KR101069899B1 - 원자현미경을 이용한 생체분자간 결합 - Google Patents
원자현미경을 이용한 생체분자간 결합 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101069899B1 KR101069899B1 KR1020117005477A KR20117005477A KR101069899B1 KR 101069899 B1 KR101069899 B1 KR 101069899B1 KR 1020117005477 A KR1020117005477 A KR 1020117005477A KR 20117005477 A KR20117005477 A KR 20117005477A KR 101069899 B1 KR101069899 B1 KR 101069899B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cantilever
- substrate
- dendron
- nucleotide
- binding
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
- G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
- G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
- G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
- G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
- G01Q60/38—Probes, their manufacture, or their related instrumentation, e.g. holders
- G01Q60/42—Functionalisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y35/00—Methods or apparatus for measurement or analysis of nanostructures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
- C12Q2565/601—Detection means characterised by use of a special device being a microscope, e.g. atomic force microscopy [AFM]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Length Measuring Devices With Unspecified Measuring Means (AREA)
Abstract
본 발명은 원자현미경(atomic force microscopy, ATM)용 캔틸레버(cantilever)에 관한 것이다. 상기 캔틸레버는 고정 말단과 비고정 말단을 가진 캔틸레버 본체, 덴드론(dendron)의 분지된 부위에 있는 다수의 말단과 결합하고 덴드론에 의해 화학적으로 변형된 표면 부위를 가진 비고정 말단, 및 관능기화된 덴드론의 선형 부위의 말단을 포함한다.
Description
본 발명은 통상의 원자현미경(AFM), 원자현미경용 캔틸레버, 및 상기 원자현미경을 이용한 생체분자간의 결합을 측정하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명은 생체분자간의 결합을 측정하는 덴드론에 의해 코팅된 Bio-AFM tip의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 제어된 중앙 스페이스를 가진 표면을 이용하여 세포 수용체를 맵핑(Mapping)하는 구체적인 Bio-AFM 힘을 제공한다.
포스트-게놈 시대에서, 질병의 진단과 예방, 및 신약개발을 위한 게놈의 정량적이며 포괄적인 연구는 급성장하고 있는 연구 개발 영역이다. 이러한 분야의 성장은 고감도 및 고특이적인 생체분자 인지 프로브에 대한 강한 요구를 이미 생산하였다 (K. Wang et al., Anal. Chem. 76, 5721, 2004).
다양한 생체분자의 인지 연구를 통하여 상보적인 DNA 가닥의 기계적인 안정성 (또는 인지 특성)을 이해하는 것은 DNA 전사, 유전자 발현과 조절, 및 DNA 복제와 같은 중요한 생물학적 과정을 심도있게 이해하는데 매우 중요하다. 이러한 점에서, DNA의 스트레칭(stretching) 및 힘에 의해 유도된 DNA의 융해(melting)는 광학 핀셋(optical tweezer), 마이크로-피펫 흡입기(micro-pipette suction), 및 원자현미경(AFM)과 같은 다양한 기술을 이용하여 조사되어 왔다 (H. Clausen-Schaumann, M. Seitz, R. Krautbauer, H. E. Gaub, Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 524 , 2000; R. Merkel, Physics Reports 346, 343, 2001; G. U. Lee, L. A. Chris, R. J. Colton, Science 266, 771, 1994).
극소수의 피코뉴튼의 힘 아래에서 작은 길이 범위 및 고감도로 각 분자간의 특이적인 결합을 측정하는 것이 가능한 것처럼, AFM은 분자 단위에서 프로브의 친화력(affinity) 및 인지 특성(recognition property)을 측정하기 위해 빠르게 개발중에 있는 기술이다 (R. Krautbauer, M. Rief, H. E. Gaub, Nano Lett. 3, 493, 2003). 힘 측정에 사용되는 다른 민감한 방법과 비교했을 때, AFM은 높은 해상도 및 높은 공간해상도를 가지고 있으며, 정전기적 반응 (J. Wang, A. J. Bard, Anal. Chem. 73, 2207, 2001), 리간드-수용체 결합 (S. M. Rigby- Singleton et al, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2 1722, 2002), 항원-항체 반응 (F. Schwesinger et al, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 97, 9972, 2000), 앱타머-단백질 반응 (C. Bai et al, Anal. Chem. 75, 2112, 2003), 단백질 접힘/풀림 (P. M. Williams et al, Nature 422, 446, 2003; M. S. Z. Kellermayer, S. B. Smith, H.L. Granzier, C. Bustamante, Science 276,1112, 1997), 세포-세포간 결합 (M. Benoit, D. Gabriel, G. Gerisch, H. E. Gaub, Nature Cell Biol. 2, 313, 2000) 및 DNA-DNA 혼성화 (C. W. Frank, Biophys. J. 76, 2922, 1999)와 같은 생물학적 과정에서의 특이적인 결합을 조사하기 위한 물리적인 조건하에서 작동 가능하다.
비록 많은 연구들이 상보적인 DNA 가닥들의 비결합 측정을 통하여 수행되었으나 (H. Clausen-Schaumann, M. Seitz, R. Krautbauer, H. E. Gaub, Curr. Opin. Chem. Biol 4, 524, 2000; R. Merkel, Physics Reports 346, 343 , 2001; G. U. Lee, L. A. Chris, R. J. Colton, Science 266, 771. 1994; R. Krautbauer, M. Rief, H. E. Gaub, Nano Lett. 3, 493, 2003), 이러한 단일 분자 단위에서 수행된 DNA 가닥을 인지하는 데에는 문제가 있다. 통상의 고정 접근법은 다-점 반응(multi-point interaction)을 수행하는 것이 어렵고, 단일 분자간의 결합을 해결하는 것도 쉽지 않다. 불필요한 반응을 피하기 위해 비활성 계면활성제와 혼합하여 표면 밀도를 줄임으로써 이를 해결할 수 있으나, 낮은 인지 효율로 인해 상기 접근법은 신뢰할 만한 분석 결과를 낼 수 없게 된다. 그러므로, 옥사이드-실란 및 골드-티올 화학과 같은 고정를 위해 통상적으로 사용되는 표면 화학은 AFM 측정시 단일 DNA-DNA 반응에서 매우 중요한 기본적인 정보를 검색하는데 최적화되어야 한다.
원자현미경(Atomic Force Microscopy)은 생체내에 있는 생체분자들간의 다양한 반응 기작을 이해하는 중요한 수단으로서 전통적으로 사용되어 왔다. 원자현미경은 생체분자들간의 결합을 분석할 수 있기 때문에, 분자 단위에서 수행되는 많은 연구들과 같은 미래의 나노 및 생명공학 분야에 더욱 유용하게 사용될 것으로 기대되고 있다.
이러한 기술적 이점을 가진 원자현미경을 이용하여 서로 다른 표면상에 있는 생체분자들간의 반응 기작을 조사하기 위해서는 많은 노력이 필요하다. 그러나, 액상과 달리 표면상에 있는 생체 물질의 관찰은 불수 흡착(involuntary adsorption) 및 입체 장애(steric hindrance)와 같은 특이적인 문제점을 발생시킨다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 수행된 많은 측정 방법 중 가장 유용한 방법 하나는 생체 물질의 표면상에 복합적인 자가-조립 필름을 적용하여 단일분자간의 결합을 측정하는 것이다. AFM을 이용하여 두 생체분자간의 단일 결합을 관찰할 경우, 두 가지 문제점이 발생하는데, 첫번째 문제점은 생체내에서와 달리 표면상에서 나타나는 생체분자의 활성 차이이고, 두번째 문제점은 단일분자간의 결합이 상기와 같은 셋팅에서 보장될 수 없다는 사실이다. 기존의 연구에서는 자가-조립 필름 기술(self-assembling film technology) 및 중앙 스페이스 조작 기술(meso space manipulation technology)을 이용할 경우 2가지 문제점이 발생될 수 있다고 보고하였다 (Langmuir 2005, 21, 4257, WO 2006/016787). 상기 기술은 도입될 수 있는 분자상의 관능기의 수를 제한함으로써 생체분자의 스페이스 및 수를 조절하여 단일분자상에서 분자간의 결합을 관찰하는 것이다. 이 방법의 가장 흔한 문제점은 동일한 관능기를 가진 분자들간의 비특이적인 결합에 의해, 상 분리(phase separation)를 초래한다는 것이다. 아울러, 상기 생체분자들이 서로간에 고르게 분포하고 있다는 어떠한 명백한 증거도 없다.
Bio-AFM 기술을 이용한 생체분자에 대한 연구의 중요성은 급속히 증가하고 있다. Bio-AFM은 생물학적 활성을 보조하는 액상조건에서 생체분자와 같은 비전도성 물질을 나노미터 단위에서 관찰할 수 있기 때문에 생체분자의 구조 및 하부구조를 연구하는데 있어서 매우 중요한 도구이다. 또한, Bio-AFM은 자체의 Bio-AFM 말단(tip)에 의해 분자간의 결합을 밀접하게 관찰할 수 있으므로 생체분자를 적재할 수 있고, 상보적인 DNA 분자간의 결합, 단백질간의 결합, 약물에 대한 면역반응을 연구하는데 중요한 리간드-수용체 결합, 단일분자상에서 생체분자간의 결합을 측정하는데 응용되기 때문에, Bio-AFM의 고감도는 1차적으로 중요하다. 단일분자의 관찰은 Bio-AFM, 광학적 핀셋 및 자기성 핀셋과 같은 방법을 통하여 수행될 수 있다. 상기 광학적 핀셋 방법은 분자의 손상을 초래할 수 있고, 자기성 핀셋 방법은 정확도가 감소되는 단점을 가지고 있다.
Bio-AFM을 이용하여 리간드-수용체의 기작을 조사하기 위해서는, 리간드를 Bio-AFM의 말단에 적재하는 것이 필요하다. 일반적으로, 이러한 적재는 바이오틴-스트렙타비딘 결합을 이용하거나, 합성 자가-조립 필름을 이용하여 수행될 수 있다. 그러나, 이러한 방법들은 분자간의 거리를 직접 조절할 수 없고, 리간드가 특정 부위에 집중될 수 있으므로, 리간드-수용체 결합을 정확하게 측정하는데 어려움이 있다.
본 발명의 목적은 고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가진 캔틸레버 본체를 포함하며, 상기 비고정 말단은 덴드론에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지며, 상기 덴드론의 분지 부위에 있는 다수의 말단은 상기 표면에 결합되고, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단은 관능기화된 것인, 원자현미경(ATM)용 캔틸레버를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 선형 부위의 관능기 사이에 약 0.1 nm 내지 약 100 nm의 규칙적인 간격으로 분포하는 덴드론을 가진 AFM의 캔틸레버를 제공하는 것이다. 특히, 상기 덴드론은 약 10 nm의 규칙적인 간격으로 분포하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 다수 개의 덴드론의 말단과 반응할 수 있도록 캔틸레버의 비고정 말단의 표면 부위를 관능화시키는 단계; 및 (ii) 상기 표면 부위가 관능화된 캔틸레버의 비고정 말단을 다수 개의 덴드론을 포함하는 용액에 침지시켜 캔틸레버의 관능화된 표면에 다수 개의 덴드론의 분지 부위의 말단을 접촉시키는 단계를 포함하는, 캔틸레버를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 프로브 뉴클레오타이드, 수용체에 대한 리간드 또는 상기 프로브 뉴클레오타이드 또는 상기 리간드와 연결된 링커가 덴드론의 선형 부위의 말단에 고정된 캔틸레버를 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 i) 상기 표면 부위상에 있는 덴드론의 선형 부위의 말단으로부터 보호기를 제거하는 단계; 및 ii) 상기 프로브 뉴클레오타이드, 리간드 또는 링커 분자 및 상기 말단이 서로 결합할 수 있도록 프로브 뉴클레오타이드, 수용체에 대한 리간드 또는 상기 프로브 뉴클레오타이드 또는 상기 리간드와 연결된 링커 분자를 서브스트레이트상에 있는 덴드론의 선형 부위의 말단에 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 링커 분자가 동형의 양작용성(homo-bifunctional) 링커 또는 이형의 양작용성(hetero-bifunctional) 링커인, 프로브 뉴클레오타이드, 수용체에 대한 리간드 또는 상기 프로브 뉴클레오타이드 또는 상기 리간드와 연결된 링커가 덴드론의 선형 부위의 말단에 고정된 캔틸레버를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 프로브 뉴클레오타이드와 표적 뉴클레오타이드간의 결합을 측정하기 위한 장치로서,
고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가지며, 상기 비고정 말단은 덴드론에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지며, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단은 프로브 뉴클레오타이드에 결합되는, 캔틸레버;
표적 뉴클레오타이드가 고정되는 서브스트레이트;
상기 덴드론에 의해 변형된 캔틸레버의 표면 부위상에 고정된 프로브 뉴클레오타이드와 서브스트레이트상에 고정된 표적 뉴클레오타이드가 결합할 수 있도록 상기 캔틸레버 및 표적 뉴클레오타이드 서브스트레이트의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 조절자; 및
상기 프로브 뉴클레오타이드와 상기 표적 뉴클레오타이드 결합에 관련된 물리적 변수를 측정하기 위한 검출자를 포함하는, 원자현미경(AFM)인 장치를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 프로브 뉴클레오타이드와 상호작용하는 표적 뉴클레오타이드를 분석하는 방법으로서,
(a) 고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가지며, 상기 비고정 말단은 덴드론에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지며, 상기 덴드론의 분지 부위에 있는 다수의 말단은 상기 표면에 결합되고, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단이 프로브 뉴클레오타이드에 결합되는, 캔틸레버를 제공하는 단계:
(b) 표적 뉴클레오타이드를 서브스트레이트상에 고정시키는 단계;
(c) 프로브 뉴클레오타이드를 고정시키기 위하여 덴드론에 의해 변형된 상기 캔틸레버의 표면 부위를 화학적으로 변형시키는 단계;
(d) 상기 덴드론-변형된 표면상에 고정된 프로브 뉴클레오타이드와 시료 지지체의 서브스트레이트상에 고정된 표적 뉴클레오타이드가 상호작용할 수 있도록 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 조절자를 포함하는 장치에, 상기 서브스트레이트와 캔틸레버를 연결하는 단계;
(e) 상기 프로브 뉴클레오타이드와 상기 표적 뉴클레오타이드가 상호작용할 수 있도록 상기 캔틸레버 및 서브스트레이트의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 단계; 및
(f) 상기 프로브 뉴클레오타이드와 상기 표적 뉴클레오타이드의 상호작용에 관련된 물리적 변수를 측정하는 단계를 포함하는, 프로브 뉴클레오타이드와 상호작용하는 표적 뉴클레오타이드를 분석하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 리간드와 표적 수용체간의 결합을 측정하기 위한 장치로서,
고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가지며, 상기 비고정 말단은 덴드론에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지며, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단은 리간드에 결합되는, 캔틸레버;
표적 수용체가 고정되는 서브스트레이트;
상기 덴드론에 의해 변형된 캔틸레버의 표면 부위상에 고정된 리간드와 서브스트레이트상에 고정된 표적 수용체가 결합할 수 있도록 상기 캔틸레버 및 표적 수용체 서브스트레이트의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 조절자; 및
상기 리간드와 상기 표적 수용체간의 결합에 관련된 물리적 변수를 측정하기 위한 검출자를 포함하는, 원자현미경(AFM)인 장치를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 리간드와 상호작용하는 표적 수용체를 분석하는 방법으로서,
(a) 고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가지며, 상기 비고정 말단은 덴드론에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지며, 상기 덴드론의 분지 부위에 있는 다수의 말단은 상기 표면에 결합되고, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단이 프로브 뉴클레오타이드에 결합되는, 캔틸레버를 제공하는 단계:
(b) 표적 수용체를 서브스트레이트상에 고정시키는 단계;
(c) 리간드를 고정시키기 위하여 덴드론에 의해 변형된 상기 캔틸레버의 표면 부위를 화학적으로 변형시키는 단계;
(d) 상기 덴드론-변형된 표면상에 고정된 리간드와 시료 지지체의 서브스트레이트상에 고정된 표적 수용체가 상호작용할 수 있도록 상기 서브스트레이트와 캔틸레버를 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 조절자를 포함하는 장치에 연결하는 단계;
(e) 상기 리간드와 상기 표적 수용체가 상호작용할 수 있도록 상기 캔틸레버 및 서브스트레이트의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 단계; 및
(f) 상기 리간드와 상기 표적 수용체간의 상호작용에 관련된 물리적 변수를 측정하는 단계를 포함하는, 리간드와 상호작용하는 표적 수용체를 분석하는 방법을 제공한다.
상기 분석 방법에 있어서, 상기 분지된 부위의 말단은 -COZ, -NHR, -OR', 또는 -PR"으로 관능화될 수 있으며, 이때 Z는 이탈기이고, R은 알킬이고, R'은 알킬, 아릴, 또는 에테르이고, 및 R"는 수소, 알킬, 알콕시, 또는 산소이다. 특히, COZ는 에스테르, 활성화된 에스테르, 산할리드, 활성화된 아미드, 또는 CO-이미다조일이고, R은 C1-C4 알킬이고, 및 R'은 C1-C4 알킬이다. 또한, 상기 서브스트레이트에 있어서, 상기 폴리머는 덴드론일 수 있다. 또한, 상기 폴리머의 선형 부위는 스페이서 부위를 포함할 수 있고, 상기 스페이서 부위는 제1관능기를 통하여 분지된 부위에 연결된 것일 수 있다. 상기 제1관능기는 -NH2, -OH, -PH3, -COOH, -CHO, 또는 -SH일 수 있고, 상기 스페이서 부위는 상기 제1 관능기에 공유적으로 결합된 링커 부위를 포함할 수 있다.
상기 서브스트레이트 및 AFM 캔틸레버, 바람직하게는 AFM 말단(tip)에 있어서, 상기 링커 부위는 치환되거나 치환되지 않은 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 아릴기, 에테르기, 폴리에테르기, 에스테르기, 또는 아미노알킬기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 스페이서 부위는 제2의 관능기를 포함할 수 있다. 상기 제2의 관능기는 -NH2, -OH, - PH3, -COOH, -CHO, 또는 -SH를 포함할 수 있고, 상기 선형 부위의 말단에 위치할 수 있다. 또한, 보호기는 상기 선형 부위의 말단에 결합될 수 있고, 산 반응성 물질 또는 염기 반응성 물질일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 AFM 캔틸레버에 있어서, 프로브 리간드 또는 뉴클레오타이드 및/또는 표적 리간드 결합 파트너 또는 뉴클레오타이드는 상기 덴드론의 선형 분위의 말단과 결합될 수 있다. 특히, 상기 표적 뉴클레오타이드 및 상기 프로브 뉴클레오타이드는 DNA, RAN, PNA, 앱타머, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 표적-특이적 리간드는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으나, 보다 일반적으로 생각될 수 있는 화합물, 폴리펩티드, 탄수화물, 항체, 항원, 생체모방제, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 리간드 또는 상기 덴드론의 선형 부위와 결합된 뉴클레오타이드간의 거리는 약 0.1 nm 내지 100 nm일 수 있다.
또 다른 본 발명의 일 실시예에서, 상기 서브스트레이트는 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체, 금속, 합금, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 유리, 또는 세라믹으로 이루어질 수 있다. 특히, 상기 서브스트레이트는 슬라이드, 입자, 비드, 마이크로-웰, 또는 다공성 물질일 수 있다.
본 발명의 이러한 목적과 다른 목적들은 하기하는 발명의 상세한 설명, 첨부된 도면 및 첨부된 청구항에 의하여 보다 잘 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에 있어서, "a"와 "an"은 단수 및 복수를 모두 의미하기 위하여 사용된다.
본 명세서에서, "앱타머(aptamer)"란 왓슨-클릭 염기 쌍 형성 또는 삼중 가닥 형성 이외의 메카니즘에 의하여 선택된 비올리고뉴클레오타이드 분자 또는 분자 군을 특이적으로 인지할 수 있는 단일 가닥, 부분적으로 단일 가닥, 부분적으로 이중 가닥 또는 이중 가닥 뉴클레오타이드 서열, 유리하게 복제 가능한 뉴클레오타이드 서열 들을 의미한다.
본 명세서에서, "바이오미메틱(biomimetic)"이란 생물학적 분자, 분자 그룹 또는 구조를 모방하는 분자, 그룹, 다분자 구조 또는 방법을 의미한다.
본 명세서에서, "덴드리머(dendrimer)"는 중심, 적어도 하나 이상의 내부 분지층, 및 표면 분지층에 의하여 특정된다 (Petar et al. Pages 641-645, In Chem. in Britain, (August 1994) 참조). "덴드론(dendron)"이란 초점으로부터 방사된 분지를 갖는 덴드리머의 일종으로, 중심에 연결되어 있거나 연결될 수 있고, 직접 또는 연결 부위를 통하여 덴드리머를 형성할 수 있다. 많은 덴드리머는 공통된 중심에 연결된 둘 또는 그 이상의 덴드론을 포함한다. 그러나, 상기 덴드리머는 넓게는 하나의 덴드론을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 거대분자 또는 덴드론 구조를 설명하기 위해 사용되는 “고도로 분지된(hyperbranched)” 또는 “분지된(branched)”이란 서브스트레이트와 공유결합 또는 이온결합할 수 있는 다수의 말단을 갖는 다수의 중합체(polymer)를 의미한다. 일 구체예에서, 상기 분지된 또는 고도로 분지된 구조를 포함하는 상기 거대분자는 미리 제조되어("pre-made"), 서브스트레이트에 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서, "고정된(immobilized)"이란 불용성화된 것을 의미하거나, 불용성, 부분적으로 불용성, 콜로이드, 미립자, 분산, 현탁 및/또는 탈수된 물질, 또는 고체 지지체에 부착되거나 이를 포함하는 분자 또는 고체상을 포함하거나, 여기에 부착되거나, 작동 가능하게 관련된 것을 의미한다.
본 명세서에서, "라이브러리(library)"란 무작위적 또는 비무작위적 혼합, 분자의 집합 또는 분류(assortment), 물질, 표면, 구조적 형태, 또는 선택적이고 제한 없는 다양한 화학적 존재, 단량체, 중합체, 구조체, 전구체, 산물, 변이체, 유도체, 물질, 형태, 모양, 또는 특징을 의미한다.
본 명세서에서, "리간드(ligand)"는 상보적인 염기쌍을 포함하는 친화성 기재의 인력에 의하여 다른 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 선택된 분자를 의미한다. 상기 리간드는 핵산, 다양한 합성 화합물, 수용체 작용제(receptor agonist), 부분적 작용제, 혼합 작용제, 길항제(antagonist), 반응 유도 파트너(response-inducing molecule), 반응 촉진 파트너(response-stimulus molecule), 약물, 호르몬, 페로몬, 신경전달물질(transmitter), 오타코이드(autacoid), 성장파트너(growth factors), 사이토카인(cytokine), 보결 분자단(prosthetic group), 조효소(coenzyme), 보조파트너(cofactor), 서브스트레이트(substrate), 전구체(precursor), 비타민, 독소(toxin), 조절파트너(regulatory factor), 항원, 합텐(hapten), 탄수화물, 분자 모사체(molecular mimics), 구조적 분자(structural molecule), 작동 분자(effector molecule), 선택 분자(selectable molecule), 바이오틴(biotin), 디곡시제닌(digoxigenin), 교차반응물질(crossreactant), 유사체(analog), 경쟁제(competitor) 또는 이들 분자의 유도체 뿐만 아니라 선택된 표적과 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리-선택 비올리고뉴클레오타이드 분자 및 이러한 물질들이 2차 반응 분자(second molecule)와 결합하여 형성되는 콘쥬게이트를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "리간드 결합 파트너"는 리간드에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다.
본 명세서에서, "링커 분자" 및 "링커"는 분지된/선형 중합체와 같은 분자 크기가 제어된 거대분자의 분지된 부분을 보호기 또는 리간드에 결합시키는 분자를 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 링커는 리간드를 덴드론에 부착시킬 수 있는 선택된 분자, 스페이서 분자 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "저밀도(low density)"는 프로브의 개수가 약 0.01 내지 약 0.5 개/nm2, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.2개/nm2, 보다 바람직하게는 약 0.075 내지 약 0.15개/nm2, 가장 바람직하게는 약 0.1개/nm2인 것을 의미한다.
본 명세서에서, "분자 모사체(molecular mimics)" 및 "미메틱스(mimetics)"는, 예컨대 천연, 생물학적 또는 선별된 분자와 같은 다른 분자 또는 분자 그룹의 구조 또는 기능과 동등하거나 유사한 구조 또는 기능을 갖도록 설계, 선택, 제작, 변형 또는 엔지니어링된 천연 또는 합성 뉴클레오타이드 또는 비뉴클레오타이드 분자 또는 분자 그룹을 의미한다. 분자 모사체는 천연, 합성, 선택 또는 생물학적 분자에 대한 대체제, 대안제, 기능향상제, 기능개선제, 구조적 유사체 또는 기능적 유사체로서 작용할 수 있는 분자 또는 다분자 구조체를 포함한다.
본 명세서에서, "프로브 뉴클레오타이드" 또는 "표적 뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하나, 하나의 뉴클레오타이드에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "뉴클레오타이드 유사체(nucleotide analog)"란 핵산 합성 및 가공, 바람직하게는 화학적 합성 및 가공뿐만 아니라 효소적 합성 및 가공에서 자연적으로 존재하는 염기를 대신하여 사용될 수 있는 분자들, 특히 염기쌍을 형성가능한 변형된 뉴클레오타이드, 및 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 또는 소수 염기들을 포함하지 않는 임의로 합성된 염기들을 의미한다. 이러한 용어는 변형된 퓨린 및 피리미딘, 소수 염기, 전환가능한 뉴클레오시드, 퓨린 및 피리미딘의 구조적 유사체, 표지화(labeled), 유도체화 및 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오타이드, 컨주게이티드된 뉴클레오시드 및 뉴클레오타이드, 서열 변형제(modifier), 말단 변형제, 스페이서 변형제, 및 골격이 변형된 뉴클레오타이드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 또한 리보스-변형 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포나미디트, 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포라미디트, 메틸포스포나미디트, 5'-β-시아노에틸 포스포라미디트, 메틸렌포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 펩티드, 핵산, 비광학선택성(achiral) 및 중성 뉴클레오타이드 연결(internucleotidic linkages)과 폴리에틸렌 글리콜, 방향성 폴리아미드 및 지질과 같은 비뉴클레오타이드 연결을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 아미노산 잔기로 구성된 중합체를 의미하는 것으로서 상호 혼용될 수 있다. 이 용어는 자연계에 존재하는 아미노산으로 구성된 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연계에 존재하는 아미노산에 상응하는 인위적으로 합성한 유사체인 경우에도 적용된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드를 만드는 아미노산을 연결하는 전형적인 펩티드 결합에 대한 다양한 변이체를 포함하는 것으로 사용된다.
본 명세서에서, "보호기(protecting group)"란 분자의 반응기(예를 들어, 하이드록실기 또는 아민기)에 결합된 그룹을 의미한다. 상기 보호기란 하나 이상의 화학 반응에서 특정 라디칼의 반응을 억제하기 위해 선택된 것을 의미한다. 일반적으로, 특정 보호기는 분자에 존재하는 다른 반응기의 변화없이 특정 반응기를 회복하기 위해 나중에 제거되도록 하기 위하여 선택되는 것을 의미한다. 보호기의 선택은 보호대상 특정 라디칼의 기능과 그것이 제시될 화합물을 고려하여 이루어진다. 상기 보호기의 선택과 관련된 기술은 예를 들어, Greene등의 Protective Groups in Organic Synthesis[2판, John Wiley & Sons, Inc. Somerset, N.J. (1991)]등에 잘 알려져 있고, 이와 관련된 내용은 본 명세서의 참조로서 포함된다.
본 명세서에서, "보호화된 아민(protected amine)"이란 아미노 보호기와 반응하는 아민을 의미한다. 아미노 보호기는 선형 말단의 관능기가 아미노기인 경우에 분지된 말단이 고체 지지체에 결합되는 동안 아미드 반응이 이루어지는 것을 방지한다. 상기 아미노 보호기는 상기 분자에서 다른 반응기의 변화없이 아미노기를 회복하기 위해 나중에 제거될 수 있다. 예를 들어, 상기 엑소사이클릭아민(exocyclic amine)은 디메틸아미노메틸렌아미노반응을 수행하기 위해 디메틸포름아미드 디에틸아세탈과 반응할 수 있다. 아미노 보호기는 일반적으로 카바메이트(carbamate), 벤질 라디칼(benzyl radical), 이미데이트(imidate) 및 관련 분야의 당업자에게 알려진 다른 것들을 포함한다. 바람직한 아미노 보호기로는 p-니트로페닐에톡시카보닐(p-nitrophenylethoxycarbonyl) 또는 디메틸아미노메틸렌아미노(dimethyaminomethyleneamino)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "규칙적인 간격(regular interval)"이란 상기 분자 크기가 제어된 거대분자의 말단 사이의 스페이스가 규칙적인 것을 의미하며, 이들간의 거리가 실제적인 입체장애(steric hindrance)없이 표적 특이적 리간드와 표적 사이의 반응이 일어나기 위한 스페이스인 약 1 nm 내지 약 100 nm인 것을 의미한다. 따라서, 서브스트레이트상의 거대분자층은 특이적인 분자 반응이 일어날 수 있도록 하기 위하여 지나치게 밀도가 높아서는 안된다.
본 명세서에서, "고체 지지체(solid support)"는 불용성 물질, 고상, 표면, 서브스트레이트, 층, 코팅(coating), 직물 또는 부직포, 매트릭스, 결정, 막(membrane), 불용성 중합체, 플라스틱, 유리, 생물학적 또는 생물 양립성(biocompatible) 또는 생물 부식성(bioerodible) 또는 생분해성 중합체 또는 메트릭스, 마이크로파티클(microparticle) 또는 나노파티클(nanoparticle)과 같은 고정된 메트릭스로 이루어진 구조를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 고체 지지체는 예를 들어, 단일층(monolayers), 이중층(bilayers), 통상의 막(commercial membranes), 수지(resins), 매트릭스, 섬유, 분리매질(separation media), 크로마토그래피 지지체(chromatography support), 중합체, 플라스틱, 유리, 운모, 금, 비드, 마이크로스피어, 나노스피어, 실리콘, 갈륨 비화물, 유기 및 무기금속, 반도체, 절연제, 마이크로 구조 및 나노 구조를 포함하나, 이제 제한되는 것은 아니다. 마이크로 구조 및 나노 구조는 초소형화이고 나노미터 규모이며 초분자 크기의 프로브, 팁(tip), 바(bar), 쐐기, 마개, 막대(rod), 슬리브(sleeve), 선(wire), 필라멘트 및 튜브를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "스페이서 분자"란 두 뉴클레오타이드간 또는 뉴클레오타이드와 비뉴클레오타이드가 결합할 수 있도록 선택되거나 고안된, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 비뉴클레오타이드 분자, 기능기, 또는 스페이서 가지(arm)를 의미하며, 바람직하게는 뉴클레오타이드간 또는 뉴클레오타이드와 비튜클레오티드간의 거리를 변화 또는 조정할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "특이적 결합"이란 리간드 및 이의 특이적 결합 파트너 사이, 또는 정의된 서열 단편 및 선택된 분자 또는 선택된 핵산 서열 사이에 측정가능하고 재현성있는 정도의 인력을 의미한다. 상기 인력의 정도는 최대일 필요는 없다. 약한, 중간, 또는 강한 인력이 여러 가지 적용에 적합할 수 있다. 이러한 상호작용에서 일어나는 특이적 결합은 관련분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 정의된 합성 서열 단편은 합성 앱타머, 합성 헤테로중합체, 뉴클레오타이드 리간드, 뉴클레오타이드 수용체, 형상 인식 요소, 및 특이적으로 결합하는 표면일 수 있다.
상기 "특이적 결합"은 구조적 형상 및 표면 특징을 특이적으로 인지하는 것을 포함한다. 한편, 특이적 결합은 화학적 동일성(identity)(즉, 하나 이상의 동일한 화학적 그룹) 또는 특이적 결합 파트너를 갖는 분자적 인식능(즉, 분자적 결합 특이성)을 공유하는 제3의 분자(즉, 경쟁자)에 의해 경쟁적으로 저해될 수 있는 두 분자간(즉, 특이적 결합 파트너)의 특이적, 포화가능한(saturable), 비공유적 상호작용을 명백히 의미한다. 상기 경쟁자는 예를 들어 교차반응물(cross reactant), 항체 또는 이의 항원 유사체, 리간드 또는 이의 수용체, 또는 앱타머 또는 이의 표적일 수 있다. 예를 들어, 항원-항체간의 특이적 결합은 교차반응하는 항체 또는 항원에 의해서 경쟁적으로 저해될 수 있다. 상기 "특이적 결합"이란 특이적 결합과 구조적 형상 인지를 모두 포함하는 특이적 인지의 부분으로서 약자로 또는 근접한 의미로 편의상 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "서브스트레이트"란 물질(substance), 구조, 표면 또는 재료(material)로 사용되는 것으로서, 비생물학적, 합성적, 살아있지 않은(nonliving), 평편적, 구형의 또는 편평한 표면을 포함하는 조성물으로서, 표면, 구조, 또는 재료를 포함하는 다양한 분자종을 초과하는 다수의 인지 부위, 특이적 결합, 혼성화 또는 촉매적 인지 부위 또는 다수의 다양한 인지 부위를 포함한다. 상기 서브스트레이트는 예를 들어, 반도체, 합성(유기)금속, 합성 반도체, 절연제, 도판트(dopant); 금속, 합금, 원소, 화합물, 미네랄; 합성, 절단, 에칭, 리쏘그래피, 인쇄, 기계화되거나, 미세하게 제작된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적 중합체, 플라스틱, 막(membrane), 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속과 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 모, 옷, 직물 또는 부직포, 재료(material), 파브릭; 분지된/선형 중합체를 이용하여 프로브 분자의 고정에 의해 변형되지 않은 나노 구조 또는 마이크로 구조를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "표적-프로브 결합(target-probe binding)"은 적어도 하나의 선택된 분자가 특이적 방식으로 다른 하나에 결합된 둘 이상 분자를 의미한다. 일반적으로, 첫 번째 선택된 분자는 두 번째 선택된 분자와 간접적으로 즉 예를 들어, 스페이서 가지(arm), 그룹, 분자, 브릿지, 운반체, 또는 특이적 인지 파트너의 개입을 통하여, 또는 직접적으로 예를 들어, 스페이서 가지, 그룹, 분자, 브릿지, 운반체, 또는 특이적 인지 파트너 없이 결합할 수 있다. 하나의 선택된 분자는 혼성화를 통해 뉴클레오타이드와 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 비공유적 결합은 뉴클레오타이드 및 비뉴클레오타이드 분자의 접합을 의미하며, 예를 들면, 이온결합, 소수성 상호작용, 리간드-뉴클레오타이드 결합, 킬레이팅제/금속 이온 쌍 또는 특이적 결합 쌍, 예컨대 아비딘/바이오틴, 스트렙타비딘/바이오틴, 안티-플루오레세인/플루오레세인, 안티-2,4-디니트로페놀(anti-2,4-dinitrophenol)/디니트로페놀(DNP), 항-퍼옥시데이즈(anti-peroxidase)/퍼옥시데이즈, 항-디곡시제닌(anti-digoxigenin)/디곡시제닌 또는 더욱 일반적으로 수용체/리간드간의 결합을 포함한다. 예를 들어, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase), 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), β-갈락토시다아제, 우레아제(urease), 루시퍼라제(luciferase), 로다민(rhodamine), 플루오레세인 (fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 루미놀, 이소루미놀, 아크리디니윰 에스테르 또는 예를 들어, 표지하기 위한 목적으로 사용된 형광 마이크로스피어 등의 리포터 분자가 선택된 분자 또는 선택된 핵산 서열에 아비딘/비오틴(avidin/biotin), 스트렙타비딘/비오틴(streptavidin/biotin), 안티-플루오세인/플루오세인, 안티-퍼옥시데이즈(peroxidase)/퍼옥시데이즈 항-2,4-디니트로페놀(anti-2,4-dinitrophenol)/디니트로페놀(DNP), 항-디곡시제닌(anti-digoxigenin)/디곡시제닌 또는 수용체/리간드간의 결합을 통해(즉, 직접적 및 공유 결합을 통해) 선택된 분자 또는 선택된 핵산 서열에 특이적 결합 쌍을 통해 접합할 수도 있다.
본 발명은 고정 말단과 비고정 말단을 가진 캔틸레버 본체, 덴드론의 분지된 부위에 있는 다수의 말단과 결합하고 덴드론에 의해 화학적으로 변형된 표면 부위를 가진 비고정 말단, 및 관능기화된 덴드론의 선형 부위의 말단을 포함하는 원자현미경(ATM)용 캔틸레버를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 적어도 하나의 가느다란 돌출부가 캔틸레버의 비고정 말단 근처에 위치하게 되며, 상기 돌출부는 피라미드형 또는 원추형이다. 상기 프로브 말단(tip)의 많은 유사 구조체를 도 2c에 나타내었다. 따라서, 상기 캔틸레버의 비고정 말단의 표면 부위는 상기 화합물 분자간의 상호작용 및 이를 측정할 수 있도록 특별한 돌출부와 접촉하거나 인접되도록 유도할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 AFM의 캔틸레버는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 도 1b 및 도 1c에서와 같은 모든 타입의 AFM 장치를 사용할 수 있다. 도 1a는 일반적인 원자현미경을 예로 나타내 것이고, 도 2a는 AFM의 캔틸레버를 나타낸 것이다. 본 발명의 AFM은 도 1a를 참조하여 설명될 수 있다. AFM 시스템은 염기(15), 염기(15)에 고정된 중앙 위치에 개구부를 가진 기판(20), 및 염기(15)에 고정된 튜브 형상 압전 작동장치(55)를 포함한다. 상기 튜브 형상 압전 작동장치(55)는 즉, 배선 라인을 통해 컨트롤러 CO로부터 압전 작동장치에 전압을 제공하여 캔틸레버의 두께의 방향을 화살표 V2로 표시된 수직 방향에서 편향 가능하다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 상기 캔틸레버(50)는 압전 작동장치(55)가 서브스트레이트(95)의 한쪽 면에 형성되는 구조를 가지고 있다. 캔틸레버의 구체예에 있어서, 상기 캔틸레버(50)는 직사각형의 서브스트레이트(95)상에 얇은 판으로 씌워진 절연층(110)위에 형성된 전극(10)을 가지고 있다. 상기 캔틸레버는 Si, SiO2, Si3N4, Si3N4Ox, Al, 또는 압전 물질을 포함하는, AFM 캔틸레버와 관련된 분야에서 잘 알려져 있는 임의의 소재로 구성될 수 있다. 상기 캔틸레버의 화학적 조성은 중요하지는 않으나, 바람직하게는 쉽게 소형으로 조립될 수 있고 AFM 측정에 필요한 기계적 성질을 가진 소재를 이용할 수 있다. 또한, 상기 캔틸레버는 AFM 캔틸레버와 관련된 분야에서 잘 알려져 있는 임의의 크기 및 형태를 갖는 것일 수 있다. 상기 캔틸레버의 크기는 바람직하게 그 길이가 약 5 마이크론 내지 약 1000 마이크론일 수 있고, 그 폭이 약 1 마이크론 내지 약 100 마이크론일 수 있고, 그 두께가 약 0.04 마이크론 내지 약 5 마이크론일 수 있다. 일반적인 AFM 캔틸레버는 그 길이가 약 100 마이크론이고, 그 폭이 약 20 마이크론이고, 그 두께가 약 0.3 마이크론이다. 상기 캔틸레버의 고정 말단은 캔틸레버가 기존의 AFM의 캔틸레버-접힘 부분에 적합하거나 조화될 수 있도록 조절될 수 있다. 상기 캔틸레버의 비고정 말단의 표면 부위는 덴드론 예를 들어, GPDES 또는 TPU와 같은 실란제(siliane agents)를 처리하기 위해 변형될 수 있다.
본 발명의 장치 및 방법은 캔틸레버에 기초한 AFM 도구로 사용하는데 특별히 제한되어 있는 것은 아니다.
화학식 1에 기재된 중합체는 새로운 중합체를 설명하기 위해 언급될 수 있다.
다양한 R, T, W, L, 및 X기의 변이체들을 화학식 1에 나타내었다. 상기 중합체는 분지되거나 고도로 분지되거나, 또는 대칭이거나 비대칭인 중합체를 포함한다. 상기 중합체의 분지된 말단은 바람직하게는 서브스트레이트의 다수의 말단에 결합할 수 있다. 상기 중합체의 선형 말단은 보호기 또는 표적 리간드에 결합할 수 있는 관능기를 가진 말단이다. 상기 서브스트레이트상에 있는 다수의 중합체중 프로브간의 거리는 약 0.1 nm 내지 약 100 nm일 수 있으며, 바람직하게는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 더욱 바람직하게는 약 2 nm 내지 약 70 nm, 더 더욱 바람직하게는 약 2 nm 내지 약 60 nm, 가장 바람직하게는 약 2 nm 내지 약 50 nm일 수 있다.
R-작용기
식 I에서, 상기 중합체는 일반적으로 분지된 영역(section)을 포함하며, 다수의 말단이 관능기화되어 서브스트레이트에 결합한다. 상기 분지된 영역 내에서, 분지의 제1세대 작용기 Rx (R1, R2, R3)는 관능기 W에 의하여 분지의 제2세대 작용기 Rxx (R11, R12, R13, R21, R22, R23, R31, R32, R33)와 연결되어 있다. 상기 분지의 제2세대 작용기는 관능기 W에 의하여 분지의 제3세대 작용기 Rxxx (R111, R112, R113, R121, R122, R123, R131, R132, R133, R211, R212, R213, R221, R222, R223, R231, R232, R233, R311, R312, R313, R321, R322, R323, R331, R332, R333)와 연결되어 있다. 그리고, 추가적인 제4세대가 동일한 방식으로 분지의 제3세대 작용기에 연결될 수 있다. 말단의 R 작용기는 서브스트레이트에 결합할 수 있도록 관능기화되어 있다.
모든 세대의 R 작용기는 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 통상적으로, R 작용기는 반복단위, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 에테르, 폴리에테르, 에스테르, 아미노알킬 등과 같은 선형 또는 분지형 유기 모이어티(organic moiety)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 모든 R 작용기가 동일한 반복단위이거나, R 작용기의 모든 원자가 위치(valence position)가 반복단위로 채워질 필요는 없다. 예컨대, 제1세대 분지 Rx, R1, R2, R3 에 있어서, 상기 분지 수준에서의 모든 R 작용기는 동일한 반복단위일 수 있다. 또는, R1 작용기는 반복단위이고, R2와 R3는 H 또는 다른 모든 화학 작용기(chemical entity)일 수 있다. 또는, R2 는 반복단위이고, R1과 R3는 H 또는 다른 모든 화학 작용기일 수 있다. 이와 유사하게, 제2세대 및 제3세대 분지의 경우, R 작용기는 반복단위, H 또는 다른 모든 화학 작용기일 수 있다.
따라서, 이러한 방식으로 다양한 모양의 중합체를 제작할 수 있다. 예컨대, R1, R11, R111, R112 및 R113이 동일한 반복단위이고, 다른 모든 R 작용기가 H' 또는 다른 많은 중성 분자 또는 원자인 경우에는, R111, R112 및 R113에 대한 세 개의 관능기 말단(termini)을 갖는 분지를 가진 상당히 길고 얇은 중합체가 만들어진다. 다양한 임의의 다른 화학적 배열이 가능하다. 따라서, 서브스트레이트에 결합 가능한 관능기를 갖는 약 3 내지 약 81 개의 말단을 얻을 수 있다. 바람직한 말단의 개수는 약 3개 내지 약 75개, 약 3개 내지 약 70개, 약 3개 내지 약 65개, 약 3개 내지 약 60개, 약 3개 내지 약 55개, 약 3개 내지 약 50개, 약 3개 내지 약 45개, 약 3개 내지 약 40개, 약 3개 내지 약 35개, 약 3개 내지 약 30개, 약 3개 내지 약 27개, 약 3개 내지 약 25개, 약 3개 내지 약 21개, 약 3개 내지 약 18개, 약 3개 내지 약 15개, 약 3개 내지 약 12개, 약 3개 내지 약 9개 또는 약 3개 내지 약 6개일 수 있다.
T-
말단기
말단기 T는 첨가 반응 또는 치환 반응이 일어나도록 하기에 충분히 반응성 있는 관능기이다. 이러한 관능기의 예로는 아미노, 하이드록실, 머캅토, 카르복실, 알케닐, 알릴, 비닐, 아미도, 할로, 우레아, 옥시라닐, 아지리디닐, 옥사졸리닐, 이미다졸리닐, 설포네이트, 포스포네이토, 이소시아네이토, 이소티오시아네이토, 실라닐, 및 할로게닐을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
W-
관능기
식 I에서, W는 중합체를 다른 것(또는 다른 모든 2가의 유기 모이어티)에 연결시킬 수 있는 모든 관능기일 수 있으며, 에테르, 에스테르, 아미드, 케톤, 우레아, 우레탄, 이미드, 카르보네이트, 카르복실산 무수물, 카르보디이미드, 이민, 아조기, 아미딘, 티오카르보닐, 유기 설파이드, 디설파이드, 폴리설파이드, 유기 설폭사이드, 설파이트, 유기 설폰, 설폰아미드, 설포네이트, 유기 설페이트, 아민, 유기 포스포러스기, 알킬렌, 알킬렌옥사이드, 알킬렌아민을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
L-
스페이서
또는 링커
화학식 I에서, 상기 중합체의 선형 부분은 임의로 작용기가 산재된 링커 부위를 포함하는 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 링커 부위는 다양한 중합체로 구성될 수 있다. 링커의 길이는 다양한 인자들에 의하여 결정될 수 있으며, 이러한 인자들로는 서브스트레이트에 결합하는 분지된 관능기의 수, 서브스트레이트와의 결합 길이, 사용된 R 작용기의 형태, 특히, 사용된 반복단위 형태, 중합체의 선형 부위의 끝에 부착될 표적 리간드 또는 보호기의 형태 등이 있다. 따라서, 상기 링커는 특정 유형의 중합체 또는 특정 길이로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 그러나, 일반적인 기준으로서, 링커의 길이는 약 0.5 nm 내지 약 20 nm일 수 있으며, 바람직하게는 약 0.5 nm 내지 약 10 nm, 가장 바람직하게는 약 0.5 nm 내지 약 5 nm일 수 있다.
상기 링커의 화학적 구조체는 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 에테르, 폴리에테르, 에스테르, 아미노알킬, 폴리알케닐글리콜 등과 같은 선형 또는 분지형 유기 모이어티를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 링커는 상기한 바와 같은 관능기를 추가로 포함할 수 있고, 어떤 특정 구조에 제한되지 않는다. 말단(tip)에서 관능기화된 상기 링커는 보호기를 포함할 수 있다.
X-보호기
보호기의 선택은 바람직한 산-반응성 또는 염기-반응성과 같은 다수의 인자에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명은 작용기가 다른 화학 관능기와 반응하는 것을 방지하는 기능을 제공하고, 원하는 특정 조건 하에서 제거될 수 있는 한, 어떠한 특정 보호기에도 한정되지 않는다. 상업적으로 입수 가능한 보호기의 목록은 Sigma-Aldrich (2003) 카탈로그에서 찾을 수 있고, 그 내용은 보호기의 기재와 관련되어 있기 때문에 전체가 본 명세서에 포함된다.
상기 중합체는 연속 조작 또는 단일 조작으로 탈보호시킬 수 있다. 상기 폴리펩티드의 제거 및 탈보호는 서브스트레이트 결합 폴리펩티드를 절단 시약(cleavage reagent)으로 처리함으로써 단일 조작으로 수행할 수 있으며, 상기 절단 시약으로는 예컨대 티아니졸(thianisole), 물, 에탄디티올 및 트리플루오로아세트산 등을 사용할 수 있다.일반적으로, 본 발명의 일 측면에서, 본 발명에 사용된 보호기는 연속하는 하나 이상의 아미노산 또는 적절하게 보호된 아미노산을 성장중인 펩타이드 사슬에 첨가하여 사용되는 것일 수 있다. 일반적으로, 제1 아미노산의 아미노기 또는 카르복실기는 적절한 보호기에 의하여 보호된 것이다.
특히 바람직한 방법에 있어서, 상기 아미노 관능기는 산 민감기 또는 염기 민감기에 의하여 보호된 것이다. 이러한 보호기들은 연결 형성 조건에 적합하면서, 성장중인 분지형/선형 중합체의 파괴 없이 용이하게 제거될 수 있는 특성을 가져야 한다. 이와 같은 적절한 보호기들에는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc), t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시카르보닐 (Cbz), 비페닐이소프로필-옥시카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 이소보닐옥시카르보닐, (a, a-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐, o-니트로페닐설페닐, 2-시아노-t-부틸옥시카르보닐 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히 바람직한 보호기의 예로는 또한 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐 (pmc), p-톨루엔설포닐, 4-메톡시벤젠설포닐, 아다만틸옥시카르보닐, 벤질, o-브로모벤질옥시카르보닐, 2,6-디클로로벤질, 이소프로필, t-부틸 (t-Bu), 시클로헥실, 시클로페닐 및 아세틸 (Ac), 1-부틸, 벤질 및 테트라하이드로피라닐, 벤질, p-톨루엔설포닐 및 2,4-디니트로페닐 등을 포함한다.
추가적인 방법에 있어서, 선형/분지형 중합체의 분지 말단을 적절한 고체 지지체에 부착시킨다. 상기 합성에 사용 가능한 적절한 고체 지지체는 사용되는 배지에서 불용성일 뿐 아니라, 순차적인 축합-탈보호 반응의 조건 및 시약에 불활성인 물질들이다.
분지형/선형 중합체의 선형 말단부분으로부터의 Fmoc와 같은 보호기의 제거는 이차 아민, 바람직하게는 피페리딘으로 처리하여 수행할 수 있다. 상기 보호된 부분을 약 3배 과량의 몰수로 도입시킬 수 있고, DMF 내에서 결합을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 결합제는 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트 (HBTU, 1 당량) 및 1-하이드록시-벤조트리아졸 (HOBT, 1 당량)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 중합체는 연속 조작 또는 단일 조작으로 탈보호시킬 수 있다. 상기 폴리펩티드의 제거 및 탈보호는 서브스트레이트 결합 폴리펩티드를 절단 시약(cleavage reagent)으로 처리함으로써 단일 조작으로 수행할 수 있으며, 상기 절단 시약으로는 예컨대 티아니졸(thianisole), 물, 에탄디티올 및 트리플루오로아세트산 등을 사용할 수 있다.
상기 서브스트레이트는 상기 분지형/선형 중합체가 공유결합 또는 이온결합에 의하여 결합할 수 있는 모든 고체 표면을 의미하는 것일 수 있다. 상기 서브스트레이트는 상기 분지형/선형 중합체의 분지된 말단 사이에 결합이 일어날 수 있도록 관능기화된 것일 수 있다. 상기 서브스트레이트의 표면은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자의 필요에 따라서 다양한 표면을 가질 수 있다. 상기 서브스트레이트는 유리 슬라이드인 것이 바람직하다. 서브스트레이트의 다른 예로는 니트로셀룰로오스 또는 나일론과 같은 맴브레인 필터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서브스트레이트는 친수성 또는 극성인 것일 수 있으며, 코팅 전 또는 후에 음전하 또는 양전하를 띠는 것일 수 있다.
덴드론의 형태 및 이의 제조 방법은 WO2005/026191에 구체적으로 기재되어 있으며, 이러한 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
반응체계(Reaction scheme) 1은 덴드론의 합성을 보여주는 도면이다. 다양한 출발 물질, 중간체 화합물 및 덴드론 화합물들이 사용될 수 있으며, 도면 중 "X"는 안트라센메틸 (A), Boc, Fmoc, Ns와 같은 모든 보호기일 수 있다.
반응체계 1
분지 말단에 표면 반응성 관능기를 갖는 제2세대 분지 덴드론을 사용할 수 있으며, 이는 자가 조립 가능하고, 이들 간 적절한 스페이스를 제공한다. 지금까지의 연구는 유리 서브스트레이트상의 양이온과 덴드론 말단의 음이온 카르복실레이트간의 다중 이온 결합 (multiple ionic attraction)에 의하여 양호한 거동의(well-behaved) 단일층을 성공적으로 생성하고, 리간드 간 간격을 24 Å이상으로 확보할 수 있음을 보여주었다 (Hong et al., Langmuir 19, 2357-2365 (2003)). 탈보호를 용이하게 하고, 탈보호된 끝부분 아민의 반응성을 증진시키기 위하여, 본 발명자들은 상기 구조를 변형시켰다. 또한, 본 발명자들은 덴드론의 카르복실산기와 표면의 하이드록실기간의 공유결합 형성이 이온결합처럼 효과적이고, 또한 말단 안정성을 증진시킴을 관찰하였다. 더욱이, 올리고에테르 층간(oligoetheral interlayer)이 비특이적 올리고뉴클레오타이드 결합을 억제하는데 효과적이었다.
기존에 보고된 방법을 이용하여 하이드록실화된 표면을 제작하였다 (Maskis et al., Nucleic Acid Res. 20, 1679-1684 (1992)). 산화된 실리콘 웨이퍼, 융합 실리카 및 유리 슬라이드를 포함하는 서브스트레이트를 (3-글리시드옥시프로필) 메틸디에톡시실란 (GPDES) 및 에틸렌 글리콜 (EG)로 변형시켰다. 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)의 존재하에 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 또는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)을 사용하여 덴드론의 카르복실산기와 서브스트레이트의 히드록실기간의 결합 반응시킴으로써 상기 덴드론을 상기 서브스트레이트에 도입하였다 (Boden et al., J. Org. Chem. 50, 2394-2395 (1985); Dhaon et al., J. Org. Chem. 47, 1962-1965 (1982)). 덴드론 도입 후 두께의 증가치는 11±2Å이었으며, 이는 이온결합에서 관찰된 기존의 값에 필적하는 값이다 (Hong et al., Langmuir 19, 2357-2365 (2003)).
기존에 확립된 방법 (Beier et al., Nucleic Acids Res. 27, 1970-1977 (1999))에 따라 디(N-숙신이미딜) 카르보네이트 (DSC)를 사용하여 변형시킨 후, Microsys 5100 Microarrayer (Cartesian Technologies, Inc.)를 사용하여 클래스 10,000 클린룸에 적절한 아민-결합된 (amine-tethered) 올리고뉴클레오타이드 (20 μM)의 50 mM 소듐 비카르보네이트 버퍼 (10% 디메틸설폭사이드 (DMSO), pH 8.5) 용액을 스포팅함으로써 프로브 올리고뉴클레오타이드를 활성화된 유리 슬라이드 표면에 고정시켰다. 통상적으로, 반응성 아민기 표면을 갖는 서브스트레이트에, 티올-결합된(tethered) 올리고뉴클레오타이드, 및 숙신이미딜 4-말레이미도 부티레이트 (SMB) 또는 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SSMCC)와 같은 이형의 양작용성(heterobifunctional) 링커를 사용한다 (Oh et al., Langmuir 18, 1764-1769 (2002); Frutos et al., Langmuir 16, 2192-2197 (2000)). 이와 대조적으로, 덴드론-변형된 표면에 의하여 아민 관능기간의 소정의 거리가 확보되기 때문에, DSC와 같은 동형의 양작용성 (homobifunctional) 링커를 사용해도 큰 문제는 없다. 결과적으로, 아민-결합된(tethered) 올리고뉴클레오타이드가 스포팅에 사용될 수 있다. 비용 효율성은 별문제로 하고, 티올-결합된(tethered) 올리고뉴클레오타이드가 특정 조건하에서 유용할 수 있지만, 쉽게 산화되는 티올-결합된 올리고뉴클레오타이드의 사용을 회피할 수 있다.
단일 분자상의 상보적인 DNA 이중가닥간의 인지 효율을 향상시키기 위하여, DNA 올리고머를 나노크기-조절된 덴드론 표면상에 고정시켰다. 상기 표면은 덴드론내의 공간조절(mesospacing)을 이용하여 입체 장애로부터 상기 고정된 DNA를 경감시키기 때문에 인지 효율을 증가시킬 수 있다고 보았다 (B. J. Hong, S. J. Oh, T. O. Youn, S. H. Kwon, J. W. Park, Langmuir 21, 4257, 2005). (3-글리시드옥시프로필) 메틸디에톡시실란 (GPDES) 또는 N-(3-(트리에톡시실릴)프로필)-O-폴리에틸렌옥사이드 우레탄 (또는 TPU)을 하위층을 생성하는데 사용하였고, 덴드론 (9-안트릴메틸 N-({[트리스({2-[({트리스[(2-카르복시에톡시)메틸]메틸}아미노)카르보닐]에톡시}메틸)메틸]아미노}카르보닐)프로필카보네이트) (또는 9-산)을 상기 하위층에 고정시켰다. 기존에 보고된 바와 같이, GPDES-변형된 표면간의 공간조절은 평균 32Å이었다 (B. J. Hong, S. J. Oh, T. O. Youn, S. H. Kwon, J. W. Park, Langmuir 21, 4257, 2005). TPU의 경우에 있어서, 초기 덴드론의 안드라센 부분으로부터 기인된 257 nm에서 관찰된 흡수 피크는 GPDES 경우의 것과 비교했을 때 1/2 수준이다. 따라서, TPU의 경우 덴드론의 스페이스는 32Å보다 크다고 볼 수 있다. 안드라센 보호기를 탈보호시킨 후, 아민기를 디(N-숙시니미딜)카르보네이트를 이용하여 활성화시켰고, 경우에 따라서는 아미 결합 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 고정시켰다.
스페이스의 효능을 이해하기 위하여, 상기 서브스트레이트에 변형된 2가지 형태를 사용하였고, 반면 AFM 말단상의 스페이스를 9-산/TPU으로 고정시켰다. 스프링 상수의 측정값은 통상적으로 10-20%의 오차를 보이므로, 힘은 동일한 말단을 사용하여 다양한 조건에서 측정되었다 (도 3). 예를 들어, 힘 곡선은 110 nm/s 내지 540 nm/s 사이에서 다양한 비율로 적재한 9-산/GPDES 서브스트레이트상에 고정된 상보적인 30-염기 DNA에서 얻어졌다 (표 1). 완전히 일치된 및 내재적으로 불일치된 올리고머 서열을 표 1에 나타내었고, 이때 밑줄친 부분은 불일치된 부위를 나타낸다.
덴드론-조절된 중앙 스페이스(meso space)을 가진 고체 서브스트레이트는 단일분자상의 거리가 유지된 체 존재하므로, 약물 스크리닝, 단백질-단백질 반응 및 단백질-저분자 반응을 조사하기 위해서는 효과적이며 폭넓은 연구가 적용되어야 한다. Bio-AFM은 분자의 손상을 최소화할 수 있으므로 고도로 정확한 측정이 가능하다. 본 발명은 조절된 중앙 스페이스 구조를 가진 고체 서브스트레이트 덴드론의 표면상에 고정된 생체분자간의 스페이스를 유지한다. 단일분자간의 결합을 관찰하기 위한 임의의 조건을 제공함으로써, 원치 않는 입체장애를 최소화한다. 상기 생체분자란 단백질, 항원, 항체, 신호전달 단백질, 펩타이드, 완전한 막 단백질, 저분자, 스테로이드, 당, DNA, 및 RAN 등과 같은 서브스트레이트를 포함하는 용어이다.
특히, 실시예 8과 9, 및 실시예 11과 15에 따르면, 본 발명은 특이적인 결합을 형성하는 PLDI-PX와 Munc-18-1 사이에서 동일한 힘을 초래한다. 본 발명은 Bio-AFM을 이용하여 결합력을 측정함으로써, 이를 약물 스크리닝에 적용할 수 있다. 상기 조건의 변화에 따른 생체분자간의 결합력의 변화를 관찰함으로써, 원인과 효과 관계를 통해 생물학적 조성물의 선택에 의해 초래되는 것으로 여겨지는 질병들에 대한 다양한 어레이(array)를 보다 명확하게 구축할 수 있다. 게다가, 본 발명의 덴드론을 이용하여 바이오틴 분자간의 스페이스를 조절함으로써 하나의 바이오틴과 스트렙타비딘간의 결합력을 측정할 수 있다. 본 발명에 적용 가능한 덴드론의 형태는 미국특허출원번호 10/917,601 및 WO2005/026191에 보다 자세하게 기재되어 있고, 이와 관련된 내용은 본 명세서의 참조로서 포함된다.
후술하는 실시예에서와 같이, 본 발명은 중앙 스페이스를 조작할 수 있는 덴드론의 도움으로 AFM 말단(tip)상의 리간드를 고정시켜 리간드 분자간의 충분한 스페이스를 유지한다. 이는 리간드와 수용체간의 비특이적 입체장애 및 정적결합을 최소화하고, 결합의 최적 조건을 제공하기 위함이다. 이러한 조건은 또한 다중결합을 최소화하므로, 따라서 단일분자 단위의 리간드-수용체 결합을 밀접하게 관찰할 수 있도록 해준다.
본 발명은 특이적 리간드 (즉, 세포 표면 수용체와 특이적으로 결합을 형성하는 것)에 적재된 AFM 말단(tip)을 도입하여 조절된 중앙 스페이스 구조의 표면을 이용함으로써, 리간드간의 스페이스를 유지하고, 이로부터 수용체 분포를 정확히 맵핑할 수 있게 해준다. 그러나, 중앙 스페이스가 조절되지 않은 AFM 말단을 이용할 경우, 리간드 분포가 고르지 않게 되고, 수용체와의 다중결합이 맵핑 정확도를 감소시킨다. 따라서, 본 발명은 리간드-수용체의 상호작용을 연구하는데 매우 유용하다.
세포 수용체는 저분자, 펩타이드, 단백질, 스테로이드 호르몬 수용체, 탄수화물, 지질, 막 단백질, 당단백질, 당지질, 렉틴, 뉴로트로핀 수용체, DNA, 및 RNA 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 세포 표면에 존재하는 모든 서브스트레이트 및 AFM 말단 표면상에 고정된 리간드와 결합할 수 있는 모든 서브스트레이트는 수용체로서 사용 가능하다.
또한, 상기 AFM 말단상에 고정된 리간드 형태는 저분자, 펩타이드, 단백질, 스테로이드, 탄수화물, 지질, 막 단백질, 뉴로트로핀, 항체, DNA, RNA, 및 복합 화합물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, AFM 말단상에 적재될 수 있는 모든 서브스트레이트 및 수용체와 결합하여 관찰될 수 있는 모든 서브스트레이트는 리간드로서 사용 가능하다.
본 발명의 실시예 11 내지 15, 및 도 16 내지 18은 펩타이드-단백질 결합, 탄수화물-당지질 결합, 렉틴-당단백질 결합, 탄수화물-당단백질 결합, 및 뉴로트로핀-뉴로트로핀 수용체 결합을 나타낸 것이다.
하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것을 뿐 본 발명을 이에 한정하는 것은 아니다.
도 1a는 bio-AFM를 모식화한 것이고, 도 1b 및 1c는 bio-AFM의 사진을 나타낸 것이다.
도 2a는 AFM의 캔틸레버를 모식화한 것이고, 도 2b는 본 발명의 실시예에 따른 AFM 캔틸레버의 말단의 개략도를 나타낸 것이고, 도 2c는 프로브 말단(tip)의 다양한 유사 구조체를 나타낸 것이다.
도 3은 AFM 방법론으로 결합력 및 비결합력을 측정하기 위하여 AFM의 프로브 말단과 서브스트레이트 표적간의 접점을 모식화한 것이다.
도 4a는 110 nm/s의 수축 속도(retraction velocity)에서 상대적으로 좁은 스페이스를 가진 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 힘 분포를 나타낸 막대 그래프이고, 도 4b 및 도 4c는 540 nm/s의 수축 속도에서 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 단일 비결합력을 직접 측정한 것이다.
도 5a는 110 nm/s의 수축 속도에서 상대적으로 넓은 스페이스를 가진 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 힘 분포를 나타낸 막대 그래프이고, 도 5b 및 도 5c는 110 nm/s의 수축 속도에서 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 비결합력을 측정한 것이다.
도 6a 및 도 6b는 상보적인 DNA 이중 가닥에서의 결합력 분포를 나타낸 막대 그래프이고, 도 6c는 상보적인 DNA 이중 가닥에서의 비결합력 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 7은 단일 염기가 잘못 연결된 DNA 이중 가닥의 결합력 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 8은 이중 염기가 잘못 연결된 DNA 이중 가닥의 결합력 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 9는 AFM의 캔틸레버 및 AFM 캔틸레버의 말단을 확대하여 모식화한 것이다.
도 10a는 충분한 스페이스를 가진 리간드로 연결된 덴드론에 의해 변형된 AFM 말단을 모식화한 것이다.
도 10b는 인접된 리간드로 연결된 AFM 말단을 모식화한 것이다.
도 11a는 덴드론에 의해 변형된 AFM 말단상에 있는 단백질을 고정하는 방법을 모식화한 것이다.
도 11b는 덴드론에 의해 변형된 서브스트레이트상에 있는 단백질을 고정하는 방법을 모식화한 것이다.
도 12는 AFM을 이용한 힘 측정 방법을 모식화한 것이다.
도 13a는 블로킹 단백질과 AFM을 이용한 힘 측정을 나타낸 모식도이다.
도 13b는 경쟁 단백질과 AFM을 이용한 힘 측정을 나타낸 모식도이다.
도 14a는 Munc-18-1 및 PLDI-PX의 결합에 대한 힘 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 14b는 용액내에 비고정 Munc-18-1의 초과량을 첨가한 후 Munc-18-1 및 PLDI-PX의 결합에 대한 힘 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 15는 경쟁 단백질인 PLC-의 농도에 따른 힘의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 16a는 리간드-코팅된 AFM 말단을 이용하여 세포상에 있는 수용체를 스크리닝하는 방법을 모식화한 것이다.
도 16b-16d는 FPRI 및 이의 결합 펩타이드간의 결합에 대한 힘의 곡선을 나타낸 것이다.
도 17a-17b는 세포의 각기 다른 부위에 있는 FPRI 및 이의 결합 펩타이드간의 결합에 대한 힘의 맵(map) 및 막대 그래프를 나타낸 것이다.
도 18은 비고정 WKYMVm (SEQ ID NO: 17)으로 블로킹하기 전과 후의 FPRI 및 이의 결합 펩타이드간의 결합에 대한 힘의 맵(map) 및 막대 그래프를 나타낸 것이다.
도 2a는 AFM의 캔틸레버를 모식화한 것이고, 도 2b는 본 발명의 실시예에 따른 AFM 캔틸레버의 말단의 개략도를 나타낸 것이고, 도 2c는 프로브 말단(tip)의 다양한 유사 구조체를 나타낸 것이다.
도 3은 AFM 방법론으로 결합력 및 비결합력을 측정하기 위하여 AFM의 프로브 말단과 서브스트레이트 표적간의 접점을 모식화한 것이다.
도 4a는 110 nm/s의 수축 속도(retraction velocity)에서 상대적으로 좁은 스페이스를 가진 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 힘 분포를 나타낸 막대 그래프이고, 도 4b 및 도 4c는 540 nm/s의 수축 속도에서 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 단일 비결합력을 직접 측정한 것이다.
도 5a는 110 nm/s의 수축 속도에서 상대적으로 넓은 스페이스를 가진 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 힘 분포를 나타낸 막대 그래프이고, 도 5b 및 도 5c는 110 nm/s의 수축 속도에서 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 비결합력을 측정한 것이다.
도 6a 및 도 6b는 상보적인 DNA 이중 가닥에서의 결합력 분포를 나타낸 막대 그래프이고, 도 6c는 상보적인 DNA 이중 가닥에서의 비결합력 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 7은 단일 염기가 잘못 연결된 DNA 이중 가닥의 결합력 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 8은 이중 염기가 잘못 연결된 DNA 이중 가닥의 결합력 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 9는 AFM의 캔틸레버 및 AFM 캔틸레버의 말단을 확대하여 모식화한 것이다.
도 10a는 충분한 스페이스를 가진 리간드로 연결된 덴드론에 의해 변형된 AFM 말단을 모식화한 것이다.
도 10b는 인접된 리간드로 연결된 AFM 말단을 모식화한 것이다.
도 11a는 덴드론에 의해 변형된 AFM 말단상에 있는 단백질을 고정하는 방법을 모식화한 것이다.
도 11b는 덴드론에 의해 변형된 서브스트레이트상에 있는 단백질을 고정하는 방법을 모식화한 것이다.
도 12는 AFM을 이용한 힘 측정 방법을 모식화한 것이다.
도 13a는 블로킹 단백질과 AFM을 이용한 힘 측정을 나타낸 모식도이다.
도 13b는 경쟁 단백질과 AFM을 이용한 힘 측정을 나타낸 모식도이다.
도 14a는 Munc-18-1 및 PLDI-PX의 결합에 대한 힘 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 14b는 용액내에 비고정 Munc-18-1의 초과량을 첨가한 후 Munc-18-1 및 PLDI-PX의 결합에 대한 힘 분포를 나타낸 막대 그래프이다.
도 15는 경쟁 단백질인 PLC-의 농도에 따른 힘의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 16a는 리간드-코팅된 AFM 말단을 이용하여 세포상에 있는 수용체를 스크리닝하는 방법을 모식화한 것이다.
도 16b-16d는 FPRI 및 이의 결합 펩타이드간의 결합에 대한 힘의 곡선을 나타낸 것이다.
도 17a-17b는 세포의 각기 다른 부위에 있는 FPRI 및 이의 결합 펩타이드간의 결합에 대한 힘의 맵(map) 및 막대 그래프를 나타낸 것이다.
도 18은 비고정 WKYMVm (SEQ ID NO: 17)으로 블로킹하기 전과 후의 FPRI 및 이의 결합 펩타이드간의 결합에 대한 힘의 맵(map) 및 막대 그래프를 나타낸 것이다.
하기 실시예에서, 화합물의 번호체계(Numbering scheme)는 화합물 1, 화합물 2, I, II, III, IV, V 등과 같이 명명되었다. 그러나, 화합물의 번호체계는 인용되는 특정 실시예에서 한정되어 일관되게 사용하기 위함이다. 예를 들어, 실시예 2에서 다시 인용된 화합물 1은 반드시 실시예 3에서의 화합물1과 같을 필요는 없다.
실시예
1: 크기-조절된 거대분자를 이용한
마이크로어레이
제조방법
실시예 1에서, 명칭(designations) I, II, III, IV, 및 V는 도 2에 나타낸 바와 같이 다양한 화합물 및 중간체 화합물을 의미한다.
실시예
1.1: 재료
실란커플링제인 (3-글리시독시프로필)메틸디에톡실란(GPDES) 및 (3-아미노프로필)디에톡시메틸실란(APDES)은 겔레스트사(Gelest, Inc.)로부터 구입하였고, 나머지 화합물들은 시그마-알드리치사로부터 시약급으로 구입하였다. 실릴화(silylation)용 반응용매는 알드리치사로부터 구입한 무수물이다(Sure/Seal bottles). 서브스트레이트에 대한 모든 세척용매는 말린크로트 시약 제조회사(Mallinckrodt Laboratory Chemicals)로부터 구입한 HPLC 급이다. UV 급 용융 실리카 플레이트(30 mm x 10 mm x 1.5 mm)는 CVI레이저 유한회사(CVI Laser Corporation)로부터 구입하였다. 연마된 1급 Si 웨이퍼 (100)(dopant, phosphorus; resistivity, 1.5-2.1 Ω.cm)는 MEMC 전자재료회사(MEMC Electronic Materials, Inc)로부터 구입하였다. 글래스 슬라이드(2.5 x 7.5 cm)는 코닝사(Corning Co)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드는 모두 메타바이온(Metabion)으로부터 구입하였다. 초순수(Ultrapure water) (18 M Ω.cm)는 Milli-Q 정제시스템(Millipore)으로부터 얻었다.
실시예
1.2: 장치
필름 두께는 엘립소미터(ellipsometer) 분광기 (J. A. Woollam Co. Model M-44)를 사용하여 측정하였다. UV-vis 스펙트럼은 휴렛팩커드사의 분광광도계(Hewlett-Packard diodearray 8453 spectrophotometer)로 측정하였다. 태핑 모드 AFM 실험(Tapping mode AFM experiments)은 "E" 유형 스캐너를 갖는 나노스코프 IIIa AFM (Digital Instruments) 장비를 사용하여 수행하였다.
실시예
1.3: 서브스트레이트 청정화
산화 실리콘 웨이퍼, 용융 실리카, 및 글래스 슬라이드와 같은 서브스트레이트는 피라냐용액(Piranha solution, 농도 H2SO4:30% H2O2 = 7:3 (v/v))에 담그고, 상기 용액과 서브스트레이트를 포함하는 반응용기를 1시간 동안 초음파 처리하였다(주의사항: 피라냐 용액은 폭발성의 유기물질을 산화시킬 수 있다. 따라서 산화성 물질의 접촉은 피한다). 초음파를 처리한 후, 과량의 탈이온수를 사용하여 플레이트를 세척하고 헹구었다. 세척된 서브스트레이트들은 다음 단계를 위해 30-40 mTorr의 진공챔버에서 건조시켰다.
실시예
1.4: 수산화된 서브스트레이트 제조
상기 청정화된 서브스트레이트은 1.0 ml (3-글리시독시프로필)메틸디에톡시실란(GPDES)이 용해된 160 ml의 톨루엔 용액에 10시간 동안 침지시켰다. 자가조립(self-assembly)반응을 수행한 후, 서브스트레이트를 톨루엔으로 간단히 세척한 다음, 오븐에 넣고, 110℃에서 30분 동안 가열하였다. 플레이트는 톨루엔, 톨루엔-메탄올(1: 1 (v/v)), 및 메탄올에서 순차적으로 각 세척 단계에서 3분 동안 초음파 처리하였다. 상기 세척된 플레이트는 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다. GPDES-변형된 서브스트레이트은 95% 황산을 2-3 방울 첨가한 순수한 에틸렌글리콜(EG) 용액에 80 - 100℃ 에서 8시간 동안 침지하였다. 냉각한 후, 상기 서브스트레이트는 에탄올 및 메탄올에서 순차적으로 각각 3분 동안 초음파 처리하였다. 세척된 서브스트레이트은 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.
실시예
1.5:
덴드론
-변형된 서브스트레이트 제조
상기 수산화된 서브스트레이트는 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) (0.82 mM) 존재하에 덴드론(1.2 mM) 및 커플링제인 1-[-3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(11 mM)를 용해한 메틸렌 클로라이드 용액에 담그었다. 실온에서 3일 후, 상기 플레이트를 메탄올, 물 및 메탄올에서 순차적으로 각각 3분 동안 초음파 처리하였다. 다음 단계를 위해서 상기 세척된 플레이트는 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.
실시예
1.6:
NHS
-변형된 서브스트레이트 제조
상기 덴드론-변형된 서브스트레이트는 1.0 M 트리플루오로아세트산(TFA)이 포함된 메틸렌 클로라이드 용액에 담그었다. 3시간 후, 20% (v/v) 디이소프로필에틸아민(DIPEA)이 포함된 메틸렌 클로라이드 용액에 10분 동안 침지하였다. 상기 플레이트는 메틸렌 클로라이드 및 메탄올에서 각각 3분 동안 초음파 처리하였다. 이후, 진공 챔버에서 건조하고, 비보호된 서브스트레이트를 디(N-숙신이미딜)카보네이트(DSC)(25 mM) 및 DIPEA (1.0 mM)가 포함된 아세토니트릴 용액에서 반응시켰다. 질소 분위기에서 4시간 동안 반응시킨 후, 상기 플레이트를 디메틸포름아미드 용액에서 30분 동안 정치시키고, 메탄올로 간단히 세척하였다. 세척된 플레이트는 다음 단계를 위해서 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.
실시예
1.7:
NHS
-변형된
서브스트레이트상에
올리고뉴클레오타이드
배열
50 mM NaHCO3 완충용액(pH 8.5)에 용해된 프로브 올리고뉴클레오타이드는 NHS-변형된 서브스트레이트상에 4 포맷에 의해 4개로 나란히 점을 찍었다. 아민화된 DNA(the amine-tethered DNA)에 충분한 반응시간을 보장하기 위해 마이크로어레이는 습도 챔버(80% 습도)에서 12시간 동안 반응시켰다. 슬라이드는 혼성화(hybridization) 완충용액(7.0 mM 소듐 도데실설페이트를 포함하는 2x SSPE 완충용액 (pH 7.4))에서 37℃, 1시간 동안 교반시킨 다음, 5분 동안 끓는 물에서 교반시켜 비특이적으로 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제거하였다. 최종적으로, DNA-관능기화된(DNA-functionalized) 마이크로어레이는 다음 단계를 위해 질소 분위기하에서 건조시켰다. 완전한 비교를 위해, 여러가지 종류의 프로브를 상기 단일 플레이트에 스팟하였다.
실시예
1.8: 혼성화(
Hybridization
)
혼성화는 GeneTACTM HybStation (Genomic Solutions, Inc.)을 이용하여 Cy3 형광염료를 사용한 표적 올리고뉴클레오타이드(1.0 nM) 표지화를 포함하는 혼성화 완충용액에서 50℃ 에서 1시간 동안 수행하였다. 마이크로어레이는 혼성화 완충용액을 사용하여 헹구어 표적 올리고뉴클레오타이드를 제거한 다음, 질소를 사용하여 건조시켰다. 각 스팟상에 형광 신호는 ScanArray Lite (GSI Lumonics)를 이용하여 측정하였고, Imagene 4.0 (Biodiscovery)으로 결과를 분석하였다.
실시예
1.9:
덴드론
합성
실시예 1.9.1: 9- 안트릴메틸 N-(3- 카르복실프로필 ) 카바메이트 (I): 화합물 I의 제조
4-아미노부티릭산(0.50 g, 4.8 mmol, 1.0 equiv)과 트리에틸아민(TEA) (1.0 ml, 7.3 mmol, 1.5 equiv)을 N,N-디메틸포름아마이드(DMF)에 용해하고, 50℃ 에서 교반하였다. 상기 용액에 9-안트릴메틸 ρ-니트로페닐 카보네이트(1.81 g, 4.8 mmol, 1.0 equiv)를 교반하면서 서서히 첨가하였다. 50℃에서 2 시간 동안 교반한 후, 용액을 증발시켜 건조시키고, 0.50 N 수산화나트륨 용액 (NaOH)으로 염기화시켰다. 수용액은 에틸아세테이트(EA)로 세척하고, 얼음조에서 교반한 다음, 묽은 염산(HCI)으로 산성화시켰다. 생성물은 EA로 추출하고, 유기용액을 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과한 다음 용매를 증발시켰다. 최종의 노란색 분말의 총량은 1.06 g을 얻었으며, 수율은 65 %이었다.
실시예 1.9.2: 9- 안트릴메틸 N-{[(트리스{[2-( 메톡시카보닐 ) 에톡시 ] 메틸 } 메틸)아미노]카보닐}프로필카보네이트(II): 화합물 II의 제조
9-안트릴메틸 N-(3-카르복실프로필)카바메이트(0.65 g, 1.93 mmol, 1.5 equiv), 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) (0.37 g, 1.93 mmol, 1.5 equiv), 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT) (0.261 g, 1.93 mmol, 1.5 equiv)는 아세토니트릴에 용해시키고, 실온에서 교반하였다. 아세토니트릴에 용해된 트리스{[(메톡시카보닐)에톡시]메틸} 아미노메탄(0.49 g, 1.29 mmol, 1.0 equiv)을 교반하면서 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 조생성물(crude product)은 EA에 용해하고, 1.0 N HCl및 포화 소듐 바이카보네이트 용액으로 세척하였다. 무수 MgSO4로 건조하고 여과한 후 용매를 증발시켰으며, 조생성물을 실리카겔로 충진된 컬럼에 로딩하고 컬럼크로마토그래피(전개용매: 에틸 아세테이트: 헥산 = 5:1 (v/v))로 정제하여 점성의 노란색 액체를 얻었다. 노란색 액체의 총량은 0.67 g이었다(수율74 %).
실시예
1.9.3: 9-
안트릴메틸
N-[({트리스{[2-(
카르복시에톡시
)
메틸
]
메틸
}아미노)
카보닐
}
프로필카보네이트
(
III
): 화합물
III
의 제조
9-안트릴메틸 N-{[(트리스{[2- (메톡시카보닐)에톡시]메틸}메틸) 아미노]카보닐}프로필카보네이트 (0.67 g, 0.93 mmol)는 아세톤 (30 ml)과 0.20 N NaOH (30 ml, 6 mmol)에 용해시켰다. 실온에서 1일 동안 교반한 후에, 아세톤을 증발시켰다. 얻어진 수용액은 EA를 사용하여 세척하고, 얼음조에서 교반하면서 묽은 염산으로 산성화시켰다. 생성물은 EA를 사용하여 추출하고, 유기용액은 무수 MgSO4로 건조하고, 여과한 후 용매를 증발시켰다. 생성물은 -20℃ 하에 아세톤 및 에테르에서 고체화하여 노란색 분말을 얻었다. 얻어진 엷은 노란색 분말의 최종량은 0.54 g이었다(수율 88%).
실시예
1.9.4: 9-
안트릴메틸
N-[({트리스[(2-{[(트리스{[2- (
메톡시카보닐
)에톡시]
메틸
} (
메틸
)아미노]
카보닐
}
에톡시
)
메틸
]
메틸
}아미노)
카보닐
]
프로필카바메이트
(
IV
): 화합물
IV
의 제조
9-안트릴메틸 N-[({트리스[(2-카복시에톡시)메틸]메틸}아미노)카보닐] 프로필카바메이트 (0.54 g, 0.82 mmol, 1.0 equiv), EDC (0.55 g, 2.87 mmol, 3.5 equiv), 및 HOBT (0.39 g, 2.89 mmol, 3.5 equiv)는 아세토니트릴에 용해하고, 실온에서 교반하였다. 이후, 아세토니트릴에 용해시킨 트리스{[(메톡시카보닐)에톡시]메틸} 아미노메탄(0.96 g, 2.53 mmol, 3.1 equiv)을 교반하면서 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 36시간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 상기 조산물을 EA에 용해시키고, 1.0N HCL로 세척하고 중탄산나트륨 용액으로 포화시켰다. 무수 MgSO4로 건조, 여과, 및 증발한 후에, 상 조 산물을 실라카 겔이 충진된 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 이용한 정제(전개용매: 에틸아세테이트: 메탄올 = 20:1 (v/v))한 결과, 점성의 노란색 액체가 얻어졌다. 상기 노란색 액체의 총 중량은 1.26 g이었다(88 % 수율).
실시예
1.9.5: 9-
안트릴메틸
N-({[트리스({2-[({트리스[(2-
카복시에톡시
)
메틸
]
메틸
}아미노)
카보닐
]
에톡시
}
메틸
]
메틸
)아미노}
카보닐
)
프로필카바메이트
(V): 화합물 V의 제조
9-안트릴메틸 N-[({트리스[(2-{[(트리스{[2-(m에톡시카보닐)에톡시]메틸}메틸)아미노]카보닐} 에톡시)메틸]메틸}아미노)카보닐]프로필카바메이트 (0.60 g, 0.34 mmol)는 아세톤(30 ml)과 0.20 N NaOH (30 ml)에 용해시켰다. 실온에서 1 d 동안 교반한 후, 아세톤을 증발시켰다. 얻어진 수용액은 EA를 사용하여 세척하고, 얼음조에서 교반하면서 묽은 염산으로 산성화시켰다. 생성물은 EA를 사용하여 추출하고, 유기용액을 무수 MgSO4로 건조하고, 여과한 후 용매를 증발시켰다. 얻어진 노란색 분말의 최종량은 0.37 g이었다(수율 68%).
실시예
2: 대체출발물질인
덴드론
거대분자 제조방법(
Fmoc
-
스페이서
-[9]-산)
실시예 2에서, 여러 가지 명칭의 화합물들을 화합물 1, 2 등으로 명명하였다. 먼저, 스페이서인 6-아지도헥실아민(1)은 1,6-디브로모헥산으로부터 문헌의 방법(Lee, J. W.; Jun, S. I.; Kim, K. Tetrahedron Lett., 2001, 42, 2709)에 따라 합성하였다.
상기 스페이서는 비대칭 우레아 형성(unsymmetric urea formation) 및 제작된 N3-스페이서-[3]에스테르(3)를 통해 반복단위를 첨부시켰다. 상기 반복단위는 tert-부틸 아크릴레이트를 사용한 트리스의 축합으로 합성하였다.(which had been reported in Cardona, C. M.; Gawley, R. E. J. Org. Chem. 2002, 67, 141).
상기 트리에스테르는 펩타이드 커플링 조건하에 가수분해 및 트리에스테르(2)로 짝지음시킴을 통해 N3-스페이서-[3]산(4)로 형질전환시켰다. 아지드의 아민기로의 환원반응, 및 Fmoc 기를 갖는 아민의 보호반응 후, 노나에스테르(nona에스테르)의 가수분해는 Fmoc-스페이서-[9]산 (5)를 제공하였다.
N-(6-
아지도헥실
)-
N'
-트리스{[2-(
fer
/-
부톡시카보실
)
에톡시
]
메틸
}-
메틸우레
아 (3)
무수 CH2Cl2 (35 mL)에 용해된 6-아지도헥실아민(1) (1.6 g, 12 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA, 2.4 mL, 13.8 mmol)의 혼합물을 실린지 펌프를 이용하여 7시간 이상의 주기로 상기에서 교반된 트리포스진 용액으로 적하하여 첨가하였다. 2시간 동안 더 교반한 후, 무수 CH2Cl2 (20 mL)에 용해된 상기 용액(2) (6.4 g, 13 mmol) 및 DIEA (2.7 mL, 15.2 mmol)를 첨가하였다. 반응혼합물은 질소분위기 하에 실온에서 4시간 동안 교반하고, 0.5 M HCl 및 소금을 사용하여 세척하였다. 유기층은 무수 MgSO4로 건조한 다음, 용매는 증발시켜 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피를 사용한 정제(silica, 1:1 EtOAc/hexane)로 무색 오일상을 얻었다(3.0 g, 40 %).
N-(6-
아지도헥실
)-
N'
-트리스{[2-
카복시에톡시
]
메틸
}
메틸우레아
(4)
N3-스페이서-[3]에스테르(3) (0.36 g, 0.56 mmol)를 24시간 동안 6.6mL의 96% 포름산에서 교반시켰다. 포름산은 50℃에서 감압으로 제거하여 정량적인(quantitative) 수율로 무색 오일을 제조하였다.
N-(6-
아지도헥실
)-
N'
-트리스[(2-{[(2-(
tert
-
부톡시카보닐
)
에톡시
)-
메틸
]
메틸
}아미노]
카보닐
}
에톡시
)
메틸
]
메틸우레아
(4.1)
HOBt (0.20 g, 1.5 mmol), DIEA (0.30 mL, 1.8 mmol), 및 EDC (0.33 g, 1.8 mmol)를 건조 아세토니트릴5.0 mL 에 용해된 상기 (4) (0.25 g, 0.50 mmol)에 첨가하였다. 그런 다음, 건조 아세토니트릴 2.5 mL 에 용해된 아민(2) (1.14 g, 2.3 mmol)을 첨가하고, 반응혼합물을 48시간 동안 N2 하에 교반하였다. 용매를 감압으로 제거한 후, 잔여물을 MC에 용해하고, 0.5M HCl 및 소금으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 로 건조시킨 다음, 용매를 진공에서 제거하고, 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 2:1 EtOAc/hexane)하여 무색오일을 얻었다(0.67 g, 70%).
N-(6-
아미노헥실
)-
N'
-트리스[(2-{[(tris{[2-(
tert
-
부톡시카보닐
)
에톡시
]-
메틸
}
메틸
)아미노]
카보닐
}
에톡시
)
메틸
]
메틸우레아
(4.2)
에탄올(20.0 mL)에 용해된 노나-tert-부틸에스테르 (4.1) (0.37 g, 0.20 mmol)를 10% Pd/C (37.0 mg)와 함께 H2 하에 실온에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 반응의 종료를 확인한 후, 혼합물을 0.2 mm 필리포어(Millipore) 필터로 여과하였다. 여과지를 CH2Cl2로 헹군 다음, 혼합된 용매를 진공에서 제거하여 무색 오일을 회수하였다.
N-{6-(9-
플루오레닐메톡시카보닐
)
아미노헥실
}-
N'
-트리스[(2-{[(트리스{[2-(tert-부
톡시
카보닐)
에톡시
]
메틸
}
메틸
)아미노]
카보닐
}
에톡시
)
메틸
]
메틸우레아
(4.3)
아민(4.2) (0.33 g, 0.17 mmol) 및 DIEA (33 mL, 0.19 mmol)는 CH2Cl2 5.0 mL에 용해하고, 질소 분위기하에서 30분 동안 교반하였다. CH2Cl2 2.0 mL에 용해된 9-플루오레닐 메틸 클로로포메이트(48 mg, 0.19 mmol)를 첨가하고, 반응혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 0.5 M HCl 및 소금으로 세척하였다(0.18 g, 64 %). 잔여물을 컬럼 크로마토그래피(silica, EtOAc)로 정제하여, 무색 오일을 얻었다.
N-{6-(9-
플루오레닐메톡시카보닐
)
아미노헥실
}-
N'
-트리스[(2-{[(트리스{[2-
카복시에톡시
]
메틸
}
메틸
)아미노]
카보닐
}
에톡시
)
메틸
]-
메틸우레아
(5)
보호기를 갖는 노나-tert-부틸 에스테르(4.3) (0.12 g, 72 mmol) 18시간 동안 10mL의 96% 포름산에서 교반시켰다. 포름산은 50 ℃ 에서 감압으로 제거하여 양적인(quantitative) 수율로 무색 오일을 제조하였다.
실시예
3: 추가
덴드론
화합물
특정 보호기를 고분자로 나타낼 수 있지만, 상기 화합물이 한정되는 것은 아님을 주지해야 한다. 또한, 여러 사슬 및 스페이서가 정확한 분자구조를 가리켜 묘사하는 한, 서브스트레이트 표면상에 조절된 밀도, 바람직하게는 저밀도의 배열을 위해 변형은 용인된 화학적 변형 방법(chemical modification methods)에 따라 가능하였다. 화합물의 숏-핸드 기술(short-hand description)에 대한 참고로서, 왼쪽 대부분의 글자들은 보호기를 가리키고; 괄호(brackets)에서 숫자는 쇄 말단(branched termini)의 수를 나타내며; 오른쪽 대부분의 화학적인 본체(entity)는 쇄 말단 상의 화학적 작용(chemistry)을 나타낸다. 실시예에 대해, "A-[27]-산"은 안트릴메틸 보호기; 27 말단, 및 말단의 산성기를 나타내는 것이다.
A-[27]-산
Boc
-[l]-산
Boc
-[3]-에스테르
Boc
-[3]-산
Boc
-[9]-에스테르
Boc
-[9]-산
Ns
-[9]-에스테르
Ns
-[9]-산
Fmoc
-[9]-에스테르 (R=t-부틸)
Fmoc
-[9]-산
AE
-[l]-산
AE
-[3]-산
AE
-[9]-산
A- [6]-산
A-[8]-산
A-[12]-산
A-[16]-산
A-[18]-산
G. R. Newkome J Org. Chem. 1985, 50, 2003
J. -J. Lee Macromolecules 1994, 27, 4632
L. J. Twyman Tetrahedron Lett. 1994, 55, 4423
D. A. Tomalia Pøfyifi. J 1985, 17, 117
E. Buhleier. Synthesis 1978, 155
A. W. van der Made J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1992, 1400
G. R. Newkome Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 1176
G. R. Newkome Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 1176
K. L. WooleyJ Chem. Soc, Perkin Trans.1 1991, 1059
실시예
3.1: 제조방법
1. A-[3]-
OEt
(3)
화합물 1은 C6H6/DMF에 용해된 NaC(CO2Et)3 2와 함께 80℃에서 반응시켰다.
2. A-[3]-
OMe
(5)
A-[3]-OEt 3은 에테르에 용해된 LiAlH4 또는 LiBH4 와 함께 반응시키고, t-BuOK/t-BUOH의 존재하에 클로로아세트산과 반응시키고, MeOH로 에스테르화하였다.
3. A-[3]-
OTs
(7)
화합물 7로 토실화된 트리올 화합물6은 에테르에서의 A-[3]-OMe 5 및 LiAlH4 의 반응으로 얻는다.
4. A-[9]-
OEt
(8)
목적화합물인 노나에스테르(화합물 8)는 A-[3]-OTs 7을C6H6-DMF에 용해된 NaC(CO2Et)3로 처리하여 제조한다.
5. A-[27]-
OH
(9)
A-[9]-OEt 8은 70℃에서 DMSO에 용해된 트리스(하이드로시메틸)아미노메탄 및 K2CO3으로 처리하였다.
실시예
3.2
l.
Boc
-[2]-
OMe
(3)
50℃ 이하의 온도에서 메탄올 용매하에 화합물 1과 메틸 아크릴레이트 2를 반응시켰다. 55℃ 이하의 고진공하에 과량의 시약과 용매를 제거하였다.
2.
Boc
-[4]-
NH2
(5)
50℃ 이하 온도에서 메탄올 용매하에 Boc-[2]-OMe 3와 매우 과량의 에틸렌디아민 (EDA) 4 를 반응시켰다. 55℃ 이하의 고진공하에 과량의 시약과 용매를 제거하였다.
3.
Boc
-[8]-
OMe
(6)
50℃ 이하의 온도에서 메탄올 용매하에 Boc-[4]-NH2 5와 메틸 아크릴레이트 2 를 반응시켰다. 55℃ 이하의 고진공하에 과량의 시약과 용매를 제거하였다.
실시예
3.3
1.
Boc
-[2]-
OH
(3)
화합물 1, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트 (HOBT)는 아세토니트릴에 용해하고, 실온에서 교반하였다. 아세토니트릴에 용해된 L-글루탐산-디에틸에틸 에스테르 (H2NCH(CO2Et)CH2CH2CO2Et)를 교반하면서 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 조생성물은 EA에 용해하고, 1.0 N HCl 및 포화 소듐 바이카보네이트 용액으로 세척하였다. 무수 MgSO4로 건조한 후, 여과하고 용매를 증발시키고, 실리카겔로 충전된 컬럼에 조생성물을 넣었다. 컬럼 크로마토그래피(전개용매: 에틸 아세테이트: 헥산)로 정제하여 점성의 노란색 액체를 얻었다.
화합물 2 는 NaOH로 가수분해하였다. 1일 동안 실온에서 교반한 후, 유기용액을 증발시켰다. 수용액은 EA로 세척하고, 얼음조에서 교반한 후, HCl로 산성화시켰다. EA를 사용하여 생성물을 추출한 후에, 유기용액을 무수 MgSO4로 건조하고, 여과하여 용매를 증발시켰다.
2.
Boc
-[4]-
OH
(3)
화합물 3, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT)를 아세토니트릴에 용해하고 실온에서 교반하였다. 교반하면서 상기 용액에 아세토니트릴에 용해된 L-글루탐산-디에틸 에스테르 (H2NCH(CO2Et)CH2CH2CO2Et)를 첨가하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 조생성물은 EA에 용해하고, 1.0 N HCl 및 포화 소듐 바이카보네이트 용액으로 세척하였다. 무수 MgSO4로 건조한 후, 여과하고 용매를 증발시키고, 실리카겔로 충전된 컬럼에 조생성물을 넣었다. 컬럼 크로마토그래피(전개용매: 에틸 아세테이트: 헥산)로 정제하여 점성의 노란색 액체를 얻었다.
화합물 4 는 NaOH로 가수분해하였다. 1일 동안 실온에서 교반한 후, 유기용액을 증발시켰다. 수용액은 EA로 세척하고, 얼음조에서 교반한 후, HCl로 산성화시켰다. EA를 사용하여 생성물을 추출한 후에, 유기용액을 무수 MgSO4로 건조하고, 여과하여 용매를 증발시켰다.
3.
Boc
-[8]-
OH
(3)
화합물 5, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT)를 아세토니트릴에 용해하고 실온에서 교반하였다. 교반하면서 상기 용액에 아세토니트릴에 용해된 L-글루탐산-디에틸 에스테르 (H2NCH(CO2Et)CH2CH2CO2Et)를 첨가하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 조생성물은 EA에 용해하고, 1.0 N HCl 및 포화 소듐 바이카보네이트 용액으로 세척하였다. 무수 MgSO4로 건조한 후, 여과하고 용매를 증발시키고, 실리카겔로 충전된 컬럼에 조생성물을 넣었다. 컬럼 크로마토그래피(전개용매: 에틸 아세테이트: 헥산)로 정제하여 점성의 노란색 액체를 얻었다.
화합물 6은 NaOH로 가수분해하였다. 1일 동안 실온에서 교반한 후, 유기용액을 증발시켰다. 수용액은 EA로 세척하고, 얼음조에서 교반한 후, HCl로 산성화시켰다. EA를 사용하여 생성물을 추출한 후에, 유기용액을 무수 MgSO4로 건조하고, 여과하여 용매를 증발시켰다.
실시예
3.4
1.
Boc
-[2]-
CN
(3)
실온에서 화합물 1을 아세토니트릴에 용해하였다. 결정상 아세트산(Glacial acetic acid)을 첨가하고, 용액을 24시간 동안 환류하에 가열하였다. 과량의 아세토니트릴을 진공하에 증류하여 제거하고, 잔여물을 클로로포름으로 추출한 후, 진한 암모니아 용액을 첨가하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.
2.
Boc
-[2]-
NH2
(4)
Boc-[2]-CN 3는 메탄올에 용해하고, 코발트(II) 클로라이드 헥사 하이드레이트를 첨가하였다. 소듐 보로하이드라이드를 분할하여 첨가하였다. 결과 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 진한 염산으로 조심스럽게 산성화시켰다. 용매를 진공하에 제거하고 농축하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.
3.
Boc
-[4]-
CN
(5)
실온에서 Boc-[2]-NH2 4 를 아세토니트릴에 용해하였다. 결정상 아세트산(Glacial acetic acid)을 첨가하고, 용액을 24시간 동안 환류하에 가열하였다. 과량의 아세토니트릴을 진공하에 증류하여 제거하고, 잔여물을 클로로포름으로 추출한 후, 진한 암모니아 용액을 첨가하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.
4.
Boc
-[4]-
NH
2
(6)
Boc-[4]-CN 5는 메탄올에 용해하고, 코발트(II) 클로라이드 헥사 하이드레이트를 첨가하였다. 소듐 보로하이드라이드를 분할하여 첨가하였다. 결과 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 진한 염산으로 조심스럽게 산성화시켰다. 용매를 진공하에 제거하고 농축하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.
5.
Boc
-[8]-
CN
(7)
실온에서 Boc-[4]-NH2 6을 아세토니트릴에 용해하였다. 결정상 아세트산(Glacial acetic acid)을 첨가하고, 용액을 24시간 동안 환류하에 가열하였다. 과량의 아세토니트릴을 진공하에 증류하여 제거하고, 잔여물을 클로로포름으로 추출한 후, 진한 암모니아 용액을 첨가하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.
6.
Boc
-[8]-
NH
2
(8)
Boc-[8]-CN 7은 메탄올에 용해하고, 코발트(II) 클로라이드 헥사 하이드레이트를 첨가하였다. 소듐 보로하이드라이드를 분할하여 첨가하였다. 결과 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 진한 염산으로 조심스럽게 산성화시켰다. 용매를 진공하에 제거하고 농축하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.
7.
Boc
-[16]-
CN
(9)
실온에서 Boc-[8]-NH2 8을 아세토니트릴에 용해하였다. 결정상 아세트산(Glacial acetic acid)을 첨가하고, 용액을 24시간 동안 환류하에 가열하였다. 과량의 아세토니트릴을 진공하에 증류하여 제거하고, 잔여물을 클로로포름으로 추출한 후, 진한 암모니아 용액을 첨가하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.
7.
Boc
-[16]-
NH
2
(10)
Boc-[16]-CN 9는 메탄올에 용해하고, 코발트(II) 클로라이드 헥사 하이드레이트를 첨가하였다. 소듐 보로하이드라이드를 분할하여 첨가하였다. 결과 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 진한 염산으로 조심스럽게 산성화시켰다. 용매를 진공하에 제거하고 농축하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.
실시예
3.5
1. A-[3]-
알켄
(3)
A-[1]-SiCl3 1을 디에틸 에테르에 용해된 과량의 10% 알릴마그네슘 브롬화물을 이용하여 4시간 동안 환류시킨 후, 0℃에서 냉각시키고, 10 % NH4Cl 수용액으로 가수분해하였다. 상기 유기층을 물로 세척하고 MgSO4를 이용하여 건조하여 농축하였다.
2. A-[3]-
SiCI
3
(4)
A-[3]-Alkene 3, HSiCl3, 및 통상적인 백금-기재의 하이드로실릴화 촉매 예를 들어, 프로판-2-올에 용해된 H2PtCl6(Speier의 촉매), 또는 백금 디비닐실록산 착화합물 (Karstedt의 촉매)의 혼합물을 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 종료되었을 때, 과량의 HSiCl3를 진공으로 제거하였다.
3. A-[9]-
알켄
(5)
A-[3]-SiCl3 4를 디에틸 에테르에 용해된 과량의 10% 알릴마그네슘 브롬화물을 이용하여 4시간 동안 환류시킨 후, 0℃에서 냉각하였다. 그 후, 10 % NH4Cl 수용액으로 가수분해하였다. 상기 유기층을 물로 세척하고 MgSO4를 이용하여 건조하여 농축하였다.
4. A-[9]-
SiCl
3
(6)
A-[9]-Alkene 5, HSiCl3, 및 통상적인 백금-기재 하이드로실릴화 촉매, 예를 들어, 프로판-2-올에 용해된 H2PtCl6(Speier의 촉매) 또는 백금 디비닐실록산 착화합물(Karstedt의 촉매)의 혼합물을 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 종료되었을 때, 과량의 HSiCl3를 진공펌프를 이용하여 제거하였다.
실시예
3.6
1. [l]-산-[3]-트리올 (3)
(a) 단계에서는 상기 트리올1을 시아노에틸화하여 상기 니트릴 화합물 2를 제조하였다. 아크릴로니트릴, nBu3SnH 및 아조비시소부티로니트릴을 상기 화합물 1이 포함된 PhCH3에 110℃에서 첨가하였다. (b) 단계에서는 상기 니트릴 화합물 2를 KOH, EtOH/H2O, H2O2 및 △과 같은 반응조건에서 가수분해하여 화합물 3과 카르복시산을 제조하였다.
2. A-[3]-트리올 (5)
(c) 단계에서는 [1]-산-[3]-트리올을 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이마이드 하이드로클로라이드(EDC)와 1-하이드록시벤조트리아졸하이드레이트(HOBT)를 이용하여 아미드 커플링 반응을 통해서 화합물 4와 결합하였다.
3. A-[3]-트리브로마이드 (6)
(d) 단계에서는 100 ℃ 에서 HBr/H2SO4으로 브롬화하여 트리브롬화물을 합성하기 위하여 상기 알콜을 사용하였다.
.
4. [l]-
CN
-[3]-
OBzl
(8)
(e) 단계에서는 상기 트리올1을 Me2SO 및 KOH를 사용하여 트리에테르를 제조하기 위하여 벤질클로라이드로 처리하였다. (f) 단계에서는 상기 트리 에테르8을 시아노에틸화하여 상기 니트릴 화합물 9를 제조하였다. 아크릴로니트릴, nBu3SnH 및 아조비스이소부티로니트릴을 상기 화합물 8을 포함하는 PhCH3에 110℃에서 첨가하였다.
5. [l]-
OH
-[3]-
OBzI
(11)
(g) 단계에서는 상기 니트릴 화합물 9를 KOH, EtOH/H2O, H2O2 및 △와 같은 반응조건에서 가수분해하여 화합물 10과 카르복시산을 제조하였다. (h) 단계에서는 상기 카르복시산과 화합물 10을 산을 알코올로 전화시키기 위하여 1.0 M의 농도를 초과하는 BH3 THF용액과 함께 반응시켰다.
6. [l]-
Alkyne
-[3]-
OBzl
(13)
(i) 단계에서는 과량의 SOCl2와 피리딘 촉매하에 알코올을 염화물(CH2Cl2)로 만들었다. (j) 단계에서는 염화물을 디메틸설폭사이드(dimethylsulphoxide)하에서 리튬 아세틸라이드 에틸렌디아민 착화합물(lithium acetylide ethylenediamine complex )과 40℃에서 반응시켰다.
7. A-[3]-
Alkyne
-[9]-
OBzl
(14)
(k) 단계에서는 4량의 알킨 말단을 만드는 블록(block) 13, 헥사메틸 포스포릭 트리아미드(HMPA), 리튬 디이소프로필아미드(LDA) 및 테트라메틸에틸렌아민(TMED)으로 0 ℃ 내지 40 ℃ 에서 1.5시간 동안 반응시켜 상기 A-[3]-OBzl 6을 알킬화시켰다.
실시예
3.7
1. A-[9]-
OH
(15)
A-[3]-Alkyne-[9]-OBzl 14는 A-[9]-OH 15를 제조하기 위해 10% Pd-C/H가 포함된 EtOH와 THF 용액하에서 Pd-C/H와 60℃ 에서 4 일 동안 반응시켜 환원시키고 탈보호화시켰다.
2. A-[27]-
COOH
(17)
상기 알코올은 염화물(CH2Cl2)하에서 SOBr2를 이용하여 40℃에서 12 시간 동안 천천히 비브롬화물(nonabromide)로 전환시켰다. 상기 과정 후에, 49%의 A-[9]-Alkyne-[27]- OBzl 16를 제조하기 위해 12가의 [1]-Alkyne-[3]-OBzl 13를 가지고 상기 비브롬화 화합물을 알킬화시켰다. A-[9]-Alkyne-[27]- OBzl 16은 10% Pd-C/H가 포함된 EtOH 및 THF 용액하에서 Pd-C/H와 60℃에서 4시간 동안 반응시키는 한 단계를 통해 환원시키고 탈보호화시켜 89%의 A-[27]-OH를 생산하였다. A-[27]-OH를 NH4OH 또는 (CH3)4NOH하에서 RuO4로 산화시켜, 85% 의 A-[27]-COOH 17를 제조하였다.
실시예
3.8
1) [
Gl
]-(
OMe
)
2
(3)
화합물 1(1.05 mol equiv.), 3,5-디메톡시벤질브롬화물(dimethoxybenzyl bromide)(1.00 mol equiv. 2), 탄산 칼륨(1.1 mol equiv.) 및 18-c-6(0.2 mol equiv.)의 혼합물을 탈수된 아세톤 하에서 48시간 동안 질소하에서 환류될 때까지 가열시켰다. 상기 혼합물을 냉각시킨 후, 건조될 때까지 증류하고 잔류물은 염화물(CH2Cl2)과 물 사이에서 분할시켰다. 상기 수용액 층은 염화물(CH2Cl2)(3×) 로 추출하고, 연결된 유기막층을 건조한 후 건조될 때까지 증발시켰다. 화합물 3을 얻기 위해 상기 조 결과물에 대해 EtOAc-CH2Cl2를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 이용하여 정제하였다.
2) [
Gl
]-(
OH
)
2
(4)
화합물 3의 메틸 에테르기를 EtOAc용액하에서 1시간 동안 BBr3에 의해 탈리시켰다. 이에 의한 조 결과물에 대해 MeOH-EtOAc를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 이용하여 정제하여 화합물 4를 얻었다.
3) [
G2
]-(
OMe
)
4
(5)
[G1]-(OH)2(1.00 mol equiv. 4), 3,5-디메톡시벤질브롬화물(dimethoxybenzyl bromide)(2.00 mol equiv. 2), 탄산 칼륨 (2.1 mol equiv.)와 18-c-6(0.2 mol equiv.)의 혼합물을 탈수된 아세톤 하에서 48시간 동안 질소하에서 환류될 때까지 가열시켰다. 상기 혼합물을 냉각시킨 후, 건조될 때까지 증류하고 잔류물은 염화물(CH2Cl2)과 물 사이에서 분할하였다. 상기 수용액 층은 염화물(CH2Cl2)(3×)로 추출하고, 연결된 유기막층을 건조한 후 건조될 때까지 증발시켰다. 화합물 5를 얻기 위해 상기 조 결과물에 대해 EtOAc-CH2Cl2를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 이용하여 정제하였다.
4) [
G2
]-(
OH
)
4
(6)
화합물 5의 메틸 에테르기를 EtOAc용액하에서 BBr3에 의해 1시간 동안 탈리시켰다. 상기 조 결과물에 대해 MeOH-EtOAc를 용출액으로 플래쉬 크로마토그래피를 실시하여, 화합물 4를 얻었다.
5) [
G3
]-(
OMe
)
8
(7)
[G2]-(OH)4(1.00 mol equiv. 6), 3,5-디메톡시벤조 브롬화물(4.00 mol equiv. 2), 탄산칼륨(4.1 mol equiv.) 및 18-c-6(0.2 mol equiv.)의 혼합물을 탈수된 아세톤 하에서 48시간 동안 질소 하에서 환류될 때까지 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시킨 후, 건조될 때까지 증류하고 잔류물은 염화물(CH2Cl2)과 물 사이에서 분할하였다. 상기 수용액 층은 염화물(CH2Cl2)(3×)로 추출하고, 연결된 유기막층을 건조한 후 건조될 때까지 증발시켰다. 화합물 7을 얻기 위해 상기 조 결과물에 대해 EtOAc-CH2Cl2를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 이용하여 정제하였다.
6) [
G3
]-(
OH
)
8
(8)
화합물 7의 메틸 에테르기는 1시간 동안 EtOAc용액 안에서 BBr3에 의해 탈리시켰다. 화합물 8을 얻기 위해, 조 결과물에 대해 MeOH-EtOAc를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 실시하였다.
실시예
4:
서브스트레이트상에서
덴드론의
조립
APDES 대신에, 유리산화물(oxide glass)상에 TMAC (N-트리메톡시실릴프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드)을 자가조립하였다. 상기 TMAC 상의 덴드리머층의 아민잔기를 캡핑할 필요는 없었다.
TMAC
에 의한
아미노실릴화
깨끗한 서브스트레이트 (슬라이드 글라스)를 TMAC (2mL) 및 아세톤 (100mL)의 혼합용액에 5시간 동안 담그었다. 자가조립한 후, 상기 서브스트레이트를 플라스크로부터 꺼내어 아세톤으로 세척하였다. 상기 서브스트레이트를 오븐에 넣고 110℃ 에서 40분간 가열하였다. 아세톤에 침지한 후, 상기 서브스트레이트에 3분간 초음파 처리를 하였다. 세척된 서브스트레이트를 Teflon 용기에 담고, O-고리에 연결된 큰 스크류 캡을 갖는 유리 용기에 두고, 상기 용기에 진공으로 처리하여 상기 TMAC 가 자가조립된 서브스트레이트를 건조하였다.
TMAC (N-트리메톡시실릴프로필-N,N,N-트리메틸암모니윰 클로라이드)의 화학식 구조.
무수 아세트산으로 아민잔기를 캡핑하는 것을 제외하고는, Fmoc-스페이서-[9]산을 CBz-[9]산과 동일한 조건으로 자가조립하였다.
Fmoc
-
스페이서
-[9]산의 자가조립 (5)
일정량의 Fmoc-스페이서-[9]산 (5)을 혼합용매 (DMF:탈이온수 = 1:1 (v/v))에 용해하여 20 mL용액을 제조하였다. 테플론 병에 상기 용액을 넣고, 상기에서 제조한 아미노실릴화된 슬라이드 글라스 조각을 용액에 담그었다. 플라스크를 상온에 두어 자가조립을 하도록 하고, 1일 후에 각 서브스트레이트 조각을 용액으로부터 꺼내었다. 조각을 꺼낸 직후, 상기 플레이트를 탈이온수로 세척하였다. 각각의 서브스트레이트를 탈이온수, 탈이온수-메탄올 혼합용매(1:1 (v/v)), 및 메탄올 변형로 3분간 초음파로 처리하였다. 초음파 처리한 후, 테플론 병에 상기 서브스트레이트를 담고, 다시 O-고리가 연결된 큰 스크류 캡이 있는 유기 용기에 담고, 상기 용기를 진공으로 하여(30-40 mTorr) 서브스트레이트를 건조하였다.
자가조립된
Fmoc
-
스페이서
-[9]산의
Fmoc
탈보호화
(5)
DMF중 5 % 피페리딘을 포함하는 테플론 병을 제조하였다. 상기 자가조립된 서브스트레이트를 상기 병에 담그고, 20분간 교반하였다. 각각의 서브스트레이트를 아세톤 및 메탄올에서 순차적으로 3분간 초음파처리하고, 진공챔버에서 (30-40 mTorr) 건조하였다.
실시예
5:
덴드론
-변형된
AFM
말단(
tip
) 및 서브스트레이트 준비
재료
실란커플링제인 N-(3-(트리에톡시실릴)프로필)-O-폴리에틸렌옥사이드 우레탄 (TPU)DMS 겔레스트사(Gelest, Inc.)로부터 구입하였고, 나머지 화합물들은 시그마-알드리치사로부터 시약급으로 구입하였다. UV급 용융 실리카 플레이트는 CVI레이저 유한회사(CVI Laser Corporation)로부터 구입하였다. 연마된 1급 Si 웨이퍼 (100)(dopant, phosphorus; resistivity, 1.5-2.1 Ω.cm)는 MEMC 전자재료회사(MEMC Electronic Materials, Inc)로부터 구입하였다. 초순수(Ultrapure water) (18 M Ω.cm)는 Barnstead E-pure-모듈 시스템으로부터 얻었다. 필름 두께는 엘립소미터(ellipsometer) 분광기 (J. A. Woollam Co. Model M-44)를 사용하여 측정하였다. UV-vis 스펙트럼은 휴렛팩커드사의 분광광도계(Hewlett-Packard diodearray 8453 spectrophotometer)로 측정하였다.
1) 서브스트레이트 청정화
용융 실리카 플레이트 및 실리콘 웨이퍼를 피라나 용액(Piranha solution, 농도 H2SO4:30% H2O2 = 7:3 (v/v))에서 4시간 동안 초음파처리한 후, 상기 플레이트와 웨이퍼를 증류수로 깨끗하게 세척하였다 (주의사항: 피라나 용액은 폭발성의 유기물질을 산화시킬 수 있다. 따라서 산화성 물질의 접촉은 피해야 함). 그런 다음, 상기 서브스트레이트를 탈이온수, 농축된 아모니아수, 및 30% 과산화수소가 (5:1:1 (v/v/v))로 혼합된 혼합액을 포함한 Teflon 비이커에 침전시켰다. 상기 비이커를 80 ℃의 물중탕기에서 10분간 열처리 하였다. 상기 반응 용액으로부터 서브스트레이트를 꺼낸 후, 이온수로 깨끗하게 세척하였고, 세척된 서브스트레이트를 탈이온수, 농축된 아모니아수, 및 30% 과산화수소가 (6:1:1 (v/v/v))로 혼합된 혼합액을 포함한 Teflon 비이커에 다시 침전시켰다. 동일한 방법으로 상기 비이커를 80 ℃의 물중탕기에서 10분간 열처리 하였고, 상기 서브스트레이트를 반응 용액으로부터 꺼낸 후, 과량의 이온수로 깨끗하게 세척하였다. 세척된 서브스트레이트들은 다음 단계를 위해 30-40 mTorr의 진공챔버에서 건조시켰다.
2) 말단(
Tip
) 청정화
피라미드형 말단(비코 장치; k=10 Pn/nm)을 가진 표준 V-유형 실리콘 질화 캔틸레버 (MLCT-AUNM)를 10% 질산에 담그고 80 ℃에서 20분간 열처리하여 최초로 활성화시켰다. 상기 용액으로부터 캔틸레버를 꺼낸 후, 과량의 이온수로 깨끗하게 세척하였다. 세척된 캔틸레버는 30-40 mTorr의 진공챔버에서 약 20분 동안 건조시켰고, 다음 단계에서 바로 사용하였다.
3)
아미노실릴화
청정화된 용융 실리카, 실리콘 웨이퍼, 및 캔틸레버를 질소가스가 채워진 반응조건하에서 커플링제 (0.2 mL)가 포함된 무수 톨루엔 (20 mL) 용액에 6시간 동안 침지시켰다. 실릴화(silylation)반응을 수행한 후, 서브스트레이트 및 캔틸레버를 톨루엔으로 간단히 세척한 다음, 오븐에 넣고, 110℃에서 30분 동안 가열하였다. 상기 서브스트레이트는 톨루엔, 톨루엔-메탄올(1: 1 (v/v)), 및 메탄올에 순차적으로 침지시켜 세척한 후, 각 세척 단계에서 3분 동안 초음파 처리하였다. 상기 캔틸레버는 톨루엔 및 메탄올에서 순차적으로 세척하였다. 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버는 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.
4)
덴드론
-변형된 표면 준비
상기 수산화된 서브스트레이트 및 캔틸레버는 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) (0.90 mM) 존재하에 덴드론(1.0 mM) 및 커플링제인 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(9.9 mM)를 용해한 소량의 DMF가 포함된 메틸렌 클로라이드 용액에서 12-24시간 동안 침지하였다. 본 실시예에서 사용된 덴드론 (9-안트릴메틸 N-({[트리스({2-[({트리스[(2- 카르복시에톡시)메틸]메틸}아미노)카르보닐]에톡시}메틸)메틸]아미노}카르보닐)프로필카르바메이트)은 본 발명에서 준비하였다. 침지 반응 후, 상기 서브스트레이트는 메틸렌 클로라이드, 메탄올, 및 물에 순차적으로 침지시켜 세척한 후, 각 세척 단계에서 3분간 초음파 처리하였다. 상기 캔틸레버는 메틸렌 클로라이드, 메탄올, 및 물에서 순차적으로 세척하였다. 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버는 메탄올로 세척한 다음, 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.
실시예
6:
올리고뉴클레오타이드
고정
1)
덴드론
표면으로부터
카르보안트릴메톡시기
탈보호화
상기 덴드론-변형된 서브스트레이트 및 캔틸레버를 1.0 M 트리플루오로아세트산 (TFA)가 포함된 메틸렌 클로라이드 용액에 침지시킨 후, 3시간 동안 교반하였다. 교반 후, 상기 용액을 20% (v/v) 디이소프로필에틸아민 (DIPEA)가 포함된 메틸렌 클로라이드 용액에서 10분 동안 교반하였다. 상기 서브스트레이트는 메틸렌 클로라이드 및 메탄올에서 각각 3분 동안 초음파 처리하였고, 상기 캔틸레버는 메틸렌 클로라이드 및 메탄올에서 순차적으로 세척하였다. 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버는 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.
2)
NHS
-변형된 서브스트레이트 제조
상기 탈보호화된 서브스트레이트 및 캔틸레버를 질소가스가 채워진 반응조건하에서 디(N-숙시니미딜)카르보네이트(DSC)(25 mM) 및 DIPEA (1.0 mM)가 포함된 아세토니트릴 용액에서 4시간 동안 침지시켰다. 침지 반응 후, 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버를 교반된 디메틸포름아마이드에서 30분간 방치한 후, 메탄올로 세척하였다. 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버는 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.
3)
덴드론
-변형된
서브스트레이트상에
올리고뉴클레오타이드
고정
상기 NHS-변형된 서브스트레이트 및 캔틸레버를 5.0 mM MgCl2가 포함된 25 mM NaHCO3 용액 (pH 8.5)에 용해된 올리고뉴클레오타이드 (20 μM)와 12시간 동안 침지시켰다. 침지 반응 후, 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버를 혼성화(hybridization) 완충용액(7.0 mM 소듐 도데실설페이트를 포함하는 2x SSPE 완충용액 (pH 7.4))에서 37℃, 1시간 동안 교반시킨 다음, 5분 동안 끓는 물에서 교반시켜 비특이적으로 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제거하였다. 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버를 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰고, 고정된 올리고뉴클레오타이드를 표 1에 나타내었다.
실시예
7:
ATM
힘 측정
7-1: 시료 준비
스페이스(spacing)의 효능을 이해하기 위하여, GPDES 및 TPU와 같은 2개의 실란제를 이용하여 제조된 2가지 형태의 변형 (9-산/GPDES 서브스트레이트 및 9-산/TPU 서브스트레이트)을 사용하였고, 반면 AFM 말단상의 스페이스를 9-산/TPU으로 고정시켰다. 상기 서브스트레이트의 표면 변형은 실시예 1에 따라 수행하였다. 서열번호 1 내지 4에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 각각 실시예 2에 따른 9-산/TPU 서브스트레이트상에 고정시켰다. 서열번호 2에 기재된 30 bp 상보적 DNA는 9-산/GPDES 서브스트레이트상에 고정시켰다. 서열번호 5 내지 20에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 각각 AFM 말단의 9-산/TPU 유형상에 고정시켰다.
표면 | 올리고뉴클레오타이드 유형 | 고정된 뉴클레오타이드 (SEQ ID NO) |
|
AFM 말단 | 9-산/TPU | 완전일치 DNA | 5 내지 8 |
9-산/TPU | 1 bp 불일치 | 9 내지 12 | |
9-산/TPU | 2 bp 불일치 | 13 내지 16 | |
서브스트레이트 | 9-산/GPDES | DNA | 1 내지 4 |
9-산/TPU | DNA | 1 내지 4 | |
27-산/TPU | DNA | 1 내지 4 |
상기 실시예에서, 9-산은 (9-안트릴메틸 N-({[트리스({2-[({트리스[(2- 카르복시에톡시)메틸]메틀리릴}아미노)카르보닐]에톡시}메틸)메틸]아미노}카르보닐)프로필카르바메이트)이고, 27-산 덴드론은 실시예 3에 나타내었다.
7-2:
AFM
힘 측정
나노 위저드(Nano Wizard)의 AFM (JPK 장치)를 이용하여 모든 힘을 측정하였다. 각각의 개별적인 AFM 말단의 스프링 상수인 kc값은 나노 위저드 소프트웨어를 이용 가능한 열적 변동(thermal fluctuation) 방법에 의해 각 실험전 용액에서 조정하였다. 상기 스프링 상수는 12 pN/nm에서 15 pN/nm까지 다양하다. 모든 측정은 실온의 신선한 PBS 완충용액 (pH 7.4)에서 수행하였다. 힘 측정의 적재율은 110 nm/s부터 540 nm/s까지 다양하다. 각 실험 조건에서, 힘 곡선은 한 스팟에서 100번 이상 기록하였고, 이렇게 기록된 적어도 5개 이상의 스팟을 조사하여 결합한 힘 곡선 및 비결합한 힘 곡선 모두를 기록하였다. 상기 말단이 실질적으로 이동한 거리를 계산하기 위해, 상기 캔틸레버 변위는 피에조(piezo) 변위를 뺀 다음, 캔틸레버 스프링 상수를 나누어 획득하였다.
7-3: 상보적인 30쌍의 DNA 염기서열에 의해 고정된 9-산/ GPDES 기질에 대한 비결합
AFM 힘 측정은 110 nm/s 내지 540 nm/s 사이에서 다양한 비율로 적재한 9-산/GPDES 서브스트레이트에 고정된 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드, 및 9-산/TPU AFM 말단에 고정된 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 실시예 3-2에 따라 측정하였고, 이때 비결합력 분포 (도 4a)를 관찰하기 위해서는 110 nm/s의 수축 비율에서 측정하였고, 힘 거리 곡선 (도 4b) 및 비결합력 분포 (도 4c)를 관찰하기 위해서는 540 nm/s의 수축 비율에서 측정하였다.
다중 결합 올리고뉴클레오타이드의 결합에 영향을 주는 보다 큰 비결합력을 관찰하기 위해 540 nm/s의 수축 비율에서 측정하였다 (도 4b). 또한, 막대그래프는 보다 광범위하며(최대 절반-폭이 15 pN임.) 미해결된 부분이다. 그러나, 110 nm/s 수축 비율에서 측정된 막대그패프 (도 4a)는 3개의 피크가 보였고, 각 피크는 날카로왔다 (제1피크에 대하여 최대 절반-폭이 3pN임.). 이것에 대한 정확한 해석은 명확하지는 않으나, 37 pN에서 나타나는 제1피크는 단일한 DNA-DNA 결합 (하기 참조)과 매우 유사하고, 및 다른 2개의 피크 (46 pN 및 55 pN)는 상기 단일 결합에 추가로 2차 결합이 발생한 비결합을 나타낸다.
도 4a는 상대적으로 좁은 스페이스 (GPDES 서브스트레이트상에서는 덴드론으로 이해됨)을 가진 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 힘 분포를 나타낸 막대그래프이고, 도 4b는 540 nm/s의 수축 속도에서 상보적인 30개의 염기쌍에 대한 단일 비결합력을 직접 측정한 것이다. 도 4b는 540 nm/s의 수축 속도를 가진 상보적인 30개의 염기쌍 사이에서 측정된 거리 곡선 대비 힘이다. 다중 올리고뉴클레오타이드의 결합에 영향을 주는 보다 큰 힘 (블루 곡선)은 540 nm/s 수축 비율 (비교하기 위해, 110 nm/s 수축 비율에서는 비결합력(레드 곡선)이 관찰됨.)이 관찰된다. 도 4c는 540 nm/s의 수축 속도를 가진 비결합력의 분포 양상을 나타낸 것이다. 상기 막대그래프는 상대적으로 좁은 스페이스 (GPDES 표면상에서는 덴드론으로 이해됨)에서 관찰된 힘 분포를 나타낸 것이다. 분포의 최대는 가우시안 피트인 68 + 13 pN이며, 상기 분폭 곡선이 단일 결합을 보여준다는 것은 확실지 않다.
7-4: 상보적인 30쌍의
DNA
염기서열에 의해 고정된 9-산/
TPU
기질에 대한 결합 및
비결합
AFM 힘 측정은 110 nm/s의 수축 비율에서 9-산/TPU 서브스트레이트에 고정된 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드, 및 9-산/TPU AFM 말단에 고정된 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 실시예 3-2에 따라 측정하였고, 이때 상기 측정은 비결합력 분포 (도 5a), 결합력 vs. 거리 곡선 (도 5b), 및 결합력 분포 곡선 (도 5c)을 관찰하기 위함이다.
상기 DNA가 9-산/TPU 표면에 고정되었을 때, 비결합력 막대그래프(도 5a)는 37 + 2 pN에서 단지 1개의 피크를 나타내었고, 피크의 좁아짐이 변하지 않았다. 46 pN 및 55 pN에서 마이너 피크의 소멸은 이러한 피크들이 2차 결합과 관련되어 발생되는 것을 의미한다. 상기 2가지 경우를 확인하기 위하여, 특이한 곡선을 제외한 90% 이상의 측정값을 상기 플롯에 포함시켰다. 9-산/GPDES 경우에 상기 곡선은 종종 만입되는 반면, 9-산/TPU 경우에 상기 곡선은 어떠한 만입도 발생하지 않았다. 그러므로, 상기 서브스트레이트 표면을 충분한 스페이스를 가진 실란제와 같은 TPU와 함께 변형하여 단일 DNA-DNA 결합을 측정하는 것은 가능하다.
상기 말단이 덴드론-변형된 표면에 도달했을 때 상기 결합력 곡선을 종종 볼 수 있다 (도 5b).
이러한 특이한 과정에서, 9-산/TPU-변형된 표면은 재차 단일-깊은 힘 곡선을 발생시키는 반면, 9-산/GPDES의 경우에는 이중-깊은 힘 곡선 또는 다중-깊은 힘 곡선을 종종 발생시켰다. 이러한 반응은 매우 일정하고 재현성있게 발생하기 때문에, 막대그래프를 만드는 경우 하나의 데이터도 버려져서는 않된다. 비결합 반응에 대한 막대그래프의 경우, 피크는 협소하고 (최대 절반-폭이 3 pN임.), 39 pN 값은 비결합 반응의 것과 매우 유사하다. 이러한 특이한 결합 과정이 DNA 사이의 스페이스가 적절하게 조절되었을 때 관찰될 수 있다는 것은 매우 흥미로운 일이다.
더욱이, 결합력 반응은 적재율에 따라 감소되었는데, 이는 70 nm/s 및 540 nm/s 사이의 모든 적재율에서 동일한 막대그래프(도 5c)가 얻어짐을 의미한다. 다른 말단 및 시료를 이용하여 여러 번 상기 실험을 반복하였고, 상기 결합 반응 및 막대그래프는 일정하게 얻어졌다.
7-5: 단일 가닥 결합을 조사하기 위한 27-산과
TPU
변형 서브스트레이트에 대한
비결합
이전에, 다른 상보적인 30개의 염기 DNA에 대한 48 pN의 비결합력은 보다 낮은 수축율에서조차 기록되었다 (T. Strunz, K. Oroszlan, R. Schafer, H.- J. Gutherodt, Pr oc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 96, 11211, 1999). 동일한 GC 함량을 가진 DNA가 보다 작은 비결합력을 나타내는지 관찰하는 것은 흥미로운 일이다. 이러한 반응이 단일 가닥 또는 다중 가닥에 의해 이루어지는지 확인하기 위하여, 보다 높은 세대 덴드론인 27-산을 이용하였다. 제3세대 덴드론은 10 nm 주위에 스페이스를 제공할 것으로 기대된다. 상기 기질상의 스페이스는 27-산과 TPU의 조합에 의해 증가되는 반면, AFM 말단은 9-산/TPU로 변형된다. 막대그래프가 상기 9-산/TPU 경우의 것과 정확히 일치하는 것은 매우 흥미로운 일이다. 상기 AFM 말단은 27-산/TPU로 변형되었고, 동일한 막대그래프가 다시 관찰되었다. 유일한 차이점은 비결합이 관찰되는 횟수가 감소한다는 것이다. 마지막에는, 약 50%의 수축이 비결합 현상에서 나타나지 않았다. 이러한 변화는 매우 타당한 것으로, 이는 올리고뉴클레오타이드 사이의 스페이스의 너무 큰 경우 혼성화되는 경우가 감소하기 때문이다. 이러한 반응은 9-산/TPU가 단일 가닥 결합을 인지하기에 충분히 크게 생성된 명백한 스페이스임을 보여준다.
7-6: 상보적인
DNA
이중 가닥에 대한 결합 및
비결합
다른 올리고뉴클레오타이드를 시험하기 전, 상기 조건에서 힘 측정의 정확도를 시험하였다. 다른 배치(batch)로부터 시료를 준비하였고, 캔틸레버의 눈금을 조절하였다. 본 발명자들은 상기 변화가 10-15% 이내임을 확인하였다. 상기 값은 재현적이면서 정확하게 상기 표면을 조절하여 최소 에러를 유발케하고; 스프링 상수와 관련된 에러를 결코 넘어서지 않는 것을 의미한다. 9-산/TPU-변형된 표면을 이용하여, 20, 30, 40, 및 50 염기쌍 (표 1)의 DNA 이중 가닥의 결합 및 비결합을 110 nm/s 적재율에서 측정하였다. 힘-거리 곡선은 접근 및 수축 사이클 동안 각 이중 가닥에서 얻어졌다.
상기에서 언급한 바와 같이, 결합 및 비결합 막대그래프는 거의 동일하며, 평균 힘의 값도 동일하다. 20, 30, 40, 및 50 염기쌍을 가진 상보적인 DNA 이중가닥의 결합력 막대그래프 및 비결합력 막대그래프를 각각 도 6a 및 도 6c에 나타내었다.
도 6a에 나타낸 막대그래프에서, DNA 길이를 가진 중첩되지 않은 피크, 및 분명한 증가가 관찰되었다. 20, 30, 40, 및 50 염기쌍에 대한 힘의 값은 29 pN, 39 pN5 50 pN, 및 59 pN이다. 상기 힘은 DNA 염기가 10개씩 증가와 동시에 10 pN씩 증가하였다. 이를 보다 명확하게 하기 위해, 비-상보적인 DNA 가닥의 힘을 측정하였다. 모든 경우에서 힘 곡선은 거의 검출되지 않았고, 검출되더라도 10 pN의 약한 힘이 기록되었다.
도 6b에서, 20, 30, 40, 및 50 염기쌍을 가진 상보적인 DNA 이중간닥의 힘-피에조 변위 곡선은 도 4의 결합력 분포를 계산하여 얻어졌다. 상기 관찰된 거리 즉, 결합 반응에 의한 변형을 줄이기 위하여 상기 표면쪽으로 이동된 상기 말단은 힘-피에조 변위 곡선으로 나타나며, 그 값은 플롯된다. 특별한 상황에서, 2.4 nm, 3.2 nm, 3.6 nm, 및 4.2 nm의 거리는 20-머(mer), 30-머, 40-머, 및 50-머와 같이 기록된다. 상기 피크는 매우 가늘며 그 거리는 DNA 길이에 따라 증가하기 때문에, 미확인 시료에 있는 결합 DNA 길이를 분석하기 위해서는 상기 변수가 진단되어야 한다.
7-7: 불일치된
DNA
이중 가닥에 대한 결합 분포
이러한 인지 현상 프로브를 더욱 조사하기 위해, 단일 염기 및 2개의 염기가 불일치된 염기쌍에 대한 결함 힘 곡선을 기록하였다 (표 1). AFM 힘 측정은 110 nm/s의 수축 비율에서 단일 염기가 불일치된 DNA에 대한 9-산/TPU 서브스트레이트에 고정된 서열번호 5 내지 8의 올리고뉴클레오타이드, 이중 염기가 불일치된 DNA에 대한 9-산/TPU 서브스트레이트에 고정된 서열번호 9 내지 12의 올리고뉴클레오타이드, 및 9-산/TPU AFM 말단에 고정된 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 실시예 3-2에 따라 측정하였고, 이때 상기 측정은 단일 염기가 불일치된 DNA 이중가닥에 대한 결합력 분포 (도 7), 및 이중 염기가 불일치된 DNA 이중가닥에 대한 결합력 (도 8)을 관찰하기 위함이다.
예상대로, 상기 불일치된 염기의 도입은 결합력 및 비결합력을 감소시켰다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 단일 염기가 불일치된 염기쌍에 있어서, 27 pN, 37 pN, 43 pN, 및 50 pN의 결합력은 각각 20-머(mer), 30-머, 40-머, 및 50-머로 관찰되었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 이중 염기가 불일치된 염기쌍에 있어서, 24 pN, 32 pN, 40 pN, 및 45 pN의 결합력은 각각 20-머(mer), 30-머, 40-머, 및 50-머로 관찰되었다.
상보적인 DNA 이중가닥에 대한 이전의 경우에서와 같이, 결합력 및 비결합력은 모두 동일하다. 그러나, 단일 염기가 불일치된 경우에 있어서, 상기 힘은 모두 20 머 및 30 머로 다소 감소하였다 (2 pN). 한편, 실질적인 감소 (> 7 pN)가 40 머 및 50 머에서 관찰되었다. 이러한 결과로부터, 40 머 길이 이상의 DNA는 단일 점 돌연변이를 검출하는데 높은 신뢰성을 보증할 수 있는 방법임을 알 수 있다. 예상대로, 힘의 보다 큰 감소가 이중 염기가 불일치된 염기쌍에서 관찰되었다. 예를 들어, 5 pN의 힘은 20 머에서 감소하였고, 반면 14 pN의 힘은 50 머에서 감소하였다. 단일 분자 단위에서 단일 염기 돌연변이를 검출하는 피코힘(picoforce) AFM의 가능성에 주목하는 것은 가치있는 일이다.
실시예
8: 신호전달
단백질들간의
생체분자 결합
이전의 연구에서는 덴드론-변형된 표면이 덴드론 분자의 크기를 조절함으로써 표면에 부착된 생체분자 사이에 충분한 스페이스를 확보할 수 있음을 보여주었다. 본 연구에서는 또한 이전에 발간된 논문 (Langmuir 2005, 21, 4257) 및 미국특허출원번호 10/917,601에 기재된 바와 같이, AFM 말단 및 Si 웨이퍼와 같은 고체 서브스트레이트를 관능화시켜 단일 분자 단위에서 단백질간의 인지 효율을 향상시켰다 (도 11). 본 발명에 사용되는 덴드론 분자는 이전의 것과 동일한 것이나 (Langmuir 2005, 21, 4257), 미국특허출원번호 10/917,601에 언급된 모든 덴드론 분자가 본 발명에 사용될 수 있는 것은 아니다.
보호기를 탈보호화시킨 후, 덴드론-변형된 서브스트레이트를 N-숙시니미딜-4-말레이미도부틸레이트 (GMBS)(16 mM)를 용해한 소량의 DMF가 포함된 50 mM NaHCO3 완충용액 (pH 8.5)과 반응시켰다. 실온에서 3시간 동안 반응시킨 후, 상기 서브스트레이트를 이온수로 깨끗하게 세척하였다. 상기 GMBS-코딩된 서브스트레이트를 글루타치온 (GSH)(16 mM)이 포함된 PBS 완충용액 (10 mM 인산 완충용액, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4)에 12시간 동안 침지시킨 다음, 이온수에서 3분 동안 초음파 처리하였다. 잔류된 활성 GMBS 관능기를 불활성화시키기 위하여 2-멀캡토에탄올 (1.6 M)이 포함된 PBS 완충용액에 침지시킨 후, 이온수에서 3분 동안 초음파 처리하였다.
또한, 상기 GSH-코팅된 서브스트레이트를 0.43 ㎍/ml GST-태깅된 PLDl-PX가 포함된 PBS 완충용액에서 4 ℃, 30분 동안 반응시킨 다음, PBST 완충용액 (10 mM 인산 완충용액, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 0.1 % tween 20, pH 7.4)으로 세척하였다. 최종적으로, 추가적인 실험을 위해 상기 GSH-코팅된 서브스트레이트를 4 ℃의 PBS 완충용액에 저장하였다. 실리콘 나이트라이드 (Si3N4) AFM 말단은 HNO3IH2O (3:1 (v/v)) 용액에 침지시켰고, 80 ℃에서 20분 동안 열처리한 다음 이온수로 세척하였다. 세척된 말단의 변형은 GST-태깅된 Munc-18-1가 도입된 것을 제외하고 Si 웨이퍼 서브스트레이트의 것과 동일하였다. 상기 GST-코팅된 말단을 0.97 ㎍/ml GST-태깅된 Munc-18-1이 포함된 PBS 완충용액에서 4 ℃, 30분 동안 반응시켰다. 최종 코딩된 말단은 PBST 완충용액으로 세척한 후, 추가적인 실험을 위해 4 ℃에 보관하였다.
Munc-18-1 및 PLDl-PX는 모두 신호전달 단백질이며, 뇌 세포의 세포질에 있는 Munc-18-1은 생체내에서 PLDl-PX의 PX 도메인을 통해 포스포리파아제 Dl (PLDl-PX)과 함께 복합체를 형성한다고 알려져 있다.
Munc-18-1로 코팅된 AFM 말단이 PLDl-PX로 코팅된 서브스트레이트에 가까이 접근하고 나서, 뒤로 후퇴할 때, 양쪽 단백질 사이에서의 결합력을 측정할 수 있다 (도 12). 측정된 결합력은 50 pN 주위에서 일정하며, 이는 본 발명에서 하나의 Munc-18-1 분자가 하나의 PLDl-PX 분자와 결합하고 있음을 의미한다 (도 14(a)). 더욱이, A-[9]-산 대신 A-[27]-산이 덴드론으로 사용되었을 때, 다중 분자에 대한 단일 결합 비율이 1.5:1에서 3:1까지 증가함을 관찰하였다. 이러한 결과는 보다 큰 크기의 생체분자는 특이적 단일 분자와의 결합을 위해 표면상에 이들간의 더 큰 스페이스를 필요로 하고, 이러한 필요는 크기-조절 가능한 덴드론 분자를 이용함으로써 쉽게 충족될 수 있음을 의미한다. 추가적인 연구 즉, 상기 측정된 힘이 비특이적인 결합이 아닌, Munc-18-1과 PLDl-PX의 특이적인 결합으로부터 기인된 것임을 증명하기 위해, 용액내에 과량의 비고정 Munc-18-1을 첨가하였고, 힘을 측정하는 동안 PLDI-PX의 결합 부위를 억제하였다 (도 13(a)). 그 결과, 상기 말단상에 있는 Munc- 18-1와 상기 서브스트레이트상에 있는 PLDl-PX와의 결합력은 관찰되지 않았다 (도 14(b)). 그러므로, 상기 결과들은 Munc-18-1은 일정한 힘을 가지면서 PLDl-PX에 특이적으로 결합하고, 덴드론-변형된 표면은 특이적 단일 생체분자와의 결합을 초래하는 표면상에 있는 생체분자간의 스페이스를 조절할 수 있음을 보여주고 있다.
실시예
9: 약물 스크리닝에 대한 3개의 다른
생체분자간의
결합 및 이의 적용
몇몇 인체 질병들은 인체내 단백질들간의 바람직하지 않은 결합으로부터 발생하고, 여러 약물 스크리닝 방법은 이러한 질병들에 대한 최상의 후보 약물을 찾기 위해 이용되어 왔다. 최근에, Bio-AFM 또한 약물 스크리닝 방법에 이용되고 있다. 이러한 방법은 후보 약물을 첨가하기 전과 후에 나타나는 2개의 다른 단백질들간의 결합력을 측정함으로써 약물의 효율성을 결정하였다. 또한, 인 시츄(in situ)내에서 약물 농도를 조절함으로써 의학적 치료를 위한 최적 약물 농도를 쉽게 탐지하는 것이 가능하다. 여기서, 본 발명자들은 덴드론-변형된 표면이 Bio-AFM과 함께 약물 스크리닝에 적용될 수 있음을 보여주었다.
본 연구에서는, 실시예 8에 기재된 바와 같이, Munc-18-1 및 PLDl-PX를 AFM 말단과 Si 웨이퍼와 같은 서브스트레이트상에 도입하였다. 후보 약물은 고체 서브스트레이트상에 있는 PLDl-PX에 결합하고, 상기 말단상에 있는 Munc-18-1과 경쟁적으로 작용하는 PLC-γ1이다 (도 13(b)). 여러 다른 농도의 PLC-γ1으로 시험한 결과, 고농도의 PLC-γ1은 PLDI-PX가 Munc-18-1에 결합하는 것을 완전히 막았으나, 저농도에서는 이러한 저해 효과가 나타나지 않았다 (도 15). 따라서, 이러한 연구는 PLC-γ1이 Munc-18-1의 경쟁자로서 작용하며, PLDl-PX와 Munc-18-1간의 결합력은 PLC-γ1의 농도에 의존적임을 보여준다. 그러므로, 이러한 Bio-AFM 분석은 약물 탐색 및 의학적 치료를 위한 연구에 폭넓게 적용될 수 있다.
실시예
10:
스트렙타비딘과
바이오틴간의
생체분자 결합
스트렙타비단과 바이오틴은 단순한 생체분자간의 결합 모델로서 폭넓게 이용되고 있다. 여기서는, Bio-AFM을 이용한 힘 측정 분야의 연구에서 이러한 단순한 모델을 적용하였다. 스트렙타비딘은 자체의 한 부위에 2개의 결합 부위를 가지고 있기 때문에, 하나의 스트렙타비딘과 하나의 바이오틴간의 결합력을 Bio-AFM으로 측정하여 입증하기는 어렵다. 그러나, 덴드론 분자를 이용하여 생체분자간의 스페이스를 조절함으로써, 보다 쉽게 상기 두 분자간의 결합력을 측정할 수 있다.
실시예 8에 기재된 바와 같이, AFM 말단과 Si 웨이퍼와 같은 고체 서브스트레이트는 덴드론 분자를 이용하여 관능화시켰다. DSC (디(N-숙시니미딜)카르보네이트) 링커 분자를 통해 스트렙타비딘은 상기 서브스트레이트상에 부착되었고, 바이오틴은 상기 말단에 부착되었다. 측정된 힘은 일정하며, 하나의 스트렙타비딘과 하나의 바이오틴간의 결합에 의해 나타나는 기존의 값과 거의 유사하다. 이러한 결과는 바이오틴 분자가 덴드론-변형된 표면상에서 단일 결합을 통해 스트레타비딘 분자에 특이적으로 결합하는 것을 보여준다. 또한, 다중 분자에 대한 단일 분자의 결합 비율이 A-[3]-산 보다는 A-[9]-산으로 코팅된 표면상에서 높게 관찰되었다. 즉, A-[3]-산은 그 크기가 작기 때문에, 표면상에서 상기 2개의 생체분자가 1:1로 결합하기에는 스페이스가 충분하지 않다. 따라서, 덴드론-변형된 표면은 표면상에서 생체분자간의 스페이스를 조절할 수 있기 때문에, 단일 생체분자간의 특이적인 결합을 관찰할 수 있다.
실시예
11:
펩타이드와
단백질간의
생체분자 결합을 통한 세포 표면상의 특이적인
리간드
맵핑(
mapping
)
세포 표면상에 있는 수용체와 리간드간의 결합은 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 깊이 연구되어져 왔으나, 이러한 방법은 세포상의 각각의 수용체를 나노미터 크기의 고해상도로 나타낼 수 없는 해결되지 않은 문제점을 가지고 있다. 최근에, Bio-AFM 장치는 이러한 한계를 극복하도록 제조되었다. 그러나, 이러한 방법은 또한 각 수용체를 개별적으로는 명확하게 보여줄 수 있으나, AFM 말단이 세포 표면에 비특이적으로 결합하고, 말단상의 리간드와 세포상의 수용체가 다중 결합을 한다는 점에서 문제점이 야기되었다. 이러한 문제점은 세포상의 수용체 분포에 대한 원치않는 정보를 줄 수 있다. 기존의 연구에서는 덴드론-변형된 표면이 생체분자와 비특이적 결합이 낮은 특징을 가지고 있으며, 표면상에 부착된 생체분자간의 스페이스를 충분히 제공함으로써 단일 생체분자간의 결합을 보증한다고 보고하였다. 그러므로, 덴드론-변형된 표면은 각각의 수용체가 Bio-AFM에 의해 고해상도로 분리되어 탐지되는 것을 도울 수 있다.
본 연구에서 사용된 RBL2H3 세포는 염증에 관여하는 FPRl (포르밀 펩타이드 수용체 1)를 과발현하는 세포이다. 상기 세포를 5 % CO2 조건하에 있는 DMEM (10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신) 배지에서 37℃, 48시간 동안 배양한 후, 5 x 104 세포/ml를 5% 마트리젤(matrigel) 용액으로 코딩된 커버 글라스상에 부착하였다. FPRI에 결합하는 리간드는 염증을 유발하는 6개의 아미노산으로 이루어진 합성 펩타이드이며, 하기와 같이 GMBS 링커 분자와 연결하기 위해 리간드 자체의 N 말단 부위에 시스테인을 가지고 있다. 또한, 상기 펩타이드는 N 말단에서의 아세틸화 반응과 C 말단에서의 아미드화 반응을 통해서 그 전하가 중성화되었다.
Ac
-
Cysteine
-
linker
-
WKYMVm
-
NH
2
실시예 8에 기재된 바와 같이, AFM 말단은 덴드론 분자를 이용하여 변형화시켰다. GMBS 및 펩타이드 리간드로 관능화시킨 후, 상기 말단은 세포의 특정 부위에 있는 수용체와 리간드간의 힘을 측정하는 세포 표면을 스캔하였다 (도 16(a)). 상기 실험은 Bio-AFM과 같은 나노 위저드®원자현미경 (JPK Instruments, Inc)을 이용하여 실온상태의 IX PBS 완충용액 (pH 7.4)내에서 실시하였다.
도 16은 일부 측정된 힘 그래프를 보여주는 것으로, 이때 청색 선(blue line)은 말단을 수축시키는 역방향 힘 곡선을 의미한다. 이러한 곡선으로부터, 각 힘은 계산될 수 있고, 최종적으로 세포상에 있는 수용체의 분포를 나타낼 수 있는 힘 지도를 제조하기 위하여 조합될 수 있다. 도 17은 FPRI와 이의 리간드 펩타이드간의 결합에 대한 힘 지도 및 힘 막대그래프를 보여주는 것이다. 밝은 픽셀은 상기 지도상의 강한 힘을 의미하며, 반면 어두운 픽셀은 약한 힘을 의미한다 (도 17 및 도 18). 2개의 뚜렷한 힘인 31 pN과 55 pN은 힘 막대그래프에서 관찰되었다 (도 17). 상기 측정된 힘이 명확하게 FPRI와 이의 리간드 펩타이드간의 특이적인 결합에 의해 유도되었는지 입증하기 위하여, 경쟁자인 비고정 WKYMVm 용액을 이용한 실험을 수행하였다 (도 18). 그 결과, 60 pN 정도의 힘이 비고정 펩타이드인 WKYMVm (서열번호 17)을 1시간 첨가하여 배양한 후 현저하게 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 60 pN 정도의 힘은 수용체와 리간드간의 특이적인 결합을 유도할 수 있으나, 30 pN 정도의 힘은 비특이적인 결합으로 인해 주위(주변) 힘을 의미한다.
실시예
12: 단백질과
당지질간의
생체분자 결합
콜레라 독소 B는 인간 내장 상피 세포의 표면에 존재하는 글리코리피드류, 강글리오사이드 GMI의 어느 하나에 선택적으로 결합하여 고통을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 여기서, 본 발명자들은 콜레라 독소 B, 이의 리간드를 이용하여 힘을 측정함으로써 세포 표면상에서 강글리오사이드 GMI의 분포를 조사하였다.
본 연구에서 사용된 세포는 강글리오사이드 GMI를 과발현하는 인간 상피 세포이다. 상기 세포를 5 % CO2 조건하에 있는 DMEM (10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신) 배지에서 37 ℃, 48시간 동안 배양한 후, 5 x 104 세포/ml를 5% 마트리젤 용액으로 코딩된 커버 글라스상에 부착하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, AFM 말단은 덴드론 분자를 이용하여 변형화시켰고, 보호기를 탈보호화시켰다. 링커 분자 및 콜레라 독소 B로 관능화시킨 후, 상기 말단은 세포의 특정 부위에 있는 수용체와 리간드간의 힘을 측정하는 세포 표면을 스캔하였다. 상기 실험은 Bio-AFM과 같은 나노 위저드®원자현미경 (JPK Instruments, Inc)을 이용하여 실온상태의 IX PBS 완충용액 (pH 7.4)내에서 실시하였다.
실시예
13: 렉틴과
당단백질간의
생체분자 결합
렉틴 단백질 중 하나인 콘카나발린(Concanavalin) A는 당단백질과의 결합력이 우수하기 때문에 당단백질을 연구하는 분야에서 다양하게 사용되고 있다. 여기서, 본 발명자들은 콘카나발린 A를 리간드로 이용하여, 상기 콘카나발린의 말단 부위에 있는 만노오즈(mannose)를 갖는 당단백질의 분포를 조사하였다.
본 연구에서 사용된 세포는 세포 표면에 당단백질을 가지고 있는 섬유아세포이다. 상기 세포를 5 % CO2 조건하에 있는 RPMI (10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신) 배지에서 37℃, 48시간 동안 배양한 후, 5 x 104 세포/ml를 5% 마트리젤 용액으로 코딩된 커버 글라스상에 부착하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, AFM 말단은 덴드론 분자를 이용하여 변형화시켰고, 보호기를 탈보호화시켰다. 링커 분자 및 콘카나발린 A로 관능화시킨 후, 상기 말단은 세포의 특정 부위에 있는 수용체와 리간드간의 힘을 측정하는 세포 표면을 스캔하였다. 상기 실험은 Bio-AFM과 같은 나노 위저드®원자현미경 (JPK Instruments, Inc)을 이용하여 실온상태의 IX PBS 완충용액 (pH 7.4)내에서 실시하였다.
실시예
14: 탄수화물과
당단백질간의
생체분자 결합
결핵균(Mycobacterium tuberculosis)은 폐의 상피 세포상에 있는 헤파린에 결합하는 HBHA(헤파린-결합 헤모글로빈 고착성)를 세포 표면에 가지고 있기 때문에 폐결핵증(pulmonary tuberculosis)을 유발한다. 여기서, 본 발명자들은 헤파린을 리간드로 이용하여, 상기 결핵균의 표면상에서 HBHA의 분포를 조사하였다.
본 연구에서 사용된 세포는 세포 표면에 HBHA를 가지고 있는 마이코박테리움 보비스(mycobacterium bovis) BCG 세포이다. 상기 세포를 5 % CO2 조건하에 있는 사우톤(Sauton) 배지에서 37 ℃, 48시간 동안 배양한 후, 5 x 104 세포/ml를 5% 마트리젤 용액으로 코딩된 커버 글라스상에 부착하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, AFM 말단은 덴드론 분자를 이용하여 변형화시켰고, 보호기를 탈보호화시켰다. 링커 분자 및 헤파린으로 관능화시킨 후, 상기 말단은 세포의 특정 부위에 있는 수용체와 리간드간의 힘을 측정하는 세포 표면을 스캔하였다. 상기 실험은 Bio-AFM과 같은 나노 위저드®원자현미경 (JPK Instruments, Inc)을 이용하여 실온상태의 IX PBS 완충용액 (pH 7.4)내에서 실시하였다.
실시예
15:
신경촉진인자(NGF)와
타이로신
키나아제
A간의 생체분자 결합
신경촉진인자(NGF)는 신경세포의 표면상에서 TrkA (타이로신 키나아제 A)와 결합하고, 이것의 생존 기능을 조절한다고 알려져 있다. 본 연구에서, 본 발명자들은 NGF를 리간드로 이용하여, 크롬친화성세포종(pheochromocytoma) PC 12 세포의 표면상에서 발현되는 HBHA의 분포를 조사하였다.
상기 세포를 5 % CO2 조건하에 있는 RPMI (5% FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신) 배지에서 37 ℃, 48시간 동안 배양한 후, 5 x 104 세포/ml를 5% 마트리젤 용액으로 코딩된 커버 글라스상에 부착하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, AFM 말단은 덴드론 분자를 이용하여 변형화시켰고, 보호기를 탈보호화시켰다. 링커 분자 및 리간드인 NGF로 관능화시킨 후, 상기 말단은 세포의 특정 부위에 있는 수용체와 리간드간의 힘을 측정하는 세포 표면을 스캔하였다. 상기 실험은 Bio-AFM과 같은 나노 위저드®원자현미경 (JPK Instruments, Inc)을 이용하여 실온상태의 IX PBS 완충용액 (pH 7.4)내에서 실시하였다.
본 발명은 구체적인 실시예에 의하여 설명되고 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 하기 청구항의 보호범위에 포함되는 모든 변형과 유사한 장치를 모두 포함하려는 의도로서 이해되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (25)
- 고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가진 캔틸레버 본체를 포함하며,
상기 비고정 말단은 다수 개의 덴드론 각각의 분지 부위에 있는 다수의 말단과의 결합에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지고,
상기 다수 개의 덴드론은 각 덴드론의 관능기화된 선형 부위 말단의 관능기 사이에 약 1 nm 내지 약 100 nm의 규칙적인 간격으로 분포하며
상기 다수 개의 덴드론은 각각 독립적으로 A-[9]-산((9-안트릴메틸 N-({[트리스({2-[({트리스[(2- 카르복시에톡시)메틸]메틸}아미노)카르보닐]에톡시}메틸)메틸]아미노}카르보닐)프로필카바메이트) 또는 하기 화학식으로 표현되는 A-[27]-산인,
원자현미경(ATM)용 캔틸레버.
[화학식]
- 제1항에 있어서, 상기 덴드론은 약 10 nm의 규칙적인 간격으로 분포하는 것인, 캔틸레버.
- 제1항에 있어서, 상기 분지 부위에 있는 다수의 말단은 각각 독립적으로 -COZ, -NHR, -OR', 또는 -PR"3으로 관능화되어 있는 것으로, 이때 Z는 이탈기이고, R은 알킬이고, R'은 알킬, 아릴, 또는 에테르이고, 및 R"는 수소, 알킬, 또는 알콕시인 것인, 캔틸레버.
- 제3항에 있어서, COZ 그룹은 산, 에스테르, 활성화된 에스테르, 산할리드, 활성화된 아미드, 또는 CO-이미다조일인 것인, 캔틸레버.
- 제1항에 있어서, 상기 선형 부위는 스페이서 부위를 포함하는 것인, 캔틸레버.
- 제5항에 있어서, 상기 스페이서 부위는 제1관능기를 통하여 분지된 부위에 연결되어 있는 것인, 캔틸레버.
- 제6항에 있어서, 상기 제1관능기는 -NH2, -OH, -PH3, -COOH, -CHO 또는 -SH인 것인, 캔틸레버.
- 제6항에 있어서, 상기 스페이서 부위는 상기 제1관능기에 공유적으로 결합된 링커 부위를 포함하는 것인, 캔틸레버.
- 제8항에 있어서, 상기 링커 부위는 치환되거나 치환되지 않은 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 아릴기, 에테르기, 폴리에테르기, 에스테르기, 또는 아미노알킬기를 포함하는 것인, 캔틸레버.
- 제5항에 있어서, 상기 스페이서 부위는 제2관능기를 포함하는 것인, 캔틸레버.
- 제10항에 있어서, 상기 제2관능기는 -NH2, -OH, -PH3, -COOH, -CHO 또는 SH인 것인, 캔틸레버.
- 제10항에 있어서, 제2관능기는 상기 선형 부위의 말단에 위치하는 것인, 캔틸레버.
- 제1항에 있어서, 상기 선형 부위 말단의 관능기는 보호기가 결합되어 있는 것인, 캔틸레버.
- 제13항에 있어서, 상기 보호기는 산 반응성 물질 또는 염기 반응성 물질인 것인, 캔틸레버.
- 제1항에 있어서, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단에 프로브 뉴클레오타이드 또는 리간드가 결합되어 있는 것인, 캔틸레버.
- 제15항에 있어서, 상기 프로브 뉴클레오타이드 또는 리간드는 약 0.01 프로브/nm2 내지 약 0.5 프로브/nm2 범위의 저밀도인 것인, 캔틸레버.
- 제15항에 있어서, 상기 프로브 뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 올리고뉴클레오타이드, cDNA, 뉴클레오타이드 유사체(analog) 또는 이들의 혼합물인 것인, 캔틸레버.
- 제15항에 있어서, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단에 결합되어 있는 프로브 뉴클레오타이드간의 거리는 약 0.1 내지 약 100 nm인 것인, 캔틸레버.
- 제1항에 따른 캔틸레버를 제조하는 방법으로서,
(i) 다수 개의 덴드론의 말단과 반응할 수 있도록 캔틸레버의 비고정 말단의 표면 부위를 관능화시키는 단계; 및
(ii) 상기 표면 부위가 관능화된 캔틸레버의 비고정 말단을 다수 개의 덴드론을 포함하는 용액에 침지시켜 캔틸레버의 관능화된 표면에 다수 개의 덴드론의 분지 부위의 말단을 접촉시키는 단계를 포함하는, 제조 방법. - 프로브 뉴클레오타이드와 표적 뉴클레오타이드간의 결합을 측정하기 위한 장치로서,
고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가지며, 상기 비고정 말단은 다수 개의 덴드론 각각의 분지 부위에 있는 다수의 말단과의 결합에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지며, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단은 프로브 뉴클레오타이드에 결합되는, 제1항에 따른 캔틸레버;
표적 뉴클레오타이드가 고정되는 서브스트레이트;
상기 변형된 표면 부위상에 고정된 프로브 뉴클레오타이드와 서브스트레이트상에 고정된 표적 뉴클레오타이드가 결합할 수 있도록 상기 캔틸레버 및 표적 뉴클레오타이드 서브스트레이트의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 조절자; 및
상기 프로브 뉴클레오타이드와 상기 표적 뉴클레오타이드 결합에 관련된 물리적 변수를 측정하기 위한 검출자를 포함하는, 원자현미경(AFM)인 장치. - 프로브 뉴클레오타이드와 상호작용하는 표적 뉴클레오타이드를 분석하는 방법으로서,
(a) 고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가지며, 상기 비고정 말단은 다수 개의 덴드론 각각의 분지 부위에 있는 다수의 말단과의 결합에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지며, 상기 덴드론의 분지 부위에 있는 다수의 말단은 상기 표면에 결합되고, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단은 프로브 뉴클레오타이드에 결합되는, 제1항에 따른 캔틸레버를 제공하는 단계:
(b) 표적 뉴클레오타이드를 서브스트레이트상에 고정시키는 단계;
(c) 프로브 뉴클레오타이드를 고정시키기 위하여 덴드론에 의해 변형된 상기 캔틸레버의 표면 부위를 화학적으로 변형시키는 단계;
(d) 상기 덴드론-변형된 표면상에 고정된 프로브 뉴클레오타이드와 시료 지지체의 서브스트레이트상에 고정된 표적 뉴클레오타이드가 상호작용할 수 있도록 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 조절자를 포함하는 장치에, 상기 서브스트레이트와 캔틸레버를 연결하는 단계;
(e) 상기 프로브 뉴클레오타이드와 상기 표적 뉴클레오타이드가 상호작용할 수 있도록 상기 캔틸레버 및 서브스트레이트의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 단계; 및
(f) 상기 프로브 뉴클레오타이드와 상기 표적 뉴클레오타이드의 상호작용에 관련된 물리적 변수를 측정하는 단계를 포함하는, 프로브 뉴클레오타이드와 상호작용하는 표적 뉴클레오타이드를 분석하는 방법. - 제21항에 있어서, 상기 프로브 뉴클레오타이드는 단일 가닥의 DNA 또는 RNA이고, 표적 뉴클레오타이드는 상보적인 가닥의 DNA 또는 RNA이거나 염기가 불일치된 가닥의 DNA 또는 RNA인 것인, 방법.
- 제21항에 있어서, 단계 (b)의 서브스트레이트는 그 위에 표적 뉴클레오타이드를 고정시키기 위하여 덴드론에 의해 화학적으로 변형화시킨 것인, 방법.
- 리간드와 표적 수용체간의 결합을 측정하기 위한 장치로서,
고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가지며, 상기 비고정 말단은 다수 개의 덴드론 각각의 분지 부위에 있는 다수의 말단과의 결합에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지며, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단이 리간드에 결합되는, 제1항에 따른 캔틸레버:
표적 수용체가 고정화되는 서브스트레이트;
상기 덴드론에 의해 변형된 캔틸레버의 표면 부위상에 고정된 리간드와 서브스트레이트상에 고정된 표적 수용체가 결합할 수 있도록 상기 캔틸레버 및 표적 수용체 서브스트레이트의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 조절자; 및
상기 리간드와 상기 표적 수용체간의 결합에 관련된 물리적 변수를 측정하기 위한 검출자를 포함하는, 원자현미경(AFM)인 장치. - 리간드와 상호작용하는 표적 수용체를 분석하는 방법으로서,
(a) 고정 말단(fixed end)과 비고정 말단(free end)을 가지며, 상기 비고정 말단은 다수 개의 덴드론 각각의 분지 부위에 있는 다수의 말단과의 결합에 의해 화학적으로 변형된 표면을 가지며, 상기 덴드론의 분지 부위에 있는 다수의 말단은 상기 표면에 결합되고, 상기 덴드론의 선형 부위의 말단이 리간드에 결합되는, 제1항에 따른 캔틸레버를 제공하는 단계:
(b) 표적 수용체를 서브스트레이트상에 고정시키는 단계;
(c) 리간드를 고정시키기 위하여 덴드론에 의해 변형된 상기 캔틸레버의 표면 부위를 화학적으로 변형시키는 단계;
(d) 상기 덴드론-변형된 표면상에 고정된 리간드와 시료 지지체의 서브스트레이트상에 고정된 표적 수용체가 상호작용할 수 있도록 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버를 상기 서브스트레이트 및 캔틸레버의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 조절자를 포함하는 장치에 연결하는 단계;
(e) 상기 리간드와 상기 표적 수용체가 상호작용할 수 있도록 상기 캔틸레버 및 서브스트레이트의 상대적 위치 및 방향을 조절하는 단계; 및
(f) 상기 리간드와 상기 표적 수용체간의 상호작용에 관련된 물리적 변수를 측정하는 단계를 포함하는, 리간드와 상호작용하는 표적 수용체를 분석하는 방법.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US70789205P | 2005-08-12 | 2005-08-12 | |
US60/707,892 | 2005-08-12 | ||
US81760806P | 2006-06-28 | 2006-06-28 | |
US60/817,608 | 2006-06-28 | ||
PCT/IB2006/004135 WO2007135483A2 (en) | 2005-08-12 | 2006-08-14 | Biomolecule interaction using atomic force microscope |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020087006105A Division KR101069898B1 (ko) | 2005-08-12 | 2006-08-14 | 원자현미경을 이용한 생체분자간 결합 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20110028565A KR20110028565A (ko) | 2011-03-18 |
KR101069899B1 true KR101069899B1 (ko) | 2011-10-05 |
Family
ID=38723659
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020087006105A KR101069898B1 (ko) | 2005-08-12 | 2006-08-14 | 원자현미경을 이용한 생체분자간 결합 |
KR1020117005477A KR101069899B1 (ko) | 2005-08-12 | 2006-08-14 | 원자현미경을 이용한 생체분자간 결합 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020087006105A KR101069898B1 (ko) | 2005-08-12 | 2006-08-14 | 원자현미경을 이용한 생체분자간 결합 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070128623A1 (ko) |
EP (1) | EP1920249A4 (ko) |
JP (1) | JP4753392B2 (ko) |
KR (2) | KR101069898B1 (ko) |
CN (1) | CN101322030B (ko) |
WO (1) | WO2007135483A2 (ko) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7745206B2 (en) * | 2007-01-29 | 2010-06-29 | Arizona State University | AFM for simultaneous recognition of multiple factors |
WO2009109809A2 (en) * | 2007-06-14 | 2009-09-11 | Postech Academy-Industry Foundation | Atomic force microscope as an analyzing tool for biochip |
US8975215B2 (en) * | 2007-09-17 | 2015-03-10 | Postech Foundation | Methods for producing surface bound oligonucleotide on solid substrate and uses thereof |
US20110160088A1 (en) * | 2007-09-17 | 2011-06-30 | Joon Won Park | Solid Substrates With Surface Bound Molecules and Methods For Producing and Using the Same |
EP2053400A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-29 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Method and system for detection of a selected type of molecules in a sample |
KR20120119909A (ko) * | 2009-11-16 | 2012-10-31 | 포항공과대학교 산학협력단 | 고체 기판 상에서 표면 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법 및 이의 용도 |
KR101293968B1 (ko) * | 2012-05-30 | 2013-08-07 | 고려대학교 산학협력단 | 은 이온 검출용 올리고뉴클레오티드 고정 마이크로 오실레이터 및 이의 공진을 이용한 은 이온 검출방법 |
US20130344500A1 (en) * | 2012-06-20 | 2013-12-26 | Aratome, LLC | Tissue adhesive substrates |
CN102749441B (zh) * | 2012-07-05 | 2013-09-25 | 中国科学院物理研究所 | 成像磁镊装置及其与单分子荧光技术集成的***和方法 |
KR101355019B1 (ko) * | 2013-03-04 | 2014-01-27 | 한국과학기술연구원 | 원자력 현미경용 캔틸레버 센서 및 이의 제조방법 |
CN103558367B (zh) * | 2013-11-19 | 2014-07-30 | 长春理工大学 | 生理条件下用纳米电极阵列测量生物细胞电特性的***及方法 |
CN104991090B (zh) * | 2015-07-01 | 2016-08-17 | 青岛大学 | 一种原子力显微镜检测单分子水平分子间相互作用的方法 |
BR112020015521A2 (pt) * | 2018-11-01 | 2021-03-30 | Nb Postech | Membrana de nitrocelulose compre¬endendo molé-cula orgânica nanoestruturada acopla¬da não co-valentemente |
CN110736858B (zh) * | 2019-10-23 | 2020-06-30 | 中南大学 | 一种氧化矿物捕收剂afm测定探针及其制备和应用方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5763768A (en) | 1997-03-17 | 1998-06-09 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Analytical method using modified scanning probes |
US6436647B1 (en) | 1997-06-16 | 2002-08-20 | Affymetrix, Inc. | Method for detecting chemical interactions between naturally occurring biological analyte molecules that are non-identical binding partners |
US20040009308A1 (en) | 2002-04-12 | 2004-01-15 | Rudiger Schlaf | Method of producing a branched carbon nanotube for use with an atomic force microscope |
US20040213910A1 (en) | 2002-12-20 | 2004-10-28 | University Of Houston | Modification of silicon-containing scanning probe microscopy tips and growth of oligo-or poly (ethylene glycol) films on silicon surfaces through formation of Si-C bonds |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6545492B1 (en) * | 1999-09-20 | 2003-04-08 | Europaisches Laboratorium Fur Molekularbiologie (Embl) | Multiple local probe measuring device and method |
EP1233259A4 (en) * | 2000-09-21 | 2005-06-22 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | SENSOR MICROSCOPE-PROBE PROBE, PROCESS FOR PRODUCING SAME, SCANNING MICROSCOPE PROBE HAVING SAME, AND POLYMER PROCESSING METHOD USING SAME MICROSCOPE |
KR100379720B1 (ko) * | 2000-10-14 | 2003-04-11 | 주식회사 마크로젠 | 덴드리머 단일층 지지체 및 그의 제조방법 |
US6987277B2 (en) * | 2003-10-10 | 2006-01-17 | Zyvex Corporation | Systems and method for picking and placing of nanoscale objects utilizing differences in chemical and physical binding forces |
JP4213577B2 (ja) * | 2003-12-05 | 2009-01-21 | 独立行政法人科学技術振興機構 | グラフト重合鎖固定基材、グラフト重合鎖固定基材の製造方法及び測定方法 |
JP2005283405A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Canon Inc | 走査型プローブ顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡用探針とそれらを用いた生体関連物質の検出方法 |
WO2006016787A1 (en) * | 2004-08-12 | 2006-02-16 | Postech Foundation | Cantilever for atomic force microscope, and method of measuring biomolecule interaction using the same |
-
2006
- 2006-08-14 WO PCT/IB2006/004135 patent/WO2007135483A2/en active Application Filing
- 2006-08-14 KR KR1020087006105A patent/KR101069898B1/ko active IP Right Grant
- 2006-08-14 US US11/464,481 patent/US20070128623A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-14 KR KR1020117005477A patent/KR101069899B1/ko active IP Right Grant
- 2006-08-14 JP JP2008525665A patent/JP4753392B2/ja active Active
- 2006-08-14 CN CN2006800367067A patent/CN101322030B/zh active Active
- 2006-08-14 EP EP06851236A patent/EP1920249A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5763768A (en) | 1997-03-17 | 1998-06-09 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Analytical method using modified scanning probes |
US6436647B1 (en) | 1997-06-16 | 2002-08-20 | Affymetrix, Inc. | Method for detecting chemical interactions between naturally occurring biological analyte molecules that are non-identical binding partners |
US20040009308A1 (en) | 2002-04-12 | 2004-01-15 | Rudiger Schlaf | Method of producing a branched carbon nanotube for use with an atomic force microscope |
US20040213910A1 (en) | 2002-12-20 | 2004-10-28 | University Of Houston | Modification of silicon-containing scanning probe microscopy tips and growth of oligo-or poly (ethylene glycol) films on silicon surfaces through formation of Si-C bonds |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101069898B1 (ko) | 2011-10-05 |
JP4753392B2 (ja) | 2011-08-24 |
WO2007135483A3 (en) | 2008-03-06 |
KR20080052587A (ko) | 2008-06-11 |
US20070128623A1 (en) | 2007-06-07 |
KR20110028565A (ko) | 2011-03-18 |
EP1920249A4 (en) | 2012-01-04 |
CN101322030B (zh) | 2013-06-19 |
EP1920249A2 (en) | 2008-05-14 |
CN101322030A (zh) | 2008-12-10 |
JP2009505057A (ja) | 2009-02-05 |
WO2007135483A2 (en) | 2007-11-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101069899B1 (ko) | 원자현미경을 이용한 생체분자간 결합 | |
US20110160088A1 (en) | Solid Substrates With Surface Bound Molecules and Methods For Producing and Using the Same | |
EP1543328B1 (en) | Detecting molecular binding by monitoring feedback controlled cantilever deflections | |
EP2164986A2 (en) | Atomic force microscope as an analyzing tool for biochip | |
US20100093553A1 (en) | Solid Substrate Comprising Array of Dendrons and Methods for Using the Same | |
US9175335B2 (en) | Biomolecule interaction using atomic force microscope | |
JP4499727B2 (ja) | サブストレート、製造方法、診断システム及び検出方法 | |
WO2006016787A1 (en) | Cantilever for atomic force microscope, and method of measuring biomolecule interaction using the same | |
US20070082352A1 (en) | Microscopy tip | |
US8647823B2 (en) | Polynucleotide synthesis on a modified surface | |
US8975215B2 (en) | Methods for producing surface bound oligonucleotide on solid substrate and uses thereof | |
Kim et al. | Immobilizing a single DNA molecule at the apex of AFM tips through picking and ligation | |
US9671396B2 (en) | Solid substrate comprising array of dendrons and methods for using the same | |
US20090258367A1 (en) | METHOD OF MAPPING OF mRNA DISTRIBUTION WITH ATOMIC FORCE MICROSCOPY | |
Eyleen et al. | Sensing immobilized molecules of streptavidin on a silicon surface by maldi-tof mass spectrometry and fluorescence microscopy | |
KR20120119909A (ko) | 고체 기판 상에서 표면 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법 및 이의 용도 | |
JP2010151828A (ja) | サブストレート、製造方法、診断システム及び検出方法 | |
MALDI-TOF | EYLEEN ARAYA*, MARCELO J. KOGAN2, ALEIX G. GUELL3, CARLOS A. ESCOBAR1, FAUSTO SANZ | |
Longo¹ et al. | AN AFM INVESTIGATION OF OLIGONUCLEOTIDES ANCHORED ON AN UNOXIDIZED CRYSTALLINE SILICON SURFACE |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A107 | Divisional application of patent | ||
A201 | Request for examination | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140925 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150902 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160901 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170810 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190910 Year of fee payment: 9 |