KR101035086B1 - Gene encoding ornithine decarboxylase antizyme protein from Spodoptera litura and uses thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 담배거세미나방 (Spodoptera litura) 유래의 ODC Az (ornithine decarboxylase antizyme) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 숙주 세포를 상기 재조합 벡터로 형질전환시켜 숙주 세포 내의 ODC 단백질을 불활성화시키는 방법 및 ODC 단백질을 불활성화시킬 수 있도록 ODC Az 염기서열을 변경시키는 방법에 관한 것이다.The present invention is a tobacco giant seminar ( Spodoptera) litura ) ODC Az (ornithine decarboxylase antizyme) protein, a gene encoding the protein, a recombinant vector comprising the gene, a host cell transformed with the recombinant vector, a host cell transformed with the recombinant vector and a host cell The present invention relates to a method of inactivating an ODC protein in an organism and a method of altering an ODC Az sequence to inactivate an ODC protein.

담배거세미나방, ornithine decarboxylase antizyme, 효모, 녹아웃, 폴리아민류 Tobacco germinants, ornithine decarboxylase antizyme, yeast, knockout, polyamines

Description

담배거세미나방 유래의 ＯＤＣ Ａｚ 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도{Gene encoding ornithine decarboxylase antizyme protein from Spodoptera litura and uses thereof}Gene encoding ornithine decarboxylase antizyme protein from Spodoptera litura and uses approximately

본 발명은 담배거세미나방 유래의 ODC Az 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an ODC Az protein coding gene derived from tobacco gelatin moth and its use.

유해한 해충 및 병원균에 의한 농작물의 침해로 인한 식량난으로 인류는 생존까지도 위협받고 있다. 이러한 문제를 해결하고 나날이 진화되어 새롭게 등장하고 있는 해충 및 병원균으로부터 식물체를 보호하기 위한 다양한 방제법 중 가장 쉽고 간편한 식물병 방제법은 농약을 살포하는 것인데, 이는 맹독성이므로 유해 해충 및 병원균뿐만 아니라 주변 생태계 생물까지도 살상함으로써 생태계를 파괴시키고 토양 및 수질을 산성화시키는 등의 폐해가 있었다. 그에 따라 농약 살포 등의 화학적 방제수단 뿐만 아니라 식물의 환경 및 조건을 고려하여 무공해적인 생물학적 해충 방제기술의 개발에 대한 시급성과 필요성은 점차 증대되고 있다.Mankind is threatened even by food shortages caused by invasion of crops by harmful pests and pathogens. The easiest and most convenient way to control plant diseases is to spray pesticides, which are highly toxic, so that not only harmful pests and pathogens but also the surrounding ecosystem organisms can be solved. By killing, there have been harms such as destroying ecosystems and acidifying soil and water quality. As a result, the urgent need and necessity for the development of pollution-free biological pest control technology in consideration of the environment and conditions of plants as well as chemical control means such as spraying of pesticides are gradually increasing.

스퍼미딘(spermidine)과 스퍼민(spermine) 등 폴리아민류는 단백질과 핵산의 합성에서 필수적인 물질로서, 특히 신속히 분화하는 정소 등의 동물 조직에서 매우 높은 수준이 요구된다. 대부분의 생체 폴리아민류는 ODC (ornithine decarboxylase)의 작용으로 오르니틴으로부터 푸트레신(putrescine)이 만들어진 다음, 푸트레신으로부터 각종 폴리아민류가 합성된다. ODC Az (antizyme)은 ODC와 heterodimer를 형성함으로써 ODC 고유의 homodimer 형성을 방해하여 ODC를 불활성화시키는 한편, ODC-ODC Az heterodimer가 proteosome에 의해 분해됨에 따라 폴리아민류 생합성 과정이 차단된다.Polyamines, such as spermidine and spermine, are essential for the synthesis of proteins and nucleic acids, and require very high levels, especially in animal tissues such as testis that rapidly differentiate. Most biopolyamines are produced by putrescine from ornithine under the action of ornithine decarboxylase (ODC), and then various polyamines are synthesized from putrescine. ODC Az (antizyme) inhibits ODC intrinsic homodimer formation by forming heterodimer with ODC, while polyamine biosynthesis process is blocked as ODC-ODC Az heterodimer is degraded by proteosome.

ODC Az를 암호화하는 유전자는 그 open reading frame (ORF)의 전반 도메인 내에 종결 코돈 (TGA)이 존재하여 전 길이에 걸친 mRNA의 해독이 이루어지지 않다가, 스퍼미딘이 일정 수준 이상으로 상승할 경우에만 리보좀 상에서 염기 T가 제거되는 frame-shifting이 일어나면서 해독이 진행된다.The gene encoding ODC Az has a stop codon (TGA) in the frontal domain of its open reading frame (ORF), resulting in no translation of mRNA over its entire length, but only when spermidine rises above a certain level. Decoding proceeds with frame-shifting, which removes base T on ribosomes.

따라서, 곤충의 생체에서 ODC Az는 스퍼미딘의 수준이 과도하게 상승하지 않는 한 해독되어 발현되지 않으나, 만일 종결 코돈의 염기 T가 제거된 ORF가 이입된다면, ODC Az의 해독이 제어되지 않음에 따라 ODC의 활성이 억제되고 폴리아민류의 결핍 현상이 유도되어 정상적인 발생을 교란시킬 수 있다.Thus, in insects, ODC Az is not detoxified and expressed unless the level of spermidine is excessively elevated, but if ORF is removed from the base T of the stop codon, the detoxification of ODC Az is not controlled. ODC activity is inhibited and polyamine deficiency can be induced to disturb normal occurrence.

특히, 폴리아민류의 결핍 효과는 신속한 세포의 분열과 분화가 진행되는 정소에서의 정자형성 과정에 심각한 지장을 초래하여 생식기능에 장애를 갖는 불임성 개체를 발생시킬 수도 있다.In particular, the deficiency effect of polyamines may cause severe hindrance to spermatogenesis in testes where rapid cell division and differentiation progress, resulting in infertile individuals with impaired reproductive function.

한국특허등록 제10-0722001호에는 오르니틴 데카복실라제 억제제의 모낭 전달용 국소 조성물이 개시되어 있으며, 미국특허 제5811634호에는 오르니틴 데카복실라제를 코딩하는 형질전환 동물이 개시되어 있다.Korean Patent Registration No. 10-0722001 discloses a topical composition for hair follicle delivery of an ornithine decarboxylase inhibitor, and US Patent No. 5811634 discloses a transgenic animal encoding ornithine decarboxylase.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 ODC Az를 이용하여 특정 해충 종의 ODC 활성을 억제시킴에 따라 생물학적으로 해충을 방제하는 기술을 개발하고자, 우선적으로 채소류의 주요 해충인 담배거세미나방 (Spodoptera litura)에서 ODC를 암호화하는 cDNA를 분리하고 이를 ODC 결핍 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에 형질도입시켜 곤충 ODC의 작용에 의해 유지되는 효모 균주를 제작하였다. 다시 담배거세미나방에서 ODC Az를 암호화하는 cDNA를 분리하고 인위적인 점돌연변이(point mutation)를 통해 해독이 가능한 ORF cDNA의 구조를 만든 다음, 이를 상기 효모 균주에 형질도입시켜 구조변경 곤충 ODC Az의 기능적 발현성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present invention has been made in accordance with the above requirements, and in the present invention, in order to develop a technique for controlling pests biologically by inhibiting ODC activity of a particular pest species using ODC Az, the main pests of vegetables are preferred. A cDNA encoding ODC was isolated from tobacco litterworm ( Spodoptera litura ) and transduced into ODC deficient yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) to produce a yeast strain maintained by the action of insect ODCs. In addition, the cDNA encoding the ODC Az is isolated from the tobacco macrophages, and the structure of the ORF cDNA that can be deciphered through artificial point mutation is made, and then transduced into the yeast strain to functionalize the structurally modified insect ODC Az. The present invention was completed by confirming the expression.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 담배거세미나방 (Spodoptera litura) 유래의 ODC Az (ornithine decarboxylase antizyme) 단백질을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides an ODC Az (ornithine decarboxylase antizyme) protein derived from tobacco macropodia ( Spodoptera litura ).

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the protein.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.

또한, 본 발명은 숙주 세포에 상기 재조합 벡터로 형질전환시켜 숙주 세포 내의 ODC 단백질을 불활성화시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for inactivating ODC protein in a host cell by transforming the host cell with the recombinant vector.

또한, 본 발명은 ODC 단백질을 불활성화시킬 수 있도록 ODC Az 염기서열을 변경시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for altering the ODC Az sequence to inactivate the ODC protein.

본 발명을 통해 개발하고자 하는 새로운 아이디어의 해충방제 기술은 아직 전 세계적으로도 시도된 바 없는 것으로서, 성공적으로 과제가 수행될 경우 농업 현장에서 즉각적으로 사용 가능한 생물학적 살충제가 생산됨에 따라 세계적으로도 큰 경제적 가치가 있는 시장이 형성될 수 있다.The pest control technology of the new idea to be developed through the present invention has not yet been attempted globally, and if the project is successfully carried out, a biopesticide that can be used immediately on the agricultural site is produced and thus a great economic Valuable markets can be formed.

또한, 즉각적인 살충 효과는 기존의 화학적 살충제에 비해 다소 떨어질 수 있으나, 토양 및 환경에 잔존하여 반복적이고 만성적인 살충효과를 나타낼 수 있는 점에서 장기적으로는 기존의 살충제에 비해 한층 더 우수한 효과를 기대할 수 있다.In addition, the immediate insecticidal effect may be slightly lower than that of conventional chemical insecticides, but in the long term, it may be more effective than conventional insecticides in that it may have a repetitive and chronic insecticidal effect remaining in the soil and environment. have.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 담배거세미나방 (Spodoptera litura) 유래의 ODC Az (ornithine decarboxylase antizyme) 단백질을 제공한다. 상기 서열번호 2는 하기 서열번호 1의 염기서열에서 223번째 염기인 T가 결실되어 frame-shifting 이 일어나 완전한 ORF가 생성된 서열이다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, tobacco giant seminar ( Spodoptera litura ) provides ODC Az (ornithine decarboxylase antizyme) protein. SEQ ID NO: 2 is a sequence in which the 223rd base T is deleted from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to perform frame-shifting to generate a complete ORF.

본 발명에 따른 ODC Az 단백질의 범위는 담배거세미나방으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.The range of the ODC Az protein according to the present invention includes a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 isolated from tobacco macropods and functional equivalents of the protein. "Functional equivalent" means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 70% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution, or deletion of the amino acid Refers to a protein having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with the protein represented by SEQ ID NO: 2.

또한, 본 발명은 상기 ODC Az 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 ODC 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1의 염기서열 중 223번째 염기인 T가 결실된 ODC AzM 이다. 여기에서, M은 변형(modification)을 말하며, 223번째 염기인 T가 결실된 것을 의미한다.The present invention also provides a gene encoding the ODC Az protein. Genes of the invention include both genomic DNA and cDNA encoding ODC proteins. Preferably, the gene of the present invention may include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. More preferably, the gene of the present invention is ODC AzM in which T, which is the 223th base of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, is deleted. Here, M means modification and means that the 223th base T is deleted.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.Variants of the above base sequences are also included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a base sequence having sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% with each of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1. It may include. The "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 ODC Az 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터에 포함되는 ODC Az 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열 중 223번째 염기인 T가 결실된 ODC AzM 이다. 상기 재조합 벡터는 바 람직하게는 재조합 효모 발현 벡터이다.The present invention also provides a recombinant vector comprising the ODC Az gene according to the present invention. The ODC Az gene included in the recombinant vector is preferably ODC AzM in which T, which is the 223th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, is deleted. The recombinant vector is preferably a recombinant yeast expression vector.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term "recombinant" refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid. The recombinant cell can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell in one of the sense or antisense form. In addition, the recombinant cell can express a gene found in a cell in its natural state, but the gene has been modified and reintroduced intracellularly by an artificial means.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.The term "vector" is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which is transferred into a cell. The vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell. The term "carrier" is often used interchangeably with "vector". The term “expression vector” refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오 퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.Vectors of the invention can typically be constructed as vectors for cloning or expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector of the present invention is an expression vector and the prokaryotic cell is a host, a strong promoter (for example, a pLλ promoter, a trp promoter, a lac promoter, a T7 promoter, a tac promoter, etc.) capable of promoting transcription, It is common to include ribosomal binding sites and transcription / detox termination sequences for initiation of translation. When E. coli is used as a host cell, a promoter and an operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway, and a phage λ left promoter (pLλ promoter) can be used as regulatory sites.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.On the other hand, vectors that can be used in the present invention are plasmids (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX series, pET series and pUC19, etc.) which are often used in the art, phage (e.g. λgt4.λB , λ-Charon, λΔz1 and M13, etc.) or viruses (eg SV40, etc.).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and the eukaryotic cell is a host, a promoter derived from the mammalian cell genome (for example, metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (for example, adeno) Late viral promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV) can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.The vector of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as an optional marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin And resistance genes for tetracycline.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector of the present invention. The host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable manner can be used in any host cell known in the art, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. strains of the genus Bacillus, such as coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia marsonsons and various Pseudomonas species Enterobacteria and strains.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.In addition, when transforming a vector of the present invention to eukaryotic cells, yeast ( Saccharomyce) as a host cell cerevisiae ), insect cells, human cells (eg, CHO cell lines (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines), and plant cells.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973), when the host cell is a prokaryotic cell). ), Hanahan method (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation method (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like. In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, microinjection method (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation method (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)), Electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)), DEAE- Dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)), and gene balm (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)) The vector can be injected into the host cell.

바람직하게는 상기 숙주세포는 효모(Saccharomyce cerevisiae)이다. 또한, 바람직하게는 상기 숙주 세포는 세포 증식이 저해되고, 폴리아민류 합성이 감소된 것일 수 있다. 본 발명의 ODC AzM 유전자를 효모에서 과발현시킨 결과, 효모 세포의 증식이 저해를 받았으며, 폴리아민류의 합성이 감소되었다.Preferably the host cell is yeast ( Saccharomyce cerevisiae ). In addition, preferably, the host cell may be one in which cell proliferation is inhibited and polyamine synthesis is reduced. As a result of overexpression of the ODC AzM gene of the present invention in yeast, the proliferation of yeast cells was inhibited and the synthesis of polyamines was reduced.

본 발명은 또한, 숙주 세포에 본 발명의 ODC AzM 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시켜 ODC AzM 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 숙주 세포 내의 ODC (ornithine decarboxylase) 단백질을 불활성화시키는 방법을 제공한다. 효모에서 과발현된 ODC AzM은 ODC와 heterodimer를 형성함으로써 ODC 고유의 homodimer 형성을 방해하여 ODC를 불활성화시키는 한편, ODC-ODC Az heterodimer가 proteosome에 의해 분해됨에 따라 폴리아민류 생합성 과정이 차단된다. 따라서, 상기 ODC 단백질 불활성화에 의해 숙주 세포 증식이 저해되고, 폴리아민류 합성이 감소될 수 있다. 상기 숙주 세포는 바람직하게는 효모이다.The present invention also provides a method of inactivating an ornithine decarboxylase (ODC) protein in a host cell comprising transforming the host cell with a recombinant vector comprising the ODC AzM gene of the present invention. ODC AzM overexpressed in yeast inhibits ODC intrinsic homodimer formation by forming heterodimer with ODC, while ODC-ODC Az heterodimer is decomposed by proteosome, blocking polyamine biosynthesis process. Therefore, host cell proliferation may be inhibited by the ODC protein inactivation, and polyamine synthesis may be reduced. The host cell is preferably yeast.

본 발명은 또한,The present invention also provides

(a) 숙주 세포에서 ODC Az 유전자를 분리하는 단계;(a) isolating the ODC Az gene from the host cell;

(b) ODC 단백질을 불활성화시킬 수 있도록 ODC Az 염기서열을 변경시키는 단계; 및(b) altering the ODC Az sequence to inactivate the ODC protein; And

(c) 상기 변경된 ODC Az 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 변경된 ODC Az 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 숙주 세포 내의 ODC (ornithine decarboxylase) 단백질을 불활성화시키는 방법을 제공한다.(c) transforming the host cell with a recombinant vector comprising the altered ODC Az sequence to overexpress the altered ODC Az gene, thereby providing a method of inactivating an ornithine decarboxylase (ODC) protein in the host cell.

본 발명의 방법에서, ODC 단백질을 불활성화시킬 수 있도록 ODC Az 염기서열을 변경시키는 단계는 분리된 ODC Az 유전자가 완전하게(fully) 번역(translation) 될 수 있도록 ORF 중간에 발생하는 정지 코돈을 제거하는 단계이다. 상기 단계는 정지 코돈에 해당하는 하나의 염기를 제거하여 frame-shifting을 유도할 수도 있고, 정지 코돈에 해당하는 하나의 염기를 다른 염기로 치환하여 termination을 막아 완전한 ORF가 생성되도록 할 수도 있다.In the method of the present invention, the step of altering the ODC Az sequence to inactivate the ODC protein removes a stop codon occurring in the middle of the ORF so that the isolated ODC Az gene can be fully translated. It's a step. In this step, one base corresponding to the stop codon may be removed to induce frame-shifting, or one base corresponding to the stop codon may be replaced with another base to prevent termination so that a complete ORF may be generated.

상기 (c) 단계에서, 변경된 ODC Az 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는데, 이때 숙주 세포는 ODC Az 유전자가 분리된 것과 동일한 숙주 세포일 수도 있고, ODC Az 유전자가 분리된 것과 상이한 숙주 세포일 수도 있다. 즉, 목적에 따라, 원하는 형질전환 숙주 세포를 선택할 수 있는 것이다.In step (c), the host cell is transformed with a recombinant vector comprising the altered ODC Az sequence, wherein the host cell may be the same host cell from which the ODC Az gene is isolated, or the ODC Az gene is isolated. It may be a different host cell. That is, according to the purpose, it is possible to select the desired transformed host cell.

숙주 세포에서 과발현된 변경된 ODC Az는 ODC와 heterodimer를 형성함으로써 ODC 고유의 homodimer 형성을 방해하여 ODC를 불활성화시킬 수 있는 것이다.Altered ODC Az, overexpressed in host cells, can inactivate ODCs by forming heterodimers with ODCs, preventing the formation of homodimers inherent in ODCs.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

1. 곤충 시료1. Insect Sample

각종 채소류 작물의 주요 해충인 담배거세미나방 (Spodoptera litura)의 유충을 growth chamber 내에서 배추를 먹이로 온도 25±1℃, 상대습도 60 % 및 광주기 16 : 8 (L : D)에서 사육하면서, 번데기 시기에 정소를 적출하고 100 mg 당 1 ml의 TRIzol reagent (Gibco BRL, USA)를 가하여 -70℃에서 보관하였다.Tobacco Geopark , a major pest of various vegetable crops ( Spodoptera) litura ) larvae were fed in the growth chamber at 25 ± 1 ℃, 60% relative humidity, and photoperiod 16: 8 (L: D), and the testes were removed during the pupal stage and 1 ml per 100 mg. TRIzol reagent (Gibco BRL, USA) was added and stored at -70 ° C.

TRIzol reagent 속에 있는 정소 조직을 micro-pestle을 사용하여 파쇄한 후, TRIzol 1 ml 당 0.2 ml의 클로로포름을 가하여 15초 동안 강하게 shaking 한 다음, 원심분리 (12,000 xg, 15 min)를 실시하여 상층액을 분리하였다. 상층액에 이소프로판올을 가하여 진탕한 후, 다시 원심분리 (12,000 xg, 10 min) 하여 total RNA를 확보하였다. Total RNA 펠렛에 75 % 에탄올을 가하여 볼텍싱한 후 원심분리 (7,500 xg, 5 min) 하여 상층액을 제거한 다음, total RNA 펠렛을 실온에서 공기 건조시켰다. Total RNA의 농도는 DEPC-H2O로 total RNA 펠렛을 용해하여 spectrophotometer (Spectronic Genesys 5)를 이용하여 파장 260 nm에서 측정하였다.After crushing testis tissue in TRIzol reagent using micro-pestle, 0.2 ml of chloroform per 1 ml of TRIzol was added and shaken vigorously for 15 seconds, followed by centrifugation (12,000 xg, 15 min). Separated. Isopropanol was added to the supernatant, shaken, and centrifuged again (12,000 xg, 10 min) to obtain total RNA. 75% ethanol was added to the total RNA pellet, followed by vortexing to remove the supernatant by centrifugation (7,500 xg, 5 min), and the total RNA pellet was air dried at room temperature. Total RNA concentration was measured at a wavelength of 260 nm using a spectrophotometer (Spectronic Genesys 5) by dissolving the total RNA pellet with DEPC-H 2 O.

Total RNA 200 ug을 1 ug Oligo (dT) 프라이머와 70℃에서 10 분간 반응시킨 후, 얼음 위에서 5 분간 정치한 다음, 제1가닥 5X 버퍼, RNasin ribonuclease inhibitor (40 유닛), 소듐 피로포스페이트(40 mM) 및 AMV 역전사효소 (30 유닛)를 첨가하여 42℃에서 1 시간 동안 반응시켜 제1가닥 cDNA를 합성하였다. 합성된 제1가닥 반응물 20 ul에 제2가닥 2.5X 버퍼, DNA 중합효소 (23 유닛) 및 RNase H (0.8 유닛)를 가하고 증류수를 이용 총 부피를 100 ul로 맞추어 14℃에서 2 시간 동안 반응시켰으며, 이 반응액을 다시 70℃에서 10 분간 가열한 다음 얼음에 정치시킨 상태에서 T4 DNA 중합효소 (2 유닛)를 가하여 37℃에서 10 분간 반응시킨 후, 200 mM의 EDTA (10 ul)를 첨가하여 반응을 종결시켰다. cDNA의 회수를 위하여 반응액에 동량의 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알콜 (25 : 24 : 1)을 첨가하여 볼텍싱 한 후, 원심분리 (15,000 rpm, 2 min) 하여 얻은 상등액에 0.1 부피의 2.5 M 소듐 아세테이트 (pH 5.2)와 2.5 부피의 100 % EtOH (-20℃)를 넣어 -70℃에서 30 분간 정치시켰다. 이어 원심분리 (15,000 rpm, 10 min)를 통해 침전시킨 cDNA 펠렛을 70 % EtOH (-20℃)로 washing 한 후 최종적으로 적정양의 DW에 용해시켰으며, spectrophotometer 파장 260 nm에서 cDNA의 농도를 측정하였다.After 200 ug of total RNA was reacted with 1 ug Oligo (dT) primer for 10 minutes at 70 ° C, it was allowed to stand on ice for 5 minutes, followed by 1st strand 5X buffer, RNasin ribonuclease inhibitor (40 units), sodium pyrophosphate (40 mM). ) And AMV reverse transcriptase (30 units) were added and reacted at 42 ° C. for 1 hour to synthesize first strand cDNA. To 20 ul of the synthesized first strand reactant, the second strand 2.5X buffer, DNA polymerase (23 units) and RNase H (0.8 unit) were added, and the total volume was adjusted to 100 ul using distilled water and reacted at 14 ° C. for 2 hours. The reaction solution was again heated at 70 ° C. for 10 minutes, and then added to T4 DNA polymerase (2 units) while standing on ice for 10 minutes at 37 ° C., followed by addition of 200 mM EDTA (10 ul). The reaction was terminated. To recover the cDNA, the same amount of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added to the reaction solution, followed by vortexing, followed by centrifugation (15,000 rpm, 2 min). Sodium acetate (pH 5.2) and 2.5 volumes of 100% EtOH (-20 ° C.) were added and allowed to stand at −70 ° C. for 30 minutes. Subsequently, the cDNA pellet precipitated through centrifugation (15,000 rpm, 10 min) was washed with 70% EtOH (-20 ° C) and finally dissolved in an appropriate amount of DW. The concentration of cDNA was measured at a spectrophotometer wavelength of 260 nm. It was.

2. 2. 담배거세미나방Tobacco Seminar Room ODC 코딩ODC Coding cDNAcDNA 의 분리Separation of

2-1. ODC 코딩 cDNA의 partial domain 제작2-1. Partial domain fabrication of ODC-coded cDNA

ODC의 partial domain을 증폭시키기 위해 기존에 보고된 곤충류 ODC들의 염기 서열을 토대로 cDNA 주형 상에서 타겟 서열들을 혼성화하도록 5′유전자 특이적 프라이머 (5'-GGGCACTGGCTTCGATTGCGC-3'; 서열번호 3) 및 3′degenerate 프라이머 (5'-YYAYTTSAGSGCRCAYTCSAC-3'; 서열번호 4)를 제작하였다.5 ′ gene specific primers (5′-GGGCACTGGCTTCGATTGCGC-3 ′; SEQ ID NO: 3) and 3′degenerate to hybridize target sequences on a cDNA template based on previously reported base sequences of insect ODCs to amplify partial domains of ODCs A primer (5'-YYAYTTSAGSGCRCAYTCSAC-3 '; SEQ ID NO: 4) was prepared.

PCR은 표 1의 조건으로 MJ Resaech, Inc의 Model PTC-100 Programmable Thermal Cycler를 사용하여 0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl2, 각 10 uM과 20 uM의 5' 및 3' 프라이머 pool및 100 ng cDNA 주형으로 이루어진 50 ul의 반응 부피로 실시하였으며, 이때 주형으로는 정소 조직에서 추출한 total RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 5 분간 preincubation 한 후 80℃에서 0.4 ul Taq 중합효소 (TaKaRa Ex-Taq)를 가함으로써 개시하였다. 증폭된 cDNA를 아가로스 겔 상에서의 전기영동을 통해 확인 (도 1) 및 정제한 다음, TA 클로닝 키트 (Invitrogen)를 사용하여 플라스미드 pCR 2.1 벡터에 삽입하여 그 염기서열을 분석함으로써 담배거세미나방 정소조직의 ODC cDNA (Slit ODC) 임을 확인하였다.PCR was performed using MJ Resaech, Inc's Model PTC-100 Programmable Thermal Cycler under Table 1, with 0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl 2 , 5 'and 3' primer pools of 10 uM and 20 uM, respectively, and a 100 ng cDNA template. The reaction volume was 50 ul, which was used. As a template, cDNA synthesized from total RNA extracted from testis tissue was used. The PCR reaction was initiated by preincubation at 95 ° C. for 5 minutes and then adding 0.4 ul Taq polymerase (TaKaRa Ex-Taq) at 80 ° C. The amplified cDNA was identified and purified by electrophoresis on agarose gel (FIG. 1), and then inserted into a plasmid pCR 2.1 vector using a TA cloning kit (Invitrogen) to analyze its nucleotide sequence. The tissue was confirmed to be ODC cDNA ( Slit ODC).

표 1. 담배거세미나방에서 ODC 코딩 cDNA의 partial domain을 증폭하기 위 한 PCR thermal cyclization 프로파일Table 1. PCR thermal cyclization profiles for amplifying partial domains of ODC-encoded cDNA in tobacco macromoth

PreheatingPreheating 95℃ for 5min95 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle AnnealingAnnealing 80℃ for 5min80 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle
Reaction
Reaction
DenaturationDenaturation 95℃ for 1min95 ℃ for 1min
39 cycles
39 cycles
AnnealingAnnealing 58℃ for 1min58 ℃ for 1min ExtensionExtension 72℃ for 2min72 ℃ for 2min Last extensionLast extension 72℃ for 5min72 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle

2-2. ODC 코딩 cDNA의 5′및 3′말단 제작2-2. 5 'and 3' end fabrication of ODC-coded cDNA

구조 분석을 통해 ODC Az를 암호화하는 것으로 확인된 cDNA partial domain의 염기서열을 토대로, ORF의 5′및 3′말단들을 증폭시키기 위해 유전자 특이적 RACE 프라이머들을 제작하였다 (5' 프라이머, 5'-TGTCATTCCACGTGGGTAGCG-3'(서열번호 5); 3' 프라이머, 5'-GGGGAAGTGCTCCTCCAAAGC-3'(서열번호 6)).Genetic specific RACE primers were constructed to amplify the 5 'and 3' ends of the ORF, based on the nucleotide sequence of the cDNA partial domain identified by the structural analysis encoding ODC Az (5 'primer, 5'-TGTCATTCCACGTGGGTAGCG). -3 '(SEQ ID NO: 5); 3' primer, 5'-GGGGAAGTGCTCCTCCAAAGC-3 '(SEQ ID NO: 6)).

RACE PCR은 Marathon cDNA 증폭 키트 (Clontech)를 이용하여 만든 Ap1 어댑터가 부착된 cDNA를 주형으로 하여 Hot Start Taq DNA 중합효소 (Takara)를 사용하여 수행하였다 (0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl2, 각 10 uM 5′및 3′프라이머, 100 ng cDNA) (표 2). 양 말단을 충족하는 충분한 길이의 PCR 산물들을 전기영동을 통해 확인 (도 2) 및 정제하였으며, 이를 pCR2.1 벡터에 삽입하고 E. coli 에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.RACE PCR was performed using a Hot Start Taq DNA Polymerase (Takara) with a cDNA with an Ap1 adapter made using the Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) (0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl 2 , 10 each). uM 5 ′ and 3 ′ primers, 100 ng cDNA) (Table 2). PCR products of sufficient length that meet both ends were identified and purified by electrophoresis (FIG. 2) and inserted into the pCR2.1 vector and subjected to E. coli The nucleotide sequence was analyzed by cloning.

표 2. RACE PCR에서 thermal cyclization 프로파일Table 2. Thermal cyclization profiles in RACE PCR

PreheatingPreheating 94℃ for 5min94 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle AnnealingAnnealing 80℃ for 5min80 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle PreheatingPreheating 94℃ for 30sec94 ℃ for 30sec 1 cycle1 cycle

Reaction

Reaction


DenaturationDenaturation 94℃ for 30sec94 ℃ for 30sec 5 cycles5 cycles AnnealingAnnealing 67℃ for 4min67 ℃ for 4min DenaturationDenaturation 94℃ for 30sec94 ℃ for 30sec 5 cycles5 cycles AnnealingAnnealing 65℃ for 4min65 ℃ for 4min DenaturationDenaturation 94℃ for 20sec94 ℃ for 20sec 35 cycles35 cycles AnnealingAnnealing 62℃ for 4min62 ℃ for 4min Last extensionLast extension 72℃ for 5min72 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle

2-3. ODC 코딩 cDNA의 전장(full length)- ORF cDNA 제작2-3. Full length of ODC-coded cDNA-construction of ORF cDNA

RACE PCR을 통해 확인된 개시 코돈 (ATG)과 정지 코돈 (TGA)이 포함된 5' 및 3' 말단의 염기서열을 토대로 전장 ORF cDNA를 증폭시키기 위해 각 ORF들의 개시 및 종결 부위에 상응하는 유전자 특이적 프라이머들을 제작하였으며 (5' 프라이머, 5'-ATGAAGGTCGTGGAA-3'(서열번호 7); 3' 프라이머, 5'-TCACTTGAGCGCGCACTC-3'(서열번호 8)), 이들을 이용하여 표 3의 조건으로 PCR을 실시하였다. 증폭된 전장 ORF cDNA들의 크기를 아가로스 겔 상에서 확인하고 (도 3), 각각 pCR2.1 벡터에 삽입 및 E. coli 에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다.Gene specificity corresponding to the initiation and termination sites of each ORF to amplify full-length ORF cDNAs based on 5 'and 3' terminal sequences containing start codons (ATG) and stop codons (TGA) identified by RACE PCR Red primers were prepared (5 'primer, 5'-ATGAAGGTCGTGGAA-3' (SEQ ID NO: 7); 3 'primer, 5'-TCACTTGAGCGCGCACTC-3' (SEQ ID NO: 8)), using them under the conditions of Table 3 Was carried out. The size of the amplified full-length ORF cDNAs was confirmed on agarose gel (FIG. 3), inserted into pCR2.1 vector and E. coli , respectively. The nucleotide sequence was analyzed by cloning.

표 3. 전장 ODC ORF cDNA의 증폭을 위한 PCR thermal cyclization 프로파일Table 3. PCR thermal cyclization profiles for amplification of full-length ODC ORF cDNA

PreheatingPreheating 95℃ for 5min95 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle AnnealingAnnealing 80℃ for 5min80 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle
Reaction
Reaction
DenaturationDenaturation 95℃ for 1min95 ℃ for 1min
39 cycles
39 cycles
AnnealingAnnealing 54℃ for 1min54 ℃ for 1min ExtensionExtension 72℃ for 2min72 ℃ for 2min Last extensionLast extension 72℃ for 5min72 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle

2-4. 효모 발현 벡터로의 Slit ODC의 클로닝2-4. Slit with Yeast Expression Vector Cloning of ODC

pCR 벡터에 삽입되어 있는 Slit ODC cDNA를 EcoRI으로 절단하여 1.3 kb의 단 편을 분리한 다음, EcoRI으로 절단한 p413GAL1 벡터에 라이게이션 하였다 (p413GAL-Slit ODC, 도 4). Slit ODC 유전자는 P413GAL1 벡터의 GAL1 프로모터에 의하여 갈락토스가 포함된 배지에서 전사되며, CYC1 터미네이터에 의하여 전사가 종결된다. Slit inserted in the pCR vector The ODC cDNA was digested with EcoRI to isolate 1.3 kb fragments, and then ligated to p413GAL1 vector digested with EcoRI (p413GAL- Slit ODC, FIG. 4). The Slit ODC gene is transcribed in a medium containing galactose by the GAL1 promoter of the P413GAL1 vector, and transcription is terminated by the CYC1 terminator.

3. 3. 담배거세미나방Tobacco Seminar Room ODCODC AzAz 코딩  Coding cDNAcDNA 의 분리Separation of

3-1. ODC Az 코딩 cDNA의 partial domain 제작3-1. Partial domain fabrication of ODC Az coding cDNA

ODC Az의 약 430 bp conserved core domain을 제작하기 위하여 기존에 보고된 곤충류 ODC Az들의 염기 서열을 토대로 cDNA로부터 타겟 서열들을 혼성화하도록 프라이머들을 제작하였다 (5′프라이머, 5'-CTGTGGTGGTCCTGATGTTCC-3'(서열번호 9); 3′프라이머, 5'-CTCTTCGGCGAAATCCAGAG-3'(서열번호 10)). PCR은 표 4의 조건으로 0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl2, 각 4 uM의 5' 및 3' 프라이머 pool과 100 ng cDNA 주형으로 이루어진 50 ul의 반응 부피로 실시하였고, 주형으로는 정소 조직에서 추출한 total RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하였으며, 95℃에서 5 분간 preincubation 한 후 80℃에서 0.4 ul Taq 중합효소 (TaKaRa Ex-Taq)를 가함으로써 개시하였다. 증폭된 cDNA를 아가로스 겔 상에서의 전기영동을 통해 확인한 후 (도 5), 상기와 같은 방법으로 염기서열을 분석하여 담배거세미나방 정소 조직의 ODC Az cDNA (Slit ODC Az) 임을 확인하였다.In order to construct about 430 bp conserved core domain of ODC Az, primers were constructed to hybridize target sequences from cDNA based on previously reported nucleotide sequences of ODC Az insect species (5 ′ primer, 5′-CTGTGGTGGTCCTGATGTTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 6). Number 9); 3 'primer, 5'-CTCTTCGGCGAAATCCAGAG-3' (SEQ ID NO: 10)). PCR was carried out in a reaction volume of 50 ul consisting of 0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl 2 , 5 'and 3' primer pools of 4 uM each, and a 100 ng cDNA template under the conditions shown in Table 4. The cDNA synthesized from total RNA was used, and preincubated at 95 ° C. for 5 minutes, and then started by adding 0.4 ul Taq polymerase (TaKaRa Ex-Taq) at 80 ° C. After confirming the amplified cDNA by electrophoresis on agarose gel (Fig. 5), it was confirmed that the ODC Az cDNA ( Slit ODC Az) of the testicular tissue of tobacco macrogonist by the same method as described above.

표 4. 담배거세미나방에서 ODC Az 코딩 cDNA의 340 bp core domain을 증폭하 기 위한 PCR thermal cyclization 프로파일Table 4. PCR thermal cyclization profiles for amplifying the 340 bp core domain of ODC Az-encoded cDNAs in tobacco litter

PreheatingPreheating 95℃ for 5min95 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle AnnealingAnnealing 80℃ for 5min80 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle
Reaction
Reaction
DenaturationDenaturation 95℃ for 1min95 ℃ for 1min
39 cycles
39 cycles
AnnealingAnnealing 62℃ for 1min62 ℃ for 1min ExtensionExtension 72℃ for 2min72 ℃ for 2min Last extensionLast extension 72℃ for 5min72 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle

3-2. ODC Az 코딩 cDNA의 5′및 3′말단 제작3-2. Fabrication of 5 ′ and 3 ′ ends of ODC Az-coded cDNA

구조 분석을 통해 ODC Az를 암호화하는 것으로 확인된 core domain cDNA의 염기서열을 토대로 유전자 특이적 RACE 프라이머들을 제작하고 (5' 프라이머, 5'-TCACCGAGTCCCAGTCTCCCA-3'(서열번호 11); 3' 프라이머; 5'-GCTTCTCTGCGTTGCTGGTGG-3'(서열번호 12)), 상기와 같은 방법으로 RACE PCR을 수행하였다 (0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl2, 각 10 uM 5′및 3′프라이머, 50 ng cDNA) (표 5). ORF의 양 말단을 충족하는 충분한 길이의 PCR 산물들을 전기영동을 통해 확인한 후 (도 6), 상기와 동일한 방법으로 pCR2.1 벡터에 삽입하고 E. coli 에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.Gene-specific RACE primers were prepared based on the nucleotide sequence of the core domain cDNA identified as ODC Az by structural analysis (5 'primer, 5'-TCACCGAGTCCCAGTCTCCCA-3' (SEQ ID NO: 11); 3 'primer;5'-GCTTCTCTGCGTTGCTGGTGG-3'(SEQ ID NO: 12), RACE PCR was performed in the same manner as described above (0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl 2 , 10 uM 5' and 3 'primers each, 50 ng cDNA) 5). PCR products of sufficient length that meet both ends of the ORF were confirmed by electrophoresis (FIG. 6), and then inserted into the pCR2.1 vector in the same manner as above and then E. coli The nucleotide sequence was analyzed by cloning.

표 5. RACE PCR에서 thermal cyclization 프로파일Table 5. Thermal cyclization profiles in RACE PCR

PreheatingPreheating 94℃ for 5min94 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle AnnealingAnnealing 80℃ for 5min80 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle PreheatingPreheating 94℃ for 30sec94 ℃ for 30sec 1 cycle1 cycle

Reaction

Reaction


DenaturationDenaturation 94℃ for 30sec94 ℃ for 30sec 5 cycles
5 cycles
AnnealingAnnealing 68℃ for 4min68 ℃ for 4min DenaturationDenaturation 94℃ for 30sec94 ℃ for 30sec 5 cycles
5 cycles
AnnealingAnnealing 66℃ for 4min66 ℃ for 4min DenaturationDenaturation 94℃ for 20sec94 ℃ for 20sec 35 cycles
35 cycles
AnnealingAnnealing 64℃ for 4min64 ℃ for 4min Last extensionLast extension 72℃ for 5min72 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle

3-3. ODC Az 코딩 cDNA의 전장 ORF cDNA 제작3-3. Full-length ORF cDNA Fabrication of ODC Az-coded cDNA

RACE PCR을 통해 확인된 개시 코돈 (ATG)과 정지 코돈 (TAA)이 정상적으로 포함된 5' 말단과 3' 말단의 염기서열을 토대로 전장 ORF cDNA를 증폭시키기 위해 각 ORF들의 개시 부위와 종결 부위의 염기서열에 상응하는 각 서열들에 BamHI 및 SacI 서열들을 5' 및 3' 말단에 첨가시킨 유전자 특이적 프라이머 쌍들을 제작하고 (5' 프라이머, 5'-GGGGGATCC ATGACGAAGTTAATACAACAA-3'(서열번호 13); 3' 프라이머, 5'-GGGGAGCTC TTACTGCATATTGTAGTGCAG-3'(서열번호 14)), 표 6의 조건에서 PCR을 실시하였다. PCR을 통해 증폭된 전장 ORF cDNA들의 크기를 아가로스 겔 상에서 확인하고 (도 7), pCR 2.1 벡터에 삽입 및, E. coli 에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다.Bases of the start and end sites of each ORF to amplify the full-length ORF cDNA based on sequences of 5 'and 3' ends that normally contain start codons (ATG) and stop codons (TAA) identified by RACE PCR making a specific gene was added to the BamHI and SacI sequences 5 'and 3' ends of the respective sequence corresponding to the sequence primer pair (5 'primer, 5'-GGG GGATCC ATG ACGAAGTTAATACAACAA- 3' ( SEQ ID NO: 13) PCR was performed under the conditions of 3 ′ primer, 5′-GGG GAGCTC TTA CTGCATATTGTAGTGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 14), and Table 6. The size of the full-length ORF cDNAs amplified by PCR was confirmed on an agarose gel (FIG. 7), inserted into a pCR 2.1 vector, and E. coli The nucleotide sequence was analyzed by cloning.

표 6. 전장 ODC Az ORF cDNA의 증폭을 위한 PCR thermal cyclization 프로파일Table 6. PCR thermal cyclization profiles for amplification of full-length ODC Az ORF cDNA

PreheatingPreheating 95℃ for 5min95 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle AnnealingAnnealing 80℃ for 5min80 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle
Reaction
Reaction
DenaturationDenaturation 95℃ for 1min95 ℃ for 1min
39 cycles
39 cycles
AnnealingAnnealing 62℃ for 1min62 ℃ for 1min ExtensionExtension 72℃ for 2min72 ℃ for 2min Last extensionLast extension 72℃ for 5min72 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle

3-4. 효모 발현 벡터로의 Slit ODC Az의 클로닝3-4. Slit with Yeast Expression Vector Cloning of ODC Az

pCR 벡터에 삽입되어 있는 Slit ODC Az cDNA를 BamHI과 Sal1으로 절단하여 단편을 분리한 다음, 동일한 제한효소들로 절단한 pG1 벡터에 라이게이션 하였다 (pG1-Slit ODC Az). Slit inserted in the pCR vector ODC Az cDNA was digested with BamHI and Sal1 to separate fragments, and then ligated to pG1 vector digested with the same restriction enzymes (pG1- Slit ODC Az).

4. 4. 담배거세미나방Tobacco Seminar Room ODCODC AzAz cDNAcDNA 의 변형(Variation of ModificationModification ))

ODC Az ORF cDNA의 223~225 번 염기에 존재하는 정지 코돈 (TGA)에서 223번 염기인 T (223-T) 를 site-directed mutagenesis 키트 (Stratagene)를 이용하여 제거하기 위해 T가 결실된 유전자 특이적 프라이머 (point mutated 프라이머 #1, 5'-CCTCTGTGGTGGTCCGATGTTCCGGCTCAG-3'(서열번호 15); point mutated 프라이머 #2, 5'-GTCACGCGGAACATCGGACCACCACAGAGG-3'(서열번호 16)) 들을 제작하였다. 표 7의 조건으로 5 ul 10x 버퍼, 1 ul dNTP mix, 3 ul quicksolution, 각 125 ng의 프라이머 #1 및 #2와 50 ng dsDNA 주형으로 이루어진 50 ul의 반응 부피로 PCR을 실시하여 223-T가 제거된 담배거세미나방 정소 조직 유래 구조변경 ODC Az cDNA (Slit ODC AzM)을 증폭하였다.Gene specific for T deletion to remove T (223-T), base 223, from the stop codon (TGA) at bases 223-225 of ODC Az ORF cDNA using site-directed mutagenesis kit (Stratagene) Red primers (point mutated primers # 1, 5'-CCTCTGTGGTGGTCCGATGTTCCGGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 15); point mutated primers # 2, 5'-GTCACGCGGAACATCGGACCACCACAGAGG-3' (SEQ ID NO: 16)) were prepared. PCR was carried out using a reaction volume of 50 ul consisting of 5 ul 10x buffer, 1 ul dNTP mix, 3 ul quicksolution, 125 ng of primer # 1 and # 2 and 50 ng dsDNA template under the conditions of Table 7. The structure-reformed ODC Az cDNA ( Slit ODC AzM) derived from the removed tobacco macromolecular testis tissue was amplified.

표 7. 담배거세미나방에서 point mutated ODC Az (ODC AzM) cDNA 를 증폭하기 위한 PCR thermal cyclization 프로파일Table 7. PCR thermal cyclization profiles for amplifying point mutated ODC Az (ODC AzM) cDNA in tobacco litter

PreheatingPreheating 95℃ for 5min95 ℃ for 5min 1 cycle1 cycle
Reaction
Reaction
DenaturationDenaturation 95℃ for 50sec95 ℃ for 50sec
18 cycles
18 cycles
AnnealingAnnealing 60℃ for 50sec60 ℃ for 50sec ExtensionExtension 68℃ for 5min68 ℃ for 5min Last extensionLast extension 68℃ for 7min68 ℃ for 7min 1 cycle1 cycle

5. 5. ODCODC 및  And ODCODC AzAz 결핍 효모 균주의 제작 Construction of Deficiency Yeast Strains

5-1. 효모 균주5-1. Yeast strain

W303-1A ( MATa ade2 , ura3 , his3 , trp1 , leu2 , can1)의 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하였으며, YPD (효모 extract - peptone - dextrose), 또 는 synthetic complete minimal medium (0.67 % yeast nitrogen base w/o a.a, 2 % 글루코스 및 아미노산, 선발에 필요한 것 제외)에서 배양하였다.W303-1A ( MATa Saccharomyces cerevisiae strains of ade2 , ura3 , his3 , trp1 , leu2 , can1 were used, and YPD (yeast extract-peptone-dextrose), or synthetic complete minimal medium (0.67% yeast nitrogen base w / o aa, 2% glucose and amino acids, except those required for selection).

5-2. ODC 유전자 (SPE1)의 녹아웃5-2. Knockout of the ODC Gene ( SPE1 )

ODC 유전자 (SPE1)를 효모 W303-1A의 염색체 DNA로부터 SPE1-5와 SPE1-3 프라이머를 사용하여 PCR 반응으로 증폭하고, 증폭된 1.4 kb의 DNA를 BamHI와 XhoI로 절단하여 pBluescript SK(+) 벡터에 클로닝 하였다 (pSPE1). pSPE1 플라스미드를 HincII와 HindIII로 절단하여 아가로스 겔에서 용출한 다음, Klenow 단편으로 Fill-In하고, 여기에 PvuII로 절단한 URA3 유전자를 라이게이션 하였다 (pSPE1::URA3) (도 8).ODC gene ( SPE1 ) was amplified by PCR reaction from chromosomal DNA of yeast W303-1A using SPE1-5 and SPE1-3 primers, and the amplified 1.4 kb of DNA was digested with BamHI and XhoI to obtain a pBluescript SK (+) vector. Cloned into (p SPE1 ). The p SPE1 plasmid was digested with HincII and HindIII, eluted from agarose gel, filled-in with Klenow fragments, and ligated to the URA3 gene digested with PvuII (pSPE1 :: URA3) (FIG. 8).

URA3 유전자가 삽입된 단편을 SPE1-5와 SPE1-3 프라이머로 증폭하여 2.5 kb크기의 PCR 단편을 분리한 다음, W303-1A 또는 W303-1A OAZ1::Hy 균주에 형질전환하여 염색체 상의 SPE1 유전자와 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 염색체 상의 SPE1 유전자를 녹아웃 시켰다 (도 9). 형질전환체로부터 DNA를 분리하고 SPE1-5와 SPE1-3 프라이머로 PCR 하여 1.4 kb의 SPE1 유전자 대신 2.5 kb의 녹아웃된 유전자의 존재를 확인하였다 (도 10).The fragment with the URA3 gene was amplified with SPE1-5 and SPE1-3 primers to isolate a 2.5 kb PCR fragment, which was then transformed into a W303-1A or W303-1A OAZ1 :: Hy strain and transformed into a SPE1 gene on a chromosome. The homologous recombination occurred to knock out the SPE1 gene on the chromosome (FIG. 9). DNA was isolated from the transformants and PCR with SPE1-5 and SPE1-3 primers to confirm the presence of 2.5 kb knocked out genes instead of 1.4 kb SPE1 genes (FIG. 10).

5-3. ODC Az 유전자 (OAZ1)의 녹아웃5-3. Knockout of the ODC Az Gene ( OAZ1 )

효모의 ODC antizyme 1 유전자 (OAZ1 )를 W303-1A 균주의 염색체 DNA로부터 AZ1-5와 AZ1-3 프라이머를 사용하여 PCR 반응으로 증폭하였다. 증폭된 1.2 kb의 DNA를 pHNT-T 벡터에 클로닝 하고, BamHI와 XhoI로 절단하여 pBluescript SK(+) 벡터에 다시 클로닝하였다 (pBAZ1). pBAZ1 플라스미드를 EcoRV와 HindIII로 절단하여 아가로스 겔에서 용출한 다음, glycerate phosphate dehydrogenase 프로모터와 phosphoglycerate kinase 터미네이터를 포함한 하이그로마이신 저항성 유전자를 pG1-Hy 플라스미드로부터 동일한 제한효소로 절단 및 추출하여 EcoRV-HindIII 절단된 pBAZ1 DNA에 라이게이션하였다 (pBAZ1::Hy) (도 11).Yeast ODC antizyme 1 gene ( OAZ1 ) was amplified by PCR reaction using AZ1-5 and AZ1-3 primers from chromosomal DNA of strain W303-1A. Amplified 1.2 kb of DNA was cloned into pHNT-T vector, cleaved with BamHI and XhoI and cloned back into pBluescript SK (+) vector (pBAZ1). The pBAZ1 plasmid was digested with EcoRV and HindIII, eluted from agarose gel, and then digested and extracted from the pG1-Hy plasmid with the same restriction enzymes from the hygromycin resistance gene, including the glycerate phosphate dehydrogenase promoter and the phosphoglycerate kinase terminator. PBAZ1 DNA was ligated (pBAZ1 :: Hy) (FIG. 11).

AZ1-5와 AZ1-3 프라이머를 이용하여 하이그로마이신 저항성 유전자 (Hy )가 삽입된 3.5 kb 크기의 PCR 단편을 증폭한 다음, W303-1A 균주에 형질전환하여 염색체 상의 OAZ1 유전자와 상동 재조합이 일어나게 함으로써 염색체 상의 OAZ1 유전자를 녹아웃시켰으며 (도 12), 형질전환체로부터 DNA를 분리하고 AZ1-5와 AZ1-3 프라이머로 PCR 하여 1.2 kb의 OAZ1 유전자 대신 Hy가 삽입된 3.5 kb의 녹아웃된 유전자를 확인하였다 (도 13).Using AZ1-5 and AZ1-3 primers, amplified 3.5 kb PCR fragment containing hygromycin resistance gene ( Hy ) was transformed into W303-1A strain and homologous recombination with OAZ1 gene on chromosome. By knocking out the OAZ1 gene on the chromosome (Fig. 12), DNA was isolated from the transformant and PCR with the AZ1-5 and AZ1-3 primers to obtain a 3.5 kb knocked out gene with Hy inserted in place of the 1.2 kb OAZ1 gene. It was confirmed (FIG. 13).

6. 효모의 형질전환6. Transformation of Yeast

밤새 배양한 W303-1A 효모 균주를 YPD 배지에 접종하고 (105~106 세포/ml), 30℃, 180 rpm에서 약 5 시간 동안 배양하여 세포 수가 약 10 배 증가하였을 때 원심분리 (5,000 rpm, 10 min)를 통해 세포를 회수하여 증류수로 세척한 다음, 0.1 M LiOAc 용액 1 mL에 세포를 현탁하였으며, 이후 30 초간 12,000 rpm에서 원심분리하고 다시 동일 용액 450 ㎕에 현탁하였다. 50 ㎕의 세포 용액을 원심분리 튜브에 넣 어 원심분리하여 얻은 세포 펠렛에 순서대로 형질전환 혼합물 (240 ㎕ 50 % PEG3350, 36 ㎕ 1 M LiOAc, 5 ㎕ 10 mg/ml ss DNA, 60 ㎕ DW, 10 ㎕ 플라스미드 DNA)를 넣어 vortex 하였다. 이를 30℃에서 30 분 동안 반응시키고 42℃에서 25 분간 열 충격을 가한 다음, 원심분리 (12,000 rpm, 30 sec)를 통해 세포 펠렛을 회수하였다. 증류수에 재현탁한 세포들을 합성 최소 배지 플레이트에 도말하여 30℃에서 2 일간 배양하였다.Overnight culture inoculated with a yeast strain W303-1A in YPD medium, and (10 5 to 10 6 cells / ml), 30 ℃, incubated at 180 rpm for about 5 hours, the number of cells by centrifugation when the increase of about 10 times (5,000 rpm , 10 min), the cells were collected, washed with distilled water, suspended in 1 mL of 0.1 M LiOAc solution, then centrifuged at 12,000 rpm for 30 seconds, and then suspended in 450 μl of the same solution. 50 μl of the cell solution was placed in a centrifuge tube and centrifuged in the cell pellet obtained in the transfection mixture in order (240 μl 50% PEG3350, 36 μl 1 M LiOAc, 5 μl 10 mg / ml ss DNA, 60 μl DW, 10 μl plasmid DNA) was added and vortexed. It was reacted at 30 ° C. for 30 minutes and subjected to heat shock at 42 ° C. for 25 minutes, and then cell pellets were recovered by centrifugation (12,000 rpm, 30 sec). The cells resuspended in distilled water were plated on a synthetic minimal medium plate and incubated at 30 ° C. for 2 days.

7. 구조변경 7. Change of structure 담배거세미나방Tobacco Seminar Room ODCODC AZAZ ( ( SlitSlit ODCODC AzMAzM )의 발현 확인Expression check

7-1. 형질전환 효모의 배양 및 증식률 분석 7-1. Culture and Growth Rate Analysis of Transgenic Yeast

담배거세미나방의 ODC 및 ODC Az 코딩 cDNA들에 의해 형질전환된 효모 세포들에서의 유전자 발현 양상을 확인하기 위해, 각 실험 군에 따라 선택배지 (+Ura/ 글루코스, -Ura/글루코스, -Ura/갈락토스 및 -Leu -Ade/갈락토스)에 104 세포/ml씩을 접종하여 30℃, 180 rpm에서 24~72 시간 진탕 배양하였으며, 각 세포 배양액 1 ml를 50 배로 희석한 후 hemacytometer를 이용하여 현미경 (x 400) 하에서 세포 수를 계수하였다.To identify the gene expression patterns in yeast cells transformed by ODC and ODC Az-coding cDNAs of tobacco castor moth, the selection medium (+ Ura / glucose, -Ura / glucose, -Ura / Galactose and -Leu -Ade / galactose) were inoculated with 10 4 cells / ml each and shaken incubated for 24 to 72 hours at 30 ° C. and 180 rpm. After diluting 1 ml of each cell culture solution 50 times, a microscope (x) was used with a hemacytometer. The cell number was counted under 400).

7-2. 세포 폴리아민류 함량 분석7-2. Cell polyamine content analysis

효모의 세포 내 폴리아민 수준은 배양된 효모 세포 10 mg에 20 % perchloric acid 2 ml을 가하여 1~2분간 용해한 후, 원심분리 (3,000rpm) 한 상층액을 Bio-Rad AG 50W-X4 음이온 교환 수지 (H+ form, 200~400 mesh)가 충진된 Kontes Econoflex 10 ml 칼럼 (Biorad)에 로딩한 다음, 0.1 M 인산나트륨 중의 0.7 M NaCl(pH 8.0), DW, 1 N HCl로 차례로 washing 한 후 6 N HCl로 용출하여 폴리아민 시료를 제작하였다.Intracellular polyamine levels of yeast were dissolved in 2 mg of 20% perchloric acid in 10 mg of cultured yeast cells for 1 to 2 minutes, and the supernatant obtained by centrifugation (3,000 rpm) was dissolved in Bio-Rad AG 50W-X4 anion exchange resin ( Loaded into a 10 ml column of Kontes Econoflex (Biorad) filled with H + form, 200-400 mesh), washed sequentially with 0.7 M NaCl (pH 8.0), DW, 1 N HCl in 0.1 M sodium phosphate, and then Elution with HCl produced a polyamine sample.

폴리아민 시료 200 ul에 25 ul의 OPT (o-phthaldehyde-mercaptoethanol) reagent를 가해 1 분간 반응시켜 유도체화 하였으며, 100 ul를 고성능액체크로마토그래피 (HPLC, Waters system 600 controller, 474 Scanning fluorescence detector - 340/455 nm excitation/emission filter)에 injection 하여 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민의 수준을 측정하였다. HPLC 분석은 C18 Brownlee lab guard 칼럼이 장착된 Altex Ultrasphere-ODS 칼럼 (5um, 4.6mm x 15cm)을 사용하여, 메탄올 (용매 A)과 0.05 M DCMA (N,N-dimethylcyclohexylamine)가 첨가된 0.1 M 인산염 버퍼 (pH 4.0) (용매 B)를 용출액으로 하여 1 ml/min의 속도에서 gradient program (0~2 min, 20 % A 에서 80 % B; 2~10 min, 80 % A 에서 20 % B linear gradient; 2.3 min hold, 12.3~12.5 min linear to initial condition)으로 실시하였다.25 ul of OPT (o-phthaldehyde-mercaptoethanol) reagent was added to 200 ul of polyamine sample and reacted for 1 minute, and 100 ul was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC, Waters system 600 controller, 474 Scanning fluorescence detector-340/455 The levels of putrescine, spermidine and spermine were measured by injection into the nm excitation / emission filter. HPLC analysis was performed using an Altex Ultrasphere-ODS column (5 μm, 4.6 mm x 15 cm) equipped with a C 18 Brownlee lab guard column, 0.1 M with methanol (solvent A) and 0.05 M DCMA (N, N-dimethylcyclohexylamine) added. Gradient program (0-2 min, 80% B at 20% A; 20% B linear at 2-10 min, 80% A) at 1 ml / min with phosphate buffer (pH 4.0) (solvent B) as eluent gradient; 2.3 min hold, 12.3-12.5 min linear to initial condition).

실시예Example 1: 효모의  1: yeast ODCODC 유전자 ( gene ( SPE1SPE1 ) 녹아웃 효과Knockout effect

1. 증식률1. Proliferation Rate

W303-1A 균주에서 ODC 유전자 (SPE1)을 녹아웃시킨 ODC 결핍 균주 (SPE1::Ura3)의 증식률을 야생형 균주과 비교한 결과 (표 8, 도 14), 배양액 내 세 포의 수가 배양 24 시간과 48 시간에서 각각 야생형 균주의 53 %와 79 %의 수준으로 감소하는 것으로 나타나, SPE1의 녹아웃으로 인한 ODC 발현 중단에 따라 세포의 증식이 저해되는 현상이 확인되었다.The growth rate of the ODC deficient strain ( SPE1 :: Ura3 ) knocked out the ODC gene ( SPE1 ) in the W303-1A strain was compared with that of the wild type strain (Table 8, FIG. 14). At 53% and 79% of the wild type strains, respectively, it was found that the inhibition of ODC expression due to knockout of SPE1 inhibited the proliferation of cells.

표 8. 야생형 및 ODC 결핍 효모 균주의 액체 배양에서 세포 수Table 8. Cell Numbers in Liquid Culture of Wild-Type and ODC Deficient Yeast Strains

균주Strain 24 hrs24 hrs 48 hrs48 hrs 야생형Wild type 2.20 × 108 세포/ml2.20 × 10 8 cells / ml 2.54 × 108 세포/ml2.54 × 10 8 cells / ml ODC 결핍(SPE1 :: Ura3)ODC deficiency ( SPE1 :: Ura3 ) 1.16 × 108 세포/ml1.16 × 10 8 cells / ml 2.01 × 108 세포/ml2.01 × 10 8 cells / ml

2. 폴리아민 수준2. Polyamine Level

W303-1A 균주에서 ODC 유전자 (SPE1)을 녹아웃시킨 ODC 결핍 균주 (SPE1::Ura3)의 세포 폴리아민 수준을 배양 48 시간에서 야생형 균주과 비교한 결과 (표 9, 도 15 및 도 16), SPE1 녹아웃 균주에서 푸트레신은 56 %, 스퍼미딘은 28 %, 스퍼민은 29 %의 수준으로 각각 감소하여, ODC의 결핍으로 인한 폴리아민 합성 감소 효과가 뚜렷이 확인되었다.Cell polyamine levels of the ODC deficient strain ( SPE1 :: Ura3 ) knocking out the ODC gene ( SPE1 ) in the W303-1A strain were compared with the wild type strain at 48 hours of culture (Table 9, FIG. 15 and FIG. 16), SPE1 knockout strain. In putrescine is reduced by 56%, spermidine 28%, spermine 29%, respectively, the effect of reducing polyamine synthesis due to the lack of ODC was clearly observed.

표 9. 야생형 및 ODC 결핍 효모 균주의 폴리아민 함량Table 9. Polyamine Content of Wild-type and ODC Deficient Yeast Strains

균주
Strain
함량* (pg/mg 세포)Content * (pg / mg cells) 푸트레신Putrescine 스퍼미딘Spermidine 스퍼민Spermine 야생형Wild type 8.608.60 62.4962.49 215.43215.43 ODC 결피 (SPE1 :: Ura3)ODC Infection ( SPE1 :: Ura3 ) 4.894.89 17.4917.49 62.3362.33

* 배양 48시간에 측정함* Measured at 48 hours of incubation

실시예Example 2:  2: 효모에서의In yeast 담배거세미나방Tobacco Seminar Room ODCODC cDNAcDNA 발현 효과 Expression effect

1. 증식률1. Proliferation Rate

ODC 유전자 (SPE1)을 녹아웃시킨 ODC 결핍 균주 (SPE1 :: Ura3)을 p413Gal 벡터에 삽입된 담배거세미나방 ODC (Slit ODC) cDNA로 형질전환시킨 균주 (SEP1::Ura3/p413Gal-Slit ODC)과 Slit ODC cDNA가 삽입되지 않은 벡터로 형질전환시킨 균주 (SEP1 :: Ura3/p413Gal)의 증식률을 비교한 결과 (표 10, 도 17), Slit ODC가 도입된 균주의 세포의 수가 배양 48 시간과 72 시간에서 각각 대조군의 약 1.8 배 및 1.6 배 수준으로 증가하여, 효모에 형질도입된 담배거세미나방의 ODC가 SPE1 녹아웃에 따른 효모 ODC의 결핍을 성공적으로 complementation 하는 것으로 확인되었다.ODC ODC gene deficient strain was a knockout (SPE1) (SPE1 :: Ura3) the tobacco giant seminar room into the vector p413Gal ODC (Slit ODC) Comparison of the growth rate of the strain transformed with cDNA ( SEP1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC) and the strain transformed with the vector without Slit ODC cDNA ( SEP1 :: Ura3 / p413Gal) (Table 10 17) The number of cells of the strain into which the Slit ODC was introduced increased to about 1.8- and 1.6-fold levels of the control at 48 and 72 hours of culture, respectively, so that the ODCs of tobacco macromolecules transduced in yeast were subjected to SPE1 knockout. It has been found to successfully complement the lack of yeast ODC.

표 10. Slit ODC cDNA로 형질전환된 효모 균주 또는 형질전환되지 않은 효모 균주의 액체 배양에서 세포 수Table 10. Cell Number in Liquid Culture of Yeast Strains or Untransformed Yeast Strains Transformed with Slit ODC cDNA

균주Strain 48 hrs48 hrs 72 hrs72 hrs SEP1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC A SEP1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC A 6.44 ×107 세포/ml6.44 × 10 7 cells / ml 9.44 ×107 세포/ml9.44 × 10 7 cells / ml SEP1 :: Ura3/p413Gal B SEP1 :: Ura3 / p413Gal B 3.63 ×107 세포/ml3.63 × 10 7 cells / ml 5.81 ×107 세포/ml5.81 × 10 7 cells / ml

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환됨;A, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector;

B, 단지 p413Gal 벡터로 형질전환됨B, only transformed with p413Gal vector

2. 폴리아민 수준2. Polyamine Level

Slit ODC cDNA를 도입시킨 균주 (SEP1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC)의 세포 폴리아민류를 배양 72 시간에서 분석한 결과 (표 11, 도 18 및 도 19), 대조군 (SEP1::Ura3/p413Gal)에 비해 푸트레신은 44.9 배, 스퍼미딘은 4.2 배, 스퍼민은 38.8 배 높은 수준을 나타내어, 담배거세미나방 ODC cDNA의 효모 ODC 유전자 (SPE1)에 대한 complementation 효과가 명확히 확인되었다. Slit Cell polyamines of the strain ( SEP1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC) introduced with ODC cDNA were analyzed at 72 hours of culture (Table 11, FIG. 18 and FIG. 19), and the control group ( SEP1 :: Ura3 / p413Gal). Compared to putrescine 44.9 times, spermidine 4.2 times, spermine 38.8 times higher, the complementation effect on the yeast ODC gene ( SPE1 ) of the tobacco gelatin moth ODC cDNA was clearly confirmed.

표 11. Slit ODC cDNA로 형질전환된 효모 균주 또는 형질전환되지 않은 효모 균주의 폴리아민 함량Table 11.Polyamine Content of Yeast Strains or Untransformed Yeast Strains Transformed with Slit ODC cDNA

균주
Strain
함량* (pg/mg 세포)Content * (pg / mg cells) 푸트레신Putrescine 스퍼미딘Spermidine 스퍼민Spermine SEP1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC A SEP1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC A 275.25275.25 172.74172.74 326.92326.92 SEP1 :: Ura3/p413Gal B SEP1 :: Ura3 / p413Gal B 6.136.13 41.3841.38 8.438.43

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환됨;A, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector;

B, 단지 p413Gal 벡터로 형질전환됨;B, only transformed with p413Gal vector;

* 배양 72시간에 측정됨* Measured at 72 hours of incubation

실시예Example 3: 구조변경  3: restructuring SlitSlit ODCODC AzAz ( ( ODCODC AzMAzM )의 )of SlitSlit ODCODC 에 대한 저해 효과Inhibitory effect on

1. 증식률1. Proliferation Rate

담배거세미나방 ODC (Slit ODC) cDNA로 complementation 된 효모 균주 (SEP1::Ura3/p413Gal-Slit ODC)을 담배거세미나방의 구조변경 ODC Az (Slit ODC AzM) cDNA가 삽입된 PG1 벡터로 형질전환시킨 균주 (SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC AzM)과 구조를 변경치 않은 담배거세미나방 고유의 ODC Az (Slit ODC Az) cDNA가 삽입된 PG1 벡터로 형질전환시킨 균주 (SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC Az)의 증식률을 비교한 결과 (표 12, 도 20), 구조변경 Slit ODC Az cDNA가 도입된 균주의 세포의 수가 배양 24 시간과 48 시간에서 각각 고유의 Slit ODC Az가 도입된 대조군의 43 % 및 56 %의 수준으로 감소하여, 담배거세미나방의 구조변경 ODC Az cDNA 발현이 담배나방의 ODC에 대해 저해 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.Tobacco Seminar ODC ( Slit ODC) Strain transformed into yeast strain ( SEP1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC) complemented with cDNA with PG1 vector incorporating ODC Az ( Slit ODC AzM) cDNA ( SPE1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC / pG1-ODC AzM) and a strain transformed with a PG1 vector inserted with an unmodified structure of tobacco macrosaeng ODC Az ( Slit ODC Az) cDNA ( SPE1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC / pG1-ODC Az) proliferation rate (Table 12, Fig. 20), the number of cells of the strain in which the structural change Slit ODC Az cDNA was introduced, the unique Slit ODC Az was introduced at 24 hours and 48 hours, respectively Reducing the levels of 43% and 56% of the control group, it was confirmed that the structural altered ODC Az cDNA expression of tobacco moth moths has an inhibitory effect on the tobacco moth ODC.

표 12. 변형된 또는 원래의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 효모 균주의 액체 배양에서 세포 수Table 12. Cell number in liquid culture of yeast strains transformed with modified or original Slit ODC Az cDNA

균주Strain 24 hrs24 hrs 48 hrs48 hrs SPE1 :: Ura3/p413Gal-SlitODC/pG1-ODC AzM A SPE1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC / pG1-ODC AzM A 1.87×107 세포/ml1.87 × 10 7 cells / ml 8.37×107 세포/ml8.37 × 10 7 cells / ml SPE1 :: Ura3/p413Gal-SlitODC/pG1-ODC Az B SPE1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC / pG1-ODC Az B 4.31×107 세포/ml4.31 × 10 7 cells / ml 1.48×108 세포/ml1.48 × 10 8 cells / ml

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC AzM cDNA로 형질전환됨;A, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC AzM cDNA of pG1 vector;

B, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환됨B, Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC Az cDNA of pG1 vector

2. 폴리아민 수준2. Polyamine Level

담배거세미나방의 구조변경 ODC Az (Slit ODC AzM) cDNA가 도입된 균주 (SPE1::Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC AzM)의 세포 폴리아민류를 배양 48 시간에서 분석한 결과 (표 11, 도 18 및 도 19), 구조를 변경치 않은 담배거세미나방 고유의 ODC Az (Slit ODC Az) cDNA가 도입된 대조군 (SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC Az)에 비해, 푸트레신은 40.1 %, 스퍼미딘은 64.1 %, 스퍼민은 58.6 %의 수준으로 각각 감소하였다. 이는 폴리아민 대사에서의 frame-shifting과 관련된 ODC Az ORF 내에 존재하는 종결 코돈에서 염기 T를 제거하는 구조변경이 ODC Az가 상시 발현될 수 있도록 하며, 발현된 ODC Az가 효과적으로 ODC의 활성을 저해한다는 사실을 입증하는 것이다.Structural Changes of Tobacco Semicoated Moths Cell polyamines of strains ( SPE1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC / pG1-ODC AzM) incorporating ODC Az ( Slit ODC AzM) cDNA were analyzed at 48 hours of culture (Table 11, 18 and 19), compared to the control ( SPE1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC / pG1-ODC Az) in which the structure of the tobacco-coated semi-ovary-specific ODC Az ( Slit ODC Az) cDNA was not changed. Trecine decreased to 40.1%, spermidine 64.1%, and spermin 58.6%. This suggests that the alteration of the removal of base T from the termination codons present in the ODC Az ORF associated with frame-shifting in polyamine metabolism allows ODC Az to be expressed at all times and that the expressed ODC Az effectively inhibits ODC activity. To prove that.

표 13. 변형된 또는 원래의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 효모 균주의 폴리아민 함량Table 13. Polyamine Content of Yeast Strains Modified or Modified with Original Slit ODC Az cDNA

균주
Strain
함량* (pg/mg 세포)Content * (pg / mg cells) 푸트레신Putrescine 스퍼미딘Spermidine 스퍼민Spermine SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC AzM A SPE1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC / pG1-ODC AzM A 7.717.71 52.5352.53 10.8410.84 SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC Az B SPE1 :: Ura3 / p413Gal- Slit ODC / pG1-ODC Az B 19.2119.21 82.0282.02 18.5018.50

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC AzM cDNA로 형질전환됨;A, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC AzM cDNA of pG1 vector;

B, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환됨;B, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC Az cDNA of pG1 vector;

* 배양 48시간에 측정됨* Measured at 48 hours of incubation

도 1은 담배거세미나방의 정소 cDNA로부터 증폭된 ODC의 코아 도메인(1,110 bp)을 코딩하는 PCR 산물을 보여준다.Degree Figure 1 shows the PCR product encoding the core domain (1,110 bp) of ODC amplified from testicular cDNA of tobacco macromolecular moth.

1, partial domain 단편;1, partial domain fragment;

M, 크기 마커M, size marker

도 2는 담배거세미나방의 정소에서 ODC cDNA의 RACE PCR 산물을 보여준다.Figure 2 shows the RACE PCR product of ODC cDNA in the testis of tobacco castor moth.

3', pCR2.1 벡터에 3' 말단의 삽입;3 ', insertion of 3' end into pCR2.1 vector;

5', pCR2.1 벡터에 5' 말단의 삽입;5 ', insertion of 5' end into pCR2.1 vector;

M, 크기 마커M, size marker

도 3은 담배거세미나방의 정소 cDNA로부터 증폭된 Slit ODC 의 ORF cDNA를 보여준다.Figure 3 is alit Slit amplified from testicular cDNA of tobacco giant Show the ORF cDNA of the ODC.

1, 전장 ORF cDNA;1, full length ORF cDNA;

M, 크기 마커M, size marker

도 4는 재조합 효모 발현 벡터 p413GAL-Slit ODC 의 모식도이다.4 shows the recombinant yeast expression vector p413GAL- Slit. It is a schematic diagram of ODC.

도 5는 담배거세미나방의 정소 cDNA로부터 증폭된 ODC Az의 core domain(1,110 bp)을 코딩하는 PCR 산물을 보여준다.Degree 5 shows a PCR product encoding the core domain (1,110 bp) of ODC Az amplified from testicular cDNA of tobacco macromolecular moth.

1, partial domain 단편;1, partial domain fragment;

M, 크기 마커M, size marker

도 6은 담배거세미나방의 정소에서 ODC Az cDNA 의 RACE PCR 산물을 보여준다.Figure 6 shows the RACE PCR product of ODC Az cDNA in the testis of tobacco weed.

3', pCR2.1 벡터에서 3' 말단의 삽입;3 ', insertion of 3' end in pCR2.1 vector;

5', pCR2.1 벡터에서 5' 말단의 삽입;5 ', insertion of 5' end in pCR2.1 vector;

M, 크기 마커M, size marker

도 7은 담배거세미나방의 정소 cDNA로부터 증폭된 Slit ODC Az의 ORF cDNA를 보여준다.Figure 7 Slit amplified from testicular cDNA of tobacco macromoth The ORF cDNA of ODC Az is shown.

1, 전장 ORF cDNA;1, full length ORF cDNA;

M, 크기 마커M, size marker

도 8은 효모 (Saccharomyces cerevisiae) ODC 유전자(SPE1)에 URA3 의 삽입을 보여준다.8 is yeast ( Saccharomyces) cerevisiae ) shows the insertion of URA3 into the ODC gene ( SPE1 ).

도 9는 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에서 ODC 유전자 (SPE1)의 녹아웃을 보여준다.9 is yeast ( Saccharomyces) cerevisiae ) shows knockout of the ODC gene ( SPE1 ).

도 10은 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에서 URA3 인서트를 갖는 녹아웃된 ODC 유전자 (SPE1)의 확인 결과이다.10 is yeast ( Saccharomyces) cerevisiae ) is the result of identification of knocked out ODC gene ( SPE1 ) with URA3 insert.

도 11은 효모 (Saccharomyces cerevisiae)의 ODC Az 유전자 (OAZ1) 내로 Hy의 삽입을 보여준다.11 is yeast ( Saccharomyces) cerevisiae ) shows the insertion of Hy into the ODC Az gene ( OAZ1 ).

도 12는 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에서 ODC Az 유전자 (OAZ1)의 녹아웃을 보여준다.12 is yeast ( Saccharomyces) cerevisiae ) shows knockout of the ODC Az gene ( OAZ1 ).

도 13은 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에서 Hy 인서트를 갖는 녹아웃된 ODC Az 유전자 (OAZ1) 확인 결과이다.13 is yeast ( Saccharomyces) cerevisiae ) knocked out ODC Az gene ( OAZ1 ) with Hy insert.

도 14는 야생형 (A) 및 ODC 결핍 (B) 균주 사이의 성장 속도의 비교 결과이 다.14 is a comparison of the growth rates between wild type (A) and ODC deficient (B) strains.

도 15는 야생형 (A) 및 ODC 결핍 (B) 효모 균주의 폴리아민의 HPLC 크로마토그램이다.15 is an HPLC chromatogram of polyamines from wild type (A) and ODC deficient (B) yeast strains.

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민PUT, putrescine; SPD, spermidine; SPM, spermine

도 16은 야생형 (A) 및 ODC 결핍 (B) 효모 균주 사이의 세포 폴리아민 함량의 비교 결과이다.16 is a comparison of cellular polyamine content between wild type (A) and ODC deficient (B) yeast strains.

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민PUT, putrescine; SPD, spermidine; SPM, spermine

도 17은 Slit ODC cDNA로 형질전환된 균주 (A) 또는 형질전환되지 않은 균주 (B) 사이의 세포 수의 비교 결과이다.17 is a comparison of cell numbers between strains (A) or strains (B) transformed with Slit ODC cDNA.

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환됨;A, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector;

B, 단지 p413Gal 벡터로 형질전환됨B, only transformed with p413Gal vector

도 18은 p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환된 효모 균주 (A) 및 단지 p413Gal 벡터로 형질전환된 효모 균주 (B)의 폴리아민의 HPLC 크로마토그램이다.FIG. 18 is an HPLC chromatogram of polyamines of yeast strain (A) transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector and only yeast strain (B) transformed with p413Gal vector.

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민PUT, putrescine; SPD, spermidine; SPM, spermine

도 19는 Slit ODC cDNA로 형질전환된 효모 균주 (A) 또는 형질전환되지 않은 효모 균주 (B) 사이의 세포 폴리아민 함량의 비교 결과이다.19 is a comparison of cellular polyamine content between yeast strains (A) or untransformed yeast strains (B) transformed with Slit ODC cDNA.

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환됨;A, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector;

B, 단지 p413Gal 벡터로 형질전환됨B, only transformed with p413Gal vector

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민PUT, putrescine; SPD, spermidine; SPM, spermine

도 20은 변형된 (A) 또는 원래의 (B) Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 배양된 효모 균주의 세포 수의 비교 결과이다.20 is a comparison of cell numbers of cultured yeast strains transformed with modified (A) or original (B) Slit ODC Az cDNA.

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC AzM cDNA로 형질전환됨;A, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC AzM cDNA of pG1 vector;

B, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환됨B, Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC Az cDNA of pG1 vector

도 21은 변형된 (A) 또는 원래의 (B) Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 효모 균주의 폴리아민의 HPLC 크로마토그램이다.21 is an HPLC chromatogram of polyamines of yeast strains transformed with modified (A) or original (B) Slit ODC Az cDNA.

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC AzM cDNA로 형질전환됨;A, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC AzM cDNA of pG1 vector;

B, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환됨B, Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC Az cDNA of pG1 vector

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민PUT, putrescine; SPD, spermidine; SPM, spermine

도 22는 변형된 (A) 및 원래의 (B) Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 효모 균주 사이의 세포 폴리아민 함량 비교 결과이다.22 is a comparison of cellular polyamine content between yeast strains transformed with modified (A) and original (B) Slit ODC Az cDNA.

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC AzM cDNA로 형질전환됨;A, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC AzM cDNA of pG1 vector;

B, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환됨;B, transformed with Slit ODC cDNA of p413Gal vector and Slit ODC Az cDNA of pG1 vector;

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민PUT, putrescine; SPD, spermidine; SPM, spermine

<110> Hannam University Institute for Industry-Academia Cooperation Nexgen Biotechnologies, Inc. <120> Gene encoding ornithine decarboxylase antizyme protein from Spodoptera litura and uses thereof <130> PN09142 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 814 <212> DNA <213> Spodoptera litura <400> 1 atgacgaagt taatacaaca attaaatttt agtagtagta ttagtagtaa ttataataat 60 tactacgacg tcgctggctt ggaaccaccc gctgttgaag agaagaatta ctatggcgac 120 agcgcgtctt tgagcgcggc cggcagcaag cgctcggctt tgtcggcttc cgacgccgag 180 tgtttctcgc tgtgcctggg tgccgggcct ctgtggtggt cctgatgttc cggctcacgg 240 ctcggcaccg cccggagggg tgaatggcgg ggccgcgagc cccgctaccc catctacacc 300 cacccacgac gacaacaacc gtgacttgtt gagcgcccta ctatgggcaa gcgcgagttc 360 cctcgcgtcc agcgcggagt ctctcgtcac cgagtcccag tctcccacgc atgcgcaccc 420 agcactccac cagcaacgca gagaagcggt tataagcaag attctggaac gcaaggacag 480 gcagccggta aaaatcgact ttaagatctt ccttactgag aacacggtga cccgctggga 540 agctgtggtc caaggtggca ctatctacct gcgtatgccg ggagtccttc agtccggcag 600 taaggagagc ttcatgctac ttctggactt cgccgaggaa aggctggggt gtaacaactg 660 catcatctgc gtcctgaaga gccgaccgga ccgcgccacc attctccgca ctttcatgtt 720 catgggattc cagttactcc caccaaactc ccctcttatg ccgcaagaaa tcaccaaccc 780 ggagtacata ttcctgcact acaatatgca gtaa 814 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Spodoptera litura <400> 2 Met Thr Lys Leu Ile Gln Gln Leu Asn Phe Ser Ser Ser Ile Ser Ser 1 5 10 15 Asn Tyr Asn Asn Tyr Tyr Asp Val Ala Gly Leu Glu Pro Pro Ala Val 20 25 30 Glu Glu Lys Asn Tyr Tyr Gly Asp Ser Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly 35 40 45 Ser Lys Arg Ser Ala Leu Ser Ala Ser Asp Ala Glu Cys Phe Ser Leu 50 55 60 Cys Leu Gly Ala Gly Pro Leu Trp Trp Ser Asp Val Pro Ala His Gly 65 70 75 80 Ser Ala Pro Pro Gly Gly Val Asn Gly Gly Ala Ala Ser Pro Ala Thr 85 90 95 Pro Ser Thr Pro Thr His Asp Asp Asn Asn Arg Asp Leu Leu Ser Ala 100 105 110 Leu Leu Trp Ala Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Ser Ala Glu Ser Leu 115 120 125 Val Thr Glu Ser Gln Ser Pro Thr His Ala His Pro Ala Leu His Gln 130 135 140 Gln Arg Arg Glu Ala Val Ile Ser Lys Ile Leu Glu Arg Lys Asp Arg 145 150 155 160 Gln Pro Val Lys Ile Asp Phe Lys Ile Phe Leu Thr Glu Asn Thr Val 165 170 175 Thr Arg Trp Glu Ala Val Val Gln Gly Gly Thr Ile Tyr Leu Arg Met 180 185 190 Pro Gly Val Leu Gln Ser Gly Ser Lys Glu Ser Phe Met Leu Leu Leu 195 200 205 Asp Phe Ala Glu Glu Arg Leu Gly Cys Asn Asn Cys Ile Ile Cys Val 210 215 220 Leu Lys Ser Arg Pro Asp Arg Ala Thr Ile Leu Arg Thr Phe Met Phe 225 230 235 240 Met Gly Phe Gln Leu Leu Pro Pro Asn Ser Pro Leu Met Pro Gln Glu 245 250 255 Ile Thr Asn Pro Glu Tyr Ile Phe Leu His Tyr Asn Met Gln 260 265 270 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' gene-specific primer <400> 3 gggcactggc ttcgattgcg c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' degenerate primer <400> 4 yyayttsags gcrcaytcsa c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 5 tgtcattcca cgtgggtagc g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 6 ggggaagtgc tcctccaaag c 21 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 7 atgaaggtcg tggaa 15 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 8 tcacttgagc gcgcactc 18 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 9 ctgtggtggt cctgatgttc c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 10 ctcttcggcg aaatccagag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 11 tcaccgagtc ccagtctccc a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 12 gcttctctgc gttgctggtg g 21 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 13 gggggatcca tgacgaagtt aatacaacaa 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 14 ggggagctct tactgcatat tgtagtgcag 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> point mutated primer #1 <400> 15 cctctgtggt ggtccgatgt tccggctcag 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> point mutated primer #2 <400> 16 gtcacgcgga acatcggacc accacagagg 30 <110> Hannam University Institute for Industry-Academia Cooperation          Nexgen Biotechnologies, Inc. <120> Gene encoding ornithine decarboxylase antizyme protein from          Spodoptera litura and uses <130> PN09142 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 814 <212> DNA <213> Spodoptera litura <400> 1 atgacgaagt taatacaaca attaaatttt agtagtagta ttagtagtaa ttataataat 60 tactacgacg tcgctggctt ggaaccaccc gctgttgaag agaagaatta ctatggcgac 120 agcgcgtctt tgagcgcggc cggcagcaag cgctcggctt tgtcggcttc cgacgccgag 180 tgtttctcgc tgtgcctggg tgccgggcct ctgtggtggt cctgatgttc cggctcacgg 240 ctcggcaccg cccggagggg tgaatggcgg ggccgcgagc cccgctaccc catctacacc 300 cacccacgac gacaacaacc gtgacttgtt gagcgcccta ctatgggcaa gcgcgagttc 360 cctcgcgtcc agcgcggagt ctctcgtcac cgagtcccag tctcccacgc atgcgcaccc 420 agcactccac cagcaacgca gagaagcggt tataagcaag attctggaac gcaaggacag 480 gcagccggta aaaatcgact ttaagatctt ccttactgag aacacggtga cccgctggga 540 agctgtggtc caaggtggca ctatctacct gcgtatgccg ggagtccttc agtccggcag 600 taaggagagc ttcatgctac ttctggactt cgccgaggaa aggctggggt gtaacaactg 660 catcatctgc gtcctgaaga gccgaccgga ccgcgccacc attctccgca ctttcatgtt 720 catgggattc cagttactcc caccaaactc ccctcttatg ccgcaagaaa tcaccaaccc 780 ggagtacata ttcctgcact acaatatgca gtaa 814 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Spodoptera litura <400> 2 Met Thr Lys Leu Ile Gln Gln Leu Asn Phe Ser Ser Ser Ile Ser Ser   1 5 10 15 Asn Tyr Asn Asn Tyr Tyr Asp Val Ala Gly Leu Glu Pro Pro Ala Val              20 25 30 Glu Glu Lys Asn Tyr Tyr Gly Asp Ser Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly          35 40 45 Ser Lys Arg Ser Ala Leu Ser Ala Ser Asp Ala Glu Cys Phe Ser Leu      50 55 60 Cys Leu Gly Ala Gly Pro Leu Trp Trp Ser Asp Val Pro Ala His Gly  65 70 75 80 Ser Ala Pro Pro Gly Gly Val Asn Gly Gly Ala Ala Ser Pro Ala Thr                  85 90 95 Pro Ser Thr Pro Thr His Asp Asp Asn Asn Arg Asp Leu Leu Ser Ala             100 105 110 Leu Leu Trp Ala Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Ser Ala Glu Ser Leu         115 120 125 Val Thr Glu Ser Gln Ser Pro Thr His Ala His Pro Ala Leu His Gln     130 135 140 Gln Arg Arg Glu Ala Val Ile Ser Lys Ile Leu Glu Arg Lys Asp Arg 145 150 155 160 Gln Pro Val Lys Ile Asp Phe Lys Ile Phe Leu Thr Glu Asn Thr Val                 165 170 175 Thr Arg Trp Glu Ala Val Val Gln Gly Gly Thr Ile Tyr Leu Arg Met             180 185 190 Pro Gly Val Leu Gln Ser Gly Ser Lys Glu Ser Phe Met Leu Leu Leu         195 200 205 Asp Phe Ala Glu Glu Arg Leu Gly Cys Asn Asn Cys Ile Ile Cys Val     210 215 220 Leu Lys Ser Arg Pro Asp Arg Ala Thr Ile Leu Arg Thr Phe Met Phe 225 230 235 240 Met Gly Phe Gln Leu Leu Pro Pro Asn Ser Pro Leu Met Pro Gln Glu                 245 250 255 Ile Thr Asn Pro Glu Tyr Ile Phe Leu His Tyr Asn Met Gln             260 265 270 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 5 'gene-specific primer <400> 3 gggcactggc ttcgattgcg c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 'degenerate primer <400> 4 yyayttsags gcrcaytcsa c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 'primer <400> 5 tgtcattcca cgtgggtagc g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 'primer <400> 6 ggggaagtgc tcctccaaag c 21 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 'primer <400> 7 atgaaggtcg tggaa 15 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 'primer <400> 8 tcacttgagc gcgcactc 18 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 'primer <400> 9 ctgtggtggt cctgatgttc c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 'primer <400> 10 ctcttcggcg aaatccagag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 'primer <400> 11 tcaccgagtc ccagtctccc a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 'primer <400> 12 gcttctctgc gttgctggtg g 21 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 'primer <400> 13 gggggatcca tgacgaagtt aatacaacaa 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 'primer <400> 14 ggggagctct tactgcatat tgtagtgcag 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> point mutated primer # 1 <400> 15 cctctgtggt ggtccgatgt tccggctcag 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> point mutated primer # 2 <400> 16 gtcacgcgga acatcggacc accacagagg 30  

Claims (12)

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 담배거세미나방 (Spodoptera litura) 유래의 ODC Az (ornithine decarboxylase antizyme) 단백질.An ODC Az (ornithine decarboxylase antizyme) protein from Spodoptera litura , consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 제1항의 ODC Az 단백질을 코딩하는 유전자.The gene encoding the ODC Az protein of claim 1. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.According to claim 2, wherein the gene is a gene, characterized in that consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 제3항에 있어서, 상기 유전자 서열번호 1의 염기서열 중 223번째 염기인 T가 결실된 ODC AzM 인 것을 특징으로 하는 유전자.The gene according to claim 3, wherein the 223nd base T in the nucleotide sequence of the gene SEQ ID NO: 1 is deleted ODC AzM. 제4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.Recombinant vector comprising the gene of claim 4. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.A host cell transformed with the recombinant vector of claim 5. 제6항에 있어서, 세포 증식이 저해되고, 폴리아민류 합성이 감소된 것을 특징으로 하는 숙주 세포.7. The host cell of claim 6, wherein cell proliferation is inhibited and polyamine synthesis is reduced. 제6항에 있어서, 효모인 것을 특징으로 하는 숙주세포.The host cell according to claim 6, which is a yeast. 숙주 세포를 제5항의 재조합 벡터로 형질전환시켜 ODC AzM 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 숙주 세포 내의 ODC (ornithine decarboxylase) 단백질을 불활성화시키는 방법.A method of inactivating an ornithine decarboxylase (ODC) protein in a host cell comprising transforming the host cell with the recombinant vector of claim 5 to overexpress the ODC AzM gene. 제9항에 있어서, 상기 ODC 단백질 불활성화에 의해 숙주 세포 증식을 저해하고, 폴리아민류 합성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the ODC protein inactivation inhibits host cell proliferation and reduces polyamine synthesis. 제9항에 있어서, 상기 숙주 세포는 효모인 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein said host cell is yeast. 숙주 세포에서 ODC Az 유전자를 분리하는 단계;Isolating the ODC Az gene from the host cell; ODC 단백질을 불활성화시킬 수 있도록 ODC Az 염기서열을 변경시키는 단계; 및Altering the ODC Az sequence to inactivate the ODC protein; And 상기 변경된 ODC Az 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 변경된 ODC Az 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 숙주 세포 내의 ODC (ornithine decarboxylase) 단백질을 불활성화시키는 방법.A method of inactivating an ornithine decarboxylase (ODC) protein in a host cell, comprising overexpressing the altered ODC Az gene by transforming the host cell with a recombinant vector comprising the altered ODC Az sequence.
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Molecules and Cells, 20091119, Vol. 28, pages 575-581

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