CN101322030A

CN101322030A - 利用原子力显微镜的生物分子相互作用

Info

Publication number: CN101322030A
Application number: CNA2006800367067A
Authority: CN
Inventors: 朴准远; 郑瑜; 洪凤振; 金镒弘; 朴振圭; 柳成浩; 李惠映
Original assignee: Posco Co Ltd; Pohang University of Science and Technology Foundation POSTECH
Current assignee: Pohang University of Science and Technology Foundation POSTECH; Posco Holdings Inc
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2006-08-14
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2026-08-14
Also published as: KR101069898B1; JP4753392B2; WO2007135483A3; KR101069899B1; KR20080052587A; US20070128623A1; KR20110028565A; EP1920249A4; CN101322030B; EP1920249A2; JP2009505057A; WO2007135483A2

Abstract

本发明申请描述了一种用于原子力显微镜(AFM)的悬臂，包括具有固定端和自由端的悬臂体，所述自由端具有被树枝状大分子化学修饰的表面区域，其中所述树枝状大分子的分支区的多个末端均结合于该表面，并且树枝状大分子的线性区的末端被功能化。

Description

利用原子力显微镜的生物分子相互作用

相关申请

本申请要求2005年8月12日提交的第60/707,892号美国临时专利申请和2006年6月28日提交的第60/817,608号美国临时专利申请的优选权，其全部内容均以引用的方式结合于此。

技术领域

本发明主要涉及原子力显微镜(AFM)、用于AFM的悬臂以及利用原子力显微镜测量生物分子之间的分子间相互作用的设备和方法。本发明涉及树枝状大分子涂布的Bio-AFM针尖在测定生物分子之间相互作用时的用途。本发明还提供了通过利用具有可控中间间隔的表面进行细胞受体的Bio-AFM(生物原子力显微镜)作用力作图的细节。

背景技术

在后基因组时代，为了药物发现以及疾病诊断和预防的目的，对基因组的定量和全面研究是快速成长的研究和发展领域。这些方面的发展已经形成了对具有高度敏感性和优良特异性的先进的生物分子识别探针的强烈需求(K.Wang et al.Anal.Chem.76，57212004)。

在多种生物分子识别研究中，理解互补DNA链的机械稳定性(或识别特性)对于深入理解多个重要的生物过程例如DNA转录、基因表达和调节以及DNA复制都很关键。在这个方面，已经利用多种技术例如光镊子、微吸量管抽吸和AFM等研究了拉伸和力诱导的DNA解链(H.Clausen-Schaumann，M.Seitz，R.Krautbauer，H.E.Gaub，Curr.Opin.Chem.Biol.4，524，2000；R.Merkel，PhysicsReports 346，343，2001；G.U.Lee，L.A.Chris，R.J.Colton，Science266，771，1994)。

由于能够在几皮牛顿力之下，以较小的长度尺度和较高的敏感性测定单个分子之间的特异性相互作用，AFM正成为一个快速发展的技术，用于在分子水平探测亲和力和识别性能(R.Krautbauer，M.Rief，H.E.Gaub，Nano Lett.3，493，2003)。相比于其他用于力测定的敏感方法，AFM具有较高力分辨率和较高空间分辨率的优势，且可在生理条件下操作，用于研究生物过程中的特异相互作用，例如静电相互作用(J.Wang，A.J.Bard，Anal.Chem.73，2207，2001)、配体-受体结合(S.M.Rigby-Singleton et al.，J.Chem.Soc.，PerkinTrans.2 1722，2002)、抗原-抗体相互作用(F.Schwesinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，9972，2000)、核酸适体-蛋白相互作用(C.Bai et al.，Anal.Chem.75，2112，2003)、蛋白质折叠/去折叠(P.M.Williams et al.，Nature 422，446，2003；M.S.Z.Kellermayer，S.B.Smith，H.L.Granzier，C.Bustamante，Science 276，1112，1997)、细胞-细胞黏附(M.Benoit，D.Gabriel，G.Gerisch，H.E.Gaub，Nature CellBiol.2，313，2000)以及DNA-DNA杂交(C.W.Frank，Biophy.J.76，2922，1999)。

尽管实施了多个对互补DNA链之间的解链力测定的研究(H.Clausen-Schaumann，M.Seitz，R.Krautbauer，H.E.Gaub，Curr..Opin.Chem.Biol.4，524，2000；R，Merkel，Physics Reports 346，343，2001；G.U.Lee，L.A.Chris，R.J.Colton，Science 266，771.1994；R.Krautbauer，M.Rief，H.E.Gaub，Nano Lett.3，493，2003)，在单分子水平的研究过程中，DNA链之间的识别依然存在问题。通常的固定途径经受多点相互作用，分辨出单分子相互作用尚不是一个容易的任务。为了避免不需要的相互作用，可通过与惰性的表面活性剂混合而降低表面密度，但该途径导致较低的识别效率，从而得到可靠性较低的分析。因此，通常用于这种固定所使用的表面化学例如氧化物-硅烷和金-硫醇化学(T.Hugel，M.Seitz，Macromol.Rapid.Commun.22，989，2001；W.K.Zhang，X.Zhang，Prog.Polym.Sci.28，1271，2003)尚未优化为可纠正在利用AFM的力测定过程中单个DNA-DNA相互作用中的无价值基础信息。

传统上，原子力显微镜在理解生物体内存在的生物分子之间的多种相互作用机制中发挥重要作用。尽管其能够分析相互作用力，随着在分子水平上开展了越来越多的研究，预期未来其在纳米和生物技术领域内的重要性将会增加。

利用该技术的优势，已经努力研究不同表面上生物分子之间的相互作用机制。然而，与液体不同，观察表面上的生物材料产生了独特的问题，例如不随意吸收和空间位阻。在解决这种问题所采取的多种措施中，最常用的措施涉及到通过将复合自组装膜涂布于表面上而测定单分子相互作用。当用AFM观察两个生物分子之间的单一相互作用力时，遇到了两个问题。第一个问题涉及表面上生物分子活性与机体内部相比的差异。第二个问题围绕这样一个事实，即在这种情况下不能保证单分子相互作用。先前的研究表明两个问题均可利用自组装膜技术和中间间隔控制技术得到解决(Langmuir2005，21，4257，WO 2006/016787)。所述技术涉及通过限制官能团(其上可引入所述分子)的数目而控制生物分子的间隔和数目，从而在单分子水平上观察分子间相互作用。该方法最常见的问题涉及导致相分离的相同官能团的分子之间的非期望的吸引。此外，没有具体的证据表明生物分子彼此之间是平均间隔的。

利用Bio-AFM技术的生物分子研究的重要性正在迅速增长，Bio-AFM能够在支持生物活性的液体环境中观察非传导性物质例如纳米水平的生物分子的能力，已经使Bio-AFM成为一种研究生物分子的结构和亚结构的重要工具。此外，Bio-AFM使得可以通过它的Bio-AFM针尖近距离观察分子相互作用，生物分子可加载于所述针尖上。重要的应用包括观察互补DNA分子之间的相互作用、蛋白质之间的相互作用、配体-受体相互作用，后者在研究对药物的免疫反应中具有显著意义。在单分子水平上研究生物分子之间的相互作用力时，高敏感性是最重要的。单分子观察可以通过诸如Bio-AFM、光镊子和磁镊子等方法实现。每一种方法均有其缺点，例如磁镊子方法缺乏准确性，光镊子方法则可招致对分子的潜在损伤。

为了利用Bio-AFM研究配体-受体机制，需要将配体加载于所述针尖的顶端。通常这可利用生物素-抗生物素蛋白链菌素相互作用或利用复合自组装膜而实现。然而，这些方法不能直接控制分子距离，而且可引起配体在某个区域聚集，使得准确观察配体-受体相互作用比较困难。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于原子力显微镜(AFM)的悬臂，所述原子力显微镜包括具有固定端和自由端的悬臂体，所述自由端具有的表面区域可用树枝状大分子进行化学修饰，其中所述树枝状大分子分支区的多个末端均结合于该表面，树枝状大分子的线性区的末端被功能化。

本发明的另一个目的是提供用于AFM的悬臂，其中在线性官能团之间，所述树枝状大分子以约0.1nm和约100nm之间的固定间隔隔开。尤其是，所述树枝状大分子以约10nm的固定间隔隔开。

本发明的进一步目的是提供用于制造悬臂的方法，包括(i)功能化所述悬臂的表面区，使得其可与树枝状大分子的末端反应；以及(ii)将树枝状大分子接触表面区使得该末端与表面形成键。

本发明的一个目的是提供用于制造悬臂的方法，其中探针核苷酸、用于受体的配体或连接于所述探针核苷酸或配体的连接分子固定于树枝状大分子线性区的末端，包括以下步骤i)从表面区域上所述树枝状大分子线性区的末端去除保护基团；以及ii)使探针核苷酸、配体或连接于所述探针核苷酸或配体的连接分子接触支持物(substrate)枝状大分子线性区的末端，从而使所述探针核苷酸、配体或连接分子与所述末端成键，其中所述连接分子是同-双功能或异-双功能连接子。

本发明还提供一种用于通过原子力显微镜测定一个探针核苷酸或配体与一个靶核苷酸或配体结合伴侣例如其受体之间的相互作用的设备，所述设备包括：

具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端具有被树枝状大分子化学修饰的表面区，其中所述树枝状大分子的分支区的多个末端结合于该表面，树枝状大分子的线性区的末端连接于所述探针核苷酸或配体。

支持物，靶核苷酸或配体结合伴侣被固定在支持物上。

控制器，用于调节悬臂和支持物上的靶核苷酸或配体结合伴侣的相对位置和方向，以引起固定于悬臂树枝状大分子修饰的表面区上的探针核苷酸或配体与固定于支持物上的靶核苷酸或配体结合伴侣之间的相互作用；以及

检测器，用于测定与探针核苷酸或配体和样本核苷酸或配体结合伴侣之间的相互作用相关的物理参数。

在一个具体实施方式中，由靶核苷酸或配体结合伴侣固定的支持物可采取本领域中任何一种表面修饰的方法。优选地，所述支持物具有一个树枝状大分子修饰的表面。

本发明的另一个目的是提供分析与探针核苷酸或配体相互作用的靶核苷酸或配体结合伴侣的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端具有被树枝状大分子化学修饰的表面区，其中所述树枝状大分子的分支区的多个末端均结合于该表面，以及支持物；

(b)化学修饰所述支持物，以在其上固定靶核苷酸或配体结合伴侣；

(c)化学修饰树枝状大分子修饰的悬臂表面区，以固定探针核苷酸或配体；

(d)将支持物和悬臂连接于包含控制器的设备，所述控制器用于调节支持物和悬臂的相对位置和方向，以引起固定于树枝状大分子修饰的悬臂表面区上的探针核苷酸或配体与固定于样品支持部件的支持物上的靶核苷酸或配体结合伴侣之间的相互作用；

(e)控制悬臂和支持物的相对位置和方向，以引起探针核苷酸或配体与靶核苷酸或配体结合伴侣之间的相互作用；以及

(f)测定与探针核苷酸或配体和靶核苷酸或配体结合伴侣之间相互作用相关的物理参数。

上文中，分支区的末端用-COZ、-NHR、-OR’或-PR”3进行功能化处理，其中Z可以是离去基团，其中R可以是烷基、其中R’可以是烷基、芳香基或醚，R”是H、烷基、烷氧基或O。尤其是，COZ是酯、活化酯、酸性卤化物、活化酰胺或CO-咪唑基(imidazoyl)；R可以为C1-C4烷基，R’可以为C1-C4烷基。此外，在上述支持物中，所述聚合物可以为树枝状大分子。更进一步，所述聚合物的线性区可以包括一个间隔区。而且所述间隔区可以通过第一官能团连接于分支区。这种第一官能团不限于-NH₂、-OH、-PH₃、-COOH、-CHO或-SH。此外，所述间隔区可包括共价结合于所述第一官能团的连接区。

在所述支持物和AFM悬臂中，优选AFM针尖，所述连接区可包括取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷、芳香基、醚、聚醚、酯或氨烷基。此外，所述间隔区可包括第二官能团。所述第二官能团可包括但不限于-NH₂、-OH、-PH₃、-COOH、-CHO或-SH。第二官能团可以位于线性区的末端。而且，保护基团可结合于线性区的末端。这种保护基团可以为酸不稳定或碱不稳定的。

在本发明的另一个具体实施方式中，在上述AFM悬臂中，探针配体或核苷酸和/或靶配体结合伴侣或核苷酸可结合于树枝状大分子线性区的末端。尤其是，所述靶核苷酸和探针核苷酸可以为DNA、RNA、PNA、核酸适体、核苷酸类似物或其组合。靶特异性配体包括核苷酸，但更通常被认为是化学复合物、多肽、碳水化合物、抗体、抗原、生物模拟物(biomimetics)、核苷酸类似物或其组合。

此外，结合于树枝状大分子线性区的配体或核苷酸之间的距离可以为从约0.1nm至约100nm。

在本发明的另外一个具体实施方式中，上述支持物可由半导体、合成的有机金属、合成的半导体、金属、合金、塑料、硅、硅酸盐、玻璃或陶瓷。尤其是，所述支持物可以不限于载玻片、颗粒、珠、微孔或多孔材料。

根据本发明的下列描述、本文中所附的参考附图以及所附的权利要求，可以更充分地理解本发明的这些和其他目的。

附图说明

图1A是Bio-AFM的示意图，图1B和1C是Bio-AFM的照片。

图2A是用于Bio-AFM的悬臂的示意图，图2B示出了根据本发明的示例性实施方式的AFM悬臂的针尖的放大视图，图2C示出了多种市售的AFM针尖。

图3是AFM的探针针尖与支持物靶标之间接触面的示意图，该接触面用于通过AFM方法学来测定结合力和非结合力。

图4A是一个柱状图，示出了具有相对较窄间隔的互补的30个碱基对在110nm/s的回缩速率下的力分布；图4B至图4C是在540nm/s的回缩速率下直接测定互补的30个碱基对的单一非结合力。

图5A是一个柱状图，示出了具有相对较宽间隔的互补的30个碱基对在110nm/s的回缩速率下的力分布；图5B至图5C是在110nm/s的回缩速率下测定互补的30个碱基对的结合力。

图6A和图6B是柱状图，示出了互补的DNA双链的结合力分布，图6C是柱状图，示出了互补的DNA双链的非结合力分布。

图7是一个柱状图，示出了单碱基错配的DNA双链的结合力分布。

图8是一个柱状图，示出了双碱基错配的DNA双链的结合力分布。

图9示出了AFM悬臂的示意图和AFM悬臂针尖的放大视图。

图10a示出了树枝状大分子修饰的AFM针尖的示意图，该针尖连接有具有足够间隔的配体。

图10b示出了AFM针尖的示意图，该针尖连接有紧密填充的配体。

图11a示出了将蛋白固定于树枝状大分子修饰的AFM针尖上的方法的示意图。

图11b示出了将蛋白固定于树枝状大分子修饰的支持物上的方法的示意图。

图12示出了利用AFM进行力测量的方法的示意图。

图13a示出了利用AFM通过封闭蛋白进行力测量的示意图。

图13b示出了利用AFM通过竞争性蛋白进行力测量的示意图。

图14a是一个柱状图，示出了Munc-18-1与PLD1-PX之间相互作用的力分布。

图14b是一个柱状图，示出了在溶液中加入过量的游离Munc-18-1后，Munc-18-1与PLD1-PX之间相互作用的力分布。

图15是一个曲线，示出了力随着竞争蛋白PLC-γ1的浓度而变化的情况。

图16a示出了通过配体涂布的AFM针尖筛查细胞上受体的方法的示意图。

图16b-16d示出了FPR1与其结合肽之间相互作用的力曲线。

图17a-17b示出了在细胞每个不同区域上FPR1与其结合肽之间相互作用的力图谱和柱状图。

图18示出了用游离WKYMVm(SEQ ED NO：17)封闭之前和封闭之后FPR1与其结合肽之间相互作用的力图谱和柱状图。

具体实施方式

在本申请中，“一个”既用来指单个又用来指多个对象。

如本文中所使用的，“核酸适体”意思是单链、部分单链、部分双链或双链核苷酸序列，有利地为可复制的核苷酸序列，它们能够通过不同于Watson-Crick碱基配对或形成三体的机制而特异性识别选择的非寡核苷酸分子或分子基团。

如在本文中使用的，“模仿生物的(biomimetic)”意思为模拟生物分子、分子基团、结构的分子、基团、多分子结构或方法。

术语“树枝状聚合物”的特征在于具有一个核心、至少一个内分支层以及一个表面分支层(见Petar et al，Pages 641-645，In Chem.In Britain，August 1994)。“树枝状大分子”是一种树枝形聚合物，具有从焦点发出的分支，所述焦点为核心或可直接或通过连接基团连接到核心以形成树枝状聚合物。许多树枝状聚合物包括连接于一个共同核心的两个或多个树枝状大分子。然而，术语“树枝状聚合物”可广泛应用，包括单个树枝状大分子。

如在本文中使用的，“超分支”或“分支”，如其用来描述大分子或树枝状大分子结构，意思指具有多个末端的多个聚合物，所述末端能共价结合或通过离子键结合于支持物。在一个具体实施方式中，包含所述分支或超分支结构的大分子是“预先制备的”，然后连接于支持物。

如在本文中使用的，“固定的”意思为不溶解的或包括连接于或可操作地连接于不溶的、部分不溶的、胶体、微粒、分散体系、悬浮液和/或脱水物质或分子或包括固态支撑物或连接于固态支撑物的固相。

如在本文中使用的，“文库”指的是分子、材料、表面、结构形状、表面特征的随机或非随机混合、收集或分类，或可选地但不限于多种化学实体、单体、聚合物、结构、前体、产物、修饰、衍生物、物质、构型、形状或特征的随机或非随机混合、收集或分类。

如在本文中使用的，“配体”意思是一种选择的分子，其能够通过基于亲和力的吸引而特异性结合于另一个分子，所述吸引包括互补性碱基配对。配体包括但不限于核酸、多种合成的化学物质、受体激动剂、部分激动剂、混合激动剂、拮抗剂、反应诱导或刺激分子、药物、激素、信息激素、递质、内泌素、生长因子、细胞因子、辅基、辅酶、辅因子、底物、前体、维生素、毒素、调节因子、抗原、半抗原、碳水化合物、分子模拟物、结构分子、效应分子、可选择的分子(selectable molecules)、生物素、地高辛、交叉反应物、类似物、这些分子的竞争剂或衍生物以及从文库选择的非寡核苷酸分子，这些分子能够特异性结合于选定的靶标和通过将这些分子中任何一种连接于另一种分子而形成的轭合物。

如在本文中使用的，“配体结合伴侣”指特异性结合于该配体的分子。

如在本文中使用的，“连接分子”和“连接子”，用于提到分子时，将大小受控的大分子例如分支/线性聚合物的分支部分连接于保护基团或配体。连接子可以包括例如但不限于间隔分子、例如所选择的能够将配体连接于树枝状大分子的分子。

如在本文中使用的，“低密度”指的是约0.01至约0.5个探针/nm²，优选约0.05至约0.2，更优选约0.075至约0.15，最优选约0.1个探针/nm²。

如在本文中使用的，“分子模拟物”和“模拟物(mimetics)”是天然或合成的核苷酸或非核苷酸分子或分子基团，其经设计、选择、制造、修饰或加工而具有的结构或功能等同于或类似于另一种分子或分子基团(例如天然存在的生物的或可选择分子)的结构或功能。分子模拟物包括能够发挥天然的、合成的、可选择的或生物分子的代替物、替换物、升级物、改良物、结构类似物或功能类似物的作用的分子和多分子结构。

如在本文中使用的，“探针核苷酸”或“靶核苷酸”包括核苷酸序列，例如寡核苷酸，且不限于一种核苷酸。

如在本文中使用的，“核苷酸类似物”指的是在核酸合成和加工中，优选在酶促合成以及化学合成和加工中可替代天然存在的碱基而使用的分子，特别是能够碱基配对的修饰的核苷酸，可选合成的碱基不包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或稀有碱基。该术语包括但不限于修饰的嘌呤或嘧啶、稀有碱基、可逆核苷、嘌呤和嘧啶的结构类似物、带标记的、衍生的及修饰的核苷和核苷酸、轭合的核苷和核苷酸、序列修饰物、末端修饰物、间隔区修饰物、以及具有主链修饰的核苷酸，包括但不限于核糖修饰的核苷酸、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、亚膦酰胺(phosphonamidite)、甲基膦酸酯、甲基亚磷酰胺(methylphosphoramidites)、甲基亚膦酰胺(phosphonamidite)、5’-β-氰乙基亚磷酰胺(cyanoethyl phosphoramidites)、亚甲基膦酸盐(methylenephosphonates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)、肽核酸、非手性和中性核苷酸间键和非核苷酸桥例如聚乙二醇、芳香聚酰胺和脂类。

如在本文中使用的，“多肽”、“肽”和“蛋白”可以在本文中交换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物的人工化学类似物。该术语还包括传统肽键的变异体，所述传统肽键连接构成多肽的氨基酸。

如在本文中使用的，“保护基团”指的是连接于分子上反应基团(例如羟基或胺)的基团。所述被选择的保护基团用来防止特定基团在化学反应的一个或多个步骤中的反应。通常，选择所述特殊保护基团以允许在后期去除该基团，以恢复所述反应基团并不改变分子中存在的其他反应基团。保护基团的选择依赖于待保护的特定基团和该保护基团将暴露于其中的化合物。保护基团的选择为本领域中的技术人员所熟知。参见例如Greene et al.，Protective Groups inOrganic Synthesis，2nd ed.，John Wiley&Sons，Inc.Somerset，N.J.(1991)，其全部内容以引用的方式结合于此。

如在本文中使用的，“受保护胺”指的是已经与氨基保护基团发生反应的胺。所述线性针尖官能团是氨基的情况下，氨基保护基团防止在分支末端连接于固态支持物的过程中氨化物功能的反应。氨基保护基团可以在后期去除而恢复氨基，并不改变分子中存在的其他反应基团。例如，环外胺可以与二甲基甲酰胺二乙缩醛发生反应，形成二甲基氨基亚甲胺(dimethylaminomethylenamino)功能部分。氨基保护基团通常包括氨基甲酸盐/酯、苯甲基、亚氨酸酯以及其他为本领域中技术人员已知的基团。优选的氨基保护基团包括但不限于p-硝苯基乙氧羰基或二甲氨基亚甲基胺。

如在本文中使用的，“固定间隔”指的是尺寸受控的大分子的针尖之间的间隔，其为约1nm至约100nm的距离，以留出靶特异性配体与靶标之间相互作用的空间，基本上无空间位阻。因此，支持物上的大分子层不过于浓密，从而使特异性分子相互作用能够发生。

如在本文中使用的，“固态支持物”指具有固定基质的组合物，该固定基质例如但不限于不溶物质、固相、表面、支持物、层、涂布层、纺织或无纺纤维、基质、晶体、膜、不可溶聚合物、塑料、玻璃、生物或生物相容性或生物蚀解性或生物可降解性聚合物或基质、微粒子或纳米粒子。固态支持物包括，例如但不限于单层、多层、商品膜、树脂、基质、纤维、分离介质、层析支持物、聚合物、塑料、玻璃、云母、金、珠子、微球、纳米球、硅、砷化镓、有机和无机金属、半导体、绝缘体、微结构和纳米结构。微结构和纳米结构可以包括但不限于超小型化、纳米尺度和超分子探针、针尖、棒、钉、塞、杆、套管、金属线、丝和管。

如在本文中使用的，“间隔分子”指的是一个或多个核苷酸和/或非核苷酸分子、基团或间隔臂，其经选择或设计用来连接两个核苷酸或非核苷酸分子，优选用来改变或调节这两个核苷酸或非核苷酸分子之间的距离。

如在本文中使用的，“特异性结合”指的是配体与其特异性结合伴侣之间，或确定的序列节段与选定的分子或选定的核酸序列之间可测定且可再现的吸引的程度。该吸引的程度无需最大化而优化。微弱、中等或强烈吸引适合于不同的应用。在这些相互作用中发生的特异性结合为本领域中的技术人员所熟知。提到合成时，指的是序列片段、合成的核酸适体、合成的杂聚体、核苷酸配体、核苷酸受体、形状识别元件以及特异性吸引表面。术语“特异性结合”可包括结构性形状和表面特征的特异性识别。在其他方面，特异性结合特指两个分子(即特异性结合伴侣)之间的特异性、可饱和的、非共价性相互作用，可被第三个分子(即竞争剂)竞争性抑制，所述第三个分子与两个特异性结合伴侣之一共有一种化学识别特性(即一种或多种相同的化学基团)或分子识别特征(即分子结合特异性)。所述竞争剂可以为交叉反应物，或者抗体或其抗原的类似物、配体或其受体，或者核酸适体或其靶标。例如，抗体与其抗原之间的特异性结合可以被交叉反应性抗体或被交叉反应性抗原竞争性抑制。为了方便，术语“特异性结合”可用来近似或简略表示既包括特异性结合又包括结构性形状识别的特异性识别的亚类(子集)。

如在本文中使用的，“支持物”当用在物质、结构、表面或材料时，是指一种包括非生物的、合成的、无生命的、平面的、球形的或扁平表面的组合物，迄今人们还不知道其包含特异性结合、杂交或催化识别位点或多个不同的识别位点或超过了构成所述表面、结构或材料的不同分子种类数目的多种不同的识别位点。所述支持物可包括例如但不限于半导体、合成(有机)金属、合成的半导体、绝缘体和掺杂剂；金属、合金、元件、化合物和矿物质；合成的、切割的、蚀刻的、平版印刷的、印刷的、机床加工的和微装配玻片(microfabricated slides)、装置、结构和表面；工业聚合物、塑料、膜；硅、硅酸盐、玻璃、金属和陶瓷；木、纸、卡纸板、棉花、羊毛、布、针织和非针织纤维、材料和织物；未通过分支/线性聚合物由固定探针分子而修饰的纳米结构和微观结构。

如在本文中使用的，“靶探针结合”意思是两种或多种分子(其中至少一个为选定的分子)以特异性方式彼此连接。典型地，第一个选定的分子可结合于第二种分子，该结合可以为间接的，例如通过***间隔臂、基团、分子、桥、载体或特异性识别伴侣，或直接地，即无需***间隔臂、基团、分子、桥、载体或特异性识别伴侣，通过直接结合比较有利。选定的分子可通过杂交特异性结合于核苷酸。用于核苷酸和非核苷酸分子轭合的其他非共价方式包括例如离子键合、疏水性相互作用、配体-核苷酸结合、螯合剂/金属离子对或特异性结合对例如抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白链菌素/生物素、抗荧光素/荧光素、抗-2，4-二硝基苯酚(DNP)/DNP、抗过氧化物酶/过氧化物酶、抗地高辛/地高辛，或者更常见地，受体/配体。例如，受体分子(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、萤光素酶、罗丹明、荧光素、藻红蛋白、发光氨(鲁米诺，3-氨基苯二甲酰肼)、异发光氨、吖啶酯或荧光微球，其为了例如标记目的，利用抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白链菌素/生物素、抗荧光素/荧光素、抗过氧化物酶/过氧化物酶、抗DNP/DNP、抗地高辛/地高辛或受体/配体连接于选定的分子或选定的核酸序列(即非直接和共价连接)，则可通过特异性结合配对的方式轭合于选定的分子或选定的核酸序列。

通过控制固定在AFM针尖和支持物表面上的DNA链之间的间隔，测定单个寡核苷酸的非结合和结合力。已观察到可改善识别效率，通过选择恰当的间隔可消除多重和/或次级相互作用。特别地，具有20、30、40和50个碱基对的DNA双链的非结合力的柱状图变尖，且代表单个双链体的力。令人吃惊的是，还观察到了结合的发生，且相应的力与所述非结合力一致。此外，观察到两种力随着DNA链长度的增加而出现线性增加，且力测定足够敏感，可区分单一的点突变。

本发明提供用于原子力显微镜(AFM)的悬臂，包括具有固定端和自由端的悬臂体，所述自由端具有被树枝状大分子化学修饰的表面区域，其中所述树枝状大分子分支区的多个末端均结合于该表面，所述树枝状大分子的线性区的末端被功能化。

在本发明的一个具体实施方式中，在悬臂游离末端附近提供至少一个锥形突起，所述突起是角锥形或圆锥形。图2C中示出了多种类似结构的探针针尖。因此，可使悬臂的游离末端的表面区与特定突起相接触或到达其附近，这样，即可测定参照化合物分子之间的相互作用。

所有类型的AFM悬臂均可用于本发明中，且对其无特殊限制。根据本发明所述的悬臂可用于所有类型的AFM，例如在图1B和1C中示出的设备。图1A示出了常见原子力显微镜的实例，图2A是用于AFM的悬臂。可参照图1A阐释本发明的AFM。AFM***10包括底座15、支架20(其中心位置有一个开口，固定于底座15)、固定于底座15的管状压电传动器55。通过接线将电压从控制器CO传送至压电传动器，使得管状压电传动器55在垂直方向即悬臂的厚度方向是可转向的(由箭头V2指出)。

参照图2A，悬臂50具有一个在支持物95的一个侧面上形成压电传动器25的结构。悬臂的一个示例性具体实施方式，悬臂50包括悬臂底座90，其具有形成在绝缘层110上的电极10，其中绝缘层110层积在矩形支持物95上。

所述悬臂可由本领域中已知用于AFM悬臂中的任何材料构建，包括Si、SiO₂、Si₃N₄、Si₃N₄O_X、Al或压电材料。悬臂的化学组成并不关键，优选为可易于微装配且具有用于AFM测量的必要机械性能的材料。同样，所述悬臂可以为本领域中用于AFM悬臂的任何大小和形状。悬臂的大小优选长约从5微米至约1000微米，宽约从1微米至约100微米，厚约从0.04微米至约5微米。典型的AFM悬臂长约100微米，宽约20微米，厚约0.3微米。可对悬臂的固定端加以改造使得该悬臂适合传统AFM的悬臂容纳的部分与其形成的界面。

悬臂的游离末端的表面区可通过硅烷试剂例如GPDES或TPU修饰用于用树枝状大分子进行处理。

本发明的设备和方法不限于通过基于悬臂的AFM仪器而使用。

描述本发明的聚合物时，可提到诸如化学式1的聚合物。

化学式1

化学式1中标出了多种R、T、W、L和X基团的变量。所述聚合物可包括任何分支或超分支的、对称或非对称的聚合物。所述聚合物的分支末端优选通过多个末端结合于支持物。聚合物的线性末端可以用可连接保护基团或靶核苷酸的官能团结束。支持物上多个聚合物中探针之间的距离可为从约0.1nm至约100nm，优选约1nm至约100nm，更优选约2nm至约70nm，更加优选约2nm至约60nm，最优选约2nm至约50nm。

R-基团

在化学式1中，所述聚合物通常包括分支部分，其中末端的终点被功能化以结合于支持物。在该分支区内，第一级分支基团R_X(R1、R2、R3)通过官能团W连接于第二级分支基团R_XX(R11、R12、R13、R21、R22、R23、R31、R32、R33)。第二级分支基团通过官能团W连接于第三级分支基团R_XXX(R111、R112、R113、R121、R122、R123、R131、R132、R133、R211、R212、R213、R221、R222、R223、R231、R232、R233、R311、R312、R313、R321、R322、R323、R331、R332、R333)。且第四级分支可以类似的方式连接于第三级分支。末端R基团被功能化，以能够结合于所述支持物。

各级R基团可为相同或不同的。典型地，所述R基团可以为重复性单元、线性或分支有机基团，例如但不限于烷基、烯基、炔基、环烷、芳香基、醚、聚醚、酯、氨烷基等。然而，应该理解，并非所有的R基团均需为相同的重复单位，且并非R基团的所有化合价部位均需用重复单位进行填充。例如，在第一级分支R_X，R₁、R₂、R₃中，该分支水平的所有R基团可以为相同的重复单元。或者，R₁可为重复单元，而R₂和R₃可为H或任何其他化学实体。或者，R₂可为重复单元，而R₁和R₃可为H或任何其他化学实体。同样，对于第二级和第三级分支，任何R基团均可为重复单元、H或任何其他化学实体。

因此，以这种方式可以制成多种形状的聚合物，例如，如果R₁、R₁₁、R₁₁₁、R₁₁₂、R₁₁₃为相同的重复单元，并且所有其他R基团均为连着H(H’s)或任何数目的中性小分子或原子，则制成了一个相当长而细且具有一个分支的聚合物，该分支具有用于R₁₁₁、R₁₁₂和R₁₁₃的三个官能团末端。多种其他可选的化学构型也是可能的。因此，其可能从约3个至约81个具有能够结合于支持物的官能团的末端而制成。优选的末端数目可为从约3个至约75个、从约3个至约70个、从约3个至约65个、从约3个至约60个、从约3个至约55个、从约3个至约50个、从约3个至约45个、从约3个至约40个、从约3个至约35个、从约3个至约30个、从约3个至约27个、从约3个至约25个、从约3个至约21个、从约3个至约18个、从约3个至约15个、从约3个至约12个、从约3个至约9个或从约3个至约6个。

T-末端基团

末端基团，T，是具有足够反应活性的官能团，以便进行加成或取代反应。这种官能团的实例包括但不限于氨基、羟基、疏基、羧基、烯基、烯丙基、乙烯基、氨基、卤素、脲、环氧乙烷基(oxiranyl)、乙烯亚氨基、噁唑啉基、咪唑啉基、磺酸基(sulfonato)、膦酰基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、硅烷基和卤素基(halogenyl)。

W-官能团

在化学式1中，W可为任何可将聚合物连接于另一个(或任何其他二价有机的)基团的官能团，例如但不限于醚、酯、酰胺、酮、脲、尿烷、二酰亚胺、碳酸盐(酯)、羧酸酐、碳化二亚胺、亚胺、偶氮基、脒、硫代羰基、有机硫化物、二硫化物、多硫化物、有机亚砜、亚硫酸盐、有机砜、磺酰胺、磺酸盐/酯、有机硫酸盐、胺、有机磷基团、烯基、环氧烷烃(alkyleneoxide)、亚烷胺(alkyleneamine)等。

L-间隔或连接基团

在化学式1中，聚合物的线性部分可包括一个间隔结构域，该间隔结构域由连接区(linker region)构成，可选地可***官能团。所述连接区可由多个聚合物构成。所述连接子的长度可由多个因素决定，包括结合于支持物的分支官能团的数目、结合于支持物的强度、所采用的R基团的类型，特别地，所采用重复单元的类型以及连接于聚合物线性区顶端的保护基团或靶核苷酸的类型。因此，应该理解所述连接子不限于任何特定类型的聚合物或任何特定的长度。

然而，作为一个通用的原则，连接子的长度可为从约0.5nm至约20nm，优选约0.5nm至约10nm，最优选约0.5nm至约5nm。

所述连接子的化学结构可包括但不限于线性或分支有机基团，例如但不限于取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳香基、醚、聚醚、酯、氨烷基、聚乙二醇等。所述连接子可进一步包括诸如上文所描述的官能团，且其本身不限于任何特定结构。针尖上功能化的连接基团可包括保护基团。

X-保护基团

保护基团的选择基于多种因素，例如需要酸或碱不稳定性。因此，本发明不限于任何特定的保护基团，只要其发挥防止官能团与另一个化学实体发生反应的功能且其能够在所需指定条件下去除。在Sigma-Aldrich(2003)目录中可查到市售保护基团的列表，其披露的保护基团的全部内容以引用的方式结合于此。

聚合物既可以以连续步骤去保护，也可以在单次操作中去保护。多肽的去除以及去保护可以在单次操作中通过用切割试剂处理支持物结合的多肽而实现，所述切割试剂例如苯甲硫醚(thianisole)、水、乙二硫醇和三氟乙酸。

通常，本发明一方面，本发明中采用的保护基团可以为那些用于将一个或多个氨基酸或恰当保护的氨基酸按顺序加入到正在成长的肽链中的基团。

通常，第一个氨基酸的氨基或羧基被恰当的保护基团保护。

在一个特别优选的方法中，氨基官能团由酸或碱敏感性基团加以保护。这些保护基团应具有如下性质：即在键形成条件下稳定且很容易去除而不破坏正在成长的分支/线性聚合物。这些恰当的保护基团可为但不限于9-芴甲氧羰基(Fmoc)、t-丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、联苯异丙基-氧羰基、t-戊基氧羰基、异冰片基氧羰基、(a，a)-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基、o-硝基苯亚磺酰基(nitrophenylsulfenyl)、2-氰-t-丁氧羰基等。

特别优选的保护基团还包括2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰(pmc)、p-甲苯磺酰、4-甲氧苯磺酰、金刚烷基氧羰基、苯甲基、o-溴苄氧羰基、2，6-二氯苯甲基、异丙基、t-丁基(t-Bu)、环己基、环丙苯基(cyclophenyl)和乙酰基(Ac)、1-丁基、苯甲基和四氢化吡喃基、苯甲基、p-甲苯磺酰和2，4-二硝基苯基。

在加入方法中，将线性/分支聚合物的分支末端连接于恰当的固态支持物。对上述合成非常有用的恰当固态支持物的材料对逐步缩合-去保护反应的试剂和反应条件是惰性的，且在所采用的介质中是不可溶的。

从分支/线性聚合物的线性针尖去除诸如Fmoc的保护基团，可通过二级胺优选哌啶处理而完成。受保护部分可以以约3摩尔倍的量引入，偶联优选在DMF中实施。所述偶联剂可为但不限于O-苯并***-l-yl-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU，1当量)和1-羟基-苯并***(HOBT，1当量)。

所述聚合物既可以以连续步骤去保护，也可以在单次操作中去保护。多肽的去除以及去保护可以通过用切割试剂处理支持物结合的多肽而在单次操作中实现，所述切割试剂例如苯甲硫醚(thianisole)、水、乙二硫醇、三氟乙酸。

所述支持物可以是分支/线性聚合物通过共价键或离子键结合的任何固态表面。可将所述支持物功能化，以使在分支/线性聚合物的分支末端之间发生结合。在本领域中，根据操作者的需要，所述支持物表面可为多个表面。优选地，所述支持物为玻璃片。其他支持物可包括滤膜，例如但不限于硝化纤维或尼龙。所述支持物可为亲水性或极性的，且可在涂布前后具有负离子或正离子。

树枝状大分子的类型及其制备方法详细披露在WO2005/026191中，其以引用的方式结合于此。

反应方案1示出了树枝状大分子的合成方案，可采用不同的初始材料、中间化合物和树枝状大分子化合物，其中“X”可以为任何保护基团，包括蒽甲基(A)、Boc、Fmoc、Ns等。

反应方案1

可采用分支末端具有表面反应活性官能团的第二级分支树枝状大分子，其可自组装并在彼此之间提供适宜的间隔。前期研究表明玻璃支持物上的阳离子与树枝状大分子末端的阴离子羧化物之间的多重离子吸引成功地生成了性质优良的单层，且保证24埃米之上的内部配体间间隔(Hong et al.，Langmuir 19，2357-2365(2003))。为了促进去保护并增强去保护顶端(apex)胺的反应性，可对结构进行修饰。而且，在树枝状大分子羧酸基与表面羟基基团之间的共价键形成如离子吸引一样有效，同时还提供增强的热稳定性。此外，低聚醚夹层(oligoetheral interlayer)对于抑制非特异性寡核苷酸结合比较有效。

该被羟基化的支持物通过利用一个之前报道过的方法而制备(Maskis et al.，Nucleic Acids Res.20，1679-1684(1992))。支持物(包括氧化硅晶片、熔融石英和玻璃片)用(3-缩水甘油丙基)甲基二乙氧基硅烷(GPDES)和乙二醇(EG)进行修饰。利用1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(DEC)或1-3-二环己基碳化二亚胺(DCC)，在4-二甲基氨基吡啶(DMAP)的存在的情况下，通过树枝状大分子的羧酸基团与支持物的羟基之间的偶联反应而将所述树枝状大分子引入上述支持物(Boden et al.，J.Org.Chem.50，2394-2395(1985)；Dhaon et al.，J.Org.Chem.47，1962-1965(1982))。树枝状大分子引入后，厚度增加为11±2埃米，其与前面的离子键所观察到的值相当(Hong et al.，Langmuir19，2357-2365(2003))。

在根据以前建立的方法(Beier et al.，Nucleic Acids Res.27，1970-1977(1999))，用二(N-丁二酰亚胺)碳酸盐(DSC)进行修饰后，在级别10,000的干净房间内，利用Microsys5100微阵列点样器(Cartesian Technologies，Inc.)通过点样恰当氨连接的寡核苷酸(20，μM)的50mM碳酸氢钠缓冲(10％二甲基亚砜(DMSO)，pH8.5)液，将探针寡核苷酸固定于玻璃片的活化表面上。典型地，对于带有反应性胺表面基团的支持物，可采用硫醇连接的寡核苷酸和异双功能连接子，例如琥珀酰亚胺-4-马来酰亚胺基丁酸盐(SMB)或磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧化物(SSMCC)(Oh et al.，Langmuir 18，1764-1769(2002)；Frutos et al.，Langmuir16，2192-2197(2000))。与之对比的是，因为树枝状大分子修饰的表面保证了胺官能团之间的一定距离，应用诸如DSC的同双功能连接子不存在问题。因此，可利用氨基连接的寡核苷酸来点样(spot)。除非费用效益非常重要，否则应该避免应用易氧化的硫醇连接的寡核苷酸，尽管这种硫醇连接的寡核苷酸可能在某些条件下是有用的。

为了改善互补DNA链之间在单分子水平的识别效率，可将DNA寡聚体固定于纳米可控的树枝状大分子表面。所述表面对于增强效率似乎是比较理想的，因为树枝状大分子中存在的中间间隔(mesospacing)减轻了被固定DNA的空间位阻(B.J.Hong，S.J.Oh，T.O.Youn，S.H.Kwon，J.W.Park，Langmuir 21，4257，2005)。可利用缩水甘油基丙基二乙氧基甲基硅烷(或GPDES)或N-(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷(N-(3-(triethoxysilyl)propyl)-O-polyethyleneoxide urethane)(或TPU)生成次层，随后将9-蒽甲基N-({[三({2-[({三[(2-羧乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]乙氧基}甲基)甲基]氨基}羰基)丙基氨基甲酸酯)(或9-酸)固定于其上。以前，GPDES修饰的表面上树枝状大分子之间的中间间隔平均为32埃米(B.J.Hong，S.J.Oh，T.O.Youn，S.H.Kwon，J.W.Park，Langmuir 21，4257，2005)。在应用TPU时，原始树枝状大分子的蒽基在257nm处观察到的吸收峰是应用GPDES时吸收峰的一半。因此，建议在应用TPU时的树枝状大分子间隔大于32埃米。蒽保护基团去保护后，用二(N-琥珀酰亚胺)碳酸盐激活胺基，最终胺连接的寡核苷酸被固定。

为了理解所述间隔的效果，对所述支持物采用了两种类型的修饰，而AFM针尖上的间隔通过应用9-酸/TPU固定。因为人们相信弹性常数的评估通常会出现10～20％的典型误差，力是用相同的针尖在不同的条件下测定的(图3)。例如，以110nm/s至540nm/s之间范围内的不同加载速率，可获得固定于9-酸/GPDES支持物上的互补的30个碱基DNA(表1)的力曲线。表1中示出了完全匹配和内部错配的寡聚体序列，其中下划线部分是错配位点。

表1

大小	支持物上的寡聚体	针尖上的寡聚体(完全匹配)	针尖上的寡聚体(内部单碱基错配)	针尖上的寡聚体(内部双碱基错配)
大小	支持物上的寡聚体	针尖上的寡聚体(完全匹配)	针尖上的寡聚体(内部单碱基错配)	针尖上的寡聚体(内部双碱基错配)	20碱基	5’-H₂N-CCATCGTGGTTGCTCCTCAG-3’(SEQ ID NO：1)	5’-H₂N-CTGAGGAGCAACCACGATGG-3’(SEQ ID NO：5)	5’-H₂N-CTGAGGAGCTACCACGATGG-3’(SEQ ID NO：9)	5’-H₂N-CTGAGGAGCTTCCACGATGG-3’(SEQ ID NO：13)
30碱基	5’-H₂N-GCTGCTATGGAGACACGCCCTGGAACGAAG-3’(SEQ ID NO：2)	5’-H₂N-CTTCGTTCCAGGGCGTGTCTCCATAGCAGC-3’(SEQ ID NO：6)	5’-H₂N-CTTCGTTCCAGGGCGCGTCTCCATAGCAGC-3’(SEQ ID NO：10)	5’-H₂N-CTTCGTTCCAGGGCTCGTCTCCATAGCAGC-3’(SEQ ID NO：14)	20碱基	5’-H₂N-CCATCGTGGTTGCTCCTCAG-3’(SEQ ID NO：1)	5’-H₂N-CTGAGGAGCAACCACGATGG-3’(SEQ ID NO：5)	5’-H₂N-CTGAGGAGCTACCACGATGG-3’(SEQ ID NO：9)	5’-H₂N-CTGAGGAGCTTCCACGATGG-3’(SEQ ID NO：13)
30碱基	5’-H₂N-GCTGCTATGGAGACACGCCCTGGAACGAAG-3’(SEQ ID NO：2)	5’-H₂N-CTTCGTTCCAGGGCGTGTCTCCATAGCAGC-3’(SEQ ID NO：6)	5’-H₂N-CTTCGTTCCAGGGCGCGTCTCCATAGCAGC-3’(SEQ ID NO：10)	5’-H₂N-CTTCGTTCCAGGGCTCGTCTCCATAGCAGC-3’(SEQ ID NO：14)	40碱基	5’-H₂N-TGGATCTGGGGTGCCATTCCGCTGTCTCAAGGTGTGCTCG-3’(SEQ ID NO：3)	5’-H₂N-CGAGCACACCTTGAGACAGCGGAATGGCACCCCAGATCCA-3’(SEQ ID NO：7)	5’-H₂N-CGAGCACACCTTGAGACAGCGTAATGGCACCCCAGATCCA-3’(SEQ ID NO：11)	5’-H₂N-CGAGCACACCTTGAGACAGCGTCATGGCACCCCAGATCCA-3’(SEQ ID NO：15)
50碱基	5’-H₂N-GTCTGACCTGTTCCAACGACCCGTATCACTCCGCTCCTGCCTGCTCTC CA-3’(SEQ ID NO：4)	5’-H₂N-TGGAGAGCAGGCAGGAGCGGAGTGATACGGGTCGTTGGAACAGGTCAGAC-3’(SEQ ID NO：8)	5’-H₂N-TGGAGAGCAGGCAGGAGCGGAGTGTTACGGGTCGTTGGAACAGGTCAGAC-3’(SEQ ID NO：12)	5’-H₂N-TGGAGAGCAGGCAGGAGCGGAGTGTAACGGGTCGTTGGAACAGGTCAGAC-3’(SEQ ID NO：16)	40碱基

具有树枝状大分子控制的中间间隔的固态支持物维持单分子之间的平均距离，因此有效地拓宽了药物筛选的研究应用、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-小分子相互作用的研究。Bio-AFM可实现高准确测量同时将分子损伤降到最低。

本发明维持生物分子之间的平均间隔，所述生物分子固定在固态支持物树枝状大分子的表面上，具有调整的中间间隔结构。将不需要的空间位阻降到最低，提供用于观察单分子间相互作用的最佳环境。术语生物分子包括诸如蛋白、抗原、抗体、信号蛋白、肽、整合膜蛋白、小分子、类固醇、葡萄糖、DNA、RNA等物质。

特别地，根据实施例8和9以及图11至15，已经表明本发明在PLD1-PX与Munc-18-1之间(其形成特异性键)形成均一的力。本发明通过利用Bio-AFM测量相互作用力而用于药物筛选。通过观察生物分子之间根据环境变化而出现的相互作用力的变化，可以清楚地建立多种被认为是由生物成分改变所引起的疾病的因果关系。此外，本发明的树枝状大分子通过调整生物素分子之间的间隔而允许测量单个生物素与抗生物素蛋白链菌素之间的相互作用力。

适用于本发明的树枝状大分子类型进一步在美国专利申请序列号为10/917,601和WO 2005/026191中详细说明，其全部内容以引用的方式结合于此。

如在接下来的实施例中所示出的，本发明借助可以控制中间间隔的树枝状大分子，通过将配体固定于AFM针尖之上，来维持配体分子之间的足够间隔。这将配体与受体之间不需要的空间位阻及静电相互作用降到最低，提供用于结合的最佳环境。该环境也将重键降到最少，从而允许在单分子水平上近距离观察配体-受体相互作用。

本发明当在引入加载有特异配体(其与细胞表面受体形成特异性键)的AFM针尖时，通过利用具有可控中间间隔结构的表面来维持配体之间的平均间隔，从而实现受体分布的准确定位。然而，如果采用的AFM针尖的中间间隔尚未经调整，配体分布变得不均匀，与受体形成的重键也降低了定位的准确性。因此，本发明示出了在研究配体-受体相互作用中的多方面用途。

细胞受体可包括但不限于小分子、肽、蛋白质、类固醇激素受体、碳水化合物、脂类、膜蛋白、糖蛋白、糖脂、凝集素、神经营养因子受体、DNA和RNA。任何存在于细胞表面且能够与固定于AFM针尖上的配体相互作用的物质均可用作受体。

此外，固定于AFM针尖上的配体类型可包括但不限于小分子、肽、蛋白质、类固醇、碳水化合物、脂类、膜蛋白、神经营养因子、抗体、DNA、RNA和复合化合物。换句话说，任何可加载于AFM针尖上且通过与受体相互作用而可观察的物质均可用作配体。

在本发明的实施例11至15以及图16至18中，研究了肽-蛋白相互作用、碳水化合物-糖脂相互作用、凝集素-糖蛋白相互作用、碳水化合物-糖蛋白相互作用以及神经营养因子-神经营养因子受体相互作用。

参考下列实施例，将进一步更详细地解释本发明。然而，不应该理解为这些实施例以任何方式限制本发明的范围。

制备实施例

在全部实施例中的化合物进行编号，例如化合物1、化合物2、I、II、III、IV、V等。然而，应该理解该化合物编号方案与提及它的特定实施例部分一致，且只限于该特定实施例部分。例如，在实施例2中列举的化合物1不一定与实施例3中存在的化合物1是相同的化合物。

实施例1-利用尺寸受控的大分子制备微阵列的方法

在实施例1中，命名I、II、III、IV和V指多种化合物及中间化合物，如在图2中所示出的。

实施例1.1-材料

硅烷偶联试剂，(3-缩水甘油丙基)甲基二乙氧基硅烷(GPDES)和(3-氨丙基)二乙氧基甲基硅烷(APDES)，可从Gelest，Inc.购买到，所有其他化学物质均为试剂级，购自Sigma-Aldrich。用于硅烷化的反应溶剂是来自Aldrich的Sure/Seal瓶中的无水溶剂。用于所述支持物的所有洗涤溶剂为HPLC级，购自Mallinckrodt LaboratoryChemicals。UV级熔融石英板(30mm×10mm×1.5mm)从CVI LaserCorporation购买。Polished prime Si(100)晶片(掺杂剂，磷；电阻率，1.5-2.1Ω.cm)从MEMC Electronic Materials，Inc购买。载玻片(2.5×7.5cm)从Corning Co.购买。所有寡核苷酸均从Metabion购买。超纯水(18MΩ/cm)从Milli-Q纯化***(Millipore)获得。

实施例1.2-仪器

膜厚度用椭偏光谱仪进行测量(J.A.Woollam Co.ModelM-44)。UV-vis光谱记录在Hewlett-Packard二极管阵列8453分光光度计上。轻敲模式AFM实验通过装配有“E”型扫描仪的毫微秒示波器IIIa AFM(Digital Instruments)而实施。

实施例1.3-清洁支持物

将支持物例如氧化硅晶片、熔融石英和载玻片等浸入Piranha溶液(浓H₂SO₄∶30％H₂O₂＝7∶3(v/v))中，盛有该溶液和支持物的反应瓶被超声处理1小时。(注意：Piranha溶液可***性地氧化有机材料。避免与可氧化性材料接触。)超声处理后，用大量去离子水洗涤所述板并彻底冲洗。干净的支持物在真空箱(30-40mTorr)中进行干燥，用于接下来的步骤。

实施例1.4-制备羟基化支持物。上述干净支持物在含1.0ml(3-缩水甘油氧丙基)甲基二乙氧基硅烷(GPDES)的160ml甲苯溶液中浸泡10小时。自组装后，所述支持物用甲苯快速洗涤、置于烤箱中并于110℃加热30分钟。所述板依次在甲苯、甲苯-甲醇(1∶1(v/v))和甲醇中进行超声处理，每个洗涤步骤3分钟。洗涤过的板在真空箱(30-40mTorr)中进行干燥。GPDES修饰的支持物在含2或3滴95％硫酸的纯净乙二醇(EG)溶液中于80-100℃下浸泡8小时。冷却后，所述支持物依次在乙醇和甲醇中进行超声处理，每一步3分钟。洗涤过的板在真空箱(30-40mTorr)中进行干燥。

实施例1.5-制备树枝状大分子修饰的支持物。

上述羟基化支持物浸入二氯甲烷溶液中，而该溶液在4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.82mM)存在的情况下溶解树枝状大分子(1.2mM)和一种偶联试剂盐酸1-[-3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺(EDC)或1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)(11mM)。室温三天后，所述板依次在甲醇、水和甲醇中进行超声处理，每步3分钟。洗涤过的板在真空箱(30-40mTorr)中进行干燥，用于接下来的步骤。

实施例1.6-制备NHS修饰的支持物。

树枝状大分子修饰的支持物浸入含1.0M三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液中。3小时后，将其再次浸入含20％(v/v)二异丙基乙胺(DIPEA)的二氯甲烷溶液中10分钟。板在二氯甲烷和甲醇中各超声处理3分钟。在真空箱中干燥后，去保护的支持物在乙腈溶液中进行孵育，所述乙腈溶液含二(N-丁二酰亚胺)碳酸酯(DSC)(25mM)和DIPEA(1.0mM)。在氮气中反应4小时后，将板置于搅拌的二甲基甲酰胺溶液中30分钟，并用甲醇快速洗涤，洗涤过的板在真空箱(30-40mTorr)中进行干燥，用于接下来的步骤。

实施例1.7-在NHS修饰的支持物上排列寡核苷酸。

将在50mM NaHCO₃缓冲液(pH8.5)中的探针寡核苷酸以4×4的格式并排点在NHS修饰的支持物上。将该微阵列在恒湿箱(湿度80％)中孵育12小时，以给胺-连接的DNA足够的反应时间。随后将载玻片在杂交缓冲液(2x SSPE缓冲液(pH7.4)，含7.0mM十二烷基硫酸钠)中在37℃下晃动1小时，在沸水中晃动5分钟以去除非特异结合的寡核苷酸。最后，将该DNA功能化的微阵列在氮气流中干燥，用于下一个步骤。为了公平比较，将不同种类的探针点在单个板上。

实施例1.8-杂交

利用GeneTACTM HybStation(Genomic Solutions，Inc.)，在含有靶寡核苷酸(1.0nM)的杂交缓冲液中在50℃下杂交1小时，所述靶寡核苷酸标记有Cy3荧光染料。用杂交缓冲液冲洗所述微阵列，去除过量的靶寡核苷酸，并用氮气干燥。用ScanArray Lite(GSILumonics)测定每个点上的荧光信号，并用Imagene 4.0(Biodiscovery)进行分析。

实施例1.9-树枝状大分子的合成

实施例1.9.1-9-蒽甲基N-(3-羧丙基)氨基甲酸酯(I)-化合物I的制备

将4-氨基丁酸(0.50g，4.8mmol，1.0当量)和三乙胺(TEA)(1.0ml，7.3mmol，1.5当量)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并在50℃下搅拌。搅拌的同时，缓慢加入9-蒽甲基ρ-硝基苯基碳酸酯(1.81g，4.8mmol，1.0当量)。50℃搅拌2小时后，将所述溶液蒸发至干燥，并用0.50N氢氧化钠(NaOH)溶液碱化该溶液。将该水溶液用乙酸乙酯(EA)洗涤、在冰浴中搅拌并用稀盐酸(HCl)酸化。用EA提取该产品后，将该有机溶液用无水MgSO₄干燥，并过滤、蒸发。所得到黄色粉末的总重量是1.06g，产率是65％。

¹H NMR(CDCl₃)

δ11.00-9.00(br，CH₂COOH，1H)，8.41(s，C₁₄H₉CH₂，1H)，8.31(d，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.97(d，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.51(t，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.46(t，C₁₄H₉CH₂，2H)，6.08(s，C₁₄H₉CH₂O，2H)，5.01(t，OCONHCH₂，1H)，3.23(q，NHCH₂CH₂，2H)，2.34(t，CH₂CH₂COOH，2H)，1.77(m，CH₂CH₂CH₂，2H).

¹³C NMR(CDCl3)

δ178.5(CH₂COOH)，157.9(OCONH)，132.1(C₁₄H₉CH₂)，131.7(C₁₄H₉CH₂)，129.7(C₁₄H₉CH₂)，129.7(C₁₄H₉CH₂)，127.3(C₁₄H₉CH₂)，126.8(C₁₄H₉CH₂)，125.8(C₁₄H₉CH₂)，124.6(C₁₄H₉CH₂)，60.2(C₁₄H₉CH₂)，41.0(NHCH₂CH₂)，31.7(CH₂CH₂COOH)，25.6(CH₂CH₂CH₂).

实施例1.9.2-9-蒽甲基N-{[(三{[2-(甲氧羰基)乙氧基]甲基}甲基)氨基]羰基}丙基碳酸酯(II)-化合物II的制备

将9-蒽甲基N-(3-羧丙基)氨基甲酸酯/盐(0.65g，1.93mmol，1.5当量)、1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺(EDC)盐酸盐(0.37g，1.93mmol，1.5当量)和1-羟基-苯并***水化物(HOBT)(0.261g，1.93mmol，1.5当量)溶解于乙腈中，并在室温下搅拌。搅拌的同时，加入溶解于乙腈中的三{[(甲氧羰基)乙氧基]甲基}氨基甲烷(0.49g，1.29mmol，1.0当量)。室温搅拌12小时后，蒸发掉乙腈。将粗产品溶解于EA中，并用1.0N的HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。用无水MgSO4干燥、过滤并蒸发后，将所述粗产品装入硅胶柱。通过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶己烷＝5∶1(v/v))纯化，得到粘稠的黄色液体。黄色液体的总重量是0.67g，产率是74％。

¹H NMR(CDCl₃)

δ8.43(s，C₁₄H₉CH₂，1H)，8.36(d，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.99(d，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.53(t，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.47(t，C₁₄H₉CH₂，2H)，6.15(s，CONHC，1H)，6.08(s，C₁₄H₉CH₂O，2H)，5.44(t，OCONHCH₂，1H)，3.63-3.55(m，CH₂OCH₂CH₂COOCH₃，21H)，3.27(q，NHCH₂CH₂，2H)，2.46(t，CH₂CH₂COOCH₃，6H)，2.46(t，CH₂CH₂CONH，2H)，1.81(m，CH₂CH₂CH₂，2H).

¹³C NMR(CDCl₃)

δ173.2(CH₂CONH)，172.7(CH₂COOCH₃)，157.4(OCONH)，132.9(C₁₄H₉CH₂)，131.5(C₁₄H₉CH₂)，129.5(C₁₄H₉CH₂)，129.4(C₁₄H₉CH₂}，127.5(C₁₄H₉CH₂)，127.0(C₁₄H₉CH₂)，125.6(C₁₄H₉CH₂)，124.7(C₁₄H₉CH₂)，69.6(NHCCH₂O)，67.2(C₁₄H₉CH₂)，60.1(OCH₂CH₂)，59.4(NHCCH₂)，52.1(OCH₃)，40.8(NHCH₂CH₂)，35.1(OCH₂CH₂)，34.7(CH₂CH₂CONH)，26.3(CH₂CH₂CH₂).

分析计算C₃₆H₄₆N₂O₁₂·0.5H₂O：C 61.18，H 6.65，N 4.03；结果：C61.09，H6.69，N 3.96.

实施例1.9.3-9-蒽甲基N-[({三[(2-羧乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]丙基氨基甲酸酯(III)-化合物III的制备。

将9-蒽甲基N-{[(三{[2-(甲氧羰基)乙氧基]甲基}甲基)氨基]羰基}丙基碳酸酯(0.67g，0.93mmol)溶解于丙酮(30ml)和0.20N NaOH(30ml，6mmol)中。室温搅拌1天后，蒸发丙酮。将该水性溶液用EA洗涤、在冰浴中搅拌并用稀盐酸酸化。用EA提取该产品后，将该有机溶液用无水MgSO₄干燥，过滤、并蒸发。在丙酮和醚溶液中在-20℃下凝固得到一种黄色粉末。最终得到的淡黄色粉末的总重量是0.54g，产率是88％。

¹H NMR(CDCl₃)

δ11.00-9.00(br，CH₂COOH，3H}，8.61(s，C₁₄H₉CH₂，1H}，8.47(d，C₁₄H₉CH₂，2H)，8.11(d，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.60(t，C₁₄H₉CH₂，2H}，7.52(t，C₁₄H₉CH₂，2H)，6.63(s，CONHC，1H)，6.36(t，OCONHCH₂，1H)，6.12(s，C₁₄H₉CH₂O，2H).3.40-363(m，CH₂OCH₂CH₂COOH，12H)，3.20(q，NHCH₂CH₂，2H)，2.52(t，CH₂CH₂COOH，6H)，2.17(t，CH₂CH₂CONH，2H)，1.75(m，CH₂CH₂CH₂，2H).

¹³C NMR(CDCl₃)

δ172.2(CH₂COOH)，172.0(CH₂CONH)，156.7(OCONH)，131.2(C₁₄H₉CH₂)，130.7(C₁₄H₉CH₂)，128.6(C₁₄H₉CH₂)，128.4(C₁₄H₉CH₂)，127.3(C₁₄H₉CH₂)，126.2(C₁₄H₉CH₂)，124.8(C₁₄H₉CH₂)，124.0(C₁₄H₉CH₂)，68.6(NHCCH₂O)，66.5(C₁₄H₉CH₂)，59.5(OCH₂CH₂)，58.0(NHCCH₂)，40.0(NHCH₂CH₂)，34.0(OCH₂CH₂)，33.5(CH₂CH₂CONH)，25.8(CH₂CH₂CH₂).

分析计算C₃₃H₄₀N₂O₁₂·1.5H₂O：C 57.97，H 6.34，N 4.10；结果：C 57.89，H6.21，N 4.09.

实施例1.9.4-9-蒽甲基N-[({三[(2-{[(三{[2-(甲氧羰基)乙氧基]甲基}(甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]丙基氨基甲酸酯/盐(IV)-化合物IV的制备。

将9-蒽甲基N-[({三[(2-羧乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]丙基氨基甲酸酯/盐(0.54g，0.82mmol，1.0当量)、EDC(0.55g，2.87mmol，3.5当量)和HOBT(0.39g，2.89mmol，3.5当量)溶解于乙腈，并在室温下搅拌。搅拌的同时，加入溶解于乙腈中的三{[(甲氧羰基)乙氧基]甲基}氨基甲烷(0.96g，2.53mmol，3.1当量)。室温搅拌36小时后，蒸发掉乙腈。将粗产品溶解于EA中，并用1.0N的HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。用无水MgSO₄干燥、过滤并蒸发后，将所述粗产品装入硅胶柱。柱纯化(洗脱剂：乙酸乙酯∶甲醇＝20∶1(v/v))得到粘稠的黄色液体。黄色液体的总重量是1.26g，产率是88％。

¹H NMR(CDCl₃)

δ8.47(s，C₁₄H₉CH₂，1H)，8.39(d，C₁₄H₉CH₂，2H)，8.02(d，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.53(t，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.47(t，C₁₄H₉CH₂，2H)，6.60(s，CH₂CH₂CH₂CONHC，1H)，6.13(s，OCH₂CH₂CONHC，3H)，6.11(s，C₁₄H₉CH₉O，2H)，5.79(t，OCONHCH₂，1H)，3.65-3.60(m，CH₂OCH₂CH₂CONH，CH₂OCH₂CH₂COOCH₃，75H)，3.29(q，NHCH₂CH₂，2H)，2.50(t，CH₂CH₂COOCH₃，18H)，2.36(t，OCH₂CH₂CONH，6H)，2.27(t，CH₂CH₂CH₂CONH，2H)，1.85(m，CH₂CH₂CH₂，2H).

¹³C NMR(CDCl₃)

δ173.3(OCH₂CH₂CONH)，172.5(CH₂CH₂CH₂CONH)，171.6(CH₂COOCH₃)，157.2(OCONH)，131.8(C₁₄H₉CH₂)，131.5(C₁₄H₉CH₂)，129.4(C₁₄H₉CH₂)，129.3(C₁₄H₉CH₂)，127.6(C₁₄H₉CH₂)，127.0(C₁₄H₉CH₂)，125.6(C₁₄H₉CH₂)，124.7(C₁₄H₉CH₂)，69.5(NHCCH₂OCH₂CH₂COOCH₃)，67.9(NHCCH₂OCH₂CH₂CONH)，67.2(C₁₄H₉CH₂)，60.3(OCH₂CH₂CONH)，60.2(OCH₂CH₂COOCH₃)，59.2(NHCCH₂OCH₂CH₂COOCH₃，NHCCH₂OCH₂CH₂CONH)，52.1(OCH₃)，41.0(NHCH₂CH₂)，37.6(OCH₂CH₂CONH)，35.1(OCH₂CH₂COOCH₃)，34.7(CH₂CH₂CH₂CONH)，26.3(CH₂CH₂CH₂).

分析计算C₈₁H₁₂₁N₅O₃₆·H₂O：C 55.31，H7.05，N 3.98；结果：C 55.05，H7.08，N 4.04.

MALDI-TOF-MS：1763.2(MNa+)，1779.2(MK+).

实施例1.9.5-9-蒽甲基N-[({三[(2-{[(三[(2-(羧乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]乙氧基}甲基)甲基]氨基}羰基)丙基氨基甲酸酯(V)-化合物V的制备。

将9-蒽甲基N-[({三[(2-{[(三{[2-(甲氧羰基)乙氧基]甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]丙基氨基甲酸酯(0.60g，0.34mmol)溶解于丙酮(30ml)和0.20N的NaOH(30ml)中。在室温下搅拌1天后，蒸发丙酮。将该水性溶液用EA洗涤、在冰浴中搅拌并用稀盐酸酸化。用EA提取该产品后，将该有机溶液用无水MgSO₄干燥，并过滤、蒸发。最终得到的黄色粉末的总重量是0.37g，产率是68％。

¹HNMR(DMSO)

δ13.00-11.00(br，CH₂COOH，9H)，8.66(s，C₁₄H₉CH2，1H)，8.42(d，C₁₄H₉CH₂，2H)，8.13(d，C₁₄H₉CH2，2H)，7.62(t，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.54(t，C₁₄H₉CH₂，2H)，7.12(t，OCONHCH₂，1H)，7.10(s，OCH₂CH₂CONHC，3H)，7.06(s，CH₂CH₂CH₂CONHC，1H)，6.06(s，C₁₄H₉CH₂O，2H)，3.57-3.55(m，CH₂OCH₂CH₂CONH，CH₂OCH₂CH₂COOH，48H)，3.02(q，NHCH₂CH₂，2H)，2.42(t，CH₂CH₂COOH，18H)，2.32(t，OCH₂CH₂CONH，6H)，2.11(t，CH₂CH₂CH₂CONH，2H)，1.60(m，CH₂CH₂CH₂，2H).

¹³C NMR(DMSO)

δ172.8(CH₂COOH)，172.2(CH₂CH₂CH₂CONH)，170.5(OCH₂CH₂CONH)，156.5(OCONH)，131.0(C₁₄H₉CH₂)，130.6(C₁₄H₉CH₂)，129.0(C₁₄H₉CH₂)，128.7(C₁₄H₉CH₂)，127.6(C₁₄H₉CH₂)，126.7(C₁₄H₉CH₂)，125.4(C₁₄H₉CH₂)，124.3(C₁₄H₉CH₂)，68.3(NHCCH₂OCH₂CH₂COOH)，67.4(NHCCH₂OCH₂CH₂CONH)，66.8(C₁₄H₉CH₂)，59.8(OCH₂CH₂COOH)，59.6(OCH₂CH₂CONH)，57.9(NHCCH₂OCH₂CH₂CONH)，55.9(NHCCH₂OCH₂CH₂COOH)，36.4(NHCH₂CH₂)，34.6(OCH₂CH₂COOH)，30.8(OCH₂CH₂CONH)，29.7(CH₂CH₂CH₂CONH)，25.9(CH₂CH₂CH₂).

制备实施例2-制备可替代性初始材料树枝状大分子-Fmoc-间隔分子-[9]-酸的方法

在实施例2中，将多种标明的化合物称为化合物1、2等。

首先，按照Lee，J.W.；Jun，S.I.；Kim，K.TetrahedronLett.，2001，42，2709用1，6-二溴己烷合成间隔分子6-叠氮己胺(1)。

通过不对称的脲的形成将该间隔区连接于重复单元(2)，制成N3-间隔分子-[3]酯(3)。所述重复单元通过用丙烯酸叔丁酯浓缩TRIS而合成，这在Cardona，C.M.；Gawley，R.E.J.Org.Chem.2002，67，141中已经报道过。

通过水解将该三酯转化为N₃-间隔分子-[3]酸(4)，并在肽偶联条件下与三酯偶联，得到N₃-间隔分子-[9]酯。将叠氮化物还原为胺并用Fmoc基团对胺加以保护后，九酯(nonaester)水解得到Fmoc-间隔分子-[9]酸(5)。

N-(6-叠氮己基)-N’-三{[2-(叔丁氧羰基)乙氧基]甲基}-甲基脲(3)。将三光气(1.3g，4.3mmol)溶解于无水CH₂Cl₂(20ml)中。利用注射泵，在7小时的时间段内将在无水CH₂Cl₂(35ml)中的6-叠氮己胺(1)(1.6g，12mmol)与N，N-二异丙基乙胺(DIEA，2.4ml，13.8mmol)的混合物逐滴加入搅拌的三光气溶液中。继续搅拌2小时后，然后加入(2)(6.4g，13mmol)的溶液和无水CH₂Cl₂(20ml)中的DIEA(2.7ml，15.2mmol)。将该反应混合物在氮气中室温下搅拌4小时，并用0.5M HCl和盐水洗涤。然后在无水MgSO₄上干燥有机层，并通过抽真空除去溶剂。利用柱层析(二氧化硅，1∶1EtOAc/己烷)得到无色油状物(3.0g，40％)。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ1.45(s，(CH₃)₃C，27H)；1.36-1.58(m，CH₂CH₂CH₂CH₂，8H)；2.46(t，CH₂CH₂O，J＝6.4Hz，6H)，3.13(m，CONHCH₂，2H)，3.26(t，N₃CH₂，J＝6.9Hz，2H)，3.64-3.76(m，CCH₂O和CH₂CH₂O，12H)；5.00(t，CH₂NHCO，J＝6.7Hz，1H)，5.29(s，CONHC，1H).

¹³C NMR(CDCl₃，75MHz)：δ26.52，26.54，28.81，30.26(CH₂CH₂CH₂CH₂)；28.14((CH₃)₃C)；36.20(CH₂CH₂O)；39.86(CONHCH₂)；51.40(N₃CH₂)；58.81(CCH₂O)；67.16(CH₂CH₂O)；69.23(CCH₂O)；80.58((CH₃)₃C)；157.96(NHCONH)；171.26(COOt-Bu).

FAB-MS：674.26(M⁺).

N-(6-叠氮己基)-N’-三{[2-羧乙氧基]甲基}甲基脲(4)。将N₃-间隔分子-[3]酯(3)(0.36g，0.56mmol)在6.6ml 96％的甲酸中搅拌24小时，随后在50℃减压去除甲酸，定量生成无色油状物。

¹H NMR(CD₃COCD₃，300MHz)：δ1.34-1.60(m，CH₂CH₂CH₂CH₂，8H)；2.53(t，CH₂CH₂O，J＝6.4Hz，6H)，3.07(t，CONHCH₂，J＝6.9Hz，2H)，3.32(t，N₃CH₂，J＝6.9Hz，2H)，3.67-3.73(m，CCH₂O和CH₂CH₂O，12H).

¹³C NMR(CD₃COCD₃，75MHz)：δ27.21，29.54，31.02(CH₂CH₂CH₂CH₂)；35.42(CH₂CH₂O)；40.27(CONHCH₂)；52.00(N₃CH₂)；59.74(CCH₂O)；67.85(CH₂CH₂O)；70.96(CCH₂O)；158.96(NHCONH)；173.42(COOH).

FAB-MS：506.19(MH⁺).

N-(6-叠氮己基)-N’-三[(2-{[(三{[2-(叔丁氧羰基)乙氧基]-甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基脲(4.1)。

将HOBt(0.20g，1.5mmol)、DIEA(0.30ml，1.8mmol)和EDC(0.33g，1.8mmol)加入溶解在5.0ml无水乙腈中的(4)(0.25g，0.50mmol)中。随后加入溶解在2.5ml无水乙腈中的胺(2)(1.14g，2.3mmol)，在氮气中搅拌该反应混合物48小时。减压去除溶剂，然后将残留物溶解于MC中，并用0.5M HCl和盐水洗涤，然后在MgSO₄上干燥有机层，并真空去除溶剂，柱层析(SiO₂，2∶1EtOAc/己烷)得到无色油状物(0.67g，70％)。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ1.45(s，(CH₃)₃C，81H)；1.36-1.58(m，CH₂CH₂CH₂CH₂，8H)；2.40-2.47(m，CH₂CH₂O gen.1&2，24H)，3.13(m，CONHCH₂，2H)，3.26(t，N₃CH₂，6.9Hz，2H)，3.62-3.69(m，CCH₂O gen.1&2，CH₂CH₂O gen.1&2，48H)；5.36(t，CH₂NHCO，J＝6.7Hz，1H)，5.68(br，CONHC，1H)，6.28(br，酰胺NH，3H).

¹³C NMR(CDCl₃，75MHz)：δ26.59，26.69，28.91，30.54(CH₂CH₂CH₂CH₂)；28.22((CH₃)₃C)；36.20(CH₂CH₂O gen.2)；37.43(CH₂CH₂O gen.1)；39.81(CONHCH₂)；51.47(N₃CH₂)；58.93(CCH₂O gen.1)；59.89(CCH₂O gen.2)；67.15(CH₂CH₂O gen.2)；67.68(CH₂CH₂O gen.1)；69.23(CCH₂O gen.2)；70.12(CCH₂O gen.1)；80.57((CH₃)₃C)；158.25(NHCONH)；171.01(COOt-Bu)171.41(CONH酰胺).

MALDI-MS：1989.8(MNa⁺)，2005.8(MK⁺).

N-(6-氨己基)-N’-三[(2-{[(三{[2-(叔丁氧羰基)乙氧基]-甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基脲(4.2)。

在室温下用在乙醇(20.0ml)中的10％Pd/C(37.0mg)将九-叔丁酯(4.1)(0.37g，0.20mmol)在H₂中搅拌12小时。在用TLC核准该反应完成后，用0.2微米的微孔滤膜过滤该混合物。用CH₂Cl₂冲洗滤纸，然后真空去除混合溶剂，回收无色油状物。

N-{6-(9-芴基甲氧羰基)氨己基1}-N’-三[(2-{[(三{[2-(叔丁羰基)乙氧基]-甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基脲(4.3)。

将胺(4.2)(0.33g，0.17mmol)和DIEA(33μL，0.19mmol)溶解于5.0mL的CH₂Cl₂中，并在氮气环境中搅拌30分钟；加入溶解在2.0ml的CH₂Cl₂的9-芴甲基氯甲酸酯(48mg，0.19mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌3小时。减压去除溶剂，并用0.5M HCl和盐水洗涤。用柱层析(二氧化硅，EtOAc)纯化残留物，得到无色油状物(0.18g，64％)。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ1.45(s，(CH₃)₃C，81H)；1.23-1.58(m，CH₂CH₂CH₂CH₂，8H)；2.37-2.47(m，CH₂CH₂O gen.1&2，24H)；3.10-3.22(m，CONHCH₂，4H)；3.62-3.70(m，CCH₂O gen.1&2，CH₂CH₂O gen.1&2，48H)；4.22(t，CH(芴基)-CH₂，J＝7.1Hz，1H)；4.36(d，芴基-CH₂，J＝7.1Hz，2H)；5.27-5.35(m，CH₂NHCO，2H)；5.67(br，CONHC，1H)；6.25(br，酰胺，3H)；7.28-7.77(芴基，8H).

¹³C NMR(CDCl₃，75MHz)：δ26.85，27.02，30.27，30.88(CH₂CH₂CH₂CH₂)；28.49((CH₃)₃C)；36.48(CH₂CH₂O gen.2)；37.73(CH₂CH₂O gen.1)；40.03，41.34(CONHCH₂)；47.68(CH(芴基)-CH₂)；59.22(CCH₂O gen.1)；60.16(CCH₂O gen.2)；66.87(芴基-CH₂)；67.43(CH₂CH₂O gen.2)；67.98(CH₂CH₂O gen.1)；69.52(CCH₂O gen.2)；70.42(CCH₂O gen.1)；80.84((CH₃)₃C)；120.28，125.52，127.38，127.98，141.65，144.48(芴基)；156.88(OCONH)；158.52(NHCONH)；171.27(COOt-Bu)171.65(酰胺CONH).

MALDI-MS：2186.8(MNa⁺)，2002.8(MK⁺).

N-{6-(9-芴基甲氧羰基)氨己基1}-N’-三[(2-{[(三{[2-羧乙氧基]-甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]-甲基脲(5)。将具有保护基团的九叔丁酯(4.3)(0.12g，72mmol)在10mL 96％的甲酸中搅拌18小时，随后在50℃下减压去除甲酸，定量生成无色油状物。

¹H NMR(CD₃COCD₃，300MHz)：δ1.23-1.51(m，CH₂CH₂CH₂CH₂，8H)；2.44-2.58(m，CH₂CH₂O gen.1&2，24H)；3.15-3.18(m，CONHCH₂，4H)；3.61-3.75(m，CCH₂O gen.1&2，CH₂CH₂O gen.1&2，48H)；4.23(t，CH(芴基)-CH₂，J＝7.0Hz，1H)；4.35(d，芴基-CH₂，J＝7.0Hz，2H)；5.85，6.09(br，CH₂NHCO，2H)；6.57(br，CONHC，1H)；6.88(br，酰胺NH，3H)；7.31-7.88(芴基，8H).

¹³C NMR(CD₃COCD₃，75MHz)：δ27.21，27.33，30.69，30.98(CH₂CH₂CH₂CH₂)；35.31(CH₂CH₂O gen.2)；37.83(CH₂CH₂O gen.1)；40.56，41.54(CONHCH₂)；48.10(CH(芴基)-CH₂)；59.93(CCH₂O gen.1)；61.10(CCH₂O gen.2)；66.86(芴基-CH₂)；67.81(CH₂CH₂O gen.2)；68.37(CH₂CH₂O gen.1)；69.80(CCH₂O gen.2)；70.83(CCH₂Ogen.1)；120.84，126.13，127.98，128.56，142.10，145.16(芴基)；157.50(OCONH)；159.82(NHCONH)；173.20(酰胺CONH)；173.93(COOH).

实施例3-其他树枝状大分子化合物

应该注意到，尽管已表明特定保护基团可用于大分子，但该化合物不限于已示出的特殊保护基团。此外，尽管已描述多种具有确切的分子结构的链和间隔分子，仍然可能根据公认的化学修饰法进行修饰而获得支持物表面上密度受控的(优选低密度)阵列的功能。对于这些化合物的简称，最左边的字母表示保护基团；括号里的数字表示分支末端的数目；最右边的化学实体表示分支末端上的化学物质。例如，“A-[27]-酸”表示蒽甲基保护基团；27个末端，以及位于末端的酸基团。

A-[27]-酸

Boc-[1]-酸

Boc-[3]-酯

Boc-[3]-酸

Boc-[9]-酯

Boc-[9]-酸

Ns-[9]-酯

Ns-[9]-酸

Fmoc-[9]-酯(R＝叔丁基)

Fmoc-[9]-酸

AE-[1]-酸

AE-[3]-酸

AE-[9]-酸

A-[6]-酸

A-[8]-酸

A-[12]-酸

A-[16]-酸

A-[18]-酸

G.R.Newkome J.Org.Chem.1985，50，2003

J.-J.Lee Macromolecules 1994，27，4632

L.J.Twyman Tetrahedron Lett，1994，35，4423

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G.R.Newkome Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1991，30，1176

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K.L.Wooley J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1 1991，1059

实施例3.1-制备方法

1.A-[3]-OEt(3)

化合物1与NaC(CO₂Et)₃2在80℃下在C₆H₆/DMF中发生反应。

2.A-[3]-OMe(5)

将A-[3]-OEt 3用LiAlH₄或LiBH₄在醚中还原，在t-BuOK/t-BuOH存在的情况下与氯乙酸反应，并用MeOH酯化。

3.A-[3]-OTs(7)

用LiAlH₄在醚中还原A-[3]-OMe 5，生成三醇化合物6，后者经甲苯磺酸化成为化合物7。

4.A-[9]-OEt(8)

用NaC(CO₂Et)₃在C₆H₆-DMF中处理A-[3]-OTs 7，得到所需要的九酯(化合物8)。

5.A-[27]-OH(9)

用三(羟甲)氨基甲烷和K₂CO₃在DMSO中于70℃处理A-[9]-OEt 8。

实施例3.2

1.Boc-[2]-OMe(3)

在低于50℃的温度下，使化合物1与丙烯酸甲酯2在甲醇溶剂中反应。过量的试剂和溶剂则在低于55℃的温度下的高真空中去除。

2.Boc-[4]-NH₂(5)

在低于50℃的温度下，使Boc-[2]-OMe 3与高度过量的乙二胺(EDA)4在甲醇溶剂中反应。过量的试剂和溶剂则在低于55℃的温度下的高真空中去除。

3.Boc-[8]-OMe(6)

在低于50℃的温度下，使Boc-[4]-NH₂ 5与丙烯酸甲酯2在甲醇溶剂中反应。过量的试剂和溶剂则在低于55℃的温度下高真空中去除。

实施例3.3

1.Boc-[2]-OH(3)

将化合物1、1-[-3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基-苯并***水化物(HOBT)溶解于乙腈中，并在室温搅拌。搅拌的同时，加入溶解在乙腈中的L-谷氨酸-二乙基酯(H₂NCH(CO₂Et)CH₂CH₂CO₂Et)，室温下搅拌12小时后，蒸发掉乙腈。将粗产品溶解于EA中，并用1.0N的HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。用无水MgSO₄干燥、过滤并蒸发后，将所述粗产品装载于硅胶柱中。通过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶己烷)纯化，得到粘稠的黄色液体。

将化合物2用NaOH溶液水解，室温搅拌1天后，蒸发掉有机液体。将该水溶液用EA洗涤、在冰浴中搅拌并用稀HCl酸化。用EA提取该产品后，将该有机溶液用无水MgSO₄干燥，并过滤、蒸发。

2.Boc-[4]-OH(3)

将化合物3、1-[-3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基-苯并***水化物(HOBT)溶解于乙腈中，并在室温搅拌。搅拌的同时，加入溶解在乙腈中的L-谷氨酸-二乙基酯(H₂NCH(CO₂Et)CH₂CH₂CO₂Et)，室温搅拌12小时后，蒸发掉乙腈。将粗产品溶解于EA中，并用1.0N的HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。用无水MgSO₄干燥、过滤并蒸发后，将所述粗产品装载于硅胶柱中。通过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶己烷)纯化，得到粘稠的黄色液体。

将化合物4用NaOH溶液水解，室温搅拌1天后，蒸发掉有机液体。将该水溶液用EA洗涤、在冰浴中搅拌并用稀HCl酸化。用EA提取该产品后，将该有机溶液用无水MgSO₄干燥，并过滤、蒸发。

3.Boc-[8]-OH(3)

将化合物5、1-[-3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基苯并***水化物(HOBT)溶解于乙腈中，并在室温搅拌。搅拌的同时，加入溶解在乙腈中的L-谷氨酸-二乙基酯(H₂NCH(CO₂Et)CH₂CH₂CO₂Et)，室温搅拌12小时后，蒸发掉乙腈。将粗产品溶解于EA中，并用1.0N的HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。用无水MgSO₄干燥、过滤并蒸发后，将所述粗产品装载于硅胶柱中。通过柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯∶己烷)纯化，得到粘稠的黄色液体。

将化合物6用NaOH溶液水解，室温搅拌1天后，蒸发掉有机液体。将该水溶液用EA洗涤、在冰浴中搅拌并用稀HCl酸化。用EA提取该产品后，将该有机溶液用无水MgSO₄干燥，并过滤、蒸发。

实施例3.4

1.Boc-[2]-CN(3)

在室温下将化合物1溶解于丙烯腈中，加入冰醋酸并回流加热该溶液24小时。真空蒸溜掉过量的丙烯腈，用氯仿提取残留物并加入浓缩的氨水溶液中。分离有机相，用水洗涤并用硫酸钠干燥。

2.Boc-[2]-NH₂(4)

将Boc-[2]-CN 3溶解于甲醇中，并加入六水氯化钴(II)。按比例加入硼氢化钠。将得到的混合物在室温下搅拌2小时，然后小心地用浓盐酸进行酸化，真空去除溶剂并进行浓缩。分离有机相，用水洗涤并用硫酸钠干燥。

3.Boc-[4]-CN(5)

将Boc-[2]-NH₂4在室温下溶解于丙烯腈中，加入冰醋酸并在回流状态下加热该溶液24小时。真空状态下蒸溜掉过量的丙烯腈，用氯仿提取残留物并加入浓缩的氨水溶液中。分离有机相，用水洗涤并用硫酸钠干燥。

4.Boc-[4]-NH₂(6)

将Boc-[4]-CN 5溶解于甲醇中，并加入六水氯化钴(II)。按比例加入硼氢化钠。将得到的混合物在室温下搅拌2小时，然后小心地用浓盐酸进行酸化，真空去除溶剂并进行浓缩。分离有机相，用水洗涤并用硫酸钠干燥。

5.Boc-[8]-CN(7)

将Boc-[4]-NH₂6在室温下溶解于丙烯腈中，加入冰醋酸并在回流状态下加热该溶液24小时。真空蒸溜掉过量的丙烯腈，用氯仿抽提残留物并加入浓缩的氨水溶液中。分离有机相，用水洗涤并用硫酸钠干燥。

6.Boc-[8]-NH₂(8)

将Boc-[8]-CN 7溶解于甲醇中，并加入六水氯化钴(II)。按比例加入硼氢化钠。将得到的混合物在室温下搅拌2小时，然后小心地用浓盐酸进行酸化，真空下去除溶剂并进行浓缩。分离有机相，用水洗涤并用硫酸钠干燥。

7.Boc-[16]-CN(9)

将Boc-[8]-NH₂ 8在室温下溶解于丙烯腈中，加入冰醋酸并在回流状态下加热该溶液24小时。真空蒸溜掉过量的丙烯腈，用氯仿抽提残留物并加入浓缩的氨水溶液中。分离有机相，用水洗涤并用硫酸钠干燥。

7.Boc-[16]-NH₂(10)

将Boc-[6]-CN 9溶解于甲醇中，并加入六水氯化钴(II)。按比例加入硼氢化钠。将得到的混合物在室温下搅拌2小时，然后小心地用浓盐酸进行酸化，真空状态下去除溶剂并进行浓缩。分离有机相，用水洗涤并用硫酸钠干燥。

实施例3.5

1.A-[3]-烯(3)

将A-[1]-SiCl₃ 1用过量10％的溴化烯丙镁在二***中回流4小时，冷却至0℃并用10％的NH₄Cl水溶液水解。将有机层用水洗涤，用MgSO₄干燥并浓缩。

2.A-[3]-SiCl₃(4)

将A-[3]-烯烃3、HSiCl₃和通用的铂基氢化硅烷化催化剂例如丙烷-2-醇(propan-2-ol)中的H2PtCl6(Speier’s催化剂)或二乙烯硅氧烷铂复合物(Karstedt’s催化剂)的混合物在室温下搅拌24小时。反应完成后，真空下去除过量HSiCl₃。

3.A-[9]-烯(5)

将A-[3]-SiCl₃ 4用过量10％的溴化烯丙镁在二***中回流4小时，冷却至0℃并用10％的NH₄Cl水溶液进行水解。将有机层用水洗涤，用MgSO₄干燥并浓缩。

4.A-[9]-SiCl₃(6)

将A-[9]-烯5、HSiCl₃和铂基氢化硅烷化催化剂例如在丙烷-2-醇中的H₂PtCl₆(Speier’s催化剂)或二乙烯硅氧烷铂复合物(Karstedt’s催化剂)的混合物室温搅拌24小时。反应完成后，真空去除过量HSiCl₃。

实施例3.6

1.[1]-酸-[3]-三醇(3)

(a)将三醇1氰乙基化，得到腈化合物2。将丙烯腈、nBu₃SnH和偶氮二异丁腈于110℃加入包含化合物1的PhCH₃中。(b)在诸如KOH、EtOH/H₂O、H₂O₂、加热等条件下，用羧酸彻底水解腈化合物2，生成化合物3。

2.A-[3]-三醇(5)

(c)利用1-[-3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基-苯并***水化物(HOBT)，通过酰胺偶联反应将[1]-酸-[3]-三醇与化合物4连接起来。

3.A-[3]三溴化物(6)

(d)通过用HBr/H₂SO₄在100℃下溴化，可利用乙醇合成三溴化物。

4.[1]-CN-[3]-OBzl(8)

(e)利用Me₂SO和KOH，通过苄基氯处理该三醇1，生成三醚。(f)该三醚8被氰乙基化，得到腈化合物9。将乙腈、nBu₃SnH和偶氮二异丁腈于110℃下加入包含化合物8的PhCH₃中。

5.[1]-OH-[3]-OBzl(11)

(g)在诸如KOH、EtOH/H₂O、H₂O₂、加热等条件下，用羧酸彻底水解腈化合物9，生成化合物10。(h)用过量的1.0M BH3·THF溶液处理具有羧酸的化合物10，将酸转化成醇。

6.[1]-炔-[3]-OBzl(13)

(i)用过量SOCl₂和催化量的吡啶将醇转化成氯化物(CH₂Cl₂)。

(j)使该氯化物与乙炔化锂-乙二胺复合物(lithium acetylideethylenediamine complex)于40℃在二甲基亚砜中发生反应。

7.A-[3]-炔-[9]-OBzl(14)

(k)用4当量的末端炔构件(terminal alkyne building)13、六甲基磷酸三酰胺(HMPA)、二异丙基酰胺锂(LDA)和四甲基乙二胺(TMED)于0-40℃下烷基化该A-[3]-OBzl 61.5个小时。

实施例3.7

1.A-[9]-OH(15)

在含有10％的Pd-C/H的EtOH和THF溶液中，用Pd-C/H将A-[3]-炔-[9]-OBzl 14于60℃还原并去保护(达4天时间)，生成A-[9]-OH 15。

2.A-[27]-COOH(17)

利用溶解在CH₂Cl₂中的SOBr₂于40℃经12小时，可将醇顺利转化为九溴化物。随后用12当量的[1]-炔-[3]-OBzl 13烷化处理该九溴化物，得到49％的A-[9]-炔-[27]-OBzl 16。在含有10％Pd-C/H的EtOH和THF溶液中，用Pd-C/H将A-[9]-炔-[27]-OBzl 16于60℃还原并去保护(达4天时间)，生成89％的A-[27]-OH。A-[27]-OH通过用NH₄OH或(CH₃)₄NOH处理RuO4而被氧化，得到85％的A-[27]-COOH 17。

实施例3.8

1)[G1]-(OMe)₂(3)

将溶解在无水丙酮中的化合物1(1.05mol当量)、3，5-二甲氧基苄溴(1.00mol当量，2)、碳酸钾(1.1mol当量)和18-c-6(0.2mol当量)的混合物在氮气中回流加热48小时。将该混合物冷却并蒸发至干燥，残留物在CH₂Cl₂和水之间分配。用CH₂Cl₂(3×)抽提水层，干燥合并的有机层，并蒸发至干燥。用快速色谱法(洗脱剂：EtOAc-CH₂Cl₂)纯化该粗产品，生成化合物3。

2)[G1]-(OH)₂(4)

在EtOAc溶液中，将化合物3的甲醚基团用BBr₃去保护达1小时，并用快速色谱法(洗脱剂：MeOH-EtOAc)纯化该粗产品，生成化合物4。

3)[G2]-(OMe)₄(5)

将溶解在无水丙酮中的[G1]-(OH)₂(1.00mol当量，4)、3，5-二甲氧基苄溴(2.00mol当量，2)、碳酸钾(2.1mol当量)和18-c-6(0.2mol当量)在氮气中回流加热48小时。将该混合物冷却并蒸发至干燥，残留物在CH₂Cl₂和水之间分配。用CH₂Cl₂(3×)抽提水层，干燥合并的有机层，并蒸发至干燥。用快速色谱法(洗脱剂：EtOAc-CH₂Cl₂)纯化该粗产品，生成化合物5。

4)[G2]-(OH)₄(6)

在EtOAc溶液中，将化合物5的甲醚基团用BBr₃去保护达1小时，并用快速色谱法(洗脱剂：MeOH-EtOAc)纯化该粗产品，生成化合物4。

5)[G3]-(OMe)₈(7)

将溶解在无水丙酮中的[G2]-(OH)₄(1.00mol当量，6)、3，5-二甲氧基苄溴(4.00mol当量，2)、碳酸钾(4.1mol当量)和18-c-6(0.2mol当量)的混合物在氮气中回流加热48小时。将该混合物冷却并蒸发至干燥，残留物在CH₂Cl₂和水之间分配。用CH₂Cl₂(3×)抽提水层，干燥合并的有机层，并蒸发至干燥。用快速色谱法(洗脱剂：EtOAc-CH₂Cl₂)纯化该粗产品，生成化合物7。

6)[G3]-(OH)₈(8)

在EtOAc溶液中，将化合物7的甲醚基团用BBr₃去保护达1小时，并用快速色谱法(洗脱剂：MeOH-EtOAc)纯化该粗产品，生成化合物8。

实施例4-树枝状大分子在支持物上的组装

TMAC(氯化N-三甲氧基甲硅烷丙基-N，N，N-三甲基铵)在氧化玻璃上而非APDES上自组装。TMAC层上的树枝状聚合物层不需要覆盖残留胺。

利用TMAC的氨硅烷化(Aminosilylation)。将干净的支持物(载玻片)放入TMAC(2mL)和丙酮(100mL)溶液中，达5小时。自组装后，将所述支持物从瓶中取出，并用丙酮洗涤。将该支持物放入烤箱中，110℃加热40分钟。将支持物浸入丙酮中，然后超声处理3分钟。将洗涤过的支持物放入Teflon(特氟纶)容器中，然后放入一个具有大螺旋帽(具有O形圈)的玻璃容器中，最后将该容器抽真空(30-40mTorr)以干燥所述支持物。

TMAC的结构(氯化N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-三甲基铵)

Fmoc-间隔分子-[9]酸的自组装在与CBz-[9]酸相同的条件下实施，只是利用无水醋酸覆盖(cap)残留胺(residual amines)。

Fmoc-间隔分子-[9]酸(5)的自组装。将一定量的Fmoc-间隔分子-[9]酸(5)溶解于混合溶剂(DMF：去离子水＝1∶1(v/v))中，得到20ml溶液。将该溶液加入特氟纶容器中，随后将上述制备的氨硅烷化载玻片放入该溶液中。尽管允许将烧瓶置于室温下进行组装，1天后将每片支持物均从所述溶液中取出。取出后，立刻用大量去离子水冲洗该板。每片支持物依次在去离子水、去离子水-甲醇(1∶1(v/v))的混合物和甲醇中超声处理3分钟。超声处理后，将所述支持物放入特氟纶容器中，然后放入一个具有大螺旋帽(具有O形圈)的玻璃容器中，最后将该容器抽真空(30-40mTorr)而干燥所述支持物。

Fmoc从已自组装的Fmoc-间隔分子-[9]酸(5)去保护。准备含有溶解在DMF中的5％哌啶的Teflon容器。将自组装的支持物浸入容器中，搅拌20分钟。每片支持物依次在丙酮和MeOH中超声处理3分钟，并在真空箱(30-40mTorr)中抽真空。

实施例5：制备树枝状大分子修饰的AFM针尖和支持物

材料

甲硅烷偶联剂N-(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷(TPU)从Gelest，Inc.购买，所有其他化学物质均为试剂级，来自Sigma-Aldrich。UV级熔融硅石板从CVI Laser Co.购买。抛光的主要的Si(100)晶片(掺杂剂，磷；电阻率，1.5-2.1Ω.cm)从MEMCElectronic Materials，Inc购买。去离子水(18MΩ.cm)通过使蒸馏水流过Barnstead E-pure 3-Module***而获得。厚度用J.A.WoollamCo.的可变角的椭偏光谱仪(Model M-44)进行测量。UV-vis光谱用Hewlett-Packard二极管阵列8453分光光度计进行记录。

1)清洁所述支持物。将熔融石英板和硅晶片在Piranha溶液(浓H₂SO₄∶30％H₂O₂＝7∶3(v/v))中超声处理4小时。(注意：Piranha溶液可***性地氧化有机材料。避免与可氧化材料接触。)超声处理后，用去离子水洗涤所述板并彻底漂洗。随后，将所述支持物浸入含去离子水、浓氨水溶液和30％的过氧化氢(5∶1∶1(v/v/v))混合物的Teflon烧杯中。将烧杯置于水浴中，于80℃加热10分钟。将支持物从该溶液中取出并用去离子水彻底冲洗后，然后将支持物置入含去离子水、浓盐酸和30％的过氧化氢(6∶1∶1(v/v/v))混合物的Teflon烧杯中，将烧杯于80℃加热10分钟。将支持物从该溶液中取出并用足量去离子水洗涤并彻底漂洗后，将干净的支持物在真空箱(30-40mTorr)中干燥约20分钟，立即用于接下来的步骤。

2)清洁针尖。首先，通过浸没在10％硝酸中并于80℃加热20分钟而活化具有锥形针尖(Veeco Instrument；k＝10Pn/mm)的标准V形氮化硅悬臂(MLCT-AUNM)。将该悬臂从溶液中取出并用足量去离子水洗涤并彻底漂洗后，将干净的悬臂在真空箱(30-40mTorr)中干燥约20分钟，立即用于接下来的步骤。

3)氨硅烷化。将干净的熔融石英、硅晶片和悬臂在氮气环境下浸入含偶联剂(0.2mL)的无水甲苯(20mL)中，并置于该溶液中6小时。硅烷化后，将该支持物和悬臂用甲苯洗涤，并于110℃烘烤30分钟。将所述支持物依次浸入甲苯、甲苯-甲醇(1∶1(v/v))和甲醇中，并在每种洗涤液中超声处理3分钟。将悬臂依次用甲苯和甲醇彻底漂洗。最后，真空(30-40mTorr)下干燥所述支持物和悬臂。

4)制备树枝状大分子修饰的表面。将上述羟基化的支持物和悬臂浸入二氯甲烷溶液中达12-24小时，该二氯甲烷溶液含有少量DMF，在4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.9mM)存在的情况下溶解树枝状大分子(1.0mM)、偶联剂和1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)中。本发明中采用的树枝状大分子(9-蒽甲基N-({[三({2-[({三[(2-羧乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]乙氧基}甲基)甲基]氨基}羰基)丙基氨基甲酸酯)在该组进行制备。反应后，将支持物依次浸入二氯甲烷、甲醇和水中，并在每个洗涤步骤中超声处理3分钟，而将悬臂依次用二氯甲烷、甲醇和水彻底漂洗。最后，将所述支持物和悬臂用甲醇洗涤并真空干燥(30-40mTorr)。

实施例6：寡核苷酸的固定

1)将碳蒽基甲氧(carboanthrylmethoxy)基团从树枝状大分子表面去保护。将树枝状大分子修饰的支持物和悬臂浸入含1.0M三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液中，并搅拌3小时。反应后，将其在含20％(v/v)二异丙基乙胺(DIPEA)的二氯甲烷溶液中浸泡10分钟。将支持物在二氯甲烷和甲醇中各超声处理3分钟，而悬臂则依次用二氯甲烷和甲醇彻底漂洗。真空(30-40mTorr)干燥所述支持物和悬臂。

2)制备NHS修饰的支持物。在氮气环境下，将上述去保护的支持物和悬臂浸入含二(N-丁二酰亚胺)碳酸酯(DSC)(25mM)和DIPEA(1.0mM)的乙腈溶液中4小时。反应后，将所述支持物和悬臂置入搅拌的二甲基甲酰胺中30分钟，并用甲醇洗涤。真空(30-40mTorr)干燥所述支持物和悬臂。

3)在树枝状大分子修饰的支持物上固定寡核苷酸。

将上述NHS修饰的支持物和悬臂浸泡在溶于含5.0mM MgCl₂的25mM NaHCO₃缓冲液(pH8.5)的寡核苷酸(20μM)中12小时。反应后，将所述支持物和悬臂在杂交缓冲液(含7.0mM十二烷基磺酸钠的2x SSPE缓冲液(pH7.4))中于37℃搅拌1小时，并在沸水中搅拌5分钟，以去除非特异性结合的寡核苷酸。最后，真空(30-40mTorr)干燥所述支持物和悬臂。待固定的寡核苷酸示于表1中。

实施例7：AFM力测定

7-1：样品制备

为了理解所述间隔的效应，通过利用两种硅烷试剂例如GPDES和TPU对支持物采用两种类型的修饰(9-酸/GPDES支持物和9-酸/TPU支持物)，同时通过采用9-酸/TPU而固定AFM针尖上的间隔。支持物的表面修饰根据实施例1而实施。SEQ ID NO：1-4示出的寡核苷酸分别按照实施例2而固定于9-酸/TPU支持物上，而SEQ IDNO：2表示的30bp互补DNA则固定于9-酸/GPDES支持物上。SEQID NO：5-20示出的寡核苷酸分别固定于9-酸/TPU型的AFM针尖上。

表2

在该实施例中，9-酸树枝状大分子是(9-蒽甲基N-({[三({2-[({三[(2-羧乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]乙氧基}甲基)甲基]氨基}羰基)丙基氨基甲酸酯)，而27-酸树枝状大分子则在实施例3中加以描述。

7-2：AFM力测定

所有的力测定均通过Nano Wizard AFM(JPK Instrument)来实施。每次实验前，每个单独AFM针尖的弹性常数，k_c，均在溶液中通过NanoWizard软件利用热波动法进行校准。弹性常数在12和15pN/nm之间变化。所有的测定均于室温下在新鲜PBS缓冲液(pH7.4)中进行。力测定的加载速率在110nm/s和540nm/s之间变化。在每种实验条件下，力曲线在每一点处记录100次以上，且检查至少5个以上的点。在这些测定中，既记录结合力又记录非结合力。为了计算针尖实际移动的距离，从压电位移(piezodisplacement)中减去悬臂的移位。将所述力除以悬臂弹性常数，即得到悬臂移位。

7-3：由30个碱基对的互补DNA固定的9-酸/GPDES支持物的非结合力

利用SEQ ID NO：2中示出的固定于9-酸/GPDES支持物上的寡核苷酸和SEQ ID NO：6中示出的固定于9-酸/TPU AFM针尖上的寡核苷酸，可根据实施例3-2的AFM测定，以110nm/s至540nm/s之间范围内的不同加载速率进行AFM力测定，获得回缩速率(retraction rate)110nm/s下的非结合力分布(图4A)以及回缩速率540nm/s下的力-距离曲线(图4B)和非结合力分布(图4C)。

在回缩速率540nm/s下，观察到一个大的非结合力，其属于多个寡核苷酸的相互作用(图4B)。此外，该柱状图相当宽(最大半宽度是15pN)且不能分辨(图4C)。然而，在回缩速率110nm/s下，该柱状图(图4A)可分解为3个峰，且每个峰都比较尖锐(第一个峰的最大半宽度是3pN)。对该特征做出确切解释并不容易，但37pN的第一个峰很可能来自单个DNA-DNA相互作用(参见下文)，另外两个峰(46pN和55pN)代表除单个DNA-DNA相互作用之外二级相互作用的非结合力(unbinding event)。

图4A是一个柱状图，示出了间隔(通过GPDES支持物上的树枝状大分子实现的)相对较窄时，互补的30个碱基对的力分布。图4B是以540nm/s的回缩速率直接测定的互补的30个碱基对的单一非结合力。图4B是以540nm/s的回缩速率测定的互补的30个碱基对之间的力-距离曲线。在540nm/s的回缩速率下，可观察到大得多的力(蓝色曲线)，其属于多个寡核苷酸的相互作用(为了比较，显示了在110nm/s的回缩速率下观察到的非结合力(红色曲线))。图4C示出了在540nm/s的回缩速率下非结合力的概率分布。该柱状图示出了间隔(通过GPDES表面上的的树枝状大分子而实现)相对较窄时，观察到的力分布。通过高斯拟合发现该分布的最大值是68±13pN，且无法分辨该分布曲线而示出单一的相互作用。

7-4：由互补的30个碱基对的DNA固定的9-酸/TPU支持物的结合力和非结合力

利用SEQ ID NO：2中示出的固定于9-酸/TPU支持物上的寡核苷酸和SEQ ID NO：6中示出的固定于9-酸/TPU AFM针尖上的寡核苷酸，可根据实施例3-2所述的AFM测定，以110nm/s的回缩速率进行AFM力测定，获得非结合力分布(图5A)以及结合力-距离曲线(图5B)和结合力分布曲线(图5C)。

当DNA固定于9-酸/TPU表面上时，非结合力柱状图(图5A)仅示出一个在37±2pN下的峰，且该峰的狭窄较突出。在46pN和55pN时小峰消失，确证了这些峰代表与二级相互作用相关的力。为了分析上述两种情况，仅弃掉不正常曲线，超过90％的测量值均包括在该曲线中。尽管在9-酸/GPDES的情况下，该曲线通常呈锯齿状，9-酸/TPU的曲线则均未表现出锯齿状。因此，由于间隔足够，可能通过以TPU作为甲硅烷试剂来修饰支持物表面，而测定单个DNA-DNA相互作用。

每次当针尖接近树枝状大分子修饰的表面时，均可观察到结合力(图5B)。

在该具体过程中，9-酸/TPU修饰的表面再次生成单次浸没(single dip)力曲线，而9-酸/GPDES修饰的表面则通常表现为双次-或多次-浸没(double-or multiple-dipped)力曲线。由于该性质如此一致且可重复，因此无需弃掉任何数据即可生成该柱状图。正如在非结合力的柱状图中，峰较狭窄(最大半宽度是3pN)，且数值39pN非常接近非结合情况的峰值。有趣的是，当恰当控制DNA之间的间隔时，即可观察到这种未曾有过的结合过程。

此外还发现结合力性质较少依赖于加载速率。换句话说，在70nm/s和540nm/s之间的任何加载速率，均可获得相同的柱状图(图5C)。采用不同的针尖和样品，多次重复该特定实验，可一致地再现上述结合行为和柱状图。

7-5：用于检测单链相互作用的27-酸与TPU修饰的支持物的非结合力

之前，甚至在较慢的回缩速率下，也可记录到其他互补的30个碱基的DNA的48pN的非结合力(T.Strunz，K.Oroszlan，R.Schaefer，，H.-J.Guentherodt，Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.96，11277，1999)。有趣的是，即使利用相同GC含量的DNA，也可观察到较小的非结合力。

为了检测这些相互作用是来自单链还是多链，采用了更高一级的树枝状大分子27-酸。预计第三级树枝状大分子提供10nm左右的间隔。支持物上的间隔随着27-酸和TPU的结合而增大，而AFM针尖则用9-酸/TPU进行修饰。有趣的是，可观察到该柱状图与9-酸/TPU情况的柱状图完全相同。用27-酸/TPU修饰的AFM针尖，再次观察到相同的柱状图。唯一差异在于观察到非结合力的几率降低了。对于最后一种情况，约50％的回缩一点也没显示出非结合现象。这种改变似乎是合理的，因为寡核苷酸之间的间隔过大会降低杂交的几率。该特征清楚地表明，为了实现单链相互作用，9-酸/TPU生成的间隔已经足够大。

7-6：互补DNA双链的结合力和非结合力

检测其他寡核苷酸之前，在上述条件下检测所述力测定的准确性。制备不同批次的样品，并校准悬臂。本发明的发明人发现变异在10-15％之内。该数值表明对所述表面的可再现及精确的控制允许小的误差：该数值从未超过与弹性常数校准有关的误差。利用9-酸/TPU修饰的表面，可以110nm/s的加载速率实施20、30、40和50碱基对(表1)的DNA双链的结合和非结合。在接近-回缩(approach and retract)的循环过程中，可以获得每一二聚体的力-距离曲线。

正如之前在上文中提到的，结合和非结合柱状图几乎相同，且平均力的数值相等。20、30、40和50个碱基对的互补DNA双链的非结合力柱状图分别在图6A和6C中示出。

在图6A所示出的柱状图中，观察到非重叠峰，且随着DNA长度增加而出现的力净增值。对于20、30、40和50个碱基对的值分别为29pN、39pN、50pN和59pN。相应地，每增加10个DNA碱基，力的增量大约是10pN。为了验证，测定了非互补DNA链的力。在所有情况中，力曲线大部分未检测到，仅有较低的概率记录到10pN的微弱作用力。

在图6B中，20、30、40和50个碱基对的互补DNA双链的力-压电位移曲线通过用图4的结合力分布曲线计算而获得。从该力-压电位移曲线可得到所观察到的针尖朝表面移动(以缓解结合过程中的张力)的距离，将值作图。在该特定情况下，对于20-mer、30-mer、40-mer和50-mer的情况所记录的距离分别为2.4nm、3.2nm、3.6nm和4.2nm。因为峰相当窄，且距离似乎随着DNA长度呈线性增加，该参数对于分析在未知样品中的相互作用-DNA长度应该具有诊断价值。

7-7：错配DNA双链的结合力分布

为了进一步探测该识别现象，记录了单碱基和双碱基错配对(表1)的相互作用力曲线。利用SEQ ID NO：5-8示出的固定于9-酸/TPU支持物上的寡核苷酸(用于单碱基错配的DNA)，SEQ IDNO：9-12中示出的固定于9-酸/TPU支持物上的寡核苷酸(用于双碱基错配的DNA)以及利用SEQ ID NO：1-4中示出的固定于9-酸/TPUAFM针尖上的寡核苷酸，可根据实施例3-2所述的AFM测定，以110nm/s的回缩速率进行AFM力测定，以获得单碱基错配的DNA双链的结合力分布(图7)以及双碱基错配的DNA双链的结合力分布(图8)。

如所预期的，我们发现错配的引入降低了结合和非结合力。如单碱基错配对的图7中所示出的，对于20-mer、30-mer、40-mer和50-mer观察到的结合力分别为27pN、37pN、43pN和50pN。如双碱基错配对的图8中所示出的，对于20-mer、30-mer、40-mer和50-mer观察到的结合力分别为24pN、32pN、40pN和45pN。

正如之前互补DNA双链的情形，结合力和非结合力是相等的。然而，对于单碱基错配，20mer和30mer仅有微弱的降低(2pN)。同时，40mer和50mer则观察到了显著的降低(＞7pN)。该结果表明采用长于40mer的DNA可保证单点突变的可靠检测。如所预期的，双碱基错配对则观察到了较大的力降低。例如，20mer观察到了5pN的降低，而50mer则观察到了14pN的降低。值得注意的是，皮力(picoforce)AFM在单分子水平检测单一的点突变的能力。

实施例8-信号转导蛋白之间生物分子的相互作用

之前的研究表明，通过控制树枝状大分子的大小，树枝状大分子修饰的表面可确保连接于表面上的生物分子之间具有足够的间隔。在本研究中，AFM针尖和固态支持物例如Si晶片也利用树枝状大分子功能化，以提高在单分子水平蛋白之间的识别效率，如在以前发表的文章(Langmuir 2005，21，4257)和序列号为10/917,601的美国专利申请中所描述的。本文采用的树枝状大分子与以前(Langmuir 2005，21，4257)所用的相同，但序列号为10/917,601的美国专利申请中提到的所有树枝状大分子均可用于本研究。

保护基团去保护后，将树枝状大分子修饰的支持物与少量DMF溶解的N-琥珀酰亚胺-4-马来酰亚胺丁酸酯(GMBS)(16mM)一起在50mM的NaHCO₃缓冲液(pH8.5)中孵育。室温孵育3小时后，用去离子水彻底漂洗。将涂布有GMBS的支持物浸于含谷胱苷肽(GSH)(16mM)的PBS缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，2.7mM KCl，137mM NaCl，pH7.4)中12小时，随后在去离子水中超声处理3分钟。浸于含2-巯基乙醇(1.6M)的PBS缓冲液中2小时以去除残留的活性GMBS官能团，然后在去离子水中超声处理3分钟。接下来，将GSH涂布的支持物在含0.43μg/ml GST标记的PLD1-PX的PBS缓冲液中于4℃孵育30分钟，随后用PBST缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，2.7mM KCl，137mM NaCl，0.1％吐温20，pH7.4)漂洗。最后，将其于4℃储存在PBS缓冲液中，用于进一步的研究。

将氮化硅(Si₃N₄)AFM针尖浸于HNO₃∶H₂O(3∶1(v/v))溶液中，80℃加热20分钟后，用去离子水洗涤针尖。对已清洁针尖的修饰与Si晶片支持物的修饰相同，只是引入了GST标记的Munc-18-1。将GSH涂布的针尖在含0.97μg/ml GST标记的Munc-18-1的PBS缓冲液中于4℃孵育30分钟，最终的涂布针尖用PBST缓冲液漂洗并储存于4℃，用于进一步的研究。

Munc-18-1和PLD1-PX都是信号转导蛋白，已知脑细胞胞浆内的Munc-18-1在体内与磷脂酶D1(PLD1-PX)通过PLD1-PX的PX结构域形成复合物。

当涂布有Munc-18-1的AFM针尖靠近到涂布有PLD1-PX的支持物上并随后撤回时，可测定两种蛋白之间的结合力(图12)。测得的力恒定在50pN左右，这意味着在本研究中是一个Munc-18-1分子与一个PLD1-PX相互作用(图14(a))。此外，当A-[27]-酸而非A-[9]-酸用作树枝状大分子时，观察到单一相互作用与多重相互作用的比率从1.5∶1提高至3∶1。该结果表明较大尺寸的生物分子需要表面上彼此之间存在较大间隔，用于特异性单一相互作用，而这个需求通过利用尺寸可控的树枝状大分子可以很轻易地满足。对于其他研究，为了证明测得的力来自Munc-18-1与PLD1-PX之间的特异性相互作用而不是非特异性，在溶液中加入过量的游离Munc-18-1，在力测定的过程中封闭PLD1-PX的结合位点(图13(a))。结果未观察到针尖上Munc-18-1与支持物上PLD1-PX之间的相互作用力(图14(b))。因此，上述结果表明Munc-18-1以恒定力特异性结合于PLD1-PX，且树枝状大分子修饰的表面可控制表面上生物分子之间的间隔，得到特异性单一生物分子的相互作用。

实施例9-三种不同生物分子之间的生物分子相互作用及其在药物筛选中的应用

某些人类疾病来源于体内蛋白之间不需要的相互作用，已经利用几种药物筛选方法来寻找用于那些疾病的最佳候选药物。最近，已将Bio-AFM用于药物筛选试验。该方法通过测定两种不同蛋白在加入候选药物前后的相互作用力来确定药物效力。此外，通过控制原位药物浓度，可能很简单地检测用于医学治疗的最佳药物浓度。本文中，我们发现树枝状大分子修饰的表面适用于利用Bio-AFM的药物筛选。

在本研究中，将Munc-18-1和PLD1-PX分别引至AFM针尖和诸如Si晶片的支持物上，如在实施例8中所描述的。候选药物是PLC-γ1，其在固态支持物上结合于PLD1-PX，与针尖上的Munc-18-1竞争(图13(b))。用几种不同浓度的PLC-γ1检测发现，高浓度的PLC-γ1完全阻止PLD1-PX与Munc-18-1的结合，低浓度则不能(图15)。因此，该研究表明PLC-γ1是Munc-18-1的竞争剂，PLD1-PX与Munc-18-1之间的相互作用力依赖于PLC-γ1的浓度。因此，该Bio-AFM分析可延伸用于药物发现和医学治疗的研究。

实施例10-抗生物素蛋白链菌素与生物素之间的生物分子相互作用

抗生物素蛋白链菌素和生物素已广泛用作简单的生物分子相互作用模型。本文中，该简单模型用于利用Bio-AFM的力测定研究领域。因为抗生物素蛋白链菌素在一个面上有两个结合位点，因此难以证明通过Bio-AFM测得的力来自一个抗生物素蛋白链菌素分子和一个生物素分子之间的相互作用。然而，通过用树枝状大分子控制生物分子之间的间隔，我们可以很容易观察到一对一的相互作用力。

AFM针尖和诸如Si晶片的固态支持物用树枝状分子功能化，如在实施例8中所描述的。通过DSC(二(N-丁二酰亚胺)碳酸酯)连接分子将抗生物素蛋白链菌素连接于支持物上，将生物素连接于针尖上。测得的力是恒定的，几乎类似于已发表的认为来自于一个抗生物素蛋白链菌素分子与一个生物素分子之间的相互作用的结果的数值。该结果表明生物素分子通过在树枝状大分子修饰的表面上的单一相互作用而特异性结合于抗生物素蛋白链菌素分子。

此外，还观察到涂布A-[9]-酸的表面上的单一相互作用与多重相互作用的比率大于涂布A-[3]-酸的表面上的该比率，即由于A-[3]-酸的尺寸较小，表面上生物分子之间的间隔对于一对一相互作用尚不足够。因此，由于树枝状大分子修饰的表面可控制表面上生物分子之间的间隔，因此可确保特异性的单一生物分子相互作用。

实施例11-通过肽与蛋白之间分子相互作用的细胞表面上特异性配体的定位

尽管利用共聚焦显微镜已经深入研究了分子表面上的受体与配体之间的相互作用，但该方法存在一个不可解决的问题，即无法以高分辨率在纳米水平确定细胞上每一个受体。最近，已经制造了Bio-AFM仪器来克服这个限制。然而，尽管已表明该方法可单独确定每一个受体，但其还是具有不满意的问题，即ATM针尖与细胞表面的非特异性结合以及针尖上配体与细胞上受体之间的多重结合。这些问题可能提供细胞上受体分布的错误信息。前面的研究表明树枝状大分子修饰的表面具有与生物分子低非特异性结合的特征，且可通过提供连接于该表面上的生物分子之间的足够间隔而确保单个生物分子相互作用。因此，所述树枝状大分子修饰的表面有助于利用Bio-AFM而以高分辨率单独检测每个受体。

本研究中采用的RBL₂H₃细胞具有过度表达的FPR1(甲酰肽受体1)，其与炎症相关。在含5％CO₂的环境下，于37℃在DMEM(10％FBS，1％青霉素/链霉素)中培养48小时后，利用5％Matrigel溶液将5×10⁴细胞/ml的细胞黏附于盖玻片上。结合于FPR1的配体是一种由6个氨基酸构成的合成肽，其引起炎症且在N末端位置具有半胱氨酸，用于与诸如下文的GMBS连接分子相连接。此外，通过N末端乙酰化和C末端酰胺化，使得所述肽的电荷被中和。

Ac-半胱氨酸-连接分子-WKYMVm-NH₂

AFM针尖利用树枝状大分子进行修饰，如实施例8中所描述的。用GMBS和所述肽配体功能化后，该针尖扫描细胞表面，测定受体与细胞特定区域上的配体之间的力(图16(a))。该实验在1×PBS缓冲液(pH 7.4)中在室温下进行，采用NanoWizard

原子力显微镜(JPK Instruments，Inc)作为Bio-AFM。

图16示出了部分测得的力曲线，其中蓝线表示回缩针尖时向后的力曲线。从该曲线，可计算每个力，并最终合并为一个力图谱(force map)，代表细胞表面上的受体分布。图17示出了FPR1与其配体肽之间相互作用的力图谱和力柱状图。亮像素表示图谱上较强的力，而暗像素则表示较弱的力(图17&18)。从所述力柱状图(图17)观察到两个显著的力，31pN和55pN。为了进一步研究，用竞争剂即在溶液中的游离WKYMV实施了另外的实验，以证明所测得的力的确来自于FPR1与其配体肽之间的特异性相互作用(图18)。结果发现，与游离肽WKYMVm(SEQ ID NO：17)一起孵育1小时后，60pN左右的一组力显著降低。该结果表明60pN左右的力来自于受体与配体之间的特异性相互作用，但30pN左右的力则是由于非特异性相互作用的背景力。

实施例12-蛋白质与糖脂之间的生物分子相互作用

已知霍乱毒素B选择性结合于其中一种糖脂-神经节苷脂GM1(其存在于人内脏上皮细胞的表面)，随后引起疼痛。本发明中，我们通过测定与其配体霍乱毒素B的作用力，来研究神经节苷脂GM1在细胞表面上的分布。

待测细胞是带有过表达神经节苷脂GM1的人上皮细胞。在含5％CO₂的环境下，于37℃在DMEM(10％FBS，1％青霉素/链霉素)中培养48小时后，利用5％Matrigel溶液将5×10⁴细胞/ml的细胞黏附于盖玻片上。用树枝状大分子修饰AFM针尖，随后将保护基团去保护，如在实施例8中所描述的。用连接分子和霍乱毒素B功能化后，该针尖扫描细胞表面，测定受体与细胞特定区域上配体之间的力。该实验在1×PBS缓冲液(pH 7.4)中室温进行，采用NanoWizard

原子力显微镜(JPK Instruments，Inc)作为Bio-AFM。

实施例13-凝集素与糖蛋白之间的生物分子相互作用

刀豆素A是一种凝集素蛋白，已经广泛用于研究糖蛋白的特征，因为其与糖蛋白强烈结合。本发明中，我们研究了末端位置具有甘露糖的糖蛋白分布，利用刀豆素A作为配体。该实验中采用的细胞是其表面上具有糖蛋白的成纤维细胞。

在含5％CO₂的环境下，于37℃在RPMI(10％FBS，1％青霉素/链霉素)中培养48小时后，利用5％Matrigel溶液将5×10⁴细胞/ml的细胞黏附于盖玻片上。用树枝状大分子修饰AFM针尖，随后将保护基团去保护，如在实施例8中所描述的。用连接分子和刀豆素A功能化后，该针尖扫描黏附于盖玻片上的细胞的表面，测定受体与细胞特定区域上配体之间的力。该实验在1×PBS缓冲液(pH7.4)中室温下进行，采用NanoWizard

原子力显微镜(JPKInstruments，Inc)作为Bio-AFM。

实施例14-碳水化合物与糖蛋白之间的生物分子相互作用

结核分枝杆菌可引起肺结核，是因为其表面具有HBHA(肝磷脂结合的血凝黏附素)，可结合于肺上皮细胞上的肝磷脂。这里我们用肝磷脂作配体，研究HBHA在结核分枝杆菌表面的分布。该实验中采用的细胞是其表面上具有HBHA的牛分枝杆菌BCG细胞。

在含5％CO₂的环境下，于37℃在索东(Sauton)培养基中培养48小时后，利用5％Matrigel溶液将5×10⁴细胞/ml的细胞黏附于盖玻片上。用树枝状大分子修饰AFM针尖，随后将保护基团去保护，如在实施例8中所描述的。用连接分子和肝磷脂功能化后，该针尖扫描黏附于盖玻片上的细胞的表面，测定受体与细胞特定区域上配体之间的力。该实验在1×PBS缓冲液(pH 7.4)中在室温下进行，采用NanoWizard原子力显微镜(JPK Instruments，Inc)作为Bio-AFM。

实施例15-神经生长因子(NGF)与酪氨酸激酶A之间的生物分子相互作用

已知NGF可结合于神经细胞表面上的TrkA(酪氨酸激酶A)，并控制其生存功能。在本研究中，我们研究了表达在嗜铬细胞瘤PC12细胞表面上的TrkA分布，利用NGF作为配体。

在含5％CO₂的环境下，于37℃在RPMI(5％FCS，1％青霉素/链霉素)中培养48小时后，利用5％Matrigel溶液将5×10⁴细胞/ml的细胞黏附于盖玻片上。用树枝状大分子修饰AFM针尖，随后将保护基团去保护，如在实施例8中所描述的。用连接分子和所述配体NGF功能化后，该针尖扫描黏附于盖玻片上的细胞的表面，测定受体与细胞特定区域上配体之间的力。该实验在1×PBS缓冲液(pH 7.4)中在室温下进行，采用NanoWizard

原子力显微镜(JPKInstruments，Inc)作为Bio-AFM。

尽管本发明是与认为比较实用的示范性实施例相联系而阐述的，应该理解本发明并不限于已披露的实施例，但是，相反，本发明旨在覆盖包含于附属权利要求的精神和范围内的多种改良和等同安排。

Claims

1.一种用于原子力显微镜的悬臂，包括具有固定端和自由端的悬臂体，所述自由端具有由树枝状大分子化学修饰的表面区域，其中所述树枝状大分子的分支区的多个末端结合于所述表面，并且所述树枝状大分子的线性区的末端被功能化。

2.根据权利要求1所述的悬臂，其中在所述自由端附近设置有至少一个锥形突起。

3.根据权利要求2所述的悬臂，其中所述突起是角锥形或圆锥形的。

4.根据权利要求1所述的悬臂，其中所述树枝状大分子在线性官能团之间以约0.1nm和约100nm之间的固定间隔隔开。

5.根据权利要求4所述的悬臂，其中所述树枝状大分子以约10nm的固定间隔隔开。

6.根据权利要求1所述的悬臂，其中所述分支区的末端用-COZ、-NHR、-OR’或-PR”3功能化，其中Z是离去基团，R是烷基、其中R’是烷基、芳香基或醚，并且R”是H、烷基或烷氧基。

7.根据权利要求6所述的悬臂，其中所述COZ是酸、酯、活化酯、酸性卤化物、活化酰胺或CO-咪唑基。

8.根据权利要求1所述的悬臂，其中所述线性区包括间隔区。

9.根据权利要求8所述的悬臂，其中通过第一官能团将所述间隔区连接于所述分支区。

10.根据权利要求9所述的悬臂，其中所述官能团是-NH₂、-OH、-PH₃、-COOH、-CHO或-SH。

11.根据权利要求8所述的悬臂，其中所述间隔区包含共价结合于所述第一官能团的连接区。

12.根据权利要求11所述的悬臂，其中所述连接区包括取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳香基、醚、聚醚、酯或氨烷基。

13.根据权利要求8所述的悬臂，其中所述间隔区包括第二官能团。

14.根据权利要求13所述的悬臂，其中所述第二官能团是-NH₂、-OH、-PH₃、-COOH、-CHO或-SH。

15.根据权利要求13所述的悬臂，其中所述第二官能团位于所述线性区的末端。

16.根据权利要求1所述的悬臂，其中保护基团结合于所述线性区的末端。

17.根据权利要求16所述的悬臂，其中所述保护基团是酸不稳定的或碱不稳定的。

18.根据权利要求1所述的悬臂，其中探针核苷酸或配体结合于所述树枝状大分子的线性区的末端。

19.根据权利要求18所述的悬臂，其中所述探针核苷酸或配体以约0.01探针/nm²至约0.5探针/nm²范围的低密度存在。

20.根据权利要求18所述的悬臂，其中所述探针核苷酸是DNA、RNA、寡核苷酸、cDNA、核苷酸类似物或其组合。

21.根据权利要求18所述的悬臂，其中结合于所述树枝状大分子线性区的探针核苷酸之间的距离为约0.1nm至约100nm。

22.一种用于制造根据权利要求1所述的悬臂的方法，包括(i)功能化所述悬臂的表面区域，使得所述悬臂的表面区域可与所述树枝状大分子末端起反应；以及(ii)使所述树枝状大分子接触所述表面区域以便所述末端与所述表面成键。

23.根据权利要求22所述的用于制造悬臂的方法，其中探针核苷酸或配体固定于所述树枝状大分子线性区的末端，包括以下步骤i)从在所述表面区域上所述树枝状大分子线性区的末端去除保护基团；以及ii)将所述探针核苷酸、配体或连接于所述探针核苷酸或配体的连接分子接触所述支持物上树枝状大分子线性区的末端，从而使所述探针核苷酸、配体或连接分子与所述末端成键，其中所述连接分子是同双官能或异双官能连接子。

24.一种利用AFM测定一个探针核苷酸与一个靶核苷酸之间相互作用的设备，所述设备包括：

具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端的表面区域由树枝状大分子进行化学修饰，其中所述树枝状大分子的分支区的多个末端结合于所述表面，并且所述树枝状大分子线性区的末端连接于根据权利要求1所述的探针核苷酸；

支持物，所述靶核苷酸固定于所述支持物上；

控制器，用于调节所述悬臂和靶核苷酸支持物的相对位置和方向，以引起固定于所述悬臂的所述树枝状大分子修饰的表面区域上的所述探针核苷酸与固定于所述支持物上的所述靶核苷酸之间的相互作用；以及

检测器，用于测定与所述探针核苷酸和所述靶核苷酸之间的相互作用相关的物理参数。

25.根据权利要求24所述的设备，其中所述支持物由树枝状大分子进行修饰，所述靶核苷酸固定于所述树枝状大分子。

26.一种分析靶核苷酸与探针核苷酸相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端的表面区域由树枝状大分子进行化学修饰，其中所述树枝状大分子分支区的多个末端结合于权利要求1所述的表面；

(b)将靶核苷酸固定于支持物上；

(c)化学修饰所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域，以固定探针核苷酸；

(d)将所述支持物和所述悬臂连接于包含控制器的设备，所述控制器用于调节所述支持物和所述悬臂的相对位置和方向，以引起固定于所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域上的所述探针核苷酸与固定于所述样品支持部件的支持物上的所述靶核苷酸之间的相互作用；

(e)控制所述悬臂和所述支持物的相对位置和方向，以引起探针核苷酸与所述靶核苷酸之间的相互作用；以及

(f)测定与所述探针核苷酸和所述靶核苷酸之间相互作用相关的物理参数。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述探针核苷酸是单链DNA或RNA，所述靶核苷酸是DNA或RNA的互补链或碱基错配链。

28.根据权利要求26所述的方法，其中在步骤(b)中，所述支持物由树枝状大分子进行化学修饰，以将靶核苷酸固定于其上。

29.一种通过AFM测定一个配体与一个靶受体之间相互作用的设备，所述设备包括：

具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端具有由树枝状大分子进行化学修饰的表面区域，其中所述树枝状大分子分支区的多个末端结合于所述表面，并且所述树枝状大分子线性区的末端连接于根据权利要求1所述的配体；

支持物，所述靶受体固定于所述支持物；

控制器，用于调节所述悬臂和靶受体支持物的相对位置和方向，以引起固定于所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域上的所述配体与固定于所述支持物上的所述靶受体之间的相互作用；以及

检测器，用于测定与所述配体和靶受体之间相互作用相关的物理参数。

30.一种分析靶受体与配体相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供具有固定端和自由端的悬臂，所述自由端具有由树枝状大分子进行化学修饰的表面区域，其中所述树枝状大分子分支区的多个末端结合于权利要求1所述的表面；

(b)将配体固定于支持物上；

(c)化学修饰所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域，以固定配体；

(d)将所述支持物和所述悬臂连接于包含控制器的设备，所述控制器用于调节所述支持物和所述悬臂的相对位置和方向，以引起固定于所述悬臂的树枝状大分子修饰的表面区域上的所述配体与固定于所述样品支持部件的所述支持物上的所述靶受体之间的相互作用；

(e)控制所述悬臂和所述支持物的相对位置和方向，以引起配体与所述靶受体之间的相互作用；以及

(f)测定与配体和所述靶受体之间相互作用相关的物理参数。