KR101098304B1

KR101098304B1 - 과채류 병해 방제용 미생물 살균제

Info

Publication number: KR101098304B1
Application number: KR1020090033985A
Authority: KR
Inventors: 김영권; 홍석일; 남명흔; 최재필; 이재준; 박정현; 이현수
Original assignee: 고려바이오주식회사
Priority date: 2009-04-20
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2011-12-26
Also published as: KR20100115430A

Abstract

본 발명은 길항균 미생물을 이용한 과채류 병해, 특히 흰가루병과 잿빛곰팡이병을 방제하기 위한 미생물 살균제에 관한 것으로, 본 발명의 미생물 살균제는 길항미생물로서 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)를 포함하고, 과채류 병원균에 항균 유효성분으로 쇠비름 등의 식물추출물, 채종유 등의 식물성 오일을 포함하여 내성유발이 없고, 인체에 무해하면서도 방제효과가 우수한 환경친화적 살균제를 제공한다.

흰가루병(Powdery mildew), 잿빛곰팡이병(Gray mold), 오이, 참외, 호박, 수박 흰가루병균(Sphaerotheca fusca), 고추 흰가루병균(Leveillula taurica), 딸기 흰가루병균(Sphaerotheca macularis), 오이, 토마토, 딸기 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401), 쇠비름(Portulaca oleracea), 채종유(Canola oil), 효력증진제

Description

과채류 병해 방제용 미생물 살균제{BIOLOGICAL GERMICIDE FOR PREVENTING FRUIT VEGETABLE DISEASE}

본 발명은 길항균 미생물을 이용한 과채류 병해 방제용 살균제에 관한 것으로, 보다 상세히는 흰가루병과 잿빛곰팡이병 등의 과채류 병해에 유용하게 이용될 수 있는 친환경 미생물 살균제에 관한 것이다.

흰가루병(Powdery mildew)은 활물기생균으로 어린 식물조직 위에 곰팡이 균사류가 엉키기 때문에 밀가루를 뿌려 놓은 듯이 크고 작은 흰색 또는 회백색의 병반이 나타나게 된다. 병원균은 약 20여 종으로 알려져 있으며 Erysiphe속, Microsphaera속, Podosphaera속, Phillactinia속, Uncinula속, Sphaerotheca속에 속하는 곰팡이종(種) 들의 특수한 변종에 의하여 생기게 된다.

이들 병원균은 자낭각 또는 균사의 형태로 병든 식물체의 잔재에서 월동하여 1차전염원이 되며, 시설재배에서는 분생포자가 공기전염이 되어 계속해서 발생한다. 밤과 낮의 온도차가 심한 지역이나 통풍이 잘되지 않는 곳에서 흔히 발생하며, 농작물뿐만 아니라 관상식물에도 널리 분포하며 항상 발생하기 때문에, 매년 흰가루병에 의한 식물 생장 및 수량 감소는 다른 어떤 병보다도 심하여 농사에 막대한 피해를 일으키는 병원균이다. 이러한 흰가루병원균은 시설재배지에 항시 존재, 발생하기 때문에 화학적인 방법으로는 근절하기가 어려운 병해이다.

잿빛곰팡이병(Gray mold)은 Botrytis cinerea에 의해 과실과 채소에 나타나는 병으로 일부 과채류는 포장에서 성숙에 가까운 단계 또는 미숙한 동안에도 침해받으며, 열매의 배꼽이나 줄기의 끝, 또는 저장조직의 상처, 갈라진 틈 또는 절단 부위에서부터 부패가 시작되어 조직 속으로 깊게, 그리고 급속히 썩어 들어가는 한정된 수침상의 갈색 부위로 나타난다. 대부분의 기주에서 습한 조건에서는 회색 또는 회갈색의 부드러운 입자상의 잿빛곰팡이층이 부패된 표면을 덮어 자란다. 잿빛곰팡이병은 저온다습한 환경에서 가장 심하게 발생하고 심지어 0℃에서도 느리지만 계속 진전된다.

병원균인 Botrytis cinerea는 진균계의 불완전균에 속하며 분생자경과 분생포자, 균핵을 형성한다. 분생자경은 갈색이며, 가지를 치고, 길이는 최고 2㎜까지 된다. 가지의 끝부분에는 작은 돌기가 형성되고, 이 끝에서 분생포자가 형성된다. 분생포자는 무색, 타원형, 혹은 계란모양으로 약간 돌출한 배꼽을 가지고 있으며, 그 크기는 6∼18×4∼11㎛이다. 균핵은 흑색, 부정형으로 길이가 3∼6㎜이다. 균사의 생육온도 범위는 5∼30℃이고, 생육적온은 22∼24℃이며, 분생포자와 균핵은 22∼24℃에서 가장 잘 형성된다. 병원균은 불완전 균류의 일종으로 분생포자를 형성한다. 시설 재배지에서 온도가 낮고 습도가 높을 때 주로 발생하고 노지에서는 장 마 시에 다발한다. 잿빛곰팡이병은 흰가루병과 더불어 시설재배지에서 자주 발생하며 방제가 어려운 가장 중요한 병해 중의 하나이다.

과채류를 비롯한 시설재배지에서는 일반적으로 화학농약을 주로 사용하는 것으로 알려져 있으며, 실제로 한 작기에 10여회 정도의 화학농약방제를 실시하고 있다. 최근 웰빙 트랜드에 따라 소비자의 고품질 안전농산물에 대한 요구가 급증하고 있으며, FTA에 따른 농산물 수입개방이 심화되고 있을 뿐 아니라 농가로서는 지속가능한 농업이 필요하게 됨으로써, 친환경농업이 절실해지고 있다. 또한 농업의 국제적인 추세 역시 친환경농업 방향으로 가고 있는 실정이다. 따라서 친환경 과채류 시설재배에 있어서 병해 방제를 위한 화학농약을 대체할 수 있는 친환경 생물농약의 개발은 더욱 부각되고 있다.

이러한 식물병해에 대한 생물학적 방제를 위해 외국의 경우 1920년대에 이미 감자 더뎅이병에 대한 방제가 시도되었으며, 1960년 이후부터 미국 등지에서 상품화되어 현재 70여 가지의 생물농약이 상품화되었다. 국내의 경우 1970년대 초반부터 인삼 뿌리썩음병의 생물학적 방제연구를 시작한 이래 다양한 식물병의 생물학적 방제에 대한 연구가 지속적으로 진행되었으나, 그 결과는 미비하여 실용화되기까지는 많은 어려움이 있었다. 1990년대에 들어와서는 국내에서 개발된 미생물제제를 이용한 일부 식물병해에 대한 생물학적 방제가 효과적으로 이루어졌으며, 2000년대에 들어와서는 꾸준한 연구와 노력을 바탕으로 비로소 국내에서도 미생물농약이 등록되었으며, 현재까지 식물병해에 대한 길항미생물을 이용한 미생물농약은 총 16개 품목이 등록되어 있고, 이 중 국내 자체 생산은 12개 품목이 등록되어 있다.

그러나 상기와 같은 미생물농약은 미생물의 단용에 의한 제품으로 방제효과가 화학농약에 비해 낮기 때문에 소비자들로부터 큰 호응을 얻고 있지는 못한 실정이다.

최근에는 미생물 및 각종 식물추출물 등을 이용한 생물학적 방제방법이 많이 연구되고 있는데, 이러한 방법은 환경오염, 내성유발, 잔류독성 등의 문제를 야기하지 않기 때문에 친환경 농산물 재배농가에서도 사용할 수 있어 매우 바람직한 방제방법으로 여겨지고 있다.

식물병원균을 방제할 수 있는 생물자재로 길항미생물, 식물추출물, 항균성오일 등이 있다. 길항미생물로는 Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus Licheniformis, Paenibacillus polymyxa, Ampelomyces quisqualis, Streptomyce속 등이 있으며, 국내외적으로 많은 연구가 진행되어 왔고, 미생물농약으로 등록도 되어있다. 식물추출물로는 소리쟁이, 쇠비름, 홀아비꽃대, 울금 등이 식물병원균에 살균효과가 있는 것으로 알려져 있으나 아직 효과적인 제품으로 상용화되지는 못하고 있다. 또한 식물성오일은 타임오일(thyme oil), 클로브 버드 오일(clove bud oil), 로즈제라늄 오일(rose geranium oil), 사사프라스 오일(sassafras oil), 피마자 오일(castor oil) 등이 있으며 살균효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 이 역시 단용으로는 만족스러운 방제가를 나타내지 못하고 있다.

이러한 식물의 성분을 이용하여 개발되어지는 생물농약은 살충제는 많이 상업화되어 있으나, 살균제는 상대적으로 미약하며 종류 또한 다양하지 못한 실정이다. 또한 식물추출물과 그 외의 다른 혼합되는 성분들과의 제제화에 있어 효과를 제대로 발휘할 수 있는 제제화 기술이 부족하여, 화학농약이나 합성 살균제에 비해 그 효과가 미약한 편이다. 뿐만 아니라 농가의 소득을 향상시키고 안정적인 수익성을 확보하기 위해서는 농작물을 친환경적으로 생산할 수 있는 기술을 개발하여야 한다.

따라서 본 발명에서는 과채류의 병해 중 특히 흰가루병과 잿빛곰팡이병에 방제효과가 우수한 환경친화적 살균제를 개발하여 친환경 과채류 재배 농가의 고층을 덜어주고자 하였다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 과채류 병해 특히 흰가루병과 잿빛곰팡이병에 방제효과가 있는 길항미생물을 제공하는 한편, 식물체로부터 항균효과 우수한 식물추출물, 식물성오일을 제공함으로써, 내성유발이 없고, 인체에 무해하면서도 방제효과가 우수한 환경친화적 살균제를 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서의 '과채류'는 오이, 참외, 호박, 수박, 고추, 딸기 등과 같은 열매채소를 의미한다.

본 발명에서 '식물추출물'은 식물체에서 추출된 물질로, 액체상, 농축액, 혼합액 또는 고형상, 분말상일 수 있으며, 조추출물(crude extract)을 포함하는 개념으로 사용된다. 또한 조추출물을 더욱 정제한 것을 포함한다. 특히 본 발명에서 있어서 가장 바람직하게는 '쇠비름(Portulaca oleracea)' 추출물을 포함하는 개념으로 사용된다.

본 발명에서 '식물성 정유'는 '식물성 오일'을 포함하고, 오일은 식물체에서 추출된 정유로 액체상, 농축액 또는 혼합액을 포함하는 개념으로 사용되며, 특히 본 발명에서 있어서 가장 바람직하게는 '채종유(Canola oil)'를 포함하는 개념으로 사용된다.

본 발명에서 '효력증진제'는 유효성분인 길항미생물의 포자를 대상병원균에 골고루 분산시키기 위한 '분산제', 길항미생물 포자의 보습유지 및 발아촉진을 위한 '보습제', 유효성분 혼합에 따라 유효성분인 식물추출물과 식물성오일의 산화를 방지하지 위한 '산화방지제'를 포함하는 개념으로 사용된다.

본 발명에서 배합비의 '%'는 다른 언급이 없는 한 '부피%'를 의미한다.

본 발명은 과채류 병해 길항균으로서 본 발명자에 의해 분리된 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)을 살균 유효성분으로 하는 과채류 병해 방제용 미생물 살균제를 제공한다. 본 발명에서 '길항균'은 바실러스 서브틸리스가 이용될 수 있으나, 특히 본 발명자들에 의하여 분리되어 기탁된 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)일 경우 가장 효과적인 방제 능력을 보인다.

본 발명의 목적은 과채류에 발생하는 병해에 대한 환경친화적 살균제를 제공하는 것인 만큼, 과채류의 종류 및 병해 종류가 특정적으로 한정되지는 않으나, 특히 흰가루병, 잿빛곰팡이병 그리고 일반적인 과채류 곰팡이병 방제에 이용될 수 있다.

구체적 실험을 통하여 오이 흰가루병(Sphaerotheca fusca), 참외 흰가루병(Sphaerotheca fusca), 호박 흰가루병(Sphaerotheca fusca), 수박 흰가루병(Sphaerotheca fusca), 고추 흰가루병(Leveillula taurica), 딸기 흰가루병(Sphaerotheca macularis) 등의 흰가루병(Powdery mildew)과, 오이 잿빛곰팡이 병(Botrytis cinerea), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 딸기 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea) 등의 잿빛곰팡이병(Gray mold)에 우수한 방제효과가 확인되었다.

또한, 본 발명의 과채류 병해 방제용 미생물 살균제는 병해에 대한 길항균으로서 상기 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P) 외에도 살균성 식물추출물을 살균 유효성분으로 더 포함할 수 있다. 상기 식물추출물은 쇠비름, 소리쟁이, 울금, 참소리쟁이, 마늘, 산초나무, 소태나무, 차나무, 측백나무로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 이 중에서도 쇠비름 추출물인 경우 그 살균력 증강에 더욱 바람직하다. 상기 식물추출물은 C1~C4의 저급 알콜에서 추출되는 것이 바람직하고, 메탄올에서 추출되는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 제한되지 않으나 약 50℃이 바람직하고, 추출시간은 제한되지 않으나 약 24시간 이상이 바람직하다.

또한, 본 발명의 과채류 병해 방제용 미생물 살균제는 병해에 대한 길항균으로서 상기 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P) 외에도 살균성이 있는 식물성 정유(오일)을 살균 유효성분으로 더 포함할 수 있다. 상기 식물성 오일은 채종유(Canola oil), 피마자오일(Castor oil), 클로브 버드(Clove bud oil), 타임(Thyme), 유칼립투스 리프(Eucalyptus leaf) 중에서 선택된 하나 이상인 것일 바람직하고, 이 중에서도 채종유인 경우 그 살균력 증강에 더욱 바람직하다.

본 발명의 과챌류 병해 방제용 미생물 살균제는 길항균인 바실러스 서브틸리 스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)과, 살균성 식물추출물로 쇠비름 추출물, 살균성 식물정유로서 채종유을 모두 포함할 때 가중 우수한 과채류 병해 방제효과를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 길항미생물, 식물추출물, 식물성 오일 외에도 유효성분의 살균효율을 증가시키기 위하여 효력증진제를 더 포함할 수 있다.

상기 효력증진제는 특별히 제한되지는 않으나, 분산제로 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르(Polyoxyethylene tridecyl ether), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate)인 것이 바람직하고, 이 중 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate)가 더욱 바람직하다. 보습제로 히알루론산(Hyaluronic acid), 히알루론산 나트륨(Sodium hyaluronate), 리놀레산(Linoleic acid)인 것이 바람직하고, 이 중 히알루론산(Hyaluronic acid)인 것이 더욱 바람직하다. 산화방지제로 부틸화 하이드록시아니솔(Butylated hydroxy anisole), 프로필 갈레이트(Propyl gallete), 에르소르빈산(Erythorbic acid)인 것이 바람직하고, 이 중 부틸화 하이드록시아니솔(Butylated hydroxy anisole)인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 길항미생물, 식물추출물, 식물성 오일 외에도 유효성분의 제제화를 위해 제제화용 첨가제가 더 포함된 살균제를 제공한다.

상기 제제화용 첨가제는 특별히 제한되지는 않으나, 폴리옥시에틸렌 모노올레이트(Polyoxyethylene monooleate), 폴리옥시에틸렌 도데실 모노 에테르(Polyoxyethylene dodecyl mono ether), 폴리옥시에틸렌 1,1,3,3-테트라메틸부틸 페닐 에테르(Polyoxyethylene 1,1,3,3-tetramethylbutyl phenyl ether), 올레인산(Oleic acid), 포타슘 소르베이트(Potassium sorbate)에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명은 흰가루병과 잿빛곰팡이병에 대한 길항미생물을 배양한 미생물배양액과 C1~C4의 저급 알콜 또는 메탄올을 이용하여 쇠비름추출물(식물추출물), 채종유(식물성오일)을 서로 일정한 비율로 혼합되어 사용될 수 있으며, 각각의 유효성분은 그 혼합비율이 제한되지는 않으나 최적의 살균효과를 위해서는 각각 대등한 비율로 혼합되는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 살균제는 3가지 유효성분과 효력증진제, 제제화용 첨가제가 혼합되어 사용되며 전체 살균제에 대하여 유효성분 중 바실러스 서브틸리스 KB-401은 1×10⁹ cfu/㎖ 이상 포함하는 것이 바람직하며, 식물추출물과 식물성오일은 약 80~86%인 것이 바람직하고, 효력증진제는 0.5 내지 2.5%인 것이 바람직하고, 제제화용 첨가제는 1.5 내지 9%인 것이 바람직하다.

본 발명의 유효성분의 함량은 살균제의 제형, 살포방법에 따라 다르게 적용되는 것이 바람직하다. 본 발명에서의 흰가루병과 잿빛곰팡이병에 대한 살균제의 제형은 액상으로 하며 살포방법은 물에 충분히 희석하여 경엽처리 할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 미생물 살균제는 흰가루병과 잿빛곰팡이병에 대하여 우수한 방제효과를 지니며, 일반적인 미생물농약에 비해 높은 방제효 과를 나타내고 있으며, 고시된 화학농약과 비교하여 화학농약 대비 85% 이상의 방제효과를 지니고 있어, 흰가루병과 잿빛곰팡이병 방제용 친환경 살균제로서 효과적으로 이용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명의 과채류 병해 방제용 미생물 살균제를 더욱 상세히 설명한다. 본 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예를 설명할 뿐, 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 흰가루병과 잿빛곰팡이병에 대한 길항미생물 선발

본 발명에서 사용되는 흰가루병과 잿빛곰팡이병에 대한 길항미생물로는 바실러스 서브틸리스 KB-401을 사용하였다.

본 발명자들은 국내 토양으로부터 분리된 미생물 중 식물병원균에 대한 항균활성을 평가한 결과 최종적으로 효과가 가장 우수한 세균 1종을 선발하였으며, 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388)이라 명명하고, 2007년 4월 24일자로 사단법인 한국종균협회(Korean Federation of Culture Collections)에 KFCC 11388P의 수탁번호로 기탁하였다.

바실러스 서브틸리스 KB-401의 주요 균학적인 특성은 다음과 같다.

[NA 배지에서의 특성]

색깔	연한 담황색
균총형태	원형
균총표면	볼록형
균총크기	1.0~3.0㎜

[생리적 특성]

그람반응		양성
내성포자 형성유무		유
세포형태		간형
세포의 활동성유무		유
산소요구성		호기성
혐기적 생장		불가
카탈라아제 생성유무		유
VP 테스트		양성
산화작용	포도당	유
	자일로오스	유
	만니톨	유
	아라비노오스	유
포도당으로터 가스 생성유무		유
가수분해능	카제인	양성
	젤라틴	양성
	녹말	양성
시트레이트 이용성		유
프로피오네이트 이용성		무
타이로신 분해능		무
질산 환원능		유
인돌 형성능		무
염분요구성		무
7% 염분농도에서의 생장		유
요소 가수분해		무
온도별 생장	최저	15℃
	최적	30℃
	최고	40℃

실시예 2: 길항균 바실러스 서브틸리스 KB-401의 길항균배양액 제조

상기 길항미생물 바실러스 서브틸리스 KB-401은 M-2배지(표 1)를 이용하여 배양하며 포자생성을 확인하였다. 배양은 30℃, 250ℓ 발효기(Fermenter)에서 150rpm, 1.0~1.5 vol/vol/min, pH6.0~7.0에서 48시간 배양하였으며, 현미경(×400)을 통하여 포자형성 여부를 확인하였다. 배양 결과 배양액내의 포자는 99%이상이었 고, 포자수는 ㎖당 2.0×10⁹ 내지 1.0×10¹⁰ CFU(Colony Forming Unit)를 나타내었다.

바실러스 서브틸리스 KB-401 배양을 위한 M-2 배지 조성

배지 조성	함량(/ℓ)
Glucose	20g
Soybean flour	25g
KH₂PO₄	1g
K₂HPO₄	1g
CaCO₃	1g
MgSO₄·7H₂O	0.3g
CuSO₄·5H₂O	0.01g
MnSO₄	0.02g
FeSO₄·7H₂O	0.02g
ZnSO₄·7H₂O	0.02g

실시예 2: 48종의 식물체로부터 조추출물 제조

여러 문헌을 통하여 각종 식물병원균에 대해 살균효과가 예상되는 하기 표 2의 식물체 48종을 선별한 후, 이를 각각 200g씩 믹서기에서 곱게 마쇄하여 유리병에 넣은 다음 메탄올 1000㎖를 혼합하여 약 50℃에서 24시간 방치하였다. 24시간 후 여과하고 추출용액을 회전진공감압농축기(EYELA N-1000, 일본)로 농축하였다. 상기 농축물을 다시 메탄올에 혼합하는 과정을 거쳐 메탄올 조추출물을 제조하였다.

조추출물 제조를 위한 48종의 식물체

식물명	학명	식물명	학명
가락풀나물	Caulophyllum thalictroicdes	오이풀	Sanguisorba officinalis
감국	Chrysanthemum morifolium	용담	Gentiana scabra
개미취	Aster tataricus	울금	Curcuma longa
개암풀	Psoralea corylifolia	인동덩굴	Lonicera japonica
깽깽이풀	Plagiorhegma dubium	은행나무	Ginkgo biloba
꽈리	Physalis franchetii	음나무	Kalopanax pictus
끈끈이주걱	Drosera rotundifolia	이질풀	Geranium nepalense
달래	Allium grayi	장구채	Melandrium firmum
닭의 장풀	Commelina communis	조릿대	Sasamorpha purpurascens
대황	Rheum undulatum	조뱅이	Cephalonopsis segetus
도꼬마리	Xanthium strumarium	제비꽃	Viola mandshurica
마늘	Allium sativum	쥐방울덩굴	Aristolochia contorta
마디풀	Polygonum aviculare	지모	Anemarrhena asphodeloides
매운냉이	Wasabia japonica	질경이	Plantago asiatica
맥문동	Liriope platyphylla	차나무	Melaleuca alternifolia
목향	Inula helenium	참소리쟁이	Rumex crispus
방풍	Saposhnikovia divaricata	측백나무	Thuja orientalis
백선	Dictamnus dasycarpus	한련초	Eclipta prostata
비파나무	Eryobotrya japonica	할미꽃	Pulsatilla koreana
사철쑥	Artemisia capillaris	현삼	Scrophularia oldhami
산초나무	Zanthoxylum piperitum	협죽도	Nerium oleander
소리쟁이	Rumex crispus	형개	Schizonepeta tenuifolia
소태나무	Picrasma ailanthoides	홀아비꽃대	Chloranthus japonicus
쇠비름	Portulaca oleracea	환삼덩굴	Humulus japonicus

실시예 3: 조추출물의 잿빛곰팡이병원균에 대한 항진균 활성 평가

상기에서 준비한 48종 조추출물의 항진균 활성평가를 위하여 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea)에 대한 항진균 활성을 평가하였다. 평가방법은 페이퍼 디스크(paper disc)방법에 준하여 각각의 조추출물을 1000ppm/disc, 500ppm/disc 농도로 점적하여 항진균 활성을 평가하고 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

조추출물의 잿빛곰팡이병원균에 대한 항진균 활성(생육저지환 직경; ㎜)

조추출물	처리농도(ppm)		조추출물	처리농도(ppm)
조추출물	1000	500	조추출물	1000	500
가락풀나물	-	-	오이풀	-	-
감국	-	-	용담	+	-
개미취	-	-	울금	+++	++
개암풀	-	-	인동덩굴	+	-
깽깽이풀	+	-	은행나무	++	+
꽈리	-	-	음나무	-	-
끈끈이주걱	+	-	이질풀	-	-
달래	+	-	장구채	+	-
닭의 장풀	+	+	조릿대	+	-
대황	+	+	조뱅이	+	-
도꼬마리	++	+	제비꽃	-	-
마늘	++	++	쥐방울덩굴	-	-
마디풀	+	-	지모	+	-
매운냉이	+	+	질경이	+	-
맥문동	+	+	차나무	++	++
목향	+	-	참소리쟁이	+++	++
방풍	+	-	측백나무	++	++
백선	+	-	한련초	++	+
비파나무	+	+	할미꽃	+	+
사철쑥	++	+	현삼	+	-
산초나무	++	++	협죽도	-	-
소리쟁이	+++	++	형개	+	-
소태나무	++	++	홀아비꽃대	-	-
쇠비름	++++	+++	환삼덩굴	+	-

※ 항균활성 정도(생육저지환 직경; ㎜) 0~5 : - , 5~10 : + , 10~15 : ++ , 15~20 : +++ , 20 이상 : ++++

실시예 4: 12종의 식물체로부터 식물성 정유(식물성오일) 제조

여러 문헌을 통하여 각종 식물병원균에 대해 살균효과가 알려져 있는 하기 표 4의 식물체로부터 수증기 증류법(steam distillation)을 실시하여 식물성오일을 제조하였다.

식물성 정유(식물성오일)을 제조하기 위한 12종의 식물체

식물성 정유명	식물명(학명)
클로브 버드(Clove bud)	Eugenia caryophyllata
피마자오일(Castor oil)	Ricinus communis L.
애니시드(Aniseed)	Pmpinella anisum
타임(Thyme)	Thymus vulgaris
유칼립투스 리프(Eucalyptus leaf)	Eucalyptus globulus
패출리 리프(Patchouli leaf)	Pogostemon cablin
로즈마리 리프(Rosemary leaf)	Rosmarinus officinalis
로즈 제라늄(Rose geranium)	Pelargonium rosium
페티그레인(Petitgrain)	Citrus aurantium amara
시나몬 바크(Cinnamon bark)	Cinnamomum cassia
사사프라스(Sassafras)	Sassafras albidum
채종유(Canola oil)	Brassica napus

실시예 5: 식물성 정유의 잿빛곰팡이병원균에 대한 항진균 활성 평가

상기에서 준비한 12종 식물성 정유의 항진균 활성평가를 위하여 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea)에 대한 항진균 활성을 평가하였다. 평가방법은 페이퍼 디스크(paper disc)방법에 준하여 각각의 식물성 정유를 1000ppm/disc, 500ppm/disc 농도로 점적하여 항진균 활성을 평가하고 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

식물성 정유의 잿빛곰팡이병원균에 대한 항진균 활성

식물성 정유명	처리농도(ppm)
식물성 정유명	1000	500
클로브 버드(Clove bud)	++	++
피마자오일(Castor oil)	++	+
애니시드(Aniseed)	+	+
타임(Thyme)	++	+
유칼립투스 리프(Eucalyptus leaf)	++	++
패출리 리프(Patchouli leaf)	-	-
로즈마리 리프(Rosemary leaf)	+	-
로즈 제라늄(Rose geranium)	+	-
페티그레인(Petitgrain)	+	-
시나몬 바크(Cinnamon bark)	+	+
사사프라스(Sassafras)	++	+0
채종유(Canola oil)	+++	++

실시예 6: 3가지 유효성분 혼합에 따른 항진균 활성 평가

상기에서 선발된 3가지 유효성분(바실러스 서브틸리스 KB-401, 쇠비름추출물, 채종유)의 살균효과를 보다 효율적으로 증진시키기 위해 각각의 유효성분을 단독으로 사용하는 것과 3가지 유효성분을 일정비율로 혼합하여 사용하는 경우 잿빛곰팡이병원균에 대한 항진균 활성을 평가하였다. 미생물배양액은 바실러스 서브틸리스 KB-401을 배양하여 포자밀도가 1×10⁹ cfu/㎖ 이상 되도록 첨가하였고, 쇠비름추출물과 채종유는 동일한 비율로 혼합하였다.

유효성분 혼합에 따른 잿빛곰팡이병원균에 대한 항진균 활성(생육저지환; ㎜)

유효성분	처리농도(ppm)
유효성분	1000	500
KB-401 배양액	20.5	17.2
쇠비름추출물	21.3	16.8
채종유	18.7	13.8
KB-401 배양액 + 쇠비름추출물	23.6	18.3
KB-401 배양액 + 채종유	21.8	17.5
쇠비름추출물 + 채종유	22.4	17.7
KB-401 배양액 + 쇠비름추출물 + 채종유	25.0	19.2

실시예 7: 효력증진제가 더 포함된 살균제 제조

상기 표 6에서 선발된 3가지 유효성분의 살균효과를 증진하기 위한 효력증진제로 분산제, 보습제, 산화방지제를 첨가하였다.

분산제는 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르(Polyoxyethylene tridecyl ether), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate), 폴리옥시에틸렌 글리세린 모노올레이트(Polyoxyethylene glycerin monooleate), 소르비탄 모노스테레이트(Sorbitan monostearate) 등의 비이온계면활성제를 이용하여 길항미생물의 포자가 골고루 분산될 수 있도록 하였다. 각각의 물질을 농도별로 희석하고 길항미생물 배양액과 혼합한 다음 현미경을 이용하여 포자의 분산정도를 비교한 결과 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르(Polyoxyethylene tridecyl ether) 1.0%에서 가장 양호한 것으로 나타났다.

보습제는 화장품에서 사용되고 있는 독성이 없는 다양한 보습제를 이용하여 목적부위에서 적정한 습도를 유지하며 길항미생물의 포자가 발아될 수 있도록 하였다. 후보물질로는 히알루론산(Hyaluronic acid), 히알루론산 나트륨(Sodium hyaluronate), 리놀레산(Linoleic acid), 글리세릴 디말토덱스트린(Glyceryl dimaltodextrin), 포타슘 셀룰로오스 수키네이트(Pottasium cellulose succinate) 등을 이용하였다. 각각의 보습제를 농도별로 처리하여 길항미생물 배양액과 혼합한 뒤 보습능력을 확인한 결과 히알루론산(Hyaluronic acid) 1.0%이상에서 포자 발아효과 및 보습능력이 우수한 것으로 나타났다.

산화방지제는 화장품 및 식품용으로 사용되고 있는 여러 종류의 산화방지제를 이용하여 유효성분인 식물추출물과 채종유의 산화를 효율적으로 방지할 수 있도록 하였다. 후보물질로는 부틸화 하이드록시아니솔(Butylated hydroxy anisole), 프로필 갈레이트(Propyl gallete), 에르소르빈산(Erythorbic acid), 터셔리 부틸하이드로퀴논(tert-Butyl hydroquinone), 옥시스테아린(Oxystearin) 등을 이용하였다. 각각의 산화방지제를 농도별로 처리하여 유효성분과 혼합한 뒤 온도를 달리하여 경시적으로 보관하면서 항균효과의 변화를 비교하여 산화방지여부를 확인한 결과 부틸화 하이드록시아니솔(Butylated hydroxy anisole) 0.5%이상에서 산화방지효과가 우수한 것으로 나타났다.

실시예 8: 제제화용 첨가제 및 안정제가 더 포함된 살균제 제조

본 발명의 3가지 유효성분 및 효력증진제의 제제화를 위해서는 제제화용 첨가제가 요구된다.

따라서, 실시예 7에서 선발된 효력증진제와 3가지 유효성분의 혼합물에 제제화용 첨가제로서 다양한 비이온 계면활성제와 안정제를 농도별로 혼합하여 물성변화를 관찰하고 제제화용 첨가제를 선발하였다.

그 결과 제제화용 첨가제로서 폴리옥시에틸렌 모노올레이트(Polyoxyethylene monooleate) 2.0%, 폴리옥시에틸렌 도데실 모노 에테르(Polyoxyethylene dodecyl mono ether) 2.5%, 폴리옥시에틸렌 1,1,3,3-테트라메틸부틸 페닐 에테르(Polyoxyethylene 1,1,3,3-tetramethylbutyl phenyl ether) 3.0%, 올레인산(Oleic acid) 1.5%, 안정제로서 포타슘 소르베이트(Potassium sorbate) 0.1% 이상 혼합하였을 경우 유효성분의 침전, 층분리 등이 없는 것으로 나타났다.

실시예 9: 최종배합에 따른 살균제 제조

상기에서 선발된 3가지 유효성분과 효력증진제, 제제화용 첨가제, 안정제를 이용하여 최종배합에 따른 살균제를 제조하였다. 유효성분인 바실러스 서브틸리스 Kb-401은 1×10⁹ cfu/㎖ 되도록 첨가하였고, 식물추출물인 쇠비름추출물은 43%, 식물성오일인 채종유는 43%를 혼합하였다. 효력증진제로 분산제는 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르(Polyoxyethylene tridecyl ether) 1.0%, 보습제는 히알루론산(Hyaluronic acid) 1.0%, 산화방지제는 부틸화 하이드록시아니솔(Butylated hydroxy anisole) 0.5%를 혼합하였다. 제제화용 첨가제는 폴리옥시에틸렌 모노올레이트(Polyoxyethylene monooleate) 2.0%, 폴리옥시에틸렌 도데실 모노 에테르(Polyoxyethylene dodecyl mono ether) 2.5%, 폴리옥시에틸렌 1,1,3,3-테트라메틸부틸 페닐 에테르(Polyoxyethylene 1,1,3,3-tetramethylbutyl phenyl ether) 3.0%, 올레인산(Oleic acid) 1.5%를 혼합하였고, 안정제는 포타슘 소르베이트(Potassium sorbate) 0.1%를 혼합하여 살균제를 제조하였다.

본 발명의 살균제의 포장에서의 방제효과 시험

실험예 1: 과채류 흰가루병에 대한 방제효과 시험

실시예 9에서 제조된 살균제를 흰가루병이 발병한 포장에서 오이 흰가루병, 참외 흰가루병, 호박 흰가루병, 수박 흰가루병, 고추 흰가루병, 딸기 흰가루병에 대한 방제효과를 시험하였다. 포장에서의 방제효과 검정은 500배로 희석하여 발병초 7일 간격으로 3회 경엽처리 하였으며, 대조약제로는 페나리몰 유제(Fenarimol), 트리플루미졸 수화제(Triflumizole), 테트라코나졸 유탁제(Tetraconazole)와 비교하였다. 포장관리는 농가 일반 경종법에 준하였고, 시험구는 난괴법 3반복으로 실시하였으며, 조사방법은 최종약제 처리 후 발병도, 이병엽율, 이병과율을 조사하였다.

오이 흰가루병에 대한 방제효과

시험약제	발 병 도 (%)				방제가 (%)
시험약제	1반복	2반복	3반복	평균	방제가 (%)
실시예 9 (500배)	10.0	8.3	5.5	7.9	83.2
페나리몰 유제 (4000배)	7.6	4.0	3.9	5.2	89.0
무처리	40.1	47.0	54.3	47.1	-

참외 흰가루병에 대한 방제효과

시험약제	발 병 도 (%)				방제가 (%)
시험약제	1반복	2반복	3반복	평균	방제가 (%)
실시예 9 (500배)	8.4	8.2	5.3	7.3	78.8
페나리몰 유제 (3000배)	3.1	2.5	1.6	2.4	93.0
무처리	31.6	33.0	38.5	34.4	-

호박 흰가루병에 대한 방제효과

시험약제	발 병 도 (%)				방제가 (%)
시험약제	1반복	2반복	3반복	평균	방제가 (%)
실시예 9 (500배)	4.0	3.5	3.8	3.8	86.5
트리플루미졸 수화제 (4000배)	0.9	1.5	2.2	1.5	94.7
무처리	28.3	22.6	33.4	28.1	-

수박 흰가루병에 대한 방제효과

시험약제	발 병 도 (%)				방제가 (%)
시험약제	1반복	2반복	3반복	평균	방제가 (%)
실시예 9 (500배)	5.3	7.5	8.9	7.2	80.4
페나리몰 유제 (3000배)	2.4	3.0	3.1	2.8	92.4
무처리	32.2	40.6	37.5	36.8	-

고추 흰가루병에 대한 방제효과

시험약제	발 병 도 (%)				방제가 (%)
시험약제	1반복	2반복	3반복	평균	방제가 (%)
실시예 9 (500배)	8.2	4.4	4.8	5.8	77.9
테트라코나졸 유탁제 (2000배)	2.5	0.8	1.3	1.5	94.3
무처리	29.5	21.6	27.4	26.2	-

딸기 흰가루병에 대한 방제효과

시험약제	발 병 도 (%)				방제가 (%)
시험약제	1반복	2반복	3반복	평균	방제가 (%)
실시예 9 (500배)	6.3	5.0	8.2	6.5	81.2
트리플루미졸 수화제 (4000배)	1.5	3.8	1.7	2.3	93.4
무처리	35.0	30.2	38.7	34.6	-

상기 표 7 내지 12에서 보는 바와 같이 실시예 9의 500배에서 흰가루병에 대한 방제효과는 77.9% ~ 86.5%의 방제가를 나타내고 있다. 각각의 대조약제와 비교하여 방제효과가 다소 떨어지게 나타나지만, 일반적인 미생물농약 방제효과가 70% 내외인 점을 감안할 때 상대적으로 높은 방제효과를 보였다.

실험예 2: 과채류 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과 시험

실시예 9에서 제조된 살균제를 잿빛곰팡이병이 발병한 포장에서 오이 잿빛곰팡이병, 토마토 잿빛곰팡이병, 딸기 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과를 시험하였다. 포장에서의 방제효과 검정은 500배로 희석하여 발병초 7일 간격으로 3회 경엽처리 하였으며, 대조약제로는 디클로플루아니드 수화제(Dichlofluanid)와 비교하였다. 포장관리는 농가 일반 경종법에 준하였고, 시험구는 난괴법 3반복으로 실시하였으며, 조사방법은 최종약제 처리 후 이병과율을 조사하였다.

오이 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과

시험약제	이병과율 (%)				방제가 (%)
시험약제	1반복	2반복	3반복	평균	방제가 (%)
실시예 9 (500배)	4.1	2.7	2.5	3.1	82.7
디클로플루아니드 수화제 (600배)	1.6	0.8	1.5	1.3	92.7
무처리	17.6	15.8	20.3	17.9	-

토마토 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과

시험약제	이병과율 (%)				방제가 (%)
시험약제	1반복	2반복	3반복	평균	방제가 (%)
실시예 9 (500배)	4.6	3.2	2.5	3.4	83.1
디클로플루아니드 수화제 (500배)	2.2	1.4	2.1	1.9	90.5
무처리	22.7	19.3	18.4	20.1	-

딸기 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과

시험약제	이병과율 (%)				방제가 (%)
시험약제	1반복	2반복	3반복	평균	방제가 (%)
실시예 9 (500배)	3.5	4.0	3.9	3.8	81.8
디클로플루아니드 수화제 (600배)	1.0	1.8	2.7	1.8	91.4
무처리	20.5	18.8	23.3	20.9	-

상기 표 13 내지 15에서 보는 바와 같이 실시예 9의 500배에서 흰가루병에 대한 방제효과는 81.8% ~ 83.1%의 방제가를 나타내고 있다. 대조약제인 디클로플루아니드 수화제와 비교하여 방제효과가 다소 떨어지게 나타나지만, 일반적인 미생물농약 방제효과가 70% 내외인 점을 감안할 때 상대적으로 높은 방제효과를 보였다.

Claims

과채류 병해 길항균을 이용한 미생물 살균제에 있어서,

바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P) 및 쇠비름 추출물 및 채종유(Canola oil)를 살균 유효성분으로 하는 오이 흰가루병(Sphaerotheca fusca) 방제용 미생물 살균제.
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