KR101061016B1 - 암세포의 성장 억제 및 염증 질환의 예방 또는 치료활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 막횡단 단백질의 일종인 paired immunoglobulin-like receptor α 또는 β (PILRα 또는 PILRβ)에서 유래한 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 포함하는 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질은 혈관내피세포의 신생혈관 형성을 억제함으로써 암세포의 성장을 억제하며, 또한 백혈구의 혈관외 유출을 억제함으로써 염증 반응을 억제한다.

암세포의 성장 억제, 염증 억제

Description

암세포의 성장 억제 및 염증 질환의 예방 또는 치료활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질{Polypeptides or fusion proteins thereof having an inhibitory activity against growth of cancer cells and preventive or treating activity against inflammatory diseases}

본 발명은 막횡단 단백질의 일종인 PILRα 또는 PILRβ에서 유래한 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 포함하는 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.

감염, 외상 등에 의해 손상된 조직의 구조와 기능을 복원하기 위한 생체의 방어 반응을 통칭하여 염증 반응이라 한다. 염증 부위로의 백혈구 세포의 이동(mobilization)은 감염에 대한 신속한 해결(resolution) 및 다양한 외상으로부터 발생하는 조직 손상을 복구하는데 중요하다. 그러나, 잘못되거나 지속적인 염증 반응은 인체 조직의 손상과 질환을 야기한다. 예를 들어, 염증 질환은 뇌척수막염, 장염, 피부염, 포도막염, 뇌염, 성인성 호흡곤란 증후군 등과 같이 세균이나 바이러스에 의한 감염이나, 외상, 자가면역질환과 장기이식 거부 등과 같은 비감염 요인에 의하여 발생한다. 염증 질환은 증상이나 병리학적 특징이 구분되는 급성 및 만성 염증 질환으로 분류된다. 알러지나 세균과 바이러스의 감염과 같은 급성 염증의 국소적 증상은 혈류 및 혈관 크기의 변화, 혈관 투과성의 변화 및 백혈구의 침윤 등으로 나타난다. 이에 반하여 류마티스 관절염, 죽상 동맥경화증. 만성 신장염, 간경화증 등을 비롯한 만성 염증의 주요 병리학적 특징은 염증 유발 요인이 제거가 되지 않아 염증부위로 대식세포, 림프구, 형질세포들이 지속적으로 침윤하는 것으로, 그 결과 염증 반응이 만성화된다.

염증 반응이 일어나기 위하여서는 백혈구 세포의 염증 부위로의 침윤이 필수적이며, 이는 여러 세포 유착 분자들(cell adhesion molecules)이 관여하는 단계를 포함한다. 즉, 염증 부위에서 분비되는 케모카인(chemokine)의 유도에 의하여 염증부위의 혈관으로 이동한 백혈구세포들이 이동속도를 줄이면서 혈관 내피 세포 표면에서 회전하는 단계 (Rolling stage), 백혈구세포들이 회전을 멈추고 혈관 내피 세포 벽에 견고히 부착하는 단계 (Adhesion stage), 모세혈관과 바닥막을 침윤하는 단계 (Transmigration stage)로 구분할 수 있다. 상기 마지막 단계 즉 침윤하는 단계(Transmigration stage)는 혈관외유출(diapedesis) 또는 내피세포횡단이동(transendothelial migration)으로 지칭된다.

발암원(carcinogen)에 의해 변화된 암세포는 정상세포보다 빠르게 증식을 하며 종양(tumors) 덩어리를 형성하고, 주변의 조직에 침투하며 정상적인 신체 기능 을 저해한다. 암세포는 혈관신생을 유도함으로써, 영양분과 산소를 공급받게 된다.

본 발명자는 CD99 분자가 활성화되면 β₁ 인테그린(β₁ integrin)의 기능을 변화시켜, 암세포가 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)에 부착하는 것을 억제함으로써, 암전이 과정에 관여할 수 있음을 개시한 바 있다(Suh JS., 2001. Control of invasiveness of human breast carcinoma cell line MCF-7 by CD99 molecule. Kangwon National University). 또한, 본 발명자는 CD99로부터 유래된 특정 서열을 갖는 펩타이드 단편이 CD99를 효과적으로 활성화시킴으로써, 암세포의 성장 및/또는 전이를 억제할 수 있으며, 또한 혈관신생 및 염증 억제 활성을 갖는다는 것을 개시한 바 있다 (대한민국 특허등록 제10-0758006호; 대한민국 특허출원 제10-2006-0060890호; 대한민국 특허출원 제10-2006-0067440호; 국제특허공개 제WO 2007/037601호).

한편, CD99의 천연리간드로 밝혀진 PILR family는 PILRα와 PILRβ로 구성되어 있다. (Mousseau, D.D., D. Banville, D. L'Abbe, P. Bouchard, and S.-H. Shen. 2000. PILRα, a novel immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif-bearing protein, recruits SHP-1 upon tyrosine phosphorylation and is paired with the truncated counterpart PILRβ. J. Biol . Chem . 275:4467; Fournier, N., L. Chalus, I. Durand, E. Garcia, J.J. Pin, T. Churakova, S. Patel, C. Zlot, D. Gorman, S. Zurawski, et al. 2000. FDF03, a novel inhibitory receptor of the immunoglobulin superfamily, is expressed by human dendritic and myeloid cells. J. Immunol . 165:1197). PILRα와 PILRβ는 당질화된 세포 밖 부위, 세포막 횡단부위와 세포 내 부위로 구성된 제1형 막횡단 단백질로서, PILRα와 PILRβ의 세포 밖 부위는 매우 유사한 아미노산 서열로 이루어진 데에 반하여, 세포질부위는 매우 상이하다. PILRα의 세포질부위에는 immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIMs)가 있어 세포의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이에 반하여 자연살해세포(Natural killer cell)나 수지상세포(dendritic cell)에서 발현되는 PILRβ에는 ITIM이 없으며, 리간드가 결합하면 PILRα와는 달리 세포들을 활성화시킨다 (Shiratori I., Ogasawara K., Saito T., Lanier LL., Arase H. (2004). Activation of natural killer cells and dendritic cells upon recognition of a novel CD99-like ligand by paired immunoglobulin-like type 2 receptor. J Exp Med 199: 525). 본 발명자는 PILRα 또는 PILRβ로부터 유래된 특정 서열을 갖는 폴리펩타이드가 CD99를 효과적으로 활성화시킴으로써, 암세포의 전이를 억제할 수 있음을 밝혀낸 바 있다 (대한민국 특허출원 제10-2007-0132173호, 2007년 12월 17일 출원)

본 발명자들은 CD99의 천연 리간드인 PILRα 또는 PILRβ로부터 유래된 특정 서열을 갖는 폴리펩타이드가 혈관신생을 억제함으로써 암세포의 성장을 억제할 수 있고, 또한 백혈구세포의 혈관외유출을 억제함으로써 염증 반응을 억제할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 PILRα 또는 PILRβ로부터 유래된 폴리펩타이드로서, 암세포의 성장 억제 및/또는 염증 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 1 또는 2의 123 ∼ 126번의 펩타이드를 포함하는 4 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로서, 암세포의 성장 억 제 또는 염증 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드가 제공된다. 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 5, 7 내지 14, 및 16의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역 또는 Fc 영역과의 융합 단백질이 제공되며, 상기 폴리히스티딘 영역 및 Fc 영역은 각각 서열번호 17 및 18의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 내지 21, 23 내지 30, 및 32의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 숙주세포, 예를 들어 에스케리치아 속(Escherichia genus) 균주 또는 피키아 속(Pichia genus) 균주를 형질전환시킨 형질전환체가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질은 혈관내피세포의 신생혈관 형성을 억제함으로써 암세포의 성장을 억제하며, 또한 백혈구의 혈관외 유출을 억제함으로써 염증 반응을 억제한다. 따라서, 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단 백질은 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제용 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.

본 명세서에서, "염증" 또는 "염증 질환"이라 함은 급성 및/또는 만성 염증 질환을 포함하며, 예를 들면, 류마티스성관절염(rheumatoid arthritis), 유착관절낭염(adhesive capsulitis), 윤활막염(sinovitis), 고관절염(coxarthritis), 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 관절주위염(periarthritis), 다발성경화증(multiple sclerosis), 골수염(osteomyelitis), 전신홍반성낭창(systemic lupus erythematosus), 류마티스성다발근육통(polymyalgia rheumatica, PMR), 소그렌증후군(Sjogren's Syndrome), 진행성전신경화증(progressive systemic sclerosis, scleroderma), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 다발근육염(polymyositis), 피부근육염(dermatomyositis), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 제1형 당뇨병(Type I diabetes mellitus), 중증근육무력증(myasthenia gravis), 하시모도갑상선염(Hashimoto's thyroditis), 그레이브스병(Graves' disease), 그드페스추어증후군(Goodpasture's disease), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease), 경화쓸개관염(sclerosing cholangitis), 크론병(Crohn's Disease)이나 궤양성대장염(ulcerative colitis)과 같은 염증성창자병(inflammatory bowel disease), 염증성피부병(inflammatory dermatoses), 간질성폐렴(usual interstitial pneumonitis, UIP), 림프성간질폐렴(lymphoid interstitial pneumonia), 거대세포간질폐렴(giant cell interstitial pneumonia), 세포성 폐렴(cellular pneumonia), 호흡결핵박리성간질폐렴(desquamative interstitial pneumonia) 석면증(asbestosis), 규폐증(silicosis), 베림륨중독증(berylliosis), 활석증(talcosis), 진폐병(pneumoconiosis), 성인성호흡곤란증후군(Adult Respiratory Distress Syndrome), 외인성알러지폐포염(extrinsic allergic alveolitis) 등을 비롯한 염증성호흡기도질환(inflammatory respiratory diseases), 천식(asthma)이나 건초열(hayfever)과 같은 즉시과민반응(immediate hypersensitivity reactions), 사코이드병(sarcoidosis), 베게너육아종(Wegener's granulomatosis), 다양한 혈관염(angiitis), 만성활동간염(chronic active hepatitis), 옻과민반응(poison ivy dermatitis)과 같은 지연형과민증(delayed-type hypersensitivity reactions), 피부알레르기(cutaneous allergies), 건선관절염(psoriatic arthritis), 라이터증후군(Reiter's syndrome), 급성과민증(immediate hypersensitivity reactions), 류마티스열(rheumatic fever), 급성 또는 만성 사구체신염(acute or chronic glomerulonephritis), 급성증오(acute exacerbations), 신우신염(pyelonephritis), 연조직염(cellulitis), 방광염(cystitis), 급성담관염(acute cholecystitis), 염증성동맥류(inflammatory aortic aneurysm), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 스틸씨병(Still's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 단백질 또는 융합 단백질은 염증 질환을 수반하는 질환, 예를 들어 재관류손상(reperfusion injury), 자가면역질환(autoimmune diseases), 조직이식 거부반응(organ transplantation rejection or tissue allograft organ rejection) 등의 환자에게도 투여될 수 있으므로, 본 명세서에서 상기 "염증" 또는 "염증 질환"은 상기한 염증 질환을 수반하는 질환을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 단백질 또는 융합 단백질은 상기 염증 질환 중 바람직하게는 류마티스성관절염, 골다공증, 호흡기도염증, 자가면역질환, 및/또는 조직이식 거부반응에 적용될 수 있으며, 특히 바람직하게는 류마티스성관절염, 자가면역질환, 및/또는 조직이식 거부반응에 적용될 수 있다.

본 발명자들은 CD99 분자를 활성화시킬 수 있는 리간드에 대하여 다양한 검색을 실시하였다. 막횡단 단백질의 일종인 PILRα 또는 PILRβ이 CD99 분자의 천연리간드로 작용할 수 있다는 점에 착안하여, PILRα 또는 PILRβ로부터 다양한 길이의 리간드를 제조하여 검색을 실시하였다. 놀랍게도, PILRα 또는 PILRβ로부터 유래된 특정 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 혈관내피세포 또는 백혈구의 표면에 높은 친화성으로 결합하여 이들의 이동을 억제함으로써, 암세포의 성장 억제 및/또는 염증 억제(즉, 염증 질환 치료) 활성을 갖는다는 것을 발견하였다.

본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 서열번호 1 또는 2의 123 ∼ 126번의 펩타이드를 포함하는 4 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로서, 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 5, 7 내지 14, 및 16의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역 또는 Fc 영역과의 융합 단백질을 포함한다. 상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 표지 펩타이드 중 하나로서, 히스티딘 결합 수지와 결합하여 본 발명의 폴리펩타이드를 분리 및 정제하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 서열번호 17의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 Fc 영역은 폴리펩타이드의 혈액내 안정성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 상기 Fc 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 PILRα 또는 PILRβ를 코딩하는 공지의 핵산 서열로부터 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 내지 21, 23 내지 30, 및 32의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 상기 벡터의 클로닝 벡터로 사용가능한 벡터로는 공지된 다양한 벡터를 사용할 수 있으며, 예를 들면, pPICZα A, B, C (Invitrogen사, 미국) 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 클로닝 벡터는 폴리히스티딘(poly-His) 영역을 코딩하는 DNA가 삽입되어 있는 벡터, 예를 들면 pET28a(+) 벡터(Novagene사, 미국)또는 Fc 영역을 코딩하는 DNA(예를 들어, 서열번호 25의 염기서열로 구성된 cDNA)를 통상의 벡터, 예를 들면 pET28a(+) 벡터(Novagene사, 미국)에 삽입시켜 제조한 벡터를 사용할 있다. 상기 벡터는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 적절한 제한효소로 절단한 클로닝 벡터에 통상의 방법으로 삽입시켜 제조할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 벡터는 유전자 치료의 목적으로 유전자 치료용 조성물에 직접 함유되거나, 형질전환체 제조를 위해 사용될 수도 있다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 포함한다. 상기 숙주세포로는 상기한 폴리펩타이드가 효과적으로 발현될 수 있다면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 에스케리치아 속(Escherichia genus) 균주(예를 들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)), 피키아 속(Pichia genus) 균주(예를 들어, X-33 Pichia; Invitrogen사, 미국) 등을 바람직한 숙주 세포로 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제용 약학 조성물을 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 암세포의 성장을 효과적으로 억제함으로써, 유방암, 위암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암을 비롯한 다양한 고형암 또는 골수성 백혈병 등의 암환자에게 투여될 수 있으며, 또한, 백혈구의 혈관외 유출을 억제함으로써 다양한 염증 질환을 앓고 있는 환자에게도 투여할 수 있다. 상기 투여용량은 통상 각 환자의 연령, 체중 및 환자의 증상에 따라 일반적으로 변화시킬 수 있는 용량, 예를 들어 1일 약 0.01 내지 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 폴리펩타이드의 합성

서열번호 3 내지 9 및 12 내지 16의 폴리펩타이드를 각각 코딩하는 서열번호 19 내지 25 및 28 내지 32의 cDNA 단편을 pET28a(+) 벡터에 삽입하여, 7종류의 pET28a-hPILRα 및 5종류의 pET28a-hPILRβ 벡터를 각각 제조하였다. 즉, PCR을 통해 서열번호 19 내지 25 및 28 내지 32의 cDNA 단편을 얻은 뒤 말단부위를 EcoRI으로 절단한 후, 결합효소를 이용하여 cDNA 단편들을 동일한 제한효소로 절단된 pET28a(+) 벡터에 결합함으로써 여러 종류의 pET28a-hPILRα 및 pET28a-hPILRβ 벡터를 각각 제조하였다. 또한 서열번호 3 내지 5 및 12 내지 14의 경우 인간의 면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 cDNA(즉, 서열번호 34의 염기서열로 구성된 cDNA)를 pET28a(+) 벡터에 삽입시켜 제조한 pET28a(+)-Fc 벡터에 삽입하여, pET28a-hPILRα I, II, III-Fc (또는 pET28a-hPILRβ I, II, III-Fc) 벡터를 제조하였다.

얻어진 발현 벡터를 BL21(DE3) 세포에 형질전환시켜 얻은 콜로니를 LB배지에서 약 4 내지 6시간 배양한 후, 흡광도(A600)가 0.4-0.6이 되었을 때 7 내지 9시간 동안 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG) (1.4 mM)를 첨가하여 발현을 유도하였다. 세포를 원심분리를 통하여 침전시킨 후, 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척한 후 다시 침전시켜 배지에 있는 불순물을 제거하였다. SDS-PAGE 겔을 통해서 발현이 유도되었는지 여부를 확인하였다.

발현된 단백질의 분리를 위해 8M 우레아 완충액 (8M urea, 0.01M Tris-Cl, 0.1M NaH₂PO₄)을 사용했으며, 분리 단계에 따라 pH 농도를 8.0 , 6.3 , 4.5 등으로 제조하여 사용하였다. 단백질분해효소 억제제들 (1mM PMSF, 10 ㎍/㎖ leupeptin, 1 ㎍/㎖, pepstatin, 1 ㎍/㎖ aprotinin)이 첨가된 pH 8.0 완충액으로 세포를 용해한 후에 4℃, 13000 rpm의 조건에서 20분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액을 히스티딘 결합 수지(His binding resin)인 Ni-NTA His Bind Resin(Novagen사, 미국)과 1 ㎖ 에펜도르프 튜브 상에서 혼합한 후에 4℃에서 16 시간 동안 반응시켜, 발현된 단백질의 히스티딘과 수지의 결합을 유도하였다. 얻어진 반응 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 버리고, pH 6.3 완충액으로 세척하였다. PBS로 투석한 후, 정량하여 냉장 보관하였다.

서열번호 10 및 11의 펩타이드는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)을 이용하여 FMOC solid-phase method로 합성하였다. 합성된 펩타이 드는 C18 analytical RP 컬럼 (Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.

상기와 같이 제조된 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 cDNA 서열을 요약하면 하기 표 1 및 도 1과 같다. 서열번호 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, PILRα VI - IX는 PILRβ VI - IX의 서열과 동일한 아미노산 서열 및 염기서열을 갖는다.

	단편	폴리펩타이드	cDNA
PILR α I	1-151	서열번호 3	서열번호 19
PILR α II	67-151	서열번호 4	서열번호 20
PILR α III	120-151	서열번호 5	서열번호 21
PILR α IV	67-119	서열번호 6	서열번호 22
PILR α V	120-135	서열번호 7	서열번호 23
PILR α VI	120-129	서열번호 8	서열번호 24
PILR α VII	123-129	서열번호 9	서열번호 25
PILR α VIII	123-127	서열번호 10	서열번호 26
PILR α IX	123-126	서열번호 11	서열번호 27
PILR β I	1-151	서열번호 12	서열번호 28
PILR β II	67-151	서열번호 13	서열번호 29
PILR β III	120-151	서열번호 14	서열번호 30
PILR β IV	67-119	서열번호 15	서열번호 31
PILR β V	120-135	서열번호 16	서열번호 32
PILR β VI	120-129	서열번호 8	서열번호 24
PILR β VII	123-129	서열번호 9	서열번호 25
PILR β VIII	123-127	서열번호 10	서열번호 26
PILR β IX	123-126	서열번호 11	서열번호 27

실시예 2. 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 제조

서열번호 3 내지 16의 폴리펩타이드를 PBS에 용해시켜, 부피 100 ㎕ 중 3 ㎍ 의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 하기 시험예에서 사용하였다.

시험예 1. 인간제대정맥 내피세포와 세포외기질 간의 부착 억제 시험

서열번호 3 내지 16의 폴리펩타이드가 인간제대정맥 내피세포 (HUVEC; human umblical vein endothelial cell)의 파이브로넥틴(fibronectin)에 대한 부착에 미치는 영향을 측정하였다.

세포외 기질 성분의 하나인 파이브로넥틴을 96 웰(well) 세포배양판에 도말하여 자외선 하에서 건조하였다. HUVEC을 웰당 5 x 10⁴이 되도록 준비한 다음, 실시예 2에서 제조한 서열번호 3 내지 16의 펩타이드 용액을 3 ㎍의 농도로 세포에 처리한 후 1시간 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 이용하여 세포외 기질에 유착되어있는 세포를 걷어낸 다음 트리판-블루(Trypan-blue)용액으로 염색하고, 혈구계산기(hemacytometer)를 사용하여 유착한 세포수를 측정하였다. 그 결과는 도 2a 및 도 2b와 같다. 도 2a 및 도 2b에서 사용한 콘트롤 폴리펩타이드는 human IgG Fc로서 서열번호 18의 폴리펩타이드이다.

도 2a 및 도 2b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 처리한 경우, 파이브로넥틴에 유착한 내피 세포의 갯수가 대조군에 비해서 약 10 ∼ 50% 정도 감소된다. 또한, 융합단백질인 pET28a-hPILRα I, II, III-Fc (또는 pET28a-hPILRβ I, II, III-Fc)로 처리한 경우에도 유사한 결과를 얻었다 (data not shown). 그러나, 서열번호 1 및 2의 123 ∼ 126 번째 아미노산을 포함하지 아니한 서열번호 6 또는 15의 폴리펩타이드의 경우는 대조군과 유사한 유착도를 나타내었다. 따라서, 서열번호 1의 123 ∼ 126 번째 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 혈관신생을 억제할 수 있을 것으로 기대된다.

시험예 2. 시험관 내( in vitro ) 혈관신생 억제능 시험

본 발명에 따른 폴리펩타이드가 혈관신생에 미치는 영향을 하기와 같이 평가하였다.

일반적으로, 혈관의 바닥막 성분과 혈관내피 세포의 상호작용은 신생혈관의 형성과 유지에 중요한 요소이며, 바닥막 성분의 복합체인 매트리겔 (Matrigel)을 24-웰 플레이트에 넣으면 중합반응을 일으켜 플러그 (plug)를 형성하게 된다. HUVEC을 8 x 10⁴ cells/well의 밀도로 매트리겔이 도포된 24 well 세포배양판에 접종한 후, 기초 피브로블라스트 성장 인자 (basic Fibroblast Growth Factor; bFGF, 150 ng/㎖)와 실시예 2로부터 제조된 서열번호 10 또는 11의 펩타이드 용액 (3 ㎍/㎖)을 각각 첨가하고, 24시간 배양하였다. 그 후 도립현미경하에서 x50 배율로 확대하여 신생혈관 형성여부를 관찰하였다. 도 3에서 콘트롤 펩타이드(control peptide)는 EEFD 로 이루어진 펩타이드이다.

도 3 은 각 샘플들의 신생혈관 형성 상태를 도립현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 함유한 단백질 용액으로 처리한 경우, 혈관신생이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있다.

시험예 3. 단핵구세포의 시험관 내( in vitro ) 혈관외 유출 억제능 시험

인간 제대 정맥 내피세포를 보이덴 챔버 (Boyden chamber)의 위칸에서 배양하였다. 배양 상층액을 제거하고, 실시예 2에서 제조한 서열번호 10 또는 11의 펩타이드 용액 (3 ㎍/㎖)으로 1시간 동안 전처리하거나 전처리하지 않은 사람 단핵구 세포 (U937; Human monocyte)를 각 처리구에 5 x 10⁵ 개씩 가하였다. 이때 아래칸에는 생쥐 섬유모세포인 NIH/3T3를 0.005% 비타민C와 0.1% 소혈청알부민이 첨가된 DMEM 무혈청배지에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액이 포함된 배양액을 넣어서 단핵구 세포의 침윤을 유도하였다. 6 시간 동안 배양하면서 아래칸으로 침윤하여 이동한 세포수를 측정하였다. 상기 시험은 5회 반복하였으며, 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 콘트롤 펩타이드(control peptide)는 EEFD 로 이루어진 펩타이드이다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 처리한 경우, 혈관 외로 유출된 단핵세포의 갯수가 대조군에 비해서 유의성 있게(약 2/3 수준) 감소된다. 백혈구가 혈관을 따라 이동하다가 염증 부위로 이동하기 위해서는 혈관 밖으로 유출되는 과정이 수반됨을 감안할 때, 본 발명의 폴리펩타이드는 효과적인 염증반응 억제 활성을 가질 것으로 기대된다.

도 1은 서열번호 3 내지 16의 폴리펩타이드의 구조를 나타낸다.

도 2a 및 도 2b는 본 발명의 폴리펩타이드가 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC; Human Umblical Vein Endothelial Cell)의 파이브로넥틴(fibronectin)에 대한 부착에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 폴리펩타이드가 HUVEC의 신생혈관 형성에 미치는 영향을 도립현미경으로 관찰한 결과이다.

도 4는 인간 단핵구 세포주인 U937 세포에 본 발명의 폴리펩타이드를 처리하였을 때, 혈관 외로 유출된 U937 세포의 갯수를 측정한 결과를 나타낸다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Polypeptides or fusion proteins thereof having an inhibitory activity against growth of cancer cells and preventive or treating activity against inflammatory diseasess <130> PN0218 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 303 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Arg Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Gln Pro Ser Gly Ser Thr Gly Ser Gly Pro Ser Tyr Leu 20 25 30 Tyr Gly Val Thr Gln Pro Lys His Leu Ser Ala Ser Met Gly Gly Ser 35 40 45 Val Glu Ile Pro Phe Ser Phe Tyr Tyr Pro Trp Glu Leu Ala Thr Ala 50 55 60 Pro Asp Val Arg Ile Ser Trp Arg Arg Gly His Phe His Arg Gln Ser 65 70 75 80 Phe Tyr Ser Thr Arg Pro Pro Ser Ile His Lys Asp Tyr Val Asn Arg 85 90 95 Leu Phe Leu Asn Trp Thr Glu Gly Gln Lys Ser Gly Phe Leu Arg Ile 100 105 110 Ser Asn Leu Gln Lys Gln Asp Gln Ser Val Tyr Phe Cys Arg Val Glu 115 120 125 Leu Asp Thr Arg Ser Ser Gly Arg Gln Gln Trp Gln Ser Ile Glu Gly 130 135 140 Thr Lys Leu Ser 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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 19 <211> 453 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide fragment <400> 19 atgggtcggc ccctgctgct gcccctactg cccttgctgc tgccgccagc atttctgcag 60 cctagtggct ccacaggatc tggtccaagc tacctttatg gggtcactca accaaaacac 120 ctctcagcct ccatgggtgg ctctgtggaa atccccttct ccttctatta cccctgggag 180 ttagccacag ctcccgacgt gagaatatcc tggagacggg gccacttcca caggcagtcc 240 ttctacagca caaggccgcc ttccattcac aaggattatg tgaaccggct ctttctgaac 300 tggacagagg gtcagaagag cggcttcctc aggatctcca acctgcagaa gcaggaccag 360 tctgtgtatt tctgccgagt tgagctggac acacggagct cagggaggca gcagtggcag 420 tccatcgagg ggaccaaact ctccatcacc cag 453 <210> 20 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide fragment <400> 20 gtgagaatat cctggagacg gggccacttc cacaggcagt ccttctacag cacaaggccg 60 ccttccattc acaaggatta tgtgaaccgg ctctttctga actggacaga gggtcagaag 120 agcggcttcc tcaggatctc caacctgcag aagcaggacc agtctgtgta tttctgccga 180 gttgagctgg acacacggag ctcagggagg cagcagtggc agtccatcga ggggaccaaa 240 ctctccatca cccag 255 <210> 21 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide fragment <400> 21 cagtctgtgt atttctgccg agttgagctg gacacacgga gctcagggag gcagcagtgg 60 cagtccatcg aggggaccaa actctccatc acccag 96 <210> 22 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide fragment <400> 22 gtgagaatat cctggagacg gggccacttc cacaggcagt ccttctacag cacaaggccg 60 ccttccattc acaaggatta tgtgaaccgg ctctttctga actggacaga gggtcagaag 120 agcggcttcc tcaggatctc caacctgcag aagcaggac 159 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide fragment <400> 23 cagtctgtgt atttctgccg agttgagctg gacacacgga gctcaggg 48 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide fragment <400> 24 cagtctgtgt atttctgccg agttgagctg 30 <210> 25 <211> 21 <212> DNA 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<211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poly-His fragment sequence <400> 33 caccaccacc accaccat 18 <210> 34 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc fragment sequence <400> 34 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa tga 993

Claims (15)

1. 삭제
2. 서열번호 3 내지 5, 7 내지 14, 및 16의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드.
3. 제2항의 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질.
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리히스티딘 영역이 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
5. 제2항의 폴리펩타이드와 Fc 영역과의 융합 단백질.
6. 제5항에 있어서, 상기 Fc 영역이 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
7. 제2항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
8. 제7항에 있어서, 서열번호 19 내지 21, 23 내지 30, 및 32의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
9. 제2항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
10. 제9항에 있어서, 상기 벡터가 폴리히스티딘(poly-His) 영역 또는 Fc 영역을 코딩하는 cDNA가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
11. 제9항의 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체.
12. 제11항에 있어서, 상기 숙주세포가 에스케리치아 속(Escherichia genus) 균주 또는 피키아 속(Pichia genus) 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
13. 제2항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제용 약학 조성물.
14. 제2항의 폴리펩타이드와 폴리히스티딘(poly-His) 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제용 약학 조성물.
15. 제2항의 폴리펩타이드와 Fc 영역과의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암세포의 성장 억제 또는 염증 억제용 약학 조성물.

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