 정상이지만, 일반 환경에서는 3~4주 후 가려움증을 수반하여 아토피 피부염이 유발된다. 실험기간 동안 사육실의 온도는 25℃, 습도는 55% 전후로 유지했으며, 광주기와 암주기를 12시간으로 조절하였다.
디니트로클로로벤젠(DNCB) 도포에 의한 아토피 발병을 확인한 후, 리포좀을 도포 처치하지 않은 무처리 마우스(control)와 에이코사펜타에노산 미함유 리포좀(liposome) 및 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀(EPAloaded liposome)을 처리한 마우스의 세 군으로 나누어 실험하였다. 투여를 시작하기 전 날과 투여를 시작한지 7, 14, 21일 후에 실험동물로부터 혈액을 채취하였다. 모든 혈액 샘플은 마우스의 안와정맥총(Orbital venous plexus)을 통하여 총 4회에 걸쳐 채취하였다. 마우스 안와정맥에서 heparinized capillary관을 이용하여 100 ㎕의 혈액을 채혈한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 채취한 혈액은 10,000 rpm으로 15분간 원심분리를 하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 -20 ℃에서 보관하였다.
혈청 중 IgE 및 IL-4, IFN-γ, TNF-α 등의 농도 측정은 sandwich ELISA 법을 이용하여 측정하였다. 일차 항체가 코팅되어 있는 ELISA 용 96 웰 플레이트 키트(GenWay, Mouse IgE ELISA kit, 40-374-130049, R&D systems, Mouse IL-4 Immunoassay M4000B, Mouse IFN-γ Immunoassay MIF00, USA, Biosource, Mouse TNF-α ELISA kit, KMC3011, USA)를 사용하였다. 희석하여 준비해 놓은 표준시료와 샘플을 각각 100 ㎕/well 씩 분주하고, 상온에서 반응시켰다. 세척과정을 4회 반복한 후 효소-항체 컨쥬게이트(Enzyme-Antibody conjugate)를 각각의 웰에 100 ㎕ 씩 첨가하였다. 실온에서 다시 반응시키고 4회의 세척과정을 거쳐 TMB substrate solution을 100 ㎕ 씩 첨가하여 10분 동안 어두운 실내에서 반응시켰다. 10분 후 각 웰에 stop solution 100 ㎕ 씩을 첨가한 후, ELISA Reader(BioTek. USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(1) 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 아토피성 피부염에 대한 효과
상기의 디니트로클로로벤젠(DNCB) 처치로 인한 아토피가 발병된 NC/Nga mice의 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀 도포 처리에 따른 아토피성 피부염에 대한 효과를 조사하였다.
아토피성 피부염에 대한 효과는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀 도포 처리한 후 0, 7, 14, 21일에 마우스 피부 표면을 육안으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4의 도면에서도 확인할 수 있듯이 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 도포 처치 후 0, 7, 14, 21일의 시간이 경과에 따라 마우스 피부 표면이 염증 부위에 털이 다시 나고 피부 손상이 개선되는 것을 육안으로도 쉽게 확인할 수 있었고, 이는 아토피성 피부염에 우수한 개선 효과를 확인한 결과이다.
(2) 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀처리에 따른 IgE 의 농도변화
티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 성능을 평가하기 위해 혈청 면역지표 IgE의 증감 정도를 ELISA 기법으로 마우스 혈중의 IgE 항체 농도를 측정하였다.
도 5의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 아토피 발병으로 인해 증가되었던 IgE가 디니트로클로로벤젠(DNCB) 도포 처치를 중지하였기에 시간이 경과함에 다소 감소함을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 리포좀을 도포 처치하지 않은 무처리 마우스(control)군과 에이코사펜타에노산 미함유 리포좀(liposome) 처리군의 IgE 항체 수준에 비해 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산가 함유된 리포좀을 도포 처치한 실험군의 IgE 항체 농도는 놀라운 속도로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 아토피 피부염이 발병된 마우스에 에이코사펜타에노산를 투여하면 아토피 피부염에 대한 면역력 증진에 효과가 있다는 것을 의미한다.
(2) 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀처리에 따른 IL -4의 농도변화
혈청 면역지표 IL-4의 증감 정도를 측정은 이미 보고된 바 있는 IL-4가 IgE의 생산을 유도하고 아토피 피부염의 진행과정에 중요한 역할을 한다고 보고를 바탕으로 한 것으로, 혈청 면역지표 IL-4의 증감 정도를 측정하여 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 성능을 평가하였다.
그 결과 도 6의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 마우스 혈중 IL-4의 농도는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 도포 처치에 의해 우수한 IL-4 농도 감소를 확인할 수 있었다.
(3) 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀처리에 따른 IFN -γ의 농도변화
혈청 면역지표 IFN-γ의 증감 정도 측정은 이미 IFN-γ가 IL-4에 의해 유도되는 IgE의 합성을 억제하는 작용을 하며 IFN-γ의 분비가 감소한 경우 아토피 피부염의 발생빈도가 높아진다는 보고를 바탕으로 한 것으로, 혈청 면역지표 IFN-γ의 증감 정도 측정하여 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 성능을 평가하였다.
그 결과, 도 7의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 아토피 발병으로 인해 낮아졌던 마우스 혈중 IFN-γ의 농도가 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀을 도포 처리를 통해 에이코사펜타에노산가 함유되지 않은 두 그룹에 비하여 놀라운 IFN-γ의 농도 증가를 확인하였다.
결국, 아토피 면역특성으로 알려진 혈중 IgE 항체 농도는 상승하였고 IL-4와 TNF-α의 값도 상승하였으며, 반면 IFN-γ값이 저하된다는 것을 확인하였으며, 이를 하기 표 2에 증감 정도를 나타내었다.
Figure 112010006320983-pat00002
아토피 피부염은 IL-4에 의해 촉진되며, IFN- γ에 의해서는 억제된다는 보고를 바탕으로 IL-4/IFN-γ을 통해 IL-4 및 IFN-γ의 상관관계를 확인하였다. 그 결과, 상기 표 2의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 혈청 총 IgE 항체 값과 혈청 IL-4/IFN-γ 비 사이에는 유의한 상관관계를 확인하였다.
(4) 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀처리에 따른 TNF-α의 농도변화
티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 성능을 평가하기 위해 혈청 면역지표 TNF-α의 증감 정도를 측정하였다.
비만세포(mast cell)의 분비물이 염증과 소양증을 유발하는 것 이외에 아토피피부염 피부의 표피증식을 유발할 수 있다고 알려져 있으며 비만세포에서 분비된 TNF-α는 Th1세포의 증식을 억제한다고 알려져 있다. 실제로 아토피피부염 환자의 혈청에는 TNF-α가 증가되어 있다.
상기의 내용을 바탕으로, 아토피 발병으로 인해 증가되었던 마우스 혈중 TNF-α 농도는 도 8의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 티올 키토산이 코팅된 코사펜타에노산 함유 리포좀을 처리함에 따라 TNF-α 농도가 감소함을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

  1. 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 함유 리포좀의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 리포좀은
    a) 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및 콜레스테롤의 혼합물에 휘발성 유기용매를 첨가하여 인지질 용액을 제조하는 단계;
    b) 상기 제조된 인지질 용액을 증발농축하여 박막을 제조하는 단계;
    c) 상기 제조된 박막에 티올 키토산용액을 첨가하여 수화시키는 단계; 및
    d) 상기 수화된 박막으로부터 리포좀을 제조하는 단계;
    를 포함하는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 a) 단계의 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및 콜레스테롤의 혼합물은 1 : 6.5 내지 7.5 : 2.5 내지 3.5의 몰 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 a) 단계의 휘발성 유기용매는 메탄올 및 클로로포롬의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 c) 단계의 티올 키토산은 수산화나트륨 및 키토산 용액의 혼합물에 이미노티올렌산(2-iminothiolane HCl)을 첨가한 후, 완충용액으로 투석하여 제조된 것을 특징으로 하는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 투석은 5 mM HCl, 5 mM HCl과 1% NaCl의 혼합물, 5 mM HCl 및 0.4 mM HCl 조성의 완충용액을 순차적으로 처리하는 것을 특징으로 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 리포좀은 에이코사펜타에노산의 함량이 3.5 내지 5.5 중량%인 것을 특징으로 하는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 리포좀은 입자의 크기가 225 내지 235 ㎚인 것을 특징으로 하는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 리포좀은 표면전하가 18 내지 28 ㎷인 것을 특징으로 하는 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀의 제조방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항에서 선택되는 어느 한 항의 리포좀의 제조방법에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀.
  11. 제 10항에 따른 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선 또는 치료용 조성물.
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