BRPI0617740A2 - agonistas seletivos peptìdicos do receptor vpac2, composição farmacêutica e uso dos referidos agonistas - Google Patents

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Lianshan Zhang
Jorge Alsina-Fernandez
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Abstract

<B>AGONISTAS SELETIVOS PEPTìDICOS DO RECEPTOR DE VPAC2, COMPOSIçãO FARMACêUTICA E USO DOS REFERIDOS AGONISTAS<D>. A presente invenção refere-se a peptídeos que ativam seletivamente o receptor de VPAC2 e são úteis no tratamento de diabetes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGONISTASSELETIVOS PEPTÍDICOS DO RECEPTOR DE VPAC2, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA E USO DOS REFERIDOS AGONISTAS".
A presente invenção refere-se a agonistas seletivos peptídicosdo receptor de VPAC2.
Em particular, a presente invenção se refere a agonistas seletivos peptídicos do receptor de VPAC2 os quais são covalentemente presos auma ou mais moléculas de polietileno glicol ou um derivado do mesmo.
Diabetes do tipo 2 ou diabetes mellitus não dependentes de in-sulina (NIDDM) é a forma mais comum de diabetes, afetando 90% das pes-soas com diabetes. Com NIDDM, os pacientes têm uma função deficiente decélulas β, resultando em produção insuficiente de insulina e/ou sensibilidadediminuída à insulina. Se NIDDM não é controlado, glicose em excesso seacumula no sangue, resultando em hiperglicemia. Ao longo do tempo, com-plicações mais graves podem surgir, incluindo disfunção renal, problemascardiovasculares, perda visual, ulceração de membros inferiores, neuropatiae isquemia. Tratamentos para NIDDM incluem uma melhora da dieta, exer-cício e controle de peso, bem como o uso de uma variedade de medicamen-tos orais. Indivíduos com NIDDM podem inicialmente controlar seus níveisde glicose no sangue tomando tais medicamentos orais. Esses medicamen-tos, contudo, não diminuem a perda progressiva de função de células β queocorre em pacientes com NIDDM e, assim, não são suficientes para contro-lar o nível de glicose no sangue nos estágios posteriores da doença. Tam-bém, tratamento com os medicamentos atualmente disponíveis expõe ospacientes com NIDDM a efeitos colaterais potenciais, tais como hipoglicemi-a, problemas gastrointestinais, retenção de fluído, edema e/ou ganho de pe-so.
O peptídeo de ativação de adenilato ciclase da pituitária (PA-CAP) e o peptídeo intestinal vasoativo (VIP) pertencem à mesma família depeptídeos que a secretina e glucagon. O PACAP e o VIP funcionam atravésde três receptores de proteína G-acoplados que exercem sua ação atravésdas vias de transdução de sinal cAMP-mediada e outras Ca2+-mediadas.Esses receptores são conhecidos como receptor PACA P-p refere η cia I do tipo1 (PAC1) (Isobe et al., Regul. Pept., 110: 213-217 (2003); Ogi et al., Bio-chem. Biophys. Res. Commun., 196: 1511-1521 (1993)) e os dois receptoresVlP-compartilhados do tipo 2 (VPAC1 e VPAC2) (Sherwood et al., Endocr.Rev., 21: 619-670 (2000); Hammar et al., Pharmacol Rev, 50: 265-270(1998); Couvineau et al., J. Biol. Chem., 278: 24759-24766 (2003); Sreedha-ran et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 193: 546-553 (1993); Lutz etal., FEBS Lett., 458: 197-203 (1999); Adamou et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 209: 385-392 (1995)). Uma série de análogos de PACAP é divul-gada na US 6.242.563 e WO 2000/05260.
PACAP tem atividades comparáveis a todos os três receptores,enquanto que o VIP ativa seletivamente os dois receptores de VPAC (Tsut-sumi et al., Diabetes, 51: 1453-1460 (2002)). Foi mostrado que o VIP (Eriks-son et al., Peptides, 10: 481-484 (1989)) e o PACAP (Filipsson et al., JCEM,82: 3093-3098 (1997)) não apenas estimulam a secreção de insulina no ho-mem quando fornecidos intravenosamente, mas também aumentam a se-creção de glucagon e a produção de glicose hepática. Como uma conse-qüência, estimulação com PACAP ou VIP geralmente não resulta em umamelhora líquida da glicemia. Ativação de múltiplos receptores pelo PACAPou VIP também tem amplos efeitos fisiológicos sobre os sistemas nervoso,endócrino, cardiovascular, reprodutivo, muscular e imune (Gozes et al., Curr.Med. Chem., 6:1019-1034 (1999)). Parece que diarréia aquosa VlP-induzidaem ratos é mediada por apenas um dos receptores de VPAC, VPAC1 (Ito etal., Peptides, 22: 1139-1151 (2001); Tsutsumi etal., Diabetes, 51: 1453-1460(2002)). Os receptores de VPAC1 e PAC1 são expressos sobre células α ehepatócitos e, assim, mais provavelmente, estão envolvidas nos efeitos so-bre a produção de glicose hepática.
A exendina-4 é encontrada nas excreções salivares do GilaMonster, Heloderma Suspectum, (Eng et al., J.Biol.Chem., 267(11): 7402-7405 (1992)). Ele é um peptídeo de 39 aminoácidos, o qual tem atividadesecretagoga de insulina dependente de glicose. Peptideos agonistas de E-xendina e Exendina PEGuiIado são descritos no WO 2000/66629.Estudos recentes mostraram que peptídeos seletivos para o re-ceptor de VPAC2 são capazes de estimular a secreção de insulina a partirdo pâncreas sem efeitos colaterais gastrointestinais (GI) e sem intensificar aliberação de glucagon e a produção de glicose hepática (Tsutsumi et al., Di-abetes, 51: 1453-1460 (2002)). Peptídeos seletivos para um receptor deVPAC2 foram inicialmente identificados através de modificação do VIP e/ouPACAP. (Veja, por exemplo, Xia et al., J Pharmacol Exp Ther., 281: 629-633(1997); Tsutsumi et al., Diabetes, 51: 1453-1460 (2002); WO 01/23420 e WO2004/06839).
Muitos dos agonistas peptídicos do receptor de VPAC2 reporta-dos até o momento têm, contudo, menos do que a potência, seletividade eperfis de estabilidade desejáveis, o que impediria sua viabilidade clínica. A-lém disso, muitos desses peptídeos não são adequados para candidatoscomerciais como um resultado de questões de estabilidade associado aospolipeptídeos em formulação, bem como questões com a meia-vida curtadesses polipeptídeos in vivo. Além disso, foi identificada que alguns agonis-tas peptídicos do receptor de VPAC2 são inativados pela dipeptidil-peptidase(DPP-IV). Uma meia-vida curta no soro poderia impedir o uso desses ago-nistas como agentes terapêuticos. Portanto, há uma necessidade por novasterapias, as quais superam os problemas associados aos medicamentosatuais para NIDDM.
A presente invenção busca proporcionar compostos aperfeiçoa-dos que são seletivos para o receptor de VPAC2 e os quais induzem à se-creção de insulina a partir do pâncreas apenas na presença de altos níveisde glicose no sangue. Os compostos da presente invenção são peptídeos,os quais acredita-se que também melhorem a função de células beta. Essespeptídeos podem ter o efeito fisiológico de induzir a secreção de insulinasem efeitos colaterais no GI ou um aumento correspondente na produção deglicose hepática e, também, em geral, têm seletividade, potência e/ou estabi-lidade intensificadas in vivo do peptídeo comparado com agonistas peptídi-cos do receptor de VPAC2 conhecidos.
A presente invenção também busca proporcionar agonistas pep-tídicos seletivos do receptor de VPAC2, os quais têm eliminação reduzida eestabilidade in vivo aperfeiçoada. É desejável que os agonistas da presenteinvenção sejam administrados um número mínimo de vezes durante um pe-ríodo prolongado de tempo.
De acordo com o primeiro aspecto da invenção, é proporcionadoum agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 compreendendouma seqüência selecionada de:SEQ ID NO: 17
HSDAVFTEQY(OMe)TRAibRAibQLAAAibOrnY(OMe)LQSIKAibOrn;SEQ ID NO: 18
HSDAVFTEK(CO(CH2)2SH)Y(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrn YLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 19
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrn YLQSIOrnK(W)Orn;SEQ ID NO: 20
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(CO(CH2)2SH)YLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 21
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAK(CO(CH2)2SH)OrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 22
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVCAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 23
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRCQVAAAibOrn YLQSIOrnOrn;
SEQ ID NO: 24HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 25
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrn YAibQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 26
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrn YLQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 27
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAbuAibOrnYLQAiblOrnOrn;SEQ ID NO: 28
HsDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 29HsDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYAibQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 30
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrn YAibQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 31
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOmYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 32
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrn YAibQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 33
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrn YAibQSIOrnOrn; SEQ ID NO: 34
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(W)QVAAAibOrn'YLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 35
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrn YLK(W)SIOrnOrn;SEQ ID NO: 36
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(W)AAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 37
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(CO(CH2)2SH)QVAAAibOrn YLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 38
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(W)YLQSIOrnOrn; SEQ ID NO: 39
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibCYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 40
HSDAVFTEQY(OMe)T0rnLRAibQLAAbuAib0rnYLQAibl0m0rn;SEQ ID NO: 41
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSK(W)OrnOrn;SEQ ID NO: 42
HSDAVFTEQY(OMe)T0rnLRAibQLAAbuAib0mYLQAibl0rnC0m;SEQ ID NO: 43
HSDA VFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibCOrnOrn; SEQ ID NO: 44
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnYLQAiblOrnOrn;SEQ ID NO: 45HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRCQLAAbuAibOrn YLQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 94
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVK(CO(CH2)2SH)AAibOmYLQSIOmOm;SEQ ID NO: 95
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnCOrn;SEQ ID NO: 96
HSDA VFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrn YLQSCOrnOrn;SEQ ID NO: 97
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnK(CO(CH2)2SH)Orn;SEQ ID NO: 98
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrn YLQSIOrnK(CO(CH2)2SH)Orn;SEQ ID NO: 99
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(W)QLAAbuAibOrnYLQAiblOrnOrn;SEQ ID NO: 100
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrn YLQSIOrnOrnC;SEQ ID NO: 101
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrn YLQSIOrnOrnC;SEQ ID NO: 102
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrn YLQSIOrnOrnC;SEQ ID NO: 103
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrn Y(OMe)LQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 104
HSDA VFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrn Y(OMe)LQAibIOrnCOrn;SEQ ID NO: 105
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrn Y(OMe)LQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 106
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAiblOrnOrnC;SEQ ID NO: 107
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 108HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrn Y(OMe)LQSIOmOrn;SEQ ID NO: 109
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrn Y(OMe)LQSIOrnCOrn;SEQ ID NO: 110
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAbuAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 111
HSDAVF-
TEQY(OMe)TornLRAibQK(CO(CH2)2SH)AAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn;e
SEQ ID NO: 112
HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(W)AAbuAibOrnYLQAiblOrnOrn;e uma extensão C-terminal, em que o N-término da extensão C-terminal éligado ao C-término da seqüência peptídica e em que a extensão C-terminalcompreende a seqüência de aminoácido da fórmula:
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12
Fórmula 3 (SEQ ID NO: 3)
em que:
Xaai é: Gly, Cys ou está ausente;Xaa2 é: Gly, Arg ou está ausente;Xaa3 é: Pro, Thr ou está ausente;Xaa4 é: Ser ou está ausente;Xaa5 é: Ser ou está ausente;Xaa6 é: Gly ou está ausente;Xaa7 é: Ala ou está ausente;Xaa8 é: Pro ou está ausente;Xaag é: Pro ou está ausente;Xaa10 é: Pro ou está ausente;Xaa11 é: Ser, Cys ou está ausente; eXaa12 é: Cys ou está ausente;
em que pelo menos cinco de Xaa1 a Xaa12 da extensão C-terminal estãopresentes e
em que se Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, ouXaan está ausente, o proximo aminoácido presente a jusante é o proximoaminoácido na extensão C-terminal e em que o aminoácido C-terminal podeser amidado,e em que;
o agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Cys o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG, ou
o agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Lys o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG, ou
o agonista peptídico compreende pelo menos um K(W) o qual é covalente-mente ligado a uma molécula de PEG, ou
o agonista peptídico compreende pelo menos um K(CO(CH2)2SH) o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG, ou
o aminoácido carbóxi-terminal do agonista peptídico é covalentemente ligadoa uma molécula de PEG, ouuma combinação dos mesmos.
De preferência, pelo menos seis de Xaai a Xaai2 da extensão C-terminal de Fórmula 3 está presente. Mais preferivelmente, pelo menos sete,oito, nove, dez, onze ou todos de Xaa1 a Xaa-I2 da extensão C-terminal estãopresentes.
Mais preferivelmente, a extensão C-terminal do agonista peptídi-
<table>table see original document page 9</column></row><table>
Ainda mais preferivelmente, a extensão C-terminal do agonistapeptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 é SEQ ID NO: 11 ou SEQ IDNO: 12.(Uma) molécula(s) de PEG pode(m) ser covalentemente Iiga-da(s) a qualquer resíduos de Lys1 Cys1 K(W) ou K(CO(CH2)2SH) em qual-quer posição no agonista peptidico do receptor de VPAC2 de acordo com oprimeiro aspecto da presente invenção. Onde o agonista peptidico PEGuiIado do receptor de VPAC2compreende uma seqüência selecionada de SEQ ID NO: 22, 23, 39, 42, 43,44, 45, 95, 96, 100, 101, 102, 104, 105, 106, 108 e 109, é preferido que oresíduo de cisteína seja PEGuilado.
Onde o agonista peptidico PEGuilado do receptor de VPAC2 compreende uma seqüência selecionada de SEQ ID NO: 19, 34, 35, 36, 38,41, 99 e 112, é preferido que o resíduo de K(W) seja PEGuilado.
Onde o agonista peptidico PEGuilado do receptor de VPAC2compreende uma seqüência selecionada de SEQ ID NO: 18, 20, 21, 37, 94,97, 98 e 111, é preferido que o resíduo de K(CO(CH2)2SH) seja PEGuilado. Onde o agonista peptidico PEGuilado do receptor de VPAC2compreende uma extensão C-terminal, a(s) molécula(s) de PEG pode(m) sercovalentemente ligada(s) a um ou mais resíduos de Cys na referida exten-são C-terminal. Onde a seqüência selecionada de SEQ ID NO: 17 a 45 e 94a 112 compreende um ou mais resíduos de Lys, Cys, K(W) ou K(CO(CH2)2SH) e a extensão C-terminal compreende um ou mais resíduosde Cys, pode haver um ou mais Resíduos PEGuiIados em uma ou ambas asseqüências.
De preferência, há pelo menos uma molécula de PEG covalen-temente ligada a um resíduo na extensão C-terminal do agonista peptidico do receptor de VPAC2.
Onde há mais de uma molécula de PEG, pode haver uma com-binação de Lys, Cys, K(CO(CH2)2SH), K(W) e PEGuilação de aminoácidocarbóxi-terminal. Por exemplo, se existem duas moléculas de PEG, uma po-de ser presa a um resíduo de Lys e uma pode ser presa a um resíduo de Cys.
De preferência, a molécula de PEG é ramificada. Alternativa-mente, a molécula de PEG pode ser linear.De preferência, a molécula de PEG tem entre 1.000 daltons e100.000 daltons de peso molecular. Mais preferivelmente, a molécula dePEG é selecionada de 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000 e 60.000 dal-tons. Ainda mais preferivelmente, ela é selecionada de 20.000, 30.000,40.000 ou 60.000 daltons. Onde existem duas moléculas de PEG covalen-temente ligadas ao agonista peptídico da presente invenção, cada uma tem1.000 a 40,000 daltons e, de preferência, elas têm pesos moleculares de20.000 e 20.000 daltons, 10.000 e 30.000 daltons, 30.000 e 30.000 daltonsou 20.000 e 40.000 daltons.
A seqüência do agonista peptídico PEGuilado do receptor deVPAC2 pode ainda compreender um resíduo de histidina no N-término dopeptídeo antes de Xaa-i.
De preferência, o agonista peptídico PEGuilado do receptor deVPAC2 de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção ainda com-preende uma modificação N-terminal no N-término do agonista peptídico, emque a modificação N-terminal é selecionada de:
(a) adição de D-histidina, isoleucina, metionina ou norleucina;
(b) adição de um peptídeo compreendendo a seqüência Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg (SEQ ID NO: 93) em que a Arg é ligada ao N-término do agonista peptídico;
(c) adição de C1-C16 alquila opcionalmente substituída por um oumais substituintes independentemente selecionados de arila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3;
(d) adição de -C(O)R1 em que R1 é uma C1-C16 alquila opcio-nalmente substituída por um ou mais substituintes independentemente sele-cionados de arila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio, -SH e -CF3; uma arilaopcionalmente substituída por um ou mais substituintes independentementeselecionados de C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi,-NH2, -OH, halogênio e -CF3; uma aril C1-C4 alquila opcionalmente substituí-da por um ou mais substituintes independentemente selecionados de C1-C6alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e-CF3, -NR2R3 em que R2 e R3 são, independentemente, hidrogênio, C1-C6alquila, arila ou arila C1-C4 alquila; -OR4 em que R4 é C1-C16 alquila opcio-nalmente substituída por um ou mais substituintes independentemente sele-cionados de arila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH1 halogênio e -CF3, arila opcional-mente substituída por um ou mais substituintes independentemente selecio-nados de C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-Ce alquinila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH1 halogênio e -CF3 ou arila C1-C4 alquila opcionalmente substituída porum ou mais substituintes independentemente selecionados de C1-C6 alquila,C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, Ci-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3;ou 5-pirrolidin-2-ona;
(e) adição de -SO2R5 em que R5 é arila, aril CrC4 alquila ou C1-C16 alquila;
(f) formação de um grupo succinimida opcionalmente substituídopor C1-C6 alquila ou -SR6, em que R6 é hidrogênio ou C1-C6 alquila;
(g) adição de sulfoxido de metionina;
(h) adição de ácido biotinil-6-amino-hexanoico (ácido 6-aminocaproico); e
(i) adição de -C(=NH)-NH2.
De preferência, a modificação N-terminal é a adição de um gru-po selecionado de: acetila, propionila, butirila, pentanoíla, hexanoíla, metio-nina, sulfoxido de metionina, 3-fenilpropionila, fenilacetila, benzoíla, norleuci-na, D-histidina, isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinil-6-amino-hexanoico (ácido 6-aminocaproico) e -C(=NH)-NH2. É especialmente prefe-rido que a modificação N-terminal seja a adição de acetila ou hexanoíla.
Será apreciado por aqueles versados na técnica que agonistaspeptídicos PEGuiIados do receptor de VPAC2 compreendendo vários com-binações de seqüências peptídicas selecionadas de SEQ ID NO: 17 a 45 e94 a 112, extensões C-terminais e modificações N-terminais conforme des-crito aqui, podem ser feitas baseado na divulgação acima.
É preferido que o agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção compreen-da uma seqüência de aminoácido selecionada de:<table>table see original document page 13</column></row><table><table>table see original document page 14</column></row><table><table>table see original document page 15</column></row><table><table>table see original document page 16</column></row><table><table>table see original document page 17</column></row><table>
É mais preferido que o agonista peptídico PEGuiIado do receptorde VPAC2 de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção compre-enda uma seqüência de aminoácido selecionada de: SEQ ID NO: 47, 64, 66,115, 119, 122, 126, 130 e 144.
De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, éproporcionado um agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada de:
<table>table see original document page 17</column></row><table><table>table see original document page 18</column></row><table>
É mais preferido que o agonista peptídico PEGuiIado do receptorde VPAC2 de acordo com o segundo aspecto da presente invenção com-preenda a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 83.De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é proporcionadoum agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 compreendendouma seqüência de aminoácido da Fórmula:
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Thr-Xaae-Xaa9-Xaaio-Thr-Xaa12-Xaa13- Xa-a 14-Xa a 15-Xa a-ι 6-Xa a 17- Xaa 18 -Abu-Xaa20-Xaa2I-Xaa22- Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa3i-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa4o
Fórmula 4 (SEQ ID NO: 4)
em que:
Xaai é: His1 dH ou está ausente;Xaa2 é: dA, Ser, Vai, Gly, Thr1 Leu, dS, Pro ou Aib;Xaa3 é: Asp ou Glu;
Xaa4 é: Ala, lie, Tyr, Phe, Vai, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib ou NMeA;Xaa5 é: Vai, Leu, Phe, He, Thr, Trp, Tyr1 dV, Aib ou NMeV;Xaa6 é: Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp ou Tyr;Xaa8 é: Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg ou Tyr;
Xaa9 é: Asn, Gln, Asp, Glu, Ser, Cys, Lys ou K(CO(CH2)2SH);Xaaio é: Tyr, Trp, Tyr(OMe), Ser, Cys ou Lys;
Xaai2 é: Arg1 Lys, Glu, hR, Orn, Lys (isopropila), Aib, Cit, Ala, Leu, Gln, Phe,Ser ou Cys;
Xaa13 é: Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys, Lys ou K(CO(CH2)2SH);
Xaa14 é: Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Lys (isopropila), Phe, Gln, Aib, Cit, Serou Cys;
Xaa15 é: Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, hR, Orn, Lys (isopropila), Phe, Gln, Aib,K(Ac), Cit, Ser, Cys, K(W) ou K(CO(CH2)2SH);Xaa 16 é: Gln, Lys, Glu, Ala, hR, Orn, Lys (isopropila), Cit, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);
Xaa17 é: Vai, Ala, Leu, lie, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH) ouK(W);
Xaa18 é: Ala, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), K(W), Abu ou Nle;Xaa2O é: Lys, Gln, hR, Arg, Ser, His, Orn, Lys (isopropila), Ala, Aib, Trp, Thr,Leu, lie, Phe, Tyr, Vai, K(Ac), Cit, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa21 é: Lys, His, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), Cit, Ser, Cys,Val, Tyr, lle, Thr, Trp, K(W) ou K(CO(CH2)2SH);
Xaa22 é: Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, lle, Vai, Tyr(OMe), Ala, Aib, Ser, Cys, Lys,K(W) ou K(CO(CH2)2SH);
Xaa23 é: Leu, Phe, lle, Ala, Trp, Thr, Vai, Aib, Ser, Cys, Lys, K(W) ouK(CO(CH2)2SH);
Xaa24 é: Gln, Glu, Asn, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH) ou K(W);
Xaa25 é: Ser, Asp, Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib, Glu, Cys,Lys, K(CO(CH2)2SH) ou K(W);
Xaa26 é: lie, Leu, Thr, Val1 Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH)ou K(W);
Xaa27 é: Lys, hR, Arg, Gln, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lle, Met, Asn, Pro,Ser, Thr, Vai, Trp, Tyr, Lys (isopropila), Cys, Leu, Orn, dK, K(W) ouK(CO(CH2)2SH);
Xaa28 é: Asn, Asp, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dK, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);
Xaa29 é: Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lle, Leu, Met,Pro, Gln, Thr, Vai, Trp, Tyr, Cys, Orn, Cit, Aib, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou estáausente;
Xaa3O é: Arg, Lys, lle, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln,Ser, Thr, Vai, Trp, Tyr, Cys, hR, Cit, Aib, Orn, K(W)1 K(CO(CH2)2SH) ou estáausente;
Xaa31 é: Tyr, His, Phe, Thr, Cys, Ser, Lys, Gln, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou es-tá ausente;
Xaa32 é: Ser, Cys, Lys ou está ausente;
Xaa33 é: Trp ou está ausente;
Xaa34 é: Cys ou está ausente;
Xaa35 é: Glu ou está ausente;
Xaa36 é: Pro ou está ausente;
Xaa37 é: Gly ou está ausente;
Xaa38 é: Trp ou está ausente;
Xaa39 é: Cys ou está ausente; e
Xaa40 é: Arg ou está ausenteem que se Xaa29, Xaa30, Xaa31, Xaa32, Xaa33, Xaa34, Xaa35, Xaa36, Xaa37,Xaa38 ou Xaa39 está ausente, o proximo aminoácido presente a jusante é oproximo aminoácido na seqüência do agonista peptídicoe uma extensão C-terminal em que o N-término da extensão C-terminal éligado ao C-término do peptídeo de Fórmula 4 e em que a extensão C-terminal compreende uma seqüência de aminoácido da Fórmula:Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12
Fórmula 3 (SEQ ID NO: 3)
em que:
Xaa1 é: Gly, Cys ou está ausente;Xaa2 é: Gly, Arg ou está ausente;Xaa3 é: Pro1 Thr ou está ausente;Xaa4 é: Ser ou está ausente;Xaa5 é: Ser ou está ausente;Xaa6 é: Gly ou está ausente;Xaa7 é: Ala ou está ausente;Xaa8 é: Pro ou está ausente;Xaa9 é: Pro ou está ausente;Xaa10 é: Pro ou está ausente;Xaa11 é: Ser, Cys ou está ausente; eXaa12 é: Cys ou está ausente;
em que pelo menos cinco de Xaa1 a Xaa12 da extensão C-terminal estãopresentes e em que se Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xa-a9, Xaa10 ou Xaa11 está ausente, o proximo aminoácido presente a jusante éo proximo aminoácido na extensão C-terminal e em que o aminoácido C-terminal pode ser amidado,e em que;
o agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Cys o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ou
o agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Lys o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ou
o agonista peptídico compreende pelo menos um K(W) o qual é covalente-mente ligado a uma molécula de PEG ou
o agonista peptídico compreende pelo menos um K(CO(CH2)2SH) o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ou
o aminoácido carbóxi-terminal do agonista peptídico é covalentemente ligadoa uma molécula de PEG ouuma combinação dos mesmos.
De preferência, o agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 de terceiro aspecto da presente invenção compreende uma seqüên-cia da Fórmula 4 (SEQ ID NO: 4) em que Xaa3 é Asp ou Glu1 Xaas é Asp ouGlu1 Xaag é Asn ou Gln, Xaaio é Tyr ou Tyr(OMe)1 Xaa-12 é Arg1 hR, Lys ouOrn1 Xaa™ é Arg, Gln1 Aib1 hR, Orn1 Cit, Lys, Ala ou Leu, Xaai5 é Lys, Aib1Orn ou Arg, Xaa-16 é Gln ou Lys, Xaai7 é Vai, Leu, Ala, lie, Lys ou Nle, Xaa2Oé Lys, Vai, Leu, Aib, Ala, Gln ou Arg, Xaa2I é Lys, Aib, Orn, Ala, Gln ou Arg,Xaa23 é Leu ou Aib, Xaa25 é Ser ou Aib, Xaa27 é Lys, Orn, hR ou Arg, Xaa2S éAsn1 Gln, Lys, hR, Aib, Orn ou Pro e Xaa2g é Lys, Orn, hR ou está ausente.
De preferência, o agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 de terceiro aspecto da presente invenção compreende uma seqüên-cia da Fórmula 4 (SEQ ID NO: 4), em que Xaa23 ou Xaa25 é Aib. Ainda maispreferivelmente, Xaa23 e Xaa25 são ambos Aib.
De preferência, o agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 de terceiro aspecto da presente invenção compreende uma seqüên-cia da Fórmula 4 em que Xaa-14 ou Xaai5 é Aib.
Alternativamente, o agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 de terceiro aspecto da presente invenção compreende uma sequên-cia da Fórmula 4 em que Xaa2O ou Xaa2I é Aib.
Mais preferivelmente, Xaau ou Xaai5 é Aib e Xaa2O ou Xaa2I éAib. É especialmente preferido que Xaai5 é Aib e Xaa2O é Aib.
De preferência, o agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 de terceiro aspecto da presente invenção compreende uma sequên-cia da Fórmula 4 em que Xaai5 é Aib, Xaa2O é Aib e Xaai2, Xaa21, Xaa27 eXaa2S são todos Orn. Mais preferivelmente, Xaai5 é Aib, Xaa20 é Aib, Xaai2,Xaa2i, Xaa27 e Xaa2S são todos Orn1 Xaas β Glu1 Xaag é Gln e Xaaio é T-yr(OMe). Ainda mais preferivelmente, Xaa15 é Aib, Xaa2o é Aib, Xaa-12, Xaa21,Xaa27 e Xaa2S são todos Orn, Xaa8 é Glu, Xaa9 é Gln, Xaa-10 é Tyr(OMe) eXaa23 e/ou Xaa25 é Aib. qualquer um ou mais de Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa12,Xaa15, Xaa20, Xaa21, Xaa23, Xaa25, Xaa27 e Xaa28 pode ser um Lys, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W) PEGuiIado1 enquanto que todas as outras posiçõestêm as substituições de aminoácido preferidas conforme descrito.
De preferência, pelo menos seis de Xaa1 a Xaa12 da extensão C-terminal de Fórmula 3 está presente. Mais preferivelmente, sete, oito, nove,dez, onze ou todos de Xaai a Xaai2 da extensão C-terminal estão presentes.
De preferência, a extensão C-terminal do agonista peptídicoPEGuiIado do receptor de VPAC2 de acordo com o terceiro aspecto da pre-sente invenção é selecionado de: SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12.
Mais preferivelmente, a extensão C-terminal do agonista peptídi-co PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acordo com o terceiro aspecto dapresente invenção é SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
(Uma) molécula(s) de PEG pode(m) ser covalentemente Iiga-da(s) a qualquer resíduo de Lys, Cys, K(W) ou K(CO(CH2)2SH) em qualquerposição no agonista peptídico do receptor de VPAC2 de acordo com o ter-ceiro aspecto da presente invenção. A extensão C-terminal pode compreen-der um ou mais resíduos de Cys os quais podem ser PEGuilados. Onde aseqüência de acordo com a Fórmula 4 compreende um ou mais resíduos deLys, Cys, K(W) ou K(CO(CH2)2SH) e a extensão C-terminal compreende umou mais resíduos de Cys1 podendo haver um ou mais resíduos PEGuiladosem uma ou ambas as seqüências.
De preferência, há pelo menos uma molécula de PEG covalen-temente ligada a um resíduo na Fórmula 4. Mais preferivelmente, há umamolécula de PEG covalentemente ligada a um resíduo em uma ou mais dasseguintes posições da Fórmula 4: 9, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 24, 25, 26 e28.
De preferência, há pelo menos uma molécula de PEG covalen-temente ligada a um resíduo na extensão C-terminal do agonista peptídicodo receptor de VPAC2.Onde há mais de uma molécula de PEG1 pode haver uma com-binação de Lys1 Cys1 K(CO(CH2)2SH)1 K(W) e PEGuilação de aminoácidocarbóxi-terminal. Por exemplo, se existem duas moléculas de PEG1 uma po-de ser presa a um resíduo de Lys e uma pode ser presa a um resíduo deCys.
De preferência, a molécula de PEG é ramificada. Alternativa-mente, a molécula de PEG pode ser linear.
De preferência, a molécula de PEG tem entre 1.000 daltons e100.000 daltons de peso molecular. Mais preferivelmente, a molécula dePEG é selecionada de 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000 e 60.000 dal-tons. Ainda mais preferivelmente, ela é selecionada de 20.000, 30.000,40.000 ou 60.000 daltons. Onde existem duas moléculas de PEG covalen-temente ligadas ao agonista peptídico da presente invenção, cada uma tem1.000 a 40.000 daltons e, de preferência, elas têm pesos moleculares de20.000 e 20.000 daltons, 10.000 e 30.000 daltons, 30.000 e 30.000 daltonsou 20.000 e 40.000 daltons.
De preferência, o agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 do terceiro aspecto da presente invenção ainda compreende umamodificação N-terminal no N-término do agonista peptídico, em que a modifi-cação N-terminal é selecionada de:
(a) adição de D-histidina, isoleucina, metionina ou norleucina;
(b) adição de um peptídeo compreendendo a seqüência Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg (SEQ ID NO: 93) em que a Arg é ligada ao N-término do agonista peptídico;
(c) adição de CrCi6 alquila opcionalmente substituída por um oumais substituintes independentemente selecionados de arila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3;
(d) adição de -C(O)R1 em que R1 é a CrCi6 alquila opcional-mente substituída por um ou mais substituintes independentemente selecio-nados de arila, CrC6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio, -SH e -CF3; uma arila op-cionalmente substituída por um ou mais substituintes independentementeselecionados de Ci-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, CrC6 alcóxi,-NH2, -OH1 halogênio e -CF3; e aril C1-C4 alquila opcionalmente substituídapor um ou mais substituintes independentemente selecionados de C1-C 6alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, Ci-C6 alcóxi, -NH2, -OH1 halogênio e-CF3; -NR2R3 em que R2 e R3 são, independentemente, hidrogênio, C1-C6alquila, arila ou aril C1-C4 alquila; -OR4 em que R4 é C1-C16 alquila opcional-mente substituída por um ou mais substituintes independentemente selecio-nados de arila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH1 halogênio e -CF3, arila opcionalmen-te substituída por um ou mais substituintes independentemente selecionadosde C1-C 6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH,halogênio e -CF3 ou aril C1-C4 alquila opcionalmente substituída por um oumais substituintes independentemente selecionados de C1-C 6 alquila, C2-C6alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3; ou 5-pirrolidin-2-ona;
(e) adição de -SO2R5 em que R5 é arila, aril C1-C4 alquila ou C1-C16 alquila;
(f) formação de um grupo succinimida opcionalmente substituídopor C1-C 6 alquila ou -SR6, em que R6 é hidrogênio ou C1-C 6 alquila;
(g) adição de sulfoxido de metionina;
(h) adição de ácido biotinil-6-amino-hexanoico (ácido 6-aminocaproico); e
(i) adição de -C(=NH)-NH2.
De preferência, a modificação N-terminal é a adição de um gru-po selecionado de: acetila, propionila, butirila, pentanoíla, hexanoíla, metio-nina, sulfoxido de metionina, 3-fenilpropionila, fenilacetila, benzoíla, norleuci-na, D-histidina, isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinil-6-amino-hexanoico (ácido 6-aminocaproico) e -C(=NH)-NH2. É especialmente prefe-rido que a modificação N-terminal seja a adição de acetila ou hexanoíla.
Será apreciado por aqueles versados na técnica que agonistaspeptídicos PEGuiIados do receptor de VPAC2 compreendendo várias com-binações de seqüência peptídica de acordo com a Fórmula 4, extensões C-terminais e modificações N-terminais conforme descrito aqui, podem ser fei-tas baseado na divulgação acima.É preferido que o agonista peptídico PEGuilado do receptor deVPAC2 de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção compreendauma seqüência de aminoácido selecionada de: SEQ ID NO: 59, 62, 64, 65,66, 71, 72, 73, 74, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 123, 124, 125, 126, 127,128, 129, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 141, 144, 146 e 148.
De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é pro-porcionado uma composição farmacêutica compreendendo um agonistapeptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 da presente invenção e um oumais diluentes, veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
De acordo com o quinto aspecto da presente invenção, é pro-porcionado um agonista peptídico PEGuilado do receptor de VPAC2 da pre-sente invenção para uso como um medicamento.
De acordo com o sexto aspecto da presente invenção, é propor-cionado o uso de um agonista peptídico PEGuilado do receptor de VPAC2da presente invenção para a fabricação de um medicamento para o trata-mento de diabetes não dependente de insulina.
De acordo com ainda um outro aspecto da presente invenção, éproporcionado o uso de um agonista peptídico PEGuilado do receptor deVPAC2 da presente invenção para a fabricação de um medicamento para otratamento de diabetes dependente de insulina.
A presente invenção proporciona um método de tratamento dediabetes em um paciente que precisa do mesmo compreendendo adminis-tração de um agonista peptídico PEGuilado do receptor de VPAC2 da pre-sente invenção, em que o diabetes pode ser diabetes não dependentes deinsulina ou pode ser diabetes dependente de insulina.
A presente invenção ainda proporciona uma composição farma-cêutica contendo um agonista peptídico PEGuilado do receptor de VPAC2da presente invenção para o tratamento de diabetes não dependentes deinsulina ou diabetes dependente de insulina.
De acordo com uma modalidade alternativa da presente inven-ção, é proporcionado um agonista peptídico PEGuilado do receptor deVPAC2 compreendendo uma seqüência selecionada de SEQ ID NO: 17 a 45e uma extensão C-terminal em que o N-término da extensão C-terminal éligada ao C-término da seqüência peptídica e em que a extensão C-terminalcompreende uma seqüência de aminoácido da Fórmula:XaarXaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaaio-Xaaii-Xaai2-Xaai3Fórmula 1 (SEQ ID NO: 1)em que:
Xaai é: Gly1 Cys1 Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa2 é: Gly, Arg1 Cys1 Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa3 é: Pro, Thr, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa4 é: Ser, Pro, His, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa5 é: Ser, Arg, Thr, Trp1 Lys, Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa6 é: Gly, Ser, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa7 é: Ala, Asp, Arg, Glu1 Lys, Gly, Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está au-sente;
Xaa8 é: Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa9 é: Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa10 é: Pro, Ser, Ala, Arg, Lys, His, Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está au-sente;
Xaa11 é: Ser, Cys, His, Pro, Lys, Arg, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa12 é: His, Ser, Arg, Lys, Cys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente; eXaa13 é: His, Ser, Arg, Lys, Cys, K(W)1 K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;contanto que, se Xaa1l Xaa2, Xaa3, Xaa4l Xaa5l Xaa6, Xaa7, Xaae, Xaag, Xa-a10, Xaa11 ou Xaa12 estiver ausente, o proximo aminoácido presente a jusan-te seja o proximo aminoácido na extensão C-terminal e em que o aminoáci-do C-terminal pode ser amidado,e em que;
o agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Cys o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ouo agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Lys o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ou
o agonista peptídico compreende pelo menos um K(W) o qual é covalente-mente ligado a uma molécula de PEG ou
o agonista peptídico compreende pelo menos um K(CO(CH2)2SH) o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ou
o aminoácido carbóxi-terminal do agonista peptídico é covalentemente ligadoa uma molécula de PEG ouuma combinação dos mesmos.
É preferível que a extensão C-terminal de Fórmula 1 tenha nãomais de três de qualquer um dos seguintes; Cys1 Lys1 K(W) ouK(CO(CH2)2SH). É mais preferível que a extensão C-terminal tenha não maisde dois de qualquer um desses resíduos. Se existem dois resíduos de Cysna extensão C-terminal, é preferido que os resíduos de Cys estejam no C-térmiN0 É ainda mais preferível que a extensão C-terminal tenha não maisde um de qualquer um desses resíduos. Se há apenas um resíduo de Cysna extensão C-terminal, é preferido que o resíduo de Cys esteja no C-térmiN0
De preferência, a extensão C-terminal do agonista peptídicoPEGuiIado do receptor de VPAC2 de acordo com a modalidade alternativaacima compreenda uma seqüência de aminoácido da Fórmula:Xaa1-Xaa2-Xaas-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13Fórmula 2 (SEQ ID NO: 2)
em que:
Xaa-i é: Gly1 Cys1 Lys ou está ausente;Xaa2 é: Gly, Arg, Cys, Lys ou está ausente;Xaa3 é: Pro, Thr, Ser, Ala, Cys, Lys ou está ausente;Xaa4 é: Ser, Pro, His, Cys, Lys ou está ausente;
Xaa5 é: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, Cys ou está ausente;Xaa6 é: Gly, Ser, Cys, Lys ou está ausente;Xaa7 é: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, Cys ou está ausente;Xaas é: Pro, Ser, Ala, Cys, Lys ou está ausente;Xaa9 é: Pro, Ser, Ala, Cys, Lys ou está ausente;
Xaa10 é: Pro, Ser, Ala, Arg, Lys, His, Cys ou está ausente;Xaan11 é: Ser, Cys, His, Pro, Lys, Arg ou está ausente;Xaa12 é: His, Ser, Arg1 Lys1 Cys ou está ausente; eXaa13 é: His1 Ser, Arg, Lys1 Cys ou está ausente;contanto que, se Xaa-ι, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaae, Xaa9, Xa-a-io, Xaa-ι ι ou Xaa12 estiver ausente, o proximo aminoácido presente a jusan-te seja o proximo aminoácido na extensão C-terminal e em que o aminoáci-do C-terminal pode ser amidado.
De preferência, pelo menos um de Xaa1 a Xaa13 da extensão C-terminal de Fórmula 1 ou 2 está presente. Mais preferivelmente, pelo menosdois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou todos deXaa1 a Xaa13 da extensão C-terminal estão presentes.
Mais preferivelmente, a extensão C-terminal do agonista peptídi-co PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acordo com a modalidade alternati-va acima compreende uma seqüência de aminoácido da Fórmula:
XaarXaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaag-Xaa10-Xaa1I-Xaa12Fórmula 3 (SEQ ID NO: 3)
em que:
Xaa1 é: Gly, Cys ou está ausente;Xaa2 é: Gly, Arg ou está ausente;Xaa3 é: Pro, Thr ou está ausente;Xaa4 é: Ser ou está ausente;Xaa5 é: Ser ou está ausente;Xaa6 é: Gly ou está ausente;Xaa7 é: Ala ou está ausente;Xaa8 é: Pro ou está ausente;Xaa9 é: Pro ou está ausente;Xaa1O é: Pro ou está ausente;Xaa11 é: Ser, Cys ou está ausente; eXaa12 é: Cys ou está ausente;contanto que, se Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaae, Xaa9, Xa-a10 ou Xaa11 estiver ausente, o proximo aminoácido presente a jusante sejao proximo aminoácido na extensão C-terminal e em que o aminoácido C-terminal pode ser amidado.De preferência, pelo menos um de Xaa1 a Xaa-12 da extensão C-terminal de Fórmula 3 está presente. Mais preferivelmente, pelo menos dois,três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou todos de Xaai a Xaai2da extensão C-terminal estão presentes.
Uma extensão C-terminal alternativa, a qual pode ser usada emqualquer um dos aspectos e modalidades da presente invenção, compreen-de uma seqüência de aminoácido da Fórmula:XaarXaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaai0
Fórmula 13 (SEQ ID NO: 13)
em que:
Xaa1 é: Ser, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa2 é: Arg, Ser, hR, Orn, His, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está au-sente,
Xaa3 é: Thr, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa4 é: Ser, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;
Xaa5 é: Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa6 é: Pro, Ser, Ala, Arg, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa7 é: Pro, Ser, Ala, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa8 é: Lys, K(W), Pro, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou está ausente;Xaa9 é: K(E-C16), Ser, Cys, Lys, K(W)1 K(CO(CH2)2SH) ou está ausente; eXaa10 é: Ser, Cys, Lys, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou está ausente.
É preferido que se Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7,Xaa8OuXaa9 de Fórmula 13 estiver ausente, o proximo aminoácido a jusanteseja o proximo aminoácido na extensão C-terminal. O aminoácido C-terminalpode ser amidado.
De preferência, pelo menos um de Xaa1 a Xaa1O da extensão C-terminal de Fórmula 13 está presente. Mais preferivelmente, pelo menosdois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou todos de Xaa1 a Xaa1O daextensão C-terminal estão presentes.
Mais preferivelmente, uma extensão C-terminal alternativa, aqual pode ser usada em qualquer um dos aspectos e modalidades da pre-sente invenção, é selecionada de:<table>table see original document page 31</column></row><table>
Os agonistas peptídicos do receptor de VPAC2 da presente in-venção têm a vantagem de que eles têm seletividade, potência e/ou estabili-dade intensificadas com relação a agonistas peptídicos do receptor deVPAC2 conhecidos. Em particular, a adição da seqüência C-terminal de E-xendina-4 ou uma variante dessa seqüência C-terminal, como a seqüênciade revestimento aumentou, surpreendentemente, a seletividade pelo recep-tor de VPAC2, bem como aumentou a estabilidade proteolítica.
A fixação covalente de uma ou mais moléculas de PEG a resí-duos particulares de um agonista peptídico do receptor de VPAC2 resultaem um agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 biologicamenteativo com uma meia-vida prolongada e eliminação reduzida quando compa-rado com aquela de agonistas não-peptídicos PEGuiIados do receptor deVPAC2.
O termo "VPAC2" é usado para se refere a e, em conjunto com oreceptor particular, (Lutz et al., FEBS Lett., 458: 197-203 (1999); Adamou etal., Biochem. Biophys. Res. Commun., 209: 385-392 (1995)) que os agonis-tas da presente invenção ativam. Esse termo também é usado para se referira e em conjunto com os agonistas da presente invenção.
Um "agonista peptídico seletivo do receptor de VPAC2" ou um"agonista peptídico do receptor de VPAC2" da presente invenção é um pep-tídeo que ativa seletivamente o receptor de VPAC2 para induzir a secreçãode insulina. De preferência, a seqüência para um agonista peptídico seletivodo receptor de VPAC2 da presente invenção tem vinte e oito a quarenta a-minoácidos que ocorrem naturalmente e/ou não ocorrem naturalmente e po-de ou não, adicionalmente, compreender uma extensão C-terminal.
Um "agonista peptídico seletivo PEGuiIado do receptor deVPAC2" ou um "agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2" é umagonista peptídico seletivo do receptor de VPAC2 covalentemente ligado aum ou mais moléculas de polietileno glicol (PEG) ou um derivado do mesmo,em que cada PEG é preso a um aminoácido de cisteína ou lisina, a um K(W)ou K(CO(CH2)2SH) ou ao carbóxi término de um peptídeo.
Agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 podem ter uma extensão C-terminal. A "extensão C-terminal" dapresente invenção compreende uma seqüência tendo de um a treze amino-ácidos que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente ligadosao C-término da seqüência no N-término da extensão C-terminal via umaligação peptídica. Quaisquer resíduos de Cys, Lys, K(W) ou K(CO(CH2)2SH)na extensão C-terminal podem ser covalentemente ligados a uma moléculade PEG e/ou o aminoácido carbóxi-terminal da extensão C-terminal pode sercovalentemente ligado a uma molécula de PEG.
Conforme usado aqui, o termo "ligado a", com referência ao ter-mo extensão C-terminal, inclui a adição ou fixação de aminoácidos ou gru-pos químicos diretamente ao C-término da seqüência peptídica.
Opcionalmente, o agonista peptídico seletivo PEGuiIado do re-ceptor de VPAC2 pode também ter uma modificação N-terminal. O termo"modificação N-terminal", conforme usado aqui, inclui a adição ou fixação deaminoácidos ou grupos químicos diretamente ao N-término de um peptídeoe a formação de grupos químicos, os quais incorporam o nitrogênio no N-término de um peptídeo.
A modificação N-terminal pode compreender a adição de um oumais aminoácidos que ocorrem naturalmente ou não ocorrem naturalmente àseqüência dos agonistas peptídicos do receptor de VPAC2, de preferênciaexistem não mais de dez aminoácidos, com um aminoácido sendo mais pre-ferido. Aminoácidos que ocorrem naturalmente os quais podem ser adicio-nados ao N-término incluem metionina e isoleucina. Um aminoácido modifi-cado adicionado ao N-término pode ser D-histidina. Alternativamente, os se-guintes aminoácidos podem ser adicionados ao N-término: SEQ ID NO: 93Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg, em que a Arg é ligada ao N-términodo agonista peptídico. De preferência, quaisquer aminoácidos adicionadosao N-término são ligados ao N-término através de uma ligação peptídica.
O termo "ligado a", conforme usado aqui, com referência ao ter-mo modificação N-terminal, inclui a adição ou fixação de aminoácidos ougrupos químicos diretamente ao N-término do agonista do receptor deVPAC2. A adição das modificações N-terminais acima pode ser obtida sobcondições normais de acoplamento para formação de ligação peptídica.
O N-término do agonista peptídico pode também ser modificadoatravés da adição de um grupo alquila (R)1 de preferência um grupo C1-C16alquila, para formar (R)NH-.
Alternativamente, o N-término do agonista peptídico pode sermodificado através da adição de um grupo da Fórmula -C(O)R1 para formaruma amida da Fórmula R1C(O)NH-. A adição de um grupo da Fórmula -C(O)R1 pode ser obtida através de reação com um ácido orgânico da Fórmu-la R1COOH. Modificação do N-término de uma seqüência de aminoácidousando acilação é demonstrada na técnica (por exemplo, Gozes et al., J.Pharmacol Exp Ther1 273: 161-167 (1995)). Adição de um grupo da Fórmula-C(O)R1 pode resultar na formação de um grupo uréia (veja WO 01/23240,WO 2004/06839) ou um grupo carbamato no N-térmiN° Também, o N-término pode ser modificado através da adição de ácido piroglutâmico ouácido 6-amino-hexanoico.
O N-término do agonista peptídico pode ser modificado atravésda adição de um grupo da Fórmula -SO2R5, para formar um grupo sulfona-mida no N-térmiN°
O N-término do agonista peptídico pode também ser modificadoatravés de reação com anidrido succínico para formar um grupo succinimidano N-térmiN° O grupo succinimida incorpora o nitrogênio no N-término dopeptídeo.
O N-término pode, alternativamente, ser modificado através daadição de sulfoxido de metionina, ácido biotinil-6-amino-hexanoico ou -C(=NH)-NH2. A adição de -C(=NH)-NH2 é uma modificação de guanidação,onde o NH2 terminal do aminoácido N-terminal se torna -NH-C(=NH)-NH2.
A maioria das seqüências da presente invenção, incluindo umamodificação N-terminal e a extensão C-terminal, contém os códigos padrõescom uma letra ou três letras para os vinte aminoácidos que ocorrem natu-ralmente. Os outros códigos usados são definidos como segue:C6 = hexanoíla
d = a isoforma D (não ocorre naturalmente) do respectivo aminoácido,por exemplo, dA = D-alanina, dS = D-serina, dK = D-Iisina hR = homoarginina
Aib = ácido amino isobutíricoOMe = metóxiNle = Nor-Ieucina
NMe = N-metila presa ao grupo alfa amino de um aminoácido,por exemplo, NMeA = N-metil alanina, NMeV = N-metil valinaOrn = omitina
K(CO(CH2)2SH) = £-(3'-mercaptopropionil)-lisinaK(W) = E-(UriptofiI)-Iisina
Abu = ácido α-amino-n-butírico ou ácido 2-aminobutanoicoCit = citrulina
K(Ac) = ε-acetil IisinaPEG = polietileno glicol
PEG40K = molécula de PEG de 40.000 DáltonPEG30K = molécula de PEG de 30.000 DáltonPEG20K = molécula de PEG de 20.000 Dálton
VIP ocorre naturalmente como uma única seqüência tendo 28 aminoácidos.Contudo, PACAP existe como um peptídeo de 38 aminoácidos (PACAP-38)ou como um peptídeo de 27 aminoácidos (PACAP-27) com uma carboxilaamidada (Miyata et al., Biochem Biophys Res Commun, 170: 643-648(1990)). As seqüências para VIP, PACAP-27 e PACAP-38 são como segue:<table>table see original document page 35</column></row><table>
O termo "aminoácido que ocorre naturalmente", conforme usadoaqui, significa os vinte aminoácidos codificados pelo código genético huma-no (isto é, os vinte aminoácidos padrões). Esses vinte aminoácidos são: Ala-nina, Arginina, Asparagina, Ácido Aspártico, Cisteína, Glutamina, Ácido Glu-tâmico, Glicina1 Histidina, lsoleucina, Leucina1 Lisina1 Metionina1 Fenilalani-na, Prolina, Serina, Treonina, Triptofano, Tirosina e Valina.
Exemplos de "aminoácidos que não ocorrem naturalmente" in-cluem aminoácidos sintéticos e aqueles modificados pelo corpo. Esses in-cluem D-aminoácidos, aminoácidos semelhantes à arginina (por exemplo,homoarginina) e outros aminoácidos tendo um metileno extra na cadeia late-ral ("homo" aminoácidos) e aminoácidos modificados (por exemplo, norleuci-na, Iisina (isopropila) - em que a amina da Iisina na cadeia lateral é modifi-cada por um grupo isopropila). Também incluídos são aminoácidos tais co-mo ornitina, ácido amino isobutirico e ácido 2-aminobutanoico.
"Seletivo", conforme usado aqui, se refere a um agonista peptí-dico do receptor de VPAC2 com seletividade aumentada pelo receptor deVPAC2 comparado com outros receptores conhecidos. O grau de seletivida-de é determinado pela proporção de afinidade de ligação ao receptor deVPAC2 para a afinidade de ligação ao receptor de VPAC1 ou pela proporçãode afinidade de ligação ao receptor de VPAC2 para a afinidade de ligação aoreceptor PAC1. A afinidade de ligação é determinada conforme descrito a-baixo no Exemplo 4.
"Atividade insulinotrópica" se refere à capacidade de estimular asecreção de insulina em resposta a níveis elevados de glicose, desse modo,causando a captação de glicose pelas células e diminuindo os níveis de gli-cose no plasma. A atividade insulinotrópica pode ser avaliada através demétodos conhecidos na técnica, incluindo usando experimentos que medema atividade de ligação ao receptor de VPAC2 ou ativação de receptor (porexemplo, secreção de insulina por linhagens de célula de insulinoma ou ilho-tas, teste de tolerância à glicose intravenosa (IVGTT), teste de tolerância àglicose intraperitoneal (IPGTT) e teste de tolerância à glicose oral (OGTT). Aatividade insulinotrópica é rotineiramente medida em seres humanos atravésde medição dos níveis de insulina ou níveis de C-peptídeos. Agonistas pep-tídicos seletivos PEGuiIados do receptor de VPAC2 da presente invençãotêm atividade insulinotrópica.
"Potência In vitro", conforme usado aqui, é a medida da capaci-dade de um peptídeo de ativar o receptor de VPAC2 em um ensaio baseadoem célula. A potência in vitro é expressa como a "EC5o", a qual é a concen-tração eficaz de composto que resulta em 50% do aumento máximo na ativi-dade em um único experimento de dose-resposta. Para fins da presente in- venção, a potência in vitro é determinada usando dois ensaios diferentes:DiscoveRx e Alpha Screen. Veja Exemplos 3 e 5 para detalhes adicionaisdesses ensaios. Embora esses ensaios sejam realizados de diferentes for-mas, os resultados demonstram uma correlação geral entre os dois ensaios.
O termo "meia-vida no plasma" se refere ao tempo no qual me-tade das moléculas relevantes circulam no plasma antes de serem elimina-das. Um termo alternativamente usado é "meia-vida de eliminação". O termo"prolongada" ou "mais longa", usado no contexto da meia-vida no plasma oumeia-vida de eliminação, indica que a há um aumento estaticamente signifi-cativo na meia-vida de um agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 com relação àquela da molécula de referência (por exemplo, a formanão-PEGuilada do peptídeo ou o peptídeo nativo), conforme determinadosob condições comparáveis. A meia-vida reportada aqui é a meia-vida deeliminação; isto é, aquela a qual corresponde à taxa de eliminação Iog-Iinearterminal. Aqueles versados na técnica apreciarão que a meia-vida é um pa-râmetro derivado que muda como uma função da eliminação e do volume dedistribuição.
A eliminação é a medida da capacidade do corpo de eliminar umfármaco. À medida que a eliminação diminui em virtude, por exemplo, demodificações em um fármaco, será esperado que a meia-vida aumente.Contudo, essa relação recíproca é verdadeira apenas quando não há altera-ção no volume de distribuição. Uma relação aproximada útil entre a meia-vida Iog-Iinear terminal (t y2), eliminação (C) e volume de distribuição (V) éfornecida pela equação: t % » 0,693 (V/C). A eliminação não indica quantofármaco está sendo removido mas, antes, o volume de fluído biológico, talcomo sangue ou plasma que teria de estar completamente livre do fármacopara levar em conta a eliminação. A eliminação é expressa como volume porunidade de tempo.
"Identidade percentual (%) de seqüência" conforme usado aqui,é usado para denotar seqüências as quais, quando alinhadas, têm aminoá-cidos similares (idênticos ou conservativamente substituídos) em posiçõesou regiões semelhantes, onde aminoácidos idênticos ou conservativamentesubstituídos são aqueles os quais não alteram a atividade ou função da pro-teína, quando comparado com a proteína de iniciação. Por exemplo, duasseqüências de aminoácido com pelo menos 85% de identidade uma a outratêm pelo menos 85% de resíduos idênticos ou conservativamente substituí-dos em uma posição semelhante quando alinhadas otimamente, permitindoaté 3 gaps, contanto que, com relação aos gaps, um total de não mais de 15resíduos de aminoácidos é afetado.
O peptídeo de referência usado para os cálculos de identidade
percentual de seqüência aqui é:_
P487 C6-HSDAVFTEQ Y(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQSI
SEQ ID NO: 84 OrnOmGGPSSGAPPPS-NH2_
A identidade percentual de seqüência pode ser calculada deter-minando-se o número de resíduos que difere entre um peptídeo abrangidopela presente invenção e um peptídeo de referência, tal como P487 (SEQ IDNO: 84), tomando esse número e dividindo o mesmo pelo número de amino-ácidos no peptídeo de referência (por exemplo, 39 aminoácidos para P487),multiplicando o resultado por 100 e subtraindo o número resultante de 100.Por exemplo, uma seqüência tendo 39 aminoácidos com quatro aminoácidosque são diferentes de P487 tem uma identidade percentual (%) de seqüên-cia de 90% (por exemplo, 100 - ((4 / 39) χ 100)). Para uma seqüência que émais longa do que 39 aminoácidos, o número de resíduos que difere da se-qüência do P487 incluirá aminoácidos adicionais além dos 39 para fins docálculo antes mencionado. Por exemplo, uma seqüência tendo 40 aminoáci-dos, com quatro aminoácidos diferentes dos 39 aminoácidos na seqüênciado P487 e com um aminoácido adicional no carbóxi-término o qual não estápresente na seqüência do P487, teria um total de cinco aminoácidos quediferem do P487. Assim, essa seqüência teria uma identidade percentual (%)de seqüência 87% (por exemplo, 100 - ((5 / 39) χ 100)). O grau de identidadede seqüência pode ser determinado usando métodos bem-conhecidos natécnica (veja, por exemplo, Wilbur, W.J. e Lipman1 D.J., Proc. Natl. Acad.Sei. USA 80: 726-730 (1983) e Myers E. e MiIIerW., Comput. Appi Biosci. 4:11-17 (1988)). Um programa o qual pode ser usado na determinação dograu de similaridade é o método com um par MegAIign Lipman-Pearson (u-sando os parâmetros de padrão) o qual pode ser obtido da DNAstar Inc,1128, Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715, EUA como parte do sis-tema Lasergene. Outro programa o qual pode ser usado é o Clustal W. Esseé um pacote de alinhamento de múltiplas seqüências desenvolvido porThompson et al. (Nucleic Acids Research, 22(22): 4673-4680(1994)) paraseqüências de DNA ou proteína. Essa ferramenta é útil para realizar compa-rações interespécie de seqüências relacionadas e visualização de conserva-ção de seqüência. O Clustal W é um programa de alinhamento de múltiplasseqüências de finalidade geral para DNA ou proteínas. Ele produz alinha-mentos de múltiplas seqüências biologicamente significativos de seqüênciasdivergentes. Ele calcula a melhor combinação para as seqüências selecio-nadas e alinha as mesmas, de modo que as identidades, similaridades ediferenças possam ser observadas. Relações evolucionárias podem ser ob-servadas através de visualização via Cladogramas ou Filogramas.
A seqüência para um agonista peptídico seletivo PEGuilado doreceptor de VPAC2 da presente invenção é seletiva para o receptor deVPAC2 e, de preferência, tem, uma identidade de seqüência na faixa de60% a 70%, 60% a 65%, 65% a 70%, 70% a 80%, 70% a 75%, 75% a 80%,80% a 90%, 80% a 85%, 85% a 90%, 90% a 97%, 90% a 95% ou 95% a97%, com P487 (SEQ ID NO: 84). De preferência, a seqüência tem uma i-dentidade de seqüência de mais de 82% com P487 (SEQ ID NO: 84). Maispreferivelmente, a seqüência tem mais de 90% de identidade de seqüênciacom P487 (SEQ ID NO: 84). Ainda mais preferivelmente, a seqüência temmais de 92% de identidade de seqüência com P487 (SEQ ID NO: 84). Aindamais preferivelmente, a seqüência tem mais de 95% de identidade de se-qüência ou 97% de identidade de seqüência com P487 (SEQ ID NO: 84).
O termo "C1-C16 alquila", conforme usado aqui, significa um radi-cal hidrocarboneto com cadeia reta, ramificada ou cíclica monovalente satu-rada tendo de 1 a 16 átomos de carbono ou, quando cíclica, tendo de 3 a 16átomos de carboN0 Assim, o termo "C1-C16 alquila" inclui, por exemplo, meti-la, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-heptila, n-octila, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e ciclo-hexila. O grupoC1-C16 alquila pode ser opcionalmente substituído por um ou mais substituin-tes incluindo, por exemplo, arila, C-pCealcóxi, -OH, halogênio, -CF3 e -SH.
O termo "C2-C6 alquenila", conforme usado aqui, significa umradical hidrocarboneto de cadeia reta, ramificada ou cíclica monovalentetendo pelo menos uma ligação dupla e tendo de 2 a 6 átomos de carbonoou, quando cíclica tendo de 3 a 6 átomos de carboN0 Assim, o termo "C2-C6alquenila" inclui vinila, prop-2-enila, but-3-enila, pent-4-enila e isopropenila.O grupo C2-C6 alquenila pode ser opcionalmente substituído por um ou maissubstituintes.
O termo "C2-C6 alquinila", conforme usado aqui, significa um ra-dical hidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada monovalente tendo pelomenos uma ligação tripla e tendo de 2 a 6 átomos de carboN0 Assim, o ter-mo "C2-C6 alquinila" inclui prop-2-inila, but-3-inila e pent-4-inila. O grupo C2-C6 alquinila pode ser opcionalmente substituído por um ou mais substituin-tes.
O termo "C1-C6 alcóxi", conforme usado aqui, significa um radicalhidrocarboneto de cadeia ramificada ou cadeia reta saturada monovalentenão-substituído tendo de 1 a 6 átomos de carbono ligados ao ponto de subs-tituição por um radical O divalente. Assim, o termo "C1-C6 alcóxi" inclui, porexemplo, metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, isobutóxi, sec-butóxie terc-butóxi. O grupo C1-C6 alcóxi pode ser opcionalmente substituído por um ou mais substituintes.
O termo "halo" ou "halogênio" significa flúor, cloro, bromo ou io-do.
O termo "arila", quando usado sozinho ou como parte de umgrupo, é um grupo heteroaromático ou aromático de 5 a 10 elementos, inclu- indo um grupo fenila, ou um grupo heteroaromático monocíclico de 5 ou 6elementos, cada elemento do qual pode ser opcionalmente substituído por 1,2, 3, 4 ou 5 substituintes (dependendo do número de posições de substitui-ção disponíveis), um grupo naftila ou um grupo heteroaromático bicíclico de8, 9 ou 10 elementos, cada elemento do qual pode ser opcionalmente substi- tuído por 1, 2, 3, 4 ou 5 substituintes (dependendo do número de posiçõesde substituição disponíveis). Dependendo da definição de arila, substituiçõesadequadas incluem C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, -NH2, -OH, halogênio, -SH e CF3.
O termo "aril C1-C4 alquila", conforme usado aqui, significa um grupo C1-C4 alquila substituído por uma arila. Assim, o termo " aril C1-C4 al-quila" inclui benzila, 1-feniletila (α-metilbenzila), 2-feniletila, 1-naftalenometilaou 2-naftalenometila.
O termo "naftila" inclui 1-naftila e 2-naftila. 1-naftila é preferido.
O termo "benzila", conforme usado aqui, significa um radical fe- nila monovalente não-substituído ligado ao ponto de substituição por umgrupo -CH2-.
O termo "grupo heteroaromático monocíclico de 5 ou 6 elemen-tos", conforme usado aqui, significa um grupo aromático monocíclico comum total de 5 ou 6 átomos no anel, em que de 1 a 4 desses átomos são, ca- da um independentemente, selecionados de Ν, O e S. Grupos preferidostêm um ou dois átomos no anel, os quais são, cada um independentemente,selecionados de Ν, O e S. Exemplos de grupos heteroaromáticos monocícli-cos com 5 elementos incluem pirrolila (também denominada azolila), furanila,tienila, pirazolila (também denominada 1H-pirazolila e 1,2-diazolila), imidazo-Iiia, oxazolila (também denominada 1,3-oxazolila), isoxazolila (também de-nominada 1,2-oxazolila), tiazolila (também denominada 1,3-tiazolila), isotia-zolila (também denominada 1,2-tiazolila), triazolila, oxadiazolila, tiadiazolila,tetrazolila, oxatriazolila e tiatriazolila. Exemplos de grupos heteroaromáticosmonocíclicos com 6 elementos incluem piridinila, pirimidila, pirazinila, pirida-zinila e triazinila.
O termo "grupo heteroaromático bicíclico de 8, 9 ou 10 elemen-tos", conforme usado aqui, significa um grupo aromático bicíclico fundidocom um total de 8, 9 ou 10 átomos no sistema de anel, em que de 1 a 4 des-ses átomos são, cada um independentemente, selecionados de Ν, O e S.Grupos preferidos têm de 1 a 3 átomos no sistema de anel os quais são,cada um independentemente, selecionado de Ν, O e S. Grupos heteroaro-máticos bicíclicos com 8 elementos adequados incluem imidazo[2,1-b][1,3]tiazolila, tieno[3,2-b]tienila, tieno[2,3-d][1,3]tiazolila e tieno[2,3-d]imidazolila. Grupos heteroaromáticos bicíclicos com 9 elementos adequa-dos incluem indolila, isoindolila, benzofuranila (também denominada ben-zo[b]furanila), isobenzofuranila (também denominada benzo[c]furanila), ben-zotienila (também denominada benzo[b]tienila), isobenzotienila (também de-nominada benzo[c]tienila), indazolila, benzimidazolila, 1,3-benzoxazolila, 1,2-benzisoxazolila, 2,1-benzisoxazolila, 1,3-benzotiazolila, 1,2-benzoisotiazolila,2,1-benzoisotiazolila, benzotriazolila, 1,2,3-benzoxadiazolila, 2,1,3-benzoxadiazolila, 1,2,3-benzotiadiazolila, 2,1,3-benzotiadiazolila, tienopiridi-nila, purinila e imidazo[1,2-a]piridina. Grupos heteroaromáticos bicíclicoscom 10 elementos adequados incluem quinolinila, isoquinolinila, cinolinila,quinazolinila, quinoxalinila, 1,5-naftiridila, 1,6-naftiridila, 1,7-naftiridila e 1,8-naftiridila.
O termo "PEG", conforme usado aqui, significa uma molécula depolietileno glicol. Em sua forma típica, o PEG é um polímero linear com gru-pos terminais hidroxila e tem a Fórmula HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH, onde n é de cerca de 8 a cerca de 4000. O hidrogênio terminal pode sersubstituído por um grupo protetor, tal como um grupo alquila ou alcanol. Depreferência, PEG tem pelo menos um grupo hidróxi, mais preferivelmente eleé um grupo hidróxi terminal. É esse grupo hidróxi o qual é, de preferência,ativado para reagir com o peptídeo. Existem muitas formas de PEG úteis napresente invenção. Numerosos derivados de PEG existem na técnica e sãoadequados para uso na invenção. (Veja, por exemplo, Patentes U.S. N-:5.445.090; 5.900.461; 5.932.462; 6.436.386; 6.448.369; 6.437.025;6.448.369; 6.495.659; 6.515.100 e 6.514.491 e Zalipsky, S. BioconjugateChem. 6: 150-165, 1995). Não se pretende que a molécula de PEG covalen-temente ligada a agonistas peptídicos do receptor de VPAC2 na presenteinvenção esteja limitada a um tipo em particular. O peso molecular de umamolécula de PEG é, de preferência, 500-100.000 daltons. PEG pode ser li-near ou ramificado. Agonistas peptídicos PEGuiIados do receptor de VPAC2da invenção podem ter uma, duas ou três moléculas de PEG presas ao pep-tídeo. É mais preferível que haja uma ou duas moléculas de PEG por ago-nista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2, contudo, quando há maisde uma molécula de PEG por molécula peptídica, é preferido que haja nãomais do que três. Considera-se ainda que ambas as extremidades da molé-cula de PEG podem ser homo- ou heterofuncionalizadas através de ligaçãoreticulada de um ou mais agonistas peptídicos do receptor de VPAC2 juntos.Onde existem duas moléculas de PEG presentes, as moléculas de PEG, depreferência, podem ser moléculas de PEG de 20.000 daltons ou ser, cadauma, moléculas de PEG de 30.000 daltons. Contudo, moléculas de PEGtendo um peso molecular diferente podem ser usadas, por exemplo, umamolécula de PEG de 10.000 daltons e uma molécula de PEG de 30.000 dal-tons ou uma molécula de PEG de 20.000 daltons e uma molécula de PEGde 40.000 daltons.
Na presente invenção, uma molécula de PEG pode ser covalen-temente ligada a um resíduo de Cys ou Lys ou ao resíduo C-terminal. Umamolécula de PEG também pode ser covalentemente ligada a um resíduo deTrp o qual é acoplado à cadeia lateral de um resíduo de Lys (K(W)). Alterna-tivamente, um grupo K(CO(CH2)2SH) pode ser PEGuiIado para formarK(CO(CH2)2S-PEG). Qualquer resíduo de Lys no agonista peptídico pode sersubstituído por um K(W) ou K(CO(CH2)2SH), o qual pode, então, ser PEGui-lado. Além disso, qualquer resíduo de Cys no agonista peptídico pode sersubstituído por um resíduo de cisteína modificado, por exemplo, hC. O resí-duo de Cys modificado pode ser covalentemente preso a uma molécula dePEG.
O termo "PEGuilação", conforme usado aqui, significa a fixaçãocovalente de uma ou mais moléculas de PEG, conforme descrito acima, aosagonistas peptídicos do receptor de VPAC2 da presente invenção.
De acordo com uma modalidade da presente invenção, é pro-porcionado um agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 com-preendendo uma seqüência peptídica selecionada de: SEQ ID NO: 17 a 45 e94 a 112 e uma extensão C-terminal selecionada de: SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8,9, 10, 11 e 12. É especialmente preferido que a extensão C-terminal sejaSEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
De acordo com uma modalidade mais preferida da presente in-venção, é proporcionado um agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 compreendendo uma seqüência peptídica selecionada de: SEQ IDNO: 17 a 45 e 94 a 112 e uma extensão C-terminal selecionada de: SEQ IDNO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 e em que o agonista peptídico do receptor deVPAC2 ainda compreende uma modificação N-terminal, modificação a qualé uma adição de acetila, propionila, butirila, pentanoíla, hexanoíla, metionina,sulfoxido de metionina, 3-fenilpropionila, fenilacetila, benzoíla, norleucina, D-histidina, isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinil-6-amino-hexanoico(ácido 6-aminocaproico) e -C(=NH)-NH2. Nessa modalidade, é mais preferi-do que a modificação N-terminal seja a adição de acetila ou hexanoíla.
De acordo com uma modalidade ainda preferida da presenteinvenção, é proporcionado um agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 compreendendo uma seqüência de aminoácido de Fórmula 4 (SEQID NO: 4) e uma extensão C-terminal selecionada de: SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8,9, 10, 11 e 12 e em que o agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 ainda compreende uma modificação N-terminal, modificação a qualé a adição de acetila, propionila, butirila, pentanoíla, hexanoíla, metionina,sulfoxido de metionina, 3-fenilpropionila, fenilacetila, benzoíla, norleucina, D-histidina, isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinil-6-amino-hexanoico(ácido 6-aminocaproico) e -C(=NH)-NH2. Nessa modalidade, é mais preferi-do que a modificação N-terminal seja a adição de acetila ou hexanoíla.
De acordo com uma modalidade mais preferida da presente in-venção, é proporcionado um agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 compreendendo uma seqüência de aminoácido de Fórmula 4 (SEQID NO: 4), em que Xaai5 é Aib1 Xaa2O é Aib e Xaai2, Xaa2i, Xaa27 e Xaa28são todos Orn e uma extensão C-terminal selecionada de: SEQ ID NO: 5, 6,7, 8, 9, 10, 11 e 12 e em que o agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 ainda compreende uma modificação N-terminal, modificação a qualé a adição de acetila, propionila, butirila, pentanoíla, hexanoíla, metionina,sulfoxido de metionina, 3-fenilpropionila, fenilacetila, benzoíla, norleucina, D-histidina, isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinil-6-amino-hexanoico(ácido 6-aminocaproico) e -C(=NH)-NH2. Nessa modalidade, é mais preferi-do que Xaa-I5 seja Aib, Xaa2O seja Aib, Xaai2, Xaa21, Xaa27 e Xaa2S sejamtodos Orn, Xaae seja Glu, Xaag seja Gln e Xaaio seja Tyr(OMe). É especial-mente preferido que Xaai5 seja Aib, Xaa20 seja Aib, Xaai2, Xaa2I, Xaa27 eXaa28 sejam todos Orn, Xaa8 é Glu, Xaag seja Gln, Xaai0 seja Tyr(OMe) eXaa23 e/ou Xaa25 seja Aib.
PEGuilação de proteínas pode superar muitos dos problemastoxicológicos/imunológicos e farmacológicos associados ao uso de peptí-deos ou proteínas como produtos terapêuticos. Contudo, para qualquer pep-tídeo individual, é incerto se a forma PEGuiIada do peptídeo terá perda signi-ficativa de bioatividade quando comparado com a forma não-PEGuilada dopeptídeo.
A bioatividade de proteínas PEGuiIadas pode ser afetada porfatores tais como: i) o tamanho da molécula de PEG; ii) os sítios particularesde fixação; iii) o grau de modificação; iv) condições de acoplamento adver-sas; v) se um Iigante é usado para fixação ou se o polímero está diretamentepreso; vi) geração de coprodutos prejudiciais; vii) dano infligido pelo polímeroativado; ou viii) retenção de carga. Trabalho realizado sobre a PEGuilaçãode citocinas, por exemplo, mostra o efeito que PEGuilação pode ter. Depen-dendo da reação de acoplamento usada, modificação polimérica de citocinasresultou em reduções dramáticas na bioatividade [Francis, G.E. et al., (1998)PEGyIation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides: the im-portance of biological optimization of coupling techniques, Intl. J. Hem. 68: 1-18]. Manutenção da bioatividade de peptídeos PEGuiIados é ainda maisproblemática do que para proteínas. Uma vez que peptídeos são menoresdo que proteínas, modificação através de PEGuilação pode ter potencial-mente um efeito maior sobre a bioatividade.
Os agonistas peptídicos do receptor de VPAC2 da presente in-venção são modificados através da fixação covalente de uma ou mais molé-culas de PEG e geralmente têm perfis farmacocinéticos aperfeiçoados emvirtude de menor degradação proteolítica e eliminação renal. PEGuilaçãoaumentará o tamanho original dos agonistas peptídicos do receptor deVPAC2, assim, reduzindo a filtração renal de alterando biodistribuição. PE-Guilação pode proteger epítopos antigênicos dos agonistas peptídicos doreceptor de VPAC2, assim, reduzindo a eliminação retículoendotelial e reco-nhecimento pelo sistema imune e também reduzindo a degradação por en-zimas proteolíticas, tal como DPP-IV.
Fixação covalente de uma ou mais moléculas de PEG a um pe-queno agonista peptídico do receptor de VPAC2 biologicamente ativo impõeo risco de afetar adversamente o agonista, por exemplo, através de deses-tabilização da estrutura secundária inerente e da conformação bioativa ereduzindo a bioatividade, de modo a tornar o agonista inadequado para usocomo um produto terapêutico. A presente invenção, contudo, é baseada nadescoberta de que fixação covalente de uma ou mais moléculas de PEG aresíduos particulares de um agonista peptídico do receptor de VPAC2 resul-ta, surpreendentemente, em um agonista peptídico PEGuiIado biologicamen-te ativo do receptor de VPAC2 com meia-vida prolongada e uma eliminaçãoreduzida quando comparado com aquela de agonistas peptídicos não-PEGuiIados do receptor de VPAC2. Os compostos da presente invençãoincluem agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor de VPAC2.
De forma a determinar os sítios potenciais de PEGuilação emum agonista peptídico do receptor de VPAC2, varredura de serina pode serconduzida. Um resíduo de Ser é substituído em uma posição particular nopeptídeo e o peptídeo Ser-modificado é testado com relação à potência eseletividade. Se a substituição de Ser tem impacto mínimo sobre a potênciae o peptídeo Ser-modificado é seletivo para o receptor de VPAC2, o resíduode Ser é, então, substituído por um resíduo de Cys ou Lys, o qual serve co-mo um sítio de PEGuilação direta ou indireta. PEGuilação indireta de umresíduo é a PEGuilação de um grupo químico ou resíduo o qual é ligado aoresíduo no sítio de PEGuilação. PEGuilação indireta de Lys inclui PEGuila-ção de K(W) e K(CO(CH2)2SH).
A invenção descrita aqui proporciona agonistas peptídicos PE-Guilados do receptor de VPAC2. PEGuilação pode intensificar a meia-vidados agonistas peptídicos seletivos do receptor de VPAC2, resultando emagonistas peptídicos PEGuiIados do receptor de VPAC2 com uma meia-vidade eliminação de pelo menos uma hora, de preferência pelo menos 3, 5, 7,10, 15, 20 ou 24 horas e, mais preferivelmente, pelo menos 48 horas. Osagonistas peptídicos PEGuiIados do receptor de VPAC2 da presente inven-ção têm, de preferência, um valor de eliminação de 200 ml/h/kg ou menos,mais preferivelmente 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg ou menos e, aindamais preferivelmente, menos de 50, 40 ou 20 ml/h/kg.
A presente invenção abrange a descoberta de que aminoácidosespecíficos adicionados ao C-término de uma seqüência peptídica para umagonista peptídico do receptor de VPAC2 podem proteger o peptídeo, bemcomo intensificar a atividade, seletividade e/ou potência. Por exemplo, essasextensões C-terminais podem estabilizar a estrutura helicoidal do peptídeo eestabilizar sítios localizados proximo do C-término, os quais são propensos àclivagem enzimática. Além disso, muitos dos peptídeos C-terminalmente es-tendidos divulgados aqui podem ser mais seletivos para o receptor deVPAC2 e podem ser mais potentes do que o VIP, PACAP e outros agonistaspeptídicos do receptor de VPAC2 conhecidos. Um exemplo de uma exten-são C-terminal preferida é o peptídeo de extensão de Exendina-4 como aseqüência de C-revestimento. Exendina-4 é encontrada nas excreções sali-va res do Gila Monster1 Heloderma Suspectum, (Eng et al., J.Biol.Chem.,267(11): 7402-7405 (1992)). Outros exemplos de extensões C-terminais sãoas seqüências C-terminais de helodermina e helospectina. Helodermina ehelospectina são também encontradas nas excreções salivares do GilaMonster.
Além disso, descobriu-se ainda que a modificação do N-términodo agonista peptídico do receptor de VPAC2 pode intensificar a potênciae/ou proporcionar estabilidade contra clivagem pela DPP-IV.
VIP e alguns agonistas peptídicos do receptor de VPAC2 sãosuscetíveis à clivagem por várias enzimas e, assim, têm uma curta meia-vidain vivo. Vários sítios de clivagem enzimática nos agonistas peptídicos do re-ceptor de VPAC2 são discutidos abaixo. Os sítios de clivagem são discutidoscom relação às posições de aminoácido no VIP (SEQ ID NO: 14) e são apli-cáveis às seqüências mencionadas aqui.
Clivagem do agonista peptídico pela enzima dipeptidil-peptidase-IV (DPP-IV) ocorre entre a posição 2 (serina no VIP) e a posição 3 (ácidoaspártico no VIP). Os agonistas da presente invenção podem ser tornadosmais estáveis à clivagem pela DPP-IV nessa região através da adição deuma modificação N-terminal. Exemplos de modificações N-terminais quepodem melhorar a estabilidade contra clivagem pela DPP-IV incluem a adi-ção de acetila, propionila, butirila, pentanoíla, hexanoíla, metionina, sulfoxidode metionina, 3-fenilpropionila, fenilacetila, benzoíla, norleucina, D-histidina,isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinil-6-amino-hexanoico ou -C(=NH2)-NH2. De preferência, a modificação N-terminal é a adição de acetilaou hexanoíla.
Existem sítios de clivagem de quimotripsina no VIP do tipo sil-vestre entre os aminoácidos 10 e 11 (tirosina e treonina) e aqueles nas 22 e 23 (tirosina e leucina). Fazer substituições na posição 10 e/ou 11 e posição22 e/ou 23 pode aumentar a estabilidade do peptídeo nesses sítios. Por e-xemplo, substituição de serina na posição 10 e/ou posição 22 por Tyr(OMe)pode aumentar a estabilidade.
Há um sítio de clivagem de tripsina entre os aminoácidos nasposições 12 e 13 do VIP do tipo silvestre. Determinados aminoácidos tornamo peptídeo menos suscetível à clivagem nesse sítio, por exemplo, ornitina naposição 12 e ácido amino isobutírico na posição 13.
No VIP do tipo silvestre e em numerosos agonistas peptídicos doreceptor de VPAC2 conhecidos na técnica, existem sítios de clivagem entreos aminoácidos básicos nas posições 14 e 15 e entre aqueles nas posições20 e 21. Os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 da presente invenção podem ter estabilidade proteolítica aperfeiçoa-da in vivo em virtude de substituições nesses sítios. As substituições preferi-das nesses sítios são aquelas as quais tornam o peptídeo menos suscetívelà clivagem por enzimas semelhantes à tripsina, incluindo tripsina. Por exem-plo, ácido amino isobutírico na posição 15, ácido amino isobutírico na posi-ção 20 e ornitina na posição 21 são todas substituições preferidas as quaispodem levar à estabilidade aperfeiçoada. A estabilidade aperfeiçoada deuma série representativa de agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados doreceptor de VPAC2 com resistência à clivagem pela peptidase e abrangidospela presente invenção é demonstrada no Exemplo 7.
Há também um sítio de clivagem entre os aminoácidos nas posi-ções 25 e 26 do VIP do tipo silvestre.
A região do agonista peptídico do receptor de VPAC2 abrangen-do os aminoácidos nas posições 27, 28, 29, 30 e 31 é também suscetível àclivagem enzimática. A adição de uma extensão C-terminal pode tornar oagonista peptídico mais estável contra neuroendopeptidase (NEP), podetambém aumentar a seletividade pelo receptor de VPAC2. Essa região tam-bém pode ser atacada por enzimas semelhantes à tripsina. Se isso ocorre, oagonista peptídico pode perder sua extensão C-terminal com uma atividadeadicional de carboxipeptidase, levando a uma forma inativa do peptídeo.Substituições preferidas as quais podem aumentar a resistência à clivagemnessa região incluem ornitina na posição 27, ornitina ou ácido amino isobutí-rico na posição 28 e ornitina na posição 29.Além dos agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptorde VPAC2 com resistência à clivagem por várias peptidases, os agonistasPEGuiIados seletivos do receptor peptídico VPAC2 da presente invençãotambém podem abranger peptídeos com seletividade intensificada pelo re-ceptor de VPAC2, potência aumentada e/ou estabilidade comparada comalguns peptídeos conhecidos na técnica. A potência e seletividade aumenta-das por vários agonistas peptídicos PEGuiIados do receptor de VPAC2 dapresente invenção são demonstradas nos Exemplos 3, 4 e 5.
A Tabela 1 no Exemplo 3 proporciona uma lista de agonistaspeptídicos seletivos PEGuiIados do receptor de VPAC2 e seus resultados depotência in vitro correspondentes. De preferência, os agonistas peptídicosseletivos PEGuiIados do receptor de VPAC2 da presente invenção têm umvalor de EC5O de menos de 200 nM. Mais preferivelmente, o valor de EC5O émenos de 100 nM. Ainda mais preferivelmente, o valor de EC5O é menos de50 nM. Ainda mais preferivelmente, o valor de EC5O é menos de 30 nM.
A Tabela 2 no Exemplo 4 proporciona uma lista de agonistaspeptídicos PEGuiIados do receptor de VPAC2 e seus resultados de ligação areceptor correspondentes para o VPAC2, VPAC1 e PAC1 humanos. VejaExemplo 4 para outros detalhes desses ensaios. O grau de seletividade édeterminado pela proporção de afinidade de ligação ao receptor de VPAC2para a afinidade de ligação ao receptor de VPAC1 e pela proporção de afini-dade de ligação ao receptor de VPAC2 para a afinidade de ligação ao recep-tor PAC1. De preferência, os agonistas da presente invenção têm uma pro-porção onde a afinidade pelo receptor de VPAC2 é pelo menos 50 vezesmaior do que para os receptores de VPAC1 e/ou PAC1. Mais preferivelmen-te, essa afinidade é pelo menos 100 vezes maior para o VPAC2 do que parao VPAC1 e/ou para o PAC1. Ainda mais preferivelmente, a afinidade é pelomenos 200 vezes maior para o VPAC2 do que para o VPAC1 e/ou para oPAC1. Ainda mais preferivelmente, a afinidade é pelo menos 500 vezesmaior para o VPAC2 do que para o VPAC1 e/ou para o PAC1. Ainda maispreferivelmente, a proporção é pelo menos 1000 vezes maior para o VPAC2do que para o VPAC1 e/ou para o PAC1.Conforme usado aqui, "agonistas peptídicos seletivos do recep-tor de VPAC2" também inclui sais farmaceuticamente aceitáveis dos agonis-tas descritos aqui. Um agonista peptídico seletivo do receptor de VPAC2 dapresente invenção pode possuir grupos funcionais suficientemente ácidos,suficientemente básicos ou ambos e, consequentemente, reagir com qual-quer um de uma série de ácidos orgânicos e inorgânicos e bases inorgâni-cas, para formar um sal. Ácidos comumente empregados para formar saisde adição de ácido são ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácidobromídrico, ácido hidroioico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e similares e áci-dos orgânicos, tais como ácido p-tolueno-sulfônico, ácido metano-sulfônico,ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfônico, ácido carbônico, ácido succínico,ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético, ácido trifluoroacético e similares.Exemplos de tais sais incluem os sulfato, piro-sulfato, bissulfato, sulfito, bis-sulfito, fosfato, mono-hidrogeno fosfato, di-hidrogeno fosfato, metafosfato,pirofosfato, cloreto, brometo, iodeto, acetato, propionato, decanotato, caprila-to, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato,malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butino-1,4-dioato, hexino-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitro-benzoato, hidroxibenzoato, metoxi benzoato, ftalato, sulfonato, xileno-sulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gama-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metano-sulfonato, propano-sulfonato, nafta-leno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato e similares.
Sais de adição de base incluem aqueles derivados de bases i-norgânicas, tais como hidroxidos, carbonatos, bicarbonatos de metal alcalinoou alcalino-terroso ou amônio e similares. Tais bases úteis para o preparodos sais da presente invenção, assim, incluem hidroxido de sódio, hidroxidode potássio, hidroxido de amônio, carbonato de potássio e similares.
Os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 da presente invenção são, de preferência, formulados como compo-sições farmacêuticas. Técnicas-padrão de formulação farmacêutica podemser empregadas, tais como aquelas descritas em Remington's Pharmaceuti-cal Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Os agonistas peptídi-cos seletivos PEGuiIados do receptor de VPAC2 da presente invenção po-dem ser formulados para administração através da via bucal, tópica, oral,transdérmica, nasal ou pulmonar ou para administração parenteral.
Administração parenteral pode incluir, por exemplo, administra-ção sistêmica, tal como através de injeção intramuscular, intravenosa, sub-cutânea, intradérmica ou intraperitoneal. Os agonistas peptídicos seletivosPEGuiIados do receptor de VPAC2 podem ser administrados ao indivíduoem conjunto com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente acei-tável como parte de uma composição farmacêutica para o tratamento deNIDDM ou dos distúrbios discutidos abaixo. Uma composição farmacêuticapode ser uma solução ou, se administrada parenteralmente, uma suspensãodo agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 ou uma suspensãodo agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 em complexo comum cátion de metal divalente, tal como zinco. Veículos farmacêuticos ade-quados podem conter ingredientes inertes os quais não interagem com opeptídeo ou derivado peptídico. Veículos farmacêuticos adequados paraadministração parenteral incluem, por exemplo, água estéril, solução salinafisiológica, solução salina bacteriostática (solução salina contendo álcoolbenzílico a cerca de 0,9% por mg/ml), solução salina tamponada por fosfato,solução de Hank, Iactato de Ringer e similares. Alguns exemplos de excipi-entes adequados incluem lactose, dextrose, sacarose, trealose, sorbitol emanitol.
O agonistas peptídicos PEGuiIados do receptor de VPAC2 dainvenção podem ser formulados para administração, de modo que os níveisde plasma no sangue são mantidos na faixa eficaz durante períodos de tem-po prolongados. A barreira principal para a distribuição eficaz de fármacopeptídico oral é a pobre biodisponibilidade em virtude da degradação depeptídeos por ácidos e enzimas, pobre absorção através das membranasepiteliais e transição de peptídeos para uma forma insolúvel após exposiçãoao ambiente com pH ácido no trato digestivo. Sistemas de distribuição oralpara peptídeos, tais como aqueles abrangidos pela presente invenção, sãoconhecidos na técnica. Por exemplo, agonistas peptídicos PEGuiIados doreceptor de VPAC2 podem ser encapsulados usando microesferas e, então,distribuídos oralmente. Por exemplo, agonistas peptídicos PEGuiIados doreceptor de VPAC2 podem ser encapsulados em microesferas compostas deum polímero biocompatível, biodegradável comercialmente disponível, (po-li)lactídeo-coglicolídeo-COOH e óleo de oliva como um material de enchi-mento (veja Joseph et al. Diabetologia 43: 1319-1328 (2000)). Outros tiposde tecnologia de microesfera também estão comercialmente disponíveis, taiscomo os polímeros biodegradáveis Medisorb® e Prolease® da Alquermes.Polímeros Medisorb® podem ser produzidos com qualquer um dos isômerosde lactídeo. Lactídeo: proporções de glicolídeo podem ser variadas entre0:100 e 100:0, permitindo uma ampla faixa de propriedades de polímero.Isso permite o design de sistemas de distribuição e dispositivos implantáveiscom tempos de reabsorção oscilando de semanas a meses. Emisphere tam-bém publicou numerosos artigos que discutem a tecnologia de distribuiçãooral para peptídeos e proteínas. Por exemplo, veja WO 95/28838 por Leone-bay et al., o qual discute veículos específicos compreendidos de aminoáci-dos modificados para facilitar a absorção.
Os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 descritos aqui podem ser usados para tratar indivíduos com umaampla variedade de doenças e condições. Agonistas abrangidos pela pre-sente invenção exercem seus efeitos biológicos atuando como um receptorreferido como o receptor de VPAC2. Indivíduos com doenças e condiçõesque respondem favoravelmente à estimulação com receptor de VPAC2 ou àadministração de agonistas peptídicos do receptor de VPAC2 podem, por-tanto, ser tratados com agonistas de VPAC2 PEGuiIados da presente inven-ção. Esses indivíduos são ditos como "estando em necessidade de trata-mento com agonistas de VPAC2" ou "em necessidade de estimulação doreceptor de VPAC2".
Os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 da presente invenção podem ser empregados para tratar diabetes,incluindo diabetes do tipo 1 e do tipo 2 (diabetes mellitus não dependente deinsulina ou NIDDM). Os agonistas também podem ser usados para tratarindivíduos que requerem tratamento profilático com um agonista do receptorde VPAC2, por exemplo, indivíduos em risco de desenvolver NIDDM. Taltratamento também pode retardar o início de diabetes e complicações diabé-ticas. Indivíduos adicionais os quais podem ser tratados com os agonistas dapresente invenção incluem aqueles com tolerância deficiente à glicose (IGT)(Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22(Sup. 1): S5, 1999) ou glicose em jejum deficiente (IFG) (Charles et al., Dia-betes 40: 796, 1991), indivíduos cujo peso corporal é cerca de 35% acima dopeso corporal normal para o peso e estrutura corporal do indivíduo, indiví-duos tendo um ou mais dos pais com NIDDM, indivíduos que tenham tidodiabetes gestacional e indivíduos com distúrbios metabólicos, tais como a-queles resultantes de secreção diminuída de insulina endógena. Os agonis-tas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor de VPAC2 podem ser usa-dos para prevenir indivíduos com tolerância deficiente à glicose de prosse-guir para o desenvolvimento de NIDDM, prevenir deterioração de células βpancreáticas, induzir à proliferação de células β, melhorar a função de célu-las β, ativar células β dormentes, diferenciar células em células β, estimulara replicação de células β e inibir a apoptose de células β. Outras doenças econdições que podem ser tratadas ou prevenidas usando agonistas da in-venção em métodos da invenção incluem: diabetes com início da maturidadedo jovem (MODY) Herman et al., Diabetes 43: 40, 1994); Diabetes Autoimu-ne Latente em Adultos (LADA) (Zimmet et al., Diabetes Med. 11: 299, 1994);diabetes gestacional (Metzger, Diabetes, 40: 197, 1991); síndrome X meta-bólica, dislipidemia, hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia eresistência à insulina.
Os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 da invenção podem também ser usados para tratar causas secundá-rias de diabetes (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus,Diabetes Care 22 (Sup. 1): S5, 1999). Tais causas secundárias incluem ex-cesso de glicocorticoide, excesso de hormônio de crescimento, feocromoci-toma e diabetes fármaco-induzido. Fármacos que podem induzir ao diabetesincluem, mas não estão limitados a, piriminila, ácido nicotínico, glicocorticoi-des, fenitoína, hormônio da tiroide, agentes β-adrenérgicos, α-interferon efármacos usados para tratar infecção por HIV.
Os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 da presente invenção podem ser eficazes na supressão da ingestãode alimento e tratamento de obesidade.
Os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 da presente invenção também podem ser eficazes na prevenção outratamento de distúrbios tais como doença aterosclerótica, hiperlipidemia,hipercolesterolemia, baixos níveis de HDL1 hipertensão, hipertensão pulmo-nar primária, doença cardiovascular (incluindo aterosclerose, doença cardía-ca coronariana e doença da artéria coronária), doença cérebro-vascular edoença de vasos periféricos; e para o tratamento de lúpus, síndrome de ová-rio policístico, carcinogênese e hiperplasia, problemas de reprodução femini-na e masculina, distúrbios sexuais, úlceras, distúrbios do sono, distúrbios dometabolismo de lipídio e carboidrato, disfunção circadiana, distúrbios decrescimento, distúrbios de homeostase de energia, doenças imunes, incluin-do doenças autoimunes (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico), bemcomo doenças inflamatórias agudas e crônicas, artrite reumatoide e choqueséptico.
Os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento dedistúrbios fisiológicos relacionados, por exemplo, à diferenciação celular pa-ra produzir células que acumulam lipídio, regulação de sensibilidade à insuli-na e níveis de glicose no sangue, os quais estão envolvidos, por exemplo,em função de células β pancreáticas anormal, tumores que secretam insuli-na e/ou hipoglicemia autoimune em virtude de auto-anticorpos à insulina,auto-anticorpos ao receptor de insulina ou auto-anticorpos que são estimula-tórios para células β pancreáticas, diferenciação de macrófagos a qual leva àformação de placas ateroscleróticas, resposta inflamatória, carcinogênese,hiperplasia, expressão de gene de adipócito, diferenciação de adipócito, re-dução na massa de células β pancreáticas, secreção de insulina, sensibili-dade tecidual à insulina, crescimento de células de lipossarcoma, doençaovariana policística, anovulação crônica, hiperandrogenismo, produção deprogesterona, esteroidogênese, potencial redox e estresse oxidativo em cé-lulas, produção de sintase de oxido nítrico (NOS), gama glutamil transpepti-dase aumentada, catalase, triglicerídeos no plasma, níveis de colesterol HDLe LDL e similares.
Além disso, os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados doreceptor de VPAC2 da presente invenção podem ser usados para o trata-mento de asma (Bolin et al., Biopolymer 37: 57-66 (1995); Patente U.S. N05.677.419; mostrando que o polipeptídeo R3PO é ativo no relaxamento domúsculo liso traqueal de porquinho-da-índia); indução de hipotensão (VIPinduz a hipotensão, taquicardia e fluxo facial em pacientes asmáticos (Mori-ce et al., Peptides 7: 279-280 (1986); Morice et al., Lancet 2: 1225-1227(1983)); para o tratamento de problemas de reprodução masculina (Siow etal., Arch. Androl. 43(1): 67-71 (1999)); como um agente antiapopto-se/neuroprotetor (Brenneman et al., Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 865: 207-12(1998)); para cardioproteção durante eventos isquêmicos (Kalfin et al., J.Pharmaco!. Exp. Ther. 1268(2): 952-8 (1994); Das et al., Ann. Ν. Y. Acad.Sei. 865: 297-308 (1998)); para a manipulação do ritmo circadiano e seusdistúrbios associados (Hamar et al., Cell 109: 497-508 (2002); Shen et al.,Proc. Nati Acad. Sei. 97: 11575-80, (2000)); e como um agente antiúleera(Tuncel et al., Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 865: 309-22, (1998)).
Uma "quantidade eficaz" de um agonista peptídico seletivo PE-Guilado do receptor de VPAC2 é a quantidade que resulta em um efeito te-rapêutico e/ou profilático desejado sem causar efeitos colaterais inaceitáveisquando administrada a um indivíduo que precisa de estimulação com o re-ceptor de VPAC2. Um "efeito terapêutico desejado" inclui um ou mais dosseguintes: 1) um alívio do(s) sintoma(s) associado(s) à doença ou condição;2) um retardo no início dos sintomas associados à doença ou condição; 3)longevidade aumentada comparado com a ausência de tratamento; e 4)maior qualidade de vida comparado com a ausência do tratamento. Por e-xemplo, uma "quantidade eficaz" de um agonista de VPAC2 PEGuiIado parao tratamento de NDDM é a quantidade que resultaria em maior controle daconcentração de glicose no sangue do que na ausência de tratamento, des-se modo, resultando em um retardo no início de complicações diabéticas,tais como retinopatia, neuropatia ou doença renal. Uma "quantidade eficaz"de um agonista peptídico seletivo PEGuiIado do receptor de VPAC2 para aprevenção de NDDM é a quantidade de retardaria, comparado com a ausên-cia do tratamento, do início de níveis elevados de glicose no sangue querequer tratamento com fármacos anti-hipoglicêmicos, tais como sulfonilurei-as, tiazolidinadionas, insulina e/ou bisguanidinas.
Uma "quantidade eficaz" do agonista peptídico seletivo PEGuiIa-do do receptor de VPAC2 administrada a um indivíduo também dependerádo tipo e gravidade da doença e das características do indivíduo, tais comosaúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a fármacos. A dose deagonista peptídico seletivo PEGuiIado do receptor de VPAC2 eficaz paranormalizar a glicose no sangue de um paciente dependerá de uma série defatores, dentre os quais estão incluídos, sem limitação, idade, peso e sexodo indivíduo, a gravidade da incapacidade de regular a glicose no sangue, avia de administração e biodisponibilidade, o perfil farmacocinético do peptí-deo, a potência e a formulação.
Uma faixa de dose típica para os agonistas peptídicos seletivosPEGuiIados do receptor de VPAC2 da presente invenção oscilarão de cercade 1 μg por dia a cerca de 5000 μg por dia. De preferência, as faixas de do-ses oscilam de cerca de 1 pg por dia a cerca de 2500 pg por dia, mais prefe-rivelmente de cerca de 1 pg por dia a cerca de 1000 pg por dia. Ainda maispreferivelmente, as faixas de dose são de cerca de 5 pg por dia a cerca de100 pg por dia. Uma faixa de dose ainda mais preferida é de cerca de 10 pgpor dia a cerca de 50 pg por dia. Mais preferivelmente, a dose é cerca de 20pg por dia.
Um "indivíduo" é um mamífero, de preferência um ser humano,mas também pode ser um animal, por exemplo, animais de companhia (porexemplo, cães, gatos e similares), animais de fazenda (por exemplo, vacas,ovelha, porcos, cavalos e similares) e animais de laboratório (por exemplo,ratos, camundongos, porquinhos-da-índia e similares).Os agonistas peptídicos seletivos PEGuiIados do receptor deVPAC2 da presente invenção podem ser preparados usando métodos-padrão de técnicas de síntese de peptídeo em fase sólida. Sintetizadores depeptídeo estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Rainin-PTISymphony Peptide Synthesizer (Tucson, AZ). Reagentes para síntese emfase sólida estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Glicopep(Chicago, IL). Sintetizadores de peptídeo em fase sólida podem ser usadosde acordo com as instruções do fabricante para bloqueio de grupos de inter-ferência, proteção do aminoácido a ser reagido, acoplamento, desacopla-mento e revestimento de aminoácidos não-reagidos.
Tipicamente, um aminoácido Ν-α-protegido e o aminoácido N-terminal sobre a cadeia peptídica em crescimento sobre uma resina são a-coplados em temperatura ambiente em um solvente inerte, tal como dimetil-formamida, N-metilpirrolidona ou cloreto de metileno na presença de agentesde acoplamento, tais como diciclo-hexilcarbodi-imida e 1-hidroxibenzotriazole uma base, tal como di-isopropiletilamina. O grupo de a-Ν-proteção é re-movido da resina peptídica resultante usando um reagente tal como ácidotrifluoroacético ou piperidina e a reação de acoplamento repetida com umproximo aminoácido N-protegido a ser adicionado à cadeia peptídica. Gru-pos de proteção de amina adequados são bem-conhecidos na técnica e sãodescritos, por exemplo, em Green e Wuts, "Protecting Groups in OrganicSynthesis", John Wiley e Sons, 1991. Exemplos incluem t-butiloxicarbonila(tBoc) e fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc).
Os agonistas peptídicos seletivos do receptor de VPAC2 tam-bém podem ser sintetizados usando protocolos padrão de síntese em fasesólida automatizados usando t-butoxicarbonil- ou fluorenilmetoxicarbonil-alfa-aminoácidos com proteção de cadeia-lateral apropriada. Após término dasíntese, modificação do N-término pode ser realizada através de reação deum grupo a-amino, por exemplo, com: (i) ésteres ativos (usando protocolossimilares conforme descrito acima para a introdução de um aminoácido a-N-protegido); (ii) aldeídos na presença de um agente de redução (procedimen-to de aminação redutiva); e (iii) reagentes de guanidação. Então, peptídeossão clivados do suporte de fase sólida com desproteção de cadeia lateralsimultânea usando métodos-padrão com fluoreto de hidrogênio ou ácido tri-fluoroacético (TFA). Peptideos brutos são, então, ainda purificados usandocromatografia em fase reversa sobre colunas VYDAC C18 usando gradien-tes de acetonitrila em TFA a 0,1%. Para remover o acetonitrila, peptídeossão Iiofilizados a partir de uma solução contendo TFA a 0,1%, acetonitrila eágua. A pureza pode ser verificada através de cromatografia de fase reversaanalítica. A identidade dos peptídeos pode ser verificada através de espec-trometria de massa. Peptídeos podem ser solubilizados em tampões aquo-sos em pH neutro.
Os agonistas peptídicos da presente invenção também podemser feitos através de métodos recombinantes conhecidos na técnica usandohospedeiros celulares procariotas e eucariotas.
Uma vez que um peptídeo é preparado e purificado, ele é modi-ficado covalentemente ligando pelo menos uma molécula de PEG a resíduosde Cys ou Lys a K(W) ou K(CO(CH2)2SH) ou ao aminoácido carbóxi-terminal. Uma ampla variedade de métodos foram descritos na técnica paraproduzir peptídeos covalentemente conjugados ao PEG e o método especí-fico usado para a presente invenção não se destina a ser Iimitativo (para umartigo de revisão veja Roberts, M. et al. Advanced Drug Delivery Reviews,54: 459-476, 2002).
Um exemplo de uma molécula de PEG a qual pode ser usada émetóxi-PEG2-MAL-40K, um PEG-maleimida bifurcado (Nektar, Huntsville1Alabama). Outros exemplos incluem, mas não estão limitados a, mPEG-SBA-20K (Nektar) denso, mPEG2-ALD-40K (Nektar) e metóxi-PEG-MAL-30K (Dow).
Fixação carbóxi-terminal de PEG pode ser feita via acoplamentoenzimático usando agonista peptídico do receptor de VPAC2 recombinantecomo um precursor ou métodos alternativos conhecidos na técnica e descri-tos, por exemplo, na Patente U.S. 4.343.898 ou Intl. J. Pept. & Prot. Res. 43:127-38 (1994).
Um método para o preparo dos agonistas peptídicos PEGuiladosdo receptor de VPAC2 da presente invenção envolve o uso de PEG-maleimida para prender diretamente PEG a um grupo tiol do peptídeo. A in-trodução de uma funcionalidade tiol pode ser obtida através da adição ouinserção de um resíduo de Cys ou hC sobre ou no peptídeo em posiçõesdescritas acima. Uma funcionalidade tiol também pode ser introduzida sobrea cadeia lateral do peptídeo (por exemplo, acilação do grupo ε-amino da Iisi-na por um ácido contendo tiol, tal como ácido mercaptopropiônico). Um pro-cesso de PEGuilação da presente invenção utiliza adição de Michael paraformar um Iigante de tioéter estável. A reação é altamente específica e ocor-re sob condições suaves na presença de outros grupos funcionais. PEG ma-Ieimida tem sido usada como um polímero reativo para o preparo de conju-gados de PEG-proteína bioativos bem-definidos. É preferível que o procedi-mento use um excesso molar, de preferência um excesso molar de 1 a 10,de um agonista peptídico do receptor de VPAC2 contendo tiol com relaçãoao PEG-maleimida para levar a reação ao térmiN0 As reações são, de prefe-rência, realizadas entre um pH de 4,0 e 9,0 à temperatura ambiente durante10 minutos a 40 horas. O excesso de peptídeo contendo tiol não-PEGuiladoé prontamente separado do produto PEGuiIado através de métodos conven-cionais de separação. O agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 é, de preferência, isolado usando HPLC em fase reversa ou croma-tografia por exclusão de tamanho. Condições específicas requeridas paraPEGuilação de agonistas peptídicos do receptor de VPAC2 são apresenta-das no Exemplo 8. PEGuilação de cisteína pode ser realizada usando PEGmaleimida ou PEG-maleimida bifurcada.
Um método alternativo para o preparo dos agonistas peptídicosPEGuiIados do receptor de VPAC2 da invenção envolve PEGuilação de umresíduo de Iisina usando um derivado de PEG-succinimdaila. De forma aobter PEGuilação sítio-específica, os resíduos de Lys os quais não são usa-dos para PEGuilação são substituídos por resíduos de Arg.
Outra abordagem para a PEGuilação é via uma reação de Pic-tet-Spengler. Um resíduo de Trp com sua amina livre é necessário para in-corporar uma molécula de PEG sobre um agonista peptídico do receptor deVPAC2. Uma abordagem para obter isso é introduzir, sítio-especificamente,um resíduo de Trp sobre a amina de uma cadeia lateral de Lys via uma liga-ção de amida durante a síntese em fase sólida (veja Exemplo 10).
Várias características e modalidades preferidas da presente in-venção serão agora descritas apenas por meio de exemplos com referênciaà figura a seguir, na qual: a figura 1 mostra a intensificação na resposta àinsulina ao estímulo com glicose i.v. em animais tratados com P505 ou P52524 h antes de injeção de glicose. A resposta à insulina em animais tratadoscom veículo é mostrada por referência.
Exemplo 1 - Preparo de agonistas peptídicos seletivos do receptor deVPAC2 através de química com t-Boc em fase sólida:
Aproximadamente 0,5-0,6 grama (0,38-0,45 mmol) de resina BocSer(BzI)-PAM é colocado em um vaso de reação padrão de 60 mL. Acopla-mentos duplos são realizados sobre um sintetizador de peptídeo AppliedBiosystems ABI430A.
Os seguintes aminoácidos protegidos na cadeia lateral (cartu-chos de 2 mmoles de Boc aminoácidos) são obtidos da Midwest Biotech (Fi-shers, IN) e são usados na síntese:
Arg-Tosila (TOS), Asp-ô-ciclo-hexil éster (OcHx), Glu-ô-cicohexiléster (OcHx), His-benziloximetila (BOM), Lys-2-clorobenziloxicarbonila (2CI-Z), Ser-O-benzil éter (OBzl), Thr-O-benzil éter (OBzI)1 Trp-formila (CHO) eTyr-2-bromobenziloxicarbonila (2Br-Z).
Ácido trifluoroacético (TFA), di-isopropiletilamina (DlEA), hidroxi-benzotriazol (HOBt) a 0,5M em DMF e diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC) a 0,5M em diclorometano sao adquiridos da PE-AppIied Biosystems (Foster City1CA). Dimetilformamida (DMF-Burdick e Jackson) e diclorometano (DCM-Mallinkrodt) são adquiridos da Mays Chemical Co. (Indianápolis, IN).
Acoplamentos padrão duplos são realizados usando anidridosimétrico ou ésteres de HOBt1 ambos formados usando DCC. Ao término dasíntese, o grupo Boc N-terminal é removido e as resinas de peptidila sãotratadas com piperidina a 20% em DMF para desformilar a cadeia lateral deTrp se Trp estiver presente na seqüência. Para a acilação N-terminal, exces-so de quatro vezes de anidrido simétrico do ácido correspondente é adicio-nado sobre a resina peptídica. O anidrido simétrico é preparado através deativação de di-isopropilcarbodi-imida (DIC) em DCM. A reação é deixadaprocessar durante 4 horas e monitorada através de um teste com ninidrina.Após lavagem com DCM1 as resinas são transferidas para um vaso de rea-ção de TEFLON e são secas in vácuo.
As clivagens são feitas através de fixação dos vasos de reação aum aparelho de HF (ácido fluorídrico) (Penninsula Laboratories). 1 mL de m-cresol por grama/resina é adicionado e 10 mL de HF (adquirido da AGA1 In-dianápolis, IN) são condensados no vaso pré-resfriado. 1 mL de DMS porgrama de resina é adicionado quando metionina está presente. As reaçõessão agitadas uma hora em um banho de gelo. O HF é removido in vácuo. Osresíduos são suspensos em etil éter. Os sólidos são filtrados e são lavadoscom éter. Cada peptídeo é extraído em ácido acético aquoso e Iiofilizado oucarregado diretamente sobre uma coluna de fase reversa.
Purificações são realizadas sobre uma coluna VYDAC C18 de2,2 χ 25 cm em tampão A (TFA a 0,1% em água). Um gradiente de 20% a90% de B (TFA a 0,1% em acetonitrila) é passado sobre uma HPLC (Wa-ters) durante 120 minutos a 10 mL/minuto enquanto se monitora a UV a 280nm (4,OA) e coleta frações de 1 minuto. Frações apropriadas são combina-das, congeladas e liofilizadas. Os produtos secos são analisados através deHPLC (METASIL AQ C18 de 0,46 χ 15 cm) e espectrometria de massaMALDI.
Exemplo 2 - Preparo dos agonistas peptídicos seletivos do receptor deVPAC2 através de química com FMoc em fase sólida:
Aproximadamente 114 mg (50 mMoles) de resina FMOCSer(tBu) WANG (adquirida da GIicoPep, Chicago, IL) são colocados em ca-da vaso de reação. A síntese é conduzida sobre um Sintetizador de Peptí-deo Rainin Symphony. Análogos com uma amida C-terminal são preparadosusando 75 mg (50 μίτιοίβε) de resina Rink Amida AM (Rapp Polymere, Tue-bingen, Alemanha).
Os seguintes FMOC aminoácidos são adquiridos da GIicoPep(Chicago, IL) e NovaBiochem (La Jolla, CA): Arg-2,2,4,6,7-pentametildi-hidrobenzofuran-5-sulfonila (Pbf), Asn-tritila (Trt), Asp-p-t-Butil éster (tBu),Glu-5-t-butil éster (tBu), Gln-tritila (Trt), His-tritila (Trt), Lys-t-butiloxicarbonila(Boc), Ser-t-butil éter (OtBu), Thr-t-butil éter (OtBu), Trp-t-butiloxicarbonila(Boc), Tyr-t-butil éter (OtBu).
Os solventes dimetiformamida (DMF-Burdick e Jackson), N-metilpirrolidona (NMP-Burdick e Jackson), diclorometano (DCM-MaIIinkrodt) sãoadquiridos da Mays Chemical Co. (Indianápolis, IN).
Hidroxibenzotriazol (HOBt), di-isopropilcarbodi-imida (DIC), di-isopropiletilamina (DIEA) e piperidina (Pip) são adquiridos da Aldrich Chemi-cal Co (Milwaukee, Wl).
Todos os aminoácidos são dissolvidos em DMF a 0,3M. Aco-plamentos DIC/HOBt-ativados de 3 horas são realizados após 20 minutos dedesproteção usando Pip/DMF a 20%. Cada resina é lavada com DMF apósdesproteções e acoplamentos. Após o último acoplamento e desproteção, asresinas de peptidila são lavadas com DCM e, então, secas in vácuo no vasode reação. Para a acilação N-terminal, excesso de quatro vezes de anidridosimétrico do ácido correspondente é adicionado sobre a resina peptídica. Oanidrido simétrico é preparado através de ativação com DIC em DCM. A re-ação é deixada processar durante 4 horas e monitorada através de um testecom ninidrina. A resina peptídica é, então, lavada com DCM e seca in vácuo.
A reação de clivagem é misturada durante 2 horas com um co-quetel de clivagem consistindo em 0,2 mL de tioanisol, 0,2 mL de metanol,0,4 mL de tri-isopropil-silano, por 10 mL de TFA, todos adquiridos da AldrichChemical Co., Milwaukee, Wl. Se Cys está presente na seqüência, etanodi-tiol a 2% é adicionado. Os filtrados de TFA são adicionados a 40 mL de etiléter. Os precipitantes são centrifugados 2 minutos a 2000 rpm. Os sobrena-dantes são decantados. Os péletes são ressuspensos em 40 mL de éter,recentrifugados, redecantados, secos sob nitrogênio e, então, in vácuo.
0,3-0,6 mg de cada produto é dissolvido em 1 mL de TFA a0,1%/acetonitrila (ACN), com 20 pL sendo analisados sobre HPLC [META-SIL AQ C18 de 0,46 χ 15 cm, 1mL/min, 45°C, 214 nM (0,2A), A = TFA a0,1%, B = TFA a 0,1%/ACN a 50%. Gradiente = 50% de B a 90% de B du-rante 30 minutos].
Purificações são realizadas sobre uma coluna VYDAC C18 de2,2 χ 25 cm em tampão A (TFA a 0,1% em água). Um gradiente de 20% a90% de B (TFA a 0,1% em acetonitrila) é passado sobre uma HPLC (Wa-ters) durante 120 minutos a 10 mL/minuto enquanto se monitora a UV a 280nm (4,0A) e coleta frações de 1 minuto. Frações apropriadas são combina-das, congeladas e liofilizadas. Os produtos secos são analisados através deHPLC (METASIL AQ C18 de 0,46 χ 15 cm) e espectrometria de massaMALDI.
Precursor ao P521 (C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY
AibQSIOrnOrnGGPSSGAPPPCC-NH2): Síntese é realizadausando protocolos de FMoc descritos acima. O peptídeo é caracterizado a-través de HPLC analítica: tR = 10,9 min, condições de HPLC conforme des-crito acima e MALDI-TOF: calculado m/z = 4290,0, medido m/z = 4290,8[M+H+]. Após purificação usando HPLC preparativa de fase reversa, as fra-ções puras são combinadas e liofilizadas: 14,8 mg são obtidos como um póIiofilizado final.
Precursor ao P525 (C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQ
AiblOrnOrnGGPSSGAPPPCC-NH2): Conforme descrito para oprecursor ao P521. HPLC analítica: tR = 11,0 min. MALDI-TOF: calculadom/z = 4288,0, medido m/z = 4288,8 [M+H+]. 18,7 mg são obtidos como umpó Iiofilizado final.
Precursor to P574 (C6-HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrn
Y(OMe)LQAiblOrnOrnGGPSSGAPPPCC-NH2): Conforme des-crito para o precursor ao P521. HPLC analítica: Xr = 11,7 min. MALDI-TOF:calculado m/z = 4330,1, medido m/z = 4330,7 [M+H+]. 46,2 mg são obtidoscomo um pó Iiofilizado final.
Exemplo 3 - Potência in vitro em receptores de VPAC2 humanos:
Alpha screen: Células são lavadas no frasco de cultura uma vez com PBS.Então, as células são enxaguadas com tampão de dissociação isento deenzima. As células dissociadas são removidas. As células são, então, centri-fugadas e lavadas em tampão de estimulação. Para cada ponto de dados,50.000 células suspensas em tampão de estimulação são usadas. Para essetampão, glóbulos aceitadores Alpha Screen são adicionados junto com oestímulo. Essa mistura é incubada durante 60 minutos. Tampão de Iise eglóbulos doadores Alpha Screen são adicionados e são incubados durante60 a 120 minutos. O sinal do Alpha Screen (indicativo dos níveis de cAMPintracelular) é lido em um instrumento adequado (por exemplo, AIphaQuestda Perkin-Elmer). Etapas incluindo glóbulos aceitadores e doadores AlphaScreen são realizadas em luz reduzida. A EC50 para a geração de cAMP écalculada a partir do sinal bruto ou é baseada nos níveis absolutos de cAMP,conforme determinado através de uma curva padrão realizada sobre cadalâmina.
Os resultados para cada agonista são, no mínimo, de duas aná-lises realizadas em uma única operação. Para alguns agonistas, os resulta-dos são a média de mais de uma operação. As concentrações de peptídeotestadas são: 10000, 1000, 100, 10, 3, 1, 0,1, 0,01, 0,003, 0,001, 0,0001 e0,00001 nM.
DiscoveRx: Uma linhagem de célula CHO-S expressando esta-velmente receptor de VPAC2 humano em uma lâmina de microtitulação com96 poços é cultivada com 50.000 células/poço um dia antes do ensaio. Ascélulas são deixadas fixar durante 24 horas em 200 μΙ. de meio de cultura.No dia do experimento, o meio é removido. Também, as células são lavadasduas vezes. As células são incubadas em tampão de ensaio mais IBMX du-rante 15 minutos em temperatura ambiente. Subseqüentemente, os estímu-los são adicionados e são dissolvidos em tampão de ensaio. Os estímulosestão presentes durante 30 minutos. Então, o tampão de ensaio é gentilmen-te removido. O reagente de Iise de célula do kit DiscoveRx cAMP é adicio-nado. Consequentemente, o protocolo padrão para desenvolvimento de sinalde cAMP, conforme descrito pelo fabricante, é usado (DiscoveRx Inc., EUA).Os valores de EC50 para geração de cAMP são calculados a partir do sinalbruto ou são baseados nos níveis absolutos de cAMP, conforme determina-do através de uma curva padrão realizada sobre cada lâmina.
Os resultados para cada agonista são a média de duas opera-ções independentes. As concentrações tipicamente testadas de peptídeosão: 1000, 300, 100, 10, 1, 0,3, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 e 0 nM.
A atividade (EC50 (nM)) para o receptor de VPAC2 humano éreportada na Tabela 1 para os diferentes formatos de ensaio.
Tabela 1. Potência de peptídeo nos receptores de VPAC2 humanos.
<table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>
Exemplo 4 - Seletividade:
Ensaios de ligação: Membrana preparada a partir de uma li-nhagem de células VPAC2-estável (veja Exemplo 3) ou de células transitori-amente transfectadas com VPAC1 ou PAC1 humano são usadas. Um ensaiode ligação a filtro é realizado usando VIP 125l-rotulado para VPAC1 e VPAC2e PACAP-27 125l-rotulado para PAC1 como os marcadores.
Para esse ensaio, as soluções e equipamento incluem:Solução de pré-embebimento: Polietilenoamina a 0,5% em água dest.Tampão para lavagem das lâminas de filtro: HEPES a 25 mM, pH de 7,4Tampão de bloqueio: HEPES a 25 mM, pH de 7,4; BSA isento de protease a0,2%
tampão de ensaio: HEPES a 25 mM, pH de 7,4; BSA com protease a 0,5%Lâmina de diluição e ensaio: PS-Microplate, forma de ULâmina de filtração: Lâmina Multiscreen FB Opaque; filtro glasfiber do tipo Bde 1,0 μΜ
De forma a preparar as lâminas de filtro, a solução pré-embebidamento é aspirada através de filtração a vácuo. As lâminas são Ia-vadas duas vezes com 200 μL de tampão de lavagem. 200 μL de tampão debloqueio são adicionados à lâmina de filtro. A lâmina de filtro é, então, incu-bada com 200 μL de solução pré-embebida durante 1 hora em temperaturaambiente.
A lâmina de ensaio é preenchida com 25 μL de tampão de en-saio, 25 μL de membranas (2,5 μ9) suspensas em tampão de ensaio, 25 μLde agonista em tampão de ensaio e 25 μL de marcador (cerca de 4000 cpm)em tampão de ensaio. A lâmina preenchida é incubada durante 1 hora comagitação.
A transferência da lâmina de ensaio para a lâmina de filtro éconduzida. O tampão de bloqueio é aspirado através de filtração a vácuo elavado duas vezes com tampão de lavagem. 90 μL são transferidos da lâmi-na de ensaio para a lâmina de filtro. Os 90 μL transferidos da lâmina de en-saio são aspirados e lavados três vezes com 200 μL de tampão de lavagem.O suporte plástico é removido. Ele é seco durante 1 hora a 60°C. 30 μL deMicroscint são adicionados. A contagem é realizada.
A ligação ao receptor (IC50) para o VPAC2, VPAC1 e PAC1 hu-mano é reportada na Tabela 2.
Tabela 2
<table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>
Exemplo 5 - Potência in vitro em receptores de VPAC1 e VPAC2 de ra-to:
DiscoveRx: Células CHO-PO são transitoriamente transfectadascom DNA de receptor de VPAC1 ou VPAC2 de rato usando reagentes detransfecção comercialmente disponíveis (Lipofectamine da Invitrogen). Ascélulas são cultivadas em uma densidade de 10.000/poço em uma lâminacom 96 poços e são deixadas crescer durante 3 dias em 200 ml de meio decultura. No dia 3, o ensaio é realizado.
No dia do experimento, o meio é removido. Também, as célulassão lavadas duas vezes. As células são incubadas em tampão de ensaiomais IBMX durante 15 minutos em temperatura ambiente. Subsequentemen-te, os estímulos são adicionados e são dissolvidos em tampão de ensaio. Osestímulos ficam presentes durante 30 minutos. Então, o tampão de ensaio égentilmente removido. O reagente de Iise de célula do kit DiscoveRx cAMP éadicionado. Consequentemente, o protocolo padrão para desenvolvimentode sinal de cAMP, conforme descrito pelo fabricante, é usado (DiscoveRxInc., EUA). Os valores de EC50 para a geração de cAMP são calculados apartir do sinal bruto ou são baseados nos níveis absolutos de cAMP, con-forme determinado por uma curva padrão realizada sobre cada lâmina.
Os resultados para cada agonista são a média de duas opera-ções independentes. Os resultados para VPAC1 e VPAC2 de rato são gera-dos apenas usando o ensaio DiscoveRx. As concentrações tipicamente tes-tadas de peptídeo são: 1000, 300, 100, 10, 1, 0,3, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 e0 nM.
A atividade (EC50(nM)) para os receptores de VPAC2 e VPAC1de rato é reportada na Tabela 3.
Tabela 3
<table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>
Exemplo 6 - Ensaios In vivo:
Teste de tolerância à glicose intravenosa (IVGTT): Ratos Wis-tar normais são submetidos a jejum durante a noite e são anestesiados an-tes do experimento. Um cateter de amostragem de sangue é inserido nosratos. O agonista é fornecido subcutaneamente, normalmente 24 horas an-tes do estímulo com glicose. Amostras de sangue são tomadas da artériacarótida. Uma amostra de sangue é tirada imediatamente antes da injeçãode glicose junto com o agonista. Após a amostra inicial de sangue, glicosemisturada é injetada intravenosamente (i.v.). Um estímulo com glicose de 0,5g/kg de peso corporal é fornecido, injetando um total de 1,5 mL de veículocom glicose e agonista por kg de peso corporal. As concentrações de peptí-deo são variadas para produzir a dose desejada em μg/kg. Amostras desangue são tiradas a 2, 4, 6 e 10 minutos após fornecer glicose. O grupo deanimais de controle recebe o mesmo veículo junto com glicose, mas semagonista adicionado. Em alguns casos, amostras de sangue pós-glicose 20 e30 minutos foram tiradas. Aprotinina é adicionada à amostra de sangue(250-500 klU/ml de sangue). O plasma é, então, analisado com relação àglicose e insulina usando metodologias padrão.
O ensaio usa um estoque de peptídeo formulado e calibrado emPBS. Normalmente, esse estoque é um estoque pré-diluído a 100 μΜ. Con-tudo, um estoque mais concentrado com aproximadamente 1 mg de agonis-ta por ml_ é usado. A concentração específica é sempre conhecida. A varia-bilidade na resposta máxima é principalmente em virtude da dose de veículo.
Detalhes do protocolo são como segue:
<table>table see original document page 74</column></row><table>Tabela 4a
<table>table see original document page 75</column></row><table>
AUC = Área sob a curva (insulina, 0-10 min após glicose)
Perfis farmacocinéticos de peptídeos PEGuiIados. 344 ratosFisher saudáveis (3 animais por grupo) foram injetados com 100 pg de ago-nista/kg (quantidade de agonista baseada no teor de peptídeo e dissolvidaem tampão de PBS). Amostras de sangue são tiradas 3, 12, 24, 48, 72, 96 e168 horas pós-dosagem e o teor de peptídeo no plasma foi analisado atra-vés de um radioimunoensaio (RIA) dirigido contra o N-término do peptídeo.Os parâmetros de PK foram, então, calculados usando um método modelo-independente (WinNonIin Pro, Pharsight Corp., Mountain View, CA, EUA).
Tabela 4b. Parâmetros de PK de agonistas peptídicos PEGuilados. Valores
<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table>
*NC = não calculado em virtude de dados insuficientes
Exemplo 7 - Estudos de estabilidade em soro de rato:
De forma a determinar a estabilidade de agonistas peptídicos doreceptor de VPAC2 em soro de rato, o clone N0 6 de células CHO-VPAC2(lâminas com 96 poços/50.000 células/poço e 1 dia de cultura), PBS 1X(Gibco), os peptídeos para análise em uma solução de estoque a 100 μΜ,soro de rato de um rato Wistar normal sacrificado, aprotinina e um kit de en-saio DiscoveRx são obtidos. O soro de rato é armazenado a 4 °C até uso e éusado dentro de duas semanas.
No Dia 0, duas alíquotas de 100 μL de peptídeo a 10 μΜ em so-ro de rato são preparadas através da adição de 10 μL de estoque de peptí-deo a 90 μL de soro de rato para cada alíquota. 250 klU de aprotinina / mLsão adicionados a uma dessas alíquotas. A alíquota é armazenada com a-protinina a 4 °C. A alíquota é armazenada sem aprotinina a 37 °C. As alíquo-tas são incubadas durante 24 ou 72 horas.
No Dia 1, após a incubação das alíquotas preparadas no dia 0durante 24 ou 72 horas, um tampão de incubação adicional contendo PBS +CaCI2 a 1,3 mM, MgCI2 a 1,2 mM, glicose a 2 mM e IBMX a 0,25 mM é pre-parado. Uma lâmina com 11 diluições seriais 5X de peptídeo para a alíquotade 4 °C e 37 °C é preparada para cada peptídeo estudado. 2000 nM são u-sados como a concentração máxima se o peptídeo tiver uma EC50 acima de1 nM e 1000 nM como a concentração máxima se o peptídeo tiver uma EC50abaixo de 1 nM a partir da seleção primária (veja Exemplo 3). A(s) lâmina(s)é (são) lavada(s) com células duas vezes em tampão de incubação. As lâ-minas são deixadas conter 50 μl de meio de incubação por poço durante 15minutos. 50 μl de solução por poço são transferidos para as células da lâ-mina preparada com 11 diluições seriais 5X de peptídeo para as alíquotasde 4 °C e 37 °C para cada peptídeo estudado, usando as concentraçõesmáximas que são indicadas pela seleção primária, em duplicata. Essa etapadilui a concentração de peptídeo em um fator de dois. As células são incu-badas em temperatura ambiente durante 30 minutos. O sobrenadante é re-movido. 40 μl/ροςο do tampão de extração/anticorpo DiscoveRx são adicio-nados. As células são incubadas sobre o agitador (300 rpm) durante 1 hora.Procedimento normal com o kit DiscoveRx é seguido. Padrões de cAMP sãoincluídos na coluna 12. Os valores de EC50 são determinados a partir dosdados do ensaio com cAMP. A quantidade restante de peptídeo ativo é esti-mada pela Fórmula EC5O, 40°C/EC50,37°c para cada condição.
Tabela 5. Estabilidade estimada do peptídeo após 24h ou 72h em soro derato a 37°C
<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>
¹Valores >100% podem representar o peptídeo intacto a partir do conjugadode PEG
Exemplo 8 - PEGuilação de agonistas peptídicos seletivos do receptorde VPAC2 usando química baseada em tiol:
Em geral, reações de PEGuilação são realizadas sob condiçõesque permitem a formação de uma ligação de tioéter. Especificamente, o pHda solução oscila de cerca de 4 a 9 e as concentrações de peptídeo conten-do tiol oscilam de um excesso molar de 0,7 a 10 da concentração de PEGmaleimida. As reações de PEGuilação normalmente são realizadas em tem-peratura ambiente. O agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2é, então, isolado usando HPLC de fase reversa ou cromatografia por exclu-são de tamanho (SEC). Agonistas peptídicos PEGuiIados são caracterizadosusando RP-HPLC analítica, HPLC-SEC, SDS-PAGE e/ou Espectrometria deMassa MALDI.
Usualmente, uma função tiol é introduzida em ou sobre um ago-nista peptídico seietivo ao receptor de VPAC2 através da adição de uma eis-teína ou uma homocisteína ou uma porção contendo tiol em um ou ambosos términos ou através de inserção de uma cisteína ou uma homocisteína ouuma porção contendo tiol em uma seqüência. Os agonistas peptídicos doreceptor de VPAC2 contendo tiol são reagidos com PEG-maleimida de 40kDa, 30 kDa ou 20 kDa para produzir derivados com PEG covalentementepresos via uma ligação de tioéter.
Síntese de P505
19 mg do peptídeo precursor (P505 não-PEGuilado) e 162 mgde metóxi-PEG-maleimida (NOF, Japão) com um peso molecular médio de20.000 Daltons são dissolvidos em 2 ml_ de tampão de NH4Ac a 100 mMcontendo EDTA a 10 mM (pH de 6,8) e a reação é deixada processar duran-te 4 h. 97 mg do produto são obtidos como um pó Iiofilizado após purificaçãoatravés de RP-HPLC preparativa. O agonista peptídico PEGuiIado é caracte-rizado através de RP-HPLC e HPLC por exclusão de tamanho e testado comrelação à atividade in vitro.
Síntese de P525
18,7 mg do peptídeo precursor (P525 não-PEGuilado) e 157 mgde metóxi-PEG-maleimida com um peso molecular médio de 20.000 Daltonssão dissolvidos em 2 mL de tampão de NH4Ac a 100 mM contendo EDTA a10 mM (pH de 6,8) e a reação é deixada processar durante 4 h. 114 mg doproduto são obtidos como um pó Iiofilizado após purificação através de RP-HPLC preparativa. O agonista peptídico PEGuiIado é caracterizado atravésde RP-HPLC e HPLC por exclusão de tamanho e testado com relação à ati-vidade in vitro.
Síntese de P572
22,3 mg do peptídeo precursor (P572 não-PEGuilado) e 177 mgde metóxi-PEG-maleimida com um peso molecular médio de 20.000 Daltonssão dissolvidos em 2 mL de tampão de NH4Ac a 100 mM contendo EDTA a10 mM (pH de 6,8) e a reação é deixada processar durante 4 h. 137 mg doproduto são obtidos como um pó Iiofilizado após purificação através de RP-HPLC preparativa. O agonista peptídico PEGuiIado é caracterizado atravésde RP-HPLC e HPLC por exclusão de tamanho e testado com relação à ati-vidade in vitro.Síntese de P574
31,9 mg do peptídeo precursor (P574 não-PEGuilado) e 283 mgde metóxi-PEG-maleimida com um peso molecular médio de 20.000 Daltonssão dissolvidos em 3 mL de tampão de NH4Ac a 100 mM contendo EDTA amM (pH de 6,8) e a reação é deixada processar durante 4 h. 171 mg doproduto são obtidos como um pó Iiofilizado após duas operações de purifica-ção através de RP-HPLC preparativa. O agonista peptídico PEGuiIado é ca-racterizado através de RP-HPLC e HPLC por exclusão de tamanho e testadocom relação à atividade in vitro.Síntese de P602
mg do peptídeo precursor (P602 não-PEGuilado) e 223 mgde metóxi-(poli)etilenoglicol/ maleimido-propionamida (Chirotech TechnologyLtda., Reino Unido) com um peso molecular médio de 30.000 Daltons sãodissolvidos em 2 mL de tampão de NH4Ac a 100 mM contendo EDTA a 10mM (pH de 6,8) e a reação é deixada processar durante 4 h. 132 mg do pro-duto são obtidos como um pó Iiofilizado após purificação através de RP-HPLC preparativa. O agonista peptídico PEGuiIado é caracterizado atravésde RP-HPLC e HPLC por exclusão de tamanho e testado com relação à ati-vidade in vitro.
Exemplo 9 - PEGuilação via acilação sobre a cadeia lateral de Lisina:
De forma a obter a PEGuilação sítio-específica de agonistaspeptídicos seletivos do receptor de VPAC2, todos os resíduos de Lys sãotrocados por resíduos de Arg1 exceto quanto a resíduos de Lys onde PEGui-lação é pretendida. Uma molécula de PEG a qual pode ser usada é mPEG-SBA-20K (Nektar, Lote N0: PT-04E-11). A reação de PEGuilação é, de prefe-rência, realizada em temperatura ambiente durante 2-3 horas. O peptídeo épurificado através de HPLC preparativa.Exemplo 10 - PEGuilação via reação de Pictet-Spengler:
Para que PEGuilação via reação de Pictet-Spengler ocorra, umresíduo de Trp com sua amina livre é necessário incorporar a molécula dePEG sobre o agonista peptídico seletivo do receptor de VPAC2. Para aco-plar um resíduo de Trp sobre a cadeia lateral do resíduo de Lys. A SAR ex-tensiva indica que essa modificação não altera as propriedades do peptídeoprecursor em termos de sua potência e seletividade in vitro.
PEG com um aldeído funcional, por exemplo mPEG2-BUTYRALD-40K (Nektar, EUA), é usado para a reação. A PEGuilação sítio-específica envolve a formação um anel de tetracarbolina entre o PEG e opeptídeo. PEGuilação é conduzida em ácido acético glacial em temperaturaambiente durante 1 a 48 horas. Um excesso molar de 1 a 10 do PEG aldeídoé usado na reação. Após remoção de ácido acético, o agonista peptídicoPEGuilado do receptor de VPAC2 é isolado através de RP-HPLC preparati-va.
Síntese de P535
27,7 mg do peptídeo precursor (P535 não-PEGuilado) e 590 mgde mPEG2-BUTYRALD-40K são dissolvidos em 3 mL de ácido acético e areação é deixada processar durante 2 dias. O produto é isolado através deRP-HPLC preparativa para proporcionar 94 mg do agonista peptídico PEGui-lado como um pó liofilizado. O agonista peptídico PEGuiIado é caracterizadoatravés de RP-HPLC e HPLC por exclusão de tamanho e testado in vitro.Síntese de P557
23 mg do peptídeo precursor (P557 não-PEGuilado) e 460 mgde mPEG2-BUTYRALD-40K são dissolvidos em 3 mL de ácido acético e areação é deixada processar durante 2 dias. O produto é isolado através deRP-HPLC preparativa para proporcionar 50 mg do agonista peptídico PEGui-lado como um pó liofilizado. O agonista peptídico PEGuiIado é caracterizadoatravés de RP-HPLC e HPLC por exclusão de tamanho e testado in vitro.
Outras modificações da presente invenção serão evidentes paraaqueles versados na técnica sem se desviar do escopo da invenção.Listagem de Seqüências
<110> Eli Lilly and Company
Alsina-Fernandez, JorgeZhang, LianshanBokvist, Bengt Krister
<120> "AGONISTAS SELETIVOS PEPTÍDICOS DO RECEPTOR DE VPAC2, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA E USO DOS REFERIDOS AGONISTAS"
<130> X17287M WO<150> US 60/730,291<151> 2005-10-26<150> US 60/740,342<151> 2005-11-29<150> US 60/743,364<151> 2006-02-28<160> 148
<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptídi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<223> Aminoácido C-terminal pode ser amidado<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (1).. (12)
<223> Qualquer Xaa pode estar independentemente presente ou_ausen-te. se um Xaa é ausente, o proximo aminoácido presente na seqüênciaé o proximo aminoácido na extensão C-terminal.<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (1)..(1)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Gly,Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou K(CO(CH2)2SH)
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (2)..(2)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Gly,Arg, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-Iysine, or K(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (3)..(3)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Thr, Ser, Ala,Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lysine, orK(C0(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (4) . . (4)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser,Pro, His, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou K (CO (CH2) 2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (5)..(5)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser,Arg, Thr, Trp, Lys, Cys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ouK(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (6)..(6)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Gly,Ser, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou K(CO(CH2)2SH)<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (7)..(7)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ala,Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, Cys, epsilon-(L-triptophyl)-Iisina, ouK(CO{CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (8)..(8)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Ser, Ala, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou K(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARAC TERÍSTICA<222> (9) .. (9)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Ser, Ala, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou K(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (10)..(10)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Ser, Ala, Arg, Lys, His, Cys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ouK(C0(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (11)..(11)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser,Cys, His, Pro, Lys, Arg, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ouK(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (12)..(12)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é His,Ser, Arg, Lys, Cys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou K(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (13)..(13)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é His,Ser, Arg, Lys, Cys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou K(CO(CH2)2SH)<4 00> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10
<210> 2<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<223> Amino ácido C-terminal pode ser amidado<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (1)..(12)
<223> Qualquer Xaa pode estar independentemente presente ou ausen-te. se um Xaa é ausente, o proximo aminoácido presente na seqüênciaé o proximo aminoácido na extensão C-terminal.<220>
< 2 21> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (1) .. (1)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Gly,Cys, ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (2) . . (2)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Gly,Arg, Cys, ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (3) . . (3)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Thr, Ser, Ala,Cys, ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (4).. (4)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser,
Pro, His, Cys, ou Lys
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (5)..(5)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser,Arg, Thr, Trp, Lys, ou Cys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (6)..(6)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é GlyvSer, Cys, ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (7) . . (7)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ala,Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, ou Cys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (8).. (8)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Ser, Ala, Cys, ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (9)..(9)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Ser, Ala, Cys, ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (10)..(10)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Ser, Ala, Arg, Lys, His, ou Cys<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> (11) . . (11)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser,Cys, His, Pro, Lys, ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (12)..(12)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é His,Ser, Arg, Lys, ou Cys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (13)..(13)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é His,Ser, Arg, Lys, ou Cys<4 00> 2
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<223> Amino ácido C-terminal pode ser amidado<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (1)..(11)
<223> Qualquer Xaa pode estar independentemente presente ou ausen-te. se um Xaa é ausente, o proximo aminoácido presente na seqüênciaé o proximo aminoácido na extensão C-terminal<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (1) .. (1)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Glyou Cys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (2)..(2)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Glyou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (3) .. (3)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Proou Thr<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (4) . . (4)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser<220>
<221> MISC CARACTERÍSTICA<222> (5)..(5)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (6)..(6)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Gly
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (7)..(7)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ala
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (8) .. (8)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (9)..(9)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (10)..(10)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (11)..(11)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Serou Cys
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (12)..(12)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Cys
<400> 3Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10
<210> 4<211> 40<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista do receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (29)..(39)<223> Qualquer Xaa pode estar independentemente presente ou ausen-te. se um Xaa é ausente, o proximo aminoácido presente na seqüênciaé o proximo amninoácido na seqüência do agonista peptidico.<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 1<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é His,ou dHis<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 2<223> Xaa é dAla, Ser, Vai, Gly, Thr, Leu, dSer, Pro, ou Aib<220><221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> 3<223> Xaa é Asp ou Glu<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 4<223> Xaa é Ala, He, Tyr, Phe, Vai, Thr, Leu, Trp, Gly, dAla, Aib,ou N-metil alanina<220>
<221> MI SC_CARACTERÍSTICA<222> 5
<223> Xaa é Vai, Leu, Phe, lie, Thr, Trp, Tyr, dVal, Aib, ou N-methyl valine<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 6
<223> Xaa é Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp, ou Tyr<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 8
<223> Xaa é Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg, ou Tyr<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> 9
<223> Xaa é Asn, Gln, Asp, Glu, Ser, Cys, Lys, ou K(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 10
<223> Xaa é Tyr, Trp, Tyr(OMe), Ser, Cys, ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 12
<223> Xaa é Arg, Lys, Glu, hR, Orn, Lys (isopropyl), Aib, Cit, Ala,Leu, Gln, Phe, Ser, ou Cys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 13
<223> Xaa é Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys, Lys, ouK(CO(CH2)2SH)<220><221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> 14
<223> Xaa é Argj Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Lys (isopropyl), Phe, GlnAib, Cit, Ser, ou Cys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 15
<223> Xaa é Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, hR, Orn, Lys (isopropil), PheGln, Aib, K(Ac), Cit, Ser, Cys, K(W), ou K(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 16
<223> Xaa é Gln, Lys, Glu, Ala, hR, Orn, Lys (isopropil), Cit, SerCys, K(CO(CH2)2SH) , ou K(W)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 17
<223> Xaa é Vai, Ala, Leu, lie, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, CysK(CO(CH2)2SH), ou K(W)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 18
<223> Xaa é Ala, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), K(W), Abu, ou Nle<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 20
<223> Xaa é Lys, Gln, hR, Arg, Ser, His, Orn, Lys (isopropil), AlaAib, Trp, Thr, Leu, He, Phe, Tyr, Vai, K(Ac), Cit, CysK(CO(CH2)2SH), ou K(W)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 21
<223> Xaa é Lys, His, Arg, Ala, Phe, Aib, Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac)Cit, Ser, Cys, Vai, Tyr, He, Thr, Trp, K(W), ou K (CO (CH2) 2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 22
<223> Xaa é Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, lie, Vai, Tyr(OMe), Ala, AibSer, Cys, Lys, K(W), ou K(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 23
<223> Xaa é Leu, Phe, lie, Ala, Trp, Thr, Vai, Aib, Ser, Cys, LysK(W), ou K(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 24
<223> Xaa é Gln, Glu, Asn, Ser, Cys, Lys, K (CO (CH2) 2SH) , ou K(W)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 25
<223> Xaa é Ser, Asp, Phe, lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Gln, Asn, TyrAib, Glu, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH) , ou K(W)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 26
<223> Xaa é lie, Leu, Thr, Vai, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys, Lys,K(CO(CH2)2SH), ou K(W)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 27
<223> Xaa é Lys, hR, Arg, Gln, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie,Met, Asn, Pro, Ser, Thr, Vai, Trp, Tyr, Lys (isopropil) , Cys, Leu,Orn, dK, K(W), ou K(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 28
<223> Xaa é Asn, Asp, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dLys,Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH), ou K(W)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 29
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Lys,Ser, Arg, Asn, hR, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Leu, Met, Pro,Gln, Thr, Vai, Trp, Tyr, Cys, Orn, Cit, Aib, K(W), ou K (CO (CH2) 2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 30
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Arg,Lys, lie, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln,Ser, Thr, Vai, Trp, Tyr, Cys, hR, Cit, Aib, Orn, K(W), ouK(CO(CH2)2SH)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 31
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Tyr,His, Phe, Thr,Cys, Ser, Lys, Gln, K(W), ou K(CO(CH2)2SH)
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 32
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser,Cys, ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 33
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Trp
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 34
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Cys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 35
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Glu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 36
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 37
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Gly<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 38
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Trp
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 39
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Cys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 40
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Arg<400> 4
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40
<210> 5<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidicodo receptor de VPAC2 PEGuilado<4 00> 5
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser1 5 10
<210> 6<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> (11).. (11)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 6
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser15 10
<210> 7<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<400> 7
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys1 5 10
<210> 8<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptídi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> (11)..(11)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 8
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys1 5 10
<210> 9<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<400> 9
Gly Arg Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptídi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado
<220>
<221> M0D_RES
<222> (11)..(11)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 10
Gly Arg Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado
<400> 11
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> (12)..(12)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 12
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado
<220>
<223> Amino ácido C-terminal pode ser amidado
<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA
<222> (1)..(9)
<223> Qualquer Xaa pode estar independentemente presente ou absen-te. Se um Xaa é ausente, é preferido que o proximo aminoácido pre-sente na seqüência é o proximo aminoácido na extensão C-terminal.<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (1)..(1)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser,Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-lisina<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (2)..(2)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Arg,Ser, homoarginine, Orn, His, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-
lisina, ou epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-Iisina
<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> (3)..(3)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Thr,Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-lisina<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (4)..(4)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Ser,Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou epsilon-(3prime-
mercaptoproprionil)-lisina<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (5).. (5)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Ser, Ala, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-lisina<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (6)..(6)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Ser, Ala, Arg, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-lisina<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (7) ... (7)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Pro,Ser, Ala, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-lisina<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (8)..(8)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é Lysepsilon-(L-triptophyl)-lisina, Pro, Cys, ou epsilon-(3prime
mercaptoproprionil)-lisina<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (9)..(9)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é K(EC16), Ser, Cys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou epsilon(3prime-mercaptoproprionil)-lisina<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (10)..(10)
<223> Xaa pode estar presente ou ausente. Se presente, Xaa é SerCys, Lys, epsilon-(L-triptophyl)-lisina, ou epsilon-(3prime
mercaptoproprionil)-lisina<400> 13
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10
<210> 14<211> 28<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 14
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln15 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn20 25
<210> 15<211> 27<212> PRT<213> Homo sapiens<220>
<221> M0D_RES<222> (27) . . (27)<223> AMIDAÇÃ0<4 00> 15
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu20 25
<210> 16
<211> 37
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> M0D_RES<222> (37) . . (37)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 16
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Gln
20 25 30
Arg Val Lys Asn Lys35
<210> 17<211> 29<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Synthetic sequence: VPAC2 receptor peptide agonist<220> <221> MOD_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi <220> <221> MOD_RES<222> (13, 15, 20, 28)<223> Aib <220> <221> MOD_RES<222> (21, , 29)<223> Orn <400> 17
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Arg Xaa Arg Xaa Gln 1 5 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Xaa Xaa20 25
<210> 18<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220><221> M0D_RES
<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 9
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SH)<400> 18
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Xaa Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 19<211> 29<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptídico do receptor de VPAC2<220><221> M0D_RES
<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> MISC CARACTERÍSTICA<222> 28<223> Xaa é K(W)<400> 19
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa20 25
<210> 20<211> 28<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220><221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> MOD_RES<222> (12, 27, 28)<223> Orn<220><221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> 21<223> Xaa é K(CO(CH2)2SH)<400> 20
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 21<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> 20
<223> Xaa é K(C0(CH2)2SH)<400> 21
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 22<211> 28<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi
<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<400> 22
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln
15 10 15
Val Cys Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa
20 25
<210> 23
<211> 28
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi
<220>
<221> MOD RES<222> (20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<400> 23
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Cys Gln15 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 24<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<400> 24
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 25<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 23)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<400> 25
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 26<211> 28<212 > PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<400> 26
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 27<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 27
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 28<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<400> 28
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 29<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptídico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 23, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<4 00> 29
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 30<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220><221> MOD_RES<222> (10) . . (10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 23)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<4 00> 30
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 31<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de<220>
<221> MOD_RES<222> (10).. (10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 31
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa15 20 25
<210> 32<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 23, 25)<223> Aib<220><221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 32
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 33<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10) .. (10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 23)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<400> 33
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 34<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220> .
<221> MOD_RES<222> (20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 15<223> Xaa é K(W)<4 00> 34
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 35<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista peptídico do receptor de VPAC2<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 24<223> Xaa é K(W)<400> 35
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 36<211> 28<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista peptídico do receptor de VPAC2<220><221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 17<223> Xaa é K(W)<400> 36
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Xaa Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 37<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de<220>
<221> M0D_RES<222> (10).. (10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 15
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SH)<400> 37
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa
20 25
<210> 38
<211> 28
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 27, 28)
<223> Orn<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 21<223> Xaa é K(W)<400> 38
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 39<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES<222> . (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 27, 28)<223> Orn<400> 39
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Cys Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 40<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 40
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 41<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28) <223> Orn <220> <221> MISC CARACTERÍSTICA <222> 26 <223> Xaa é K(W) <4 00> 41 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa 1 5 10Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 42 <211> 29 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Seqüência Sintética: agonista peptidico <220> <221> MOD_RES <222> (10) . . (10) <223> Metóxi <220><221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220><221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 42
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Cys Xaa20 25
<210> 43<211> 28<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20, 25)
<223> Aib<220>
<221> MOD RES<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> M0D_RES
<222> (19)..(19)
<223> Abu
<400> 43
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln
15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Cys Xaa Xaa
20 25
<210> 44
<211> 28
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2
<220>
<221> M0D_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi
<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20, 25)
<223> Aib
<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> M0D_RES
<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 44
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
5 Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 45<211> 28<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES
<222> (20, 25)
<223> Aib<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 45
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Cys Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 46<211> 39<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acylation<220>
<221> M0D_RES<222> (10) . . (10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> 21
<223> Xaa é K(WPEG40K)<220>
<221> M0D_RES<222> (39)
<223> AMIDAÇÃO<400> 46His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 47<211> 40<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista do receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> M0D_RES<222> 1<223> C6 acylation<220><221> M0D_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi<220><221> M0D_RES<222> (13, 15, 20, 28)<223> Aib<220><221> M0D_RES<222> (21, 29)<223> Orn<220><221> M0D_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 40<223> Cys(PEG4 0Κ)<400> 47
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Arg Xaa Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Xaa Xaa Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35 40
<210> 48<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acylation<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 9
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG40K)<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 48
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Xaa Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 49<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acylation<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 28
<223> Xaa é K(WPEG40K)<220>
<221> MOD_RES<222> 40<223> AMIDAÇÃO<400> 49
His Ser Asp Ala Val1 5
Val Ala Ala Xaa Xaa20
Ser Ser Gly Ala Pro
35 40
<210> 50<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 21<223> Cys(PEG4 0Κ)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 50
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Cys Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 51<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista do receptor de VPAC2 PEGui<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> C6 acilação
<220>
<221> MOD_RES<222> (10) .. (10)<223> Metóxi<220> <221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES <222> (12, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 21
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG4 0K)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO <400> 51
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu. Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 52<211> 39< 212 > PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 21
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 52
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 53<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10) . . (10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 20
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG4ÒK)<220>
<221> MOD RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 53His Ser Asp Ala1
Val Ala Ala Xaa20
Ser Gly Ala Pro35
<210> 54<211> 39<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln5 10 15
Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser25 30
Pro Pro Ser<221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> 18<223> Cys(PEG4 OK)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 54His Ser Asp Ala1
Val Cys Ala Xaa20
Ser Gly Ala Pro35
<210> 55<211> 39<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (20)<223> Aib
Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln5 10 15
Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser25 30
Pro Pro Ser<220> <221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220> <221> MIS C_CARAC T E R íSTICA<222> 15<223> Cys(PEG40K)<220> <221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 55
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Cys Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 56<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 15
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG4OK)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 56
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 57<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20, 23)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39<223> Cys(PEG40K)<220><221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃ0<400> 57
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 58<211> 39<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39<223> Cys(PEG40K)<220>
<221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 58
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35
<210> 59
<211> 39
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> C6 acilação
<220>
<221> M0D_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi
<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20, 25)
<223> Aib
<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> M0D_RES
<222> (19)..(19)
<223> Abu
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 39
<223> Cys(PEG4 OK)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 59
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 60<211> 40<212> PRT15 <213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 23)<223> Aib
<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (39, 40)<223> Cys(PEG20K)<220><221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 60
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys35 40
<210> 61<211> 40<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> M0D_RES<222> 1<223> C6 acilação<220><221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> MOD RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (39, 40)<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 61
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys
35 40
<210> 62<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220> <221> MOD_RES
<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19) <223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (39, 40)<223> Cys(PEG20K) <220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 62
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys 35 4 0
<210> 63<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 23, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (39, 40)<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> M0D_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 63
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys
35 40
<210> 64<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10).. (10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 23)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (39, 40)<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 64
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys
35 40
<210> 65<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220> <221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220> <221> MISC CARACTERÍSTICA<222> (39, 40)<223> Cys(PEG20K)<220> <221> M0D_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 65
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys
35 40
<210> 66<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> MOD_RES
<222> (15, 20, 23, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (39, 40)<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 66
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys30 35 40
<210> 67<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 15
<223> Xaa é K(WPEG40K)
<220>
<221> M0D_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 67
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 68<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10) .. (10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 24
<223> Xaa é K(WPEG40K)<220>
<221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 68
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 69<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC CARACTERÍSTICA<222> 17
<223> Xaa é K(WPEG40K)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)
<223> AMIDAÇÃO<4 00> 69
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Xaa Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 70<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220><221> M0D_RES
<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220> <221> MISC CARACTERÍSTICA<222> 26<223> Xaa é K(WPEG4OK)<220> <221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 70
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 71<211> 40<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> M0D_RES<222> 1<223> C6 acilação<220><221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20, 25)
<223> Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 29)
<223> Orn<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 28
<223> Cys(PEG4 0Κ)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 71
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro
25 20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 72<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10).. (10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 26<223> Cys(PEG40K)<220>
<221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 12
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xas Cys Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 73<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20, 25)
<223> Aib<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 17
<223> Cys(PEG40K)<220>
<221> MOD_RES<222> (19).. (19)<223> Abu<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 73
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 74<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (20, 25)<223> Aib<220><221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220> <221> MISC CARACTERÍSTICA<222> 15<223> Cys(PEG40K)<220> <221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220> <221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 74
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Cys Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 75<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES
<222> (10) .. (10)
<223> Metóxi
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA
<222> 13
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 75
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Xaa Arg Xaa Gln15 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser25 20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 76<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuiiado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10).. (10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 24
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 76
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 77<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10) .. (10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 19
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> MISC CARACTERÍSTICA<222> 39
<223> Cys(PEG20K)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 77
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln
1 5 10 15
Val Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 78
<211> 39
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado
<220>
<221> M0D_RES
<222> 1
<223> C6 acilação
<220>
<221> M0D_RES
<222> (10).. (10)
<223> Metóxi
<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib
<220><221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220> <221 > MISC_CARACTERÍSTICA<222> 25<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39<223> Cys(PEG20K)<220> <221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 78
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 79<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)<223> Metóxi
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 26
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> MIS C_CARAC T ER ί S TIC A<222> 39<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 7 9
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 80<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 28
<223> Xaa é K (CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 40
<223> Cys(PEG20K)
<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 80
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35 40
<210> 81<211> 39<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> MOD_RES<222> 1<223> C6 acilação<220><221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220><221> MISC CARACTERÍSTICA<222> (24, 39)<22 3> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 81
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Cys Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 82<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> MOD RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220> <221> MISC CARACTERÍSTICA<222> (26, 39)<223> Cys(PEG20K)<220> <221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 82
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Cys Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 83<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10) . . (10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (28, 40)<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)
<223> AMIDAÇÃO<400> 83
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
20 Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35 40
<210> 84<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: peptideo de referência utilização paracálculo de porcentagem da identidade de seqüência<220>
<221> MOD RES<222> 1<223> C6 acilação<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃ0<400> 84
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 85<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptídi-co do receptor de VPAC2 PEGuiladoreceptor peptide agonist<400> 85
Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro1 5
<210> 86<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidico do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> (7)<223> AMIDAÇÃO<400> 86
Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro1 5
<210> 87<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidico do receptor de VPAC2 PEGuilado<400> 87
Ser Ser Thr Ser Pro Arg Pro Pro Ser Ser1 5 10
<210> 88<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> (10)<223> AMIDAÇÃO<400> 88
Ser Ser Thr Ser Pro Arg Pro Pro Ser Ser1 5 10
<210> 89<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptídi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (8) .. (8)
<223> Xaa é epsilon-(L-triptophyl)-Iisina<400> 89
Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro Xaa1 5
<210> 90<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptídi-co do receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> MISC CARACTERÍSTICA<222> (8) . . (8)<223> Xaa é epsilon-(L-triptophyl)<220> <221> MOD_RES<222> (8)<223> AMIDAÇÃO<400> 90
Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro Xaa1 5
<210> 91<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidico do receptor de VPAC2 PEGuilado<400> 91
Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro Cys1 5
<210> 92<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: extensão C-terminal do agonista peptidico do receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> (8)<223> AMIDAÇÃO<400> 92Ser Arg Thr Ser Pro Pro Pro Cys1 5
<210> 93<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Sequencia Sintética: Modificação N-terminal para o agonistapeptidico do receptor de VPAC2 PEGuilado<400> 93
Ser Trp Cys Glu Pro Gly Trp Cys Arg1 5
<210> 94<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220><221> M0D_RES
<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC CARACTERÍSTICA<222> (18)
<223> Xaa é epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-lisina<4 00> 94
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 95<211> 29<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptídico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 95
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa20 25
<210> 96<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220><221> MOD_RES
<222> (10)..(10)<223> Hetóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 96
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Cys Xaa Xaa20 25
<210> 97<211> 29<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (28)
<223> Xaa é epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-Iisina<400> 97
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa20 25
<210> 98<211> 29<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> (28)
<223> Xaa é epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-Iisina<400> 98
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa20 25
<210> 99<211> 28<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (15)
<223> Xaa é epsilon-(L-triptophyl)-Iisina<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 99
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 100<211> 29<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<400> 100
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys20 25
<210> 101<211> 29<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista peptídico do receptor de<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<400> 101
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys20 25
<210> 102<211> 29<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<4 00> 102
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys20 25
<210> 103
<211> 28
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi<220><221> MOD_RES
<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 103
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25
<210> 104<211> 29<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 104
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Cys Xaa20 25
<210> 105<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220><221> MOD_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi <220> <221> MOD_RES
<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES <222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19) <223> Abu<400> 105
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa 20 25
<210> 106<211> 29<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)
<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19) . . (19)<223> Abu<400> 106
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Cys20 25
<210> 107<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de<220>
<221> M0D_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 107
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25
<210> 108<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES
<222> (10, 22)
<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn<220>
<221> M0D_RES
<222> (19)..(19)
<223> Abu<400> 108
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa 20 25
<210> 109
<211> 29
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2
<220>
<221> M0D_RES
<222> (10, 22)
<223> Metóxi
<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib
<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 29)
<223> Orn
<220>
<221> M0D_RES
<222> (19)..(19)
<223> Abu
<400> 109
His Ser Asp. Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa 20 25<210> 110<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (18)<223> Abu<400> 110
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa20 25
<210> 111<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERlSTICA<222> (17)
<223> Xaa é epsilon-(3prime-mercaptoproprionil)-Iisina<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<400> 111
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 112<211> 28<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista peptidico do receptor de VPAC2<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (17)
<223> Xaa é epsilon-(L-triptophyl)-Iisina<400> 112
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa20 25
<210> 113<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 18
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG4 0K)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 113
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Val Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35
<210> 114<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10) .. (10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 18
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 114
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 115<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220><221> M0D_RES
<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 28<223> Cys(PEG4 OK)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 115
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 116<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220> <221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220> <221> MISC CARACTERÍSTICA<222> 26<223> Cys(PEG4 0K)<220> <221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 116
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Cys Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 117<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<22 3> Metóxi<220><221> MOD_RES
<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> . MISC_CARACTERÍSTICA<222> 28
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 40<223> Cys(PEG20K)<220><221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 117
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro20 25 30Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35 40
<210> 118
<211> 40
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 29)
<223> Orn
< 2 2 0 >
<221> M0D_RES
<222> (19)..(19)
<223> Abu<220>
<221> MI SC_CARACTERÍSTICA
<222> 28
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 40<223> Cys(PEG20K)<220><221> HOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 118
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35 40
<210> 119<211> 40<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> M0D_RES<222> 1<223> C6 acilação<220><221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220><221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19) . . (19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 28, 40<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 119
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35 40
<210> 120<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES
<222> (20, 25)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA<222> 15
<223> Xaa é K(WPEG40K)<220><221> MOD_RES
<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MOD_RES<222> (39)
<223> AMIDAÇÃ0<4 00> 120
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser<210> 121<211> 40<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10).. (10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 29<223> Cys(PEG40K)<220>
<221> M0D_RES<222> (40)
<223> AMIDAÇÃO<400> 121His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 122<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 29, 40<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 122
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35 4 0
<210> 123<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10).. (10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220> <221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 29<223> Cys(PEG4 0K)<220> <221> M0D_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 123
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Cys Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40
<210> 124<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1<223> C6 acilaçâo<220>
<221> MOD RES<222> (10)..(10)
<22 3> Metóxi<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Abu
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 29
<223> Cys(PEG4 0Κ)<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 124
His Ser Asp Ala Val Phe Thr
1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro35 40
<210> 125<211> 40<212> PRT
Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln
10 15
Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys Gly Gly Pro25 30
Ser40<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 29, 40<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)
<223> AMIDAÇÃO<4 00> 125His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Cys Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35 40
<210> 126<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39, 40<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 126
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys
35 40
<210> 127<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 29)
<223> Orn
<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 28<223> Cys(PEG4 OK)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 127
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 128<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES
<222> (10, 22)
<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20, 25)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 17
<223> Cys(PEG4 0Κ)<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Abu<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)
<223> AMIDAÇÃO<4 00> 128
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
30 Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser<210> 129<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> .M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 29, 40<223> Cys(PEG20K)<220><221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 129
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Cys Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35 40
<210> 130<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn<220> <221> M0D_RES<222> (19).. (19)<223> Abu<220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39, 40<223> Cys(PEG20K)<220> <221> M0D_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 130
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys
35 40
<210> 131<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 29)
<223> Orn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Abu
<220>
<221> MISC_CARACTERÍ STICA
<222> 28
<223> Cys(PEG4 OK)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 131
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro 20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40
<210> 132
<211> 39
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES
<222> (10, 22)
<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib
<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 17<223> Cys(PEG40K)<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 132
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 133<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10, 22)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 28, 40<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 133
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35 40
<210> 134<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> M0D_RES<222> (18)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39, 40<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)
<223> AMIDAÇÃO<400> 134
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys
35 40
<210> 135 <211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado
<220>
<221> MOD_RES<222> 1<223> C6 acilação<220><221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> MOD_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220><221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220><221> MISC_CARACTERtSTICA<222> 17<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220><221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39<223> Cys(PEG20K)<220><221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 135
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 136<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 17
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG4OK)<220>
<221> MOD RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 136His Ser Asp Ala1
Xaa Ala Xaa Xaa20
Ser Gly Ala Pro35
<210> 137<211> 39<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln5 10 15
Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser25 30
Pro Pro Ser<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 17
<223> Xaa é K(WPEG40K)<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 137
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 138<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação144
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)<22 3> Metóxi
<22 0>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 39
<223> Xaa é K(WPEG40K)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 138
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Xaa35
<210> 139<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 9
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 139
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Xaa Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210> 140
<211> 39
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES
<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES
<222> (10).. (10)
<223> Metóxi
<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)
<223> Aib<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> 15
<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220>
<221> M0D_RES
<222> (39)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 140
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35 <210> 141<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> .1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 25)<223> Aib<220>
<221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 29)<223> Orn<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 28, 40<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)<223> AMIDAÇÃO<400> 141
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Cys Xaa Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35 40
<210> 142<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220> <221> M0D_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 17<223> Cys(PEG20K)<220> <221> M0D_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 142
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Cys Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 143<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação
<220>
<221> M0D_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES<222> (15, 20)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 17, 39<223> Cys(PEG20K)<220>
<221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<4 00> 143
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Cys Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 144<211> 40<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20, 25)
<223> Aib<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39, 40<223> Cys(PEG30K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)
<223> AMIDAÇÃO<400> 144
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys<210> 145<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> M0D_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> M0D_RES<222> (10) . . (10)<223> Metóxi<220>
<221> M0D_RES<222> (15, 20, 23, 25)<223> Aib<220>
<221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220>
<221> MOD_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39
<223> Xaa é K(WPEG40K)<220><221> MOD_RES
<222> (39)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 145
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Xaa 35
<210> 146
<211> 39
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado
<220>
<221> M0D_RES
<222> 1
<223> C6 acilação
<220>
<221> M0D_RES
<222> (10) . . (10)
<223> Metóxi
<220>
<221> M0D_RES
<222> (15, 20, 25)
<223> Aib
<220>
<221> M0D_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn<220> <221> MISC CARACTERÍSTICA<222> 17, 39<223> Cys(PEG20K)<220> <221> MOD_RES<222> (19)·.(19)<223> Abu<220> <221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 146
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Cys Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys35
<210> 147<211> 39<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220>
<221> MOD_RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Metóxi<220><221> MOD_RES<222> (15)<223> Aib<220><221> MOD_RES<222> (12, 21, 27, 28)<223> Orn<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 20<223> Xaa é K(CO(CH2)2SPEG20K)<220><221> MOD_RES<222> (39)<223> AMIDAÇÃO<400> 147
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln1 5 10 15
Val Ala Ala Xaa Xaa Tyr Leu Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35
<210> 148<211> 40<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência Sintética: agonista receptor de VPAC2 PEGuilado<220><221> MOD RES<222> 1
<223> C6 acilação<220>
<221> MOD_RES
<222> (10).. (10)
<223> Metóxi<220>
<221> MOD_RES
<222> (15, 20, 23)
<223> Aib<220>
<221> MOD_RES
<222> (12, 21, 27, 28)
<223> Orn
<220>
<221> M0D_RES<222> (19)..(19)<223> Abu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> 39, 40<223> Cys(PEG30K)<220>
<221> MOD_RES<222> (40)
<223> AMIDAÇÃ0<4 00> 148
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Glu Gln Tyr Thr Xaa Leu Arg Xaa Gln15 10 15
Leu Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser Ile Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Cys35 40

Claims (17)

1. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2, caracte-rizado pelo fato de que compreende uma seqüência selecionada de:SEQ ID NO: 17 HSDAVFTEQY(OMe)TRAibRAibQLAAAibOrnY(OMe)LQSIKAibOrn;SEQ ID NO: 18 HSDAVFTEK(CO(CH2)2SH)Y(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 19 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnK(W)Orn;SEQ ID NO: 20 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(CO(CH2)2SH)YLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 21 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAK(CO(CH2)2SH)OrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 22 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVCAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 23 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRCQVAAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 24 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 25 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYAibQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 26 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 27 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAbuAibOrnYLQAibIOmOrn;SEQ ID NO: 28 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 29 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYAibQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 30 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLFRAibQLAAbuAibOrnYAibQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 31 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOm YLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 32 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYAibQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 33 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYAibQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 34 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(W)QVAAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 35 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLK(W)SIOrnOrn;SEQ ID NO: 36 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(W)AAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 37 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(CO(CH2)2SH)QVAAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 38 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibK(W)YLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 39 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibCYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 40 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 41 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSK(W)OrnOrn;SEQ ID NO: 42 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAiblOrnCOrn;SEQ ID NO: 43 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibCOrnOrn;SEQ ID NO: 44 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnYLQAiblOrnOrn;SEQ ID NO: 45 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRCQLAAbuAibOrnYLQAiblOrnOrn;SEQ ID NO: 94 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVK(CO(CH2)2SH)AAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 95 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnCOrn;SEQ ID NO: 96 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSCOrnOrn;SEQ ID NO: 97 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAibIOrnK(CO(CH2)2SH)Orn;SEQ ID NO: 98 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQSIOrnK(CO(CH2)2SH)Orn;SEQ ID NO: 99 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRK(W)QLAAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 100 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAAibOrnYLQSIOrnOrnC;SEQ ID NO: 101 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQVAAAibOrnYLQSIOrnOrnC;SEQ ID NO: 102 HSDAVFTEQY(0Me)T0mLRAibQLAAbuAib0mYLQSI0m0mC;SEQ ID NO: 103 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 104 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnCOm;SEQ ID NO: 105 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnY(OMe)LQAibIOrnOrn;SEQ ID NO: 106 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnYLQAiblOrnOrnC;SEQ ID NO: 107 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 108 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQCAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 109 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAAbuAibOrnY(OMe)LQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 110 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQLAbuAAibOrnYLQSIOrnOrn;SEQ ID NO: 111 HSDAVFTEQY(OMe)TOmLRAibQK(CO(CH2)2SH)AAbuAibOrnYLQAibIOrnOrn; eSEQ ID NO: 112 HSDAVFTEQY(OMe)TOrnLRAibQK(W)AAbuAibOrnYLQAiblOrnOrn;e uma extensão C-terminal em que o N-término da extensão C-terminal éligada ao C-término da seqüência peptídica e em que a extensão C-terminalcompreende uma seqüência de aminoácido da Fórmula:Xaa1Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12Fórmula 3 (SEQ ID NO: 3)em que:Xaa1 é: Gly, Cys ou está ausente;Xaa2 é: Gly, Arg ou está ausente;Xaa3 é: Pro, Thr ou está ausente;Xaa4 é: Ser ou está ausente;Xaa5 é: Ser ou está ausente;Xaa6 é: Gly ou está ausente;Xaa7 é: Ala ou está ausente;Xaa8 é: Pro ou está ausente;Xaa9 é: Pro ou está ausente;Xaa10 é: Pro ou está ausente;Xaa11 é: Ser, Cys ou está ausente; eXaa12 é: Cys ou está ausente;em que pelo menos cinco de Xaa1 a Xaa12 da extensão C-terminal estãopresentes e em que se Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xa-a9, Xaa10 ou Xaa11 está ausente, o proximo aminoácido presente a jusante éo proximo aminoácido na extensão C-terminal e em que o aminoácido C-terminal pode ser amidado,e em que:o agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Cys o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG, ouo agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Lys o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ouo agonista peptídico compreende pelo menos um K(W) o qual é covalente-mente ligado a uma molécula de PEG ouo agonista peptídico compreende pelo menos um K(CO(CH2)2SH) o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ouo aminoácido carbóxi-terminal do agonista peptídico é covalentemente ligadoa uma molécula de PEG ouuma combinação dos mesmos.
2. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acor-do com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a extensão C-terminal é selecionada de:<table>table see original document page 241</column></row><table>
3. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acor-do com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a extensão C-terminal é SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
4. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acor-do com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que há pelo menos umamolécula de PEG covalentemente ligada a um resíduo na extensão C-terminal.
5. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato deque a molécula de PEG é ramificada.
6. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato deque a molécula de PEG é linear.
7. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato deque cada molécula de PEG tem 20.000, 30.000, 40.000 ou 60.000 daltonsde peso molecular.
8. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato deque ainda compreende uma modificação N-terminal no N-término do agonis-ta peptídico, em que a modificação N-terminal é selecionada de:(a) adição de D-histidina, isoleucina, metionina ou norleucina;(b) adição de um peptídeo compreendendo a seqüência Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg (SEQ ID NO: 93) em que a Arg é ligada ao N-término do agonista peptídico;(c) adição de C1-C16 alquila opcionalmente substituída por um oumais substituintes independentemente selecionados de arila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3;(d) adição de -C(O)R1 em que R1 é uma Ci-C16 alquila opcio-nalmente substituída por um ou mais substituintes independentemente sele-cionados de arila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio, -SH e -CF3; uma arilaopcionalmente substituída por um ou mais substituintes independentementeselecionados de C1-C 6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi,-NH2, -OH, halogênio e -CF3; uma aril C1-C4 alquila opcionalmente substituí-da por um ou mais substituintes independentemente selecionados de CrC 6alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e-CF3; -NR2R3 em que R2 e R3 são, independentemente, hidrogênio, C1-C6alquila, arila ou aril C1-C4 alquila; -OR4 em que R4 é C1-C16 alquila opcional-mente substituída por um ou mais substituintes independentemente selecio-nados de arila, Ci-C6 alcóxi, -NH2, -OH1 halogênio e -CF3, arila opcionalmen-te substituída por um ou mais substituintes independentemente selecionadosde C1-C 6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH,halogênio e -CF3 ou aril C1-C4 alquila opcionalmente substituída por um oumais substituintes independentemente selecionados de C1-C 6 alquila, C2-C6alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 alcóxi, -NH2, -OH, halogênio e -CF3; ou 5-pirrolidin-2-ona;(e) adição de -SO2R5 em que R5 é arila, aril CrC4 alquila ou C1-C16 alquila;(f) formação de um grupo succinimida opcionalmente substituídopor C1-C6 alquila ou -SR6, em que R6 é hidrogênio ou CrC 6 alquila;(g) adição de sulfoxido de metionina;(h) adição de ácido biotinil-6-amino-hexanoico (ácido 6-aminocaproico); e(i) adição de -C(=NH)-NH2.
9. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de acor-do com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a modificação N-terminal é a adição de um grupo selecionado de: acetila, propionila, butirila,pentanoíla, hexanoíla, metionina, sulfoxido de metionina, 3-fenilpropionila,fenilacetila, benzoíla, norleucina, D-histidina, isoleucina, 3-mercaptopropionila, ácido biotinil-6-amino-hexanoico (ácido 6-aminocaproico) e -C(=NH)-NH2.
10. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de a-cordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a modificação N-terminal é a adição de acetila ou hexanoíla.
11. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de a-cordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreendeuma seqüência de aminoácido selecionada de:<table>table see original document page 243</column></row><table><table>table see original document page 244</column></row><table><table>table see original document page 245</column></row><table><table>table see original document page 246</column></row><table><table>table see original document page 247</column></row><table><table>table see original document page 248</column></row><table>
12. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2, carac-terizado pelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido sele-cionada de:<table>table see original document page 249</column></row><table><table>table see original document page 250</column></row><table>
13. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2, carac-terizado pelo fato de que compreende uma seqüência da Fórmula:Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Thr-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Xaa12-Xaa13- Xa-a-14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18 -Abu-Xaa20-Xaa21-Xaa22- Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40Fórmula 4 (SEQ ID NO: 4)em que:Xaa1 é: His, dH ou está ausente;Xaa2 é: dA, Ser, Val, Gly, Thr, Leu, dS, Pro ou Aib;Xaa3 é: Asp ou Glu;Xaa4 é: Ala, lle, Tyr, Phe, Val, Thr, Leu, Trp, Gly, dA, Aib ou NMeA;Xaa5 é: Val, Leu, Phe, lle, Thr, Trp, Tyr, dV, Aib ou NMeV;Xaa6 é: Phe, lle, Leu, Thr, Val, Trp ou Tyr;Xaa8 é: Asp, Glu, Ala, Lys, Leu, Arg ou Tyr;Xaa9 é: Asn, Gln, Asp, Glu, Ser, Cys, Lys ou K(CO(CH2)2SH);Xaa10 é: Tyr, Trp, Tyr(OMe), Ser, Cys ou Lys;Xaa12 é: Arg, Lys, Glu, hR, Orn, Lys (isopropila), Aib, Cit, Ala, Leu, Gln, Phe,Ser ou Cys;Xaa13 é: Leu, Phe, Glu, Ala, Aib, Ser, Cys, Lys ou K(CO(CH2)2SH);Xaai4 é: Arg, Leu, Lys, Ala, hR, Orn, Lys (isopropila), Phe, Gln, Aib, Cit, Serou Cys;Xaa15 é: Lys, Ala, Arg, Glu, Leu, hR, Orn, Lys (isopropila), Phe, Gln, Aib,K(Ac), Cit, Ser, Cys, K(W) ou K(CO(CH2)2SH);Xaa16 é: Gln, Lys, Glu, Ala, hR, Orn, Lys (isopropila), Cit, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa17 é: Val, Ala, Leu, lle, Met, Nle, Lys, Aib, Ser, Cys, K(CO(CH2)2SH) ouK(W);Xaa18 é: Ala, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH), K(W), Abu ou Nle;Xaa20 é: Lys, Gln, hR, Arg, Ser, His, Orn, Lys (isopropila), Ala, Aib, Trp, Thr,Leu, lle, Phe, Tyr, Val, K(Ac), Cit, Cys, K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa21 é: Lys, His1 Arg1 Ala, Phe1 Aib1 Leu, Gln, Orn, hR, K(Ac), Cit, Ser, Cys,Val, Tyr, lle, Thr, Trp, K(W) ou K(CO(CH2)2SH);Xaa22 é: Tyr, Trp, Phe, Thr, Leu, lle, Val, Tyr(OMe), Ala, Aib, Ser, Cys, Lys,K(W) ou K(CO(CH2)2SH);Xaa23 é: Leu, Phe, lie, Ala, Trp, Thr, Vai, Aib, Ser, Cys, Lys, K(W) ouK(CO(CH2)2SH);Xaa24 é: Gln, Glu, Asn, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa2S é: Ser, Asp, Phe, lle, Leu, Thr, Val, Trp, Gln, Asn, Tyr, Aib, Glu, Cys,Lys, K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa26 é: lle, Leu, Thr1 Val, Trp, Tyr, Phe, Aib, Ser, Cys, Lys, K(CO(CH2)2SH)ou K(W);Xaa27 é: Lys, hR, Arg, Gln, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Met, Asn, Pro,Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Lys (isopropila), Cys, Leu, Orn, dK, K(W) ouK(CO(CH2)2SH);Xaa28 é: Asn, Asp, Gln, Lys, Arg, Aib, Orn, hR, Cit, Pro, dK, Ser, Cys,K(CO(CH2)2SH) ou K(W);Xaa29 é: Lys, Ser, Arg, Asn, hR, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lle, Leu, Met,Pro, Gln, Thr, Vai, Trp, Tyr, Cys, Orn, Cit, Aib, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou estáausente;Xaa30 é: Arg, Lys, lle, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Leu, Met, Asn, Pro, Gln,Ser, Thr, Vai, Trp, Tyr, Cys, hR, Cit, Aib, Orn, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou estáausente;Xaa31 é: Tyr, His, Phe, Thr, Cys, Ser, Lys, Gln, K(W), K(CO(CH2)2SH) ou es-tá ausente;Xaa32 é: Ser, Cys, Lys ou está ausente;Xaa33 é: Trp ou está ausente;Xaa34 é: Cys ou está ausente;Xaa3S é: Glu ou está ausente;Xaa36 é: Pro ou está ausente;Xaa37 é: Gly ou está ausente;Xaa3S é: Trp ou está ausente;Xaa3g é: Cys ou está ausente; eXaa40 é: Arg ou está ausenteem que se Xaa29, Xaa30, Xaa31, Xaa32, Xaa33, Xaa34, Xaa35l Xaa36l Xaa37,Xaa38 ou Xaa3g está ausente, o proximo aminoácido presente a jusante é oproximo aminoácido na seqüência do agonista peptídico e uma extensão C-terminal em que o N-término da extensão C-terminal éligada ao C-término do peptídeo de Fórmula 4 e em que a extensão C-terminal compreende uma seqüência de aminoácido da Fórmula:XaarXaaa-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaae-Xaa7-Xaae-Xaag-Xaa10-Xaai1-Xaai2Fórmula 3 (SEQ ID NO: 3) em que:Xaa1 é: Gly1 Cys ou está ausente;Xaa2 é: Gly1 Arg ou está ausente;Xaa3 é: Pro1 Thr ou está ausente;Xaa4 é: Ser ou está ausente; Xaa5 é: Ser ou está ausente;Xaa6 é: Gly ou está ausente;Xaa7 é: Ala ou está ausente;Xaa8 é: Pro ou está ausente;Xaa9 é: Pro ou está ausente; Xaa10 é: Pro ou está ausente;Xaa11 é: Ser, Cys ou está ausente; eXaa12 é: Cys ou está ausente;em que pelo menos cinco de Xaa1 a Xaa12 da extensão C-terminal estãopresentes e em que se Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xa- a9, Xaa10 ou Xaa11 está ausente, o proximo aminoácido presente a jusante éo proximo aminoácido na extensão C-terminal e em que o aminoácido C-terminal pode ser amidado,e em que;o agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Cys o qual é covalentemente ligado a uma molécula de PEG ouo agonista peptídico compreende pelo menos um resíduo de Lys o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ouo agonista peptídico compreende pelo menos um K(W) o qual é covalente-mente ligado a uma molécula de PEG ouo agonista peptídico compreende pelo menos um K(CO(CH2)2SH) o qual écovalentemente ligado a uma molécula de PEG ouo aminoácido carbóxi-terminal do agonista peptídico é covalentemente ligadoa uma molécula de PEG ouuma combinação dos mesmos.
14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e um ou mais diluentes,veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
15. Agonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 de a-cordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fatode que é para uso como um medicamento.
16. Uso de um agonista peptídico PEGuiIado do receptor deVPAC2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracte-rizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tra-tamento de diabetes não dependente de insulina ou diabetes dependente deinsulina.
17. Método de tratamento de diabetes não dependentes de insu-lina ou diabetes dependente de insulina em um paciente que precisa domesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administração de umagonista peptídico PEGuiIado do receptor de VPAC2 como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 13.
BRPI0617740-9A 2005-10-26 2006-10-24 agonistas seletivos peptìdicos do receptor vpac2, composição farmacêutica e uso dos referidos agonistas BRPI0617740A2 (pt)

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