KR101100855B1 - 신규한 미생물 크리세오박테리움 ｆｂｆ―7 및 상기 균주로부터 생산되는 케라틴 분해활성을 갖는 단백질 분해효소 - Google Patents
신규한 미생물 크리세오박테리움 ｆｂｆ―7 및 상기 균주로부터 생산되는 케라틴 분해활성을 갖는 단백질 분해효소 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 미생물 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 및 상기 균주로부터 생산되는 케라틴 분해활성을 갖는 단백질 분해효소에 관한 것으로 보다 상세하게는 깃털로부터 분리한 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주, 상기 균주 및 균주 배양물을 이용한 가금 산업으로부터 발생되는 깃털의 처리방법을 제공하는 것으로, 본 발명에 따른 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주로부터 생산되는 케라틴계열 단백질분해효소는 사료, 직물, 천연가죽 등의 가공 및 유기 폐기물의 처리 등 다양한 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
크리세오박테리움, 케라틴, 깃털
Description
본 발명은 신규한 미생물 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 및 상기 균주로부터 생산되는 케라틴 분해활성을 갖는 단백질 분해효소에 관한 것으로, 보다 상세하게는 깃털로부터 분리한 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주, 상기 균주 및 균주 배양물을 이용한 가금 산업으로부터 발생되는 깃털의 처리방법에 관한 것이다.
우리나라에서 닭은 연간 150 백만 마리 정도가 도계되어(미국의 경우는 약 85억 마리) 상업적으로 가공 처리되고 있으며, 닭 무게의 5 내지 7%에 해당되는 닭털은 년간 약 18만 kg(미국의 경우 약 10억 kg) 정도가 방출되고 있고 단백질 함량이 높기 때문에 가축 및 양어 사료 등으로 이용되고 있다. 닭털의 주성분인 케라틴(keratin)은 생물체의 보호기능을 하는 피부, 손톱, 머리털, 양모, 말발굽, 뿔, 깃털 등을 구성하는 섬유상 구조 단백질로서 β-구조를 형성하는 펩타이드 결합과 사슬 내의 수많은 수소 결합 및 이황화결합(disulfide 결합)에 의하여 결합되어 있 어 물리적, 화학적으로 매우 안정하다. 이러한 구조적인 안정성 때문에 산이나 알카리 등의 화학적인 처리 또는 동물의 소화기관 내의 펩신, 트립신 및 키모트립신과 같은 단백질 분해효소에 의해서 쉽게 분해되지 않으며 물에 녹지 않는 불용성이라 그 활용도가 낮은 부산물이다. 이러한 이유로 배출된 닭털의 극히 일부만이 보온재, 쿠션의 충진 물질로 사용되며 대부분의 많은 양이 폐기물로 배출되어 이를 처리하기 위해 소각이나 매립을 하고 있으나, 소각 시 많은 매연이 발생하고, 매립 시에도 난분해성으로 많은 문제를 가지고 있어 환경오염의 주요 요인 중 하나로 대두되고 있는 실정이다.
그러나 케라틴은 다양한 아미노산 조성을 가지고 있고 저가이므로 최근 동물 영양학자들에 의해 동물용 단백질 사료로 사용할 수 있는 가능성이 활발히 연구되어 왔다(Korean J. Anim. Science 1998, 40, 103-110; Korean J. Poult. Sci, 24, 185-191, 1997). 케라틴의 구조적 안정성과 단백질 분해효소에 대한 저항성 때문에 닭털을 사료화하는 공정은 현재까지 가압가열 처리에 의존하여 왔으며 실제로 닭 사육 시 좋은 결과를 나타냈다는 보고도 있다. 그러나 이러한 공정 중에 적지 않은 양의 아미노산이 파괴되고 과도한 에너지가 소요되므로, 가열처리 공정의 에너지 효율 및 경제성을 고려해 볼 때 케라틴 분해효소를 이용한 효율적인 처리기술에 대한 연구가 필요한 실정이다.
또한, 케라틴의 물리, 화학적 그리고 생물학적으로 매우 안정한 구조 때문에 난분해성 케라틴을 수용화하는 공정은 가압, 가열 처리 후 수산화나트륨을 사용하여 분해시키는 방법, 산화·환원방법 및 산·알칼리 화학제를 사용하여 화학적 방 법으로 수용화하는 방법이 보고된 바 있다. 그러나 상기 물리 화학적 처리는 공정 역시 공정 중에 폐수 및 악취가 대량 발생함으로서 환경오염을 유발하는 원인이 되고 있으며, 처리비용이 높아 경제성이 낮고, 아르기닌(arginine), 시스테인(cystine) 등의 특정 아미노산이 파괴되는 것으로 보고된 바 있다.
따라서 화학적 처리공정의 비효율성을 고려해 볼 때, 효소 및 미생물과 같은 생물 촉매를 이용한 친환경적 분해기술에 대한 연구가 절실히 요구되어 왔으며, 이에 난분해성 케라틴을 수용화하기 위한 생물학적 처리공정으로 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 분해하는 방법이 보고된 바 있다.
상기 생물학적 처리공정은 케라틴을 분해하는 미생물이 생산하는 특이적인 효소를 케라티나제(keratinase) 또는 케라틴 분해 프로테아제(keratinolytic protease)를 이용한 방법으로, 상기 효소들은 매우 안정된 구조의 기질을 분해한다는 측면에서 다른 단백질 분해효소와 구별되어 진다. 따라서 우선적으로 환경 친화적 처리에 의한 깃털의 유용자원화를 위하여 자연계에 다양하게 존재하는 미생물 중 케라틴 분해 프로테아제(keratinolytic protease)를 생성하는 미생물을 분리하는데 집중되어 왔다. 그 결과 바실러스 속(Bacillus), 비브리오 속(Vibrio), 엑티노마이세테스 속(Actinomycetes), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces), 곰팡이, 예를 들어 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) PWD-1이 호기성발효에 의해 깃털의 주성분인 케라틴을 분해하는 것으로 보고된 바 있다. 국내에서도 케라틴 분해효소를 고효율로 생산하는 균주를 탐색하여 닭털을 사료화하기 위한 연구가 진행되어 왔지만 아직 그 결과가 미미한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 인식하여 양계장의 깃털로부터 여러 가지 균주를 탐색하고, 이들 균주 중 강력한 케라틴 분해활성을 갖는 단백질 분해효소를 생산하는 균주를 분리·동정하고, 상기 균주로부터 케라틴 분해활성을 갖는 단백질 분해효소를 대량 생산하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 케라틴 분해효소를 고효율로 생산하는 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주 및 이를 이용한 케라틴 분해효소의 대량생산방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 상기 신규 미생물 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주 또는 상기 균주의 배양물을 함유하는 조성물 및 이를 이용한 유기 폐기물을 분해하는 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주로부터 단백질 분해효소를 대량생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주의 배양물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 함유하는, 유기 폐기물 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 이용하여 난분해성 케라틴을 수용화하는 단계를 포함하는 유기 폐기물을 분해하는 방법을 제공한다.
이하. 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 케라틴 계열의 단백질 분해효소 생성능을 가지는 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주를 제공한다.
상기 본 발명은 충남 보령 지역의 양계장으로부터 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주를 분리하였다. 구체적으로, 충남 보령 지역의 양계장으로부터 채취한 깃털과 퇴비로부터 총 125 균주를 분리하였다. 분리된 125 균주를 대상으로 케라틴계열 단백질분해효소 생성능을 검정하기 위하여 단백질 분해 균주의 선택배지인 SMA(skim milk agar, Difco)배지에서 효소 생성능력을 검정하였다. 배양 48시간에 1cm 이상의 커다란 투명환을 나타내어 단백질분해효소 생성능이 우수한 8 균주를 1차 순수분리한 후, 상기 순수분리된 8 균주를 대상으로 케라틴계열 단백질로 이루어진 폐깃털의 분해능이 우수한 균을 순수 분리하였다.
상기 케라틴 단백질 분해효소의 활성이 뛰어난 균주의 분류 동정하기 위하여 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하여 서열번호 1로 기재되는 크리세오박테리움(Chryseobacterium)속에 속하는 균주임을 확인하였다. 도 2를 참조한다.
이에 본 발명자들은 상기 분리된 신규한 균주를 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7라 명명하고 이를 2009년 4월 1일자로 한국농업미생물자원센터에 기탁하였다(KACC 91463P).
본 발명에 따른 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주에 의한 폐깃털의 분해능을 확인하기 위하여 분해 후 생성된 아미노산을 정량 및 정성분석 하였다. 그 결과, 총 아미노산의 함량이 배양 24시간, 48시간 및 72시간으로 배양 시간에 따라 유의성 있는 차이를 확인하였다. 구체적으로 생성된 주요 아미노산은 글루타민산이 8.17 nmol/g (17%)로 가장 높게 추출되었으며, 아르기닌이 5.73 nmol/g (12%), 알라닌이 5.28 nmol/g (11%), 발린이 4.16 nmol/g (9%), 프롤린이 4.02 nmol/g (8%), 루신이 3.84 nmol/g (8%), 그 외 11종의 아미노산이 확인되었으며, 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주에 의해 폐깃털로부터 총 17종의 아미노산이 생성되었다.
따라서 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주로부터 생산된 단백질 분해효소가 강력한 케라틴 분해활성을 갖는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주로부터 단백질 분해효소를 대량생산하는 방법을 제공한다.
먼저 케라틴 계열의 단백질분해효소 생성능을 가지는 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주를 종균배양하는 단계; 및 상기 종균배양된 균주를 0.1 내지 5% 유기 질소원, 0.1 내지 5%의 탄소원을 포함하는 배지에 접종한 후, 27 내지 47℃의 배양온도, 20 내지 80시간의 배양시간, pH 6.5 내지 pH 8.5의 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주를 배양하는 방법을 제공한다.
상기 유기 질소원은 깃털, 탈지분유 및 펩톤으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 그 공급의 농도는 0.1 내지 5%인 것이 바람직하다. 케라틴 분해 활성을 갖는 단백질 분해효소를 생산하기 위한 케라틴으로는 우모분, 오리털 및 닭털로 구성되는 가금류 깃털 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 성분을 사용하는 것이 바람직하고. 그 공급 농도는 0.1 내지 5% 인 것이 바람직하고, 0.2 내지 2.5%로 공급하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 배양 배지의 pH는 pH 6.5 내지 pH 8.5인 것이 바람직하고 ,pH 7 내지 pH 8인 것이 더욱 바람직하다.
최적 배양조건은 하기와 같다. 상기의 배지 조성물을 이용하여 미리 배양한 종균 배양액을 0.5 내지 10% 범위에서 접종하고, 특히 1 내지 5%로 접종하는 것이 바람직하며, 종균 배양액을 접종한 후 20 내지 80시간 동안 배양하는 것이 바람직하고, 24 내지 72 시간 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하다. 배양 온도의 범위는 27 내지 47℃인 것이 바람직하고, 30 내지 40℃가 더욱 바람직하다. 배양 중 교반 속도는 150 내지 200rpm인 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 배양 방법에 따른 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주의 배양물을 제공한다.
본 발명은 상기 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 함유하는, 유기 폐기물 분해용 조성물을 제공한다.
본 발명은 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 이용하여 난분해성 케라틴을 수용화하는 단계를 포함하는 유기 폐기물 즉, 오리털 및 닭털과 같은 가금류의 깃털을 분해하는 방법을 제공한다.
구체적인 예로 상기 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주를 깃털과 함께 배양한 결과 깃털을 완전히 분해하는 것을 확인하였다. 균주의 처리시간이 길어질수록 깃털 분해율 및 생육능도 증가하는 것을 알 수 있었다. 도 3 및 도 4를 참조한다.
본 발명에 따른 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주는 케라틴계열 단백질분해효소를 생산하므로 사료, 직물, 천연가죽 등의 가공 및 유기 폐기물의 처리 등 다양한 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있고, 닭털, 오리털을 포함하는 가금류의 깃털을 완전하게 분해함으로써, 가금 산업으로부터 발생되는 깃털을 편리하고 낮은 비용으로 처리하는 데 이용 될 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주는 폐깃털 및 발톱과 같은 케라틴 단백질 부산물로부터 17종의 아미노산을 생성함으로써 산업 및 농업적 용도의 유용한 자원으로서 사용가능할 것이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게는 명백한 것이다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[
실시예
1] 케라틴 분해 활성을 갖는 균주의 분리
케라틴계열 단백질 분해미생물을 분리하기 위해 충남 보령에 소재한 양계장 으로부터 폐깃털 및 계분을 이용하여 발효가 진행되고 있는 퇴비를 채취하여 사용하였다. 깃털은 양계장 내부에서 일정기간 분해가 이루어진 깃털을 위주로 채취하였고, 퇴비는 양계장 내 10곳의 채집 지점을 임의로 선정하여 100g씩 채취한 후 polyethylene vinyl bag에 넣어 실험실로 운반하였다. 채취한 각 시료를 10g씩 정량하여 멸균수 90㎖에 넣고 균질화기(Ace M-10, Nihonseiki, Japan)로 15,000 rpm에서 2분간 충분히 분산시킨 후 9㎖ 멸균수가 든 시험관에 넣어 10-7까지 순차적으로 희석하였다. 순차적으로 희석한 최종 희석수로부터 100㎕의 시료를 영양육즙배지(nutrient agar medium; 조성은 육즙(beef extract) 10g, 펩톤(peptone) 10g, 염화나트륨(NaCl) 5g, 한천(agar) 15g 및 증류수(distilled water) 1000㎖, pH 7.5)에 각각 분주한 후 평판도말법으로 고르게 도말하였다. 모든 시료는 37℃에서 3일간 배양한 후, 형성된 콜로니를 계수하고 형성된 콜로니로부터 해부현미경(Zoom 2000, Leica)을 이용하여 분리한 총 125 균주를 영양육즙배지에 순수 분리하였다.
[
실시예
2] 케라틴 분해 활성을 갖는 균주의 단백질분해효소
생성능
조사
상기 실시예 1에서 순수 분리된 125 균주를 대상으로 단백질 분해효소 생성능을 조사하기 위하여 단백질 분해 균주의 선택배지인 SMA(skim milk agar, Difco)배지를 사용하였다. 기질로 탈지유 1%와 무기염이 첨가된 영양배지(skin milk 1%, K2HPO4 0.03%, KH2PO4 0.03%, Na2CO3 0.01%, agar 1.5%)를 제조한 후 상기의 영양배지에 깃털과 퇴비 시료로부터 분리한 125 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 배양하면서 단백질 분해효소 생성능을 조사하였다. 그 결과 단백질 분해능을 나타내는 48 균주를 분리하였다. 분리된 총 48 균주 중 도 1에 나타난 바와 같이, 배양 48시간에 1cm 이상의 커다란 투명환을 나타내어 케라틴 단백질 분해효소 생성능이 우수한 8 균주를 순수분리 하였다.
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실시예
3] 케라틴 분해 활성을 갖는 균주의
폐깃털
분해능 측정
상기 실시예 2에서 순수분리된 8 균주의 폐깃털 분해능을 평가하기 위하여 깃털배지를(1,000㎖ 제조 시 NH4Cl 0.05%, NaCl 0.05%, K2HPO4 0.03%, KH2PO4 0.03%, MgCl26H2O 0.01%, yeast extract 0.01%, 깃털분말(whole chicken feather powder) 1%, pH 7.5) 제조한 후, 상기의 단백질 우수 분해미생물 8 균주를 각각 접종하고 37℃, 180rpm으로 진탕배양하면서 균주가 접종된 깃털배지를 24시간, 48시간, 72시간을 배양하였다. 상기 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 하층에 잔존하는 깃털을 여과지(whattman filter paper No.2)로 걸른 후 10㎖의 멸균된 증류수로 4회 세척하였다. 여과지에 걸러진 깃털을 60℃의 건조기(dry oven)에 24시간 건조시킨 후 깃털의 건조중량(dry weight)을 측정하여 깃털 분해율을 산출하였다. 그 결과 깃털 분해율이 가장 높은 FBF-7 균주를 최종 선발하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 신균주인 FBF-7 균주는 배양 24시간째에 첨가한 깃털의 35%, 48시간 내에 65% 그리고 72시간째에 67%의 높은 분해율을 나타내었다.
[
실시예
4]
FBF
-7 균주의 16S
rDNA
염기서열 분석
상기 실시예 3에서 최종 선발된 FBF-7 균주의 계통학적 위치를 확인하기 위하여 하기와 같이 16S rDNA를 PCR로 증폭하여 염기서열을 결정하였다. 16S rDNA를 증폭하기 위해서 사용한 프라이머는 27F(서열번호 2: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(서열번호 3: 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3')이었다.
PCR은 다음 조건에 따라 이루어졌다. 94℃ 5분간 반응한 다음 94℃ 변성(denaturation) 30초, 55℃ 어닐링(annealing) 30초, 72℃ 확장(extention) 1분을 35회 반복하고, 72℃에서 7분간 최종 확장(final extention)을 실시하였다. DNA 증폭장치인 Thermal cycler는 Perkin Elmer(GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems)를 이용하였다. PCR 증폭산물은 1% 아가로오즈 겔(agarose gel), 0.5×TAE buffer (0.045M Tris-borate, 0.001M EDTA)에서 100V, 25mA로 30분 전기영동(Mupid-21, Gel documentation system, Bio-Rad)하여 EtBr(ethidium bromide)에 15분간 염색하여 UV하에서 증폭 여부를 확인하고, Qiagen PCR Purification Kit (Qiagen Inc)로 정제하였다. 16S rDNA의 염기서열 결정에는 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)를 이용하여 cycle sequencing을 행한 후 ABI PRISM 310 Genetic Analyser(Applied Biosystems)로 염기서열을 결정하였다. 상기 실험을 통하여 얻은 16S rDNA 염기서열의 상동성은 DDBJ/NCBI/RDP/GeneBank database의 BLAST program을 이용하여 조사하였다. 각 염기서열의 정렬(alignment)은 Clustal X algorithm을 이용하여 정렬하였고, 계통도의 작성은 근린 결합법에 의거하여 계통학적 위치를 결정하였다.
그 결과, 케라틴계열 단백질 우수 분해미생물 FBF-7 균주의 계통학적 위치를 확인하기 위하여 16S rDNA PCR 증폭산물에 대해 염기서열(1305 bp)을 결정하였다. 16S rDNA 염기서열을 해석한 후 DDBJ/NCBI/RDP/Genebank의 database와 상동성 검색을 수행한 결과, FBF-7 균주는 ‘크리세오박테리움’로 동정되었다.
이에 상기 분리된 균주를 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7라 명명하여, 2009년 4월 1일자로 한국농업미생물자원센터에 기탁하여 KACC 91463P를 부여받았다.
[실시예 5] 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주의 케라틴 단백질 분해효소의 생산
(1) 유기 질소원인 깃털배지 내 생육능 측정
케라틴계열 단백질 우수 분해미생물 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주의 깃털배지 내 생육능을 측정하기 위하여 1% 농도로 제조된 깃털배지에 접종한 후 37℃에서 180rpm으로 3일간 진탕배양하면서 24시간 마다 배양액 1㎖을 9㎖의 멸균수가 든 시험관에 넣고 10-6 내지 10-8까지 순차적으로 희석한 후 최종 희석수 100㎕를 영양육즙한천배지(nutrient agar)에 분주한 후 평판도말법으로 고르게 도말하여 37℃에서 3일간 배양 후 영양육즙한천배지 평판상에 형성된 콜로니를 계수하여 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주의 생육능을 측정하였다. 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주는 깃털을 영양분으로 이용하면서 48시간 이내에 1.7×108 cfu/㎖로 급격히 증식하는 최대 증식능을 나타내었으며 48시간이 경과된 후 생육속도가 감소하는 특징을 나타내었다.
(2) 폐깃털로부터 크리세오박테리움(
Chryseobacterium
sp.) FBF-7 균주에 의해 생성된 아미노산의 정량 정성 분석
케라틴계열 단백질 우수 분해미생물 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주에 의해 폐깃털로부터 아미노산의 생성은 1% 농도로 조절된 깃털배지에 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주를 접종한 후, 37℃에서 180 rpm으로 24시간, 48시간, 72시간을 배양하였다. 상기 배양된 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 깃털로부터 분해되어 아미노산으로 수용화된 상층액을 추출하였다. 추출된 아미노산의 정량·정성 분석은 Waters UPLCTM 아미노산 분석기를 이용하여 아미노산의 정량·정성을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 케라틴계열 단백질 우수 분해미생물 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주에 의해 폐깃털로부터 생성된 케라틴계열 아미노산의 총 함량을 측정한 결과, 배양 24시간에 7.03 nmol/g, 48시간째에 13.93 nmol/g 그리고 72시간째에 48.25 nmol/g로 배양 72시간에 가장 높게 추출되는 특성을 나타내었다. 또한, 배양 72시간 후에 폐깃털로부터 FBF-7 균주에 의해 생성된 주요 아미노산은 글루타민산이 8.17 nmol/g (17%)로 가장 높게 추출되었으며, 아르기닌이 5.73 nmol/g (12%), 알라닌이 5.28 nmol/g (11%), 발린이 4.16 nmol/g (9%), 프롤린이 4.02 nmol/g (8%), 루신이 3.84 nmol/g (8%), 그 외 11종의 아미노산이 추출되었으며, 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주에 의해 폐깃털로부터 총 17종의 아미노산이 생성되는 특징을 나타내었다.
도 1은 본 발명에 따른 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주의 순수분리하는 과정을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주의 16S rDNA 염기서열을 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주의 폐깃털의 주성분인 케라틴 계열의 단백질의 분해능 측정한 결과이고,
도 4는 본 발명에 따른 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7 균주의 생육능을 측정한 결과이다.
삭제
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Mokwon University
<120> Novel Elizabethkingia miricola FBF-7 having keratinolytic
activity and the protease therefrom
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1305
<212> DNA
<213> chryseobacterium sp.
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1305)
<223> FBF-7 16S rDNA
<400> 1
gcggcgcacg ggtgcggaac acgtgtgcaa cctgccttta tctgggggat agcctttcga 60
aagggagatt aataccccat aatatactga gtggcatcac ttattattga aaactccggt 120
ggatagagat gggcacgcgc aagattagat agttggtgag gtaacggctc accaagtcaa 180
tgatctttag ggggcctgag agggtgatcc cccacactgg tactgagaca cggaccagac 240
tcctacggga ggcagcagtg aggaatattg gacaatgggt gagagcctga tccagccatc 300
ccgcgtgaag gacgacggcc ctatgggttg taaacttctt ttgtacaggg ataaaccttt 360
ccacgtgtgg aaagctgaag gtactgtacg aataagcacc ggctaactcc gtgccagcag 420
ccgcggtaat acggagggtg caagcgttat ccggatttat tgggtttaaa gggtccgtag 480
gcggatctgt aagtcagtgg tgaaatctca tagcttaact atgaaactgc cattgatact 540
gcaggtcttg agtaaggtag aagtagctgg aataagtagt gtagcggtga aatgcataga 600
tattacttag aacaccaatt gcgaaggcag gttactatgt cttaactgac gctgatggac 660
gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgctgta aacgatgcta 720
actcgttttt gggttttcgg attcagagac taagcgaaag tgataagtta gccacctggg 780
gagtacgaac gcaagtttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggat 840
tatgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttaccaa gacttaaatg ggaattgaca 900
gatttagaaa tagatcctcc ttcgggcaat tttcaaggtg ctgcatggtt gtcgtcagct 960
cgtgccgtga ggtgttaggt taagtcctgc aacgagcgca acccctgtca ctagttgcca 1020
tcattcagtt ggggactcta gtgagactgc ctacgcaagt agagaggaag gtggggatga 1080
cgtcaaatca tcacggccct tacgtcttgg gccacacacg taatacaatg gccggtacag 1140
agggcagcta cacagcgatg tgatgcaaat ctcgaaagcc ggtctcagtt cggattggag 1200
tctgcaactc gactctatga agctggaatc gctagtaatc gcgcatcagc catggcgcgg 1260
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcaagc catgg 1305
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 27F forward primer
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1492 reverse primer
<400> 3
aaggaggtga tccagccgc 19
Claims (9)
- 닭 우모분으로부터 케라틴 계열 아미노산 생산능을 가지는 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주.
- a) 제 1항의 균주를 종균배양하는 단계;및b) 상기 종균배양된 균주를 0.1 내지 5% 우모분, 오리털, 닭털, 탈지분유 및 펩톤으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 유기 질소원, 0.1 내지 5%의 탄소원을 포함하는 배지에 접종한 후, 27 내지 47℃의 배양온도, 20 내지 80시간의 배양시간, pH 6.5 내지 pH 8.5의 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주를 배양하는 방법.
- 제 2항에 있어서,상기 유기 질소원은 우모분, 오리털. 닭털로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주를 배양하는 방법.
- 삭제
- 제 2항에 따른 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주의 배양물.
- 제 1항에 따른 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주 또는 제 5항의 균주 배양물을 함유하는, 유기 폐기물 분해용 조성물.
- 제 1항에 따른 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) FBF-7(KACC 91463P) 균주 또는 제 5항의 균주 배양물을 이용하여 오리털, 닭털 또는 이들의 혼합 폐깃털을 수용화하는 단계를 포함하는 유기 폐기물을 분해하는 방법.
- 삭제
- 삭제
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