KR101057284B1 - 선택적 ｖｐａｃ２ 수용체 펩티드 작동제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VPAC2 수용체를 선택적으로 활성화시키고 당뇨병을 치료하는데 유용한 펩티드를 포괄한다.
선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제, PEG 분자, 당뇨병 치료, 인슐린 비의존성 당뇨병

Description

선택적 ＶＰＡＣ２ 수용체 펩티드 작동제 {Selective VPAC2 Receptor Peptide Agonists}
본 발명은 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제(agonist)에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자 또는 그의 유도체에 공유적으로 부착되는 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 관한 것이다.
유형 2 당뇨병 또는 인슐린 비의존성 당뇨병 (NIDDM)은 당뇨병 환자의 90％를 차지하는 가장 흔한 형태의 당뇨병이다. NIDDM 환자는 β-세포 기능에 장애가 생겨 인슐린 생성이 불충분하고/하거나 인슐린 민감성이 저하된다. NIDDM이 제어되지 않을 경우, 과도한 글루코스가 혈액 내에 축적되어 고혈당증이 유발된다. 시간이 지남에 따라 보다 심각한 합병증이 야기될 수 있는데, 이러한 합병증으로는 신장 기능이상, 심혈관계 질환, 시력 상실, 다리 궤양형성, 신경병증 및 허혈증이 있다. NIDDM에 대한 치료법에는 식이 개선, 운동 및 체중 조절 뿐만 아니라 각종 경구용 약물을 사용하는 것이 포함된다. NIDDM에 걸린 개개인은 이러한 경구용 약물을 복용함으로써 그들의 혈당치 제어를 시작할 수 있다. 그러나, 이들 약물은 NIDDM 환자에게서 일어나는 β-세포 기능의 점진적인 상실을 약화시키지 못하므로, 질병 말기에서 혈당치를 제어하는데 충분하지 못하다. 또한, 현재 입수 가능한 약 물을 이용한 치료법으로 인해, NIDDM 환자는 저혈당증, 위장 장애, 유체 잔류, 부종 및 체중 증가와 같은 잠재적 부작용에 노출된다.
뇌하수체 아데닐레이트 시클라제-활성화 펩티드 (PACAP) 및 혈관활성 장 펩티드 (VIP)는 세크레닌 및 글루카곤과 동일한 계열의 펩티드에 속한다. PACAP 및 VIP는 cAMP-매개형 및 기타 Ca2+-매개형 신호 변환 경로를 통하여 그들의 작용을 발휘하는 3가지 G-단백질-커플링된 수용체를 통하여 작동한다. 이들 수용체는 PACAP-선호 유형 1 (PACl) 수용체 [참고: Isobe, et al., Regul. Pept., 110:213-217 (2003); Ogi, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 196:1511-1521 (1993)] 및 2가지 VIP-공유된 유형 2 수용체 (VPAC1 및 VPAC2)로서 공지되어 있다 [참고: Sherwood et al., Endocr . Rev., 21:619-670 (2000); Hammar et al., Pharmacol Rev, 50:265-270 (1998); Couvineau, et al., J. Biol Chem., 278:24759-24766 (2003); Sreedharan, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 193:546-553 (1993); Lutz, et al., FEBS Lett., 458: 197-203 (1999); Adamou, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 209: 385-392 (1995)]. 일련의 PACAP 유사체가 US 6,242,563 및 WO 2000/05260에 기재되어 있다.
PACAP는 3가지 수용체 모두에 대하여 거의 동등한 수준의 활성을 지니고 있는 반면, VIP는 상기 2가지 VPAC 수용체를 선택적으로 활성화시킨다 [참고: Tsutsumi et al., Diabetes, 51:1453-1460 (2002)]. VIP [참고: Eriksson et al., Peptides, 10: 481-484 (1989)]와 PACAP [참고: Filipsson et al., JCEM, 82:3093- 3098 (1997)] 둘 다는 정맥내 투여되는 경우에 인간에게서 인슐린 분비를 자극시킬 뿐만 아니라 글루카곤 분비와 간내 글루코스 배출을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 그 결과, PACAP 또는 VIP 자극은 일반적으로, 혈당 상의 전반적인 개선을 가져다 주지 못하였다. PACAP 또는 VIP에 의한 다중 수용체의 활성화는 또한, 신경계, 내분비계, 심혈관계, 생식기, 근육계 및 면역계에 광범위한 생리적 영향을 미쳤다 [참고: Gozes et al., Curr. Med. Chem., 6:1019-1034 (1999)]. 래트에게서의 VIP-유도된 장액성 설사 (watery diarrhoea)는 VPAC 수용체들 중의 단지 1개 수용체, 즉 VPAC1에 의해 매개되는 것으로 여겨진다 [참고: Ito et al., Peptides, 22:1139-1151 (2001); Tsutsumi et al., Diabetes, 51:1453-1460 (2002)]. VPAC1 및 PAC1 수용체는 α-세포 및 간세포 상에서 발현되므로, 대부분이 간내 글루코스 배출에 대한 효과에 관여하는 것으로 예상된다.
엑센딘 (exendin)-4는 미국산 독도마뱀 (Gila Monster)인 헬로데르마 서스펙툼 (Heloderma Suspectum)으로부터의 타액 분비물에서 발견된다 [참고: Eng et al., J.Biol.Chem., 267(11):7402-7405 (1992)]. 이는 글루코스 의존성 인슐린 분비촉진 활성을 지닌 39개 아미노산 펩티드이다. 특별한 PEG화(PEGylated) 엑센딘 및 엑센딘 작동제 펩티드가 WO 2000/66629에 기재되어 있다.
최근의 연구 결과, VPAC2 수용체에 대해 선택적인 펩티드가 위장 (GI) 부작용 없이 그리고 글루카곤 방출과 간내 글루코스 배출을 증강시키지 않고서도 췌장으로부터의 인슐린 분비를 자극할 수 있는 것으로 밝혀졌다 [참고: Tsutsumi et al., Diabetes, 51:1453-1460 (2002)]. VPAC2 수용체에 대해 선택적인 펩티드는 초기에는, VIP 및/또는 PACAP를 변형시킴으로써 확인되었다 [참고: 예를 들어, Xia et al., J Pharmacol Exp Ther., 281:629-633 (1997); Tsutsumi et al., Diabetes, 51:1453-1460 (2002); WO 01/23420 and WO 2004/06839].
그러나, 지금까지 보고된 많은 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 목적하는 효력, 선택성 및 안정성 프로파일 수준에 못미쳤기 때문에 그들의 임상 실행가능성은 지연되었다. 또한, 이들 펩티드 중의 상당 수는 제형화시 폴리펩티드와 연관된 안정성 상의 문제 뿐만 아니라 이들 폴리펩티드의 생체내 반감기가 짧다는 것과 연관된 문제 제기에 따라 상업적 후보로서 적합하지 못하다. 더우기, 몇몇 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 디펩티딜-펩티다제 (DPP-IV)에 의해 불활성화되는 것으로 확인되었다. 짧은 혈청 반감기는 이들 작동제를 치료제로서 사용하는 것을 방해할 수 있다. 따라서, 현재 이용되고 있는 NIDDM 치료용 약물과 연관된 문제점들을 극복하는 새로운 요법이 요망된다.
본 발명은 VPAC2 수용체에 대해 선택적이고 고 혈당치의 존재 하에서만 췌장으로부터의 인슐린 분비를 유도시키는 개선된 화합물을 제공하고자 한다. 본 발명의 화합물은 베타 세포 기능을 또한 개선시키는 것으로 여겨지는 펩티드이다. 이들 펩티드는 GI 부작용이나 상응하는 간내 글루코스 배출 증가 없이 인슐린 분비를 유도시키는 생리적 효과를 지닐 수 있고, 또한 일반적으로, 공지된 VPAC2 수용체 펩티드 작동제와 비교해서 펩티드의 증강된 선택성, 효력 및/또는 생체내 안정성을 지닐 수 있다.
본 발명은 또한, 청소율이 저하되고 생체내 안정성이 개선된 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 제공하고자 한다. 본 발명의 작동제는 장기간 동안 최소 횟수로 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제1 국면에 따르면,
Figure 112008029974643-pct00001
Figure 112008029974643-pct00002
Figure 112008029974643-pct00003
Figure 112008029974643-pct00004
중에서 선택된 서열 및 C-말단 연장부를 포함하며, C-말단 연장부의 N-말단은 펩티드 서열의 C-말단에 연결되고, C-말단 연장부는 하기 화학식 3의 아미노산 서열 (서열 3) 또는 그의 조합물을 포함한다:
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12
상기 식에서,
Xaa1은 Gly, Cys, 또는 부재하고;
Xaa2는 Gly, Arg, 또는 부재하며;
Xaa3은 Pro, Thr, 또는 부재하고;
Xaa4는 Ser, 또는 부재하며;
Xaa5는 Ser, 또는 부재하고;
Xaa6은 Gly, 또는 부재하며;
Xaa7은 Ala, 또는 부재하고;
Xaa8은 Pro, 또는 부재하며;
Xaa9는 Pro, 또는 부재하고;
Xaa10은 Pro, 또는 부재하며;
Xaa11은 Ser, Cys, 또는 부재하고;
Xaa12는 Cys, 또는 부재하는데,
C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa12 중의 5개 이상이 존재하고, Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, 또는 Xaa11이 부재하는 경우, 하류에 존재하는 그 다음 아미노산은 C-말단 연장부 내의 그 다음 아미노산이고, C-말단 아미노산은 아미드화될 수 있으며;
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 Cys 잔기를 포함하거나,
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 Lys 잔기를 포함하거나,
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 K(W)를 포함하거나,
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 K(CO(CH2)2SH)를 포함하거나, 또는
상기 펩티드 작동제의 카복시 말단 아미노산은 PEG 분자에 공유적으로 부착된다.
바람직하게, 화학식 3의 C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa12 중의 6개 이상이 존재한다. 보다 바람직하게, C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa12 중의 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 이상, 또는 모두가 존재한다.
보다 바람직하게, PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 C-말단 연장부는 하기 서열 중에서 선택된다:
Figure 112008029974643-pct00005
보다 더 바람직하게, PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 C-말단 연장부는 서열 11 또는 서열 12이다.
PEG 분자는 본 발명의 제1 국면에 따른 VPAC2 수용체 펩티드 작동제 내의 모든 위치에서 Lys, Cys, K(W) 또는 K(CO(CH2)2SH) 잔기에 공유적으로 부착될 수 있다.
PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 서열 22, 23, 39, 42, 43, 44, 45, 95, 96, 100, 101, 102, 104, 105, 106, 108 및 109 중에서 선택된 서열을 포함하는 경우에는, 시스테인 잔기를 PEG화하는 것이 바람직하다.
PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 서열 19, 34, 35, 36, 38, 41, 99 및 112 중에서 선택된 서열을 포함하는 경우에는, K(W)잔기를 PEG화하는 것이 바람직하다.
PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 서열 18, 20, 21, 37, 94, 97, 98 및 111 중에서 선택된 서열을 포함하는 경우에는, K(CO(CH2)2SH) 잔기를 PEG화하는 것이 바람직하다.
PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 C-말단 연장부를 포함하는 경우에는, PEG 분자(들)가 이러한 C-말단 연장부 내의 하나 이상의 Cys 잔기에 공유적으로 부착될 수 있다. 서열 17 내지 45 및 94 내지 112 중에서 선택된 서열이 하나 이상의 Lys, Cys, K(W) 또는 K(CO(CH2)2SH) 잔기를 포함하고 C-말단 연장부가 하나 이상의 Cys 잔기를 포함하는 경우에는, 어느 한 서열이나 양 서열에 하나 이상의 PEG화 잔기가 존재할 수 있다.
바람직하게, VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 C-말단 연장부 내의 잔기에 공유적으로 부착된 하나 이상의 PEG 분자가 존재한다.
하나 이상의 PEG 분자가 존재하는 경우에는, Lys, Cys, K(CO(CH2)2SH), K(W) 및 카복시 말단 아미노산 PEG화물의 조합물이 존재할 수 있다. 예를 들어, 2개의 PEG 분자가 존재하는 경우에는, 그 중 1개가 Lys 잔기에 부착될 수 있고, 다른 하나는 Cys 잔기에 부착될 수 있다.
바람직하게, PEG 분자는 분지된다. 또 다른 한편, PEG 분자는 선형일 수 있다.
바람직하게, PEG 분자는 분자량이 1,000 달톤 내지 100,000 달톤이다. 보다 바람직하게, PEG 분자는 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000 및 60,000 달톤 중에서 선택된다. 보다 더 바람직하게, 이는 20,000, 30,000, 40,000, 또는 60,000 달톤 중에서 선택된다. 2개의 PEG 분자가 본 발명의 펩티드 작동제에 공유적으로 부착된 경우에는, 각각의 분자량이 1,000 내지 40,000 달톤, 바람직하게 20,000 및 20,000 달톤, 10,000 및 30,000 달톤, 30,000 및 30,000 달톤, 또는 20,000 및 40,000 달톤이다.
PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제 서열은 Xaa1 앞의 펩티드 N-말단에 히스티딘 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 제1 국면에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 이러한 펩티드 작동제의 N-말단에 N-말단 변형을 추가로 포함하는데, 상기 N-말단 변형은 하기 변형 중에서 선택된다:
(a) D-히스티딘, 이소루이신, 메티오닌 또는 노르루이신의 부가;
(b) 서열 Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg (서열 93) (여기서, Arg는 펩티드 작동제의 N-말단에 연결된다)을 포함하는 펩티드의 부가;
(c) 아릴, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 C1-C16 알킬의 부가;
(d) -C(O)R1 [여기서, R1은 아릴, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐, -SH 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 C1-C16 알킬; C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴; 또는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴 C1- C4 알킬이다]; -NR2R3 [여기서, R2 및 R3은 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬, 아릴 또는 아릴 C1-C4 알킬이다]; -OR4 [여기서, R4는 아릴, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐, 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 C1-C16 알킬; C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴; 또는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴 C1-C4 알킬이다]; 또는 5-피롤리딘-2-온의 부가;
(e) -SO2R5 [여기서, R5는 아릴, 아릴 C1-C4 알킬 또는 C1-C16 알킬이다]의 부가;
(f) C1-C6 알킬 또는 -SR6 [여기서, R6은 수소 또는 C1-C6 알킬이다]에 의해 임의로 치환된 석신이미드기의 형성;
(g) 메티오닌 설폭시드의 부가;
(h) 바이오티닐-6-아미노헥산산 (6-아미노카프로산)의 부가; 및
(i) -C(=NH)-NH2의 부가.
바람직하게, N-말단 변형은 하기 기들 중에서 선택된 기의 부가이다: 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일, 헥사노일, 메티오닌, 메티오닌 설폭시드, 3-페닐프로피오닐, 페닐아세틸, 벤조일, 노르루이신, D-히스티딘, 이소루이신, 3-머캅토프로피오닐, 바이오티닐-6-아미노헥산산 (6-아미노카프로산), 및 -C(=NH)-NH2. N-말단 변형이 아세틸 또는 헥사노일의 부가인 것이 특히 바람직하다.
당업자는 본원에 기재된 바와 같은 서열 17 내지 45 및 94 내지 112 중에서 선택된 펩티드 서열, C-말단 연장부 및 N-말단 변형물의 각종 조합을 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 상기 기재 내용을 근거로 하여 만들 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.
본 발명의 제1 국면에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 하기 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다:
Figure 112008029974643-pct00006
Figure 112008029974643-pct00007
Figure 112008029974643-pct00008
Figure 112008029974643-pct00009
본 발명의 제1 국면에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 서열 47, 64, 66, 115, 119, 122, 126, 130 및 144 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 제2 국면에 따르면, 하기 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 제공된다:
Figure 112008029974643-pct00010
본 발명의 제2 국면에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 서열 80 또는 서열 83의 아미노산 서열을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 제3 국면에 따르면, 하기 화학식 4의 아미노산 서열 (서열 4) 및 C-말단 연장부를 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 제공된다:
Figure 112008029974643-pct00011
상기 식에서,
Xaa1은 His, dH, 또는 부재하고;
Xaa2는 dA, Ser, Val, Gly, Thr, Leu, dS, Pro, 또는 Aib이며;
Xaa3은 Asp 또는 Glu이고;
Xaa4는 Ala, Ile, Tyr, Phe, Val, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib, 또는 NMeA이며;
Xaa5는 Val, Leu, Phe, Ile, Thr, Trp, Tyr, dV, Aib, 또는 NMeV이고;
Xaa6은 Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, 또는 Tyr이며;
Xaa8은 Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg, 또는 Tyr이고;
Xaa9는 Asn, Gln, Asp, Glu, Ser, Cys, Lys, 또는 K(CO(CH2)2SH)이며;
Xaa10은 Tyr, Trp, Tyr(OMe), Ser, Cys, 또는 Lys이고;
Xaa12는 Arg, Lys, Glu, hR, Orn, Lys (이소프로필), Aib, Cit, Ala, Leu, Gln, Phe, Ser, 또는 Cys이며;
Xaa13은 Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys, Lys, 또는 K(CO(CH2)2SH)이고;
Xaa14는 Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Lys (이소프로필), Phe, Gln, Aib, Cit, Ser, 또는 Cys이며;
Xaa15는 Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, hR, Orn, Lys (이소프로필), Phe, Gln, Aib, K(Ac), Cit, Ser, Cys, K(W), 또는 K(CO(CH2)2SH)이고;
Xaa16은 Gln, Lys, Glu, Ala, hR, Orn, Lys (이소프로필), Cit, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이며;
Xaa17은 Val, Ala, Leu, Ile, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
Xaa18은 Ala, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), K(W), Abu, 또는 Nle이며;
Xaa20은 Lys, Gln, hR, Arg, Ser, His, Orn, Lys (이소프로필), Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Val, K(Ac), Cit, Cys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
Xaa21은 Lys, His, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), Cit, Ser, Cys, Val, Tyr, Ile, Thr, Trp, K(W), 또는 K(CO(CH2)2SH)이며;
Xaa22는 Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, Ile, Val, Tyr(OMe), Ala, Aib, Ser, Cys, Lys, K(W), 또는 K(CO(CH2)2SH)이고;
Xaa23은 Leu, Phe, Ile, Ala, Trp, Thr, Val, Aib, Ser, Cys, Lys, K(W), 또는 K(CO(CH2)2SH)이며;
Xaa24는 Gln, Glu, Asn, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
Xaa25는 Ser, Asp, Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib, Glu, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이며;
Xaa26은 Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
Xaa27은 Lys, hR, Arg, Gln, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Met, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Lys (이소프로필), Cys, Leu, Orn, dK, K(W), 또는 K(CO(CH2)2SH)이며;
Xaa28은 Asn, Asp, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dK, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
Xaa29는 Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Thr, Val, Trp, Tyr, Cys, Orn, Cit, Aib, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa30은 Arg, Lys, Ile, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Cys, hR, Cit, Aib, Orn, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa31은 Tyr, His, Phe, Thr, Cys, Ser, Lys, Gln, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa32는 Ser, Cys, Lys, 또는 부재하고;
Xaa33은 Trp 또는 부재하며;
Xaa34는 Cys 또는 부재하고;
Xaa35는 Glu 또는 부재하며;
Xaa36은 Pro 또는 부재하고;
Xaa37은 Gly 또는 부재하며;
Xaa38은 Trp 또는 부재하고;
Xaa39는 Cys 또는 부재하며;
Xaa40은 Arg 또는 부재하는데,
Xaa29, Xaa30, Xaa31, Xaa32, Xaa33, Xaa34, Xaa35, Xaa36, Xaa37, Xaa38, 또는 Xaa39가 부재하는 경우, 하류에 존재하는 그 다음 아미노산은 펩티드 작동제 서열 내의 그 다음 아미노산이고,
상기 C-말단 연장부의 N-말단은 화학식 4의 펩티드의 C-말단에 연결되고, C-말단 연장부는 하기 화학식 3의 아미노산 서열 (서열 3) 또는 그의 조합물을 포함한다:
<화학식 3>
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12
상기 식에서,
Xaa1은 Gly, Cys, 또는 부재하고;
Xaa2는 Gly, Arg, 또는 부재하며;
Xaa3은 Pro, Thr, 또는 부재하고;
Xaa4는 Ser, 또는 부재하며;
Xaa5는 Ser, 또는 부재하고;
Xaa6은 Gly, 또는 부재하며;
Xaa7은 Ala, 또는 부재하고;
Xaa8은 Pro, 또는 부재하며;
Xaa9는 Pro, 또는 부재하고;
Xaa10은 Pro, 또는 부재하며;
Xaa11은 Ser, Cys, 또는 부재하고;
Xaa12는 Cys, 또는 부재하는데,
C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa12 중의 5개 이상이 존재하고, Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, 또는 Xaa11이 부재하는 경우, 하류에 존재하는 그 다음 아미노산은 C-말단 연장부 내의 그 다음 아미노산이고, C-말단 아미노산은 아미드화될 수 있으며;
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 Cys 잔기를 포함하거나,
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 Lys 잔기를 포함하거나,
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 K(W)를 포함하거나,
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 K(CO(CH2)2SH)를 포함하거나, 또는
상기 펩티드 작동제의 카복시 말단 아미노산은 PEG 분자에 공유적으로 부착된다.
바람직하게, 본 발명의 제3 국면의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 Xaa3이 Asp 또는 Glu이고, Xaa8이 Asp 또는 Glu이고, Xaa9가 Asn 또는 Gln이며, Xaa10이 Tyr 또는 Tyr(OMe)이고, Xaa12가 Arg, hR, Lys, 또는 Orn이며, Xaa14가 Arg, Gln, Aib, hR, Orn, Cit, Lys, Ala, 또는 Leu이고, Xaa15가 Lys, Aib, Orn, 또는 Arg이며, Xaa16이 Gln 또는 Lys이고, Xaa17이 Val, Leu, Ala, Ile, Lys, 또는 Nle이며, Xaa20이 Lys, Val, Leu, Aib, Ala, Gln, 또는 Arg이고, Xaa21이 Lys, Aib, Orn, Ala, Gln, 또는 Arg이며, Xaa23이 Leu 또는 Aib이고, Xaa25가 Ser 또는 Aib이며, Xaa27이 Lys, Orn, hR, 또는 Arg이고, Xaa28이 Asn, Gln, Lys, hR, Aib, Orn, 또는 Pro이며, Xaa29가 Lys, Orn, hR, 또는 부재하는 화학식 4의 서열 (서열 4)를 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 제3 국면의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 Xaa23 또는 Xaa25가 Aib인 화학식 4의 서열 (서열 4)을 포함한다. 보다 더 바람직하게, Xaa23과 Xaa25는 둘 다 Aib이다.
바람직하게, 본 발명의 제3 국면의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 Xaa14 또는 Xaa15가 Aib인 화학식 4의 서열을 포함한다.
또 다른 한편, 본 발명의 제3 국면의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 Xaa20 또는 Xaa21이 Aib인 화학식 4의 서열을 포함한다.
보다 바람직하게, Xaa14 또는 Xaa15가 Aib이고 Xaa20 또는 Xaa21이 Aib이다. Xaa15가 Aib이고 Xaa20이 Aib인 것이 특히 바람직하다.
바람직하게, 본 발명의 제3 국면의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 Xaa15가 Aib이고, Xaa20이 Aib이며, Xaa12, Xaa21, Xaa27 및 Xaa28이 모두 Orn인 화학식 4의 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, Xaa15가 Aib이고, Xaa20이 Aib이며, Xaa12, Xaa21, Xaa27 및 Xaa28이 모두 Orn이며, Xaa8이 Glu이고, Xaa9가 Gln이며 Xaa10이 Tyr(OMe)이다. 보다 더 바람직하게, Xaa15가 Aib이고, Xaa20이 Aib이며, Xaa12, Xaa21, Xaa27 및 Xaa28이 모두 Orn이며, Xaa8이 Glu이고, Xaa9가 Gln이며 Xaa10이 Tyr(OMe)이고, Xaa23 및/또는 Xaa25가 Aib이다. Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa12, Xaa15, Xaa20, Xaa21, Xaa23, Xaa25, Xaa27 및 Xaa28 중의 하나 이상이 PEG화 Lys, Cys, K(CO(CH2)2SH) 또는 K(W)일 수 있는 반면, 기타 모든 위치는 기재된 바와 같은 바람직한 아미노산 치환을 갖는다.
바람직하게, 화학식 3의 C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa12 중의 6개 이상이 존재한다. 보다 바람직하게, C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa12 중의 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 모두가 존재한다.
바람직하게, 본 발명의 제3 국면에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 C-말단 연장부는 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중에서 선택된다.
보다 바람직하게, 본 발명의 제3 국면에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작 동제의 C-말단 연장부는 서열 11 또는 서열 12이다.
PEG 분자는 본 발명의 제3 국면에 따른 VPAC2 수용체 펩티드 작동제 내의 모든 위치에서 Lys, Cys, K(W) 또는 K(CO(CH2)2SH) 잔기에 공유적으로 부착될 수 있다. C-말단 연장부는 PEG화될 수 있는 하나 이상의 Cys 잔기를 포함할 수 있다. 화학식 4에 따른 서열이 하나 이상의 Lys, Cys, K(W) 또는 K(CO(CH2)2SH) 잔기를 포함하고 C-말단 연장부가 하나 이상의 Cys 잔기를 포함하는 경우에는, 어느 한 서열이나 양 서열에 하나 이상의 PEG화 잔기가 존재할 수 있다.
바람직하게, 화학식 4 내의 잔기에 공유적으로 부착된 하나 이상의 PEG 분자가 존재한다. 보다 바람직하게, 화학식 4의 다음 위치들 중의 하나 이상에서의 잔기에 공유적으로 부착된 PEG 분자가 존재한다: 9, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 24, 25, 26 및 28.
바람직하게, VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 C-말단 연장부 내의 잔기에 공유적으로 부착된 하나 이상의 PEG 분자가 존재한다.
하나 이상의 PEG 분자가 존재하는 경우에는, Lys, Cys, K(CO(CH2)2SH), K(W) 및 카복시 말단 아미노산 PEG화물의 조합물이 존재할 수 있다. 예를 들어, 2개의 PEG 분자가 존재하는 경우에는, 그 중 1개가 Lys 잔기에 부착될 수 있고, 다른 하나는 Cys 잔기에 부착될 수 있다.
바람직하게, PEG 분자는 분지된다. 또 다른 한편, PEG 분자는 선형일 수 있다.
바람직하게, PEG 분자는 분자량이 1,000 달톤 내지 100,000 달톤이다. 보다 바람직하게, PEG 분자는 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000 및 60,000 달톤 중에서 선택된다. 보다 더 바람직하게, 이는 20,000, 30,000, 40,000, 또는 60,000 달톤 중에서 선택된다. 2개의 PEG 분자가 본 발명의 펩티드 작동제에 공유적으로 부착된 경우에는, 각각의 분자량이 1,000 내지 40,000 달톤, 바람직하게 20,000 및 20,000 달톤, 10,000 및 30,000 달톤, 30,000 및 30,000 달톤, 또는 20,000 및 40,000 달톤이다.
바람직하게, 본 발명의 제3 국면에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 이러한 펩티드 작동제의 N-말단에 N-말단 변형을 추가로 포함하는데, 이러한 N-말단 변형은 하기 변형 중에서 선택된다:
(a) D-히스티딘, 이소루이신, 메티오닌 또는 노르루이신의 부가;
(b) 서열 Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg (서열 93) (여기서, Arg는 펩티드 작동제의 N-말단에 연결된다)을 포함하는 펩티드의 부가;
(c) 아릴, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 C1-C16 알킬의 부가;
(d) -C(O)R1 [여기서, R1은 아릴, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐, -SH 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 C1-C16 알킬; C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴; 또는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴 C1-C4 알킬이다]; -NR2R3 [여기서, R2 및 R3은 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬, 아릴 또는 아릴 C1-C4 알킬이다]; -OR4 [여기서, R4는 아릴, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐, 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 C1-C16 알킬; C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴; 또는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕시, -NH2, -OH, 할로겐 및 -CF3 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴 C1-C4 알킬이다]; 또는 5-피롤리딘-2-온의 부가;
(e) -SO2R5 [여기서, R5는 아릴, 아릴 C1-C4 알킬 또는 C1-C16 알킬이다]의 부가;
(f) C1-C6 알킬 또는 -SR6 [여기서, R6은 수소 또는 C1-C6 알킬이다]에 의해 임의로 치환된 석신이미드기의 형성;
(g) 메티오닌 설폭시드의 부가;
(h) 바이오티닐-6-아미노헥산산 (6-아미노카프로산)의 부가; 및
(i) -C(=NH)-NH2의 부가.
바람직하게, N-말단 변형은 하기 기들 중에서 선택된 기의 부가이다: 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일, 헥사노일, 메티오닌, 메티오닌 설폭시드, 3-페닐프로피오닐, 페닐아세틸, 벤조일, 노르루이신, D-히스티딘, 이소루이신, 3-머캅토프로피오닐, 바이오티닐-6-아미노헥산산 (6-아미노카프로산), 및 -C(=NH)-NH2. N-말단 변형이 아세틸 또는 헥사노일의 부가인 것이 특히 바람직하다.
당업자는 본원에 기재된 바와 같은 화학식 4에 따른 펩티드 서열, C-말단 연장부 및 N-말단 변형물의 각종 조합을 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 상기 기재 내용을 근거로 하여 만들 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.
본 발명의 제3 국면에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 서열 59, 62, 64, 65, 66, 71, 72, 73, 74, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 141, 144, 146 및 148 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제4 국면에 따르면, 본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제와 하나 이상의 제약상 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
본 발명의 제5 국면에 따르면, 약물로서 사용하기 위한 본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 제공된다.
본 발명의 제6 국면에 따르면, 인슐린 비의존성 당뇨병을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 국면에 따르면, 인슐린 의존성 당뇨병을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 용도가 제공된다.
본 발명은 본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에게서 인슐린 비의존성 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 인슐린 비의존성 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병을 치료하기 위한, 본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 함유하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열 17 내지 45 및 94 내지 112 중에서 선택된 서열 및 C-말단 연장부를 포함하며, C-말단 연장부의 N-말단은 펩티드 서열의 C-말단에 연결되고, C-말단 연장부는 하기 화학식 1의 아미노산 서열 (서열 1) 또는 그의 조합물을 포함한다:
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13
상기 식에서,
Xaa1은 Gly, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa2는 Gly, Arg, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa3은 Pro, Thr, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa4는 Ser, Pro, His, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa5는 Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa6은 Gly, Ser, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa7은 Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa8은 Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa9는 Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa10은 Pro, Ser, Ala, Arg, Lys, His, Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa11은 Ser, Cys, His, Pro, Lys, Arg, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa12는 His, Ser, Arg, Lys, Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa13은 His, Ser, Arg, Lys, Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하는데;
단 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11 또는 Xaa12가 부재하는 경우, 하류에 존재하는 그 다음 아미노산은 C-말단 연장부 내의 그 다음 아미노산이고, C-말단 아미노산은 아미드화될 수 있으며;
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 Cys 잔기를 포함하거나,
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 Lys 잔기를 포함하거나,
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 K(W)를 포함하거나,
상기 펩티드 작동제는 PEG 분자에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 K(CO(CH2)2SH)를 포함하거나, 또는
상기 펩티드 작동제의 카복시 말단 아미노산은 PEG 분자에 공유적으로 부착된다.
화학식 1의 C-말단 연장부가 다음 중의 어느 하나를 3개 이하 갖는 것이 바람직하다: Cys, Lys, K(W) 또는 K(CO(CH2)2SH). C-말단 연장부가 이들 잔기 중의 어느 하나를 2개 이하 갖는 것이 보다 바람직하다. C-말단 연장부에 2개의 Cys 잔기가 존재하는 경우에는, Cys 잔기가 C-말단에 있는 것이 바람직하다. C-말단 연 장부가 상기 잔기 중의 어느 하나를 1개 이하 갖는 것이 보다 더 바람직하다. C-말단 연장부에 단지 1개의 Cys 잔기가 존재하는 경우에는, Cys 잔기가 C-말단에 있는 것이 바람직하다.
바람직하게, 상기 또 다른 양태에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 C-말단 연장부는 하기 화학식 2의 아미노산 서열 (서열 2)을 포함한다:
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13
상기 식에서,
Xaa1은 Gly, Cys, Lys, 또는 부재하고;
Xaa2는 Gly, Arg, Cys, Lys, 또는 부재하며;
Xaa3은 Pro, Thr, Ser, Ala, Cys, Lys, 또는 부재하고;
Xaa4는 Ser, Pro, His, Cys, Lys, 또는 부재하며;
Xaa5는 Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, Cys, 또는 부재하고;
Xaa6은 Gly, Ser, Cys, Lys, 또는 부재하며;
Xaa7은 Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, Cys, 또는 부재하고;
Xaa8은 Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, 또는 부재하며;
Xaa9는 Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, 또는 부재하고;
Xaa10은 Pro, Ser, Ala, Arg, Lys, His, Cys, 또는 부재하며;
Xaa11은 Ser, Cys, His, Pro, Lys, Arg, 또는 부재하며;
Xaa12는 His, Ser, Arg, Lys, Cys, 또는 부재하며;
Xaa13은 His, Ser, Arg, Lys, Cys, 또는 부재하는데;
단 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11 또는 Xaa12가 부재하는 경우, 하류에 존재하는 그 다음 아미노산은 C-말단 연장부 내의 그 다음 아미노산이고, C-말단 아미노산은 아미드화될 수 있다.
바람직하게, 화학식 1 또는 2의 C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa13 중의 1개 이상이 존재한다. 보다 바람직하게, C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa13 중의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 이상, 또는 모두가 존재한다.
보다 바람직하게, 상기 또 다른 양태에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 C-말단 연장부는 하기 화학식 3의 아미노산 서열 (서열 3)을 포함한다:
<화학식 3>
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12
상기 식에서,
Xaa1은 Gly, Cys, 또는 부재하고;
Xaa2는 Gly, Arg, 또는 부재하며;
Xaa3은 Pro, Thr, 또는 부재하고;
Xaa4는 Ser, 또는 부재하며;
Xaa5는 Ser, 또는 부재하고;
Xaa6은 Gly, 또는 부재하며;
Xaa7은 Ala, 또는 부재하고;
Xaa8은 Pro, 또는 부재하며;
Xaa9는 Pro, 또는 부재하고;
Xaa10은 Pro, 또는 부재하며;
Xaa11은 Ser, Cys, 또는 부재하며;
Xaa12는 Cys, 또는 부재하는데;
단 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10 또는 Xaa11이 부재하는 경우, 하류에 존재하는 그 다음 아미노산은 C-말단 연장부 내의 그 다음 아미노산이고, C-말단 아미노산은 아미드화될 수 있다.
바람직하게, 화학식 3의 C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa12 중의 1개 이상이 존재한다. 보다 바람직하게, C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa12 중의 2개, 3개, 4 개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 또는 모두가 존재한다.
본 발명의 모든 국면 및 양태에 사용될 수 있는 또 다른 C-말단 연장부는 하기 화학식 13의 아미노산 서열 (서열 13)을 포함한다:
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10
상기 식에서,
Xaa1은 Ser, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa2는 Arg, Ser, hR, Orn, His, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa3은 Thr, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa4는 Ser, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa5는 Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa6은 Pro, Ser, Ala, Arg, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa7은 Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa8은 Lys, K(W), Pro, Cys, K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하며;
Xaa9는 K(E-C16), Ser, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
Xaa10은 Ser, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재한다.
화학식 13의 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8 또는 Xaa9가 부재하는 경우, 하류에 존재하는 그 다음 아미노산이 C-말단 연장부 내의 그 다음 아미노산인 것이 바람직하다. C-말단 아미노산은 아미드화될 수 있다.
바람직하게, 화학식 13의 C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa10 중의 1개 이상이 존재한다. 보다 바람직하게, C-말단 연장부의 Xaa1 내지 Xaa10 중의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 이상, 또는 모두가 존재한다.
보다 바람직하게, 본 발명의 모든 국면 및 양태에 사용될 수 있는 또 다른 C-말단 연장부는 하기 서열 중에서 선택된다:
Figure 112008029974643-pct00012
본 발명의 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 공지된 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 비해 선택성, 효력 및/또는 안정성이 증강되었다는 이점을 지니고 있다. 특히, 엑센딘-4의 C-말단 서열, 또는 이러한 C-말단 서열의 변이체를 c-캡핑 서열로서 부가하면, 놀랍게도 VPAC2 수용체 선택성이 증가하였을 뿐만 아니라 단백질 분해적 안정성이 증가하였다.
하나 이상의 PEG 분자가 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 특별한 잔기에 공유 적으로 부착되면, 비-PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제와 비교해서 반감기가 연장되고 청소율이 감소된 생물학적 활성의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 생성된다.
용어 "VPAC2"는 본 발명의 작동제가 활성화시키는 특별한 수용체 [참고: Lutz, et al., FEBS Lett., 458: 197-203 (1999); Adamou, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 209: 385-392 (1995)]를 지칭하고 이와 연계하기 위해 사용된다. 상기 용어는 또한, 본 발명의 작동제를 지칭하고 이와 연계하기 위해 사용된다.
본 발명의 "선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제" 또는 "VPAC2 수용체 펩티드 작동제"는 VPAC2 수용체를 선택적으로 활성화시켜 인슐린 분비를 유도시키는 펩티드이다. 바람직하게, 본 발명의 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 대한 서열은 28개 내지 40개 천연 발생적 및/또는 비-천연 발생적 아미노산을 가지며, C-말단 연장부를 부가적으로 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
"선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제" 또는 "PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제"는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자, 또는 그의 유도체에 공유적으로 부착된 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제인데, 각 PEG는 시스테인 또는 리신 아미노산, K(W) 또는 K(CO(CH2)2SH), 또는 펩티드의 카복시 말단에 부착된다.
선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 C-말단 연장부를 가질 수 있다. 본 발명의 "C-말단 연장부"는 펩티드 결합을 통하여 C-말단 연장부의 N-말단에서 서열의 C-말단에 연결된 1 내지 13개 천연 발생적 또는 비-천연 발생적 아미노산을 갖는 서열을 포함한다. C-말단 연장부 내의 어떠한 Cys, Lys, K(W) 또는 K(CO(CH2)2SH) 잔기도 PEG 분자에 공유적으로 부착될 수 있고/있거나 C-말단 연장부의 카복시 말단 아미노산이 PEG 분자에 공유적으로 부착될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, C-말단 연장부와 관련한 용어 "연결된"에는, 아미노산 또는 화학기가 펩티드 서열의 C-말단에 직접적으로 부가되거나 부착되는 것이 포함된다.
임의로, 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 N-말단 변형을 지닐 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "N-말단 변형"에는 아미노산 또는 화학기를 특정 펩티드의 N-말단에 직접적으로 부가하거나 부착시키는 것과, 특정 펩티드의 N-말단에서 질소를 혼입시키는 화학기의 형성이 포함된다.
N-말단 변형에는 하나 이상의 천연 발생적 또는 비-천연 발생적 아미노산, 바람직하게는 10개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산을 VPAC2 수용체 펩티드 작동제 서열에 부가하는 것이 포함될 수 있다. N-말단에 부가될 수 있는 천연 발생적 아미노산에는 메티오닌 및 이소루이신이 포함된다. N-말단에 부가된 변형된 아미노산은 D-히스티딘일 수 있다. 또 다른 한편, 다음 아미노산을 N-말단에 부가할 수 있다: 서열 93 Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg (여기서, Arg는 펩티드 작동제의 N-말단에 연결된다). 바람직하게, N-말단에 부가된 모든 아미노산은 펩티드 결합에 의해 N-말단과 연결된다.
용어 N-말단 변형과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "연결된"에는 아미노산 또는 화학기를 VPAC2 수용체 작동제의 N-말단에 직접적으로 부가하거나 부착시키는 것이 포함된다. 상기 N-말단 변형의 부가는 펩티드 결합 형성을 위한 정상적인 커플링 조건 하에 달성할 수 있다.
펩티드 작동제의 N-말단은 알킬기 (R), 바람직하게 C1-C16 알킬기를 부가하여 (R)NH-를 형성함으로써 변형시킬 수도 있다.
또 다른 한편, 펩티드 작동제의 N-말단은 식 -C(O)R1의 기를 부가하여 식 R1C(O)NH-의 아미드를 형성시킴으로써 변형시킬 수 있다. 식 -C(O)R1의 기를 부가하는 것은 식 R1COOH의 유기 산과의 반응에 의해 달성할 수 있다. 아실화를 이용하여 아미노산의 N-말단을 변형시키는 것이 당해 분야에서 입증되었다 [참고: 예를 들어, Gozes et al., J. Pharmacol Exp Ther, 273: 161-167 (1995)]. 식 -C(O)R1의 기를 부가하면, N-말단에 우레아 기가 형성되거나 [참고: WO 01/23240, WO 2004/06839] 또는 카바메이트 기가 형성될 수 있다. 또한, N-말단은 피로글루탐산 또는 6-아미노헥산산을 부가함으로써 변형시킬 수 있다.
펩티드 작동제의 N-말단은 식 -SO2R5의 기를 부가하여 N-말단에 설폰아미드 기를 형성함으로써 변형시킬 수 있다.
펩티드 작동제의 N-말단은 석신산 무수물과 반응시켜 N-말단에 석신이미드 기를 형성함으로써 변형시킬 수도 있다. 석신이미드 기는 펩티드의 N-말단에 질소를 혼입시킨다.
N-말단은 또 다른 한편, 메티오닌 설폭시드, 바이오티닐-6-아미노헥산산, 또는 -C(=NH)-NH2를 부가함으로써 변형시킬 수 있다. -C(=NH)-NH2를 부가하는 것은 구아니드화 변형인데, 여기서 N-말단 아미노산의 말단 NH2가 -NH-C(=NH)-NH2로 된다.
N-말단 변형물과 C-말단 연장부를 포함한 본 발명의 서열 대부분은 20개의 천연 발생적 아미노산에 대한 표준 1 문자 또는 3 문자 부호를 함유한다. 사용된 기타 부호는 다음과 같이 정의된다:
C6 = 헥사노일
d = 각각의 아미노산의 D 이소형 (비-천연 발생적), 예를 들어 dA = D-알라닌, dS = D-세린, dK = D-리신
hR = 호모아르기닌
Aib = 아미노 이소부티르산
OMe = 메톡시
Nle = 노르-루이신
NMe = 아미노산의 알파 아미노 기에 부착된 N-메틸, 예를 들어 NMeA = N-메틸 알라닌, NMeV = N-메틸 발린
Orn = 오르니틴
K(CO(CH2)2SH) = ε-(3'-머캅토프로피오닐)-리신
K(W) = ε-(L-트립토필)-리신
Abu = α-아미노-n-부티르산 또는 2-아미노부탄산
Cit = 시트룰린
K(Ac) = ε-아세틸 리신
PEG = 폴리에틸렌 글리콜
PEG40K = 40,000 달톤 PEG 분자
PEG30K = 30,000 달톤 PEG 분자
PEG20K = 20,000 달톤 PEG 분자.
VIP는 천연상 28개 아미노산을 갖는 단일 서열로서 존재한다. 그러나, PACAP는 아미드화 카복실을 수반한 27개 아미노산 펩티드 (PACAP-27) 또는 38개 아미노산 펩티드 (PACAP-38)로서 존재한다 [참고: Miyata, et al., Biochem Biophys Res Commun, 170:643-648 (1990)]. VIP, PACAP-27, 및 PACAP-38에 대한 서열은 다음과 같다:
Figure 112008029974643-pct00013
본원에 사용된 바와 같은 용어 "천연 발생적 아미노산"은 인간 유전자 암호에 의해 암호화된 20개 아미노산을 의미한다 (즉, 20개 표준 아미노산). 이들 20 개 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린이다.
"비-천연 발생적 아미노산"의 예에는 합성 아미노산과 체내 변형된 아미노산 둘 다가 포함된다. 이에는 D-아미노산, 아르기닌-유사 아미노산 (예를 들어, 호모아르기닌) 및 측쇄에 규정외의 메틸렌을 갖는 기타 아미노산 ("호모" 아미노산), 및 변형된 아미노산 [예를 들어, 노르루이신, 리신 (이소프로필) - 여기서, 리신의 측쇄 아민은 이소프로필 기에 의해 변형된다]이 포함된다. 또한, 오르니틴, 아미노 이소부티르산 및 2-아미노부탄산 등의 아미노산이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "선택적"은 기타 공지된 수용체와 비교해서 VPAC2 수용체에 대한 선택성이 증가된 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 지칭한다. 선택도는 VPAC2 수용체 결합 친화도 대 VPAC1 수용체 결합 친화도의 비, 또는 VPAC2 수용체 결합 친화도 대 PAC1 수용체 결합 친화도의 비로써 결정된다. 결합 친화도는 다음 실시예 4에 기재되는 바와 같이 결정한다.
"인슐린 분비촉진" 활성은 혈당치 상승에 반응하여 인슐린 분비를 자극함으로써, 세포에 의한 글루코스 흡수를 유발시키고 혈장 글루코스 수치를 감소시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 인슐린 분비촉진 활성은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 평가할 수 있는데, 이러한 방법에는 VPAC2 수용체 결합 활성 또는 수용체 활성화 (예를 들어, 인슐린종 세포주 또는 섬에 의한 인슐린 분비)를 측정하는 실험, 정맥내 내당능 시험 (IVGTT), 복강내 내당능 시험 (IPGTT), 및 경구 내당능 시험 (OGTT)을 사용하는 것이 포함된다. 인슐린 분비촉진 활성은 통상적으로, 인슐린 수준 또는 C-펩티드 수준을 측정함으로써 인간에게서 측정한다. 본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 인슐린 분비촉진 활성을 지닌다.
본원에 사용된 바와 같은 "시험관내 효력"은 세포에 의거한 검정에서 VPAC2 수용체를 활성화시킬 수 있는 펩티드의 능력에 관한 측정치이다. 시험관내 효력은 단일 용량-반응 실험에서 최대 활성 증가의 50％를 유발시켜 주는 화합물의 유효 농도인 "EC50"으로서 표현된다. 본 발명의 목적상, 시험관내 효력은 2가지 상이한 검정, 즉 DiscoveRx 및 알파 스크린 (Alpha Screen)을 사용하여 결정한다. 이들 검정에 대한 추가의 상세 내역에 관해서는 실시예 3과 5를 참고할 수 있다. 이들 검정을 상이한 방식으로 수행하긴 하지만, 그 결과는 이들 두 검정 간의 일반적 상관 관계를 입증하고 있다.
용어 "혈장 반감기"는 청소되기 전에 관련 분자의 절반이 혈장 내에 순환되는 시간을 지칭한다. 또 다르게 사용된 용어는 "제거 반감기"이다. 혈장 반감기 또는 제거 반감기 맥락에서 사용된 용어 "연장된" 또는 "장기간"은 비교 가능한 조건 하에 측정된 바와 같이 기준 분자 (예를 들어, 비-PEG화 형태의 펩티드 또는 본래의 펩티드)와 비교해서 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 반감기가 통계상 유의적으로 증가하였다는 것을 나타낸다. 본원에 보고된 반감기는 제거 반감기인데, 이는 종결 log-제거 선형 속도에 상응한다. 당업자는 반감기가 청소율과 분포 용적 둘 다의 함수로서 변화하는 유도 파라미터라는 것을 인지하고 있다.
청소율은 특정 약물을 제거시킬 수 있는 신체 능력의 측정치이다. 청소율은, 예를 들어 약물에 대한 변형으로 인해 감소하기 때문에, 반감기는 증가할 것으로 예상된다. 그러나, 이러한 상호 관계는 분포 용적 상의 변화가 전혀 없을 경우에만 정확하다. 종결 log-선형 반감기 (t1/2), 청소율 (C) 및 분포 용적 (V) 간의 유용한 근사적 관계는 다음 방정식으로써 제공된다: t1/2 ≒ 0.693 (V/C). 청소율은 얼마나 많은 약물이 제거되는 가를 표시하는 것이 아니라, 오히려 제거되는 것으로 기대되는 약물이 완전히 없는 생물학적 유체 (예: 혈액 또는 혈장)의 용적을 표시한다. 청소율은 시간 단위당 용적으로서 표현된다.
본원에 사용된 바와 같은 "서열 동일률 (％)"은 정렬시킨 경우에 유사한 위치나 영역에 유사한 (동일하거나 보존적으로 대체시킨) 아미노산을 갖고 있는 서열을 나타내기 위해 사용하는데, 동일하거나 보존적으로 대체시킨 아미노산은 출발 단백질과 비교해서 단백질의 활성이나 기능을 변경시키지 않는 것이다. 예를 들어, 서로에 대한 동일률이 85％ 이상인 2개의 아미노산 서열은 정렬시킨 경우에 최적으로는 3개 이하의 갭을 허용하면서 유사한 위치에서 85％ 이상 유사한 (동일하거나 보존적으로 대체시킨) 잔기를 갖는데, 단 갭과 관련하여 총 15개 이하의 아미노산 잔기에만 영향을 미쳐야 한다.
본원에서 서열 동일률 계산을 위해 사용된 기준 펩티드는 다음과 같다:
Figure 112008029974643-pct00014
서열 동일률 (％)은 본 발명에 포괄된 펩티드와 기준 펩티드 [예를 들어, P487 (서열 84)] 간에 상이한 잔기 수를 결정하고, 이러한 잔기 수를 기준 펩티드 내의 아미노산 수 (예를 들어, P487의 경우에는 39개 아미노산)로 나누며, 그 결과치에 100을 곱한 다음, 이로써 나온 수치를 100으로부터 공제함으로써 계산할 수 있다. 예를 들어, 4개의 아미노산이 P487과 상이한, 39개 아미노산을 갖는 서열은 서열 동일률이 90％일 것이다 [예를 들어, 100 - ((4/39) x 100)]. 39개 아미노산 보다 더 긴 서열의 경우, P487 서열과 상이한 잔기 수에는 전술된 계산 목적을 위해 39개 이상의 부가 아미노산이 포함될 것이다. 예를 들어, P487 서열 내의 39개 아미노산과 4개 아미노산이 상이하고 카복시 말단에 P487 서열에는 존재하지 않는 1개의 부가 아미노산을 수반하는, 40개 아미노산을 갖는 서열은 총 5개 아미노산이 P487과 상이할 것이다. 따라서, 이러한 서열은 서열 동일률 (％)이 87％일 것이다 [예를 들어, 100 - ((5/39) x 100)]. 서열 동일률은 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다 [참고: 예를 들어, Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730 (1983) and Myers E. and Miller W., Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)]. 유사성 정도를 결정하는데 사용할 수 있는 하나의 프로그램은 레이저진 (Lasergene) 시스템의 일부로서 공급처 (DNAstar Inc, 1128, Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715, USA)로부터 수득할 수 있는 메그얼라인 립만-페어슨 (MegAlign Lipman-Pearson) 원 페어 방법 [디폴트 (default) 방법을 사용함]이다. 사용될 수 있는 또 다른 프로그램은 클러스털 더블유 (Clustal W)이다. 이는 DNA 또는 단백질 서열용으로 개발된 [참고: Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22(22):4673-4680(1994)] 다중 서열 정렬 패키지 이다. 이러한 도구는 관련 서열을 종간 비교하고 서열 보존을 관찰하는데 유용하다. 클러스털 더블유는 DNA 또는 단백질에 대한 일반적 목적의 다중 서열 정렬 프로그램이다. 이는 생물학적으로 의미가 큰 발산 서열의 다중 서열 정렬을 가져다 준다. 이는 선별된 서열에 대한 가장 우수한 매치를 계산하고, 동일성, 유사성 및 차이가 관찰될 수 있도록 이들을 한줄로 늘어서게 한다. 진화적 상관 관계는 분기도 (Cladogram) 또는 계통수 (Phylogram)를 관찰함으로써 알 수 있다.
본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 대한 서열은 VPAC2 수용체에 대해 선택적이고, 바람직하게는 P487 (서열 84)과의 서열 동일률이 60％ 내지 70％, 60％ 내지 65％, 65％ 내지 70％, 70％ 내지 80％, 70％ 내지 75％, 75％ 내지 80％, 80％ 내지 90％, 80％ 내지 85％, 85％ 내지 90％, 90％ 내지 97％, 90％ 내지 95％, 또는 95％ 내지 97％의 범위 내이다. 바람직하게, 상기 서열은 P487 (서열 84)과의 서열 동일률이 82％ 초과이다. 보다 바람직하게, 상기 서열은 P487 (서열 84)과의 서열 동일률이 90％ 초과이다. 보다 더 바람직하게, 상기 서열은 P487 (서열 84)과의 서열 동일률이 92％ 초과이다. 보다 더 바람직하게, 상기 서열은 P487 (서열 84)과의 서열 동일률이 95％ 초과 또는 97％ 초과이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "C1-C16 알킬"은 1 내지 16개의 탄소 원자를 갖거나 사이클릭인 경우에는 3 내지 16개의 탄소 원자를 갖는 1가의 포화 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 따라서, 용어 "C1-C16 알킬"에는, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급- 부틸, n-헵틸, n-옥틸, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실이 포함된다. C1-C16 알킬 기는, 예를 들어 아릴, C1-C6 알콕시, -OH, 할로겐, -CF3 및 -SH를 포함한 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "C1-C6 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖거나 사이클릭인 경우에는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 1가의 포화 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 따라서, 용어 "C1-C6 알킬"에는, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실이 포함된다. C1-C6 알킬 기는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "C2-C6 알케닐"은 1개 이상의 이중 결합을 갖고 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖거나 사이클릭인 경우에는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 1가의 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 따라서, 용어 "C2-C6 알케닐"에는 비닐, 프로프-2-에닐, 부트-3-에닐, 펜트-4-에닐 및 이소프로페닐이 포함된다. C2-C6 알케닐 기는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "C2-C6 알키닐"은 1개 이상의 삼중 결합을 갖고 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 1가의 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 의미 한다. 따라서, 용어 "C2-C6 알키닐"에는 프로프-2-이닐, 부트-3-이닐 및 펜트-4-이닐이 포함된다. C2-C6 알키닐 기는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "C1-C6 알콕시"는 2가 O 라디칼에 의한 치환 점에 연결된 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 1가의 치환되지 않은 포화 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 따라서, 용어 "C1-C6 알콕시"에는, 예를 들어 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, 2급-부톡시 및 3급-부톡시가 포함된다. C1-C6 알콕시 기는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
단독으로 사용되거나 특정 기의 일부로서 사용되는 경우의 용어 "아릴"은 페닐 기를 포함한 5원 내지 10원 방향족 또는 헤테로방향족 기, 5원 또는 6원 모노사이클릭 헤테로방향족 기 [이의 각 구성원은 (이용 가능한 치환 위치 수에 따라서) 1, 2, 3, 4 또는 5개 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다], 나프틸 기 또는 8원, 9원 또는 10원 바이사이클릭 헤테로방향족 기 [이의 각 구성원은 (이용 가능한 치환 위치 수에 따라서) 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다]이다. 이러한 아릴 정의 내에서 적합한 치환체에는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, -NH2, -OH, 할로겐, -SH 및 CF3이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아릴 C1-C4 알킬"은 아릴에 의해 치환된 C1-C4 알킬 기를 의미한다. 따라서, 용어 "아릴 C1-C4 알킬"에는 벤질, 1-페닐에틸 (α-메틸벤질), 2-페닐에틸, 1-나프탈렌메틸 또는 2-나프탈렌메틸이 포함된다.
용어 "나프틸"에는 1-나프틸 및 2-나프틸이 포함된다. 1-나프틸이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벤질"은 -CH2- 기에 의한 치환 점에 연결된 1가의 치환되지 않은 페닐 라디칼을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "5원 또는 6원 모노사이클릭 헤테로방향족 기"는 환 내에 총 5개 또는 6개 원자를 수반한 모노사이클릭 방향족 기를 의미하는데, 이들 환 원자 중의 1 내지 4개는 N, O 및 S 중에서 각각 독립적으로 선택된다. 바람직한 기는 환 내에 1개 또는 2개의 원자를 갖는데, 이는 N, O 및 S 중에서 각각 독립적으로 선택된다. 5원 모노사이클릭 헤테로방향족 기의 예에는 피롤릴 (아졸릴으로 지칭되기도 함), 푸라닐, 티에닐, 피라졸릴 (1H-피라졸릴 및 1,2-디아졸릴으로 지칭되기도 함), 이미다졸릴, 옥사졸릴 (1,3-옥사졸릴으로 지칭되기도 함), 이속사졸릴 (1,2-옥사졸릴으로 지칭되기도 함), 티아졸릴 (1,3-티아졸릴으로 지칭되기도 함), 이소티아졸릴 (1,2-티아졸릴으로 지칭되기도 함), 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 옥사트리아졸릴 및 티아트리아졸릴이 포함된다. 6원 모노사이클릭 헤테로방향족 기의 예에는 피리디닐, 피리미딜, 피라지닐, 피리다지닐 및 트리아지닐이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "8원, 9원 또는 10원 바이사이클릭 헤테로방향족 기"는 환 시스템 내에 총 8개, 9개 또는 10개 원자를 수반한 융합 바이사이클릭 방향족 기를 의미하는데, 이들 환 원자 중의 1 내지 4개는 N, O 및 S 중에서 각각 독립적으로 선택된다. 바람직한 기는 환 시스템 내에 1개 내지 3개의 원자를 갖는데, 이는 N, O 및 S 중에서 각각 독립적으로 선택된다. 적합한 8원 바이사이클릭 헤테로방향족 기의 예에는 이미다조[2,1-b][1,3]티아졸릴, 티에노[3,2-b]티에닐, 티에노[2,3-d][1,3]티아졸릴 및 티에노[2,3-d]이미다졸릴이 포함된다. 적합한 9원 바이사이클릭 헤테로방향족 기에는 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조푸라닐 (벤조[b]푸라닐로 지칭되기도 함), 이소벤조푸라닐 (벤조[c]푸라닐로 지칭되기도 함), 벤조티에닐 (벤조[b]티에닐로 지칭되기도 함), 이소벤조티에닐 (벤조[c]티에닐로 지칭되기도 함), 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 1,3-벤족사졸릴, 1,2-벤즈이속사졸릴, 2,1-벤즈이속사졸릴, 1,3-벤조티아졸릴, 1,2-벤조이소티아졸릴, 2,1-벤조이소티아졸릴, 벤조트리아졸릴, 1,2,3-벤족사디아졸릴, 2,1,3-벤족사디아졸릴, 1,2,3-벤조티아디아졸릴, 2,1,3-벤조티아디아졸릴, 티에노피리디닐, 푸리닐 및 이미다조[1,2-a]피리딘이 포함된다. 적합한 10원 바이사이클릭 헤테로방향족 기에는 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 1,5-나프티리딜, 1,6-나프티리딜, 1,7-나프티리딜 및 1,8-나프티리딜이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "PEG"는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 의미한다. 그의 전형적인 형태에서, PEG는 말단 히드록실 기를 수반하고 식 HO-CH2CH2- (CH2CH2O)n-CH2CH2-OH (여기서, n은 약 8 내지 약 4000이다)을 갖는 선형 중합체이다. 말단 수소는 알킬 또는 알카놀 기와 같은 보호 기에 의해 치환될 수 있다. 바람직하게, PEG는 1개 이상의 히드록실 기를 갖고, 보다 바람직하게 이는 말단 히드록실 기이다. 이러한 히드록실 기는 바람직하게, 펩티드와 반응하도록 활성화된다. 많은 형태의 PEG가 본 발명에 유용하다. PEG의 수 많은 유도체가 당해 분야에 존재하고 본 발명에 사용하기 적합하다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,445,090호; 제5,900,461호; 제5,932,462호; 제6,436,386호; 제6,448,369호; 제6,437,025호; 제6,448,369호; 제6,495,659호; 제6,515,100호 및 제6,514,491호; 및 Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995]. 본 발명에서 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 공유적으로 부착된 PEG 분자는 특별한 유형으로 제한되지 않는다. PEG 분자의 분자량은 바람직하게 500 내지 100,000 달톤이다. PEG는 선형이거나 분지될 수 있다. 본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 펩티드에 부착된 1개, 2개 또는 3개의 PEG 분자를 가질 수 있다. PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제당 1개 또는 2개의 PEG 분자가 존재하는 것이 보다 바람직하지만, 펩티드 분자당 1개 초과의 PEG 분자가 존재하는 경우에는, 3개 이하로 존재하는 것이 바람직하다. PEG 분자의 양 말단이 2개 이상의 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 함께 가교 결합시키기 위해 동종- 또는 이종-관능성화될 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 2개의 PEG 분자가 존재하는 경우, 이러한 PEG 분자는 바람직하게 각각 20,000 달톤 PEG 분자, 또는 각각 30,000 달톤 PEG 분자일 것이다. 그러나, 상이한 분자량을 갖는 PEG 분자를 사용할 수 있는데, 예를 들어 하나는 10,000 달톤 PEG 분자이고 다른 하나는 30,000 달톤 PEG 분자이거나, 또는 하나는 20,000 달톤 PEG 분자이고 다른 하나는 40,000 달톤 PEG 분자일 수 있다.
본 발명에서, PEG 분자는 Cys 또는 Lys 잔기, 또는 C-말단 잔기에 공유적으로 부착될 수 있다. PEG 분자는 또한, Lys 잔기의 측쇄와 커플링되는 Trp 잔기 (K(W))에 공유적으로 부착될 수 있다. 또 다른 한편, K(CO(CH2)2SH) 기를 PEG화하여 K(CO(CH2)2S-PEG)를 형성시킬 수 있다. 펩티드 작동제 내의 모든 Lys 잔기를 K(W) 또는 K(CO(CH2)2SH)로 대체시킨 다음, PEG화할 수 있다. 또한, 펩티드 작동제 내의 모든 Cys 잔기를 변형된 시스테인 잔기, 예를 들어 hC로 대체시킬 수 있다. 이러한 변형된 Cys 잔기는 PEG 분자에 공유적으로 부착될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "PEG화"는 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 PEG 분자가 본 발명의 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 공유적으로 부착되는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 서열 17 내지 45 및 94 내지 112 중에서 선택된 펩티드 서열, 및 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중에서 선택된 C-말단 연장부를 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 제공된다. C-말단 연장부가 서열 11 또는 서열 12인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 보다 바람직한 양태에 따르면, 서열 17 내지 45 및 94 내지 112 중에서 선택된 펩티드 서열, 및 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중에서 선택된 C-말단 연장부를 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 제공되는데, 이러한 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일, 헥사노일, 메티오닌, 메티오닌 설폭시드, 3-페닐프로피오닐, 페닐아세틸, 벤조일, 노르루이신, D-히스티딘, 이소루이신, 3-머캅토프로피오닐, 바이오티닐-6-아미노헥산산 (6-아미노카프로산), 및 -C(=NH)-NH2의 부가인 N-말단 변형을 추가로 포함한다. 이러한 양태에서, N-말단 변형이 아세틸 또는 헥사노일의 부가인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에 따르면, 화학식 4의 아미노산 서열 (서열 4), 및 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중에서 선택된 C-말단 연장부를 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 제공되는데, 이러한 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일, 헥사노일, 메티오닌, 메티오닌 설폭시드, 3-페닐프로피오닐, 페닐아세틸, 벤조일, 노르루이신, D-히스티딘, 이소루이신, 3-머캅토프로피오닐, 바이오티닐-6-아미노헥산산 (6-아미노카프로산), 및 -C(=NH)-NH2의 부가인 N-말단 변형을 추가로 포함한다. 이러한 양태에서, N-말단 변형이 아세틸 또는 헥사노일의 부가인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 보다 바람직한 양태에 따르면, 화학식 4의 아미노산 서열 (서열 4) [여기서, Xaa15는 Aib이고, Xaa20은 Aib이며, Xaa12, Xaa21, Xaa27 및 Xaa28은 모두 Orn이다], 및 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중에서 선택된 C-말단 연장부를 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 제공되는데, 이러한 PEG화 VPAC2 수 용체 펩티드 작동제는 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일, 헥사노일, 메티오닌, 메티오닌 설폭시드, 3-페닐프로피오닐, 페닐아세틸, 벤조일, 노르루이신, D-히스티딘, 이소루이신, 3-머캅토프로피오닐, 바이오티닐-6-아미노헥산산 (6-아미노카프로산), 및 -C(=NH)-NH2의 부가인 N-말단 변형을 추가로 포함한다. 이러한 양태에서, Xaa15가 Aib이고, Xaa20이 Aib이며, Xaa12, Xaa21, Xaa27 및 Xaa28이 모두 Orn이며, Xaa8이 Glu이고, Xaa9가 Gln이며 Xaa10이 Tyr(OMe)인 것이 보다 바람직하다. Xaa15가 Aib이고, Xaa20이 Aib이며, Xaa12, Xaa21, Xaa27 및 Xaa28이 모두 Orn이며, Xaa8이 Glu이고, Xaa9가 Gln이며 Xaa10이 Tyr(OMe)이고, Xaa23 및/또는 Xaa25가 Aib인 것이 특히 바람직하다.
단백질의 PEG화는 펩티드 또는 단백질을 치료제로서 사용하는 것과 연관된 수 많은 약리학적 및 독성학적/면역학적 문제점을 극복시켜줄 수 있다. 그러나, 어떠한 개개의 펩티드에 대해서도, 이러한 펩티드의 PEG화 형태가 비-PEG화 형태의 펩티드와 비교해서 생체 활성이 상당히 상실될 것인지에 관해서는 확실치 않다.
PEG화 단백질의 생체 활성은 다음과 같은 요인들에 의해 영향을 받을 수 있다: i) PEG 분자의 크기; ii) 특별한 부착 위치; iii) 변형 정도; iv) 불리한 커플링 조건; v) 부착을 위해 링커를 사용하는지의 여부 또는 중합체를 직접 부착시키는지의 여부; vi) 해로운 부산물의 생성; vii) 활성화 중합체로 인해 입은 손상; 또는 viii) 전하 체류. 예를 들어, 사이토킨의 PEG화를 위해 수행된 작업 결과, PEG화로 인해 나타날 수 있는 효과가 밝혀졌다. 사용된 커플링 반응에 따라서, 사이토킨을 중합체 변형시키면 생체 활성이 현저하게 저하되었다 [참고: Francis, G.E., et al., (1998) PEGylation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides: the importance of biological optimization of coupling techniques, Intl. J. Hem. 68:1-18]. PEG화 펩티드의 생체 활성을 유지시키는 것이 단백질에 대한 문제 보다 훨씬 더 큰 문제를 유발시킨다. 펩티드는 단백질 보다 더 작기 때문에, PEG화에 의한 변형은 잠재적으로 생체 활성에 대해 보다 큰 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 하나 이상의 PEG 분자를 공유적으로 부착함으로써 변형시키고, 일반적으로 보다 느린 단백질 분해적 분해와 신장 청소율로 인해 개선된 약동학적 프로파일을 갖고 있다. PEG화는 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 겉보기 크기를 증가시킬 것이므로, 신장 여과율을 저하시키고 생체 분포를 변경시킬 것이다. PEG화는 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 항원성 에피토프를 은폐시키므로, 면역계에 의한 세망내피 청소와 인식을 저하시키고, 또한 단백질 분해적 효소 (예: DPP-IV)에 의한 분해를 저하시킬 수 있다.
하나 이상의 PEG 분자를 생물학적 활성의 소형 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 공유적으로 부착시키면, 고유 이차 구조와 생체 활성 입체 형태를 탈안정화시키고 생체 활성을 저하시켜 상기 작동제가 치료제로서 사용하기에 부적절하게 만듦으로써, 작동제에 불리하게 영향을 미치는 위험에 놓이게 된다. 그러나, 본 발명은 하나 이상의 PEG 분자를 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 특별한 잔기에 공유적으로 부착시키면, 놀랍게도 비-PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제와 비교해서 반감기가 연장되고 청소율이 저하된 생물학적 활성의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 생성된다는 발견에 기초한 것이다. 본 발명의 화합물에는 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 포함된다.
VPAC2 수용체 펩티드 작동제 내의 잠재적 PEG화 부위를 결정하기 위해, 세린 스캐닝을 수행할 수 있다. Ser 잔기는 펩티드 내의 특별한 위치에서 치환되고, 이와 같이 Ser-변형된 펩티드를 대상으로 하여, 효력과 선택성에 관해 시험한다. Ser 치환이 효력에 최소한의 영향을 미치고 Ser-변형된 펩티드가 VPAC2 수용체에 대해 선택적인 경우에는, Cys 또는 Lys 잔기를 Ser 잔기로 대체시키는데, 이는 직접 또는 간접적인 PEG화 부위로서 제공된다. 특정 잔기의 간접적 PEG화는 PEG화 부위 잔기와 결합되는 화학기 또는 잔기의 PEG화이다. Lys의 간접적 PEG화에는 K(W) 및 K(CO(CH2)2SH)의 PEG가 포함된다.
본원에 기재된 발명은 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 제공한다. PEG화는 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 반감기를 증강시키므로, 제거 반감기가 1시간 이상, 바람직하게 3, 5, 7, 10, 15, 20 또는 24시간 이상, 가장 바람직하게 48시간 이상인 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제가 생성될 수 있다. 본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 청소율 값이 바람직하게 200 ml/h/kg 이하, 보다 바람직하게 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg 이하, 가장 바람직하게 50, 40 또는 20 ml/h/kg 미만이다.
본 발명은 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 대한 펩티드 서열의 C-말단에 부가된 특이적 아미노산이 펩티드를 보호해줄 수 있을 뿐만 아니라 활성, 선택성 및/또는 효력을 증강시킬 수 있다는 발견을 포괄한다. 예를 들어, 이들 C-말단 연장부는 펩티드의 나선 구조를 안정화시킬 수 있고, 효소적 절단되기 쉬운, C-말단 근처에 위치한 부위들을 안정화시킬 수 있다. 더우기, 본원에 기재된 C-말단적으로 연장된 수 많은 펩티드는 VPAC2 수용체에 대해 보다 선택적일 수 있고, VIP, PACAP, 및 기타 공지된 VPAC2 수용체 펩티드 작동제 보다 더 효능이 있을 수 있다. 바람직한 C-말단 연장부의 예는 C-캡핑 서열로서의 엑센딘-4의 연장 펩티드이다. 엑센딘-4는 미국산 독도마뱀인 헬로데르마 서스펙툼 (Heloderma Suspectum)으로부터의 타액 분비물에서 발견된다 [참고: Eng et al., J.Biol.Chem., 267(11):7402-7405 (1992)]. C-말단 연장부의 기타 예는 헬로데르민 (helodermin) 및 헬로스펙틴 (helospectin)의 C-말단 서열이다. 헬로데르민과 헬로스펙틴은 또한, 미국산 독도마뱀의 타액 분비물에서 발견된다.
더우기, VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 N-말단을 변형시키는 것이 효력을 증강시킬 수 있고/있거나 DPP-IV 절단에 대항하여 안정성을 제공할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.
VIP 및 몇몇 공지된 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 각종 효소에 의해 절단되기 쉬우므로, 생체내 반감기가 짧다. VPAC2 수용체 펩티드 작동제 내의 각종 효소적 절단 부위는 다음에 논의되어 있다. 절단 부위는 VIP (서열 14) 내의 아미노산 위치를 기준으로 하여 논의되고, 본원에 언급된 서열에 적용 가능하다.
효소 디펩티딜-펩티다제-IV (DPP-IV)에 의한 펩티드 작동제의 절단은 위치 2 (VIP 내의 세린)과 위치 3 (VIP 내의 아스파르트산) 사이에서 일어난다. 본 발명의 작동제는 N-말단 변형을 부가함으로써 상기 영역에서의 DPP-IV 절단에 대해 보다 안정적일 수 있다. DPP-IV 절단에 대항하여 안정성을 개선시킬 수 있는 N-말단 변형의 예에는 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일, 헥사노일, 메티오닌, 메티오닌 설폭시드, 3-페닐프로피오닐, 페닐아세틸, 벤조일, 노르루이신, D-히스티딘, 이소루이신, 3-머캅토프로피오닐, 바이오티닐-6-아미노헥산산, 또는 -C(=NH)-NH2의 부가가 포함된다. 바람직하게는, 상기 N-말단 변형이 아세틸 또는 헥사노일의 부가이다.
야생형 VIP의 아미노산 10과 11 (티로신과 트레오닌) 사이 및 아미노산 22와 23 (티로신과 루이신) 사이에 키모트립신 절단 부위가 있다. 위치 10 및/또는 11, 및 위치 22 및/또는 23에서 치환이 이루어지게 하면, 이들 부위에서 펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 위치 10 및/또는 22에서의 티로신을 Tyr(OMe)로 치환시키면 안정성을 증가시킬 수 있다.
야생형 VIP의 위치 12와 13의 아미노산 사이에 트립신 절단 부위가 있다. 특정의 아미노산은 펩티드가 상기 부위에서의 절단에 덜 감수성이 되도록 하는데, 예를 들면 위치 12에서의 오르니틴 및 위치 13에서의 아미노 이소부티르산이 있다.
야생형 VIP에서, 및 당해 분야에 공지된 수 많은 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에서는, 위치 14와 15의 염기성 아미노산 사이, 및 위치 20과 21의 염기성 아미 노산 사이에 절단 부위가 있다. 본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 이들 부위에서의 치환으로 인해 개선된 생체내 단백질 분해적 안정성을 지닐 수 있다. 이들 부위에서의 바람직한 치환은 펩티드가 트립신-유사 효소 (트립신 포함)에 의한 절단에 덜 감수성이 되도록 하는 것이다. 예를 들어, 위치 15의 아미노 이소부티르산, 위치 20의 아미노 이소부티르산, 및 위치 21의 오르니틴은 모두, 개선된 안정성을 유발시킬 수 있는 바람직한 치환이다. 펩티다지 절단에 대한 내성을 지니고 있고 본 발명에 포괄된, 대표적인 수 많은 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 개선된 안정성은 실시예 7에서 입증되었다.
야생형 VIP의 위치 25와 26의 아미노산 사이에도 절단 부위가 있다.
위치 27, 28, 29, 30 및 31의 아미노산을 포괄하는 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 영역 또한, 효소 절단에 대해 감수성이다. C-말단 연장부를 부가하면, 이러한 펩티드 작동제가 뉴로엔도펩티다제 (NEP)에 대항하여 보다 안정적일 수 있게 되고, VPAC2 수용체에 대한 선택성이 증가될 수도 있다. 상기 영역은 또한, 트립신-유사 효소에 의해 공격받을 수 있다. 이와 같이 된다면, 펩티드 작동제는 그의 C-말단 연장부를 상실할 수 있는데, 부가의 카복시펩티다제 활성으로 인해 불활성 형태의 펩티드가 유발된다. 상기 영역에서의 절단에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 바람직한 치환에는 위치 27에서의 오르니틴, 위치 28에서의 오르니틴 또는 아미노 이소부티르산, 및 위치 29에서의 오르니틴이 포함된다.
각종 펩티다제에 의한 절단에 대해 내성이 있는 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제 이외에도, 본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 또한, 당해 분야에 공지된 몇몇 펩티드와 비교해서 VPAC2 수용체에 대한 선택성이 증강되고/되거나, 효력이 증가되고/되거나 안정성이 증가된 펩티드를 포괄할 수 있다. 본 발명의 각종 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 대한 증가된 효력과 선택성은 실시예 3, 4 및 5에서 입증되었다.
실시예 3 중의 표 1은 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 목록과 그의 상응하는 시험관내 효력 결과를 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 EC50 값이 200 nM 미만이다. 보다 바람직하게, EC50 값은 100 nM 미만이다. 보다 더 바람직하게, EC50 값은 50 nM 미만이다. 보다 바람직하게, EC50 값은 30 nM 미만이다.
실시예 4 중의 표 2는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 목록과, 인간 VPAC2, VPAC1 및 PAC1에 대한 그의 상응하는 수용체 결합성 결과를 제공한다. 이들 검정에 대한 추가의 상세 내역에 관해서는 실시예 4를 참고할 수 있다. 선택도는 VPAC2 수용체 결합 친화도 대 VPAC1 수용체 결합 친화도의 비, 및 VPAC2 수용체 결합 친화도 대 PAC1 수용체 결합 친화도의 비로써 결정된다. 바람직하게, 본 발명의 작동제는 VPAC2 수용체에 대한 친화도가 VPAC1 수용체 및/또는 PAC1 수용체에 대한 친화도 보다 50배 이상 더 큰 선택도 비를 갖는다. 보다 바람직하게, VPAC2에 대한 친화도는 VPAC1 및/또는 PAC1에 대한 것 보다 100배 이상 더 크다. 보다 더 바람직하게, VPAC2에 대한 친화도는 VPAC1 및/또는 PAC1에 대한 것 보다 200배 이상 더 크다. 보다 바람직하게, VPAC2에 대한 친화도는 VPAC1 및/또는 PAC1에 대 한 것 보다 500배 이상 더 크다. 보다 바람직하게, VPAC2에 대한 친화도는 VPAC1 및/또는 PAC1에 대한 것 보다 1000배 이상 더 크다.
본원에 사용된 바와 같은 "선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제"에는 또한, 본원에 기재된 작동제의 제약상 허용가능한 염이 포함된다. 본 발명의 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 충분히 산성인 관능기, 충분히 염기성인 관능기, 또는 양 관능기를 보유할 수 있으므로, 수 많은 무기 염기, 및 무기 및 유기 산과 반응하여 염을 형성할 수 있다. 산 부가 염을 형성하기 위해 통상적으로 이용되는 산은 무기 산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 등; 및 유기 산, 예를 들어 p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 옥살산, p-브로모페닐-설폰산, 카본산, 석신산, 시트르산, 벤조산, 아세트산, 트리플루오로아세트산 등이다. 이러한 염의 예에는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 감마-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등이 포함된다.
염기 부가 염에는 무기 염기로부터 유래된 것, 예를 들어 암모늄 또는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 히드록사이드, 카보네이트, 바이카보네이트 등이 포함된다. 따라서, 본 발명의 염을 제조하는데 유용한 염기에는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 탄산칼륨 등이 포함된다.
본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 제약 조성물로서 제형화는 것이 바람직하다. 표준 제약 제형화 기술을 이용할 수 있다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]. 본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 볼내, 국소, 경구, 경피, 비내 또는 폐 경로를 통한 투여, 또는 비경구 투여용으로 제형화할 수 있다.
비경구 투여에는, 예를 들어 전신 투여, 예를 들면 근육내, 정맥내, 피하, 피내 또는 복강내 주사가 포함될 수 있다. 본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 NIDDM, 또는 다음에 논의된 장애를 치료하기 위한 제약 조성물의 일부로서 허용가능한 제약 담체, 희석제 또는 부형제와 연계해서 대상체에게 투여할 수 있다. 제약 조성물은 용제일 수 있거나, 또는 비경구로 투여되는 경우에는, PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 현탁제, 또는 2가 금속 양이온 (예: 아연)과 착화된 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 현탁제일 수 있다. 적합한 제약 담체는 펩티드 또는 펩티드 유사체와 상호 작용하지 않는 불활성 성분을 함유할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제약 담체에는, 예를 들어 멸균성 수, 생리 식염수, 제 균성 식염수 (약 0.9％ mg/ml 벤질 알코올을 함유하는 식염수), 인산염 완충 식염수, 한크 (Hank) 용액, 링거-락테이트 등이 포함된다. 적합한 부형제의 몇몇 예에는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 트레할로스, 솔비톨 및 만니톨이 포함된다.
본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 혈액 혈장 수준을 장기간 동안 효능있는 범위로 유지시켜 주는 투여용으로 제형화할 수 있다. 유효한 경구 펩티드 약물 전달에 대한 주요 장벽은 산 및 효소에 의한 펩티드 분해로 인해 생체내 이용 효율이 불량하고, 상피 막을 통한 흡수가 불량하며, 소화관에서의 산성 pH 환경에 노출된 후 펩티드가 불용성 형태로 전이되는 것이다. 본 발명에 포괄된 바와 같은 펩티드용 경구 전달 시스템은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 미소구를 이용하여 피막화한 다음, 경구 전달할 수 있다. 예를 들어, PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 시판용의 생체 적합성, 생분해성 중합체, 폴리(락티드-코-글리콜리드)-COOH, 및 충진제로서의 올리브유로 구성된 미소구 내로 피막화시킬 수 있다 [참고: Joseph, et al. Diabetologia 43: 1319-1328 (2000)]. 기타 유형의 미소구 기술 또한 상업적으로 이용 가능한데, 예를 들어 Medisorb® 및 Prolease® 생분해성 중합체 (공급처: Alkermes)이다. 락티드 이성체 중의 어느 하나를 이용하여 Medisorb® 중합체를 제조할 수 있다. 락티드:글리콜리드 비는 광범위한 중합체 특성을 고려하여 0:100 내지 100:0로 다양할 수 있다. 이로써, 흡수 시간이 수 주 내지 수 개월인 전달 시스템과 이식 가능한 장치를 설계할 수 있다. 펩티드와 단백질에 대한 경구 전달 기술에 관해 논의한 수 많은 문헌에 반구가 또한 공개되었다. 예를 들어, 흡수를 촉진시키기 위한 변형된 아미노산으로 구성된 특이적 담체에 관해 기재된 WO 95/28838 (Leone-bay et al.)을 참고할 수 있다.
본원에 기재된 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 사용하여, 광범위한 질병과 질환이 있는 대상체를 치료할 수 있다. 본 발명에 포괄된 작동제는 VPAC2 수용체로서 지칭된 수용체에서 작용함으로써 그들의 생물학적 효과를 발휘한다. 따라서, VPAC2 수용체 자극에 대해 호의적으로 반응하거나 또는 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 투여에 대해 호의적으로 반응하는 질병 및/또는 질환이 있는 대상체는 본 발명의 PEG화 VPAC2 작동제를 이용하여 치료할 수 있다. 이들 대상체는 "VPAC2 작동제를 이용한 치료를 필요로 하는" 또는 "VPAC2 수용체 자극을 필요로 하는"으로 불리운다.
본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 이용하여 당뇨병, 예를 들어 유형 1 당뇨병과 유형 2 당뇨병 (인슐린 비의존성 당뇨병 또는 NIDDM) 둘 다를 치료할 수 있다. 본 발명의 작동제를 또한 사용하여, VPAC2 수용체 작동제를 이용한 예방적 처치를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 NIDDM이 발생할 위험이 있는 대상체를 처치할 수 있다. 이러한 처치는 당뇨병과 당뇨병 합병증 발생을 지연시킬 수도 있다. 본 발명의 작동제를 이용하여 치료할 수 있는 부가의 대상체에는 내당능 이상 (IGT) 환자 [참고: Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp.1):S5, 1999] 또는 공복시 혈당 이상 (IFG) 환자 [참고: Charles, et al., Diabetes 40:796, 1991]; 체중이 해당 대상체의 키와 체격에 대한 정상 체중 보다 약 25％ 이상인 대상체; 부모 중의 적어도 한분이 NIDDM 환자인 대상체; 임신성 당뇨병에 걸린 적이 있는 대상체; 및 내인성 인슐린 분비 저하로부터 비롯되는 바와 같은 대사 장애가 있는 대상체가 포함된다. 본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 사용하여, 내당능 이상이 있는 대상체가 NIDDM으로 진행 발병하지 못하게 할 수 있고, 췌장 β-세포 악화를 예방할 수 있으며, β-세포 증식을 유도시킬 수 있고, β-세포 기능을 개선시킬 수 있으며, 잠복중인 β-세포를 활성화시킬 수 있고, 세포를 β-세포로 분화시킬 수 있으며, β-세포 복제를 자극할 수 있고, β-세포 세포사멸을 억제할 수 있다. 본 발명의 방법에서 본 발명의 작동제를 사용하여 치료하거나 예방할 수 있는 기타 질병 및 질환에는 다음이 포함된다: 청년 발증 성인형 당뇨병 (MODY) [참고: Herman, et al., Diabetes 43:40, 1994]; 성인 발병 잠복성 자가면역성 당뇨병 (LADA) [참고: Zimmet, et al., Diabetes Med. 11:299, 1994]; 임신성 당뇨병 [참고: Metzger, Diabetes, 40:197, 1991]; 대사 증후군 X, 이상지질혈증, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트리글리세라이드혈증 및 인슐린 저항성.
본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 또한 사용하여, 당뇨병의 이차 원인을 치료할 수 있다 [참고: Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1):S5, 1999]. 이러한 이차 원인으로는 글루코코르티코이드 과다, 성장 호르몬 과다, 크롬친화세포종 (pheochromocytoma), 및 약물 유도성 당뇨병이 있다. 당뇨병을 유도시킬 수 있는 약물에는 피리미닐, 니코틴산, 글루코코르티코이드, 페니토인, 갑상선 호르몬, β- 아드레날린작동제, α-인터페론 및 HIV 감염 치료를 위해 사용된 약물이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 식품 섭취 억제와 비만 치료에 유효할 수 있다.
본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 또한, 아테롬성 경화증, 과지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 저 HDL 수준, 고혈압, 원발성 폐 고혈압, 심혈관계 질환 (아테롬성 경화증, 관상 심장 질환 및 관상 동맥 질환 포함), 뇌혈관계 질환 및 말초혈관계 질환과 같은 장애를 예방 또는 치료하는데 유효할 수 있고; 루푸스, 다낭성 난소 증후군, 발암현상 및 과형성, 남성 및 여성 생식기 질환, 성적 장애, 궤양, 수면 장애, 지질 및 탄수화물 대사 장애, 일주기성 기능이상, 성장 장애, 에너지 생체항상성 장애, 면역 질환, 예를 들어 자가면역 질환 (예: 전신성 홍반성 루푸스) 뿐만 아니라 급성 및 만성 염증 질환, 류마티스성 관절염 및 패혈성 쇽을 치료하는데 유효할 수 있다.
본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 또한, 예를 들어 지질 축적성 세포를 생산하기 위한 세포 분화; 예를 들어, 인슐린에 대한 자기항체, 인슐린 수용체에 대한 자기항체 또는 췌장 β-세포에 대해 자극성인 자기항체로 인한 비정상적인 췌장 β-세포 기능, 인슐린 분비성 종양 및/또는 자가면역성 저혈당증에 관여하는 인슐린 민감성 및 혈당치의 조절; 아테롬성 경화성 플라크의 형성을 유발시키는 대식 세포 분화; 염증 반응; 발암 현상; 과형성; 지방세포 유전자 발현; 지방세포 분화; 췌장 β-세포 질량 감소; 인슐린 분비; 인슐린에 대한 조직 민 감성; 지방육종 세포 성장; 다낭성 난소 질병; 만성 무배란; 고안드로겐혈증, 프로게스테론 생성; 스테로이드 생성; 세포에서 레독스 (산화환원) 전위 및 산화적 스트레스; 산화질소 신타제 (NOS) 생성; 감마 글루타밀 트랜스펩티다제, 카탈라제, 혈장 트리글리세라이드, HDL 및 LDL 콜레스테롤 수준 증가 등과 관련된 생리적 장애를 치료하는데 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 천식을 치료하는데 사용할 수 있고 [참고: Bolin, et al., Biopolymer 37:57-66 (1995); U.S. Patent No. 5,677,419 (이는 폴리펩티드 R3PO가 기니아 피그 기관 평활근을 이완시키는데 활성이 있다는 것을 보여준다)]; 저혈압 유도를 치료하는데 사용할 수 있으며 (VIP는 천식 환자에게서 저혈압, 빈맥, 및 안면 홍조를 유도시킨다) [참고: Morice, et al., Peptides 7:279-280 (1986); Morice, et al., Lancet 2:1225-1227 (1983)]; 남성 생식기 장애를 치료하는데 사용할 수 있고 [참고: Siow, et al., Arch. Androl. 43(1):67-71 (1999)]; 항-세포소멸/신경보호제로서 사용할 수 있으며 [참고: Brenneman, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:207-12 (1998)]; 허혈증 증상 동안 심장보호를 위해 사용할 수 있고 [참고: Kalfin, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1268(2):952-8 (1994); Das, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:297-308 (1998)]; 일주기성 시계를 조작하고 이와 연관된 장애를 치료하는데 사용할 수 있으며 [참고: Hamar, et al., Cell 109:497-508 (2002); Shen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97:11575-80, (2000)]; 항궤양제로서 사용할 수 있다 [참고: Tuncel, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:309-22, (1998)].
선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 "유효량"은 VPAC2 수용체 자극을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 경우에 허용가능하지 않은 부작용은 유발시키지 않으면서 목적하는 치료 및/또는 예방 효과를 가져다 주는 양이다. "목적하는 치료 효과"에는 다음 효과들 중의 한 가지 이상이 포함된다: 1) 해당 질병 또는 질환과 연관된 증상의 개선; 2) 해당 질병 또는 질환과 연관된 증상의 발병 지연; 3) 치료 부재시와 비교한 수명 증가; 및 4) 치료 부재시와 비교한 삶의 질 향상. 예를 들어, NIDDM을 치료하기 위한 PEG화 VPAC2 작동제의 "유효량"은 치료 부재 보다 더 큰 혈당 농도 제어를 가져다 줌으로써, 망막증, 신경병증 또는 신장 질환과 같은 당뇨병 합병증의 발병을 지연시켜 주는 양이다. NIDDM을 예방하기 위한 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 "유효량"은 치료 부재시와 비교해서, 설포닐우레아, 티아졸리딘디온, 인슐린 및/또는 비스구아니딘과 같은 저혈당 치료 약물을 이용한 치료를 요구하는 혈당치 상승 발병을 지연시켜 주는 양이다.
대상체에게 투여된 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 "유효량"은 또한, 질병의 유형과 중증도, 및 대상체의 특징, 예를 들어 일반적인 건강 상태, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 좌우될 것이다. 환자의 혈당을 정상화시키는데 유효한 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 용량은 수 많은 요인들, 예를 들어 대상체의 성별, 체중 및 연령, 혈당 조절 불능의 중증도, 투여 경로 및 생체내 이용 효율, 펩티드의 약동학적 프로파일, 효력 및 제형 등에 좌우될 것이다.
본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제에 대한 전형적인 용량 범위는 1일 약 1 ㎍ 내지 1일 약 5000 ㎍의 범위일 것이다. 바람직하게, 용량은 1일 약 1 ㎍ 내지 1일 약 2500 ㎍의 범위, 보다 바람직하게 1일 약 1 ㎍ 내지 1일 약 1000 ㎍의 범위이다. 보다 더 바람직하게, 용량 범위는 1일 약 5 ㎍ 내지 1일 약 100 ㎍이다. 추가의 바람직한 용량 범위는 1일 약 10 ㎍ 내지 1일 약 50 ㎍이다. 가장 바람직하게, 용량은 1일 약 20 ㎍이다.
"대상체"는 포유류, 바람직하게 인간이지만, 동물, 예를 들어 애완용 동물 (예: 개, 고양이 등), 농장 동물 (예: 암소, 양, 돼지, 말 등), 및 실험용 동물 (예: 래트, 마우스, 기니아 피그 등)일 수도 있다.
본 발명의 선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 고체 상 펩티드 합성 기술의 표준 방법을 사용함으로써 제조할 수 있다. 펩티드 합성기는, 예를 들어 공급처 [Rainin-PTI Symphony Peptide Synthesizer (Tucson, AZ)]로부터 시판되고 있다. 고체 상 합성을 위한 시약은, 예를 들어 공급처 [Glycopep (Chicago, IL)]로부터 시판되고 있다. 고체 상 펩티드 합성기는 간섭 기를 차단시키고, 반응될 아미노산을 보호하며, 커플링하고, 탈커플링한 다음, 반응되지 않은 아미노산을 캡핑하는 것에 대한 제조업자의 지시에 따라서 사용할 수 있다.
전형적으로, 수지 상에 성장하고 있는 펩티드 쇄 상의 N-말단 아미노산과 α-N-보호된 아미노산을 커플링제, 예를 들어 디시클로헥실카보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸 및 염기, 예를 들어 디이소프로필에틸아민의 존재 하에 불활성 용매, 예를 들어 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 또는 메틸렌 클로라이드 중에서 실온 하에 커플링시킨다. 트리플루오로아세트산 또는 피페리딘 등의 시약을 사용 하여, 상기와 같이 하여 생성된 펩티드 수지로부터 α-N-보호 기를 제거하고, 펩티드 쇄에 부가될 그 다음 목적하는 N-보호된 아미노산을 이용하여 커플링 반응을 반복하였다. 적합한 아민 보호 기는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1991]. 그 예에는 t-부틸옥시카보닐 (tBoc) 및 플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc)이 포함된다.
선택적 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 또한, 적당한 측쇄 보호를 수반하면서 t-부톡시카보닐- 또는 플루오레닐메톡시카보닐-알파-아미노산을 이용하여 표준 자동화 고체 상 합성 프로토콜을 사용하여 합성할 수 있다. 합성 완료 후, α-아미노 기를, 예를 들어 (i) 활성 에스테르 (α-N-보호된 아미노산의 도입에 대해 상기 언급된 바와 유사한 프로토콜을 사용한다); (ii) 환원제의 존재 하에서의 알데히드 (환원적 아민화 과정); 및 (iii) 구아니드화 시약과 반응시킴으로써 N-말단 변형을 달성할 수 있다. 이어서, 표준 불화수소 방법 또는 트리플루오로아세트산 (TFA)을 사용하여 동시에 측쇄 탈보호시키면서 고체 상 지지체로부터 펩티드를 절단시킨다. 이어서, 0.1％ TFA 중의 아세토니트릴 구배를 이용하여 VYDAC C18 칼럼 상에서 역상 크로마토그래피함으로써, 조 펩티드를 추가로 정제하였다. 아세토니트릴을 제거하기 위해, 0.1％ TFA, 아세토니트릴 및 물을 함유하는 용액으로부터 펩티드를 동결건조시킨다. 분석적 역상 크로마토그래피함으로써 순도를 검증할 수 있다. 펩티드의 실체는 질량 분광측정법에 의해 검증할 수 있다. 펩티드는 중성 pH 하의 수성 완충액 중에서 가용화시킬 수 있다.
본 발명의 펩티드 작동제는 진핵 세포 숙주와 원핵 세포 숙주 둘 다를 이용하여 당해 분야에 공지된 재조합 방법에 의해 만들 수도 있다.
일단 펩티드가 제조되고 정제되면, 하나 이상의 PEG 분자를 Cys 또는 Lys 잔기, K(W) 또는 K(CO(CH2)2SH), 또는 카복시 말단 아미노산에 공유적으로 연결시킴으로써 상기 펩티드를 변형시킨다. PEG와 공유적으로 접합된 펩티드를 제조하기 위한 광범위한 방법이 당해 분야에 보고되었고, 본 발명을 위해 사용된 구체적인 방법은 제한적이지 않다 [참고: Roberts, M. et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002].
사용될 수 있는 PEG 분자의 예는 분기된 (bifurcated) PEG 말레이미드인 메톡시-PEG2-MAL-40K (공급처: Nektar, Huntsville, Alabama)이다. 기타 예에는 벌크 mPEG-SBA-20K (공급처: Nektar), mPEG2-ALD-40K (공급처: Nektar) 및 메톡시-PEG-MAL-30K (공급처: Dow)가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
PEG의 카복시-말단 부착은 전구체로서 재조합 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 사용하여 효소적 커플링함으로써 부착시킬 수 있거나, 당해 분야에 공지된 또 다른 방법에 의해 부착시킬 수 있고, 이는 예를 들어, 미국 특허 제4,343,898호 또는 문헌 [참고: Intl. J. Pept. & Prot. Res. 43:127-38 (1994)]에 기재되어 있다.
본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 제조하기 위한 한 가지 방법은 PEG를 펩티드의 티올 기에 직접적으로 부착시키기 위해 PEG-말레이미드를 사용하는 것을 포함한다. 티올 관능기의 도입은 Cys 또는 hC 잔기를 상기 언급된 위치 에서 펩티드 상으로 또는 펩티드 내로 부가하거나 삽입함으로써 달성할 수 있다. 티올 관능기는 펩티드의 측쇄 상으로 도입할 수도 있다 (예를 들어, 머캅토프로피온산과 같은 티올 함유 산에 의해 리신 ε-아미노 기를 아실화시킴). 본 발명의 PEG화 과정은 안정한 티오에테르 링커를 형성하기 위한 미카엘 (Michael) 부가를 활용한다. 이 반응은 고도로 특이적이고 기타 관능기의 존재 하에 온순한 조건 하에 일어난다. 명확히 정의된 생체 활성의 PEG-단백질 접합체를 제조하기 위해 반응성 중합체로서 PEG 말레이미드를 사용하였다. 이러한 과정은 반응 완료를 구동하기 위해 PEG 말레이미드를 기준으로 하여 티올-함유 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 몰 과량, 바람직하게 1 내지 10배 몰 과량으로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 반응은 실온 하 pH 4.0 내지 9.0에서 10분 내지 40시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 과량의 비-PEG화 티올-함유 펩티드는 통상적인 격리 방법에 의해 PEG화 생성물로부터 용이하게 격리시킨다. PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제는 역상 HPLC 또는 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리시키는 것이 바람직하다. VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 PEG화하는데 요구되는 구체적 조건이 실시예 8에 제시되어 있다. 시스테인 PEG화는 PEG 말레이미드 또는 분기된 PEG 말레이미드를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 제조하기 위한 또 다른 방법은 PEG-석신이미딜 유도체를 사용하여 리신 잔기를 PEG화하는 것을 포함한다. 부위 특이적 PEG화를 달성하기 위해서는, PEG화를 위해 사용되지 않은 Lys 잔기를 Arg 잔기 대신 사용한다.
PEG화하기 위한 또 다른 접근 방식은 픽테트-스펜글러 (Pictet-Spengler) 반응을 통해서이다. PEG 분자를 VPAC2 수용체 선택적 펩티드 상으로 혼입시키기 위해서는, 자유 아민을 수반한 Trp 잔기가 필요하다. 이를 달성하기 위한 한 가지 접근 방식은 Trp 잔기를 고체 상 합성 동안 아미드 결합을 통하여 Lys 측쇄의 아민 상으로 부위 특이적으로 도입하는 것이다 (실시예 10 참고).
본 발명의 각종 바람직한 특징과 양태는 다음 도면을 참고로 하여 실시예를 통해서만 기재될 것이다.
도 1은 글루코스를 주사하기 24시간 전에 P505 또는 P525로 처치한 동물에게서 정맥내 글루코스 챌린지(challenge)에 대한 인슐린 반응 증강을 도시한 것이다. 비히클-처치된 동물 중에서의 인슐린 반응이 기준용으로 도시되었다.
실시예 1 - 고체 상 t-Boc 화학에 의한 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 제조
대략 0.5 내지 0.6 그램 (0.38 내지 0.45 mmole)의 Boc Ser(Bzl)-PAM 수지를 표준 60 mL 반응 용기에 놓아 두었다. 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems) ABI430A 펩티드 합성기 상에서 이중 커플링을 수행하였다.
다음 측쇄 보호된 아미노산 (Boc 아미노산의 2 mmole 카트릿지)를 공급처 [Midwest Biotech (Fishers, IN)]로부터 수득하고, 이를 다음 합성에 사용하였다:
Arg-토실 (TOS), Asp-δ-시클로헥실 에스테르 (OcHx), Glu-δ-시클로헥실 에 스테르 (OcHx), His-벤질옥시메틸 (BOM), Lys-2-클로로벤질옥시카보닐 (2Cl-Z), Ser-O-벤질 에테르 (OBzl), Thr-O-벤질 에테르 (OBzl), Trp-포르밀 (CHO) 및 Tyr-2-브로모벤질옥시카보닐 (2Br-Z).
트리플루오로아세트산 (TFA), 디-이소프로필에틸아민 (DIEA), DMF 중의 0.5 M 히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 및 디클로로메탄 중의 0.5 M 디시클로헥실카보디이미드 (DCC)는 공급처 [PE-Applied Biosystems (Foster City, CA)]로부터 구입하였다. 디메틸포름아미드 (DMF-Burdick and Jackson) 및 디클로로메탄 (DCM- Mallinkrodt)은 공급처 [Mays Chemical Co. (Indianapolis, IN)]로부터 구입하였다.
대칭 무수물 또는 HOBt 에스테르 (둘 다 DCC를 사용하여 형성하였다)를 사용하여 표준 이중 커플링을 수행하였다. 합성 완료시, N-말단 Boc 기를 제거하고, 펩티딜 수지를 DMF 중의 20％ 피페리딘으로 처리하여, Trp가 서열에 존재하는 경우에는 Trp 측쇄를 탈포밀화시켰다. N-말단 아실화를 위해, 상응하는 산의 4배 과량의 대칭 무수물을 펩티드 수지 상에 가하였다. DCM 중에서 디이소프로필카보디이미드 (DIC) 활성화시킴으로써 대칭 무수물을 제조하였다. 이 반응을 4시간 동안 진행시키고, 닌히드린 (ninhydrin) 시험에 의해 모니터링하였다. DCM으로 세척한 후, 수지를 TEFLON 반응 용기에 옮긴 다음, 진공 하에 건조시켰다.
상기 반응 용기를 HF (불화수소산) 장치 (공급처: Penninsula Laboratories)에 장착시킴으로써 절단을 수행하였다. 수지 1 그램당 1 ml의 m-크레졸을 가하고, 10 ml HF (구입처: AGA, Indianapolis, IN)를 예비-냉각시킨 용기 내로 농축시켰 다. 메티오닌이 존재하는 경우에는, 수지 1 그램당 1 ml DMS을 가하였다. 반응물을 냉욕에서 1시간 동안 교반시켰다. HF를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 에틸 에테르에 현탁시켰다. 고형물을 여과시키고 에테르로 세척하였다. 각 펩티드를 수성 아세트산 내로 추출하고, 어느 하나를 동결 건조시키거나 역상 칼럼 상에 직접 부하하였다.
완충액 A (수중 0.1％ TFA) 중의 2.2 x 25 cm VYDAC C18 칼럼 상에서 정제를 수행하였다. 280 nm 하에서의 UV (4.0 A)를 모니터링하고 1분 분획을 수집하면서, 10 ml/min으로 120분에 걸쳐 20％ 내지 90％ B (아세토니트릴 중의 0.1％ TFA)의 구배를 HPLC (Waters) 상에서 수행하였다. 적당한 분획을 합하고, 냉동시킨 다음, 동결건조시켰다. 건조된 생성물을 HPLC (0.46 x 15 cm METASIL AQ C18) 및 MALDI 질량 분광측정법으로 분석하였다.
실시예 2 - 고체 상 FMoc 화학에 의한 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 제조
대략 114 mg (50 mMole) FMOC Ser(tBu) WANG 수지 (공급처: GlycoPep, Chicago, IL)를 각 반응 용기에 놓아 두었다. 합성을 펩티드 합성기 (Rainin Symphony 펩티드 합성기) 상에서 수행하였다. 75 mg (50 μmole) 링크 아미드 AM 수지 (공급처: Rapp Polymere. Tuebingen, Germany)를 사용하여 C-말단 아미드를 수반한 유사체를 제조하였다.
다음 FMOC 아미노산을 공급처 [GlycoPep (Chicago, IL) and NovaBiochem (La Jolla, CA)]로부터 구입하였다: Arg-2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐 (Pbf), Asn-트리틸 (Trt), Asp-β-t-부틸 에스테르 (tBu), Glu-δ-t-부틸 에스테르 (tBu), Gln-트리틸 (Trt), His-트리틸 (Tit), Lys-t-부틸옥시카보닐 (Boc), Ser-t-부틸 에테르 (OtBu), Thr-t-부틸 에테르 (OtBu), Trp-t-부틸옥시카보닐 (Boc), Tyr-t-부틸 에테르 (OtBu).
용매 디메틸포름아미드 (DMF-Burdick and Jackson), N-메틸 피롤리돈 (NMP-Burdick and Jackson), 디클로로메탄 (DCM-Mallinkrodt)은 공급처 [Mays Chemical Co. (Indianapolis, IN)]로부터 구입하였다.
히드록시벤조트리아졸 (HOBt), 디-이소프로필카보디이미드 (DIC), 디-이소프로필에틸아민 (DIEA), 및 피페리딘 (Pip)은 공급처 [Aldrich Chemical Co (Milwaukee, WI)]로부터 구입하였다.
모든 아미노산을 DMF 중의 0.3 M로 용해시켰다. 20％ Pip/DMF를 사용하여 20분 탈보호시킨 후에 3시간 동안 DIC/HOBt 활성화 커플링을 수행하였다. 탈보호 및 커플링 후에 각 수지를 DMF로 세척하였다. 최종 커플링 및 탈보호 후에, 펩티딜 수지를 DCM으로 세척하고 반응 용기 중에서 진공 하에 건조시켰다. N-말단 아실화를 위해, 상응하는 산의 4배 과량의 대칭 무수물을 펩티드 수지 상에 가하였다. DCM 중에서 DIC 활성화시킴으로써 대칭 무수물을 제조하였다. 이 반응을 4시간 동안 진행시키고, 닌히드린 시험에 의해 모니터링하였다. 이어서, 펩티드 수지를 DCM으로 세척한 다음, 진공 하에 건조시켰다.
절단 반응물을 10 ml TFA당 0.2 ml 티오아니솔, 0.2 ml 메탄올, 0.4 ml 트리이소프로필실란으로 이루어진 절단 칵테일 [모두 공급처 (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)로부터 구입하였다]과 함께 2시간 동안 혼합하였다. Cys가 서열에 존재하는 경우에는, 2％의 에탄디티올을 가하였다. TFA 여액을 40 ml 에틸 에테르에 가하였다. 침전물을 2000 rpm으로 2분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 경사 제거하였다. 펠릿을 40 ml 에테르에 재현탁시키고, 재원심분리시키며, 재경사 제거하고, 질소 하에 건조시킨 다음, 진공 하에 건조시켰다.
각 생성물 0.3 내지 0.6 mg을 1 ml 0.1％ TFA/아세토니트릴 (ACN)에 용해시켰는데, 20 ㎕을 HPLC 상에서 분석하였다 [0.46 x 15cm METASIL AQ C18, 1 ml/min, 45℃, 214 nM (0.2A), A=O.1％ TFA, B=O.1％ TFA/50％ ACN. 30분에 걸친 구배 = 50％ B 내지 90％ B].
완충액 A (수중 0.1％ TFA) 중의 2.2 x 25 cm VYDAC C18 칼럼 상에서 정제를 수행하였다. 280 nm 하에서의 UV (4.0 A)를 모니터링하고 1분 분획을 수집하면서, 10 ml/min으로 120분에 걸쳐 20％ 내지 90％ B (아세토니트릴 중의 0.1％ TFA)의 구배를 HPLC (Waters) 상에서 수행하였다. 적당한 분획을 합하고, 냉동시킨 다음, 동결건조시켰다. 건조된 생성물을 HPLC (0.46 x 15 cm METASIL AQ C18) 및 MALDI 질량 분광측정법으로 분석하였다.
P521에 대한 전구체
(C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQSIOrnOrnGGPSSGAPPPCC-NH 2 ): 상기 언급된 FMoc 프로토콜을 사용하여 합성을 수행하였다. 펩티드는 다음 분석적 HPLC함으로써 명확히 규명하였다: tR = 10.9분, 상기 언급된 바와 같은 HPLC 조건, 및 MALDI-TOF: 계산치 m/z = 4290.0, 측정치 m/z = 4290.8 [M+H+]. 역상 분취 HPLC를 사용하여 정제한 후, 순수한 분획을 합하고 동결건조시켰다: 14.8 mg을 최종 동결건조 분말로서 수득하였다.
P525에 대한 전구체
(C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPCC-NH 2 ): P521에 대한 전구체에 관해 기재된 바와 같음. 분석적 HPLC: tR = 11.0분. MALDI-TOF: 계산치 m/z = 4288.0, 측정치 m/z = 4288.8 [M+H+]. 18.7 mg을 최종 동결건조 분말로서 수득하였다.
P574에 대한 전구체
(C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnOrnGGPSSGAPPPCC-NH 2 ): P521에 대한 전구체에 관해 기재된 바와 같음. 분석적 HPLC: tR = 11.7분. MALDI-TOF: 계산치 m/z = 4330.1, 측정치 m/z = 4330.7 [M+H+]. 46.2 mg을 최종 동결건조 분말로서 수득하였다.
실시예 3 - 인간 VPAC2 수용체에서의 시험관내 효력
알파 스크린: 세포를 배양 플라스크에서 PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 효소 무함유 해리 완충액으로 세정하였다. 해리된 세포를 제거하였다. 이어서, 세포를 침강시키고 자극 완충액에서 세척하였다. 각 데이터 점에 대해, 자극 완충액에 현탁된 50,000개 세포를 사용하였다. 이 완충액에 알파 스크린 수용자 비드를 자극과 함께 가하였다. 이 혼합물을 60분 동안 항온 배양하였다. 용해 완충액과 알파 스크린 공여자 비드를 가하고 60 내지 120분 동안 항온 배양하였다. 알파 스크린 신호 (세포내 cAMP 수준의 지표)를 적합한 기기 [예: AlphaQuest (공급처: Perkin-Elmer)]에서 판독하였다. 알파 스크린 공여자 및 수용자 비드를 포함한 단계를 조명 감소 하에 수행하였다. cAMP 발생에 대한 EC50은 미가공 신호로부터 계산하거나, 또는 각 판 상에서 수행된 표준 곡선으로써 결정된 바와 같은 절대 cAMP 수준에 기준하였다.
각 작동제에 대한 결과는 최소한, 단일 수행에서 수행된 2가지 분석으로부터의 것이다. 몇몇 작동제의 경우에는, 그 결과가 1회 이상 수행치의 평균이다. 시험된 펩티드 농도는 다음과 같다: 10000, 1000, 100, 10, 3, 1, 0.1, 0.01, 0.003, 0.001, 0.0001 및 0.00001 nM.
DiscoveRx: 96-웰 미세역가 판에서 인간 VPAC2 수용체를 안정적으로 발현하는 CHO-S 세포주를 검정 전날 50,000개 세포/웰로 시딩하였다. 이 세포를 200 ㎕ 배양 배지에 24시간 동안 부착시켜 두었다. 실험 당일에 상기 배지를 꺼냈다. 또한, 세포를 2회 세척하였다. 세포를 실온 하에 15분 동안 IBMX가 부가된 검정 완충액에서 항온 배양하였다. 그 후, 자극을 가하고 검정 완충액에 용해시켰다. 자극은 30분 동안 존재하였다. 이어서, 검정 완충액을 온화하게 제거하였다. DiscoveRx cAMP 키트의 세포 용해 시약을 가하였다. 그 후, 제조업자가 기재된 바와 같이 cAMP 신호를 전개하기 위한 표준 프로토콜을 사용하였다 (공급처: DiscoveRx Inc., USA). cAMP 발생에 대한 EC50은 미가공 신호로부터 계산하거나, 또는 각 판 상에서 수행된 표준 곡선으로써 결정된 바와 같은 절대 cAMP 수준에 기준하였다.
각 작동제에 대한 결과는 2가지 독립적인 수행의 평균이다. 전형적으로 시험된 펩티드 농도는 다음과 같다: 1000, 300, 100, 10, 1, 0.3, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 및 0 nM.
인간 VPAC2 수용체에 대한 활성 [EC50 (nM)]이 상이한 검정 포맷에 대해 표 1에 보고되었다.
Figure 112008029974643-pct00015
Figure 112008029974643-pct00016
실시예 4 - 선택성
결합 검정: 안정한 VPAC2 세포주 (실시예 3 참고)로부터 제조된 막, 또는 인간 VPAC1 또는 PAC1로 일시적으로 형질감염시킨 세포로부터 제조된 막을 사용하였다. VPAC1 및 VPAC2의 경우에는 추적자로서 125I-표지된 VIP를 사용하고 PAC1의 경우에는 추적자로서 125I-표지된 PACAP-27을 사용하여, 필터 결합 검정을 수행하였다.
이러한 검정을 위한 용액 및 장비에는 다음이 포함된다:
예비침지 용액: 증류수 중의 0.5％ 폴리에틸렌아민
필터 판 수세용 완충액: 25 mM HEPES pH 7.4
차단 완충액: 25 mM HEPES pH 7:4; 0.2％ 프로테아제 무함유 BSA
검정 완충액: 25 mM HEPES pH 7.4; 0.5％ 프로테아제 무함유 BSA
희석 및 검정 판: PS-미소판, U 형태
여과 판: 멀티스크린 FB 불투명 판; 1.0 μM 유형 B 글라스피버 필터.
필터 판을 제조하기 위해, 예비침지 용액을 진공 여과함으로써 흡인시켰다. 판을 200 ㎕ 수세 완충액으로 2회 수세하였다. 200 ㎕ 차단 완충액을 필터 판에 가하였다. 이어서, 필터 판을 실온 하에 1시간 동안 200 ㎕ 예비침지 용액과 함께 항온 배양하였다.
검정 판에 25 ㎕ 검정 완충액, 검정 완충액에 현탁된 25 ㎕ 막 (2.5 ㎍), 검정 완충액 중의 25 ㎕ 작동제, 및 검정 완충액 중의 25 ㎕ 추적자 (약 40000 cpm)를 충전시켰다. 이와 같이 충전시킨 판을 진탕시키면서 1시간 동안 항온 배양하였다.
검정 판에서부터 필터 판으로의 이송을 수행하였다. 차단 완충액은 진공 여과시킴으로써 흡인시키고, 수세 완충액으로 2회 세척하였다. 90 ㎕를 검정 판에서부터 필터 판으로 옮겼다. 검정 판으로부터 이송된 90 ㎕를 흡인시키고, 200 ㎕ 수세 완충액으로 3회 세척하였다. 플라스틱 지지체를 꺼냈다. 이를 60℃ 하에 1시간 동안 건조시켰다. 30 ㎕ 마이크로신트 (Microscint)를 가하였다. 계수를 수행하였다.
인간 VPAC2, VPAC1 및 PAC1에 대한 수용체 결합도 (IC50)가 표 2에 보고되었다.
Figure 112008029974643-pct00017
Figure 112008029974643-pct00018
실시예 5 - 래트 VPAC1 및 VPAC2 수용체에서의 시험관내 효력
DiscoveRx: 시판용 형질감염 시약 [Lipofectamine (공급처: Invitrogen)]을 사용하여, CHO-PO 세포를 래트 VPAC1 또는 VPAC2 수용체 DNA로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 96-웰 판에서 10,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하고 200 ml 배양 배지에서 3일 동안 성장시켜 두었다. 3일 째에, 검정을 수행하였다.
실험 당일에 상기 배지를 꺼냈다. 또한, 세포를 2회 세척하였다. 세포를 실온 하에 15분 동안 IBMX가 부가된 검정 완충액에서 항온 배양하였다. 그 후, 자극을 가하고 검정 완충액에 용해시켰다. 자극은 30분 동안 존재하였다. 이어서, 검정 완충액을 온화하게 제거하였다. DiscoveRx cAMP 키트의 세포 용해 시약을 가하였다. 그 후, 제조업자가 기재된 바와 같이 cAMP 신호를 전개하기 위한 표준 프로토콜을 사용하였다 (공급처: DiscoveRx Inc., USA). cAMP 발생에 대한 EC50 값은 미가공 신호로부터 계산하거나, 또는 각 판 상에서 수행된 표준 곡선으로써 결정된 바와 같은 절대 cAMP 수준에 기준하였다.
각 작동제에 대한 결과는 2가지 독립적인 수행의 평균이다. 래트 VPAC1 및 VPAC2 결과는 DiscoveRx 검정을 사용해서만 생성되었다. 전형적으로 시험된 펩티드 농도는 다음과 같다: 1000, 300, 100, 10, 1, 0.3, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 및 0 nM.
래트 VPAC2 및 VPAC1 수용체에 대한 활성 [EC50 (nM)]이 표 3에 보고되었다.
Figure 112008029974643-pct00019
Figure 112008029974643-pct00020
실시예 6 - 생체내 검정:
정맥내 내당능 시험 (IVGTT): 정상 비스타 (Wistar) 래트를 밤새 단식시키고 실험에 앞서 마취시켰다. 혈액 샘플링 카테터를 래트 내로 삽입하였다. 글루코스 챌린지하기 통상 24시간 전에, 작동제를 피하 투여하였다. 경동맥으로부터 혈액 샘플을 취하였다. 글루코스를 작동제와 함께 주사하기 직전에 혈액 샘플을 채집하였다. 초기 혈액 샘플링 후, 혼합된 글루코스를 정맥내 주사하였다. 체중 kg당 0.5 g의 글루코스 챌린지를 제공하였는데, 체중 kg당 총 1.5 ml의 비히클을 글루코스 및 작동제와 함께 주사하였다. 펩티드 농도를 다양하게 하여 목적하는 용량 (㎍/kg)이 생성되도록 하였다. 글루코스 투여 후 2, 4, 6 및 10분 째에 혈액 샘플을 채집하였다. 동물 대조군에게는 동일한 비히클을 글루코스와 함께 투여하였지만, 작동제는 투여하지 않았다. 몇몇 경우에는, 20분 내지 30분 후에 혈당 샘플을 채집하였다. 아프로티닌 (Aprotinin)을 혈액 샘플에 가하였다 (250-500 kIU/ml 혈액). 이어서, 표준 방법론을 사용하여 글루코스 및 인슐린에 관하여 알아보기 위해 혈장을 분석하였다.
본 검정은 PBS 중의 제형화되고 교정된 펩티드 원액을 이용하였다. 정상적으로, 이러한 원액은 예비-희석시킨 100 μM 원액이다. 그러나, 대략 1 mg 작동제/ml를 수반한 보다 진한 원액을 사용하였다. 구체적인 농도는 항상 공지되어 있다. 최대 반응 상의 변동성은 대부분이 비히클 용량 상의 변동성에 기인한다. 프로토콜 상세 내역은 다음과 같다:
종/균주/체중 래트/비스타 유니레버/대략 275-300 g
처리 기간 단일 용량
용량 용적/경로 1.5 ml/kg/정맥내
비히클 8％ PEG300, 수중 0.1％ BSA
음식물/물 섭생 수술하기에 앞서 래트를 밤새 단식시켰다
생존-양상 파라미터 검사가 끝날 무렵 동물을 희생시켰다
IVGTT: 펜토바르비탈 마취 하에 각 군의 래트 상에서 수행됨 (2개의 카테터, 경정맥 및 경동맥을 이용함) 글루코스 정맥내 거환: 시간 0에서 10％ 용액으로서 500 mg/kg (5 ml/kg).
화합물 정맥내: 혈당 샘플링하기 0 내지 240분전 (경동맥으로부터의 300 ㎕; 항응고제로서의 EDTA; 항-단백질분해제로서의 아프로티닌 및 PMSF; 얼음 상에서 유지시킴): 0, 2, 4, 6, 10, 20 및 30분.
결정된 파라미터: 인슐린 + 글루코스
독력학 인슐린 측정 후에 잔존하는 혈액 샘플을 -20℃ 하에 유지시키고 화합물 수준을 결정하였다.
작동제 # 글루코스와 화합물 간의 시간 증가율(％)
AUC:용량=0.09 mg/kg		 증가율(％)
AUC:용량=0.1 mg/kg		 증가율(％)
AUC:용량=0.3 mg/kg
P505 24시간 12 74
P511 24시간 38 59
P525 24시간 72 208
P570 24시간 36
P602 24시간 73 198
AUC = 곡선하 면적 (인슐린, 글루코스 후 0 내지 10 분).
PEG화 펩티드의 약동학적 프로파일: 건강한 344마리 피셔 (Fisher) 래트 (한 무리당 3마리 동물)에게 100 ㎍ 작동제/kg (작동제 양은 PBS 완충액에 용해시킨 펩티드 함량에 기준한 것이다)를 주사하였다. 투여한지 3, 12, 24, 48, 72, 96 및 168시간 후에 혈액 샘플을 채집하고, 펩티드의 N-말단에 대항하여 유도된 방사성 면역검정 (RIA)에 의해 혈장 중의 펩티드 함량을 분석하였다. 이어서, 모델-독립적 방법 (공급처: WinNonlin Pro, Pharsight Corp., Mountain View, CA, USA)을 사용하여 PK 파라미터를 계산하였다.
Figure 112008029974643-pct00021
PEG화 펩티드 작동제의 PK 파라미터. N=3에 대한 평균 및 (SD) 값.
*NC = 불충분한 데이터로 인해 계산되지 못함.
실시예 7 - 래트 혈청 안정성 연구:
래트 혈청에서의 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 안정성을 결정하기 위해, CHO-VPAC2 세포 클론 #6 (96 웰 판/50,000개 세포/웰, 및 1일 배양), PBS 1X (공급처: Gibco), 100 μM 원액 중의 분석용 펩티드, 희생시킨 정상 비스타 래트로부터의 래트 혈청, 아프로티닌, 및 DiscoveRx 검정 키트를 수득하였다. 래트 혈청을 사용할 때까지 4℃ 하에 저장하고 2주 이내에 사용하였다.
0일째에, 10 ㎕ 펩티드 원액을 각 분취액에 대한 90 ㎕ 래트 혈청에 부가함으로써, 래트 혈청 중의 10 μM 펩티드의 2개 100 ㎕ 분취액을 제조하였다. 250 kIU 아프로티닌/ml를 이들 분취액 중의 하나에 가하였다. 분취액을 4℃ 하에 아프로티닌과 함께 저장하였다. 분취액을 37℃ 하에 아프로티닌 없이 저장하였다. 분취액을 24 또는 72시간 동안 항온 배양하였다.
1일째에, 0일째에 제조된 분취액을 24 또는 72시간 동안 항온 배양한 후, PBS + 1.3 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 2 mM 글루코스 및 0.25 mM IBMX를 함유하는 항온 배양 완충액을 제조하였다. 4℃ 및 37℃ 분취액에 대한 11개 일련의 5X 펩티드 희석물을 수반한 판을, 연구된 각 펩티드에 대해 제조하였다. 일차 스크린으로부터 펩티드의 EC50이 1 nM 이상인 경우에는 최대 농도로서 2000 nM을 사용하고, 펩티드의 EC50이 1 nM 미만인 경우에는 최대 농도로서 1000 nM을 사용하였다 (실시예 3 참고). 판을 항온 배양 완충액 중에서 세포로 2회 세척하였다. 판을 15분 동안 웰당 50 ㎕ 항온 배양 배지를 유지하도록 하였다. 웰당 50 ㎕ 용액을, 일차 스크린에 의해 표시되는 최대 농도를 두 번 되풀이하여 사용하여, 연구된 각 펩티드에 대해 4℃ 및 37℃ 분취액에 대한 11개 일련의 5X 펩티드 희석물을 이용하여 제조된 판으로부터 세포로 옮겼다. 이러한 단계는 펩티드 농도를 2 인자 정도 희석시켜 주었다. 상기 세포를 실온 하에 30분 동안 항온 배양하였다. 상등액을 제거하였다. 40 ㎕/웰의 DiscoveRx 항체/추출 완충액을 가하였다. 세포를 진탕기 (300 rpm) 상에서 1시간 동안 항온 배양하였다. DiscoveRx 키트를 이용한 정상 과정을 수행하였다. cAMP 표준물이 칼럼 12에 포함되었다. EC50 값은 cAMP 검정 데이터로부터 결정하였다. 활성 펩티드의 나머지 양은 각 조건에 대해 식 EC50,4℃/EC50,37℃로써 추정되었다.
Figure 112008029974643-pct00022
1>100％ 값은 본래의 펩티드가 PEG 접합체로부터 방출되었다는 것을 나타낼 수 있다.
실시예 8 - 티올계 화학을 이용한 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 PEG화
일반적으로, PEG화 반응은 티오에테르 결합 형성을 허용해 주는 조건 하에 수행하였다. 구체적으로 언급하면, 용액의 pH 범위는 약 4 내지 9이고, 티올 함유 펩티드 농도 범위는 PEG 말레이미드 농도의 0.7 내지 10 몰 과량이다. PEG화 반응을 실온 하에 통상적으로 수행하였다. 이어서, 역상 HPLC 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 분리하였다. PEG화 펩티드 작동제는 분석적 RP-HPLC, HPLC-SEC, SDS-PAGE, 및/또는 MALDI 질량 분광측정법을 이용하여 명확히 규명하였다.
통상적으로, 시스테인 또는 호모시스테인 또는 티올 함유 부분을 어느 한 말단 또는 양 말단에 부가하거나, 또는 시스테인 또는 호모시스테인 또는 티올 함유 부분을 서열 내로 삽입함으로써, 티올 관능기를 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제 내로 또는 상으로 도입하였다. 티올 함유 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 40 kDa, 30 kDa 또는 20 kDa PEG-말레이미드와 반응시켜, 티오에테르 결합을 통하여 공유적으로 부착된 PEG를 수반한 유도체를 제조하였다.
P505의 합성
19 mg의 펩티드 전구체 (비-PEG화 P505) 및 162 mg의 메톡시-PEG-말레이미드 (공급처: NOF, Japan) (평균 분자량 20,000 달톤)를, 10 mM EDTA (pH 6.8)를 함유하는 2 ml의 100 mM NH4Ac 완충액에 용해시키고, 반응을 4시간 동안 진행시켜 두었다. 분취 RP-HPLC 정제 후에 동결건조된 분말로서 생성물 97 mg을 수득하였다. PEG화 펩티드 작동제를 RP-HPLC 및 크기-배제 HPLC에 의해 명확히 규명하였고, 시험관내 활성을 알아보기 위해 시험하였다.
P525의 합성
18.7 mg의 펩티드 전구체 (비-PEG화 P525) 및 157 mg의 메톡시-PEG-말레이미드 (평균 분자량 20,000 달톤)를, 10 mM EDTA (pH 6.8)를 함유하는 2 ml의 100 mM NH4Ac 완충액에 용해시키고, 반응을 4시간 동안 진행시켜 두었다. 분취 RP-HPLC 정제 후에 동결건조된 분말로서 생성물 114 mg을 수득하였다. PEG화 펩티드 작동제를 RP-HPLC 및 크기-배제 HPLC에 의해 명확히 규명하였고, 시험관내 활성을 알아보기 위해 시험하였다.
P572의 합성
22.3 mg의 펩티드 전구체 (비-PEG화 P572) 및 177 mg의 메톡시-PEG-말레이미드 (평균 분자량 20,000 달톤)를, 10 mM EDTA (pH 6.8)를 함유하는 2 ml의 100 mM NH4Ac 완충액에 용해시키고, 반응을 4시간 동안 진행시켜 두었다. 분취 RP-HPLC 정제 후에 동결건조된 분말로서 생성물 137 mg을 수득하였다. PEG화 펩티드 작동제를 RP-HPLC 및 크기-배제 HPLC에 의해 명확히 규명하였고, 시험관내 활성을 알아보기 위해 시험하였다.
P574의 합성
31.9 mg의 펩티드 전구체 (비-PEG화 P574) 및 283 mg의 메톡시-PEG-말레이미드 (평균 분자량 20,000 달톤)를, 10 mM EDTA (pH 6.8)를 함유하는 3 ml의 100 mM NH4Ac 완충액에 용해시키고, 반응을 4시간 동안 진행시켜 두었다. 분취 RP-HPLC 정제를 2회 수행한 후에 동결건조된 분말로서 생성물 171 mg을 수득하였다. PEG화 펩티드 작동제를 RP-HPLC 및 크기-배제 HPLC에 의해 명확히 규명하였고, 시험관내 활성을 알아보기 위해 시험하였다.
P602 의 합성
20 mg의 펩티드 전구체 (비-PEG화 P602) 및 223 mg의 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)-말레이미드-프로피온아미드 (공급처: Chirotech Technology Ltd., UK) (평균 분자량 30,000 달톤)를, 10 mM EDTA (pH 6.8)를 함유하는 2 ml의 100 mM NH4Ac 완충액에 용해시키고, 반응을 4시간 동안 진행시켜 두었다. 분취 RP-HPLC 정제 후에 동결건조된 분말로서 생성물 132 mg을 수득하였다. PEG화 펩티드 작동제를 RP-HPLC 및 크기-배제 HPLC에 의해 명확히 규명하였고, 시험관내 활성을 알아보기 위해 시험하였다.
실시예 9 - 리신의 측쇄 상에서 아실화를 통한 PEG화
선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제의 부위 특이적 PEG화를 달성하기 위해, 모든 Lys 잔기를 Arg 잔기로 변화시켰는데, 단 PEG화를 수행하고자 하는 Lys 잔기는 제외하였다. 사용될 수 있는 PEG 분자는 mPEG-SBA-20K (공급처: Nektar, Lot #: PT-04E-11)이다. PEG화 반응을 실온에서 2 내지 3시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 펩티드를 분취 HPLC에 의해 정제하였다.
실시예 10 - 픽테트-스펜글러 반응을 통한 PEG화:
픽테트-스펜글러 반응을 통하여 PEG화가 일어나는 경우, PEG 분자를 선택적 VPAC2 수용체 펩티드 작동제 상으로 혼입시키기 위해서는 자유 아민을 수반한 Trp 잔기가 필요하다. Trp 잔기를 Lys 잔기의 측쇄 상으로 커플링하였다. 광범위한 SAR은 상기 변형이 시험관내 효력과 선택성 측면에서 모 펩티드의 특성을 변화시키지 않았다는 것을 나타낸다.
알데히드 관능기를 수반한 PEG, 예를 들어 mPEG2-BUTYRALD-40K (공급처: Nektar, USA)를 상기 반응에 사용하였다. 부위 특이적 PEG화는 PEG와 펩티드 사이에 테트라카볼린 환을 형성시키는 것을 포함한다. PEG는 실온 하에 1 내지 48시간 동안 빙초산에서 수행하였다. 1 내지 10 몰 과량의 PEG 알데히드를 상기 반응에 사용하였다. 아세트산을 제거한 후, PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 분취 RP-HPLC에 의해 분리하였다.
P535의 합성
27.7 mg의 펩티드 전구체 (비-PEG화 P535) 및 590 mg의 mPEG2-BUTYRALD-40K를 3 ml 아세트산에 용해시키고, 반응을 2일 동안 진행시켜 두었다. 생성물을 분취 RP-HPLC함으로써 분리하여 94 mg의 PEG화 펩티드 작동제를 동결건조된 분말로서 산출하였다. 이러한 PEG화 펩티드 작동제를 RP-HPLC 및 크기-배제 HPLC에 의해 명확히 규명하였고, 시험관 내에서 시험하였다.
P557의 합성
23 mg의 펩티드 전구체 (비-PEG화 P557) 및 460 mg의 mPEG2-BUTYRALD-40K를 3 ml 아세트산에 용해시키고, 반응을 2일 동안 진행시켜 두었다. 생성물을 분취 RP-HPLC함으로써 분리하여 50 mg의 PEG화 펩티드 작동제를 동결건조된 분말로서 산출하였다. 이러한 PEG화 펩티드 작동제를 RP-HPLC 및 크기-배제 HPLC에 의해 명확히 규명하였고, 시험관 내에서 시험하였다.
본 발명의 기타 변형은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서도 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company Alsina-Fernandez, Jorge Zhang, Lianshan Bokvist, Bengt Krister <120> Selective VPAC2 Receptor Peptide Agonists <130> X17287M WO <150> US 60/730,291 <151> 2005-10-26 <150> US 60/740,342 <151> 2005-11-29 <150> US 60/743,364 <151> 2006-02-28 <160> 148 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <223> C-terminal amino acid may be amidated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> Any Xaa may be independently present or absent. If an Xaa is absent, the next amino acid present downstream is the next amino acid in the C-terminal extension. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly, Cys, Lys, epsilon- (L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly, Arg, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Thr, Ser, Ala, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Pro, His, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, Cys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly, Ser, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, Cys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Ser, Ala, Arg, Lys, His, Cys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Cys, His, Pro, Lys, Arg, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is His, Ser, Arg, Lys, Cys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is His, Ser, Arg, Lys, Cys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or K(CO(CH2)2SH) <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <223> C-terminal amino acid may be amidated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> Any Xaa may be independently present or absent. If an Xaa is absent, the next amino acid present downstream is the next amino acid in the C-terminal extension. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly, Cys, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly, Arg, Cys, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Thr, Ser, Ala, Cys, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Pro, His, Cys, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly, Ser, Cys, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Ser, Ala, Cys, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Ser, Ala, Cys, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Ser, Ala, Arg, Lys, His, or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Cys, His, Pro, Lys, or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is His, Ser, Arg, Lys, or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is His, Ser, Arg, Lys, or Cys <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <223> C-terminal amino acid may be amidated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Any Xaa may be independently present or absent. If an Xaa is absent, the next amino acid present downstream is the next amino acid in the C-terminal extension. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Cys <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(39) <223> Any Xaa may be independently present or absent. If an Xaa is absent, the next amino acid present downstream is the next amino acid in the peptide agonist sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> 1 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is His, or dHis <220> <221> MISC_FEATURE <222> 2 <223> Xaa is dAla, Ser, Val, Gly, Thr, Leu, dSer, Pro, or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> 3 <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> 4 <223> Xaa is Ala, Ile, Tyr, Phe, Val, Thr, Leu, Trp, Gly, dAla, Aib, or N- methyl alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> 5 <223> Xaa is Val, Leu, Phe, Ile, Thr, Trp, Tyr, dVal, Aib, or N-methyl valine <220> <221> MISC_FEATURE <222> 6 <223> Xaa is Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> 8 <223> Xaa is Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> 9 <223> Xaa is Asn, Gln, Asp, Glu, Ser, Cys, Lys, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 10 <223> Xaa is Tyr, Trp, Tyr(OMe), Ser, Cys, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> 12 <223> Xaa is Arg, Lys, Glu, hR, Orn, Lys (isopropyl), Aib, Cit, Ala, Leu, Gln, Phe, Ser, or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> 13 <223> Xaa is Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys, Lys, or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 14 <223> Xaa is Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Lys (isopropyl), Phe, Gln, Aib, Cit, Ser, or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> 15 <223> Xaa is Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, hR, Orn, Lys (isopropyl), Phe, Gln, Aib, K(Ac), Cit, Ser, Cys, K(W), or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 16 <223> Xaa is Gln, Lys, Glu, Ala, hR, Orn, Lys (isopropyl), Cit, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), or K(W) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 17 <223> Xaa is Val, Ala, Leu, Ile, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), or K(W) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 18 <223> Xaa is Ala, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), K(W), Abu, or Nle <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> MISC_FEATURE <222> 20 <223> Xaa is Lys, Gln, hR, Arg, Ser, His, Orn, Lys (isopropyl), Ala, Aib, Trp, Thr, Leu, Ile, Phe, Tyr, Val, K(Ac), Cit, Cys, K(CO(CH2)2SH), or K(W) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 21 <223> Xaa is Lys, His, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), Cit, Ser, Cys, Val, Tyr, Ile, Thr, Trp, K(W), or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 22 <223> Xaa is Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, Ile, Val, Tyr(OMe), Ala, Aib, Ser, Cys, Lys, K(W), or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 23 <223> Xaa is Leu, Phe, Ile, Ala, Trp, Thr, Val, Aib, Ser, Cys, Lys, K(W), or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 24 <223> Xaa is Gln, Glu, Asn, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), or K(W) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 25 <223> Xaa is Ser, Asp, Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib, Glu, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), or K(W) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 26 <223> Xaa is Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), or K(W) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 27 <223> Xaa is Lys, hR, Arg, Gln, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Met, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Lys (isopropyl), Cys, Leu, Orn, dK, K(W), or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 28 <223> Xaa is Asn, Asp, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dLys, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), or K(W) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 29 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Thr, Val, Trp, Tyr, Cys, Orn, Cit, Aib, K(W), or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 30 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Arg, Lys, Ile, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Cys, hR, Cit, Aib, Orn, K(W), or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 31 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Tyr, His, Phe, Thr, Cys, Ser, Lys, Gln, K(W), or K(CO(CH2)2SH) <220> <221> MISC_FEATURE <222> 32 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Cys, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> 33 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> 34 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> 35 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> 36 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> 37 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> 38 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> 39 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> 40 <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Arg <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <400> 5 Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> AMIDATION <400> 6 Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <400> 7 Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> AMIDATION <400> 8 Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <400> 9 Gly Arg Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> AMIDATION <400> 10 Gly Arg Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <400> 11 Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> AMIDATION <400> 12 Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <223> C-terminal amino acid may be amidated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Any Xaa may be independently present or absent. If an Xaa is absent, it is preferred that the next amino acid present downstream is the next amino acid in the C-terminal extension. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Cys, Lys, epsilon- (L-tryptophyl)-lysine, or epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Arg, Ser, homoarginine, Orn, His, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or epsilon-(3prime- mercaptoproprionyl)-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Thr, Cys, Lys, epsilon- (L-tryptophyl)-lysine, or epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Cys, Lys, epsilon- (L-tryptophyl)-lysine, or epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)- lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Ser, Ala, Arg, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or epsilon-(3prime- mercaptoproprionyl)-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)- lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Lys, epsilon-(L- tryptophyl)-lysine, Pro, Cys, or epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is K(E-C16), Ser, Cys, Lys, epsilon-(L-tryptophyl)-lysine, or epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)- lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa may be present or absent. If present, Xaa is Ser, Cys, Lys, epsilon- (L-tryptophyl)-lysine, or epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)-lysine <400> 13 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 14 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25 <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> AMIDATION <400> 15 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu 20 25 <210> 16 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> AMIDATION <400> 16 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Gln 20 25 30 Arg Val Lys Asn Lys 35 <210> 17 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (13, 15, 20, 28) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (21, 29) <223> Orn <400> 17 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Arg Xaa Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Xaa Xaa 20 25 <210> 18 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SH) <400> 18 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Xaa Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 19 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> Xaa is K(W) <400> 19 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 20 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 21 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SH) <400> 20 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 21 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 20 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SH) <400> 21 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 22 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 22 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Cys Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 23 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 23 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Cys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 24 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 24 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 25 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 26 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 26 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 27 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 27 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 28 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 28 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 29 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 29 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 30 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 30 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 31 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 31 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 32 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 32 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 33 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 33 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 34 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Xaa is K(W) <400> 34 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 35 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 24 <223> Xaa is K(W) <400> 35 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 36 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 17 <223> Xaa is K(W) <400> 36 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 37 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SH) <400> 37 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 38 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 21 <223> Xaa is K(W) <400> 38 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 39 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 27, 28) <223> Orn <400> 39 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Cys Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 40 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 40 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 41 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 26 <223> Xaa is K(W) <400> 41 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 42 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 42 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Cys Xaa 20 25 <210> 43 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 43 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Cys Xaa Xaa 20 25 <210> 44 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 44 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 45 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 45 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Cys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 46 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 21 <223> Xaa is K(WPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 46 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 47 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (13, 15, 20, 28) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (21, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <220> <221> misc_feature <222> 40 <223> Cys(PEG40K) <400> 47 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Arg Xaa Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Xaa Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 40 <210> 48 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 48 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Xaa Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 49 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> Xaa is K(WPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> 40 <223> AMIDATION <400> 49 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 50 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 21 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 50 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Cys Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 51 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 21 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 51 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 52 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> misc_feature <222> 21 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (12, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 52 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 53 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 20 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 53 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 54 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 18 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 54 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Cys Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 55 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 55 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Cys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 56 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 56 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 57 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 39 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 57 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 58 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 39 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 58 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 59 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 39 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 59 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 60 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> (39, 40) <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 60 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 35 40 <210> 61 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES 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Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 35 40 <210> 63 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> (39, 40) <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 63 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 35 40 <210> 64 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> (39, 40) <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 64 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 35 40 <210> 65 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> (39, 40) <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 65 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 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(12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Xaa is K(WPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 67 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 68 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 24 <223> Xaa is K(WPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 68 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 69 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 17 <223> Xaa is K(WPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 69 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 70 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 26 <223> Xaa is K(WPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 70 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 71 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 71 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 72 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 26 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 72 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Cys Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 73 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 17 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 73 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 74 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 74 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Cys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 75 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 75 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Xaa Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 76 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 24 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> misc_feature <222> 39 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 76 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 77 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 19 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> misc_feature <222> 39 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 77 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 78 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 25 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> misc_feature <222> 39 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 78 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 79 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 26 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> misc_feature <222> 39 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 79 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 80 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> misc_feature <222> 40 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 80 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 40 <210> 81 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> (24, 39) <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 81 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Cys Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 82 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> (26, 39) <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 82 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Cys Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 83 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> (28, 40) <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 83 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 40 <210> 84 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Reference peptide used for percentage sequence identity calculations <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 84 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <400> 85 Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> AMIDATION <400> 86 Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro 1 5 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <400> 87 Ser Ser Thr Ser Pro Arg Pro Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION <400> 88 Ser Ser Thr Ser Pro Arg Pro Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is epsilon-(L-tryptophyl)-lysine <400> 89 Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro Xaa 1 5 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is epsilon-(L-tryptophyl)-lysine <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> AMIDATION <400> 90 Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro Xaa 1 5 <210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <400> 91 Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: C-terminal extension of the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> AMIDATION <400> 92 Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: N-terminal modification to the PEGylated VPAC2 receptor peptide agonist <400> 93 Ser Trp Cys Glu Pro Gly Trp Cys Arg 1 5 <210> 94 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> Xaa is epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)-lysine <400> 94 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 95 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 95 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa 20 25 <210> 96 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 96 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Cys Xaa Xaa 20 25 <210> 97 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Xaa is epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)-lysine <400> 97 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 98 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Xaa is epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)-lysine <400> 98 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 99 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Xaa is epsilon-(L-tryptophyl)-lysine <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 99 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 100 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 100 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys 20 25 <210> 101 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <400> 101 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys 20 25 <210> 102 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 102 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys 20 25 <210> 103 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 103 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 104 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 104 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Cys Xaa 20 25 <210> 105 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 105 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 106 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 106 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Cys 20 25 <210> 107 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 107 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 108 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 108 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 109 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 109 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa 20 25 <210> 110 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (18) <223> Abu <400> 110 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 111 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> Xaa is epsilon-(3prime-mercaptoproprionyl)-lysine <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <400> 111 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 112 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> Xaa is epsilon-(L-tryptophyl)-lysine <400> 112 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25 <210> 113 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 18 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 113 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 114 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 18 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 114 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 115 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 115 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 116 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 26 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 116 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Cys Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 117 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> misc_feature <222> 40 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 117 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 40 <210> 118 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> misc_feature <222> 40 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 118 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 40 <210> 119 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 28, 40 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 119 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 40 <210> 120 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Xaa is K(WPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 120 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 121 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 29 <223> Cys(PEG40K) 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<222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 29 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 123 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Cys Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 124 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 29 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 124 His Ser 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acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 39, 40 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 126 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 35 40 <210> 127 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10, 22) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 28 <223> Cys(PEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 127 His Ser Asp Ala Val 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Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 140 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 140 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 141 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 29) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 28, 40 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 141 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 40 <210> 142 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 17 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 142 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Cys Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 143 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 17, 39 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 143 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Cys Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 144 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 39, 40 <223> Cys(PEG30K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 144 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 35 40 <210> 145 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 39 <223> Xaa is K(WPEG40K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 145 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Xaa 35 <210> 146 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 25) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 17, 39 <223> Cys(PEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 146 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys 35 <210> 147 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> misc_feature <222> 20 <223> Xaa is K(CO(CH2)2SPEG20K) <220> <221> MOD_RES <222> (39) <223> AMIDATION <400> 147 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 148 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PEGylated VPAC2 receptor agonist <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> C6 acylation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Methoxy <220> <221> MOD_RES <222> (15, 20, 23) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Abu <220> <221> misc_feature <222> 39, 40 <223> Cys(PEG30K) <220> <221> MOD_RES <222> (40) <223> AMIDATION <400> 148 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 35 40

Claims (21)

  1. Figure 112010039792409-pct00035
    Figure 112010039792409-pct00036
    Figure 112010039792409-pct00037
    Figure 112010039792409-pct00038
    중에서 선택된 서열 및 C-말단 연장부를 포함하며, C-말단 연장부의 N-말단이 상기 펩티드 서열의 C-말단에 연결되고, C-말단 연장부가 하기 서열 중에서 선택된 것이며,
    Figure 112010039792409-pct00045
    PEG 분자에 공유적으로 부착된 하나 이상의 Cys 잔기를 포함하거나,
    PEG 분자에 공유적으로 부착된 하나 이상의 Lys 잔기를 포함하거나,
    PEG 분자에 공유적으로 부착된 하나 이상의 K(W)를 포함하거나,
    PEG 분자에 공유적으로 부착된 하나 이상의 K(CO(CH2)2SH)를 포함하거나,
    카복시 말단 아미노산이 PEG 분자에 공유적으로 부착되거나, 또는
    위 경우들의 조합을 갖는
    PEG화(PEGylated) VPAC2 수용체 펩티드 작동제(agonist).
  2. 제1항에 있어서, 각 PEG 분자의 분자량이 20,000, 30,000, 40,000 또는 60,000 달톤인 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드 작동제의 N-말단에 N-말단 변형을 추가로 포함하며, N-말단 변형이 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일, 헥사노일, 메티오닌, 메티오닌 설폭시드, 3-페닐프로피오닐, 페닐아세틸, 벤조일, 노르루이신, D-히스티딘, 이소루이신, 3-머캅토프로피오닐, 바이오티닐-6-아미노헥산산 (6-아미노카프로산), 및 -C(=NH)-NH2 중에서 선택된 기의 부가인 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제.
  4. 제3항에 있어서, N-말단 변형이 아세틸 또는 헥사노일의 부가인 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제.
  5. 제1항에 있어서, 하기 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제:
    Figure 112010039792409-pct00040
    Figure 112010039792409-pct00041
    Figure 112010039792409-pct00042
    Figure 112010039792409-pct00043
  6. 하기 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제:
    Figure 112010039792409-pct00044
  7. 하기 화학식 4의 서열 (서열 4) 및 C-말단 연장부를 포함하며, C-말단 연장부의 N-말단이 상기 화학식 4의 펩티드의 C-말단에 연결되고, C-말단 연장부가 하기 서열 중에서 선택된 것이며,
    Figure 112010039792409-pct00046
    PEG 분자에 공유적으로 부착된 하나 이상의 Cys 잔기를 포함하거나,
    PEG 분자에 공유적으로 부착된 하나 이상의 Lys 잔기를 포함하거나,
    PEG 분자에 공유적으로 부착된 하나 이상의 K(W)를 포함하거나,
    PEG 분자에 공유적으로 부착된 하나 이상의 K(CO(CH2)2SH)를 포함하거나,
    카복시 말단 아미노산이 PEG 분자에 공유적으로 부착되거나, 또는
    위 경우들의 조합을 갖는
    PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제.
    <화학식 4>
    Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Thr-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Xaa12-Xaa13- Xaa14-
    Aib-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Abu-Aib-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-
    Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40
    (상기 식에서,
    Xaa1은 His, dH, 또는 부재하고;
    Xaa2는 dA, Ser, Val, Gly, Thr, Leu, dS, Pro, 또는 Aib이고;
    Xaa3은 Asp 또는 Glu이고;
    Xaa4는 Ala, Ile, Tyr, Phe, Val, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib, 또는 NMeA이고;
    Xaa5는 Val, Leu, Phe, Ile, Thr, Trp, Tyr, dV, Aib, 또는 NMeV이고;
    Xaa6은 Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, 또는 Tyr이고;
    Xaa8은 Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg, 또는 Tyr이고;
    Xaa9는 Asn, Gln, Asp, Glu, Ser, Cys, Lys, 또는 K(CO(CH2)2SH)이고;
    Xaa10은 Tyr, Trp, Tyr(OMe), Ser, Cys, 또는 Lys이고;
    Xaa12는 Arg, Lys, Glu, hR, Orn, Lys (이소프로필), Aib, Cit, Ala, Leu, Gln, Phe, Ser, 또는 Cys이고;
    Xaa13은 Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys, Lys, 또는 K(CO(CH2)2SH)이고;
    Xaa14는 Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Lys (이소프로필), Phe, Gln, Aib, Cit, Ser, 또는 Cys이고;
    Xaa16은 Gln, Lys, Glu, Ala, hR, Orn, Lys (이소프로필), Cit, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
    Xaa17은 Val, Ala, Leu, Ile, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
    Xaa18은 Ala, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), K(W), Abu, 또는 Nle이고;
    Xaa21은 Lys, His, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), Cit, Ser, Cys, Val, Tyr, Ile, Thr, Trp, K(W), 또는 K(CO(CH2)2SH)이고;
    Xaa22는 Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, Ile, Val, Tyr(OMe), Ala, Aib, Ser, Cys, Lys, K(W), 또는 K(CO(CH2)2SH)이고;
    Xaa23은 Leu, Phe, Ile, Ala, Trp, Thr, Val, Aib, Ser, Cys, Lys, K(W), 또는 K(CO(CH2)2SH)이고;
    Xaa24는 Gln, Glu, Asn, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
    Xaa25는 Ser, Asp, Phe, Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib, Glu, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
    Xaa26은 Ile, Leu, Thr, Val, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
    Xaa27은 Lys, hR, Arg, Gln, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Met, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Lys (이소프로필), Cys, Leu, Orn, dK, K(W), 또는 K(CO(CH2)2SH)이고;
    Xaa28은 Asn, Asp, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dK, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), 또는 K(W)이고;
    Xaa29는 Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Thr, Val, Trp, Tyr, Cys, Orn, Cit, Aib, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
    Xaa30은 Arg, Lys, Ile, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Cys, hR, Cit, Aib, Orn, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
    Xaa31은 Tyr, His, Phe, Thr, Cys, Ser, Lys, Gln, K(W), K(CO(CH2)2SH), 또는 부재하고;
    Xaa32는 Ser, Cys, Lys, 또는 부재하고;
    Xaa33은 Trp 또는 부재하고;
    Xaa34는 Cys 또는 부재하고;
    Xaa35는 Glu 또는 부재하고;
    Xaa36은 Pro 또는 부재하고;
    Xaa37은 Gly 또는 부재하고;
    Xaa38은 Trp 또는 부재하고;
    Xaa39는 Cys 또는 부재하고;
    Xaa40은 Arg 또는 부재하며;
    Xaa29, Xaa30, Xaa31, Xaa32, Xaa33, Xaa34, Xaa35, Xaa36, Xaa37, Xaa38, 또는 Xaa39가 부재하는 경우, 하류에 존재하는 그 다음 아미노산은 펩티드 작동제 서열 내의 그 다음 아미노산임).
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 PEG화 VPAC2 수용체 펩티드 작동제를 함유하는, 인슐린 비의존성 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병을 치료하기 위한 제약 조성물.
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