JP2002538769A - Xenogeneic transfer of apoptotic genes and transgenic plants developed thereby - Google Patents

Xenogeneic transfer of apoptotic genes and transgenic plants developed thereby

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JP2002538769A JP2000579763A JP2000579763A JP2002538769A JP 2002538769 A JP2002538769 A JP 2002538769A JP 2000579763 A JP2000579763 A JP 2000579763A JP 2000579763 A JP2000579763 A JP 2000579763A JP 2002538769 A JP2002538769 A JP 2002538769A
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apoptosis
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ビー． ディックマン，マーティン
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ユニバーシティ オブ ネブラスカ−リンカーン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物細胞へのアポトーシス遺伝子の異種間伝達、それから開発された植物、及び上記植物を用いたスクリーニング・アッセイに関する。本発明は、トランスジェニック植物細胞を用いた医薬発見スクリーニング方法にも関する。さらに、本発明は、非植物タンパク質及び核酸を用いた植物アポトーシス経路成分の同定方法にも関する。 (57) Abstract The present invention relates to cross-species transmission of apoptotic genes to plant cells, plants developed therefrom, and screening assays using the above plants. The present invention also relates to a method for screening for drug discovery using transgenic plant cells. Furthermore, the present invention relates to a method for identifying a component of a plant apoptosis pathway using a non-plant protein and a nucleic acid.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 発明の属する技術分野 本発明は、一般に、植物におけるアポトーシスの修飾に関し、詳しくは、非植
物種から植物へのアポトーシス経路タンパク質をコード化する遺伝子の新しい移
入、及びそれによるいろいろな生物的及び非生物的攻撃に対する抵抗性の強化な
らびに他の関連した利点を有する植物の生成、に関する。[0001] The present invention relates generally to the modification of apoptosis in plants, and in particular, to the novel transfer of genes encoding apoptosis pathway proteins from non-plant species to plants, and thereby to various biological processes. And the production of plants with enhanced resistance to abiotic attack and other related advantages.

【０００２】 発明の背景 動物細胞におけるプログラムされた細胞死を誘発する複雑な信号経路に関する
理解が最近進展しており、それに伴って、進化的には隔たりのある生物、例えば
植物、における同様な経路を明らかにしようとする研究が盛んになっている。植
物では、プログラムされた細胞死という機制は発生の際の特定の時点で出現する
と認識されており、病原体への応答として解発される可能性がある（Woodson et
al., Plant Physiol. 99:526-532, 1992; O'Neil et al., The Plant Cell 5:4
19-432, 1993; Chasan, The Plant Cell 6:917-919, 1994; Smart, New Phytol
. 126:419-448, 1994; Keen, Ann. Rev. Genet. 24:447-463, 1990; Lamb, Cell
76:419-422, 1994; Mittler et al., Cell 7:29-42,1995 ）。細胞死が決定的
な役割を演ずると言われている疾病関連状況としては、不適合な植物−微生物相
互作用に特徴的な過敏抵抗性（ＨＲ）と関連した細胞死がある。ＤＮＡはしご（
ladder）やアポトーティック・ボディー（Wyllie, Curr. Opin. Gen. Dev. 5:97
-104,1995）を含めて、アポトーシスの証拠を示す形態学的な証拠は、植物発生
、疾病関連死、及び過敏反応において報告されているが（Wang et al., The Pla
nt Cell 8:375-391, 1996; Ryerson and Heath, The Plant Cell 8:393-402, 19
96）、植物の細胞死をコントロールする遺伝子及び対応するタンパク質について
、また、動物細胞におけるアポトーシスをコントロールする動物の遺伝子（脊椎
動物及び無脊椎動物）が植物において相同体を有するかどうかについては、ほと
んど何も知られていない。BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] Recent understanding of complex signal pathways that trigger programmed cell death in animal cells has been accompanied by similar pathways in evolutionarily separated organisms such as plants. Research to clarify is becoming active. In plants, the programmed mechanism of cell death is recognized to emerge at a specific point in development and may be triggered in response to a pathogen (Woodson et al.
al., Plant Physiol. 99: 526-532, 1992; O'Neil et al., The Plant Cell 5: 4
19-432, 1993; Chasan, The Plant Cell 6: 917-919, 1994; Smart, New Phytol
126: 419-448, 1994; Keen, Ann. Rev. Genet. 24: 447-463, 1990; Lamb, Cell.
76: 419-422, 1994; Mittler et al., Cell 7: 29-42, 1995). Disease-related situations in which cell death is said to play a critical role include cell death associated with hypersensitivity resistance (HR) characteristic of incompatible plant-microbial interactions. DNA ladder (
ladder) and apoptotic body (Wyllie, Curr. Opin. Gen. Dev. 5:97
Morphological evidence, including evidence of apoptosis, has been reported in plant development, disease-related death, and hypersensitivity reactions (Wang et al., The Plasm).
nt Cell 8: 375-391, 1996; Ryerson and Heath, The Plant Cell 8: 393-402, 19
96), about genes and corresponding proteins that control plant cell death and whether animal genes (vertebrates and invertebrates) that control apoptosis in animal cells have homologues in plants. Nothing is known.

【０００３】 動物組織においてはホメオスタシス（生体恒常性）がアポトーシスという過程
−すなわち、プログラムされた細胞死という正常な生理的過程−によって維持さ
れている。正常細胞のターンオーバーを阻止又は遅らせるアポトーシス経路の変
化は、細胞サイクルの調節の異常と同様に、疾病の病因として重要になることが
ある。細胞サイクル調節タンパク質の間の複雑な相互作用でコントロールされる
細胞***と同様、アポトーシスも、正常な状況では細胞死を阻止又は誘発する遺
伝子の産物の相互作用によって同様に調節される。[0003] In animal tissues, homeostasis is maintained by a process called apoptosis, a normal physiological process of programmed cell death. Alterations in the apoptotic pathway that prevent or delay normal cell turnover, as well as dysregulation of the cell cycle, can be important as pathogens of disease. Like cell division, which is controlled by complex interactions between cell cycle regulatory proteins, apoptosis is likewise regulated by the interaction of gene products that, in normal circumstances, prevent or trigger cell death.

【０００４】 アポトーシスには、胚の発生、免疫細胞の調節、及び正常な細胞のターンオー
バー、など一連の生理的プロセスにおける生体恒常性を維持する機能があるので
、調節されたアポトーシスの不調又は喪失は、いろいろな疾病状態につながる可
能性がある。例えば、アポトーシスが働かなくなると、多くの自己免疫疾患で見
られるような自己反応的なリンパ球の病的蓄積に導く可能性がある。アポトーシ
スの不適切な喪失又は阻害は、ウイルス感染細胞、新生物、又は腫瘍細胞などの
異常繁殖性の細胞の蓄積につながる可能性がある。同様に、アポトーシスの不適
切な活性化は、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、神経萎縮疾患、及
び虚血障害、などのいろいろな疾病状態を引き起こす可能性がある。これら及び
その他の疾病状態においてアポトーシス経路を修飾するように特に設計された治
療によってこれらの疾患の多くの自然な進行を変化させることができる。したが
って、動物において認識されているアポトーシスの重要性、及び植物における病
原抵抗性の発生に関して報告されているその重要性（Mittler, When Cell Die,
Lockshin et al. (eds.), pp. 147-174, 1998）を考えると、植物などの生物に
おけるアポトーシス経路を理解することは重要な価値がある。[0004] Apoptosis has the function of maintaining homeostasis in a series of physiological processes, such as embryonic development, regulation of immune cells, and normal cell turnover, and thus upregulation or loss of regulated apoptosis Can lead to various disease states. For example, failure of apoptosis can lead to pathological accumulation of self-reactive lymphocytes, as seen in many autoimmune diseases. Improper loss or inhibition of apoptosis can lead to the accumulation of abnormally proliferating cells, such as virus-infected cells, neoplasms, or tumor cells. Similarly, inappropriate activation of apoptosis can cause various disease states, such as, for example, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), neurotrophic disease, and ischemic injury. Many natural progressions of these diseases can be altered by treatments specifically designed to modify the apoptotic pathway in these and other disease states. Therefore, the importance of apoptosis recognized in animals and its significance reported for the development of pathogen resistance in plants (Mittler, When Cell Die,
Given Lockshin et al. (Eds.), Pp. 147-174, 1998), it is important to understand the apoptotic pathway in organisms such as plants.

【０００５】 アポトーシスは、いろいろな信号と、細胞の遺伝子産物の複雑な相互作用によ
って媒介されているが、この相互作用の結果は最終的にはヒトと無脊椎動物の間
で進化的に保存されている細胞死の経路に送り込まれる。この経路自体は、血液
の凝固カスケードのそれと同様なタンパク質分解チモーゲン活性化のカスケード
を含んでいる。興味深いことに、植物における類似の経路を同定しようとする努
力は未だ結実に至らず、哺乳類と無脊椎動物におけるアポトーシスと植物におけ
るプログラムされた細胞死の経路のそれとの関連は、いくら良く言っても、曖昧
なままにとどまっている。しかし、過敏反応及び植物の老化は、プログラムされ
た細胞死の経路と矛盾しない特性を示している（Drake et al., Plant Mol. Bio
l. 30:755-767, 1996）。したがって、植物のプログラムされた細胞死の経路に
ついての理解は、それを調節する方法に導き、したがってまた、ユニークな表現
型特性、例えば、いろいろな生物的及び非生物的な攻撃に対する抵抗性や、カッ
トされた植物、フルーツ、及び野菜、の長い貯蔵寿命、などの特性を備えた細胞
死修飾因子を含む遺伝子導入植物に導く可能性がある。[0005] Apoptosis is mediated by a complex interaction of various signals and cellular gene products, the result of which is ultimately evolutionarily conserved between humans and invertebrates. Into the cell death pathway. This pathway itself involves a cascade of proteolytic zymogen activation similar to that of the blood coagulation cascade. Interestingly, efforts to identify similar pathways in plants have yet to bear fruit, and the link between apoptosis in mammals and invertebrates and that of programmed cell death in plants, at best, , Stays vague. However, hypersensitivity reactions and plant aging have shown properties that are consistent with programmed cell death pathways (Drake et al., Plant Mol. Bio.
l. 30: 755-767, 1996). Thus, an understanding of the pathway of programmed cell death in plants leads to ways to regulate it, and therefore also has unique phenotypic characteristics, such as resistance to various biological and abiotic attacks, It may lead to transgenic plants containing cell death modifiers with properties such as long shelf life of cut plants, fruits and vegetables.

【０００６】 このように、植物における細胞死経路の成分を同定する方法、及び、植物にお
けるプログラムされた細胞死を修飾する方法、が必要とされている。さらに、作
物の収率を高め生命力を強化するために生物的及び非生物的な攻撃に抵抗性を有
する植物を生み出す必要がある。また、老化がゆるやかな植物及び植物生成物を
生み出すことも必要とされている。本発明は、アポトーシス経路タンパク質をコ
ード化する遺伝子の異種間移入によって、植物細胞の病気と老化を防止するよう
に植物のプログラムされた細胞死経路を修飾することを可能にし、化合物のアポ
トーシス阻害及び増強能力を分析するための方法及び組成物を提供し、またその
他の関連した利点を提供することによって、上記の必要を満たすものである。 発明の要約 簡単に言うと、本発明は、生物学的に機能するアポトーシス経路タンパク質を
コード化しているヌクレオチド配列を利用して植物におけるアポトーシスを修飾
する方法を提供する。[0006] Thus, there is a need for methods of identifying components of the cell death pathway in plants and methods of modifying programmed cell death in plants. In addition, there is a need to create plants that are resistant to biological and abiotic attacks in order to increase crop yields and enhance vitality. There is also a need to produce plants and plant products with slow aging. The present invention makes it possible to modify the programmed cell death pathway of plants to prevent disease and senescence of plant cells by xenotransferring genes encoding apoptosis pathway proteins, to inhibit apoptosis of compounds and to inhibit apoptosis of compounds. The above needs are met by providing methods and compositions for analyzing potentiating capacity and by providing other related advantages. SUMMARY OF THE INVENTION Briefly, the present invention provides a method of modulating apoptosis in plants using a nucleotide sequence encoding a biologically functional apoptosis pathway protein.

【０００７】 一つの態様では、本発明は、生物学的に機能するアポトーシス経路タンパク質
、又はその機能的な変型、をコード化できる少なくとも一つの異種ヌクレオチド
配列を含む植物細胞からなる遺伝子導入植物を提供する。いくつかの実施形態で
は、この遺伝子導入植物は、抗アポトーシス・タンパク質をコード化するヌクレ
オチド配列を有する。いろいろな実施形態で、ヌクレオチド配列はCed-9, Bcl-2
, IAP, E1B 19K, 及びそれらの機能的変型、をコード化する。さらに別の実施形
態では、アポトーシス経路タンパク質の発現は、組織特異的プロモーター、誘発
プロモーター、又は構成プロモーターによってコントロールされる。他のいくつ
かの実施形態では、植物は病原体又は老化抵抗性である。以下で詳しく述べるよ
うに、本発明の別の態様はいろいろな生物的又は非生物的な抵抗性を有する植物
を提供する。[0007] In one aspect, the invention provides a transgenic plant comprising a plant cell comprising at least one heterologous nucleotide sequence capable of encoding a biologically functional apoptosis pathway protein, or a functional variant thereof. I do. In some embodiments, the transgenic plant has a nucleotide sequence that encodes an anti-apoptotic protein. In various embodiments, the nucleotide sequence is Ced-9, Bcl-2
, IAP, E1B 19K, and their functional variants. In yet another embodiment, the expression of an apoptosis pathway protein is controlled by a tissue-specific, inducible, or constitutive promoter. In some other embodiments, the plant is pathogen or aging resistant. As described in detail below, another aspect of the present invention provides plants having various biological or abiotic resistances.

【０００８】 本発明は、また、生物学的に機能するアポトーシス経路タンパク質、又はその
機能的な変型、をコード化することができる異種ヌクレオチド配列を含む植物細
胞及び種子を提供する。別のいろいろな実施形態では、遺伝子導入植物について
上で述べたと同じ特性を有する植物細胞が提供される。 上述のように、本発明は、生物的な攻撃に抵抗性を有する遺伝子導入植物を提
供する。この植物は、生物学的に機能するアポトーシス経路タンパク質、好まし
くは抗アポトーシス・タンパク質、をコード化する異種核酸配列を含む。いくつ
かの実施形態では、この抗アポトーシス・タンパク質は、Ced-9, Bcl-2, IAP, E
1B 19K, 及びそれらの相同体、から成る群から選択される。いろいろな実施形態
で、この生物的な攻撃は病原体による結果である。[0008] The present invention also provides plant cells and seeds comprising a heterologous nucleotide sequence capable of encoding a biologically functional apoptotic pathway protein, or a functional variant thereof. In various other embodiments, there is provided a plant cell having the same properties as described above for the transgenic plant. As mentioned above, the present invention provides transgenic plants that are resistant to biological attack. The plant contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a biologically functional apoptotic pathway protein, preferably an anti-apoptotic protein. In some embodiments, the anti-apoptotic protein is Ced-9, Bcl-2, IAP, E
1B 19K, and homologs thereof. In various embodiments, the biological attack is the result of a pathogen.

【０００９】 ある関連した態様で、非生物的な攻撃に抵抗性を有する遺伝子導入植物が提供
される。この植物は、生物学的に機能するアポトーシス経路タンパク質、好まし
くは抗アポトーシス・タンパク質、をコード化する異種核酸配列を含む。いくつ
かの実施形態では、この抗アポトーシス・タンパク質は、Ced-9, Bcl-2, IAP, E
1B 19K, 及びそれらの相同体、から成る群から選択される。さらに、本発明は、
このような生物的又は非生物的に抵抗性を有する遺伝子導入植物を生成する方法
であって、生物学的に機能するアポトーシス経路タンパク質をコード化し作用的
にプロモーターと関連している少なくとも一つの核酸配列を含むベクターで植物
細胞を形質転換させるステップと、形質転換された植物細胞から植物を生成する
ステップと、生物的又は非生物的な抵抗性を有する形質転換された植物を選択す
るステップを含む方法を提供する。In a related aspect, a transgenic plant is provided that is resistant to abiotic challenge. The plant contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a biologically functional apoptotic pathway protein, preferably an anti-apoptotic protein. In some embodiments, the anti-apoptotic protein is Ced-9, Bcl-2, IAP, E
1B 19K, and homologs thereof. Further, the present invention provides
A method for producing such a biologically or abiotically resistant transgenic plant, comprising at least one nucleic acid encoding a biologically functional apoptosis pathway protein and operatively associated with a promoter. Transforming a plant cell with a vector containing the sequence, generating a plant from the transformed plant cell, and selecting a transformed plant having biological or abiotic resistance. Provide a way.

【００１０】 本発明のさらに別の態様では、植物におけるアポトーシスを修飾する方法であ
って、通常はその植物細胞によって生成されない生物学的に機能するアポトーシ
ス経路タンパク質をコード化する、誘発できるプロモーターと作用的に関連する
核酸配列を含むベクターで植物細胞を形質転換させるステップと、植物の形成に
適する条件下で形質転換された植物細胞を培養するステップと、その核酸配列の
転写を誘発するに十分な条件下で十分な時間その植物を栽培するステップを含む
方法が提供される。In yet another aspect of the invention, a method of modifying apoptosis in a plant, comprising an inducible promoter and action encoding a biologically functional apoptotic pathway protein that is not normally produced by the plant cell. Transforming a plant cell with a vector containing the nucleic acid sequence that is specifically related; culturing the transformed plant cell under conditions suitable for plant formation; and sufficient to induce transcription of the nucleic acid sequence. A method is provided that includes cultivating the plant under conditions for a sufficient time.

【００１１】 また、アポトーシス経路活性を有する植物遺伝子を同定する方法であって、植
物のｃＤＮＡライブラリーによって動物細胞を形質転換するステップと、アポト
ーシス誘発因子を形質転換された細胞に接触させるステップと、その細胞におけ
るアポトーシス活性を検出するステップと、この活性を対照の細胞ラインと比較
するステップを含み、ｃＤＮＡライブラリーの各メンバーは作用的にプロモータ
ーと関連しており、活性の増加又は減少が植物ｃＤＮＡライブラリーにおけるア
ポトーシス経路タンパク質の存在を示すことを特徴とする方法が提供される。A method for identifying a plant gene having an apoptosis pathway activity, comprising the steps of: transforming an animal cell with a plant cDNA library; and contacting the transformed cell with an apoptosis-inducing factor. Detecting the apoptotic activity in the cell and comparing the activity to a control cell line, wherein each member of the cDNA library is operatively associated with a promoter and the increase or decrease in A method is provided that indicates the presence of an apoptosis pathway protein in a library.

【００１２】 関連した態様で、本発明は、植物において機能するアポトーシス遺伝子を同定
する方法であって、一つ以上の植物細胞を少なくとも一つの、プロモーターと作
用的に関連した異種核酸分子によって形質転換するステップと、アポトーシス誘
発因子を形質転換された細胞に接触させるステップと、その細胞におけるアポト
ーシス活性を検出するステップと、この活性を対照の細胞ラインと比較するステ
ップを含み、活性の増加又は減少が植物において機能するアポトーシス遺伝子の
存在を示すことを特徴とする方法を提供する。いくつかの実施形態では、異種の
核酸分子は異種ｃＤＮＡライブラリーを含み、そのｃＤＮＡライブラリーのメン
バーは作用的にプロモーターと関連している。In a related aspect, the invention is a method of identifying an apoptotic gene that functions in a plant, comprising transforming one or more plant cells with at least one heterologous nucleic acid molecule operably associated with a promoter. Contacting the transformed cell with an apoptosis-inducing factor, detecting apoptotic activity in the cell, and comparing this activity to a control cell line, wherein the increase or decrease in activity is A method is provided that indicates the presence of an apoptotic gene that functions in a plant. In some embodiments, the heterologous nucleic acid molecule comprises a heterologous cDNA library, wherein members of the cDNA library are operatively associated with a promoter.

【００１３】 上述のような本発明の遺伝子導入植物、植物細胞、及び方法は、植物のプログ
ラムされた細胞死に一般的に適用できる。これによって、植物における細胞死経
路の成分を同定する方法、ならびに植物におけるプログラムされた細胞死を修飾
する方法、が提供される。上述のように、本発明はまた、作物の収率と生命力を
高めるために生物的及び非生物的攻撃に対する抵抗性を有する植物を提供する。
さらに、老化がゆっくりになった植物および植物生成物が提供され、カットされ
たフルーツや野菜、ならびにカットされた花、などの貯蔵寿命の増大につながる
。さらに、本発明は、化合物のアポトーシス阻害及び増強能力を分析するための
方法及び組成物、及び他の関連した利点を提供する方法及び組成物にも適用でき
る。The transgenic plants, plant cells, and methods of the present invention as described above are generally applicable to programmed cell death of plants. This provides methods for identifying components of the cell death pathway in plants, as well as methods for modifying programmed cell death in plants. As noted above, the present invention also provides plants that are resistant to biological and abiotic attack to increase crop yield and vitality.
In addition, slow aging plants and plant products are provided, leading to increased shelf life of cut fruits and vegetables, as well as cut flowers. In addition, the present invention is applicable to methods and compositions for analyzing the ability of compounds to inhibit and enhance apoptosis, and methods and compositions that provide other related advantages.

【００１４】 本発明のこれらの態様及びその他の態様は、以下の詳しい記述と添付された図
面を参照すれば明らかになるであろう。さらに、以下でいろいろな参照文献が示
されるが、それらはいくつかの手順や組成物をさらに詳しく述べており（例えば
、プラスミド、など）、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。 発明の詳しい記述 本発明について記述する前に、以下で用いられるいくつかの用語の定義を述べ
ることがその理解のために有益であろう。[0014] These and other aspects of the present invention will become apparent with reference to the following detailed description and accompanying drawings. In addition, various references are set forth below, which further elaborate some procedures and compositions (eg, plasmids, etc.) and are incorporated herein by reference in their entirety. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Before describing the present invention, it will be helpful for an understanding to provide a definition of some terms used below.

【００１５】 “ネクロトロフ（necrotroph）”とは、本明細書で用いる場合、細胞を殺して
そのライフサイクルを完結させ、死んだ細胞物質を利用して栄養を摂る病原体（
例えば、多くのカビ）を指す。 “生物的攻撃”とは、本明細書で用いられる場合、生存可能な又は生物的な因
子（生物因子）によってもたらされる植物への攻撃を指す。したがって、生物的
な攻撃を生ずる生物因子には、例えば、昆虫、カビ、バクテリア、ウイルス、線
虫、ウイロイド、マイコプラズマ、等、が含まれる。“Necrotroph”, as used herein, refers to a pathogen that kills a cell to complete its life cycle and nourishes using dead cellular material.
For example, many molds). "Biological attack", as used herein, refers to an attack on a plant caused by viable or biological factors (biological factors). Thus, biological agents that cause a biological attack include, for example, insects, molds, bacteria, viruses, nematodes, viroids, mycoplasmas, and the like.

【００１６】 “非生物的攻撃”とは、本明細書で用いられる場合、生存可能でない又は生き
ていない因子（非生物因子）によってもたらされる植物への攻撃を指す。したが
って、非生物的な攻撃を生ずる非生物因子には、例えば、低水分（干ばつ）、高
水分（洪水）、栄養欠乏、放射線レベル、大気汚染（オゾン、酸性雨、二酸化硫
黄、等）、温度（極端な高温及び低温）、及び土壌毒性、などの環境因子、なら
びに除草剤の害、殺虫剤の害、その他の農業慣行（例えば、肥料過剰、不適切な
化学剤スプレー、等）が含まれる。“Abiotic attack”, as used herein, refers to an attack on a plant caused by a non-viable or non-living factor (a non-biological factor). Thus, abiotic agents that cause abiotic attacks include, for example, low moisture (drought), high moisture (flood), nutrient deficiencies, radiation levels, air pollution (ozone, acid rain, sulfur dioxide, etc.), temperature. (Extreme high and low temperatures), and environmental factors such as soil toxicity, as well as herbicide harm, pesticide harm, and other agricultural practices (eg, excess fertilizer, inappropriate chemical spray, etc.) .

【００１７】 “アポトーシス経路タンパク質”とは、本明細書で用いられる場合、いくつか
の生物、例えばヒト、マウス、C. elegance 、Drosophila Melanogaster、及び
バキュロウイルス・タンパク質（バキュロウイルスのp35 遺伝子を除く）、にお
いて明らかにされたようなプログラムされた細胞死の経路に関与しているタンパ
ク質のいずれかを指す。 さらに、“アポトーシス経路タンパク質をコード化す
る遺伝子”と“アポトーシス経路遺伝子”というフレーズは、本明細書では互換
的に用いられる。いろいろなアポトーシス経路タンパク質が知られており、本発
明の文脈の中で有用である。例としてあげられる分子には、caspase 分子（現在
それは１４同定されている）、bcl-2ファミリー・メンバー（例えば、bcl-2, bc
l-XL, bcl-XS, bcl-W, McL-1, A1, NR13, Ced-9, E1B 19K, BHRF1, KSHV ORF 16
, LMW5-HL, KS-bcl-2, 等）、Bax, Bak, Bok, Bad, Bik, Bid, Blk, Hrk, BNIP3
, BimL, EGL-1, アポトーシスの阻害物質（例えば、IAP-バキュロウイルス、DIA
P 1&2-Drosophila, c-IAP 1&2-ヒト、X-IAP-ヒト、NIAP-ヒト、survivin-ヒト、
等）、などが含まれる。これらの遺伝子及びその他の遺伝子の配列は、Genbank
Databaseから入手できるし、When Cell Die, Lockshin et al. (eds.), Wiley-L
iss, New York, 1998, など多数の刊行物に記述されている。“Apoptotic pathway proteins” as used herein refers to several organisms, such as humans, mice, C. elegance, Drosophila Melanogaster, and baculovirus proteins (excluding the baculovirus p35 gene). , Refers to any of the proteins involved in the programmed cell death pathway as revealed in Further, the phrases "gene encoding apoptosis pathway protein" and "apoptosis pathway gene" are used interchangeably herein. A variety of apoptosis pathway proteins are known and are useful in the context of the present invention. Examples of molecules include caspase molecules (14 of which are currently identified), bcl-2 family members (eg, bcl-2, bc
lX L, bcl-X S, bcl-W, McL-1, A1, NR13, Ced-9, E1B 19K, BHRF1, KSHV ORF 16
, LMW5-HL, KS-bcl-2, etc.), Bax, Bak, Bok, Bad, Bik, Bid, Blk, Hrk, BNIP3
, BimL, EGL-1, an inhibitor of apoptosis (eg, IAP-baculovirus, DIA
P 1 & 2-Drosophila, c-IAP 1 & 2-human, X-IAP-human, NIAP-human, survivin-human,
Etc.). The sequences of these and other genes are
Database, and When Cell Die, Lockshin et al. (Eds.), Wiley-L
iss, New York, 1998, and many other publications.

【００１８】 本明細書で用いる場合、“rev-caspase”とは、システイン・タンパク質分解
酵素であってタンパク質を特にAsp 残基の後で切断し、チモーゲンとして表現さ
れ、小さなサブユニットが大きなサブユニットのＮ末端であるものを指す（PCT
WO99/00632参照）。 本発明の文脈では、アポトーシス経路タンパク質は野生タイプのタンパク質配
列、ならびに原生タンパク質配列の他の変異体（対立因子を含む）、を含むもの
と理解すべきである。簡単に言うと、それらの変異体は、自然の多形現象として
生ずるか又は遺伝子組み換え法によって合成され、野生タイプのタンパク質とは
一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、削除、などで異なるものである。組み換えさ
れる場合、普通、アミノ酸置換は保守的である、すなわち、極性、非極性、芳香
族、荷電、などのアミノ酸グループの内部の置換である。原生タンパク質配列と
の相同領域で、変異体は少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有することが好
ましく、いくつかの実施形態では、92％、95％、又は97％を超える同一性を有す
ることが好ましい。このようなアミノ酸及び核酸配列の同一性は、標準的な方法
によって、例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov から入手できる国立バイオテクノロ
ジー情報センターBLAST探索方法の利用など、によって、決定できる。好ましい
同一性決定法は、ノンギャップのBLASTアルゴリズムである。しかし、米国特許
第5,691,179 号及びAltschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997
に記載されている同一性決定アルゴリズムも有用であり、参照によって本明細
書に取り入れられる。したがって、Gapped BLAST 2.0 を用いる場合、それはデ
フォルト設定で用いられる。さらに、ヌクレオチド変異体は、普通、ストリンジ
ェント・ハイブリダイゼーション条件の下で基準配列とハイブリダイズするに十
分な配列の類似性を有する（約500 bp を超える核酸分子の場合、ストリンジェ
ントな条件とはＴｍより25乃至30℃低い温度で約１M Na + を含む溶液；例えば
、5×SSPE, 0.5％SDS, 65℃;を含む; Ausubel et al., Current Protocols in M
olecular Biology, Greene Publishing, 1995; Sambrook et al., Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; を見よ）。変
異体によっては、コドンのディジェネラシー、例えば、ある特定宿主におけるコ
ドン最適化のために導入されたディジェネラシー、のために基準配列にハイブリ
ダイズしないものがある。その場合は、アミノ酸同一性を用いて、基準タンパク
質と変異体の類似性を評価することができる。As used herein, “rev-caspase” is a cysteine proteolytic enzyme that cleaves proteins, especially after Asp residues, is expressed as a zymogen, and small subunits are replaced by large subunits. N-terminal (PCT
WO99 / 00632). In the context of the present invention, apoptosis pathway proteins should be understood to include wild-type protein sequences, as well as other variants of the native protein sequences, including alleles. Briefly, these variants occur as natural polymorphisms or are synthesized by recombinant methods and differ from wild-type proteins by one or more amino acid substitutions, insertions, deletions, and the like. is there. When recombined, amino acid substitutions are usually conservative, ie, substitutions within a group of amino acids such as polar, non-polar, aromatic, charged, and the like. In regions of homology to the native protein sequence, the variants preferably have at least 90% amino acid sequence identity, and in some embodiments, have greater than 92%, 95%, or 97% identity. preferable. Such amino acid and nucleic acid sequence identities can be determined by standard methods, such as by using the National Institute of Biotechnology Information BLAST search method available at www.ncbi.nlm.nih.gov. A preferred identity determination method is the non-gap BLAST algorithm. However, U.S. Pat.No. 5,691,179 and Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997.
The identity determination algorithm described in is also useful and is incorporated herein by reference. Therefore, when using Gapped BLAST 2.0, it is used by default. In addition, nucleotide variants usually have sufficient sequence similarity to hybridize to a reference sequence under stringent hybridization conditions (for nucleic acid molecules greater than about 500 bp, stringent conditions do not include stringent conditions). A solution containing about 1 M Na + at a temperature 25-30 ° C. below Tm; including, for example, 5 × SSPE, 0.5% SDS, 65 ° C .; Ausubel et al., Current Protocols in M
olecular Biology, Greene Publishing, 1995; Sambrook et al., Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989;). Some variants do not hybridize to the reference sequence due to codon degeneracy, eg, degeneracy introduced for codon optimization in a particular host. In that case, amino acid identity can be used to evaluate the similarity between the reference protein and the variant.

【００１９】 “単離された核酸分子”とは、少なくとも一回実質的に純粋な形でその源細胞
（通常存在する染色体を含む）から分離されたことがある、別の断片の形又はも
っと大きな核酸構造の成分としてのポリヌクレオチド分子を指す。核酸分子は、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似物、又はそれらの組み合わせ、など多様なヌ
クレオチドから成る。An “isolated nucleic acid molecule” is another fragment, or more, that has been separated from its source cell (including the chromosome normally present) at least once in substantially pure form Refers to a polynucleotide molecule as a component of a large nucleic acid structure. Nucleic acid molecules are
Consisting of a variety of nucleotides, such as DNA, RNA, nucleotide analogs, or combinations thereof.

【００２０】 “インビトロ（in vitro）”という用語は、完全な細胞に達しないものから成
るシステムを指す。 “エクスビボ（ex vivo）”という用語は、細胞培養システムを指し、例えば
、一次及び二次細胞培養、全器官培養、及び類似システム、を含む。 “インビボ（in vivo）”という用語は、全体としての生物体を指す。[0020] The term "in vitro" refers to a system consisting of less than intact cells. The term "ex vivo" refers to cell culture systems and includes, for example, primary and secondary cell cultures, whole organ cultures, and similar systems. The term "in vivo" refers to an organism as a whole.

【００２１】 “遺伝的修飾”とは、本明細書で用いられる場合、一つ以上の植物細胞への一
つ以上の異種核酸配列の導入であって、全体としての、性的に能力を有する、生
存力のある植物を生成できるものを指す。“遺伝子導入された”という用語と“
遺伝的に修飾された”という用語は本明細書では互換的に用いられ、前記のプロ
セスによって生成された植物を指す。本発明の遺伝子導入植物は、自家受粉又は
同じ種の他の植物との他家受粉ができ、生殖細胞系を運ばれてきた外来遺伝子を
挿入又は育種して農業的に有用な植物変種を作ることができる。“Genetic modification,” as used herein, is the introduction of one or more heterologous nucleic acid sequences into one or more plant cells, and as a whole, sexually competent. , Which can produce viable plants. The terms “transfected” and “
The term "genetically modified" is used interchangeably herein and refers to a plant produced by the process described above. A transgenic plant of the present invention is self-pollinated or is It is possible to cross-pollinate and insert or breed foreign genes that have been carried through the germ line to produce agriculturally useful plant varieties.

【００２２】 “植物細胞”という用語は、本明細書で用いられる場合、プロトプラスト、生
殖体産生細胞、及び全体としての植物体にまで再生できる細胞、を指す。したが
って、全体としての植物体にまで再生できる多数の植物細胞を含む種子は、“植
物細胞”の定義に含まれる。 “植物組織”という用語は、本明細書で用いられる場合、植物の分化した又は
未分化の組織を指し、根、茎、芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織、及び単一細胞、
プロトプラスト、胚、及びカルス組織など、いろいろな形の細胞及び培養を含む
が、これだけに限定されない。“植物”という用語は、本明細書で用いられる場
合、全体としての植物体、植物の部分、及び植物細胞のグループ、例えば、植物
組織、を指す。小植物も“植物”の意味の中に含まれる。本発明で用いるのに適
した植物は、形質転換技術で用いることができる全ての植物を含み、単子葉植物
も双子葉植物も含む。[0022] The term "plant cell" as used herein refers to protoplasts, germ cell-producing cells, and cells that can regenerate into whole plants. Thus, seeds that contain a large number of plant cells that can be regenerated to whole plants are included in the definition of “plant cells”. The term "plant tissue" as used herein refers to the differentiated or undifferentiated tissue of a plant, including roots, stems, buds, leaves, pollen, seeds, tumor tissues, and single cells.
Including but not limited to various forms of cells and cultures, such as protoplasts, embryos, and callus tissue. The term "plant" as used herein refers to whole plants, plant parts, and groups of plant cells, such as plant tissues. Small plants are also included in the meaning of "plant". Plants suitable for use in the present invention include all plants that can be used in transformation techniques, including both monocots and dicots.

【００２３】 単子葉植物としては、例えば、アスパラガス、フィールドコーン及びスイート
コーン、オオムギ、コムギ、イネ、モロコシ類、オニオン、パールミレット、ラ
イムギ及びエンバク、及び観賞植物、などがあるが、それだけに限定されない。
双子葉植物としては、例えば、トマト、ポテト、シロイスナズナ、タバコ、木綿
、ナタネ、フィールドビーン、大豆、ペッパー、レタス、ピーズ、アルファルフ
ァ、クローバ、アブラナ科作物（例えば、キャベツ、ブロッコリ、カリフラワー
、メキャベツ）、ラディッシュ、ニンジン、ビート、ナス、ホウレンソウ、キュ
ウリ、カボチャ、メロン、カンタロープ、ヒマワリ、及びいろいろな観賞植物、
などがあるが、それだけに限定されない。本明細書ではタバコ・プラントが例と
して用いられている。Examples of monocotyledonous plants include, but are not limited to, asparagus, field corn and sweet corn, barley, wheat, rice, sorghum, onion, pearl millet, rye and oat, and ornamental plants. .
Examples of dicotyledonous plants include tomato, potato, Arabidopsis, tobacco, cotton, rapeseed, field bean, soybean, pepper, lettuce, peas, alfalfa, clover, cruciferous crops (for example, cabbage, broccoli, cauliflower, and cabbage), Radish, carrot, beet, eggplant, spinach, cucumber, pumpkin, melon, cantaloupe, sunflower, and various ornamental plants,
And the like, but are not limited thereto. A tobacco plant is used herein as an example.

【００２４】 “異種核酸配列”という用語は、本明細書で用いられる場合、少なくとも一つ
の構造遺伝子、一般にプロモーターなどの調節配列と作用的に関連した遺伝子、
を指す。この核酸配列は、異種に由来するものであるか、又は同じ種に由来する
ものであればその元の形から実質的に変化している。例えば、“異種核酸配列”
という用語は、その配列が自然の又は野生タイプのプロモーターとは異なるプロ
モーターと作用的に関連している場合、同じ種から由来する核酸も含む。The term “heterologous nucleic acid sequence” as used herein refers to at least one structural gene, generally a gene operatively associated with a regulatory sequence such as a promoter,
Point to. The nucleic acid sequence may be derived from a heterologous or, if derived from the same species, substantially altered from its original form. For example, a "heterologous nucleic acid sequence"
The term also includes nucleic acids from the same species if the sequence is operatively related to a different promoter than the native or wild-type promoter.

【００２５】 “構造遺伝子”とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写されるＤＮＡ
配列であり、それが次に特定ポリペプチドを表すアミノ酸配列に翻訳されるもの
である。“発現”という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。 “作用的に関連した”という用語は、あるプロモーター・配列とそのプロモー
ター核酸配列との間の機能的連関を指す。作用的に関連したプロモーターは、そ
の構造遺伝子がコード化しているポリペプチドの発現をコントロールする。“Structural gene” refers to DNA transcribed into messenger RNA (mRNA)
Sequence, which is then translated into an amino acid sequence representing a particular polypeptide. The term "expression" refers to the biosynthesis of a gene product. The term "operably related" refers to a functional association between a promoter sequence and its promoter nucleic acid sequence. An operatively related promoter controls the expression of the polypeptide encoded by the structural gene.

【００２６】 “プロモーター”とは、本明細書で用いられる場合、構造遺伝子の転写を指令
するＤＮＡ配列を指す。普通、プロモーターはある遺伝子の５’領域にあり、構
造遺伝子の転写開始部位に近い場所にある。 “クローニング・ベクター”とは、本明細書で用いられる場合、宿主細胞で自
律的に複製できるプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージなどのＤＮＡ
分子を指す。クローニング・ベクターは、普通、一つの又は少数の制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を含み、そこに外来ＤＮＡ配列をベクターの本質的な生物的
機能を損なわずに決定的な仕方で挿入でき、そのクローニング・ベクターによっ
て形質転換される細胞の同定及び選択に利用するのに適したマーカー遺伝子も挿
入できる。“Promoter,” as used herein, refers to a DNA sequence that directs the transcription of a structural gene. Usually, a promoter is located in the 5 'region of a gene, close to the transcription start site of a structural gene. “Cloning vector” as used herein refers to a DNA such as a plasmid, cosmid, or bacteriophage that is capable of autonomous replication in a host cell.
Refers to a molecule. Cloning vectors usually contain one or a few restriction endonuclease recognition sites into which foreign DNA sequences can be inserted in a definitive manner without impairing the essential biological function of the vector. Marker genes suitable for use in the identification and selection of cells transformed by the chromosome can also be inserted.

【００２７】 “発現ベクター”とは、本明細書で用いる場合、宿主細胞で発現される遺伝子
を含むＤＮＡ分子を指す。普通、遺伝子発現は、プロモーター、組織特異的な調
節エレメント、及びエンハンサーなど、いくつかの調節因子のコントロールの下
に置かれる。このような遺伝子は、上記のように、調節因子と“作用的に関連し
ている”。“Expression vector” as used herein refers to a DNA molecule that contains a gene that is expressed in a host cell. Usually, gene expression is placed under the control of several regulatory elements, such as promoters, tissue-specific regulatory elements, and enhancers. Such genes are "operably associated" with the regulator, as described above.

【００２８】 “病原体”とは、本明細書で用いられる場合、植物における疾病、又は疾病状
態、を生ずる作用因を指し、ウイルス、カビ、バクテリア、線虫、その他の微生
物、を含むが、それだけに限定されない。 本明細書で用いられる場合、“修飾する”とは、基底レベルから変化又は変更
する能力を指す。“Pathogen”, as used herein, refers to an agent that causes a disease or disease state in a plant, including, but not limited to, viruses, molds, bacteria, nematodes, and other microorganisms. Not limited. As used herein, "modify" refers to the ability to change or change from the basal level.

【００２９】 本明細書で用いられる場合、“阻害する”とは、統計的に有意な仕方である活
性又は結果の強さをブロック、遅延、又は減少させる能力を指す。 Ａ． アポトーシス経路遺伝子及び遺伝子産物 上述のように、本発明は、アポトーシス経路タンパク質をコード化している遺
伝子を含み、遺伝子の発現を可能にする遺伝子導入植物及び植物組織を提供する
。アポトーシス経路タンパク質をコード化するいろいろな遺伝子が知られており
、本発明の文脈の中で利用できる。例としてあげられる分子には、caspase 分子
（現在それは１４同定されている）、bcl-2ファミリー・メンバー（例えば、bcl
-2, bcl-XL, bcl-XS, bcl-W, McL-1, A1, NR13, Ced-9, E1B 19K, BHRF1, KSHV
ORF 16, LMW5-HL, KS-bcl-2, 等）、Bax, Bak, Bok, Bad, Bik, Bid（Genbank N
M 001196）, Blk, Hrk, BNIP3, BimL, EGL-1, アポトーシスの阻害物質（例えば
、バキュロウイルスOpIAP、DIAP 1&2-Drosophila, c-IAP 1&2-ヒト、X-IAP-ヒト
、NIAP-ヒト、survivin-ヒト、等）、など、が含まれる（例示的リスト及びGenb
ank 受け入れ番号は、下の表１を見よ）。本明細書での開示に基づいて、いろい
ろな細胞タイプから所望のアポトーシス経路遺伝子を単離して植物に使用するの
に適した発現ベクターを構築することができる。As used herein, “inhibit” refers to the ability to block, delay, or reduce the intensity of an activity or result in a statistically significant manner. A. Apoptosis Pathway Genes and Gene Products As described above, the present invention provides transgenic plants and plant tissues that include genes encoding apoptosis pathway proteins and that allow expression of the genes. Various genes encoding apoptosis pathway proteins are known and can be used in the context of the present invention. Examples of molecules include caspase molecules (14 of which are currently identified), members of the bcl-2 family (eg, bcl
-2, bcl-X L , bcl-X S , bcl-W, McL-1, A1, NR13, Ced-9, E1B 19K, BHRF1, KSHV
ORF 16, LMW5-HL, KS-bcl-2, etc.), Bax, Bak, Bok, Bad, Bik, Bid (Genbank N
M 001196), Blk, Hrk, BNIP3, BimL, EGL-1, an inhibitor of apoptosis (eg, baculovirus OpIAP, DIAP 1 & 2-Drosophila, c-IAP 1 & 2-human, X-IAP-human, NIAP-human, survivin -Human, etc.), etc. (exemplary list and Genb
(See Table 1 below for ank accession numbers.) Based on the disclosure herein, desired apoptosis pathway genes can be isolated from a variety of cell types to construct expression vectors suitable for use in plants.

【００３０】[0030]

【表１】 [Table 1]

【００３１】[0031]

【表２】 [Table 2]

【００３２】[0032]

【表３】 [Table 3]

【００３３】[0033]

【表４】 [Table 4]

【００３４】[0034]

【表５】 [Table 5]

【００３５】 本発明は、この明細書で述べるように、異種のアポトーシス経路タンパク質を
コード化している遺伝子を発現する植物細胞及び植物組織を提供する。アポトー
シス経路遺伝子はゲノムＤＮＡから、又は好ましくはｃＤＮＡライブラリーから
、単離される。ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからのアポトーシス経路タンパク質を
コード化している遺伝子を単離することは、普通、まず適当なＤＮＡライブラリ
ーを当業者には公知のライブラリーを構成する方法によって（Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989,
を見よ）、又は商業的な源から購入して（例えば、Clontech, Palo Alto, CA）
生成することによって進められる。簡単に言うと、ｃＤＮＡライブラリーはバク
テリオファージ・ベクター（例えば、λＺＡＰII）、プラスミド、その他スクリ
ーニングに適したものから構成することができ、ゲノムＤＮＡライブラリーは、
染色体ベクター、例えばＹＡＣｓ（イースト人工染色体）、バクテリオファージ
・ベクター、例えば、λＥＭＢＬ３、λｇｔ１１、コスミド、又はプラスミド、
で構成することができる。The present invention provides plant cells and tissues that express a gene encoding a heterologous apoptosis pathway protein, as described herein. Apoptosis pathway genes are isolated from genomic DNA or, preferably, from a cDNA library. Isolating genes encoding apoptosis pathway proteins from genomic DNA or cDNA is usually accomplished by first constructing a suitable DNA library by methods known to those skilled in the art (Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989,
See also) or purchased from commercial sources (eg, Clontech, Palo Alto, CA)
Proceed by generating. Briefly, a cDNA library can be composed of bacteriophage vectors (eg, λZAPII), plasmids, or any other suitable for screening.
A chromosomal vector such as YACs (yeast artificial chromosome), a bacteriophage vector such as λEMBL3, λgt11, a cosmid, or a plasmid;
Can be configured.

【００３６】 ある実施形態では、既知のアポトーシス経路核酸配列を用いて、ゲノム又はｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに適したオリゴヌクレオチド・ハイ
ブリダイゼーション・プローブが設計される。このようなオリゴヌクレオチド・
プローブの長さは20-30 塩基であることが好ましい。ハイブリダイゼーション検
出を容易にするために、オリゴヌクレオチドは、放射性核種（例えば、32Ｐ）、
酵素ラベル、タンパク質ラベル、蛍光ラベル、又はビオチン、などのレポーター
分子によって、一般に５’末端で、適当に標識される。次に、このライブラリー
は一般に、用いるベクターによって、ファージ又はコロニーとして培養される。
その後、コロニー又はファージが移されたニトロセルローズ又はナイロン膜をプ
ローブで調べてアポトーシス経路タンパク質をコード化している遺伝子を含む候
補クローンが同定される。この候補がアポトーシス経路タンパク質をコード化し
ているＤＮＡを含むことは、いろいろな手段、例えばＤＮＡ配列分析、又は第二
の重複しないプローブによるハイブリダイゼーション、のどれかによって検証さ
れる。In one embodiment, the known apoptosis pathway nucleic acid sequences are used to generate genomic or c
An oligonucleotide hybridization probe suitable for screening a DNA library is designed. Such oligonucleotides
The length of the probe is preferably 20-30 bases. To facilitate hybridization detection, the oligonucleotide may comprise a radionuclide (eg, 32 P),
Appropriately labeled, generally at the 5 'end, by a reporter molecule, such as an enzyme label, protein label, fluorescent label, or biotin. The library is then generally cultured as phage or colonies, depending on the vector used.
The nitrocellulose or nylon membrane to which the colony or phage has been transferred is then probed to identify candidate clones containing the gene encoding the apoptosis pathway protein. That the candidate contains DNA encoding an apoptotic pathway protein is verified by any of a variety of means, such as DNA sequence analysis, or hybridization with a second non-overlapping probe.

【００３７】 あるライブラリーが、アポトーシス経路タンパク質をコード化している遺伝子
を含むと同定されると、その遺伝子が増幅によって単離される。簡単に言うと、
ｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡをテンプレートとして用いる場合、増幅のプライ
マーは既知のアポトーシス経路タンパク質をコード化している遺伝子配列に基づ
いて設計される（例えば、表１を見よ）。増幅のためのプライマーは、好ましく
は、５’及び３’未翻訳領域の配列から取り出してｃＤＮＡの全長を単離するよ
うにする。プライマーは、好ましくは、ＧＣ含有量が約５０％であり、制限部位
を含んでクローニングが容易であり、自己相補的な配列を含まず、その３’末端
に相補配列を含まない（プライマー−ダイマー形成を防止するため）。プライマ
ーをアニールしてｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡにし、十分な回数の増幅サイクルを
実行してゲル電気泳動及び染色によって容易に見ることができるような生成物を
得る。増幅された断片を精製し、λｇｔ１０又はｐＢＳ（Ｍ１３＋）などのベク
ターに挿入し、増殖させる。断片の性質の確認は、ＤＮＡ配列分析によって、又
はコード化されたタンパク質のアミノ酸配列決定によって間接的に、行うことが
できる。When a library is identified as containing a gene encoding an apoptotic pathway protein, the gene is isolated by amplification. Put simply,
When using DNA from a cDNA library as a template, amplification primers are designed based on the gene sequence encoding a known apoptosis pathway protein (see, eg, Table 1). Primers for amplification are preferably removed from the sequences of the 5 'and 3' untranslated regions to isolate the full length cDNA. Primers preferably have a GC content of about 50%, contain restriction sites, are easy to clone, do not contain self-complementary sequences, and do not contain complementary sequences at their 3 'ends (primer-dimer To prevent formation). The primers are annealed to cDNA or genomic DNA and a sufficient number of amplification cycles are performed to obtain a product that can be easily viewed by gel electrophoresis and staining. The amplified fragment is purified, inserted into a vector such as λgt10 or pBS (M13 +) and propagated. Confirmation of the nature of the fragment can be performed by DNA sequence analysis or indirectly by amino acid sequencing of the encoded protein.

【００３８】 他の方法を用いて、アポトーシス経路タンパク質をコード化している核酸分子
を得ることもできる。例えば、そのような核酸分子は、アポトーシス経路タンパ
ク質に反応する抗体（単数又は複数）によるスクリーニングによって発現ライブ
ラリーから入手することもできる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A La
boratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989;
Ausubel, et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishi
ng Associates and Wiley-Interscience, NY, 1995）。[0038] Other methods can also be used to obtain nucleic acid molecules encoding apoptosis pathway proteins. For example, such nucleic acid molecules can be obtained from expression libraries by screening with antibody (s) reactive to apoptosis pathway proteins (Sambrook et al., Molecular Cloning: A La).
boratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989;
Ausubel, et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishi
ng Associates and Wiley-Interscience, NY, 1995).

【００３９】 いろいろな種からのアポトーシス経路タンパク質をコード化している遺伝子が
、標準的な方法によって単離される。密接に関連している種の場合、ヒトの配列
又はその一部をゲノム又はｃＤＮＡライブラリーでのプローブとして用いること
ができる。例えば、caspase の場合、触媒部位を包含する断片を標識して、マウ
ス、霊長類、ラット、イヌ、又は他の脊椎動物、温血動物、又は哺乳類、から構
成されたライブラリーでプローブとして用いることができる。通常のストリンジ
ェンシーでの最初のハイブリダイゼーションによって候補のクローン又は断片が
得られることがある。もしも何もハイブリダイゼーションが見られなかった場合
、ストリンジェンシーの度合いを変えることができる（Sambrook et al., 前出
、及びストリンジェンシー条件に関する他の周知の文献）。このようなプローブ
を用いて進化的に異なる種、例えば、ショウジョウバエ、からのライブラリーを
調べることもできるが、ハイブリダイゼーション条件はもっと緩和されることに
なるだろう。[0039] Genes encoding apoptotic pathway proteins from various species are isolated by standard methods. In the case of closely related species, human sequences or portions thereof can be used as probes in genomic or cDNA libraries. For example, in the case of caspase, the fragment containing the catalytic site should be labeled and used as a probe in a library composed of mice, primates, rats, dogs, or other vertebrates, warm-blooded animals, or mammals. Can be. Initial hybridization at normal stringency may yield candidate clones or fragments. If no hybridization is seen, the degree of stringency can be varied (Sambrook et al., Supra, and other well-known references to stringency conditions). Such probes can be used to probe libraries from evolutionarily different species, for example, Drosophila, but hybridization conditions will be more relaxed.

【００４０】 ヒトの配列から設計されたプローブを用いた緩和されたハイブリダイゼーショ
ン条件によっても、進化的に異なる種におけるアポトーシス経路タンパク質をコ
ード化している遺伝子を同定できるけれども、ヒトの配列それ自体を必要としな
い方法を用いてライブラリーからこれらの遺伝子を直接単離することを試みる方
が有益であろう。そのような方法としては、保存された領域から得られたプライ
マーを用いる増幅、いろいろな領域からのディジェネレート・プライマーを用い
る増幅、発現ライブラリーの抗体プロービング、などがあるが、それだけに限定
されない。例えば、ランダム・プライムド増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応
）を用いることもできる（例えば、Methods Enzymol. 254:275, 1995; Trends G
enet. 11:242, 1995; Liang and Pardee, Science 257;967, 1992; Welsh et al
., Nucl. Acids Res. 20:4965, 1992）。さらに、特にある特定の遺伝子又は遺
伝子ファミリーを望む場合、ランダム・プライムドＰＣＲの変型を用いることも
できる。その方法では、増幅プライマーの一つは“アンカード・オリゴ（ｄＴ）
（オリゴ（ｄＴ）ｄＮ）”であり、他のプライマーは関連遺伝子のアミノ酸又は
ヌクレオチド配列に基づくディジェネレート・プライマーである。遺伝子配列は
、アミノ酸の類似性、核酸の類似性、及び／又は機能的同等性によって、アポト
ーシス経路タンパク質として同定される。さらに、機能性と二次構造を比較した
り、機能を三次形態の領域構造と関連づけたりするコンピュータ・アルゴリズム
に基づいてある遺伝子をアポトーシス経路タンパク質と同定することができる。
そのようなアルゴリズムが、現在、利用できる。候補遺伝子を発現させ、遺伝子
産物の酵素活性及び／又は他の機能活性が標準的なアポトーシス分析及び本明細
書で記述される分析又は他の同等な分析を用いて調べられる。[0040] Although relaxed hybridization conditions using probes designed from human sequences can identify genes encoding apoptosis pathway proteins in evolutionarily different species, the human sequences themselves are required. It may be beneficial to attempt to isolate these genes directly from the library using methods that do not. Such methods include, but are not limited to, amplification using primers obtained from conserved regions, amplification using degenerate primers from various regions, antibody probing of expression libraries, and the like. For example, random primed amplification (eg, polymerase chain reaction) can be used (eg, Methods Enzymol. 254: 275, 1995; Trends G).
enet. 11: 242, 1995; Liang and Pardee, Science 257; 967, 1992; Welsh et al.
., Nucl. Acids Res. 20: 4965, 1992). Furthermore, a variant of random primed PCR can be used, especially if a particular gene or gene family is desired. In that method, one of the amplification primers is "Uncard Oligo (dT)
(Oligo (dT) dN) "and the other primer is a degenerate primer based on the amino acid or nucleotide sequence of the relevant gene. The gene sequence may have amino acid similarity, nucleic acid similarity, and / or function. Genes are identified as apoptotic pathway proteins by genetic equivalence, and a gene is identified as an apoptotic pathway protein based on computer algorithms that compare functionality with secondary structure or link function to tertiary morphological domain structure. Can be identified.
Such algorithms are currently available. Candidate genes are expressed and the enzymatic and / or other functional activities of the gene products are determined using standard apoptosis assays and the assays described herein or other equivalent assays.

【００４１】 本明細書で提供されるアポトーシス経路タンパク質をコード化する遺伝子の変
異体は、天然の変異体（例えば、多形、スプライス変異体、突然変異体）から組
み立てたり、合成、又は構成できる。突然変異体を生成するために多くの方法が
開発されている（Sambrook et al., 前出；Ausubel et al., 前出；及び上の議
論、を見よ）。簡単に言うと、少数のヌクレオチド置換を生成する好ましい方法
は突然変異される塩基（単数又は複数）を含むオリゴヌクレオチドを用い、突然
変異した塩基（単数又は複数）を含む。このオリゴヌクレオチドが相補的な一本
鎖核酸にハイブリダイズされ、第二鎖合成がこのオリゴヌクレオチドから開始さ
れる。二本鎖核酸が調製されて形質転換のために宿主細胞に入れられる。宿主細
胞は、普通、E. coli であるが、他の原核生物、イースト、又は他の真核生物も
用いられる。標準的なスクリーニング及びベクター増殖プロトコルを用いて突然
変異体配列を同定し、高い収率を得る。Variants of the genes encoding the apoptosis pathway proteins provided herein can be assembled, synthesized, or composed of naturally occurring variants (eg, polymorphisms, splice variants, mutants). . Many methods have been developed to generate mutants (see Sambrook et al., Supra; Ausubel et al., Supra; and the discussion above). Briefly, the preferred method of generating a small number of nucleotide substitutions employs an oligonucleotide containing the base (s) to be mutated, including the mutated base (s). The oligonucleotide is hybridized to a complementary single-stranded nucleic acid and second strand synthesis is initiated from the oligonucleotide. Double-stranded nucleic acids are prepared and placed into host cells for transformation. The host cell is usually E. coli, but other prokaryotes, yeast, or other eukaryotes may be used. Mutant sequences are identified using standard screening and vector propagation protocols and yield high yields.

【００４２】 同様に、アポトーシス経路タンパク質をコード化する遺伝子の削除及び／又は
挿入は、上で述べたいろいろな公知の方法のいずれかによって行われる。例えば
、遺伝子を制限酵素によって切断し結び直して、ある配列を削除したり、余分な
配列と共に結び直して挿入又は大きな置換を行うことができる。変異体配列を生
成する他の手段を当業者には公知の方法で、例えば、Sambrook et al., 前出、
及びAusubel etal., 前出、に記述されているようなもの、によって用いること
ができる。変異体配列の検証は、普通、制限酵素マッピング、配列分析、又はプ
ローブ・ハイブリダイゼーションによって行われる。Similarly, deletion and / or insertion of a gene encoding an apoptosis pathway protein can be performed by any of the various known methods described above. For example, a gene can be cut and ligated with a restriction enzyme to delete certain sequences, or ligated with extra sequences to make insertions or major substitutions. Other means of generating variant sequences are known in the art and are described, for example, in Sambrook et al., Supra.
And Ausubel et al., Supra, can be used. Verification of variant sequences is usually performed by restriction mapping, sequence analysis, or probe hybridization.

【００４３】 植物のアポトーシス経路タンパク質に向けられたアンチセンス及びリボザイム
分子を発現する遺伝子導入植物及び植物細胞も、本発明の範囲に包含される。ア
ンチセンスＲＮＡ分子の発現は標的ｍＲＮＡに結合しタンパク質翻訳を妨害する
ことによってｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。ＲＮＡの特定
の切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムの発現も、タ
ンパク質翻訳をブロックするのに用いられる。リボザイムの作用メカニズムには
、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーショ
ンと、それに続くエンドヌクレオライティック切断が関わっている。ＲＮＡ配列
のエンドヌクレオライティック切断を特異的かつ効率的に触媒するように設計さ
れたハンマーヘッド・モチーフ・リボザイム分子は本発明の範囲に入るものであ
る。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコード化しているＤＮＡ配列の転写によって生
成される。Transgenic plants and plant cells expressing antisense and ribozyme molecules directed against plant apoptosis pathway proteins are also within the scope of the invention. Expression of the antisense RNA molecule acts to directly block translation of the mRNA by binding to the target mRNA and preventing protein translation. Expression of ribozymes, enzymatic RNA molecules that can catalyze specific cleavage of RNA, is also used to block protein translation. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA, followed by endonucleolytic cleavage. Hammerhead motif ribozyme molecules designed to specifically and efficiently catalyze endonucleolytic cleavage of RNA sequences are within the scope of the invention. RNA molecules are produced by the transcription of a DNA sequence that encodes an RNA molecule.

【００４４】 本発明で記述されるているように用いる核酸及びオリゴヌクレオチドは、当業
者には公知の方法によって合成できる（例えば、WO93/01286, 米国特許出願第07
/723,454 号；米国特許第5,218,088 号；米国特許第5,175,269 号；米国特許第5
,109,124 号、を見よ）。アンチセンス因子として用いられるリボザイム及びオ
リゴヌクレオチド、及び遺伝子治療のためのＤＮＡの同定は当業者に周知の方法
による。例えば、このようなオリゴヌクレオチドの望ましい性質、長さ、及びそ
の他の特性は周知である。The nucleic acids and oligonucleotides used as described in the present invention can be synthesized by methods known to those skilled in the art (eg, WO93 / 01286, US Patent Application No. 07).
U.S. Pat. No. 5,218,088; U.S. Pat. No. 5,175,269; U.S. Pat.
, 109,124). Identification of ribozymes and oligonucleotides used as antisense factors, and DNA for gene therapy, is by methods well known to those skilled in the art. For example, the desirable properties, length, and other properties of such oligonucleotides are well known.

【００４５】 アンチセンス・ヌクレオチドは、ｍＲＮＡやＤＮＡなどの核酸に配列特異的な
仕方で 結合するオリゴヌクレオチドである。相補的配列を有するｍＲＮＡに結
合する場合、アンチセンスはｍＲＮＡの翻訳を阻止する（例えば、Altman et al
., への米国特許第5,168,053 号；Inoyue への米国特許第5,190,931 号；Burch
への米国特許第5,135,917 号；Smith への米国特許第5,087,617 号；及び、ダン
ベル・アンチセンス・オリゴヌクレオチドを記述しているClusel et al., Nucl.
Acids Res. 21:3405-3411, 1993,を見よ）。三重式分子とは、一本鎖ＤＮＡが
二本鎖ＤＮＡと結合して共直線的な三重式分子を形成し転写を阻止するものを指
す（例えば、Hogan et al. への米国特許第5,176,996 号を見よ；これは二本鎖
ＤＮＡの標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドを作る方法を記述している
）。An antisense nucleotide is an oligonucleotide that binds to a nucleic acid, such as mRNA or DNA, in a sequence-specific manner. When binding to an mRNA having a complementary sequence, antisense blocks translation of the mRNA (eg, Altman et al.
U.S. Patent No. 5,168,053 to Inoyue; U.S. Patent No. 5,190,931 to Inoyue; Burch
U.S. Pat. No. 5,135,917 to Smith; U.S. Pat. No. 5,087,617 to Smith; and Clusel et al., Nucl. Describing dumbbell antisense oligonucleotides.
Acids Res. 21: 3405-3411, 1993). Triplex molecules refer to those in which single-stranded DNA binds to double-stranded DNA to form a colinear triplex molecule and blocks transcription (see, eg, US Patent No. 5,176,996 to Hogan et al.). See, this describes how to make synthetic oligonucleotides that bind to the target site of double-stranded DNA).

【００４６】 特に有用なアンチセンス・ヌクレオチド及び三重式分子は、アポトーシス経路
を修飾することに関わるタンパク質又はそのタンパク質の翻訳を阻止することが
望ましいような他の望まれないプロセスを媒介するタンパク質をコード化してい
るＤＮＡ又はｍＲＮＡのセンス鎖と相補的又は結合する分子である。 アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、普通、ホスホロチオネート、メチルホ
スホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオネート、ホスホ
ルアミデート、ホスフェート・エステル、その他のリンケージを用いて内生的な
ヌクレオライティック酵素による劣化に抵抗するように設計される（例えば、Ag
rwal et al., Tetrehedron Lett. 28:3539-3542, 1987; Miller et al., J. Am.
Chem. Soc. 93:6657-6665, 1971; Stec et al., Tetrehedron Lett. 26:2191-2
194, 1985; Moody et al., Nucl. Acids Res. 12:4769-4782, 1989; Uznanski e
t al., Nucl. Acids Res., 1989; Letsinger et al., Tetrahedron 40:137-143,
1984; Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54:367-402, 1985; Eckstein, Trends
Biol. Sci. 14:97-100, 1989; Stein, in: Oligodeoxynucleotides. Antisense
Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp. 9
7-117, 1989; Jager et al., Biochemistry 27:7237-7246, 1988）。Particularly useful antisense nucleotides and triplex molecules encode proteins involved in modifying the apoptotic pathway or proteins that mediate other unwanted processes where it is desirable to prevent translation of that protein. It is a molecule that is complementary to or binds to the sense strand of DNA or mRNA that is becoming active. Antisense oligonucleotides are generally endogenous nucleolytics using phosphorothioate, methylphosphonate, sulfone, sulfate, ketyl, phosphorodithionate, phosphoramidate, phosphate esters, and other linkages. Designed to resist degradation by enzymes (eg, Ag
rwal et al., Tetrehedron Lett. 28: 3539-3542, 1987; Miller et al., J. Am.
Chem. Soc. 93: 6657-6665, 1971; Stec et al., Tetrehedron Lett. 26: 2191-2.
194, 1985; Moody et al., Nucl. Acids Res. 12: 4769-4782, 1989; Uznanski e
t al., Nucl. Acids Res., 1989; Letsinger et al., Tetrahedron 40: 137-143,
1984; Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54: 367-402, 1985; Eckstein, Trends
Biol. Sci. 14: 97-100, 1989; Stein, in: Oligodeoxynucleotides. Antisense
Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp. 9
7-117, 1989; Jager et al., Biochemistry 27: 7237-7246, 1988).

【００４７】 植物で生成されるアポトーシス経路タンパク質に関して言うと、これらのタン
パク質は標準的な方法によって、例えば、アフィニティー・クロマトグラフィー
、サイズ排除クロマトグラフィー、金属イオン・クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、その他の公知のタンパク質単離方法、によっ
て、単離できる。（一般的に、Ausubel et al., 前出；Sambrook et al., 前出
、を見よ）。単離され精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでCoomassie
ブルーで染色すると一本の帯を与える。本発明は、植物を遺伝子組み換え生産の
ビヒクルとして用いる非植物アポトーシス・タンパク質、例えば哺乳類のアポト
ーシス・タンパク質、の遺伝子組み換え産生の他に、植物の内生的なアポトーシ
ス・タンパク質の産生も包含するということを認識すべきである。さらに、本発
明は、また、植物細胞における動物の遺伝子とその機能を研究するのにも利用で
きる。したがって、以下で詳しく述べるように、アポトーシスを阻害するアポト
ーシス経路タンパク質を生ずる遺伝子導入植物を生成することによって、内生的
又は異種のポリペプチドの遺伝子組み換え産生に関連した細胞死の発生を減らす
ことになり、いろいろなペプチド及びポリペプチド（アポトーシスに関連しない
ペプチド及びポリペプチドを含む）の遺伝子組み換え産生が大きく増強されるで
あろう。With respect to the apoptosis pathway proteins produced in plants, these proteins can be obtained by standard methods, for example, affinity chromatography, size exclusion chromatography, metal ion chromatography, ion exchange chromatography, HPLC, It can be isolated by other known protein isolation methods. (See, generally, Ausubel et al., Supra; Sambrook et al., Supra). The isolated and purified protein was analyzed by SDS-PAGE using Coomassie
Gives one band when stained with blue. That the invention encompasses the production of endogenous plant apoptotic proteins in addition to the recombinant production of non-plant apoptotic proteins, such as mammalian apoptotic proteins, using plants as vehicles for recombinant production. Should be aware of. Furthermore, the present invention can also be used to study animal genes and their functions in plant cells. Thus, as described in detail below, by generating transgenic plants that produce apoptosis pathway proteins that inhibit apoptosis, it is possible to reduce the incidence of cell death associated with the recombinant production of endogenous or heterologous polypeptides. Thus, the recombinant production of various peptides and polypeptides (including those not involved in apoptosis) will be greatly enhanced.

【００４８】 アポトーシス経路タンパク質は、hexa-his 融合タンパク質として発現させ、
金属を含むクロマトグラフィー、例えばニッケル結合ビーズなど、によって単離
することもできる。要するに、His6 をコード化する配列がアポトーシス経路タ
ンパク質をコード化するＤＮＡ配列とリンクさせる。His6 配列は分子のどこに
位置させることもできるが、好ましくは終結コドンのすぐ前の３’末端にリンク
させる。融合は、いろいろな方法のどれを用いて行ってもよい。好適な方法は、
His6 のコドンを含む下流プライマーを用いてアポトーシス経路タンパク質をコ
ード化する遺伝子を増幅することである。The apoptosis pathway protein is expressed as a hexa-his fusion protein,
It can also be isolated by chromatography involving metals, such as nickel-binding beads. In short, the sequence encoding His 6 links to the DNA sequence encoding the apoptosis pathway protein. His 6 sequence may also be where the position of the molecules, thereby preferably linked directly in front of the 3 'end of the termination codon. Fusion may be performed using any of a variety of methods. The preferred method is
It is to amplify the gene encoding the apoptosis pathway proteins using downstream primers containing codons His 6.

【００４９】 精製されたアポトーシス経路タンパク質は阻害化合物をスクリーニングする分
析に用いることができる。この分析は、インビトロでもンビボでも行うことがで
き、本明細書で記述される方法又は当業者に公知の方法のいずれを用いることも
できる。このタンパク質は、また、結晶化させてＸ線解析を行って３次元構造を
決定したり、抗体を作り出すのに利用することもできる。さらに、後述するよう
に、アポトーシス経路タンパク質をコード化する異種核酸を植物で発現させてア
ポトーシスの阻害剤及びエンハンサーのスクリーニング分析に使用する植物細胞
を作り出すことができる。 Ｂ． ベクター及び形質転換方法 アポトーシス経路タンパク質は、いろいろな宿主生物で発現させることができ
る。しかし、本明細書で述べるように、このタンパク質は植物細胞の中に入れら
れた場合、特に同様なアポトーシス経路タンパク質が何も同定されていない場合
、予期しなかった利点がある。例えば、植物細胞で発現される場合、アポトーシ
ス経路阻害タンパク質を用いて、カビ及びウイルス感染に対する抵抗性を含め、
生物的及び非生物的な攻撃に対する抵抗性を高めるのに利用できる。さらに、植
物における細胞死を修飾できる能力は、植物内での、殺虫化合物、例えばBacill
us thuringiensisでコード化されている毒素（例えば、ＰＣＴ出願 WO 97/34926
, を見よ）、の発現を組み合わせることを可能にする。したがって、植物におい
て、あるタイプ又はレベルの殺虫化合物を発現するときに、通常であればプログ
ラムされた細胞死サイクルを開始させるであろうよりも高いレベルの殺虫化合物
許容能力を植物で実現できる。同様に、除草剤で誘発されるプログラムされた細
胞死イベントへの植物細胞の抵抗性を高めることによって、除草剤への高い許容
能力を実現することができる。多くの植物タイプで遺伝物質の伝達はありふれた
ことであり、様々な程度で全ての植物において可能である。植物細胞における発
現のために適当ないろいろなベクターが容易に入手できるということは当業者に
は理解できるであろう。The purified apoptosis pathway protein can be used in assays to screen for inhibitory compounds. This analysis can be performed in vitro or ex vivo, and can use any of the methods described herein or known to those of skill in the art. This protein can also be crystallized and used for X-ray analysis to determine its three-dimensional structure and to generate antibodies. In addition, as described below, heterologous nucleic acids encoding apoptosis pathway proteins can be expressed in plants to create plant cells for use in screening assays for inhibitors and enhancers of apoptosis. B. Vectors and Transformation Methods Apoptosis pathway proteins can be expressed in a variety of host organisms. However, as described herein, this protein has unexpected advantages when placed into plant cells, especially if no similar apoptotic pathway protein has been identified. For example, when expressed in plant cells, using apoptosis pathway inhibitory proteins, including resistance to mold and viral infections,
Can be used to increase resistance to biological and abiotic attacks. In addition, the ability to modify cell death in plants can be attributed to insecticidal compounds, such as Bacill, in plants.
toxin encoded by us thuringiensis (see, eg, PCT application WO 97/34926)
, See), which allows to combine the expression of Thus, a higher level of insecticidal compound tolerance in a plant can be achieved when expressing a certain type or level of insecticide compound than would normally initiate a programmed cell death cycle. Similarly, by increasing the resistance of plant cells to herbicide-induced programmed cell death events, high herbicide tolerance can be achieved. Transmission of genetic material is common in many plant types and is possible in all plants to varying degrees. One skilled in the art will appreciate that a variety of suitable vectors are readily available for expression in plant cells.

【００５０】 １． ベクター 本発明の遺伝子導入植物は、プログラムされた細胞死（すなわち、アポトーシ
ス）を修飾するタンパク質をコード化する構造遺伝子を少なくとも一つ含む異種
核酸配列を含むベクターを植物細胞に接触させることによって生み出される。問
題の構造遺伝子は、効果的であるためには、植物細胞に導入された後その植物細
胞内で問題の遺伝子の転写を引き起こす効果があるプロモーターと作用的に関連
づけられなければならない。さらに、やはり植物細胞で認められているポリアデ
ニレーション配列又は転写コントロール配列が用いられる。本明細書で述べられ
るように、培養によって形質転換した細胞を形質転換されない細胞から容易に選
択できるように、異種核酸配列を含むベクターは一つ以上の選択可能なマーカー
遺伝子を含むことが好ましい。1. Vectors The transgenic plants of the present invention are produced by contacting a plant cell with a vector comprising a heterologous nucleic acid sequence comprising at least one structural gene encoding a protein that modifies programmed cell death (ie, apoptosis). . In order to be effective, the structural gene in question must be operatively associated with a promoter that, after introduction into a plant cell, is effective to cause transcription of the gene in question in the plant cell. Furthermore, a polyadenylation sequence or a transcription control sequence also found in plant cells is used. As described herein, the vector containing the heterologous nucleic acid sequence preferably contains one or more selectable marker genes so that cells transformed by culture can be readily selected from non-transformed cells.

【００５１】 通常の技術を有する当業者は、異種核酸配列を比較的無傷な状態で導入するの
に適当なベクターを選択することができるであろう。導入されたＤＮＡ配列を持
つ植物を生成できるどんなベクターでも十分である。したがって、裸のＤＮＡで
も利用できるが、形質転換は低い効率でしか起こりそうもない。ベクターの選択
、又はベクターを用いるかどうか、は、普通、選択される形質転換の方法によっ
て左右される。Those of ordinary skill in the art will be able to select an appropriate vector to introduce a heterologous nucleic acid sequence in a relatively intact state. Any vector capable of producing a plant with the introduced DNA sequence is sufficient. Thus, although naked DNA is available, transformation is likely to occur with low efficiency. The choice of vector, or whether to use a vector, usually depends on the transformation method chosen.

【００５２】 要するに、アポトーシス経路タンパク質をコード化したＤＮＡ配列が、宿主植
物細胞に関し適当な発現ベクターに導入される。ある実施形態では、アポトーシ
ス経路タンパク質は、アポトーシスの阻害物質であり、別の実施形態では、アポ
トーシス経路タンパク質はアポトーシスの増強因子又はイニシエイターである。
好ましい阻害物質には、ＩＡＰ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘL 、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｍｃ
Ｌ−１，Ａ１，ＮＲ１３、ＣＥＤ−９，Ｅ１Ｂ １９Ｋ、ＢＨＲＦ１，Ｂａｇ−
１，などがあるが、それだけに限定されない。別の実施形態では、アポトーシス
経路タンパク質をコード化する核酸がベクターに挿入され、別のポリペプチドを
コード化する核酸分子にリンクされて融合タンパク質が生成される。アポトーシ
ス経路タンパク質配列は、この明細書で述べるようにして得られる。上で述べた
ように、この配列は、複数のコドンを有する各アミノ酸に関して代替コドンを含
んでもよい。代替コドンは、宿主種に“最適”となるように選ぶことができ、そ
のような最適化の手順は当業者には周知である。さらに、普通、プライマー配列
には制限部位が組み込まれ、ベクターのクローニング部位に関連して選ばれる。
必要ならば、翻訳開始及び終結コドンをプライマー配列に組み込むことができる
。 最小限、ベクターはプロモーター配列を含まなければならない。上述のよう
に、“プロモーター”とは、リンク／関連した遺伝子の転写を指示するエレメン
トを含むヌクレオチド配列を指す。最小限、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼ
結合部位を含む。普通、真核生物では、プロモーター配列は、遺伝子発現の速さ
とタイミングをコントロールする他の転写因子に関する結合部位を含む。そのよ
うな部位には、ＴＡＴＡ ｂｏｘ、ＣＡＡＴ ｂｏｘ、ＰＯＵ ｂｏｘ、ＡＰ１
結合部位、などがある。プロモーター領域は、また、増強因子エレメントも含む
ことがある。あるプロモーターがある遺伝子とリンクしてその遺伝子の転写を可
能にするとき、プロモーターはそれと“作用的にリンク又は関連している”。Briefly, a DNA sequence encoding an apoptosis pathway protein is introduced into an appropriate expression vector for the host plant cell. In one embodiment, the apoptosis pathway protein is an inhibitor of apoptosis, and in another embodiment, the apoptosis pathway protein is an apoptosis enhancer or initiator.
Preferred inhibitors, IAP, Bcl-2, Bcl -x L, Bcl-W, Mc
L-1, A1, NR13, CED-9, E1B 19K, BHRF1, Bag-
1, but is not limited thereto. In another embodiment, a nucleic acid encoding an apoptosis pathway protein is inserted into a vector and linked to a nucleic acid molecule encoding another polypeptide to produce a fusion protein. Apoptosis pathway protein sequences are obtained as described herein. As noted above, the sequence may include alternative codons for each amino acid having multiple codons. Alternative codons can be chosen to be "optimal" for the host species, and procedures for such optimization are well known to those skilled in the art. In addition, usually a restriction site is incorporated into the primer sequence and selected in relation to the cloning site of the vector.
If necessary, translation start and stop codons can be incorporated into the primer sequence. At a minimum, the vector must include a promoter sequence. As noted above, "promoter" refers to a nucleotide sequence that contains elements that direct transcription of a linked / associated gene. At a minimum, the promoter contains an RNA polymerase binding site. Usually, in eukaryotes, a promoter sequence contains binding sites for other transcription factors that control the speed and timing of gene expression. Such sites include TATA box, CAAT box, POU box, AP1
Binding sites, and the like. The promoter region may also include enhancer elements. A promoter is "operably linked or associated" with a gene when it is linked to and allows transcription of that gene.

【００５３】 他の調節配列も含まれることがある。そのような配列としては、転写終結信号
配列、イントロン、分泌信号配列、複写開始点、選択可能マーカー、などがある
。調節配列は互いに作用的に関連して転写又は翻訳を可能にする。 本明細書で用いられる発現ベクターは植物宿主細胞においてタンパク質を発現
するように設計されたプロモーターを含む。適当なプロモーターは多様に入手可
能であり、当業者には周知である。誘導又は構成プロモーターが好ましい。[0053] Other regulatory sequences may also be included. Such sequences include transcription termination signal sequences, introns, secretion signal sequences, origins of replication, selectable markers, and the like. The regulatory sequences are operatively associated with each other to permit transcription or translation. The expression vectors used herein include a promoter designed to express the protein in a plant host cell. Suitable promoters are widely available and well known to those skilled in the art. Inducible or constitutive promoters are preferred.

【００５４】 別の好ましい実施形態では、ベクターは、また、転写終結配列を含む。“転写
終結領域”は選択されたプロモーターを認識するポリメラーゼによる転写を終結
する信号を出す配列を有するか及び／又はポリアデニレーションのための信号配
列を有する。 上述のように、本発明で用いられるベクターは一般にアポトーシス経路タンパ
ク質をコード化する、少なくとも一つの構造遺伝子を有し、プロモーターと作用
的に関連した核酸配列を含む。本発明にしたがって形質転換プロセスを開始する
には、まず適当なベクターを構成してそれを適切に植物細胞に導入することが必
要である。本明細書で用いられるベクターの構成の詳細は、植物遺伝子工学の分
野の当業者には公知であり、必要な形質転換の方法も同様であるが、どちらもこ
の明細書の中で詳しく説明される。普通、発現ベクターは、バクテリア宿主にお
ける発現ベクターの増殖と選択を可能にするためのバクテリア複製起点（例えば
、E. coli ori）をコードする原核生物核酸エレメント及びレポーター遺伝子又
は選択マーカー（例えば、抗生物質抵抗性）；植物とバクテリアの両方の増殖の
ためにプロモーターなど転写の開始をコントロールする核酸エレメント；転写終
結／ポリアデニレーションなど、転写の処理をコントロールする核酸エレメント
；及びプロモーターと作用的に関連したレポーター遺伝子又はマーカー、を含む
。有用なレポーター遺伝子には、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクシトダーゼ
、クロルアンフェニコール アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、な
どがある。好ましくは、レポーター遺伝子は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
又はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。好ましい選択マーカーとしては
、G418，ハイグロマイシン、カナマイシン、bialophos （bar遺伝子によって与
えられる）、等がある。ある実施形態では、バクテリア発現システムを用いてあ
る程度の量の構成物を合成し、その後、制限エンドヌクレアーゼによる消化で問
題の遺伝子を切り取る。次に、問題の遺伝子を植物発現ベクターに結合させて、
植物細胞を形質転換するのに用いる。したがって、バクテリアにおいては、植物
とは全く異なるレポーター遺伝子又は選択マーカーを用いることができるという
ことは、当業者ならば容易に認められるであろう。好ましいバクテリアの選択は
アンピシリン抵抗性によって行い、遺伝子導入植物細胞は、普通、カナマイシン
抵抗性に基づいて選択される。[0054] In another preferred embodiment, the vector also includes a transcription termination sequence. A “transcription termination region” has a sequence that provides a signal to terminate transcription by a polymerase that recognizes the selected promoter and / or has a signal sequence for polyadenylation. As mentioned above, the vectors used in the present invention generally have at least one structural gene encoding an apoptosis pathway protein and include a nucleic acid sequence operatively associated with a promoter. To start the transformation process according to the invention, it is first necessary to construct a suitable vector and to introduce it appropriately into plant cells. The details of the construction of the vectors used herein are known to those skilled in the field of plant genetic engineering, and the necessary transformation methods are the same, but both are described in detail in this specification. You. Usually, the expression vector is a prokaryotic nucleic acid element encoding a bacterial origin of replication (eg, E. coli ori) and a reporter gene or selectable marker (eg, an antibiotic) to allow propagation and selection of the expression vector in a bacterial host. Resistance); nucleic acid elements that control the initiation of transcription, such as promoters, for the growth of both plants and bacteria; nucleic acid elements that control the processing of transcription, such as transcription termination / polyadenylation; and operatively associated with the promoter Reporter gene or marker. Useful reporter genes include β-glucuronidase, β-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, luciferase, and the like. Preferably, the reporter gene is β-glucuronidase (GUS)
Or green fluorescent protein (GFP). Preferred selectable markers include G418, hygromycin, kanamycin, bialophos (provided by the bar gene), and the like. In one embodiment, a bacterial expression system is used to synthesize a quantity of the construct, followed by digestion with a restriction endonuclease to excise the gene of interest. Next, the gene of interest is ligated to a plant expression vector,
Used to transform plant cells. Thus, it will be readily appreciated by those skilled in the art that in bacteria, reporter genes or selectable markers that are completely different from plants can be used. Selection of the preferred bacteria is based on ampicillin resistance, and transgenic plant cells are usually selected on the basis of kanamycin resistance.

【００５５】 植物発現ベクター及びレポーター遺伝子の一般的記述は、Gruber et al.,“Ve
ctors for Plant Transformation, in Methods in Plant Molecular Biology &
Biotechnology” Glich et al.,Eds. pp. 89-119, CRC Press 1993, にある。さ
らに、ＧＵＳ発現ベクター及びＧＵＳ遺伝子カセットは、Clontech Laboratorie
s, Inc., Palo Alto, Calif. から入手でき、ＧＦＰ発現ベクター及びＧＦＰ遺
伝子カセットは、Aurora Biosciences (San Diego, CA) から入手できる。 ア
ポトーシス経路タンパク質をコード化している核酸配列は、また、分泌信号を含
むことがあり、その場合得られるポリペプチドは処理され分泌される前駆タンパ
ク質である。用いるのに適した分泌信号は広く入手でき、当業者には周知である
、例えば、During et al., Plant Mol. Biol. 15:281-293, 1990; Lindsey and
Jones in: Plant Cell Line Selection, pp. 317-335, VCH Weinham, Germany,
1990; Gruber and Crosby in: Methods in Plant Molecular Biology and Biote
chnology, pp. 89-117, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993. 本発明で用いられる異種核酸配列は、Ｔｉプラスミド、根誘導（Ｒｉ）プラス
ミド、粒子打ち込み、エレクトロポレーション、及び植物ウイルス・ベクター、
によって植物細胞に導入することができる。（これらの方法及びベクターについ
ての概説は、例えば、Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular B
iology, Academic Press, NY, Section VHI, pp. 421-463, 1988; Grierson & C
orey, Plant Molecular Biology, 2nd Ed., Blackie, London, Ch. 7-9, 1988,
及びHorsch et al., Science 227:1229, 1985; 及び Gene Transfer to Plants,
eds. Potrykus. Springer Verlag, 1995、を見よ）全て参照によって本明細書
に取り込まれる。A general description of plant expression vectors and reporter genes can be found in Gruber et al., “Ve
ctors for Plant Transformation, in Methods in Plant Molecular Biology &
Biotechnology "Glich et al., Eds. Pp. 89-119, CRC Press 1993. Further, GUS expression vectors and GUS gene cassettes are available from Clontech Laboratorie.
, Inc., Palo Alto, Calif .; GFP expression vectors and GFP gene cassettes are available from Aurora Biosciences (San Diego, CA). Nucleic acid sequences encoding apoptosis pathway proteins may also include secretion signals, in which case the resulting polypeptide is a processed and secreted precursor protein. Secretion signals suitable for use are widely available and well known to those skilled in the art, for example, During et al., Plant Mol. Biol. 15: 281-293, 1990; Lindsey and
Jones in: Plant Cell Line Selection, pp. 317-335, VCH Weinham, Germany,
1990; Gruber and Crosby in: Methods in Plant Molecular Biology and Biote
Heterology, pp. 89-117, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993. Heterologous nucleic acid sequences used in the present invention include Ti plasmids, root inducing (Ri) plasmids, particle bombardment, electroporation, and plant virus vectors. ,
Can be introduced into plant cells. (For an overview of these methods and vectors, see, for example, Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular B
iology, Academic Press, NY, Section VHI, pp. 421-463, 1988; Grierson & C
orey, Plant Molecular Biology, 2nd Ed., Blackie, London, Ch. 7-9, 1988,
And Horsch et al., Science 227: 1229, 1985; and Gene Transfer to Plants,
eds. Potrykus. Springer Verlag, 1995), all incorporated herein by reference.

【００５６】 ゲノムの又は合成の断片を含む発現ベクターは、プロトプラスト、又は無傷の
組織、又は細胞に導入できる。発現ベクターは、無傷の組織に導入することが好
ましい。植物組織を培養する一般的な方法は、Miki et al., in: Methods in Pl
ant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al., Eds., pp. 67-88, CR
C Press, 1993; 及び Phillips et al., in: Corn & Corn Improvement, 3rd Ed
ition, Sprague et al., Eds. American Society of Agronomy Inc. et al. pp.
345-387, 1988,にあり、また以下でさらに詳しく述べる。[0056] Expression vectors, including genomic or synthetic fragments, can be introduced into protoplasts or intact tissues or cells. The expression vector is preferably introduced into an intact tissue. General methods for culturing plant tissue are described in Miki et al., In: Methods in Pl
ant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al., Eds., pp. 67-88, CR
C Press, 1993; and Phillips et al., In: Corn & Corn Improvement, 3rd Ed
, Sprague et al., Eds. American Society of Agronomy Inc. et al. pp.
345-387, 1988, and described in more detail below.

【００５７】 ２． プロモーター 宿主植物が選択され、その植物への遺伝子移入の方法が決定したら、その宿主
植物に対する構成的な、誘導的な／発生的に調節される、又は組織特異的なプロ
モーターを選択して、異種タンパク質がその植物の所望の部分で（例えば、全て
の細胞で、一部の細胞で、又は組織全体で）発現されるようにする。通常の技術
を有する当業者ならば直ちに理解できるように、構造遺伝子、もっと具体的には
アポトーシス経路遺伝子、を発現させるために植物と両立するどんなプロモータ
ーを用いてもよい。問題の構造遺伝子の内生的プロモーターをその遺伝子の転写
調節に用いてもよいが、プロモーターは異種の調節配列であることが好ましい。
植物の発現ベクターに対し、適当なウイルス・プロモーターとしては、ＣａＭＶ
の３５Ｓ ＲＮＡ及び１９Ｓ ＲＮＡプロモーター（Brisson et al., Nature,
310:511, 1984; Odell et al., Nature 313:810, 1985）；Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍ
ｏｓａｉｃ Ｖｉｒｓ ＦＭＶからの全長転写プロモーター）（Gowda et al.,
J. Cell Biochem. 13D:301, 1989 及び米国特許第5,378,619 号）及びＴＭＶの
外皮タンパク質プロモーター（Takamatsu et al., EMBO J 6:307, 1987）などが
ある。その他に、リブローズ・ビスホスフェート・カルボキシラーゼの小さなサ
ブユニットからの光誘導プロモーター（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）（Corruzzi et al
., EMBO J 3:1671, 1984; Broglie et al., Science 224:838, 1984）；マンノ
パイン・シンテアーゼ・プロモーター（Velten et al., EMBO J 3:2723, 1984）
、ノパリン・シンテアーゼ（ＮＯＳ）及びオクトパイン・シンテアーゼ（ＯＣＳ
）プロモーター（Agrobacterium tumefaciens の腫瘍誘導プラスミドに付着する
）又はヒート・ショック・プロモーター、例えば、ダイズhsp17.5-E 又はhsp17.
3-B（Gurley et al., Mol. Cell Biol. 6:559, 1986; Severin et al., Plant M
ol. Biol. 15:827, 1990）を用いることができる。本発明の文脈において使用す
るに適したいろいろな既知の植物プロモーターの概説については、ＰＣＴ刊行物
WO 91/19806 を見よ。[0057] 2. Promoters Once a host plant has been selected and the method of gene transfer to the plant has been determined, a constitutive, inducible / developmentally regulated or tissue-specific promoter for the host plant may be selected to provide a heterologous promoter. Allow the protein to be expressed in the desired part of the plant (eg, in all cells, some cells, or in whole tissue). As will be readily appreciated by those of ordinary skill in the art, any plant compatible promoter may be used to express the structural gene, more specifically the apoptosis pathway gene. Although the endogenous promoter of the structural gene in question may be used to regulate the transcription of that gene, it is preferred that the promoter be a heterologous regulatory sequence.
For plant expression vectors, suitable viral promoters include CaMV
35S RNA and 19S RNA promoters (Brisson et al., Nature,
310: 511, 1984; Odell et al., Nature 313: 810, 1985); FIG.
osic Virs FMV) (Gowda et al.,
J. Cell Biochem. 13D: 301, 1989 and US Pat. No. 5,378,619) and the coat protein promoter of TMV (Takamatsu et al., EMBO J 6: 307, 1987). In addition, a light-inducible promoter (ssRUBISCO) from a small subunit of ribose bisphosphate carboxylase (Corruzzi et al.
., EMBO J 3: 1671, 1984; Broglie et al., Science 224: 838, 1984); Mannopine synthase promoter (Velten et al., EMBO J 3: 2723, 1984).
, Nopaline synthase (NOS) and octopine synthase (OCS)
) Promoter (attached to Agrobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmid) or heat shock promoter such as soybean hsp17.5-E or hsp17.
3-B (Gurley et al., Mol. Cell Biol. 6: 559, 1986; Severin et al., Plant M
ol. Biol. 15: 827, 1990). For a review of various known plant promoters suitable for use in the context of the present invention, see the PCT publication
See WO 91/19806.

【００５８】 ａ． 構成プロモーター 本発明の文脈で有用なプロモーターには、天然の構成及び誘導プロモーター、
ならびに人工プロモーターが含まれる。それらのプロモーターは、植物、ウイル
ス、又はその他の源から得られ、次のようなものがあるが、それだけに限定され
ない：カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、
本明細書で用いられる場合、“ＣａＭＶ３５Ｓ”プロモーターという言葉は、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターの変異体や類似体を含む、例えば、オペレーター領域
との結合、ランダム又はコントロールされた突然変異、によって得られるプロモ
ーター、タンデム・プロモーター、等；種子貯蔵タンパク質遺伝子のプロモータ
ー、例えば、Ｚｍａ１０ＫＺ又はＺｍｇ１２（それぞれ、トウモロコシ・ゼイン
及びグルテリン遺伝子）、又はあらゆる細胞で発現する“ハウスキーピング遺伝
子”（例えば、Ｚｍａａｃｔ、トウモロコシ・アクチン遺伝子）（Benfey et al
., Science 244:174-181, 1989; Elliston in Plant Biotechnology, eds. Kung
and Arntzen, Butterworth Publishers, Boston, Mass., p. 115-139, 1989）
。したがって、本発明は、食用の植物部分で高い発現を与えることが知られてい
る遺伝子のプロモーターを利用することができる、例えば、ポテトのパタチン遺
伝子プロモーター、などである。例えば、Wenzler et al., Plant Mol. Biol. 1
2:41-45, 1989, を見よ。ＣａＭＶプロモーターはよくあげられる構成プロモー
ターの例であるが、ウビキチン・プロモーター（ＥＰ特許出願0342926 号を見よ
）及びクロレラ・ウイルスＤＮＡメチルトランスフェラーゼ・プロモーター（米
国特許第5,563,328 号を見よ）もそうである。A. Constitutive promoters Useful promoters in the context of the present invention include natural constitutive and inducible promoters,
As well as artificial promoters. These promoters can be obtained from plants, viruses, or other sources, including but not limited to: the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter,
As used herein, the term “CaMV35S” promoter refers to the C
aMV35S promoter variants and analogs, for example, promoters obtained by binding to the operator region, random or controlled mutations, tandem promoters, etc .; Seed storage protein gene promoters, such as Zma10KZ or Zmg12 (The maize zein and glutelin genes, respectively), or “housekeeping genes” expressed in any cell (eg, Zmaact, the maize actin gene) (Benfey et al.
., Science 244: 174-181, 1989; Elliston in Plant Biotechnology, eds.Kung
and Arntzen, Butterworth Publishers, Boston, Mass., p. 115-139, 1989)
. Therefore, the present invention can utilize a promoter of a gene known to give high expression in an edible plant part, such as a potato patatin gene promoter. For example, Wenzler et al., Plant Mol. Biol. 1
2: 41-45, 1989, see. The CaMV promoter is an example of a constitutive promoter that is frequently mentioned, but also the ubiquitin promoter (see EP Patent Application No. 0342926) and the chlorella virus DNA methyltransferase promoter (see US Pat. No. 5,563,328).

【００５９】 ｂ． 誘導プロモーター 上述のように、誘導プロモーターは本発明の文脈において有用である。誘導プ
ロモーターとは、誘導物質に応答して核酸配列の転写を直接又は間接に活性化さ
せることができるプロモーターである。誘導物質がない場合は配列は転写されな
い。ある実施形態では、誘導プロモーターに特異的に結合して転写を活性化させ
るタンパク質因子が不活性な形で存在し、誘導物質によってそれが直接又は間接
に活性な形に転換される。誘導物質は生物的又は非生物的な攻撃かもしれない、
例えばタンパク質、代謝産物（糖、アルコール、等）、成長調節因子、除草剤、
又はフェノール化合物、などの化学物質、又は直接に熱、塩、毒性成分、などに
より、又は間接に病原体、又はウイルスなどの疾病因子による生理的なストレス
、が考えられる。誘導プロモーターを含む植物細胞は、散水、水やり、加熱、露
光、病原体への曝露、又は同様な方法によって誘導因子を外部から印加すること
によって誘導因子に曝されることがある。ある実施形態では、誘導プロモーター
は、種子形成の全期間にわたって、又は少なくとも組み換え核酸分子の核酸配列
の転写に対応する期間の間、誘導された状態にある。B. Inducible promoters As mentioned above, inducible promoters are useful in the context of the present invention. An inducible promoter is a promoter that can directly or indirectly activate transcription of a nucleic acid sequence in response to an inducer. In the absence of the inducer, the sequence is not transcribed. In certain embodiments, the protein factor that specifically binds to the inducible promoter and activates transcription is present in an inactive form, and the inducer converts it directly or indirectly to the active form. Inducer may be a biological or abiotic attack,
For example, proteins, metabolites (sugars, alcohols, etc.), growth regulators, herbicides,
Physiological stress due to heat, salts, toxic components, etc. directly or indirectly due to pathogens or disease factors such as viruses. Plant cells containing the inducible promoter may be exposed to the inducing agent by watering, watering, heating, exposing to light, exposing to the pathogen, or applying the inducing agent externally in a similar manner. In certain embodiments, the inducible promoter is in an inducible state for the entire period of seed formation, or at least for a period corresponding to transcription of the nucleic acid sequence of the recombinant nucleic acid molecule.

【００６０】 非常に有用であるためには、誘導プロモーターは、誘導因子が存在しないとき
は発現が低いか全く発現させず；誘導因子があるときは高い発現を与え；その植
物の正常な生理を妨害しない形の誘導スキームを用い；他の遺伝子の発現にほと
んど影響を及ぼさないということが好ましい。本発明の文脈の中で有用な誘導プ
ロモーターの例としては、化学的手段によって誘導されるものが含まれる；例え
ば、銅イオンによって活性化されるイースト・メタロチオネイン・プロモーター
（Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4567, 1993）；置換された
ベンゼンスルフォンアミド、例えば除草剤セーフナー、によって活性化されるIn
2-1 及びIn2-2 調節配列（Hershey et al., Plant Mol. Biol. 17:679, 1991）
；トウモロコシ・グルタチオン- Ｓ- トランスフェラーゼ（ＧＳＴ II）遺伝子
の27 kD サブユニットから単離された化学的に誘導される遺伝子プロモーター配
列、これは、Ｎ，Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセタミド（通称：ジクロラ
ミド）又はベンジル−２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）−５−チアゾー
ルカルボキシレート（通称：フルラゾール）によって誘導され、刊行されたＰＣ
Ｔ刊行物No. WO 90/08830 に記載されているもの；グルココルチコイドによって
誘導されるＧＲＥ調節配列（Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
8:10421, 1991）；D. melanogaster の70kDa 熱ショック・プロモーター（Freel
ing and Bennet, Maize ADN 1, Ann. Rev. of Genetics 19:297-323）及びエタ
ノールによって誘導されるアルコール・デヒドロゲナーゼ・プロモーター（Naga
o et al., Miflin, Ed, Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology
, Vol. 3, p. 384-438, Oxford University Press, Oxford, 1986）又は化学的
処理によって解発され、Ligand Pharmaceuticals から入手できるＬｅｘ Ａプロ
モーター、である。その他の誘導プロモーターとしては、病原体の攻撃によって
誘導されるもの、例えば、ＰＣＴ刊行物No. WO 98/22599 で記述されている線虫
で誘導されるプロモーター、グルココルチコイド誘導プロモーター（Aoyama and
Chua, The Plant J. 11:605-612, 1997）、チャルコン・シンターゼ・プロモー
ター、及び防衛で活性化されるプロモーター（prop1-1）（Strittmatter et al.
, Bio/Technology 13: 1085-1089,1995）がある。誘導プロモーターは、また、
公開されているChiba-Geigy による出願No. EP89/103888.7 にも記述されており
、そこでは、ＰＲタンパク質遺伝子、特にタバコＰＲタンパク質遺伝子、例えば
、ＰＲ−１ａ、ＰＲ−１ｂ、ＰＲ−１ｃ、ＰＲ−１、ＰＲ−Ａ、ＰＲ−Ｓ、など
、キュウリ・キチナーゼ遺伝子、及び酸性及び塩基性タバコ・ベータ１，３−グ
ルカナーゼ遺伝子、などいくつかの誘導プロモーターが同定されている。本発明
の文脈では、傷によって誘導される（ＷＩＮ）プロモーターも有用であろう、そ
れについての議論は、Lindsey and Jones in: Plant Cell Line Selection, pp.
317-335, VCH Weinham, Germany, 1990, を見よ。その他のプロモーター、構成
プロモーター及び誘導プロモーター及び増強因子は通常の技術を有する当業者に
は公知である。To be very useful, an inducible promoter will have low or no expression in the absence of an inducer; confer high expression in the presence of an inducer; A non-interfering form of induction scheme is used; it preferably has little effect on the expression of other genes. Examples of inducible promoters useful in the context of the present invention include those induced by chemical means; for example, the yeast metallothionein promoter activated by copper ions (Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4567, 1993); In activated by a substituted benzenesulfonamide, such as a herbicide safener.
2-1 and In2-2 regulatory sequences (Hershey et al., Plant Mol. Biol. 17: 679, 1991)
A chemically derived gene promoter sequence isolated from the 27 kD subunit of the corn glutathione-S-transferase (GST II) gene, which comprises N, N-diallyl-2,2-dichloroacetamide; (Known as dichloramide) or benzyl-2-chloro-4- (trifluoromethyl) -5-thiazolecarboxylate (also known as flurazole) and published PC
GRE regulatory sequence induced by glucocorticoids (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
8: 10421, 1991); 70 kDa heat shock promoter of D. melanogaster (Freel
ing and Bennet, Maize ADN 1, Ann. Rev. of Genetics 19: 297-323) and the alcohol dehydrogenase promoter (Naga) induced by ethanol.
o et al., Miflin, Ed, Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology
, Vol. 3, p. 384-438, Oxford University Press, Oxford, 1986) or the Lex A promoter, which is cleaved by chemical treatment and available from Ligand Pharmaceuticals. Other inducible promoters include those induced by pathogen attack, for example, the nematode-induced promoter described in PCT Publication No. WO 98/22599, the glucocorticoid-inducible promoter (Aoyama and
Chua, The Plant J. 11: 605-612, 1997), the Chalcon synthase promoter, and a defense-activated promoter (prop1-1) (Strittmatter et al.
Bio / Technology 13: 1085-1089, 1995). Inducible promoters also
It is also described in published application No. EP89 / 103888.7 by Chiba-Geigy, in which PR protein genes, especially tobacco PR protein genes, such as PR-1a, PR-1b, PR-1c, PR- Several inducible promoters have been identified, such as the 1, cucumber chitinase gene, such as PR-A, PR-S, and the acidic and basic tobacco beta 1,3-glucanase genes. In the context of the present invention, wound-induced (WIN) promoters may also be useful, a discussion of which can be found in Lindsey and Jones in: Plant Cell Line Selection, pp.
See 317-335, VCH Weinham, Germany, 1990 ,. Other promoters, constitutive and inducible promoters and enhancers are known to those of ordinary skill in the art.

【００６１】 ｃ． 組織特異的プロモーター 組織特異的なプロモーターも、本発明で利用できる。組織特異的なプロモータ
ーの一例は、シュート***組織で発現されるプロモーターである（Atanassova e
t al., Plant J. 2:291, 1992）。遺伝子導入植物において有用な他の組織特異
的なプロモーターは、cdc2a プロモーター及びcyc07 プロモーターを含め、当業
者には公知であろう。（例えば、Ito et al., Plant Mol. Biol. 24:863, 1994;
Martinez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7360, 1992; Medford et a
l., Plant Cell 3:359,1991; Terada et al., Plant Journal 3:241, 1993; Wis
senbach et al., Plant Journal 4;411, 1993; 塊茎に向けられたクラスＩパタ
チン・プロモーター、Bevan et al., Nucleic Acids Res. 14:4625-38, 1986;
ポテト塊茎ADPGPP 遺伝子に関連したプロモーター、Muller et al., Mol. Gen.
Genet. 224:136-46, 1990; ダイズのβ−コングリシニン・プロモーター、７Ｓ
タンパク質とも呼ばれる、種子に向けられた転写、Bray, Planta 172:364-370,
1987; トウモロコシ胚乳のゼイン遺伝子からの種子に向けられたプロモーター、
Pedersen et al., Cell 29:1015-26, 1982; 及びトウモロコシから単離された花
粉特異的なプロモーターを開示しているMascarenhas への米国特許第5,086,169
号；トウモロコシからの別の花粉特異的プロモーターを開示しているAllen et a
l. への米国特許第5,412,085号；別の特異的プロモーターを開示しているTuttle
et al. への米国特許第5,477,002 号; タペータム特異的プロモーターを開示し
ているHuffman et al. への米国特許第5,470,359 号; Brassicaceae から単離さ
れたタペータム特異的プロモーターを開示しているDraper et al. へのWO 92/11
379、タバコからの花粉特異的プロモーターを開示しているPlant 8(1):55-63, 1
995, などにおいて開示された花粉特異的なプロモーター）。C. Tissue-Specific Promoters Tissue-specific promoters can also be used in the present invention. One example of a tissue-specific promoter is a promoter expressed in shoot meristems (Atanassova e
t al., Plant J. 2: 291, 1992). Other tissue-specific promoters useful in transgenic plants will be known to those of skill in the art, including the cdc2a promoter and the cyc07 promoter. (For example, Ito et al., Plant Mol. Biol. 24: 863, 1994;
Martinez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7360, 1992; Medford et a.
l., Plant Cell 3: 359,1991; Terada et al., Plant Journal 3: 241, 1993; Wis
senbach et al., Plant Journal 4; 411, 1993; Class I patatin promoter directed to tubers, Bevan et al., Nucleic Acids Res. 14: 4625-38, 1986;
A promoter related to the potato tuber ADPGPP gene, Muller et al., Mol. Gen.
Genet. 224: 136-46, 1990; soybean β-conglycinin promoter, 7S
Seed-directed transcription, also called protein, Bray, Planta 172: 364-370,
1987; a seed-directed promoter from the maize endosperm zein gene,
Pedersen et al., Cell 29: 1015-26, 1982; and U.S. Pat.No. 5,086,169 to Mascarenhas, which discloses a pollen-specific promoter isolated from corn.
No. Allen et a discloses another pollen-specific promoter from maize
U.S. Pat. No. 5,412,085 to L. Tuttle discloses another specific promoter
U.S. Patent No. 5,477,002 to Huffman et al .; U.S. Patent No. 5,470,359 to Huffman et al .; Draper et al. WO 92/11 to.
379, Plant 8 (1): 55-63, 1 which discloses a pollen-specific promoter from tobacco
995, etc.).

【００６２】 プロモーター構造にイントロン配列を含めることも望ましいであろう。何故な
らコーディング領域にイントロンを含めることで発現及び特異性が強められるか
らである。したがって、ある植物の細胞／組織にユニークなポリペプチドの最初
のイントロン及びエクソン配列を含むプロモーター配列に発現されるＤＮＡ配列
を加えることが有利であろう。さらに、あるプロモーターの領域を異なるプロモ
ーターの領域に結合してキメラ・プロモーターを得ることができる。It may also be desirable to include intron sequences in the promoter structure. This is because including an intron in the coding region enhances expression and specificity. Therefore, it would be advantageous to add a DNA sequence that is expressed in a promoter sequence that includes the first intron and exon sequence of a polypeptide that is unique to certain plant cells / tissues. Further, a region of one promoter can be linked to a region of a different promoter to obtain a chimeric promoter.

【００６３】 ３． マーカー 本発明のベクターは、また、宿主において機能する少なくとも一つの選択可能
な又はスコアラブルなマーカー／レポーターを含むことが好ましい。このための
多数の遺伝子が同定されている。（例えば、Fraley in: Plant Biotechnology,
eds. Kung and Arntzen, Butterworth Publishers, Boston, Mass., p. 395-407
,1989; Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988, を見よ）。選択
マーカー遺伝子は、形質転換した細胞を同定し選択的に増殖することを可能にす
る表現型又は形質を宿主に付与する遺伝子を含む。したがって、選択マーカー遺
伝子は、植物細胞に化学物質への又は生理的ストレスへの抵抗性を付与する、あ
るいは組み換え核酸分子によって形質転換された植物細胞を選択因子によって容
易に選択できるようにする識別可能な表現型特性をその細胞に付与する選択遺伝
子産物をコード化している。バクテリア宿主に関する適当な選択マーカー遺伝子
としては、アンピシリン抵抗性遺伝子（Ampr）,テトラサイクリン抵抗性遺伝子
（Tcr）、及びカナマイシン抵抗性遺伝子（Kanr)などがある。いまのところ、ア
ンピシリン抵抗性遺伝子が好ましい。真核生物の適当なマーカーは、普通、宿主
における相補的な欠失を必要とする（例えば、tk- 宿主におけるチミジンキナー
ゼ（tk））。しかし、薬剤マーカーも利用できる（例えば、G418 抵抗性及びハ
イグロマイシン抵抗性）。適当な選択マーカーとしては、例えば、bar 遺伝子、
アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、ハイグロマイシン
−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチングアニンホス
ホリボシル−トランスフェラーゼ、及びアミノグリコシド３’−Ｏ−ホスホトラ
ンスフェラーゼII（カナマイシン、ネオマイシン、及びG418 抵抗性）、などが
ある。その他の適当なマーカーは当業者には公知である。さらに、遺伝子発現の
同定は植物が産生する問題のｍＲＮＡのノーザン・ブロットなどの方法によって
行うことができる。[0063] 3. Markers The vectors of the present invention also preferably include at least one selectable or scoreable marker / reporter that functions in the host. Numerous genes for this have been identified. (For example, Fraley in: Plant Biotechnology,
eds.Kung and Arntzen, Butterworth Publishers, Boston, Mass., p. 395-407
, 1989; Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477, 1988). Selectable marker genes include genes that confer on a host a phenotype or trait that allows the transformed cell to be identified and selectively grown. Thus, a selectable marker gene is identifiable that confers plant cell resistance to chemicals or to physiological stress or that facilitates selection of plant cells transformed with recombinant nucleic acid molecules by a selection factor. It encodes a selection gene product that confers unique phenotypic characteristics to the cell. Suitable selectable marker genes for bacterial hosts include the ampicillin resistance gene (Amp r ), the tetracycline resistance gene (Tc r ), and the kanamycin resistance gene (Kan r ). At present, the ampicillin resistance gene is preferred. Suitable markers in eukaryotes usually require a complementary deletion in the host (eg, thymidine kinase (tk) in the tk-host). However, drug markers are also available (eg, G418 resistance and hygromycin resistance). Suitable selectable markers include, for example, the bar gene,
Adenosine deaminase, dihydrofolate reductase, hygromycin-B-phosphotransferase, thymidine kinase, xanthine guanine phosphoribosyl-transferase, and aminoglycoside 3'-O-phosphotransferase II (kanamycin, neomycin, and G418 resistance), and the like. . Other suitable markers are known to those skilled in the art. Further, gene expression can be identified by methods such as Northern blotting of the mRNA in question produced by the plant.

【００６４】 ４． 形質転換方法 本発明による植物の形質転換は、本質的には植物分子生物学の分野の当業者に
公知のいろいろな方法のいずれによっても行うことができる。（例えば、Method
s of Enzymacology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman, Eds., Academic Press
, を見よ；これは参照によって本明細書に取り込まれる）。本明細書で用いられ
る場合、“形質転換”という用語は、異種核酸配列の導入による宿主植物の遺伝
子型の変化を意味する。[0064] 4. Transformation Methods Transformation of plants according to the present invention can be performed by essentially any of a variety of methods known to those skilled in the field of plant molecular biology. (For example, Method
s of Enzymacology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman, Eds., Academic Press
, See; this is incorporated herein by reference). As used herein, the term "transformation" refers to a change in the genotype of a host plant due to the introduction of a heterologous nucleic acid sequence.

【００６５】 植物組織に発現ベクターを導入する方法は、物理的及び化学的手段を含み、エ
レクトロポレーション、粒子打ち込み、ウイルス及びバクテリア感染／共培養、
例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスとの共培養、などがある。これ
らの形質転換方法は、外来性遺伝子を単子葉植物及び双子葉植物に導入するのに
利用できる。Potrykus, Annu. Plant Physiol., Plant Mol. Biol. 42:205-225,
1991, 及びShimamoto et al., Nature 338:274-276, 1989. 外来性ＤＮＡを
植物のゲノムＤＮＡに安定に組み込ませる主な方法としては、次のようなアプロ
ーチがある；１）アグロバクテリウムに媒介される遺伝子移入；Horsch et al.,
Science 227:1229,1985; Gruber et al., 前出； Klee et al., Annu. Rev. Pl
ant Physiol. 38:467-486, 1987; Klee et al., Molecular Biology of Plant N
uclear Genes 6:2-25,1989; Gatenby, Plant Biotechnology, 93-112, 1989; Wh
ite, Plant Biotechnology, 3-34 1989; 及び２）直接ＤＮＡ取り込み、Paszkow
ski et al., Molecular Biology of Plant Nuclear Genes 6:52-68, 1989, プロ
トプラストへのＤＮＡの直接取り込み、Toriyama et al., Bio/Technology 6:10
72-1074, 1988; 植物細胞の短時間電気ショックで誘発されるＤＮＡ取り込み、Z
hang et al., Plant Cell Rep. 7:379-384,1988, 及びFromm et al., Nature 31
9:791-792,1986。粒子打ち込みによる植物細胞又は組織へのＤＮＡ注入、Klein
et al., Progress in Plant Cellular and Molecular Biology, 56-66, 1988; K
lein et al., Bio/Technology 6:559-563, 1988; McCabe et al., Bio/Technolo
gy 6:923-926, 1988, 及びSanford, Physiol. Plant 79:206-209, 1990, マイク
ロピペット・システムを用いるもの、Hess, Int. Rev. Cytol. 107:367-395, 19
87; Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75:30-36, 1987, Neuhaus and Span
genberg, Physiol. Plant 79: 213-217, 1990, 又はＤＮＡを発芽する花粉と一
緒に直接培養、DeWet et al., Experimental Manipulation of Ovule Tissue, 1
97-209, 1985, Ohta, Y. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 715-719, 1986; な
どの方法を含む；又は ３）遺伝子ベクターとして植物ウイルスを利用するもの
、Klee et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Futterer et al., Phy
siol. Plant 79:154-157, 1990. ベクターとしての、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）（Howell
et al., Science 208:1265, 1980）及びゲミニ・ウイルス（Goodman, J. Gen V
irol. 54:9,1981）の利用が示唆されているが、最大の成功は、アグロバクテリ
ウムsp.に関して報告されている（Rorsch et al., Science 227:1229-1231, 198
5）。形質転換システムに基づくアグロバクテリウムの使用方法は、今では多く
の異なる種について記述されている。一般に、天然に生ずるＴｉプラスミドの修
飾バージョンを含むバクテリアの株が用いられ、ＤＮＡを宿主植物に移入しても
その後腫瘍が形成されないようにする。この方法は、挿入されるＤＮＡをＴｉプ
ラスミドの境界内で選択マーカー遺伝子とリンクした植物ゲノムに挿入して形質
転換した細胞の選択を容易にしている。このようなベクター・システムは、Hajd
ukiewicz et al., Plant Mol. Biol. 25:989-994,1994, に記述されている。こ
のような二元システムは、植物に移入ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）を導入するために不
可欠なビルレンス領域（ｖｉｒ）を有する第一のＴｉプラスミド、及びキメラ・
プラスミドを含む。後者は、移入される核酸をくっつけた、野生株のＴｉプラス
ミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも一つの境界領域を含む。二元Ｔｉプラスミド
・システムは植物細胞を形質転換するのに有効であることが示されている（De F
ramond Biotechnology 1:262, 1983; Hoekema et al., Nature 303:179,1983）
。その他の二元システムはＰＣＴ刊行物 Nos. WO 99/01563 及びWO 99/10514 に
記述されている。Methods for introducing expression vectors into plant tissues include physical and chemical means, including electroporation, particle bombardment, viral and bacterial infection / co-culture,
Examples include co-culture with Agrobacterium tumefaciens. These transformation methods can be used to introduce foreign genes into monocots and dicots. Potrykus, Annu.Plant Physiol., Plant Mol. Biol. 42: 205-225,
1991, and Shimamoto et al., Nature 338: 274-276, 1989. The main approaches to stably integrate exogenous DNA into plant genomic DNA include the following approaches; 1) Agrobacterium Mediated gene transfer; Horsch et al.,
Science 227: 1229, 1985; Gruber et al., Supra; Klee et al., Annu. Rev. Pl.
ant Physiol. 38: 467-486, 1987; Klee et al., Molecular Biology of Plant N
uclear Genes 6: 2-25,1989; Gatenby, Plant Biotechnology, 93-112, 1989; Wh
ite, Plant Biotechnology, 3-34 1989; and 2) Direct DNA uptake, Paszkow
ski et al., Molecular Biology of Plant Nuclear Genes 6: 52-68, 1989, Direct incorporation of DNA into protoplasts, Toriyama et al., Bio / Technology 6:10
72-1074, 1988; DNA uptake induced by short-term electric shock of plant cells, Z
hang et al., Plant Cell Rep. 7: 379-384, 1988, and Fromm et al., Nature 31.
9: 791-792,1986. DNA injection into plant cells or tissues by particle bombardment, Klein
et al., Progress in Plant Cellular and Molecular Biology, 56-66, 1988; K
lein et al., Bio / Technology 6: 559-563, 1988; McCabe et al., Bio / Technolo
gy 6: 923-926, 1988, and Sanford, Physiol. Plant 79: 206-209, 1990, using a micropipette system, Hess, Int. Rev. Cytol. 107: 367-395, 19
87; Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75: 30-36, 1987, Neuhaus and Span
genberg, Physiol. Plant 79: 213-217, 1990, or direct culture with DNA germinating pollen, DeWet et al., Experimental Manipulation of Ovule Tissue, 1
Natl. Acad. Sci. USA 83: 715-719, 1986; or 3) those using plant viruses as gene vectors, Klee et al. , Ann. Rev. Plant Physiol. 38: 467-486; Futterer et al., Phy.
siol. Plant 79: 154-157, 1990. Cauliflower mosaic virus (CaMV) as a vector (Howell
et al., Science 208: 1265, 1980) and the Gemini virus (Goodman, J. Gen V).
irol. 54: 9, 1981), but the greatest success has been reported for Agrobacterium sp. (Rorsch et al., Science 227: 1229-1231, 198).
Five). Methods of using Agrobacterium based transformation systems have now been described for many different species. Generally, bacterial strains containing a modified version of the naturally occurring Ti plasmid are used so that transfer of the DNA to the host plant does not result in the formation of a tumor. This method facilitates selection of transformed cells by inserting the inserted DNA into the plant genome linked to a selectable marker gene within the boundaries of the Ti plasmid. Such a vector system is known as Hajd
ukiewicz et al., Plant Mol. Biol. 25: 989-994, 1994. Such a binary system comprises a first Ti plasmid having a virulence region (vir) essential for introducing the transferred DNA (T-DNA) into the plant, and a chimeric plasmid.
Includes plasmid. The latter comprises at least one border region of the T-DNA region of the wild-type Ti plasmid to which the transferred nucleic acid has been attached. The binary Ti plasmid system has been shown to be effective in transforming plant cells (De F
ramond Biotechnology 1: 262, 1983; Hoekema et al., Nature 303: 179,1983)
. Other binary systems are described in PCT publications Nos. WO 99/01563 and WO 99/10514.

【００６６】 バクテリアと植物組織を一緒に培養して外来のＤＮＡを植物細胞に移入させ、
次に形質転換された植物が選択媒質で再生される。Brassicaceaeのメンバーにつ
いて具体的に述べられているように、アグロバクテリウムに媒介される形質転換
では、いろいろな器官及び組織を標的として用いることができる。それは例えば
、薄い細胞層（Chares et al., Theor. Appl. Genet. 75:438-444,1988）、胚軸
（DeBlock et al., Plant Physiol. 91:694-701, 1989）、リーフディスク（Fel
dman, Plant Sci. 47:63-69, 1986）、茎（Fry et al., Plant Cell Repts 6:32
1-325, 1987）、子葉（Moloney et al., Plant Cell Repts 8:238-242, 1989）
、及び胚様体（Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75:30-36, 1987）などで
ある。しかし、作物によっては異なる組織又は形質転換の方法を選ぶことが望ま
しいかもしれない。Bacteria and plant tissue are cultured together to transfer foreign DNA into plant cells,
The transformed plants are then regenerated on the selection medium. As described specifically for members of the Brassicaceae, Agrobacterium-mediated transformation can use a variety of organs and tissues as targets. It includes, for example, thin cell layers (Chares et al., Theor. Appl. Genet. 75: 438-444, 1988), hypocotyls (DeBlock et al., Plant Physiol. 91: 694-701, 1989), leaf disks ( Fel
dman, Plant Sci. 47: 63-69, 1986), stem (Fry et al., Plant Cell Repts 6:32)
1-325, 1987), cotyledon (Moloney et al., Plant Cell Repts 8: 238-242, 1989)
And embryoid bodies (Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75: 30-36, 1987). However, for some crops it may be desirable to choose a different tissue or method of transformation.

【００６７】 遺伝子組み換えで形質転換された植物を何個体か生成して位置効果を免れた植
物を回収することが有益であろう。ある実施形態では、サイレンシング効果を小
さくするために、導入された異種核酸分子をワン・コピー含む植物を選択するこ
とが好ましい。 ある実施形態では、発現ベクターは、植物細胞とウイルス又はバクテリアとの
共培養（co-cultivation）によって植物組織に導入される。例えば、植物ＲＮＡ
−ウイルスをベースとするシステムは、普通、問題の構造遺伝子をプロモーター
のコントロールの下で適当な植物ウイルスの外皮プロモーター領域に挿入すると
いう形で用いることができる。植物ＲＮＡ−ウイルスをベースとするシステムは
、例えば、米国特許第5,500,360 号；5,316,931 号；及び5,589,367 号に記述さ
れており、それぞれ全体が参照によって本明細書に取り込まれる。It may be beneficial to generate some transgenically transformed plants and recover those plants that have escaped position effects. In certain embodiments, it is preferable to select plants that contain one copy of the introduced heterologous nucleic acid molecule to reduce the silencing effect. In certain embodiments, the expression vector is introduced into the plant tissue by co-cultivation of the plant cells with a virus or bacterium. For example, plant RNA
-Virus-based systems can usually be used in which the structural gene in question is inserted under control of the promoter into the coat promoter region of a suitable plant virus. Plant RNA-virus based systems are described, for example, in U.S. Patent Nos. 5,500,360; 5,316,931; and 5,589,367, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

【００６８】 上述のように、本発明のある実施形態では、アグロバクテリウム−Ｔｉプラス
ミド・システムが用いられる、Watson et al., Recombinant DNA, a Short Cour
se, Scientific American Books, 164-175, 1983。A. tumefaciens の腫瘍誘発
（Ｔｉ）プラスミドは、形質転換ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれるプラスミドＤ
ＮＡ部分を含み、それが植物細胞に移入されて植物宿主ゲノムに統合される。形
質転換ベクター・システムの構築は二つの基本ステップを含む。最初に、Escher
ichia coli （E. coli）において複製されるプラスミド・ベクターが構築される
。このプラスミドは問題のタンパク質（本発明の抗原タンパク質）をコード化し
ているＤＮＡを含んでいる；このＤＮＡに、そのＤＮＡが植物ゲノムに統合され
る点を定めるＴ−ＤＮＡ境界シーケンスが横付けされる。通常、選択マーカーを
コード化する遺伝子（カナマイシンなどの抗生物質に対する抵抗性をコード化す
る遺伝子）も左境界（ＬＢ）と右境界（ＲＢ）シーケンスの間に挿入される；形
質転換された細胞におけるこの遺伝子の発現は、統合されたＴ−ＤＮＡ領域を有
する植物又は植物細胞を同定するポジティブな選択方法を与える、Watson et al
., Recombinant DNA, a Short Course, Scientific American Books, 164-175,
1983; White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989。二番目のステップは、E. col
i からアグロバクテリウムへのプラスミドの伝達である。これは、接合交配シス
テム、又はアグロバクテリウムによるプラスミドＤＮＡの直接の取り込みによっ
て行われる。その後のＴ−ＤＮＡの植物への移入のために、用いられるアグロバ
クテリウム株は、植物細胞へのＴ−ＤＮＡ移入のためのビルレンス（ｖｉｒ）遺
伝子を含む、White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989; Frarey, Plant Biotec
hnology, 395-407, 1989; Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Bio. 25:989-994,
1994。当業者は、植物の遺伝子形質転換を最適化するために用いることができ
るアグロバクテリウム株及びプラスミド構築戦略には多数の選択があるというこ
とを認識されるであろう。また、A. tumefaciens が用いられる唯一のアグロバ
クテリウム株ではないであろうということも認識されるであろう。他のアグロバ
クテリウム株、例えばA. rhizogenes，の方が用途によってはもっと適当である
かもしれない。植物組織の接種方法は、植物の種及びアグロバクテリウム送出シ
ステムによって異なる。非常に好適なアプローチは、リーフディスク手法であり
、これはどんな外植でも行うことができ、完全な植物分化の開始のための良い源
を提供する。条件によっては、栄養組織を加えることが望ましいかもしれない。
A. tumefaciens による再生するプロトプラストのin vitro形質転換など、他の
手順に従って形質転換した植物細胞を得ることもできる、Potrykus, Plant Mol.
Biol. 42:205-225, 1991; White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989。As mentioned above, in one embodiment of the present invention, the Agrobacterium-Ti plasmid system is used, Watson et al., Recombinant DNA, a Short Cour
se, Scientific American Books, 164-175, 1983. A. tumefaciens tumor-inducing (Ti) plasmid contains a plasmid D, called transforming DNA (T-DNA).
Contains the NA portion, which is transferred to plant cells and integrated into the plant host genome. Construction of a transformation vector system involves two basic steps. First, Escher
A plasmid vector that is replicated in ichia coli (E. coli) is constructed. This plasmid contains DNA encoding the protein of interest (the antigenic protein of the invention); this DNA is flanked by T-DNA border sequences that define the point at which the DNA integrates into the plant genome. Usually, a gene encoding a selectable marker (a gene encoding resistance to an antibiotic such as kanamycin) is also inserted between the left border (LB) and right border (RB) sequences; Expression of this gene provides a positive selection method to identify plants or plant cells that have integrated T-DNA regions, Watson et al.
., Recombinant DNA, a Short Course, Scientific American Books, 164-175,
1983; White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989. The second step is E. col
Transfer of plasmid from i to Agrobacterium. This is done by conjugative mating systems or by direct uptake of plasmid DNA by Agrobacterium. For the subsequent transfer of T-DNA to plants, the Agrobacterium strain used is White, Plant Biotechnology, 3-34, containing the virulence (vir) gene for transfer of T-DNA to plant cells. 1989; Frarey, Plant Biotec
hnology, 395-407, 1989; Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Bio. 25: 989-994,
1994. One skilled in the art will recognize that there are many choices for Agrobacterium strains and plasmid construction strategies that can be used to optimize plant genetic transformation. It will also be appreciated that A. tumefaciens will not be the only Agrobacterium strain used. Other Agrobacterium strains, such as A. rhizogenes, may be more suitable for some applications. Plant tissue inoculation methods vary depending on the plant species and the Agrobacterium delivery system. A very suitable approach is the leaf disc approach, which can be performed on any explant and provides a good source for the initiation of full plant differentiation. Depending on the conditions, it may be desirable to add nutrient tissue.
Potrykus, Plant Mol. Can also be used to obtain plant cells transformed according to other procedures, such as in vitro transformation of regenerated protoplasts by A. tumefaciens.
Biol. 42: 205-225, 1991; White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989.

【００６９】 アグロバクテリウムを用いる方法としては次のようなものがあるが、それだけ
に限定されない：１）アグロバクテリウムと培養された単離プロトプラストの共
培養（co-cultivation）；２）アグロバクテリウムによる植物細胞又は組織の形
質転換；又は３）アグロバクテリウムによる種子、根端、又は***組織の形質転
換。さらに、遺伝子の移入は、Bechtold et al., C. R. Acad. Sci. Paris 316:
1194, 1993, に記述されているような、アグロバクテリウムによるイン・シチュ
（in situ）形質転換、及び米国特許出願第08/667,188 及び対応するＰＣＴ刊行
物No. WO 97/48814 に記述され、ここに例示されている形質転換方法、によって
も実行できる。簡単に言うと、この方法はアグロバクテリウム細胞の懸濁液の真
空浸潤に基づく。Methods using Agrobacterium include, but are not limited to: 1) co-cultivation of Agrobacterium and cultured isolated protoplasts; 2) Agrobacterium Or 3) transformation of seeds, root tips or meristems with Agrobacterium. In addition, gene transfer was performed according to Bechtold et al., CR Acad. Sci. Paris 316:
In situ transformation with Agrobacterium, as described in 1194, 1993, and described in US patent application Ser. No. 08 / 667,188 and corresponding PCT publication No. WO 97/48814, It can also be performed by the transformation method exemplified herein. Briefly, this method is based on vacuum infiltration of a suspension of Agrobacterium cells.

【００７０】 異種の核酸を植物細胞に導入する好ましい方法は、その植物細胞、外植片、分
裂組織、又は種子に、上述のような形質転換したアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens）を感染させることである。当業者には
公知の適当な条件の下で、形質転換した植物細胞は増殖して、シュート、根、を
形成し、さらに植物にまで成長する。ある実施形態では、本発明のベクターは、
Ｔｉプラスミド二元システムを含み、異種核酸配列がアポトーシス経路タンパク
質をコード化している。いくつかの実施形態では、核酸配列は少なくとも一つの
抗アポトーシス・タンパク質をコード化している。このようなベクターは、オプ
ションとして、第二の又はさらに多くのアポトーシス経路タンパク質をコード化
している核酸配列を含む。あるいは、二つ以上のベクターを用いて、各ベクター
が異種核酸配列を含むようにすることもできる。同様に、他のアポトーシス経路
遺伝子を用いて一つ以上のベクターを構築することもできる。A preferred method for introducing a heterologous nucleic acid into a plant cell is to infect the plant cell, explant, meristem, or seed with a transformed Agrobacterium tumefaciens as described above. That is. Under suitable conditions known to those skilled in the art, transformed plant cells proliferate, form shoots, roots, and even grow into plants. In one embodiment, the vector of the invention comprises:
Including the Ti plasmid binary system, the heterologous nucleic acid sequence encodes an apoptosis pathway protein. In some embodiments, the nucleic acid sequence encodes at least one anti-apoptotic protein. Such vectors optionally include a nucleic acid sequence encoding a second or even more apoptotic pathway protein. Alternatively, two or more vectors can be used, each vector containing a heterologous nucleic acid sequence. Similarly, one or more vectors can be constructed using other apoptosis pathway genes.

【００７１】 いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、直接の物理的又は化学的手段を用
いて植物細胞に接触させることによって植物細胞に導入することができる。例え
ば、核酸は、ミクロピペット又は粒子打ち込みを用いる植物細胞への直接のミク
ロインジェクションによって物理的に移入することができる。あるいは、核酸は
、遺伝物質と析出錯体を形成するポリエチレングリコールを用い、それを細胞に
取り込ませることによって、植物細胞に移入することもできる。In some embodiments, a heterologous nucleic acid sequence can be introduced into a plant cell by contacting the plant cell using direct physical or chemical means. For example, nucleic acids can be physically transferred by direct microinjection into plant cells using a micropipette or particle bombardment. Alternatively, nucleic acids can be transferred to plant cells by using polyethylene glycol, which forms a precipitation complex with the genetic material, and incorporating it into the cells.

【００７２】 核酸を植物細胞に導入する別の方法は、小粒子の高速弾道打ち込みである。導
入しようとする核酸は、打ち込まれる小さなビーズ又は粒子のマトリクス内部に
、又はその表面に収められている（Klein et al., Nature 327:70, 1987; 米国
特許第4,945,050 号、5,036,006 号及び5,100,792 号）。普通、小粒子打ち込み
を用いる場合、ＤＮＡは硫化マグネシウムの結晶又はタングステン粒子などのミ
クロ飛翔体に吸着され、そのミクロ飛翔体が物理的に加速されて細胞又は植物組
織に打ち込まれる。通常、新しい核酸配列は一回だけの導入が望まれるが、この
方法では、普通、複数回にわたって導入することが可能になる。Another method of introducing nucleic acids into plant cells is by high speed ballistic bombardment of small particles. The nucleic acid to be introduced is contained within or on a matrix of small beads or particles to be implanted (Klein et al., Nature 327: 70, 1987; U.S. Patent Nos. 4,945,050, 5,036,006 and 5,100,792). ). Normally, when using small particle bombardment, DNA is adsorbed on microprojectiles such as magnesium sulfide crystals or tungsten particles, which are physically accelerated and driven into cell or plant tissue. Usually, only one introduction of a new nucleic acid sequence is desired, but this method usually allows for multiple introductions.

【００７３】 異種核酸は、また、エレクトロポレーションによって植物細胞に導入すること
もできる（Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:5824,1985, これ
は参照によって本明細書に取り込まれる）。この方法では、関連核酸配列を含む
ベクター又は核酸の存在下で、植物プロトプラストを電気的に穿孔する。高い電
界強度の電気パルスが細胞膜に可逆的に孔をあけて核酸の導入を可能にする。電
気穿孔された植物プロトプラストは、細胞壁を再形成し、***して植物カルスを
形成する。形質転換遺伝子によって形質転換された植物細胞の選択は、この明細
書で述べるような表現型マーカーを用いて行うことができる。Heterologous nucleic acids can also be introduced into plant cells by electroporation (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824, 1985, which is incorporated herein by reference. It is captured). In this method, plant protoplasts are electroporated in the presence of a vector or nucleic acid containing the relevant nucleic acid sequence. Electric pulses of high electric field strength reversibly puncture the cell membrane to allow for the introduction of nucleic acids. Electroporated plant protoplasts reform the cell wall and divide to form plant callus. Selection of plant cells transformed with the transforming gene can be performed using phenotypic markers as described herein.

【００７４】 さらに、上述のように、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）を植
物細胞に異種核酸を導入するためのベクターとして用いることもできる（米国特
許第4,407,956 号）。ＣａＭＶウイルスＤＮＡゲノムを親バクテリア・プラスミ
ドに挿入して組み換えＤＮＡ分子を作り、それをバクテリアで増殖させることが
できる。クローニングの後、組み換えプラスミドをクローニングし、所望の核酸
配列を導入してさらに修飾することができる。次に、組み換えプラスミドの修飾
されたウイルス部分を親バクテリア・プラスミドから切り取り、植物細胞又は植
物に接種するのに用いる。Further, as described above, cauliflower mosaic virus (CaMV) can be used as a vector for introducing a heterologous nucleic acid into plant cells (US Pat. No. 4,407,956). The CaMV viral DNA genome can be inserted into a parent bacterial plasmid to create a recombinant DNA molecule that can be propagated in bacteria. After cloning, the recombinant plasmid can be cloned and further modified by introducing the desired nucleic acid sequence. Next, the modified viral portion of the recombinant plasmid is excised from the parent bacterial plasmid and used to inoculate plant cells or plants.

【００７５】 いろいろな実施形態で、本発明は修飾されたアポトーシス、非生物的攻撃、及
び／又は生物的攻撃への抵抗性、を有する遺伝子導入植物を生成する方法を提供
する。この方法は、植物細胞にベクターを接触させるステップと、アポトーシス
経路タンパク質をコード化し、あるプロモーターと作用的に関連している、少な
くとも一つの構造遺伝子を含む異種核酸配列を備えるステップと、前記形質転換
された植物細胞から植物を生成するステップと、非生物的又は生物的攻撃抵抗性
及び／又は修飾されたアポトーシスを示す植物を選択するステップを含む。In various embodiments, the invention provides methods for generating transgenic plants with modified apoptosis, abiotic attack, and / or resistance to biological attack. The method comprises contacting a vector with a plant cell, providing a heterologous nucleic acid sequence encoding at least one apoptotic pathway protein and comprising at least one structural gene operatively associated with a promoter, wherein said transforming comprises: Generating a plant from the plant cells obtained and selecting a plant that exhibits abiotic or biological attack resistance and / or modified apoptosis.

【００７６】 本明細書で用いられる場合、“接触させる”という用語は、上述のような化学
的、物理的、又は機械的手段を含む植物細胞にベクターを導入する何らかの手段
を指す。好ましくは、接触させるとは、植物細胞（外植片、***組織、又は種子
を含む）に、上述のように異種核酸で形質転換されたアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンスによって、核酸又はベクターを導入することを指す。As used herein, the term “contacting” refers to any means of introducing a vector into a plant cell, including chemical, physical, or mechanical means as described above. Preferably, contacting involves introducing a nucleic acid or vector into a plant cell (including an explant, meristem, or seed) by Agrobacterium tumefaciens transformed with a heterologous nucleic acid as described above. Point to.

【００７７】 通常、植物細胞を再生させて、形質転換プロセスからの完全な植物を得る。形
質転換の直接の産物は“トランスゲノート（transgenote）”と呼ばれる。本明
細書で用いられる場合、“生育させる”、“生成する”、又は“再生”とは、植
物細胞、植物細胞のグループ、植物部分（種子を含む）、又は植物組織（例えば
、プロトプラスト、カルス、又は組織部分）から完全な植物を成長させることを
指す。Typically, the plant cells are regenerated to obtain a complete plant from the transformation process. The direct product of the transformation is called "transgenote". As used herein, “grow”, “generate” or “regenerate” refers to a plant cell, a group of plant cells, a plant part (including seeds), or a plant tissue (eg, protoplast, callus). , Or tissue parts).

【００７８】 プロトプラストからの再生は、植物の種によって異なるが、一般にプロトプラ
ストの懸濁液が最初に作られる。いくつかの種では、次にプロトプラストの懸濁
液から胚形成が誘導され、自然の胚としての成熟と発芽の段階に進む。培養媒質
は一般に、成長と再生に必要なアミノ酸とホルモンを含む。用いられるホルモン
は、例えば、オーキシン及びサイトキシンなどである。媒質にグルタミン酸及び
プロリンを加えることが、特にコーン及びアルファルファなどの種では、有利で
ある。効率的な再生は、媒質、遺伝子型、及び培養の経過、に依存する。これら
の変数がコントロールされれば、再生は再現性がある。The regeneration from protoplasts depends on the species of the plant, but generally a suspension of protoplasts is first created. In some species, embryogenesis is then induced from the suspension of protoplasts and proceeds to the stage of maturation and germination as a natural embryo. The culture medium generally contains amino acids and hormones necessary for growth and regeneration. Hormones used are, for example, auxin and cytoxin. The addition of glutamic acid and proline to the medium is advantageous, especially in species such as corn and alfalfa. Efficient regeneration depends on the medium, the genotype, and the course of the culture. If these variables are controlled, playback is reproducible.

【００７９】 再生は、植物カルス、外植片、器官又は部分からも起こる。形質転換は、器官
又は植物部分の再生という状況でも行うことができる。（Method in Enzymology
, Vol. 118 及び Klee et al., Ann. Rev. Plant Phys. 38:467, 1987, を見よ
）。Horsch et al., Science 227:1229, 1985のリーフディスク−形質転換−再
生方法を用いると、ディスクは、選択的培地で培養され、約２−４週でシュート
が形成される。発達したシュートをカルスから切り取って、適当な根を誘導する
選択的培地に移植する。適当な選択的培地は当業者には公知であり、Curry and
Cassells in: Plant Cell Culture Protocols, pp. 31-43, Human Presws, Toto
wa, NJ, 1999; Blackwell et al., IBID 19-30, 1999; Franklin and Dixon in:
Plant Cell Culture, pp. 1-25, IRL Press, Oxford, 1994, に記述されている
。根が出現したらできるだけ速やかに根が付いた小植物を土壌に移植する。必要
に応じて、小植物は鉢に移して成熟するのを待つ。Regeneration also occurs from plant calli, explants, organs or parts. Transformation can also be performed in the context of organ or plant part regeneration. (Method in Enzymology
, Vol. 118 and Klee et al., Ann. Rev. Plant Phys. 38: 467, 1987). Using the leaf disk-transformation-regeneration method of Horsch et al., Science 227: 1229, 1985, disks are cultured in selective media and shoots are formed in about 2-4 weeks. Developed shoots are cut from calli and transplanted to a selective medium that induces appropriate roots. Suitable selective media are known to those of skill in the art, and are described in Curry and
Cassells in: Plant Cell Culture Protocols, pp. 31-43, Human Presws, Toto
wa, NJ, 1999; Blackwell et al., IBID 19-30, 1999; Franklin and Dixon in:
Plant Cell Culture, pp. 1-25, IRL Press, Oxford, 1994. As soon as the roots appear, the rooted plantlets are transplanted to the soil. If necessary, transfer the plantlets to pots and wait for them to mature.

【００８０】 栄養繁殖される作物では、成熟した遺伝子導入植物は、切片を採取して又は組
織培養法によって繁殖させて多数の同一植物を得る。望ましいトランスゲノート
を選択し、新種を得て、栄養繁殖させて商業的に利用する。種子で繁殖させる作
物では、成熟した遺伝子導入植物を自己交配させ、ホモ接合の同型繁殖植物を生
成する。この同型繁殖植物は、新しく導入された異種核酸配列を含む種子を生ず
る。この種子を生育させて、選択された表現型、例えば病原体抵抗性、を生ずる
植物を生成する。In vegetatively propagated crops, mature transgenic plants are harvested from sections or propagated by tissue culture to obtain a number of identical plants. The desired transgene notes are selected, new species are obtained, vegetatively propagated and used commercially. For seed-propagated crops, mature transgenic plants are self-crossed to produce homozygous homozygous propagation plants. This homozygous plant gives rise to seeds containing the newly introduced heterologous nucleic acid sequence. The seed is grown to produce a plant that produces a selected phenotype, for example, pathogen resistance.

【００８１】 再生された植物から得られる部分、例えば、花、種子、葉、枝、果実、などは
、それらの部分が上記のように形質転換された細胞を含む場合、本発明に含まれ
る。再生された植物の後代及び変異体及び突然変異体も、それらの部分が導入さ
れた異種核酸配列を含む場合、本発明の範囲に含まれる。 いくつかの実施形態では、植物細胞は少なくとも二つのＤＮＡ配列を含む組み
換えＤＮＡ分子によって、又は二つ以上の組み換えＤＮＡ分子によって、形質転
換されると考えられている。このような実施形態のＤＮＡ配列又は組み換えＤＮ
Ａ分子は、同じベクターにあることによって物理的にリンクされていることもあ
り、又は異なるベクターにあって物理的に別々であることもある。各ベクターが
ユニークな選択マーカー遺伝子を有する場合、細胞は、二つ以上のベクターで同
時に形質転換されることもある。あるいは、細胞は、二つ以上のベクターによっ
て、最初のベクターによる形質転換の後、中間の再生ステップを許容して順次形
質転換されることもある。さらに、個々の植物、又は異なるＤＮＡ配列、又は組
み換えＤＮＡ分子を含む植物系統、の間で性的な交雑を行うことが可能である。
好ましくは、ＤＮＡ配列又は組み換えＤＮＡ分子は連関している又は同じ染色体
にあり、その後、交雑の子孫から両方のＤＮＡ配列又は組み換えＤＮＡ分子を含
む植物を選択する。[0081] Parts obtained from regenerated plants, such as flowers, seeds, leaves, branches, fruits, etc., are included in the present invention if those parts include cells transformed as described above. Progeny and variants and mutants of the regenerated plants are also within the scope of the invention, provided that those parts comprise the introduced heterologous nucleic acid sequence. In some embodiments, the plant cells are believed to be transformed by a recombinant DNA molecule comprising at least two DNA sequences, or by more than one recombinant DNA molecule. The DNA sequence or recombinant DN of such an embodiment
The A molecules may be physically linked by being on the same vector, or may be physically separate on different vectors. If each vector has a unique selectable marker gene, the cells may be transformed simultaneously with two or more vectors. Alternatively, cells may be transformed with two or more vectors sequentially after transformation with the first vector, allowing for an intermediate regeneration step. Furthermore, it is possible to carry out sexual crosses between individual plants or plant lines containing different DNA sequences or recombinant DNA molecules.
Preferably, the DNA sequences or recombinant DNA molecules are linked or on the same chromosome, and then plants containing both DNA sequences or recombinant DNA molecules are selected from the progeny of the cross.

【００８２】 形質転換された植物細胞における、本明細書で記述されたＤＮＡ配列及びプロ
モーターを含む組み換えＤＮＡ分子の発現は、ノーザン・ブロット法、サザン・
ブロット法、及び／又はマーカー発現、ならびに当業者には公知の他の方法、を
用いてモニターすることができる。 Ｃ． 望ましい形質を有する植物又は植物の部分の生成 本発明は、異種アポトーシス経路タンパク質が植物で機能するという驚くべき
発見に向けられている。この発見は、生物的及び非生物的攻撃に対する植物及び
植物の部分（例えば、カットした花、野菜、等）の抵抗性の増加、ならびに老化
の防止、など、いろいろな利益を与える。さらに、本発明は、機能的な、植物の
アポトーシス・タンパク質相同体を同定する方法、及び植物細胞に関連したアポ
トーシス経路タンパク質の阻害物質及び増強物質を同定する方法を提供する。[0082] Expression of the recombinant DNA molecules, including the DNA sequences and promoters described herein, in transformed plant cells was determined by Northern blot, Southern blot.
Blotting, and / or marker expression, and other methods known to those of skill in the art can be monitored. C. Generation of Plants or Plant Parts with Desirable Traits The present invention is directed to the surprising discovery that heterologous apoptotic pathway proteins function in plants. This discovery offers a variety of benefits, including increased resistance of plants and plant parts (eg, cut flowers, vegetables, etc.) to biological and abiotic attacks, and prevention of aging. In addition, the present invention provides methods for identifying functional, plant apoptotic protein homologs, and for identifying inhibitors and enhancers of apoptosis pathway proteins associated with plant cells.

【００８３】 １． 生物的攻撃／作用因抵抗性 生物的攻撃とは、生物的因子の作用の直接又は間接の結果として植物に加えら
れる攻撃である。生物的因子としては、例えば、昆虫、カビ、バクテリア、ウイ
ルス、線虫、ウイルス様体、マイコプラズマ、等、がある。生物因子は、普通、
作用を受ける植物細胞にプログラムされた細胞死を引き起こす。このようなプロ
グラムされた細胞死は、侵入した病原体の拡散を阻止するために起こると考えら
れている。しかし、本発明のある実施形態では、他の生物におけるアポトーシス
の抑制に関わっているタンパク質をコード化することができる核酸配列が植物細
胞に送り込まれ、それによって生まれた植物がいろいろな生物的作用因に対する
抵抗性をはっきりと示す。1. Biological attack / agent resistance A biological attack is an attack that is applied to plants as a result of direct or indirect effects of biological agents. Biological factors include, for example, insects, molds, bacteria, viruses, nematodes, virus-like bodies, mycoplasmas, and the like. Biological factors are usually
Causes programmed plant death in affected plant cells. It is believed that such programmed cell death occurs to prevent the spread of invading pathogens. However, in one embodiment of the present invention, a nucleic acid sequence capable of encoding a protein involved in inhibiting apoptosis in other organisms is delivered to plant cells, and the resulting plant is transformed into various biological agents. Clearly show resistance to

【００８４】 いくつかの実施形態では、生物的攻撃に抵抗する植物が作物の収量や観賞植物
の健康の持続に関連して顕著な利点を示す。生物作用因の主なものはカビやウイ
ルスなどのいろいろな病原体である。病原体の一例は、カビ病原体Sclerotinia
sclerotiorum である。これは、最も非特異的で雑食性の植物病原体の一つとし
て知られている。（例えば、Purdy, Phytopathology 69:875-880,1979, を見よ
）。さらに、他のいろいろな経済的に重要な病原体が知られている。例えば、カ
ビBotrytis cinerea, Magnaportyhe grisea, Phytophthora spp, Cochliobolus
spp, fusarium graminearum, 及びfusarium spp, 線虫Meloidogyne spp （ネコ
ブセンチュウ）,ウイルス、例えば、タバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）、
トマト斑点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）、タバコ・エッチ・ウイルス（ＴＥ
Ｖ）、タバコ壊死ウイルス（ＴＮＶ）、コムギ・ストリーク・モザイク・ウイル
ス（ＷＳＭＶ）、土壌コムギ・モザイク・ウイルス（ＳＢＷＭＶ）、オオムギ・
イエロー・ドワーフ・ウイルス（ＢＹＤＶ）、バクテリアPseudomonas spp 及び
Xanthomonas ssp その他多数、である。いくつかの例があり、当業者には容易に
同定できる、例えば、Plant Pathology, 4th ed.,Agrios, ed., Academic Press
, San Diego, 1997,を見よ。In some embodiments, plants that resist biological attack exhibit significant benefits in relation to crop yield and the sustainability of ornamental plants. The main biological agents are various pathogens such as molds and viruses. An example of a pathogen is the mold pathogen Sclerotinia
sclerotiorum. It is known as one of the most nonspecific and omnivorous plant pathogens. (See, eg, Purdy, Phytopathology 69: 875-880,1979). In addition, various other economically important pathogens are known. For example, mold Botrytis cinerea, Magnaportyhe grisea, Phytophthora spp, Cochliobolus
spp, fusarium graminearum, and fusarium spp, nematode Meloidogyne spp (nematode infestation), viruses such as tobacco mosaic virus (TMV),
Tomato spot blight virus (TSWV), tobacco etch virus (TE
V), tobacco necrosis virus (TNV), wheat streak mosaic virus (WSMV), soil wheat mosaic virus (SBWMV), barley
Yellow dwarf virus (BYDV), bacteria Pseudomonas spp and
Xanthomonas ssp and many others. There are several examples that can be readily identified by those skilled in the art, for example, Plant Pathology, 4th ed., Agrios, ed., Academic Press
, San Diego, 1997.

【００８５】 ある実施形態では、本発明は生物的攻撃に抵抗性を有する遺伝子導入植物を提
供する。この実施形態では、アポトーシス経路タンパク質をコード化する異種核
酸配列が上述のような方法によって植物に移入される。いくつかの実施形態では
、コード化されるアポトーシス経路タンパク質は抗アポトーシス・タンパク質−
すなわち、プログラムされた細胞死サイクルへの細胞の進入、又はその進行、を
直接又は間接にネガティブに調節するタンパク質−である。好ましい阻害物質と
しては、ドミナント・ネガティブ調節因子、例えば活性部位システイン・ミュー
テーテッドcaspase 分子、CARD ドメイン、Apaf-1 の切形形態、等、ならびにそ
の他のネガティブ調節因子、例えば、IAP, Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, Mcl-1,A1, N
R13, Ced-9, E1B 19K, BHRF1, などがあるが、それだけに限定されない。したが
って、本明細書で例示される阻害因子はBcl-2 及びCed-9 を含む。これらのアポ
トーシス阻害因子は、それが移入される植物に生物的攻撃に対する抵抗性を付与
する。例示される生物的攻撃抵抗性は、病原体抵抗性であって、いろいろなウイ
ルスやカビ、例えば、タバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）、タバコ壊死ウイ
ルス（ＴＮＶ）、トマト斑点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）、Sclerotinia sc
lerotiorum 1980 （Dickman and Mitra, Physiol. Mol. Plant Pathol. 41:255-
263, 1992）；Botrytis cinerea （ＡＴＣＣ）、Cercospora nicotianae、及びG
lomerella cingulata など、への抵抗性を含む。 しかし、本発明は、これらの
例示された病原体への抵抗性だけに限定されるものではないということを注意し
ておかなければならない。したがって、いくつかの態様では、殺虫剤の発現と散
布及び除草剤による処理が植物に疾病状態を誘発してアポトーシスの出現につな
がることがあり、抗アポトーシス・ポリペプチドの発現がある特定植物の殺虫化
合物を発現する能力を増大させ、及び／又は、いろいろな除草剤による処理に対
する特定植物の抵抗性を高めることによって非生物的な攻撃に抵抗できるように
なる可能性がある。In one embodiment, the invention provides a transgenic plant that is resistant to biological attack. In this embodiment, a heterologous nucleic acid sequence encoding an apoptosis pathway protein is introduced into a plant by a method as described above. In some embodiments, the encoded apoptotic pathway protein is an anti-apoptotic protein-
That is, proteins that directly or indirectly negatively regulate the entry of, or progression of, cells into the programmed cell death cycle. Preferred inhibitors include dominant negative modulators such as active site cysteine mutated caspase molecules, CARD domains, truncated forms of Apaf-1 and the like, and other negative modulators such as IAP, Bcl-2 , Bcl-X L , Bcl-W, Mcl-1, A1, N
R13, Ced-9, E1B 19K, BHRF1, etc., but are not limited thereto. Thus, the inhibitors exemplified herein include Bcl-2 and Ced-9. These apoptosis inhibitors confers resistance to biological attack on the plant into which they are introduced. Exemplary biological attack resistance is pathogen resistance, including various viruses and fungi, such as tobacco mosaic virus (TMV), tobacco necrosis virus (TNV), tomato spotting virus (TSWV), Sclerotinia sc
lerotiorum 1980 (Dickman and Mitra, Physiol. Mol. Plant Pathol. 41: 255-
263, 1992); Botrytis cinerea (ATCC), Cercospora nicotianae, and G
Including resistance to lomerella cingulata, etc. However, it should be noted that the invention is not limited to resistance to these exemplified pathogens. Thus, in some embodiments, expression and application of insecticides and treatment with herbicides can induce disease states in plants, leading to the appearance of apoptosis, and the insecticidal activity of certain plants with expression of anti-apoptotic polypeptides. Increasing the ability to express the compound and / or increasing the resistance of certain plants to treatment with various herbicides may allow them to resist abiotic attack.

【００８６】 ２． 非生物的攻撃／作用因抵抗性 上で述べたように、本発明は、また、非生物的攻撃に対する抵抗性を高める。
非生物的攻撃を生ずる非生物的作用因としては、例えば、低水分（干ばつ）、高
水分（洪水）、栄養欠乏、放射線レベル、大気汚染（オゾン、酸性雨、二酸化硫
黄、等）、温度（極端な暑熱及び寒冷）、及び土壌毒性、ならびに除草剤被害、
殺虫剤被害、又はその他の農業慣行（例えば、過剰肥料、化学剤の不適切な散布
、等）などがある。したがって、食糧作物や観賞植物など、いろいろな植物タイ
プの生存力にこのような非生物的作用因がますます大きな役割を演じている現状
において、本発明はそれらの攻撃に対する高い抵抗性を有する植物を生成するの
に利用できる。[0086] 2. Abiotic Attack / Agent Resistance As noted above, the present invention also increases resistance to abiotic attack.
Abiotic agents that cause abiotic attacks include, for example, low moisture (drought), high moisture (flood), nutrient deficiencies, radiation levels, air pollution (ozone, acid rain, sulfur dioxide, etc.), temperature ( Extreme heat and cold), and soil toxicity, and herbicide damage,
Such as pesticide damage, or other agricultural practices (eg, excess fertilizer, improper application of chemicals, etc.). Thus, in the current situation where such abiotic agents play an increasingly important role in the viability of various plant types, such as food crops and ornamental plants, the present invention relates to plants that have a high resistance to their attack. Can be used to generate

【００８７】 ある実施形態では、上で生物的な攻撃に関して述べたように、本発明は非生物
的攻撃に対する抵抗性を有する遺伝子導入植物を提供する。この実施形態では、
アポトーシス経路タンパク質をコード化した異種核酸配列が、本明細書で詳述さ
れている方法によって植物に移入される。生物的な攻撃に対する抵抗性と同様に
、これらのアポトーシス阻害因子は、それが移入される植物に非生物的攻撃に対
する抵抗性を付与する。In certain embodiments, the present invention provides transgenic plants that are resistant to abiotic challenge, as described above for biological challenge. In this embodiment,
A heterologous nucleic acid sequence encoding an apoptosis pathway protein is introduced into a plant by the methods detailed herein. Similar to resistance to biological attack, these inhibitors of apoptosis confer resistance to abiotic attack on the plant into which they are introduced.

【００８８】 本明細書に開示されたことを考慮すれば、当業者は、ある特定の生物的又は非
生物的攻撃／作用因に対する抵抗性は、その特定作用因の作用方法に応じてその
植物全体又は葉の部分を用いて容易にテストできるということを直ちに認識でき
るであろう。 ３． 老化 植物の老化は、最終的には細胞の死にまで至る調節される過程であることが知
られている（それについての詳しい議論は、一般的に、Guiamet et al., Plant
Cell Phys. 31:1123-1130, 1990 を見よ）。さらに、それにはシステイン・プロ
テアーゼ、ＲＮａｓｅ、等の誘導など、プログラムされた細胞死と矛盾しない、
いろいろな生化学的及び構造的な変化が伴う。したがって、アポトーシス経路タ
ンパク質をコード化する異種核酸分子の移入を利用して、本発明は、植物におけ
る老化を変化させる方法を提供する。植物の寿命を延ばすことに一般的に応用で
きるという以外に、その他の利点も実現できる。例えば、老化を阻止することは
野菜やフルーツの貯蔵寿命を延ばすことにつながり、さらにカットされた花及び
その他の観賞植物の寿命と美的魅力の増大につながる。さらに、生きた植物で、
花の期間の拡大とフルーツ生産の増加も実現できる。したがって、本発明は、食
糧産物市場及び観賞植物市場に広い応用がある。In view of the disclosure herein, one of ordinary skill in the art will recognize that resistance to a particular biological or abiotic attack / agent will depend on the method of action of that particular agent. It will be immediately recognized that whole or leaf parts can be easily tested. 3. Senescence Plant senescence is known to be a regulated process that ultimately leads to cell death (a detailed discussion of which is generally available in Guiamet et al., Plant
Cell Phys. 31: 1123-1130, 1990). In addition, it is consistent with programmed cell death, such as induction of cysteine protease, RNase, etc.
Various biochemical and structural changes are involved. Thus, utilizing the transfer of a heterologous nucleic acid molecule encoding an apoptosis pathway protein, the present invention provides a method for altering senescence in a plant. In addition to its general application in extending plant life, other benefits can be realized. For example, inhibiting aging can extend the shelf life of vegetables and fruits, and can also increase the life and aesthetic appeal of cut flowers and other ornamental plants. In addition, with living plants,
A longer flowering season and increased fruit production can also be realized. Therefore, the present invention has wide application in food products market and ornamental plants market.

【００８９】 さらに、本発明の方法を用いて、植物の内在的なプログラムされた細胞死修飾
因子を同定することができ、それを次に適当な植物細胞で過剰発現させて老化の
減少を実現することができる。 Ｄ． アポトーシス経路遺伝子の異種間移入を利用する方法 １． アポトーシス活性の阻害因子及び増強因子 植物のアポトーシスの阻害因子と増強因子の研究は、遺伝子導入植物の設計な
らびに除草剤及び殺虫剤の設計に関して有用なデータを提供できる。さらに、極
めて多様な種からのアポトーシス経路タンパク質をコード化する遺伝子が植物に
おいても同様に機能するという予期されなかった驚くべき発見によって、移入さ
れたアポトーシス経路タンパク質をコード化する遺伝子の機能を調べる分析に植
物細胞を利用することができる。例えば、caspases 及びBcl-2 ファミリー・メ
ンバーなどの哺乳類のアポトーシス経路遺伝子を植物細胞に移入して、例えば核
酸抽出物を分析してＤＮＡラダーなどのアポトーシス・マーカーを同定したり、
ＴＵＮＥＬ染色分析、及び／又は細胞の顕微鏡検査でアポトーシス核凝縮を同定
する、などのいろいろな方法によってアポトーシスの阻害又は増強を調べること
ができる。In addition, the methods of the present invention can be used to identify endogenous programmed cell death modifiers in plants, which are then overexpressed in appropriate plant cells to achieve reduced senescence can do. D. Methods utilizing cross-species transfer of apoptosis pathway genes Inhibitors and enhancers of apoptotic activity Studies of inhibitors and enhancers of plant apoptosis can provide useful data for the design of transgenic plants and for the design of herbicides and pesticides. In addition, an analysis that examines the function of the genes encoding the transferred apoptotic pathway proteins by the unexpected and surprising finding that genes encoding apoptotic pathway proteins from a wide variety of species work similarly in plants. Plant cells can be used for the above. For example, mammalian apoptosis pathway genes, such as caspases and Bcl-2 family members, can be transferred into plant cells and nucleic acid extracts analyzed to identify apoptosis markers, such as DNA ladders,
Apoptosis inhibition or enhancement can be determined by a variety of methods, such as identifying apoptotic nuclear condensation by TUNEL staining analysis and / or microscopic examination of cells.

【００９０】 いろいろな源、例えば、ヒト、齧歯類、ハエ（D. melanogaster）、ムシ（C.
elegance）、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス）、バク
テリア、カビ、植物、寄生虫、化学物質、ペプチド、又はペプチド誘導体、など
のライブラリー、から阻害因子及び増強因子の候補が単離又は調達できる。阻害
因子及び増強因子は、Ｘ線結晶学から決定されたタンパク質構造に基づいて合理
的に設計することもできる（Mittl et al., J. Biol. Chem., 272:6539-6547, 1
997）。いくつかの好ましい実施形態では、阻害因子はある特定アポトーシス経
路タンパク質（例えば、bcl-2 又はその相同体）を標的にしている。Various sources, such as humans, rodents, flies (D. melanogaster), worms (C.
elegance), viruses (eg, baculovirus, herpes virus), libraries of bacteria, molds, plants, parasites, chemicals, peptides, or peptide derivatives; it can. Inhibitors and enhancers can also be rationally designed based on the protein structure determined from X-ray crystallography (Mittl et al., J. Biol. Chem., 272: 6539-6547, 1).
997). In some preferred embodiments, the inhibitor targets a particular apoptosis pathway protein (eg, bcl-2 or a homolog thereof).

【００９１】 特定のメカニズムに拘束されることなく、阻害因子は、アポトーシス経路チモ
ーゲン（例えばcaspase）の処理を妨害することにより、酵素活動を妨げること
により、経路成分の相互作用を（直接又は間接に）妨げることにより、又は他の
メカニズムによって、作用する。阻害因子自体が直接又は間接に作用する可能性
もある。好ましい実施形態では、植物におけるアポトーシスの阻害因子は、ＤＮ
Ａラダリング、末端デオキシトランスフェラーゼ媒介dUTP ニック・エンド・ラ
ベリング（ＴＵＮＥＬ）（市販キットがある）、Ca2+ 依存ヌクレアーゼのレベ
ル（Mittler et al., Plant Cell 7:1951-1962, 1995）、Trypan blue などの生
体染色の利用、又は同様の方法、で測定されるプログラムされた細胞死を減少さ
せる。他の好ましい実施形態では、阻害因子は小さな分子である。非常に好まし
いある実施形態では、阻害因子はアポトーシスを妨げる。細胞に侵入できる阻害
因子が好ましい。[0091] Without being bound by a particular mechanism, inhibitors can inhibit the interaction of pathway components (directly or indirectly) by interfering with the processing of the apoptotic pathway zymogen (eg, caspase), thereby preventing enzymatic activity. ) Work by interfering or by other mechanisms; The inhibitor itself may act directly or indirectly. In a preferred embodiment, the inhibitor of apoptosis in the plant is DN
A laddering, terminal deoxytransferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) (a commercial kit is available), Ca 2+ -dependent nuclease levels (Mittler et al., Plant Cell 7: 1951-1962, 1995), Trypan blue, etc. The use of vital stains, or similar methods, to reduce programmed cell death. In another preferred embodiment, the inhibitor is a small molecule. In some highly preferred embodiments, the inhibitor prevents apoptosis. Inhibitors that can enter cells are preferred.

【００９２】 さらに、状況によっては、アポトーシス活動又はアポトーシス経路タンパク質
発現の増強因子が望ましい。ときには、アポトーシスの増強が病原体による損害
を、特に機能するために生きた細胞を必要とする病原体（例えば、ウイルス又は
カビ病原体）の場合、軽減することがある。したがって、病原体で誘導されるそ
のような増強因子の発現が有益である可能性がある。増強因子は、ＤＮＡラダリ
ング、ＴＵＮＥＬポジティブ細胞、Ｃａ2+ 依存ヌクレアーゼの増加（Mittler e
t al., Plant Cell 7:1951-1962, 1995）、チモーゲン（caspase 又はその相同
体）処理、の増加によって示されるアポトーシス進行の速さ又は効率を高めたり
、転写又は翻訳を増加させたり、又は他のメカニズムによって作用する。当業者
には明らかなように、上で述べたガイドラインの多くは増強因子の設計にもあて
はまる。Further, in some situations, enhancers of apoptotic activity or apoptotic pathway protein expression are desirable. Occasionally, enhanced apoptosis may reduce pathogen damage, especially for pathogens that require living cells to function (eg, viral or fungal pathogens). Thus, expression of such potentiators induced by pathogens may be beneficial. Enhancers include DNA laddering, TUNEL positive cells, Ca 2+ -dependent nuclease increase (Mittler e
t al., Plant Cell 7: 1951-1962, 1995), increasing the speed or efficiency of apoptosis progression, increasing transcription or translation, as indicated by increased zymogen (caspase or homologue) treatment, or It works by other mechanisms. As will be apparent to those skilled in the art, many of the guidelines described above also apply to the design of enhancers.

【００９３】 阻害因子及び増強因子のスクリーニング分析は、阻害因子又は増強因子のタイ
プ及び影響される活動の性質によって異なる。分析は、インビトロ（in vitro）
でもインビボ（in vivo）でも行うことができる。一般に、in vitro 分析はアポ
トーシス表現型の現象、ＤＮＡラダリング、ＴＵＮＥＬ染色、Ｃａ2+ 依存ヌク
レアーゼ・レベル（Mittler et al., Plant Cell 7:1951-1962, 1995）、タンパ
ク質処理、又は酵素活性を評価するように設計され、in vivo 分析は生物的及び
非生物的攻撃に対する反応性を評価するように設計される。いずれの分析でも、
適切な対照と比較して統計的に有意な増加又は減少があれば、それは抵抗性、増
強、又は阻害を示すものである。Screening assays for inhibitors and enhancers depend on the type of inhibitor or enhancer and the nature of the activity affected. Analysis is in vitro
However, it can also be performed in vivo. In general, in vitro assays evaluate the phenomenon of apoptotic phenotype, DNA laddering, TUNEL staining, Ca 2+ -dependent nuclease levels (Mittler et al., Plant Cell 7: 1951-1962, 1995), protein processing, or enzyme activity. In vivo assays are designed to assess responsiveness to biological and abiotic attacks. In both analyses,
Any statistically significant increase or decrease as compared to the appropriate control is indicative of resistance, enhancement, or inhibition.

【００９４】 ２． 植物のアポトーシス・タンパク質及び関連遺伝子の同定 植物におけるアポトーシス経路タンパク質を研究するあるin vitro 分析は、
植物細胞タンパク質の哺乳類タンパク質（又は他の既知のアポトーシス経路タン
パク質）との結合を調べることによって行われる。簡単に言うと、植物ｃＤＮＡ
の発現ライブラリーをスクリーニングして発現される産物がいろいろな哺乳類ア
ポトーシス経路成分と結合する能力を調べることができる。同様に、植物抽出物
もスクリーニングできる。例えば、Apaf-1 タンパク質をカラムなどの固体表面
に固定し、植物ｃＤＮＡライブラリーの発現産物を接触させることができる。哺
乳類Apaf-1に結合し、その後ｐＨ勾配、塩勾配、などで溶出するタンパク質は植
物caspase-9相同体を示している可能性がある。したがって、どのアポトーシス
経路タンパク質も同様な仕方で固定して植物ｃＤＮＡの発現ライブラリーを調べ
るのに用いることができる。当業者なら理解できるように、いろいろな種からの
アポトーシス・タンパク質が植物において機能的な活性を保持しているという驚
くべき発見は、タンパク質−タンパク質相互作用を調べる公知のどんな方法も他
の既知のアポトーシス・タンパク質に関する植物タンパク質相同体を同定するの
に有効であることを示している。当業者なら、いろいろな標識及び検出の方法が
利用できるということを認めるであろう。そのような方法としては、酵素結合免
疫吸着検定法、超遠心分離分析、及びBiaCore 3000（商標）（BiaCore, Uppsula
, Sweden）の利用、などがある。[0094] 2. Identification of Plant Apoptosis Proteins and Related Genes An in vitro assay to study apoptosis pathway proteins in plants has
This is done by examining the binding of plant cell proteins to mammalian proteins (or other known apoptotic pathway proteins). Simply put, plant cDNA
Can be screened for the ability of the expressed product to bind to various mammalian apoptotic pathway components. Similarly, plant extracts can be screened. For example, Apaf-1 protein can be immobilized on a solid surface such as a column and contacted with the expression product of a plant cDNA library. Proteins that bind to mammalian Apaf-1 and subsequently elute in a pH gradient, salt gradient, etc., may indicate a plant caspase-9 homolog. Thus, any apoptosis pathway protein can be immobilized in a similar manner and used to examine plant cDNA expression libraries. As the skilled artisan will appreciate, the surprising discovery that apoptotic proteins from various species retain functional activity in plants is that any known method of examining protein-protein interactions can It has been shown to be effective in identifying plant protein homologs for apoptotic proteins. One skilled in the art will recognize that a variety of labels and methods of detection are available. Such methods include enzyme-linked immunosorbent assays, ultracentrifugation analysis, and BiaCore 3000 ™ (BiaCore, Uppsula).
, Sweden).

【００９５】 したがって、植物のアポトーシス経路タンパク質を同定するある方法では、既
知の異種アポトーシス経路タンパク質又はその断片及び抗体又はその他の分子（
例えばグルタチオン）で結合したタグ・ペプチド配列（例えば、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ）を含む融合タンパク質が構成される。この融合タンパ
ク質をコード化したベクターがバクテリアで形質転換される。この融合タンパク
質が精製される。簡単に言うと、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Pharmacia, Uppsala, Sw
eden）においてＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）Bcl-2融合タ
ンパク質がＩＰＴＧによって誘導され、グルタチオン・ビーズ（Kaelin et al.,
Cell 64:521, 1991）を用いて精製される。植物から得られた発現ライブラリー
構成物を含む細胞を代謝的にラベルすることができる。細胞の抽出物がＧＳＴ−
Ｂｃｌ−２を充填したグルタチオン−Sepharose ビーズで培養される。あるいは
、融合タンパク質をインミュノプレシピテーションさせてもよい。結合しないタ
ンパク質は洗い流され、結合したタンパク質が溶出される。結合したタンパク質
は、例えばゲル電気泳動などによって、さらに分画される。その後、結合したタ
ンパク質は、抗体の生成、アミノ酸配列の決定、及びその他のin vitro テスト
に使用することができる。結合したタンパク質をコード化したクローンは、いろ
いろな標準的方法、例えば発現ライブラリーの免疫スクリーニング、部分アミノ
酸配列に基づくプローブによるプローブ・ハイブリダイゼーション、及びその他
の既知の方法、のいずれかによって単離できる。Thus, one method of identifying plant apoptotic pathway proteins involves the use of known heterologous apoptotic pathway proteins or fragments thereof and antibodies or other molecules (
Tag peptide sequences (eg, glutathione-
(S-transferase). The vector encoding this fusion protein is transformed with bacteria. This fusion protein is purified. Briefly, pGEX-4T-3 (Pharmacia, Uppsala, Sw
eden), a GST (glutathione-S-transferase) Bcl-2 fusion protein was induced by IPTG and glutathione beads (Kaelin et al.,
Cell 64: 521, 1991). Cells containing expression library constructs obtained from plants can be metabolically labeled. GST-
Cultured on glutathione-Sepharose beads filled with Bcl-2. Alternatively, the fusion protein may be immunoprecipitated. Unbound proteins are washed away and bound proteins are eluted. The bound proteins are further fractionated, for example, by gel electrophoresis. The bound protein can then be used for antibody production, amino acid sequence determination, and other in vitro tests. Clones encoding the bound protein can be isolated by any of a variety of standard methods, such as immunoscreening of expression libraries, probe hybridization with probes based on partial amino acid sequences, and other known methods. .

【００９６】 植物発現ライブラリー又は植物抽出物と既知のアポトーシス経路成分との間で
タンパク質−タンパク質相互作用が検出されたら、植物発現ライブラリーからの
タンパク質を配列決定によって同定し、適当なｃＤＮＡを同定することができる
。 ある実施形態では、植物アポトーシス経路タンパク質を検出する方法であって
、植物から得られた発現ｃＤＮＡライブラリーで細胞に形質移入又は形質転換す
るステップと、細胞の発現されたタンパク質と異種アポトーシス経路タンパク質
との間の相互作用を検出するステップとを含む方法が提供される。別の実施形態
では、植物のアポトーシス経路タンパク質と推定されるものを検出する方法であ
って、植物抽出物又は発現ライブラリーから得られた植物タンパク質に既知の異
種アポトーシス経路タンパク質を接触させるステップと、その異種アポトーシス
経路タンパク質と植物から得られたタンパク質との間の相互作用を検出するステ
ップとを含む方法が提供される。いろいろな方法によって、植物又は動物からの
遺伝子は、植物由来の遺伝子を動物細胞で発現させたり、動物由来の遺伝子を植
物細胞で発現させたりして、その機能的な同等性をテストしたり、アポトーシス
活性をスクリーニングしたりできる。例えば、ある組織又は細胞源からのｃＤＮ
Ａライブラリーをベクターに構築して、融合タンパク質がレポーター・タンパク
質又はペプチド・タグと共に生成されるようにする。レポーター又はタグは、容
易で高感度の測定が可能などんなタンパク質でもよい。例えば、β−ガラクトシ
ダーゼ及びＦＬＡＧペプチドを用いることもできる。さらに、複数のタグを用い
て、サンドイッチ測定による検出ができるようにしてもよい。一般に、ベクター
は、ｃＤＮＡ融合遺伝子の発現を促進するための強力なプロモーターと宿主細胞
における複製のための適当な開始点を用いる。次ぎに、植物遺伝子のライブラリ
ーが動物宿主細胞に形質転換又は形質移入される。あるいは、動物遺伝子の機能
的なアポトーシス同等性を、ここに記述される方法又は他の公知の方法によって
、植物宿主細胞を形質転換させることによってテストすることもできる（例えば
、タバコ−（ＢＹ−２Nagata et al., Int. Rev. Cytol. 132:1-30, 1992; トウ
モロコシ（Ｈｉ−II）、Maize Handbook, pp.663-671, Freeling et al., eds.,
Springer, NY, 1994; シロイスナズナ（landsberg erecta）Fuerst et al., Pl
ant Physiol. 112:1023-1028, 1996）。Once a protein-protein interaction has been detected between a plant expression library or plant extract and a known apoptotic pathway component, proteins from the plant expression library are identified by sequencing and the appropriate cDNA is identified. can do. In certain embodiments, a method of detecting a plant apoptosis pathway protein, comprising transfecting or transforming a cell with an expressed cDNA library obtained from a plant, and comprising expressing the cell's expressed protein and a heterologous apoptosis pathway protein. Detecting an interaction between the two. In another embodiment, a method for detecting a putative plant apoptotic pathway protein, comprising contacting a known heterologous apoptotic pathway protein with a plant protein obtained from a plant extract or expression library; Detecting an interaction between the heterologous apoptosis pathway protein and a protein obtained from a plant. By various methods, genes from plants or animals can be tested for their functional equivalence by expressing plant-derived genes in animal cells or expressing animal-derived genes in plant cells, Or screen for apoptotic activity. For example, cDN from a tissue or cell source
The A library is constructed into a vector so that the fusion protein is generated with a reporter protein or peptide tag. The reporter or tag can be any protein that allows for easy and sensitive measurements. For example, β-galactosidase and FLAG peptide can be used. Further, detection by sandwich measurement may be performed using a plurality of tags. In general, vectors employ a strong promoter to drive expression of the cDNA fusion gene and an appropriate origin for replication in host cells. Next, the library of plant genes is transformed or transfected into animal host cells. Alternatively, functional apoptotic equivalence of animal genes can be tested by transforming plant host cells by the methods described herein or other known methods (eg, tobacco- (BY-2Nagata). 132: 1-30, 1992; Maize (Hi-II), Maize Handbook, pp. 663-671, Freeling et al., eds.,
Springer, NY, 1994; Arabidopsis thaliana (landsberg erecta) Fuerst et al., Pl
ant Physiol. 112: 1023-1028, 1996).

【００９７】 あるいは、別の植物アポトーシス経路タンパク質を他の方法、例えばイースト
・ツー・ハイブリッド・システムなど、によって同定することもできる。簡単に
言うと、ツー・ハイブリッド・システムでは、ＤＮＡ結合ドメイン−アポトーシ
ス経路タンパク質の融合が（例えば、ＧＡＬ４−Ｂｃｌ−２融合）が構築され、
選択マーカー遺伝子にリンクしたＧＡＬ４結合部位を含む細胞に形質転換又は形
質移入される。植物細胞及び組織から得られたｃＤＮＡのライブラリーがＧＡＬ
４活性化ドメインに融合されて構築され、共に形質転換又は形質移入される。ｃ
ＤＮＡ−ＧＡＬ４活性化ドメイン融合におけるｃＤＮＡがＢｃｌ−２と相互作用
するタンパク質をコード化していると、選択マーカーが発現される。次ぎに、ｃ
ＤＮＡを含む細胞を増殖させ、構成物を単離し、特性を決定する。Alternatively, another plant apoptosis pathway protein can be identified by other methods, such as the yeast two hybrid system. Briefly, in a two-hybrid system, a DNA binding domain-apoptosis pathway protein fusion is constructed (eg, a GAL4-Bcl-2 fusion),
Cells containing a GAL4 binding site linked to a selectable marker gene are transformed or transfected. GAL is a library of cDNAs obtained from plant cells and tissues.
Four activation domains are fused and constructed and co-transformed or transfected. c
A selectable marker is expressed if the cDNA in the DNA-GAL4 activation domain fusion encodes a protein that interacts with Bcl-2. Next, c
The cells containing the DNA are grown, the constituents isolated and characterized.

【００９８】 さらに分析を行って、あるポリペプチドがコード化しているタンパク質が別の
ポリペプチドがコード化している既知のアポトーシス経路タンパク質と機能的に
同等かどうかを決定したり、又はさらに、ある植物遺伝子がアポトーシス促進活
性又は抗アポトーシス活性を有するかどうかを決定することもできる。ある実施
形態では、この分析は、問題の遺伝子をいくつかのシステムのいずれかで異種的
に発現させることによって行われる。それらのシステムは、例えば、ヒトを含む
哺乳類システム、組織培養の細胞又は細胞ライン、線虫がプログラムされた細胞
死で機能する遺伝子ced 9, ced 4, 又はced 3 に突然変異を有する（したがって
、機能回復を調べることができる）C. elegance線虫システム、及びショウジョ
ウバエ、D. melanogaster 、特にハエの目におけるアポトーシスをコントロール
する異種遺伝子の過剰発現又は欠失によるハエ網膜の過剰なアポトーシスのため
に小さな目を持つように遺伝子組み換えされたハエの系統で目特異的プロモータ
ーのコントロール下にあるもの、である。Further analysis may be performed to determine whether a protein encoded by one polypeptide is functionally equivalent to a known apoptosis pathway protein encoded by another polypeptide, or One can also determine whether a gene has pro-apoptotic or anti-apoptotic activity. In certain embodiments, this analysis is performed by heterologously expressing the gene of interest in any of several systems. Such systems have mutations in, for example, mammalian systems, including humans, cells or cell lines in tissue culture, genes ced9, ced4, or ced3 that nematodes function in programmed cell death (hence, Functional recovery can be examined) due to the C. elegance nematode system and excessive fly apoptosis in the fly retina due to overexpression or deletion of heterologous genes that control apoptosis in Drosophila, D. melanogaster, especially fly eyes. Flies that have been genetically engineered to have an eye under the control of an eye-specific promoter.

【００９９】 哺乳類分析システムを用いる場合、発現は、あるプロモーター（例えば、ＣＭ
Ｖ）のコントロール下での遺伝子又はｃＤＮＡの形質移入による。遺伝子を発現
する細胞を観測してアポトーシスの自発誘導の証拠を探すか、またはアポトーシ
スを誘発する刺激を与えて、遺伝子発現がアポトーシスのカイネティックス又は
広がりに及ぼす影響を測定する。アポトーシスを誘発する刺激は、当業者には公
知であり、成長因子の中止、電離放射線、ＴＮＦレセプタ・ファミリー（例えば
、Ｆａｓ、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ）のデス・レセプタと結合するリガンドによる
刺激、及びアポトーシス促進遺伝子（例えば、Bax, Bad）の異種発現、などを含
む。形質移入された細胞におけるアポトーシス刺激に応答したアポトーシスが、
いくつかの分析方法で測定される、それらの方法はすべて当業者には公知であり
、caspase 酵素活性の誘導（細胞の洗浄剤抽出物がcaspase 基質Acetyl-Asp-Glu
-Asp-アミノメチルクマリンを切断する能力を決定することにより測定される）
、ＤＮＡ分解（アガローズゲル電気泳動法によって決定される）、核凝縮（Hoec
hst or DAPI 染色によって決定される）、ミトコンドリアから細胞質へのシトク
ロームｃの放出（例えば、細胞分画研究又はシトクロームｃモノクローナル抗体
による免疫細胞化学的位置決定によって測定される）、及びミトコンドリア機能
（テトラゾリウム塩、ＭＴＴ又はＭＴＳ、の還元によって測定される）、などで
ある。したがって、問題の遺伝子は、もしもそのアポトーシスへの効果が（アポ
トーシス表現型のカイネティックス又は広がりを増大又は減少させる又はそれ自
体のアポトーシスを誘発する効果が）定性的及び／又は定量的に同様であるなら
、既知の遺伝子（例えば、Bcl-2, Bax）と機能的に等価であると判定される；そ
して、植物遺伝子の場合、その遺伝子の発現がアポトーシス表現型のカイネティ
ックス又は広がりに影響するか又はそれ自体のアポトーシスを誘発する場合、ア
ポトーシス促進又は抗アポトーシス遺伝子であると判定される。When using a mammalian analysis system, expression is controlled by a promoter (eg, CM)
By transfection of the gene or cDNA under the control of V). Cells expressing the gene are monitored for evidence of spontaneous induction of apoptosis, or given a stimulus to induce apoptosis to determine the effect of gene expression on the kinetics or spread of apoptosis. Stimuli that induce apoptosis are known to those skilled in the art and include growth factor cessation, ionizing radiation, stimulation by ligands that bind to the death receptor of the TNF receptor family (eg, Fas, TNFα, TRAIL), and promotion of apoptosis. Heterologous expression of genes (eg, Bax, Bad), and the like. Apoptosis in transfected cells in response to apoptotic stimuli
All of these methods are known to those skilled in the art, as measured by several analytical methods, and are known to induce caspase enzymatic activity (the detergent extract of the cells contains the caspase substrate Acetyl-Asp-Glu
-Asp-Aminomethylcoumarin, measured by determining its ability to cleave)
DNA degradation (as determined by agarose gel electrophoresis), nuclear condensation (Hoec
hst or DAPI staining), release of cytochrome c from the mitochondria to the cytoplasm (e.g., as determined by cell fractionation studies or immunocytochemical localization with a cytochrome c monoclonal antibody), and mitochondrial function (tetrazolium salt). , MTT or MTS). Thus, the gene in question may be qualitatively and / or quantitatively similar if its effect on apoptosis (increase or decrease the kinetics or spread of the apoptotic phenotype or induce its own apoptosis). If so, it is determined to be functionally equivalent to a known gene (eg, Bcl-2, Bax); and in the case of a plant gene, expression of that gene affects the kinetics or spread of the apoptotic phenotype Or if it induces its own apoptosis, it is determined to be a pro-apoptotic or anti-apoptotic gene.

【０１００】 C. elegans システムに関しては、ced 9 機能喪失突然変異ワーム（ワーム細
胞の多く又はほとんどがプログラムされた細胞死を起こす）における遺伝子の発
現は、その遺伝子が抗アポトーシス・タンパク質をコード化している場合（例え
ば、ced 9 機能喪失ワームにおけるced 9 レスキュー）、細胞の一部又は全部を
救うことになる。ced 3 又はced 4 機能喪失突然変異ワーム（発生中の雌雄同体
においてアポトーシスを起こすようにプログラムされた128 の細胞が阻止される
）における遺伝子の発現は、もしもその遺伝子がアポトーシス促進的であるなら
、失われた細胞死を回復する。With respect to the C. elegans system, expression of a gene in the ced 9 loss-of-function mutant worm (many or most of the worm cells undergo programmed cell death) is determined by the fact that the gene encodes an anti-apoptotic protein. (Eg, ced 9 rescue in a ced 9 loss-of-function worm), will save some or all of the cells. Expression of the gene in the ced3 or ced4 loss-of-function mutant worm (128 cells programmed to undergo apoptosis in the developing hermaphrodite) is lost if the gene is pro-apoptotic. Restores cell death.

【０１０１】 さらに、D. melanogaster システムに関しては、遺伝子は、もしもそれがハエ
の目を正常なサイズに戻すならば抗アポトーシス・タンパク質をコード化してい
ると見なされ、発現の結果がハエの目をさらに小さくすることになる場合、アポ
トーシス促進的であると見なされる。 in vivo 分析は、普通、本明細書で述べられるようなアポトーシス経路タンパ
ク質をコード化する遺伝子を含む発現ベクターで一時的に又は安定して形質転換
又は形質移入された細胞で行われる。植物細胞の場合、in vivo 分析は、普通、
細胞、植物、又は植物の部分を生物的又は非生物的な作用因によって攻撃し、接
種部位を観測してアポトーシスの兆候を探すことを含む。この接種部位は、その
後の分析でさらに、ＤＮＡの断片化及びＴＵＮＥＬポジティブ細胞の数の変化を
対照サンプルと比較して測定することができる。さらに、動物細胞の場合、それ
らの細胞を用いてcaspase 処理、基質ターンオーバー、又は候補化合物があると
き及びないときのアポトーシス、を測定することができる。アポトーシスを分析
するときには、いろいろな細胞分析方法を用いることができる。例えば、色素染
色と顕微鏡観察によって核酸の断片化と細胞の多孔性を調べる、などである。さ
らに、形質転換又は形質移入されたアポトーシス経路タンパク質又はそれによっ
て活性化されるタンパク質が、共に形質移入される、共に形質転換される、又は
候補化合物の存在下で培養媒質に入れられる既知の基質を開裂する能力について
のin vivo 分析を行って、基質ターンオーバーを検出し決定することができる。Further, with respect to the D. melanogaster system, a gene is considered to encode an anti-apoptotic protein if it returns fly eyes to normal size, and the result of expression is If it becomes smaller, it is considered pro-apoptotic. In vivo assays are typically performed on cells transiently or stably transformed or transfected with an expression vector containing a gene encoding an apoptosis pathway protein as described herein. For plant cells, in vivo analysis is usually
Includes attacking cells, plants, or plant parts by biological or abiotic agents, and observing the site of inoculation for signs of apoptosis. This inoculation site can be further determined by subsequent analysis for DNA fragmentation and changes in the number of TUNEL positive cells compared to control samples. Furthermore, in the case of animal cells, those cells can be used to measure caspase treatment, substrate turnover, or apoptosis with and without candidate compounds. When analyzing apoptosis, various cell analysis methods can be used. For example, the fragmentation of nucleic acids and the porosity of cells are examined by dye staining and microscopic observation. In addition, the transformed or transfected apoptotic pathway protein or a protein activated thereby can be used to transform a known substrate that is co-transfected, co-transformed, or placed in a culture medium in the presence of a candidate compound. In vivo analysis for the ability to cleave can be performed to detect and determine substrate turnover.

【０１０２】 アポトーシス経路酵素の検出方法は、酵素反応を分析するためによく用いられ
ているものであり、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分光、ＨＰＬＣ分析、オートラ
ジオグラフィー、化学ルミネッセンス、色素形成反応、及び免疫化学（例えば、
ブロッティング、沈澱、等）、などである。さらに、植物におけるプログラムさ
れた細胞死（すなわち、アポトーシス）を観測するいろいろな検出方法がある。
例えば、Mittler et al., Plant Cell 7:29-42, 1995; Mittler et al., Plant
Mol. Biol. 34:209-221, 1997; Oncor and Boehringer-Mannheim からのＴＵＮ
ＥＬキット、を見よ。Methods for detecting apoptotic pathway enzymes are those commonly used to analyze enzymatic reactions, including, for example, SDS-PAGE, spectroscopy, HPLC analysis, autoradiography, chemiluminescence, chromogenic reactions, and Immunochemistry (for example,
Blotting, precipitation, etc.). In addition, there are various detection methods for observing programmed cell death (ie, apoptosis) in plants.
For example, Mitttler et al., Plant Cell 7: 29-42, 1995; Mittler et al., Plant
Mol. Biol. 34: 209-221, 1997; TUN from Oncor and Boehringer-Mannheim.
See EL kit.

【０１０３】 例えば、caspase 活性の分析を望む場合、推定される植物アポトーシス経路遺
伝子が動物細胞で発現されるとき、又はその他に必要な場合、色素形成基質を用
いることが好ましい。この基質のターンオーバーは、直接又は間接、アポトーシ
ス経路、及び、特に一つ以上のcaspase 分子の酵素活性を測定する。これに関連
して、いろいろな基質、例えば標識されたcaspase 分子、lamin 、ＰＡＲＰ、及
びcaspase 基質アナログ、が当業者には公知である。このような基質は、また、
Oncogene Research Products, Cambridge, MA, などの会社からも市販されてい
る。蛍光マーカーでタグされた基質アナログは、例えば、ZEVD-amc （カルボベ
ンゾキシ-Glu-Val-Asp-アミノメチルクマリン）、YVAD-amc （アセチル-Tyr-Val
-Ala-Asp-アミノメチルクマリン）、及びDEVD-amc （アセチル-Asp-Glu-Val-Asp
-アミノメチルクマリン）、などである。For example, if analysis of caspase activity is desired, if the putative plant apoptosis pathway gene is expressed in animal cells, or otherwise required, it is preferred to use a chromogenic substrate. This substrate turnover measures the direct or indirect, apoptotic pathway, and in particular, the enzymatic activity of one or more caspase molecules. In this context, various substrates are known to those skilled in the art, such as labeled caspase molecules, lamin, PARP, and caspase substrate analogs. Such a substrate also
It is also commercially available from companies such as Oncogene Research Products, Cambridge, MA. Substrate analogs tagged with fluorescent markers include, for example, ZEVD-amc (carbobenzoxy-Glu-Val-Asp-aminomethylcoumarin), YVAD-amc (acetyl-Tyr-Val
-Ala-Asp-aminomethylcoumarin) and DEVD-amc (acetyl-Asp-Glu-Val-Asp)
-Aminomethylcoumarin), and the like.

【０１０４】 さらに、他の分析実施形態では、真核細胞プロモーターを構築物の内部で用い
て誘導又は構成的に発現されるアポトーシス促進、又は抗アポトーシス・タンパ
ク質を分析する細胞に送給することができる。例えば、細胞を形質転換又は形質
移入して抗アポトーシス・ポリペプチドBcl-2 を過剰発現するようにし、膜の試
料が高レベルのBcl-2 を含み、このBcl-2 阻害に打ち勝つことができるアポトー
シス増強因子だけが検出されるようにすることができる。したがって、細胞は、
植物の発現ライブラリーからの誘導ｃＤＮＡを含む第二のベクターで形質転換す
ることができるだろう。この点で、これらの細胞はアポトーシスの刺激で処理し
て、ｃＤＮＡ転写の前に細胞がアポトーシスに対して“身構える”ようにするこ
とができる。Further, in other assay embodiments, a eukaryotic promoter can be used inside the construct to deliver inducible or constitutively expressed pro-apoptotic or anti-apoptotic proteins to cells to be analyzed. . For example, cells may be transformed or transfected to overexpress the anti-apoptotic polypeptide Bcl-2, and a sample of the membrane may contain high levels of Bcl-2, and apoptosis capable of overcoming this Bcl-2 inhibition. Only enhancement factors can be detected. Thus, the cell
One could transform with a second vector containing derived cDNA from a plant expression library. In this regard, these cells can be treated with a stimulus of apoptosis so that the cells "get ready" for apoptosis prior to cDNA transcription.

【０１０５】 アポトーシスの阻害因子及び増強因子の同定に関して上で述べた方法は、細胞
がプログラムされた細胞死に対して“身構える”ように処理されるという点でア
ポトーシス活性を測定する別のフォーマトを提供する。このようにして、細胞は
プログラムされた細胞死に必要な全ての成分を合成及び／又は活性化する。必要
なものは、細胞をその停止点を過ぎてアポトーシスへと伸展させる刺激だけであ
る。したがって、増強因子は細胞をプログラムされた細胞死へと進行させ、他方
阻害因子は、アポトーシス刺激（例えば、anti-fas 抗体、スタウロファスリン
、など）の存在下でこの進行を遅らせたり、抑制したりする。The methods described above for the identification of inhibitors and enhancers of apoptosis provide another format for measuring apoptotic activity in that cells are treated to “get ready” for programmed cell death. I do. In this way, the cell synthesizes and / or activates all components necessary for programmed cell death. All that is needed is a stimulus that causes the cells to extend past their stopping point into apoptosis. Thus, enhancers cause cells to progress to programmed cell death, whereas inhibitors reduce or slow this progression in the presence of apoptotic stimuli (eg, anti-fas antibodies, staurofasulin, etc.). Or

【０１０６】 細胞がプログラムされた細胞死へと進行するのを妨げる停止点は、細胞生存（
抗アポトーシス）ポリペプチドであるアポトーシス経路タンパク質の過剰発現で
あるか、又は既知のアポトーシス阻害因子による細胞の処理であるかもしれない
。抗アポトーシス・ポリペプチドは、アポトーシスを起こすように誘導された細
胞で発現又は活性化されるとアポトーシスを阻止する能力があるという特徴があ
る。例えば、機能的な抗アポトーシス・ポリペプチドが存在しない場合、アポト
ーシス増強因子（例えば、アポトーシス促進物質）で処理された細胞はアポトー
シスを開始又は加速する。しかし、アポトーシス・ポリペプチドが存在する場合
、アポトーシス促進物質／増強因子による処理はプログラムされた細胞死の経路
を開始させることができるが、その経路で一つ以上の事象が阻害されるため細胞
は生き残る。抗アポトーシス・ポリペプチドが機能する点により、プログラムさ
れた細胞死の経路は、最終的な細胞の死に導く事象の遂行の中で早い段階で阻害
されたり又は比較的遅く阻害されたりする。抗アポトーシス・ポリペプチドとそ
れをコード化する核酸は当業者には周知であり、例えば、Bcl-2 という関連した
タンパク質のファミリーBcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, E1B 19K, IAP, Ced-9, Bcl-w,
etc. ならびにcaspaseのドミナント・ネガティブ形態、を含む。この形態は、例
えば、活性部位システインが不活性化された突然変異を有するcaspase's を含む
。The stop point that prevents cells from progressing to programmed cell death is cell survival (
It may be overexpression of an apoptosis pathway protein that is a (anti-apoptotic) polypeptide, or treatment of cells with known apoptosis inhibitors. Anti-apoptotic polypeptides are characterized by their ability to inhibit apoptosis when expressed or activated in cells induced to undergo apoptosis. For example, in the absence of a functional anti-apoptotic polypeptide, cells treated with an apoptosis-enhancing factor (eg, a pro-apoptotic agent) will initiate or accelerate apoptosis. However, in the presence of an apoptosis polypeptide, treatment with a pro-apoptotic agent / enhancer can initiate a programmed cell death pathway that inhibits one or more events in the cell, thus leading to survive. Due to the function of anti-apoptotic polypeptides, the programmed cell death pathway is inhibited early or relatively late in the performance of events that lead to eventual cell death. Anti-apoptotic polypeptides and the nucleic acids encoding them are well known to those of skill in the art, for example, the family of related proteins called Bcl-2, Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, E1B 19K, IAP, Ced -9, Bcl-w,
etc. and dominant negative forms of caspase. This form includes, for example, caspase's with a mutation in which the active site cysteine is inactivated.

【０１０７】 抗アポトーシス・ポリペプチドの過剰発現は、例えば、当業者には公知の組み
換え法によって達成できる。そのような組み換え発現法を実行する通常の手順は
、例えば、下記に記述されている、Sambrook et al., Molecular Cloning: A La
boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992), Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, (1995)。この方法
を用いて、アポトーシスの誘発を阻止するに十分なレベルで抗アポトーシス・ポ
リペプチドを安定的又は一時的に発現させることができる。抗アポトーシス・ポ
リペプチドをコード化する核酸分子は、例えば、同じ種又は細胞タイプから得ら
れる同種の核酸でコード化することも、あるいは異なる種又は細胞タイプから得
られる異種の核酸でコード化することもできる。コード化された抗アポトーシス
・ポリペプチドがアポトーシス阻害活性を示す限り、コード化する核酸の源は重
要ではない。[0107] Overexpression of an anti-apoptotic polypeptide can be achieved, for example, by recombinant methods known to those of skill in the art. Conventional procedures for performing such recombinant expression methods are described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A La
boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992), Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, (1995). Using this method, anti-apoptotic polypeptides can be stably or transiently expressed at levels sufficient to prevent the induction of apoptosis. A nucleic acid molecule encoding an anti-apoptotic polypeptide can be encoded by, for example, a homologous nucleic acid from the same species or cell type, or a heterologous nucleic acid from a different species or cell type. You can also. The source of the encoding nucleic acid is not critical so long as the encoded anti-apoptotic polypeptide exhibits apoptosis-inhibiting activity.

【０１０８】 アポトーシスの誘導を阻止するに十分な抗アポトーシス・ポリペプチドの発現
レベルは当業者には公知であり、また、当業者はそれを機械的な手順で決定でき
る。組み換えポリペプチド発現を可能にする発現ベクター及びシステムは公知で
あり、商業的に入手できる。特定宿主細胞において十分なレベルの発現を可能に
するベクター又はシステムを選ぶことも当業者にとっては機械的な仕事である。
あるいはまた、アポトーシスの誘導を阻止するのに十分な発現レベルは、抗アポ
トーシス・ポリペプチドを発現させ、次ぎにアポトーシス促進物質による処理；
又は植物由来のｃＤＮＡ分子の誘導、の後で細胞が生き残るかどうかを測定する
ことによって機械的に決定することもできる。The level of expression of an anti-apoptotic polypeptide sufficient to prevent the induction of apoptosis is known to those of skill in the art and can be determined by mechanical procedures. Expression vectors and systems that allow recombinant polypeptide expression are known and commercially available. Choosing a vector or system that allows a sufficient level of expression in a particular host cell is also a mechanical task for those skilled in the art.
Alternatively, an expression level sufficient to prevent induction of apoptosis causes expression of the anti-apoptotic polypeptide, followed by treatment with a pro-apoptotic agent;
Alternatively, it can be determined mechanically by measuring whether cells survive after induction of a cDNA molecule from a plant.

【０１０９】 抗アポトーシス・ポリペプチドを過剰発現する組み換え法以外に、抗アポトー
シス・ポリペプチドを本来的に過剰発現する細胞を用いることもできる。抗アポ
トーシス・ポリペプチドを本来的に過剰発現する細胞の具体的な一例は、Bcl-2
が最初に同定されたＢ細胞リンパ腫である。この白血病は、染色体１４から１８
への転座があり、それが高レベルのBcl-2 の発現、それによる細胞の生存、を引
き起こしている。すなわち、この白血病表現型は細胞生存率の増加による。内在
的に抗アポトーシス・ポリペプチドを過剰発現する他の細胞系も本発明の方法で
利用することができる。In addition to recombinant methods that overexpress anti-apoptotic polypeptides, cells that naturally overexpress anti-apoptotic polypeptides can also be used. One specific example of a cell that naturally overexpresses an anti-apoptotic polypeptide is Bcl-2
Are the first identified B cell lymphomas. This leukemia can be found on chromosomes 14-18.
, Which causes high levels of Bcl-2 expression, and thus cell survival. That is, this leukemia phenotype is due to increased cell viability. Other cell lines that overexpress the endogenous anti-apoptotic polypeptide can also be used in the methods of the invention.

【０１１０】 抗アポトーシス・ポリペプチドの過剰発現によるアポトーシスのブロックと、
アポトーシス促進因子による細胞の処理は、細胞に拮抗的な影響を及ぼす。これ
により、細胞は本質的にプログラムされた細胞死に対して身構える。アポトーシ
ス促進因子としては、細胞へのいろいろな攻撃、分子的、環境的、及び物理的な
刺激を含む攻撃、があり得る。前に述べたように、それらの刺激は当業者には公
知であり、アポトーシス経路内の分子を活性化することで特徴づけられる。アポ
トーシス促進因子の例は、成長因子の遮断、Fasリガンド、抗Fas 抗体、スタウ
ロスポリン、腫瘍壊死因子、紫外線及びガンマ線、などのインジューサーである
。このように、抗アポトーシス・ポリペプチドを過剰発現する細胞をアポトーシ
ス促進因子で処理すると、ポジティブな信号とネガティブな信号の両方がバラン
スして、細胞をアポトーシスに向けて下準備させる。この下準備の一つの利点は
、いったんアポトーシスのブロックに打ち勝つ信号が受信されると、アポトーシ
スのために細胞死の全ての成分が利用できるようになっているということである
。これによりアポトーシスの速やかな誘導が可能になり、Bcl-2, 又はBcl-XL又
は関連分子の存在下でアポトーシス誘導活性を有する化合物のスクリーニングに
利用できる。このような細胞は、植物から得られるｃＤＮＡ発現ライブラリーを
スクリーニングしてアポトーシス促進ポリペプチドを探すのに特に有用である。
同様に、アポトーシス促進ポリペプチドを誘導プロモータの指令の下で発現させ
ることができる。すなわち、もしも誘導が細胞死に導かない場合、発現されるｃ
ＤＮＡから得られる細胞死調節因子が存在すると推測される。Blocking apoptosis by overexpression of an anti-apoptotic polypeptide;
Treatment of cells with pro-apoptotic factors has a antagonistic effect on the cells. This essentially prepares the cells for programmed cell death. Pro-apoptosis factors can include a variety of attacks on cells, including molecular, environmental, and physical stimuli. As mentioned earlier, those stimuli are known to those skilled in the art and are characterized by activating molecules within the apoptotic pathway. Examples of pro-apoptotic factors are growth factor blockers, Fas ligands, anti-Fas antibodies, staurosporine, tumor necrosis factor, ultraviolet and gamma rays, and inducers. Thus, treating cells overexpressing an anti-apoptotic polypeptide with a pro-apoptotic factor balances both positive and negative signals, preparing the cells for apoptosis. One advantage of this preparation is that once a signal is received that overcomes the block of apoptosis, all components of cell death are available for apoptosis. Thus enables rapid induction of apoptosis can be used for screening compounds having an apoptosis-inducing activity in the presence of Bcl-2, or Bcl-X L or related molecules. Such cells are particularly useful for screening cDNA expression libraries obtained from plants for pro-apoptotic polypeptides.
Similarly, a pro-apoptotic polypeptide can be expressed under the direction of an inducible promoter. That is, if induction does not lead to cell death, the expressed c
It is assumed that there is a cell death regulator obtained from DNA.

【０１１１】 植物由来のｃＤＮＡライブラリーから得られる抗アポトーシス・タンパク質は
、宿主細胞、例えば哺乳類細胞、を植物ｃＤＮＡ発現ライブラリーによって形質
転換させるステップと、細胞にアポトーシス誘導因子、例えばスタウロスポリン
、ガンマ線照射、抗Fas、又はFas リガンド、など、を接触させるステップと、
アポトーシスに進入しない細胞を検出し、細胞及び抗アポトーシス・タンパク質
を発現させるｃＤＮＡ構成子を同定するステップを含む方法によっても同定する
ことができる。An anti-apoptotic protein obtained from a plant-derived cDNA library can be obtained by transforming a host cell, eg, a mammalian cell, with a plant cDNA expression library, and causing the cell to undergo an apoptosis-inducing factor, eg, staurosporine, gamma ray. Contacting with irradiation, anti-Fas, or Fas ligand, etc .;
It can also be identified by a method comprising detecting cells that do not enter apoptosis and identifying cells and cDNA constructs that express anti-apoptotic proteins.

【０１１２】 ３． 高処理量 この明細書で述べられる方法は、また、高処理量フォーマト（例えば、多数の
サンプルを速やかにかつ効率的にスクリーニングできるマルチウエル型式のアッ
セイ）に組み込むことができる。例えば、96 ウエル型式は、操作及び測定デバ
イスに適したプレートが市販されているので、実際的な利点がある。それらの手
順はさらに自動化してこの方法のスピードと効率を高めることができる。これら
の特長は、この方法の特異性と合わせて、アポトーシス活性の阻害因子又は増強
因子の候補の細胞を含まない、高処理量のスクリーニングを可能にする。 Ｅ． 製薬への応用 プログラムされた細胞死の阻害因子及び増強因子を本発明の文脈で用いて細胞
死プロセスをコントロールすることができる。すなわち、これらの阻害因子及び
増強因子は、過剰な又は不十分なレベルのアポトーシスで特徴づけられる疾病、
及び生物的及び非生物的攻撃からの植物の保護に有用性があるだろう。したがっ
て、植物におけるアポトーシスの阻害因子は、主要な神経退化疾患：発作、パー
キンソン病、アルツハイマー病、及びＡＬＳの治療でヒトに対して潜在的な治療
価値があるであろう。同様に、阻害因子を用いて、心筋梗塞の後の心臓、及び急
性虚血の後の腎臓、及び肝臓疾患で、アポトーシスを阻止することができるだろ
う。[0112] 3. High Throughput The methods described herein can also be incorporated into high throughput formats (eg, multi-well assays that can screen large numbers of samples quickly and efficiently). For example, the 96-well format has practical advantages because plates suitable for operating and measuring devices are commercially available. These procedures can be further automated to increase the speed and efficiency of the method. These features, combined with the specificity of the method, allow for high-throughput screening without candidate cells for inhibitors or enhancers of apoptotic activity. E. FIG. Pharmaceutical Application Programmed cell death inhibitors and enhancers can be used in the context of the present invention to control the cell death process. That is, these inhibitors and potentiators are those diseases characterized by excessive or insufficient levels of apoptosis,
And may be useful in protecting plants from biological and abiotic attack. Thus, inhibitors of apoptosis in plants would have potential therapeutic value in humans in the treatment of major neurodegenerative diseases: seizures, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and ALS. Similarly, inhibitors could be used to block apoptosis in the heart after myocardial infarction and in kidney and liver disease after acute ischemia.

【０１１３】 製薬組成物も本発明によって提供される。これらの組成物は、上記の阻害因子
、増強因子、ＤＮＡ分子、ベクター又は宿主細胞、のいずれかを製薬的又は生理
的に受容できるキャリア、賦形剤、希釈剤と合わせて含む。一般に、そのような
キャリアは用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに無毒でなければならない
。普通、そのような組成物の調製は、治療物質を、バッファー、アスコルビン酸
などの抗酸化剤、低分子量（約１０個未満の残基）のポリペプチド、タンパク質
、アミノ酸、グルコース、スクロース、又はデキストリンなどの糖質、ＥＤＴＡ
などのキレート剤、グルタチオンなどの安定剤及び賦形剤、と組み合わせること
を含む。中性の緩衝食塩水又は非特異血清アルブミンなどが適当な希釈剤の例で
ある。[0113] Pharmaceutical compositions are also provided by the present invention. These compositions comprise any of the above inhibitors, enhancers, DNA molecules, vectors or host cells in combination with a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier, excipient, diluent. Generally, such carriers must be non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed. Typically, preparation of such compositions involves treating the therapeutic substance with a buffer, an antioxidant such as ascorbic acid, a low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide, protein, amino acid, glucose, sucrose, or dextrin. Carbohydrates such as EDTA
And a stabilizer such as glutathione and excipients. Neutral buffered saline or non-specific serum albumin are examples of suitable diluents.

【０１１４】 さらに、本発明の製薬組成物は、いろいろな異なるルートで投与されるように
、例えば関節内に、頭蓋内に、皮内に、肝臓内に、筋肉内に、眼内に、腹腔内に
、くも膜下に、静脈内に、皮下に投与されるように、又は腫瘍に直接投与される
ようにさえ、調製できる。さらに、本発明の製薬組成物は、それらの製薬組成物
の使用に関する指示を与える包装材料と一緒に容器に入れてもよい。一般に、そ
のような指示は、試薬の濃度、ならびにいくつかの実施形態では、製薬組成物を
再構成するのに必要な賦形剤成分の相対量又は希釈剤（例えば、水、塩水、又は
ＰＢＳ）、を記述している明確な表現を含む。製薬組成物は診断にも治療にも有
用である。Furthermore, the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered by a variety of different routes, for example, intraarticularly, intracranial, intradermally, intrahepaticly, intramuscularly, intraocularly, intraperitoneally. It can be prepared for administration intra-, intrathecally, intravenously, subcutaneously, or even directly to the tumor. In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention may be packaged in a container together with packaging material providing instructions regarding the use of the pharmaceutical compositions. In general, such instructions will include the concentrations of the reagents, as well as, in some embodiments, the relative amounts of excipient components or diluents (eg, water, saline, or PBS) necessary to reconstitute the pharmaceutical composition. ), Including a clear expression describing Pharmaceutical compositions are useful for diagnosis as well as for therapy.

【０１１５】 本発明の製薬組成物は、治療する（又は、予防する）疾病に適した仕方で投与
することができる。投与する量及び頻度は、患者の状態、及び患者の疾病のタイ
プと重症度などの因子によって決定される。投薬量は、臨床試験の間に最も正確
に決定できる。患者をモニターして、臨床的な増悪、画像診断、などの適当な方
法によって治療的な効果を監視することができる。The pharmaceutical compositions of the invention can be administered in a manner suitable for the disease to be treated (or prevented). The amount and frequency of administration will depend on factors such as the condition of the patient and the type and severity of the patient's disease. Dosages can be most accurately determined during clinical trials. The patient can be monitored to monitor therapeutic efficacy by appropriate methods such as clinical exacerbations, diagnostic imaging, and the like.

【０１１６】 別の実施形態では、植物から得られたアポトーシス経路タンパク質が遺伝子送
給ビヒクルの一部として細胞に送給される。多くの疾病や症候群で、アポトーシ
スが弱すぎることがその発病の重要な特徴である。多くの自己免疫疾患及び腫瘍
の治療では、アポトーシスを増加させることが有利になる。アポトーシスを増加
させる一つの手段は、caspase 遺伝子を発現できる形で標的細胞に供給すること
である。これは、アポトーシス促進ポリペプチドのin vivo 転写が可能なＤＮＡ
又はｃＤＮＡを送給することによって達成される。もっと具体的に言うと、アポ
トーシス・ポリペプチドをin vivo で生成するために、アポトーシス・ポリペプ
チドをコード化する核酸配列が真核細胞プロモーター（例えば、pol III プロモ
ーター、ＣＭＶ、又はＳＶ４０プロモーター）のコントロールの下に置かれる。
転写をもっと細かくコントロールしたいと思う場合、アポトーシス・ポリペプチ
ドは組織又は細胞特異的プロモーター（例えば、肝臓の標的細胞の）又は誘導て
きプロモーター、例えばメタロチオネイン、のコントロールの下に置かれる。In another embodiment, apoptosis pathway proteins obtained from a plant are delivered to cells as part of a gene delivery vehicle. In many diseases and syndromes, too weak apoptosis is an important feature of its onset. In the treatment of many autoimmune diseases and tumors, it is advantageous to increase apoptosis. One means of increasing apoptosis is to supply the caspase gene to target cells in an expressible manner. This is a DNA capable of in vivo transcription of a pro-apoptotic polypeptide.
Or by delivering cDNA. More specifically, in order to produce apoptotic polypeptides in vivo, the nucleic acid sequence encoding the apoptotic polypeptide is controlled by a eukaryotic promoter (eg, pol III promoter, CMV, or SV40 promoter). Is placed under
If one wants more control over transcription, the apoptotic polypeptide is placed under the control of a tissue or cell specific promoter (eg, of a target cell in the liver) or an inducible promoter, eg, metallothionein.

【０１１７】 細胞に核酸を導入するための多くの方法が知られている。そのような方法とし
ては、レトロウイルス・ベクターとその後のレトロウイルス感染、アデノウイル
ス又はアデノ随伴ウイルス・ベクターとその後の感染、縮合物質（例えば、ポリ
リジン）による核酸の錯体、がある。これらの錯体又はウイルス・ベクターは、
ビヒクルに組み込まれたリガンドによって特定の細胞タイプを標的にすることが
できる。腫瘍細胞及びその他の細胞に特異的な多くのリガンドは当業者には周知
である。[0117] Many methods are known for introducing nucleic acids into cells. Such methods include retroviral vector and subsequent retroviral infection, adenovirus or adeno-associated virus vector and subsequent infection, complexing nucleic acids with condensing agents (eg, polylysine). These complexes or viral vectors are
Specific cell types can be targeted by ligands incorporated into the vehicle. Many ligands specific for tumor cells and other cells are well known to those skilled in the art.

【０１１８】 本発明に関連した状況で多様なベクターを用いることができる。例えば、プラ
スミド、ウイルス、レトロトランスポゾン、及びコスミド、などである。代表的
な例は、アデノウイルス・ベクター（例えば、WO 94/26914, WO 93/9191; Yei e
t al., Gene Therapy 1:192-200, 1994; Kolls et al., PNAS 91(1):215-219, 1
994; Kass-Eisler et al., PNAS 90(24):11498-502,1993; Guzman et al., Circ
ulation 88(6):2838-48,1993; Guzman et al., Cir. Res. 73(6):1202-1207,199
3; Zabner et al., Cell 75(2):207-216, 1993; Li et al., Hum Gene Ther. 4(
4):403-409, 1993; Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5(10):1287-1291,199
3）、アデノ随伴タイプ１（“ＡＡＶ−１”）又はアデノ随伴タイプ２（“ＡＡ
Ｖ−２”）ベクター（WO 95/13365; Flotte et al., PNAS 90(22):10613-10617, 1993）、肝炎デルタ・ベクター、弱毒化デルタ・ウイルス及びヘルペス・ウイ
ルス・ベクター（例えば、米国特許第5,288,641 号）、ならびに米国特許第5,16
6,320 号に開示されたベクター、などであろる。他の代表的なベクターとしては
、レトロウイルス・ベクターがある（例えば、EP 0 415 731; WO 90/07936; WO
91/02805; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; 米国特許第5,219,740 号
；WO 93/11230; WO 93/10218）。A variety of vectors can be used in the context of the present invention. For example, plasmids, viruses, retrotransposons, and cosmids. Representative examples include adenovirus vectors (eg, WO 94/26914, WO 93/9191; Yei e
t al., Gene Therapy 1: 192-200, 1994; Kolls et al., PNAS 91 (1): 215-219, 1
994; Kass-Eisler et al., PNAS 90 (24): 11498-502, 1993; Guzman et al., Circ.
ulation 88 (6): 2838-48,1993; Guzman et al., Cir. Res. 73 (6): 1202-1207,199
3; Zabner et al., Cell 75 (2): 207-216, 1993; Li et al., Hum Gene Ther. 4 (
4): 403-409, 1993; Caillaud et al., Eur.J. Neurosci. 5 (10): 1287-1291,199
3), adeno-associated type 1 ("AAV-1") or adeno-associated type 2 ("AA
V-2 ″) vector (WO 95/13365; Flotte et al., PNAS 90 (22): 10613-10617, 1993), hepatitis delta vector, attenuated delta virus and herpes virus vectors (eg, US No. 5,288,641), and U.S. Pat.
6,320, and the like. Other exemplary vectors include retroviral vectors (eg, EP 0 415 731; WO 90/07936; WO
91/02805; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; U.S. Patent No. 5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218).

【０１１９】 本発明のいくつかの態様では、アポトーシス経路タンパク質をコード化する核
酸分子は、ビヒクルを用いて、又はいろいろな物理的な方法によって宿主細胞に
導入することができる。そのような方法の代表的な例は、リン酸カルシウム沈澱
を用いる変換（Dubensky et al., PNAS 81:7529-7533, 1984）、無傷の標的細胞
への核酸分子の直接のマイクロインジェクション（Acsadiet al., Nature 352:8
15-818, 1991）、及び導電性溶液に懸濁された細胞に強い電界をかけて一時的に
膜を分極化し、核酸分子の進入を可能にするエレクトロポレーションである。他
の方法として、不活性アデノウイルスにリンクした核酸分子を用いるもの（Cott
on et al., PNAS 89:6094, 1990）、リポフェクション（lipofection）（Felgne
r et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989）、マイクロ飛翔
体打ち込み（Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991）、ポリリジンなどの
ポリカチオン化合物、レセプタ特異的リガンド、核酸分子をトラップしたリポゾ
ーム、核酸分子を含む E. coli から外側細胞壁を取り去りポリエチレングリコ
ールを用いて動物細胞に融合するスフェロプラスト融合、ウイルス・トランスダ
クション、（Cline et al., Pharmac. Ther. 29:69, 1985; Friedman et al., S
cience 244: 1275, 1989）、ならびにセンダイ・ウイルスやアデノウイルスなど
のソラレン不活性化されたウイルス、がある。適当なビヒクルとしては、米国特
許第5,763,416 号及びWO 97/38729, U.S. Ser. No. 08/631,334 に記述されてい
る遺伝子活性化マトリクスもある。In some aspects of the invention, a nucleic acid molecule encoding an apoptosis pathway protein can be introduced into a host cell using a vehicle or by a variety of physical methods. Representative examples of such methods include conversion using calcium phosphate precipitation (Dubensky et al., PNAS 81: 7529-7533, 1984), direct microinjection of nucleic acid molecules into intact target cells (Acsadi et al., Nature 352: 8
15-818, 1991), and electroporation in which a strong electric field is applied to cells suspended in a conductive solution to temporarily polarize the membrane and allow entry of nucleic acid molecules. Another approach uses nucleic acid molecules linked to an inactive adenovirus (Cott
on et al., PNAS 89: 6094, 1990), lipofection (Felgne
Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1989), microprojectile bombardment (Williams et al., PNAS 88: 2726-2730, 1991), polycation compounds such as polylysine, Receptor-specific ligands, liposomes entrapping nucleic acid molecules, spheroplast fusion that removes the outer cell wall from E. coli containing nucleic acid molecules and fuses them to animal cells using polyethylene glycol, virus transduction, (Cline et al., Pharmac. Ther. 29:69, 1985; Friedman et al., S
cience 244: 1275, 1989), as well as psoralen-inactivated viruses such as Sendai virus and adenovirus. Suitable vehicles also include the gene activation matrices described in US Pat. No. 5,763,416 and WO 97/38729, US Ser. No. 08 / 631,334.

【０１２０】 以下の実施例は例示のために提出されるものであり、限定するためではない。 実施例 実施例 Ｉ ＩＡＰを含むバイナリー・ベクターの構築 ベクターｐＯＰＩＡＰＲＣ（Birmbaum et al., J. of Virology 68:2521-2528
, 1994）内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰＣＲによって操作し
て５’末端にNco Iサイトを、３’末端にBam HI サイトを導入した。この操作で
原生のタンパク質のMet （ポジション１）残基とSer （ポジション２）残基の間
にAla 残基が導入された。用いられたＰＣＲ条件は次の通りであった：１分９４
℃；１分４５℃；２分７２℃を２サイクル、続いて１分９４℃をさらに３５サイ
クル；１分５５℃；２分７２℃。The following examples are offered by way of illustration, and not by way of limitation. EXAMPLES Example I Construction of Binary Vector Containing IAP Vector pOPIAPRC (Birmbaum et al., J. of Virology 68: 2521-2528
, 1994) by PCR to introduce an Nco I site at the 5 'end and a Bam HI site at the 3' end. This procedure introduced an Ala residue between the Met (position 1) and Ser (position 2) residues of the native protein. The PCR conditions used were as follows: 1 min 94
2 minutes 72 ° C for 2 cycles, followed by 1 minute 94 ° C for another 35 cycles; 1 minute 55 ° C; 2 minutes 72 ° C.

【０１２１】 プライマー prc-5: 5'-gttgcagaccatggccagctcccgagcattggc-3' プライマー pre-3: 5'-ttttggatccttttattgttacacttgg-3' ＰＣＲ産物は、Nco I 及びBam HI で消化され、植物発現カセットｐＲＴＬ２
（Carrington et al., J. of Virology 64:1590-1597, 1990,によってｐＲＴＬ
ＧＵＳとして記述されている）でサブクローニングされた。得られたベクターは
ｐＰＴＮ１４４と呼ばれる。ｐＰＴＮ１４４の３５Ｓ−ＩＡＰカセットがHind I
II を用いてバイナリー・ベクターｐＺＰ２１２（Hajdukiewicz et al., Plant
Mol. Bio 25:989-994, 1994）にサブクローニングされた。得られたベクターは
ｐＰＴＮ１４８と呼ばれる（図１Ｂ）。Primer prc-5: 5′-gttgcagaccatggccagctcccgagcattggc-3 ′ Primer pre-3: The 5′-ttttggatccttttattgttacacttgg-3 ′ PCR product was digested with Nco I and Bam HI, and the plant expression cassette pRTL2
(PRTL by Carrington et al., J. of Virology 64: 1590-1597, 1990,).
(Described as GUS). The resulting vector is called pPTN144. The 35S-IAP cassette of pPTN144 is Hind I
II using the binary vector pZP212 (Hajdukiewicz et al., Plant
Mol. Bio 25: 989-994, 1994). The resulting vector is called pPTN148 (FIG. 1B).

【０１２２】 実施例 II Ced-9 を含むバイナリー・ベクターの構築 Ced-9 のＯＲＦをＰＣＲで操作して、５’末端にNco Iサイトを、３’末端にX
ba I サイトを導入した。この操作で原生のタンパク質のMet（ ポジション１）
残基とThr （ポジション２）残基の間にAla 残基が導入された。ＰＣＲ条件は、
ｐＯＰＩＡＰＲＣのＯＲＦの操作に関して述べたものと同一であった。Example II Construction of Binary Vector Containing Ced-9 The ORF of Ced-9 was manipulated by PCR to have an Nco I site at the 5 'end and an X
ba I site was introduced. By this operation, Met of the native protein (position 1)
An Ala residue was introduced between the residue and the Thr (position 2) residue. PCR conditions are:
It was the same as described for the operation of the ORF of pOPIAPRC.

【０１２３】 プライマー ced-5: 5'-gaattccggtttgagccatggcgacacgctgcacggcg-3' プライマー ced-3-2: 5'-ttttttctagaaatacgttacttcaagctg-3' ＰＣＲ産物は、Nco I 及びXba Iで消化され、植物発現カセットｐＲＴＬ２（C
arrington et al., J. of Virology 64:1590-1597, 1990）にサブクローニング
された。得られたベクターはｐＰＴＮ１４３と呼ばれる（図３Ａ）。ｐＰＴＮ１
４３からのced-9 植物発現カセットは Hind III 断片としてバイナリー・ベクタ
ーｐＺＰ２１２にサブクローニングされた（Hajdukiewicz et al., Plant Mol.
Bio 25:989-994, 1994）。得られたベクターはｐＰＴＮ１４７と呼ばれる（図３
Ｂ）。Primer ced-5: 5′-gaattccggtttgagccatggcgacacgctgcacggcg-3 ′ Primer ced-3-2: 5′-ttttttctagaaatacgttacttcaagctg-3 ′ The PCR product was digested with NcoI and XbaI, and the plant expression cassette pRTL2 (C
arrington et al., J. of Virology 64: 1590-1597, 1990). The resulting vector is called pPTN143 (FIG. 3A). pPTN1
The ced-9 plant expression cassette from 43 was subcloned as a Hind III fragment into the binary vector pZP212 (Hajdukiewicz et al., Plant Mol.
Bio 25: 989-994, 1994). The resulting vector is called pPTN147 (FIG. 3).
B).

【０１２４】 実施例 III Bcl-2 を含むバイナリー・ベクターの構築 bcl-2 のｃＤＮＡを操作して、bcl-2 のＯＲＦの５’末端にNco Iサイトを、
ＯＲＦの３’末端にXba I サイトを導入した。ＰＣＲ反応は、次のプライマーを
用いて、実施例Ｉで述べたと同一の条件で行われた： プライマーBcl2-5: 5'-tttttcctctgggagggccatggcgcacgctgg-3' プライマーBcl2-3: 5'-ttttttctagatgctcttcgggcgtgg-3' この操作は、原生のタンパク質のMet（ ポジション１）残基とHis（ポジショ
ン２）残基の間にAla 残基を導入した。ＰＣＲ産物は、Nco I 及びXba Iで消化
され、植物発現カセットｐＲＴＬ２にサブクローニングされた。得られたベクタ
ーはｐＰＴＮ１５７と呼ばれる（図２Ａ）。次ぎに、エンドヌクレアーゼHind I
II を用い、引き続き結紮して、全bcl-2 植物発現カセットをバイナリー・ベク
ターｐＺＰ２１２にサブクローニングした。得られたベクターは本明細書ではｐ
ＰＴＮ１６１と呼ばれる（図２Ｂ）。Example III Construction of Binary Vector Containing Bcl-2 By manipulating the cDNA of bcl-2, an Nco I site was added at the 5 'end of the ORF of bcl-2.
An XbaI site was introduced at the 3 'end of the ORF. The PCR reaction was performed under the same conditions as described in Example I, using the following primers: Primer Bcl2-5: 5'-tttttcctctgggagggccatggcgcacgctgg-3 'Primer Bcl2-3: 5'-ttttttctagatgctcttcgggcgtgg-3' The procedure introduced an Ala residue between the Met (position 1) and His (position 2) residues of the native protein. The PCR product was digested with NcoI and XbaI and subcloned into the plant expression cassette pRTL2. The resulting vector is called pPTN157 (FIG. 2A). Next, the endonuclease Hind I
The entire bcl-2 plant expression cassette was subcloned into the binary vector pZP212 using II and subsequent ligation. The resulting vector is referred to herein as p
It is called PTN161 (FIG. 2B).

【０１２５】 実施例 IV E1B 19K を含むバイナリー・ベクターの構築 ベクターｐＣＭＶ１９Ｋ（White and Cipriani, Mol. Cell. Biol. 10:120-13
0, 1990）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ+にサブクローニングして配列を分析
した。得られたベクターはｐＰＴＮ１４５と呼ばれる（図４Ｃ）。テンプレート
ｐＰＴＮ１４５から得られた配列データに基づいて、プライマーが、ＰＣＲによ
ってＯＲＦの５’末端にNco I サイトを、ＯＲＦの３’末端にBam HI サイトを
導入するように設計された。この操作でタンパク質内部に新たな残基は付け加え
られなかった。Example IV Construction of Binary Vector Containing E1B 19K Vector pCMV19K (White and Cipriani, Mol. Cell. Biol. 10: 120-13)
0, 1990) was subcloned into pBluescript KS + and sequenced. The resulting vector is called pPTN145 (FIG. 4C). Based on the sequence data obtained from template pPTN145, primers were designed by PCR to introduce an Nco I site at the 5 'end of the ORF and a Bam HI site at the 3' end of the ORF. This procedure did not add any new residues inside the protein.

【０１２６】 プライマーｐＰＴＮ１４５−５：5'-gcttcctgaactccatggaggcttggg-3' プライマーｐＰＴＮ１４５−３：5'-tttttggatccaacattcattcccgagggg-3' Ｅ１Ｂ−１９Ｋ ＯＲＦの中のNco I サイトによって、ｐＰＴＮ１４５からの
断片が三重結紮としてのｐＲＴＬ２（NcoI/Bam HI）にサブクローニングされた
。得られたベクターは、ｐＰＴＮ１６０と呼ばれる（図４Ａ）。ｐＰＴＮ１６０
からの３５Ｓ−１９Ｋカセットは、Hind III 断片としてバイナリー・ベクター
ｐＺＰ２１２にサブクローニングされた。得られたベクターは、ｐＰＴＮ１６２
と呼ばれる（図４Ｂ）。Primer pPTN145-5: 5'-gcttcctgaactccatggaggcttggg-3 'Primer pPTN145-3: 5'-tttttggatccaacattcattcccgagggg-3' The NcoI site in the E1B-19K ORF allows the fragment from pPTN145 to be in a triple ligated form (RTL). NcoI / Bam HI). The resulting vector is called pPTN160 (FIG. 4A). pPTN160
The 35S-19K cassette from was subcloned into the binary vector pZP212 as a HindIII fragment. The resulting vector was designated as pPTN162.
(FIG. 4B).

【０１２７】 実施例 Ｖ 植物形質転換プロトコル アグロバクテリウム株： Agrobacterium tumefaciens株、Ｃ５８Ｃ１（Mol. G
en. Genet. 204:383, 1986）、を全てのタバコ形質転換で用いた。三親交雑によ
りバイナリー・ベクターｐＰＴＮ１４７、ｐＰＴＮ１４８、ｐＰＴＮ１６１、及
び ｐＰＴＮ１６２がＣ５８Ｃ１に注入された。100 mg/L のストレプトマイシン
、100 mg/L のスペクチノマイシン、50 mg/L のリファンピシン、50 mg/L のゲ
ンタマイシン及び1.5 スクロースを補充したＡＢ最小培地でアクロバクテリウム
接合体（transconjugant）が選択された。Example V Plant Transformation Protocol Agrobacterium strain : Agrobacterium tumefaciens strain, C58C1 (Mol. G
en. Genet. 204: 383, 1986) was used in all tobacco transformations. The binary vectors pPTN147, pPTN148, pPTN161, and pPTN162 were injected into C58C1 by three parent crosses. Transconjugant was selected on AB minimal medium supplemented with 100 mg / L streptomycin, 100 mg / L spectinomycin, 50 mg / L rifampicin, 50 mg / L gentamicin and 1.5 sucrose. Was.

【０１２８】 野生種タバコNicotiana tabacum 栽培品種Glurk（遺伝子型ＮＮ）又はN. taba
cum 栽培品種Turkish（遺伝子型ｎｎ）が病原体接種及び遺伝子導入植物の構築
に用いられた。（品種Glurk及びTurkishはどちらも、いろいろな源から、例えば
，University of Nebraska at Lincoln, Collectionから、入手できる）。 タバコの形質転換は、葉ディップ・プロトコルの変型を用いて行われた（Hors
ch et al., ）。外植体は30-40 日の植物の最初の二枚の葉から調製された。３
日間の共培養期間の後、外植体は、1 ｍｇ／ｌＢＡＰ、0.1 ｍｇ／ｌＮＡＡ及び
100 ｍｇ／ｌカナマイシンを補充したＭＳ／Ｂ５培地に継代培養された。アグロ
バクテリウムに対して対抗選択するために抗生物質カルベニシリン及びセフォタ
キシムが加えられた。外植体は２週間毎に新しい培地に植え継ぎされた。６−８
週間の培養後、分化したカナマイシン寛容シュートを切り取った。シュートは、
0.1 ｍｇ／ｌＮＡＡ及び50 ｍｇ／ｌカナマイシンを補充したＭＳ／Ｂ５培地に
活着させた。Wild tobacco Nicotiana tabacum cultivar Grlurk (genotype NN) or N. taba
The cum cultivar Turkish (genotype nn) was used for pathogen inoculation and construction of transgenic plants. (Both varieties Glurk and Turkish are available from a variety of sources, for example, from the University of Nebraska at Lincoln, Collection). Transformation of tobacco was performed using a modification of the leaf dip protocol (Hors
ch et al.,). Explants were prepared from the first two leaves of the plant for 30-40 days. 3
After a co-cultivation period of one day, explants contained 1 mg / l BAP, 0.1 mg / l NAA and
The cells were subcultured in MS / B5 medium supplemented with 100 mg / l kanamycin. Antibiotics carbenicillin and cefotaxime were added to counterselect against Agrobacterium. Explants were subcultured every two weeks in fresh medium. 6-8
After weeks of culture, the differentiated kanamycin tolerant shoots were excised. Shoot is
The cells were activated on MS / B5 medium supplemented with 0.1 mg / l NAA and 50 mg / l kanamycin.

【０１２９】 実施例 VI 遺伝子導入系統のスクリーニング分析 カナマイシン抵抗性の遺伝子導入植物は、硫酸カナマイシン（100 ｍｇ／ｌ）
、ＮＡＡ（オーキシン）、0.1 ｍｇ／ｌ及びＢＡＰ（サイトキニン）1 ｍｇ／ｌ
を補充したMurashige-5k00G 基礎塩培地で繁殖させた。Example VI Screening Analysis of Transgenic Lines Transgenic plants resistant to kanamycin were converted to kanamycin sulfate (100 mg / l).
, NAA (auxin), 0.1 mg / l and BAP (cytokinin) 1 mg / l
Were grown in Murashige-5k00G basal medium supplemented with.

【０１３０】 発現研究のために、タバコの葉を採取し、液体窒素で凍結させ、すりつぶして
パウダーにした。植物ＲＮＡは実施例VIIIで述べるように単離された。ＲＮＡブ
ロットを放射性標識されたｐＰＮ１４７，ｐＰＴＮ１４８，ｐＰＴＮ１６１２，
ｐＰＴＮ１６２とハイブリダイズさせた。１８ＳｒＲＮＡが、等価なＲＮＡ負荷
を保証するための内部対照としてもちいられた。ＲＮＡブロット・ハイブリダイ
ゼーション及び膜洗浄はストリンジェント条件の下で行われた（Sambrook et al
., 前出）。For expression studies, tobacco leaves were harvested, frozen in liquid nitrogen and ground to a powder. Plant RNA was isolated as described in Example VIII. RNA blots were prepared using radiolabeled pPN147, pPTN148, pPTN1612,
Hybridized with pPTN162. 18S rRNA was used as an internal control to ensure equivalent RNA loading. RNA blot hybridization and membrane washes were performed under stringent conditions (Sambrook et al.
., Supra).

【０１３１】 ウエスタン分析：ＴＭＶタンパク質は、Coomassie blue 染色及び／又はＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥからの免疫分析によって検出された。感染した植物組織をｄｄＨ２
０中（0.2 ｇ組織／1 ｍｌ）すりつぶし、５体積のLaemmliローディング・バッ
ファ（Laemmli, Nature 227:680-685,1975）中で1-5 分煮沸した。約15 μｌを1
2 ％ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルに塗布した。タンパク質は電気泳動でニト
ロセルローズ膜に移され、1:1000 に希釈されたビリオンに対して作られたＴＭ
Ｖポリクローナル抗体（ＡＴＣＣ ＰＶＡＳ−１３５、Manassass, VA, から入
手できる）によって、比色分析（Immun-Blot キット、BioRad）を用いて検出さ
れた（図１１Ａ及び１１Ｂ）。 Western analysis : TMV protein was stained with Coomassie blue and / or SD
Detected by immunoassay from S PAGE. Infected plant tissue was ddH2
0 (0.2 g tissue / 1 ml) and boiled in 5 volumes of Laemmli loading buffer (Laemmli, Nature 227: 680-685, 1975) for 1-5 minutes. About 15 μl in 1
Coated on 2% SDS polyacrylamide gel. Proteins were electrophoretically transferred to a nitrocellulose membrane and TM made against virions diluted 1: 1000.
V polyclonal antibody (ATCC PVAS-135, available from Manassass, Va.) Was detected using colorimetric analysis (Immun-Blot kit, BioRad) (FIGS. 11A and 11B).

【０１３２】 ノーザン及びサザン分析：サザン分析（データは示されていない）及びノーザ
ン・ブロットは４つの導入遺伝子の存在と発現を示した。 実施例 VII 病原体接種及び抵抗性分析 植物の抵抗性の評価はタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）で調べられた。
この実験では、ＴＭＶ抵抗性のＮ遺伝子を持つ品種（Glurk）と持たない品種（T
urkish）が形質転換された。４つの導入遺伝子の各々で、最低１０のカナマイシ
ン抵抗性Glurk 及びTurkish 系統が得られた。サザン分析（データは示されない
）及びノーザン・ブロットは、４つの導入遺伝子の存在と発現を示した（図５，
はIAP 及びCed-9 の発現を、図８と９は、Bcl-2とCed-9 の発現を、それぞれ、
示している）。コピー・ナンバー、発現及び植物応答のレベルの間に何も相関は
なかった。野生種の対照と比較したとき、 遺伝子導入植物の間に何も検出でき
る様な生理的な差はなかった。全ての植物が、同様な仕方で開花し、結実した。
ランダムに選んだシングル・コピー挿入カナマイシン抵抗性タバコの病原体攻撃
に対する応答が評価された。 Northern and Southern analysis : Southern analysis (data not shown) and Northern blot showed the presence and expression of the four transgenes. Example VII Pathogen Inoculation and Resistance Analysis Evaluation of plant resistance was examined with tobacco mosaic virus (TMV).
In this experiment, varieties with TMV resistance N gene (Glurk) and varieties without TMV resistance (Tlur
urkish) was transformed. For each of the four transgenes, a minimum of 10 kanamycin resistant Glurk and Turkish strains were obtained. Southern analysis (data not shown) and Northern blot showed the presence and expression of the four transgenes (FIG. 5,
8 and 9 show the expression of IAP and Ced-9, and FIGS. 8 and 9 show the expression of Bcl-2 and Ced-9, respectively.
Shown). There was no correlation between copy number, expression and level of plant response. There were no detectable physiological differences between the transgenic plants when compared to wild-type controls. All plants flowered and set fruit in a similar manner.
The response of randomly selected single copy inserted kanamycin resistant tobacco to pathogen challenge was evaluated.

【０１３３】 タバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）、タバコ壊死ウイルス（ＴＮＶ）、タ
バコ・エッチ・ウイルス（ＴＥＶ）、トマト斑点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ
）、Sclerotinia sclerotiorum 1980 （Dickman and Mitra, Physiol. Mol. Pla
nt Pathol. 41:255-263, 1992）；Botrytis cinerea （ＡＴＣＣ）、Cercospora nicotianae 、及びGlomerella cingulata に対する遺伝子導入タバコの抵抗性
がテストされた。遺伝子導入タバコと対照タバコは温室内で16 時間の明期間、2
5℃で生育された。Tobacco mosaic virus (TMV), tobacco necrosis virus (TNV), tobacco etch virus (TEV), tomato spot wilt virus (TSWV)
), Sclerotinia sclerotiorum 1980 (Dickman and Mitra, Physiol. Mol. Pla
nt Pathol. 41: 255-263, 1992); the transgenic tobacco resistance to Botrytis cinerea (ATCC), Cercospora nicotianae, and Glomerella cingulata was tested. Transgenic and control tobaccos were used in a greenhouse for
Growed at 5 ° C.

【０１３４】 ウイルス分析：切断されたタバコの葉に、カーボランダムを散粉し、50μｌの
Ｈ2Ｏ中の110 μｇのＴＭＶをなすりつけ接種した。５分後、葉を水で十分に洗
浄し、ペトリ皿に置き、25 ℃で一定の照明の下に保持した。ＴＮＶ及びＴＳＷ
Ｖの接種も同様であったが、接種材料には感染した植物の汁液を10 ｍＭ Ｎａリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ７）に1/25(w/v)に希釈したものが用いられた。 Virus analysis : Cut tobacco leaves were dusted with carborundum and swabbed with 110 μg TMV in 50 μl H 2 O. After 5 minutes, the leaves were thoroughly washed with water, placed in petri dishes and kept at 25 ° C under constant light. TNV and TSW
V was inoculated similarly, but the inoculum used was a sap of the infected plant diluted 1/25 (w / v) in 10 mM Na phosphate buffer (pH 7).

【０１３５】 抵抗性（ＮＮ）及び罹病性（ｎｎ）タバコ系統におけるＴＭＶへの抗アポトー
シス遺伝子発現の影響が調べられた。Ｎ遺伝子はＴＭＶ感染に対する過敏な応答
を付与し、それがウイルスの全体的な拡散を阻止する。ＴＭＶに感染してから４
乃至５日後に壊死状の病斑が出現し、時間と共にサイズが拡大し続ける。局所的
な病斑の進展は二段階的な性質のものであるように見える。最初は２乃至３日後
に小さな（１−２ｍｍ）水浸状の病斑が発生し、やがて一様に壊死状になる。そ
の後、壊死は拡大し続け、周縁が水浸状というより萎黄状になる。ウイルスの動
きは病斑の付近に制限されるが、病斑は成長し集合して葉全体の死に至る。ＴＭ
Ｖは、Ｎ遺伝子を持たないタバコの接種された葉には何も目に見える症状を誘発
しないが、実際に複製されて葉全体に広がる。ＴＭＶは、４つの異なる遺伝子導
入されたGlurk（ＮＮ）ラインに（最小限３つの異なるラインを用いて）、なら
びに２つのTurkish（ｎｎ）ラインに、接種された。形質転換されないタバコ、
及びベクターだけを含むタバコ、及びベクター・オンリー植物、が対照として用
いられた。The effect of anti-apoptotic gene expression on TMV in resistant (NN) and susceptible (nn) tobacco lines was examined. The N gene confers a hypersensitive response to TMV infection, which blocks the overall spread of the virus. 4 after infected with TMV
Necrotic lesions appear after ~ 5 days and continue to expand in size over time. Local lesion development appears to be of a two-step nature. Initially, after a few days, small (1-2 mm) water-immersed lesions develop and eventually become necrotic. Thereafter, the necrosis continues to expand and the periphery becomes yellow rather than water-immersed. The movement of the virus is restricted to the vicinity of the lesion, but the lesion grows and aggregates, leading to the death of the entire leaf. TM
V induces no visible symptoms in inoculated leaves of tobacco without the N gene, but is actually replicated and spread throughout the leaves. TMV was inoculated into four different transgenic Glurk (NN) lines (with a minimum of three different lines), as well as two Turkish (nn) lines. Untransformed tobacco,
And tobacco containing vector only, and vector only plants were used as controls.

【０１３６】 さらに、切断葉分析が実験的に有利であり、温室内のの完全植物に比べて病原
体の攻撃に対して100 ％の相関を示すので、ほとんどの実験で切断葉分析が用い
られた。 ＴＭＶは、Glurk ラインでBcl-2, CED 9 及びIAP 遺伝子を含むものにも含ま
ないものにも局所的な病斑を生じた。全ての研究で、アデノウイルスE1B 19K を
含む遺伝子導入植物は、どちらのタバコ品種においても、この病原体に抵抗性を
有するように見えなかったので、それ以上評価しなかった。しかし、他の導入遺
伝子を発現しているラインでは、病斑の二次的な成長は大きく制限された（図７
，図１０Ａ、及び１０Ｂ）。このように、Bcl-2, CED-9, 及びIAP は、Ｎ遺伝子
が与える抵抗性を強化して病斑の拡大を阻止するように見える。ＴＭＶが最初の
病斑から外へ広がってもそれ以上壊死を生じないという可能性もあった。この点
をはっきりさせるために、局所的な病斑と周りの組織について別々のウエスタン
・ブロット分析が行われた（図１１Ａ）。病斑の内部にはウイルスが多かったが
、病斑境界の外側では何もウイルスは検出されず、Ｎ遺伝子の抵抗性が実際にBc
l-2 及びced-9 によって強化されたことが確認された。他方、Turkish ラインで
は、Bcl-2 及びced-9 はＴＭＶの蓄積に何も影響を及ぼさなかった。（図１１Ｂ
）。In addition, cut leaf analysis was used in most experiments because cut leaf analysis is experimentally advantageous and shows a 100% correlation to pathogen attack compared to whole plants in a greenhouse. . TMV produced localized lesions on the Glurk line, both with and without the Bcl-2, CED 9 and IAP genes. In all studies, transgenic plants containing adenovirus E1B 19K were not evaluated further in neither tobacco variety as they did not appear to be resistant to this pathogen. However, secondary growth of lesions was greatly restricted in lines expressing other transgenes (FIG. 7).
, FIGS. 10A and 10B). Thus, Bcl-2, CED-9, and IAP appear to enhance the resistance provided by the N gene and prevent lesion expansion. It was possible that TMV spread out of the initial lesion but did not cause further necrosis. To clarify this point, separate Western blot analyzes were performed on local lesions and surrounding tissue (FIG. 11A). There was a lot of virus inside the lesion, but no virus was detected outside the lesion boundary, and the resistance of the N gene actually
It was confirmed that it was strengthened by l-2 and ced-9. On the Turkish line, on the other hand, Bcl-2 and ced-9 had no effect on TMV accumulation. (FIG. 11B
).

【０１３７】 多くの植物宿主−ウイルスの組み合わせは、また、壊死状の局所的病斑を生ず
るが、特定の宿主遺伝子型に限定されない。この組み合わせにおいて、植物は、
そのウイルスの局所病斑宿主と呼ばれる。タバコは、タバコ壊死ウイルス（ＴＮ
Ｖ）やトマト斑点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）など、いくつかのウイルスの
局所病斑宿主である。ＴＭＶとＮ遺伝子とは異なり、このような一般的な壊死的
応答の遺伝的な基礎は不明であるが、局所病斑の形態は極めて様々であるから、
この基礎はウイルスによって異なると思われる。したがって、これらの共通する
ところがない植物ウイルスに対する宿主の応答への導入遺伝子の影響を決定する
ことに興味が引かれた。驚いたことに、Bcl-2 又はced-9 を発現するタバコの系
統の葉は、ＴＮＶ又はＴＳＷＶを接種した後、何も目に見える症状を示さなかっ
た（図１２）。IAP を発現する植物でも、これらのウイルスの各々を接種した後
、壊死は大きく制限された。すなわち、どちらかの導入遺伝子を含むタバコは、
もはやこれら二つのウイルスの局所病斑宿主ではない。予期されたことであるが
、Ｎ遺伝子はＴＭＶ特異的であるから、ＮＮ及びｎｎ遺伝バックグラウンドの両
方で同じ表現型が認められた。Many plant host-virus combinations also produce necrotic local lesions, but are not limited to a particular host genotype. In this combination, the plant
It is called the local lesion host of the virus. Tobacco uses the tobacco necrosis virus (TN)
V) and tomato spot wilt virus (TSWV) are local lesion hosts for some viruses. Unlike the TMV and N genes, the genetic basis of such a common necrotic response is unknown, but the morphology of local lesions is quite variable,
This basis may vary from virus to virus. Therefore, it was of interest to determine the effect of the transgene on the response of the host to these dissimilar plant viruses. Surprisingly, leaves of tobacco lines expressing Bcl-2 or ced-9 showed no visible symptoms after inoculation with TNV or TSWV (FIG. 12). Necrosis was greatly restricted after inoculation with each of these viruses, even in plants expressing IAP. That is, tobacco containing either transgene
It is no longer a local lesion host for these two viruses. As expected, since the N gene is TMV specific, the same phenotype was observed in both the NN and nn genetic backgrounds.

【０１３８】 さらに、タバコ・エッチ・ウイルス（ＴＥＶ）も、他のウイルスについて上述
したようにテストされたが、ＴＳＷＶと同様なＮ遺伝子非依存性を示した。した
がって、Bcl-2 及びCed-9 を発現する細胞は、ＴＥＶの接種によって何も目に見
える症状を示さなかった（データは示されない）。 いくつかのタバコ・プラントが自植（self）された（すなわち、同じ遺伝子型
と交雑された）。重要なことは、子孫のプラントの間で、カナマイシン抵抗性が
なく導入遺伝子の発現を欠いたものは、今度はすべて罹病性であったことである
。In addition, tobacco etch virus (TEV) was tested as described above for other viruses, but showed similar N gene independence as TSWV. Thus, cells expressing Bcl-2 and Ced-9 did not show any visible symptoms upon inoculation of TEV (data not shown). Several tobacco plants have been selfed (ie, crossed with the same genotype). Importantly, among the progeny plants, those lacking kanamycin resistance and lacking transgene expression were now susceptible.

【０１３９】 導入遺伝子を発現するカナマイシン抵抗性の子孫は（図１３（Ced-9 例示的Bc
l-2 及びIAP 同様）、１４Ａ（Bcl-2 発現及びＴＭＶ接種）、１４Ｂ（Ced-9 発
現及びＴＭＶ接種）、１４Ｃ（Ced-9 発現及びＴＳＷＶ接種））は全て抵抗性で
あり、ウイルス攻撃後の表現型が親で見られるものと同一であった。 真菌分析：切断葉分析では、両方の栽培品種の１０個別プラント／導入遺伝子
からプラントあたり最小限二枚の葉に、ジャガイモ培地で育成されたS. sclerot
iorum 又はB. cinerea の生後３日のコロニーからの活発に成長している菌糸チ
ップを含む５ｍｍ寒天プラグを載せることによって接種した。The kanamycin resistant progeny expressing the transgene (see FIG. 13 (Ced-9 Exemplary Bc
l-2 and IAP), 14A (Bcl-2 expression and TMV inoculation), 14B (Ced-9 expression and TMV inoculation), and 14C (Ced-9 expression and TSWV inoculation)) are all resistant to virus attack. The later phenotype was identical to that seen in the parent. Fungal analysis : For cut leaf analysis, S. sclerot grown in potato medium from 10 individual plants / transgenes of both cultivars to a minimum of 2 leaves per plant.
Inoculation was performed by placing a 5 mm agar plug containing actively growing hypha chips from a 3 day old colony of iorum or B. cinerea.

【０１４０】 葉は、ガラス・ペトリ皿内の湿らせた無菌のフィルター・ペーパーに載せて、
３−７日25℃で高湿度で培養された。完全なプラントに接種する場合（S. scler
otiorum のみ）、子嚢胞子（〜104/ml）がＹＰＳＳ液体培地（Tuite, 1968）で
２時間培養され、タバコの葉に流れ落ちるようになるまで散布された。接種され
たプラントは、相対湿度100 ％、25℃のミスト・チャンバー内に、暗黒中に置か
れた。最小限５プラント／ラインが使用された。全ての実験は少なくとも３回繰
り返された。The leaves are placed on moist, sterile filter paper in a glass Petri dish,
The cells were cultured at a high humidity of 25 ° C for 3-7 days. When inoculating a complete plant (S. scler
otiorum only), ascospores (〜10 4 / ml) were cultured in YPSS liquid medium (Tuite, 1968) for 2 hours and sprayed until they flowed down to tobacco leaves. The inoculated plants were placed in the dark in a mist chamber at 100% relative humidity and 25 ° C. A minimum of 5 plants / line was used. All experiments were repeated at least three times.

【０１４１】 Sclerotinia sclerotiorum についての分析は、遺伝子導入タバコが非常に寛
容であり、ほとんどの場合、非常に罹病性が高い野生種のタバコと異なり、完全
に抵抗性がある。このカビは、水又は緩衝液だけで送給できる他の多くのカビと
は異なり栄養源と共に培養する必要がある。図１５に示されているように、この
カビは、富栄養源と一緒に接種されるとタバコの葉の表面に沿って成長するが、
感染又は宿主コロニー化は起こらない。カビはやがて、多分栄養源の枯渇のため
に成長を停止し、重要なことであるが、長時間培養してもカビは依然としてコロ
ニー化し植物組織に感染することはできない。これと対照的に、野生種のカビは
同じ時間の間に完全にコロニー化し、葉の組織に浸解する（図１５）。Analysis for Sclerotinia sclerotiorum shows that transgenic tobacco is very tolerant and in most cases completely resistant, unlike very susceptible wild tobacco. This mold must be cultured with a nutrient source, unlike many other molds that can only be supplied with water or buffer. As shown in FIG. 15, the mold grows along the surface of tobacco leaves when inoculated with a eutrophic source,
No infection or host colonization occurs. Mold eventually ceases to grow, possibly due to depletion of nutrients, and importantly, even after prolonged culture, the mold still colonizes and cannot infect plant tissue. In contrast, wild-type molds completely colonize during the same time and soak into leaf tissue (FIG. 15).

【０１４２】 前述の自植されたタバコもS. sclerotiorum の攻撃への応答が調べられた（図
１６）。やはり、カナマイシン抵抗性及び導入遺伝子の発現のない子孫のタバコ
はすべて罹病性であった。カナマイシン抵抗性及び導入遺伝子発現によって選ば
れたタバコ・プラントは、一般に抵抗性があり、親の、一次形質転換株と表現型
が同一であった。The self-planted tobacco described above was also examined for response to S. sclerotiorum challenge (FIG. 16). Again, all progeny tobacco without kanamycin resistance and transgene expression were susceptible. Tobacco plants selected for kanamycin resistance and transgene expression were generally resistant and phenotypically identical to the parent, primary transformant.

【０１４３】 Botrytis cinerea は、やはり宿主域が広い、壊死を引き起こす病原体であり
、３つの導入遺伝子のいずれかを含む遺伝子導入タバコに接種されると同様な応
答を示した。どちらのカビの例でも、プラント全体への接種は、切断葉分析で見
られるものとと表現型応答は同一であった（図１７Ａ-bcl-2 発現、１７Ｂ−Ced
-9 発現）。[0143] Botrytis cinerea, also a broad host range necrotic pathogen, showed a similar response when inoculated into transgenic tobacco plants containing any of the three transgenes. In both cases of mold, inoculation of the entire plant had a phenotypic response identical to that seen in the cut leaf analysis (FIG. 17A-bcl-2 expression, 17B-Ced).
-9 expression).

【０１４４】 さらに、３つの導入遺伝子、Ced-9, Bcl-2, 及びIAP、をコード化しているプ
ラントは、S. sclerotiorum について述べたと同様な仕方で Cercospora nicoti
anae（図１９）及びGlomerella cingulata の両方に抵抗性があった（データは
示されない）。 最後に、プラントは、上と同じ親ベクターで野生タイプbcl-xL 及びbcl-xL の
非機能的突然変異型Ｇ１３８Ａをコード化するベクターによって形質転換された
。S. sclerotiorum への曝露の後。In addition, plants encoding the three transgenes, Ced-9, Bcl-2, and IAP, can be used in a manner similar to that described for S. sclerotiorum in the manner described for Cercospora nicoti.
Both anae (Figure 19) and Glomerella cingulata were resistant (data not shown). Finally, the plant was transformed with the same parental vector as above with a vector encoding wild-type bcl-xL and a non-functional mutant G138A of bcl-xL. After exposure to S. sclerotiorum.

【０１４５】 実施例 VIII 形質転換されたタバコ・ラインからのＲＮＡの単離とブロッティング 形質転換されたタバコ・プラントの再生されたカナマイシン抵抗性株が、ＲＮ
Ａサンプルを問題のアポトーシス経路タンパク質をコード化する遺伝子を包含す
る放射性標識されたプローブとハイブリダイズさせることによって分析された、
Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2, 603-618, 1990。Example VIII Isolation and Blotting of RNA from Transformed Tobacco Line The regenerated kanamycin resistant strain of the transformed tobacco plant was
A sample was analyzed by hybridizing it to a radiolabeled probe containing the gene encoding the apoptosis pathway protein of interest;
Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2, 603-618, 1990.

【０１４６】 形質転換されたタバコ・プラントの葉からの全ＲＮＡは、Strommer et al., i
n: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, pp. 46-65, Crc
Press, Boca Raton, FL., 1993 に記述されているように単離された。ほぼ600
乃至700 mgの葉を切り取り、中央脈を除去し、葉を氷に載せる。葉は、液体窒素
で凍結させてすりつぶし、マイクロセントリフュージ・チューブに移される。１
ｍｌのＴＲＩｚｏｌを加え、葉を放置して解凍する。サンプルを室温で５分間培
養し、その後0.2 ｍｌのクロロホルムを加え、混合し、その後さらに３分間培養
する。次ぎに、サンプルを、４℃で15分間、12,000×g で回転させ、上澄みを別
のチューブに移す。上澄みに、0.5 ｍｌのイソプロピルアルコールを加え、得ら
れた溶液を穏やかに攪拌し、10 分間室温で培養する。次ぎに、サンプルを４℃
で10分間、12,000×g で回転させ、上澄みを除去する。ペレットを１ｍｌの75
％エタノールで洗浄して穏やかに攪拌する。洗浄したペレットを、４℃で５分間
、7,500×g で回転させ、上澄みを除去し、得られたペレットを３乃至５分間真
空乾燥するか、又は10分間室温で放置乾燥させる。その後、20 乃至50 μｌのＤ
ＥＰＣ Ｈ2Ｏ又はFormamide を加え、55℃で10 分間培養する。その後、サンプ
ルは、使用するか、−80℃で必要になるまで保管する。Total RNA from leaves of transformed tobacco plants was obtained from Strommer et al., I.
n: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, pp. 46-65, Crc
Isolated as described in Press, Boca Raton, FL., 1993. Almost 600
Cut ~ 700 mg leaves, remove central vein, and place leaves on ice. Leaves are frozen and ground with liquid nitrogen and transferred to microcentrifuge tubes. 1
Add ml of TRIzol and leave the leaves to thaw. The samples are incubated at room temperature for 5 minutes, then 0.2 ml of chloroform is added, mixed and then incubated for a further 3 minutes. The sample is then spun at 12,000 xg for 15 minutes at 4 ° C and the supernatant is transferred to another tube. 0.5 ml of isopropyl alcohol is added to the supernatant, and the resulting solution is gently stirred and incubated for 10 minutes at room temperature. Next, sample at 4 ° C
Spin at 12,000 xg for 10 minutes and remove the supernatant. Pellet 1 ml of 75
Wash with 10% ethanol and gently stir. The washed pellet is spun at 7,500 × g for 5 minutes at 4 ° C., the supernatant is removed, and the resulting pellet is vacuum dried for 3-5 minutes or left to dry at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 20 to 50 μl of D
Add EPC H2O or Formamide and incubate at 55 ° C for 10 minutes. The samples are then used or stored at -80 ° C until needed.

【０１４７】 ＲＮＡ試料は標準的な手順でゲル電気泳動を用いて分解され、ハイブリダイゼ
ーションのために膜に移される。（Sambrook et al., 前出）。最初に、膜は、
（12.5 ｍｌ,1Ｍ ＮａＨＰＯ4 ｐＨ7.2, 0.25 ｇＢＳＡ，50μｌＥＤＴＡ（0.5
Ｍストック）、1.75g ＳＤＳ及びｄｄＨ2Ｏ で 25 ｍｌ（約11.5 ｍｌ）に）を
含む25 ｍｌの溶液で65℃のロータリー・オーブンで１時間予備ハイブリダイゼ
ーションされる。プローブが32Ｐ-ｄＣＴＰによるklenow ラベリングによって調
製される。このプローブを、次ぎに、直接ハイブリダイゼーション溶液に加え、
回転オーブンの中で65 ℃で一晩培養する。膜を室温で10 分間50 ｍｌの低スト
リンジェンシー洗浄液（２ｍｌ１Ｍ ＮａＨＰＯ4 ｐＨ7.2, 0.25 ｇＢＳＡ，100
μｌＥＤＴＡ（0.5 Ｍストック）、2.5g ＳＤＳ及びｄｄＨ2Ｏ で 50 ｍｌに）
で洗浄する。次ぎに、膜を、室温で10 分間一回、65℃で10 分間二回、50 ｍｌ
の高ストリンジェンシー洗浄液（８ｍｌ１Ｍ ＮａＨＰＯ4，ｐＨ7.2，400μｌＥ
ＤＴＡ（0.5 Ｍストック）２ｇＳＤＳ，及びｄｄＨ2Ｏ で 200 ｍｌに）で洗浄
する。次ぎに、膜は、Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルムに−80℃で5乃至10時間増感
スクリーンを用いて露出される。[0147] RNA samples are resolved using gel electrophoresis in standard procedures and transferred to a membrane for hybridization. (Sambrook et al., Supra). First, the membrane
(12.5 ml, 1 M NaHPO 4 pH 7.2, 0.25 g BSA, 50 μl EDTA (0.5
M stock), is 1 hour prehybridization at 65 ° C. Rotary oven with a solution 25 ml of including in 25 ml at 1.75 g SDS and ddH 2 O (about 11.5 ml)). Probes are prepared by klenow labeling with 32 P-dCTP. This probe is then added directly to the hybridization solution,
Incubate overnight at 65 ° C in a rotating oven. The membrane was washed for 10 minutes at room temperature with 50 ml of low stringency wash (2 ml 1 M NaHPO 4 pH 7.2, 0.25 g BSA, 100
μl EDTA (0.5 M stock), 2.5 g SDS and ddH 2 O to 50 ml)
Wash with. The membrane was then washed once at room temperature for 10 minutes, twice at 65 ° C for 10 minutes, 50 ml
High stringency wash (8 ml 1 M NaHPO 4 , pH 7.2, 400 μl
It washed with DTA in (0.5 M stock) 2gSDS, and 200 ml in ddH 2 O). Next, the membrane is exposed to X-OMAT AR film at -80 ° C for 5-10 hours using an intensifying screen.

【０１４８】 上述したことから、この明細書では説明のために本発明の特定の実施形態が記
述されているが、本発明の精神と範囲から逸脱することなくいろいろな変更を加
えることができるということは理解されるであろう。したがって、本発明は、添
付された特許請求の範囲による以外には限定されない。 本出願で引用された学術雑誌論文、特許、及び特許出願、を含む全ての参照文
献は参照によって本明細書にその全体が取り入れられる。From the foregoing, while specific embodiments of the present invention are described herein by way of explanation, various modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention. It will be understood. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims. All references, including journal articles, patents, and patent applications, cited in the present application are hereby incorporated by reference in their entirety.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１Ａ】 図１Ａは、IAP をコード化する核酸分子を含むプラスミドの模式的な表現であ
る。FIG. 1A is a schematic representation of a plasmid containing a nucleic acid molecule encoding IAP.

【図１Ｂ】 図１Ｂは、IAP をコード化する核酸分子を含むプラスミドの模式的な表現であ
る。FIG. 1B is a schematic representation of a plasmid containing a nucleic acid molecule encoding IAP.

【図２Ａ】 図２Ａは、Bcl-2 をコード化する核酸分子を含むプラスミドの模式的な表現で
ある。FIG. 2A is a schematic representation of a plasmid containing a nucleic acid molecule encoding Bcl-2.

【図２Ｂ】 図２Ｂは、Bcl-2 をコード化する核酸分子を含むプラスミドの模式的な表現で
ある。FIG. 2B is a schematic representation of a plasmid containing a nucleic acid molecule encoding Bcl-2.

【図３Ａ】 図３Ａは、Ced-9 をコード化する核酸分子を含むプラスミドの模式的な表現で
ある。FIG. 3A is a schematic representation of a plasmid containing a nucleic acid molecule encoding Ced-9.

【図３Ｂ】 図３Ｂは、Ced-9 をコード化する核酸分子を含むプラスミドの模式的な表現で
ある。FIG. 3B is a schematic representation of a plasmid containing a nucleic acid molecule encoding Ced-9.

【図４Ａ】 図４Ａは、E1B-19K をコード化する核酸分子を含むプラスミドの模式的な表現
である。FIG. 4A is a schematic representation of a plasmid containing a nucleic acid molecule encoding E1B-19K.

【図４Ｂ】 図４Ｂは、E1B-19K をコード化する核酸分子を含むプラスミドの模式的な表現
である。FIG. 4B is a schematic representation of a plasmid containing a nucleic acid molecule encoding E1B-19K.

【図５】 図５は、形質転換されたタバコ・プラントにおける導入遺伝子の発現のノーザ
ン・ブロット分析を表す走査画像である。レーン１−３は、別々のタバコ・プラ
ントにおけるIAP の発現を表し、レーン４は、対照ベクターで形質転換されたあ
るタバコ・プラントにおける発現を表し、レーン５−６は、別々のタバコ・プラ
ントにおける Ced-9 の発現を表す。FIG. 5 is a scanned image depicting Northern blot analysis of transgene expression in transformed tobacco plants. Lanes 1-3 represent IAP expression in separate tobacco plants, lane 4 represents expression in one tobacco plant transformed with a control vector, and lanes 5-6 represent expression in separate tobacco plants. Indicates the expression of Ced-9.

【図６】 図６は、三つの遺伝子導入タバコ・ライン（Ａ、Ｃ、Ｄ）及び対照ライン（Ｂ
）にSclerotinia sclerotiorum を接種した後の葉の形態の写真である。FIG. 6 shows three transgenic tobacco lines (A, C, D) and a control line (B
4) is a photograph of leaf morphology after inoculation of Sclerotinia sclerotiorum.

【図７】 図７は、野生タイプ対照（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び二つのIAP 発現遺伝子導入タバコ
・ライン（ＤとＥ）にタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）を接種した後の葉
の形態の写真である。FIG. 7 shows leaf morphology after inoculation of wild-type controls (A, B, C) and two IAP-expressing transgenic tobacco lines (D and E) with tobacco mosaic virus (TMV). It is a photograph of.

【図８】 図８は、Bcl-2 を含む一次タバコ形質転換体（Glurk株）のノーザン・ブロッ
ト分析を表す走査画像である。レーン２，３，５，及び７は、Bcl-2発現を示し
ているが、対照レーンは、Bcl-2挿入なしのベクター（G115）による形質転換を
表している。FIG. 8 is a scanned image showing a Northern blot analysis of primary tobacco transformants containing Bcl-2 (Glurk strain). Lanes 2, 3, 5, and 7 show Bcl-2 expression, while control lanes represent transformation with the vector without Bcl-2 insertion (G115).

【図９】 図９は、Ced-9 を含む一次タバコ形質転換体のノーザン・ブロット分析を表す
走査画像である。レーン４と８は発現を示している。FIG. 9 is a scanned image showing Northern blot analysis of primary tobacco transformants containing Ced-9. Lanes 4 and 8 show expression.

【図１０Ａ】 図１０Ａは、Bcl-2を含むタバコにＴＭＶを接種した後の葉の形態の写真であ
る。中央の葉は野生株であるが、他の葉は別々のBcl-2を含むタバコ・プラント
から得られたものである。FIG. 10A is a photograph of leaf morphology after inoculating TMV into tobacco containing Bcl-2. The middle leaf is a wild strain, while the other leaves are obtained from a separate Bcl-2 containing tobacco plant.

【図１０Ｂ】 図１０Ｂは、Bcl-2を含むタバコにＴＭＶを接種した後の葉の形態の写真であ
る。中央の葉は野生株であるが、他の葉は別々のBcl-2を含むタバコ・プラント
から得られたものである。FIG. 10B is a photograph of leaf morphology after inoculating TMV into tobacco containing Bcl-2. The middle leaf is a wild strain, while the other leaves are obtained from a separate Bcl-2 containing tobacco plant.

【図１１Ａ】 図１１Ａは、Bcl-2又はCed-9 遺伝子を含むＮ遺伝子含有（Ａ）及びＮ遺伝子
不在（Ｂ）タバコ・ラインにおけるＴＭＶ発現のウエスタン・ブロット分析の走
査画像である。ＢはBcl-2、ＣはCed-9 、ＴはＴＭＶ、そしてＡは接種部位に隣
接する部分から採取された葉のサンプルを表す。FIG. 11A is a scanned image of a Western blot analysis of TMV expression in an N gene-containing (A) and N gene-free (B) tobacco line containing the Bcl-2 or Ced-9 gene. B represents Bcl-2, C represents Ced-9, T represents TMV, and A represents a leaf sample taken from the portion adjacent to the inoculation site.

【図１１Ｂ】 図１１Ｂは、Bcl-2又はCed-9 遺伝子を含むＮ遺伝子含有（Ａ）及びＮ遺伝子
不在（Ｂ）タバコ・ラインにおけるＴＭＶ発現のウエスタン・ブロット分析の走
査画像である。ＢはBcl-2、ＣはCed-9 、ＴはＴＭＶ、そしてＡは接種部位に隣
接する部分から採取された葉のサンプルを表す。FIG. 11B is a scanned image of Western blot analysis of TMV expression in N gene-containing (A) and N gene-free (B) tobacco lines containing Bcl-2 or Ced-9 genes. B represents Bcl-2, C represents Ced-9, T represents TMV, and A represents a leaf sample taken from the portion adjacent to the inoculation site.

【図１２】 図１２は、トマト斑点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）を接種した後の Bcl-
2及びCed-9 を含むタバコ・プラントの葉の形態の写真である。上及び下右の葉
は対照であり、上左の葉はCed-9 を含むGlurk 株であり、下左の葉はCed-9 を含
むTurkish 株である。FIG. 12 shows Bcl- after inoculation of tomato spot blight virus (TSWV).
2 is a photograph of leaf form of a tobacco plant containing 2 and Ced-9. The upper and lower right lobes are controls, the upper left lobe is a Glurk strain containing Ced-9, and the lower left lobe is a Turkish strain containing Ced-9.

【図１３】 図１３は、自植の遺伝子導入タバコ・プラントの Ced-9 発現のノーザン・ブ
ロット分析の走査画像である。レーン１−４は、個々の後代プラントである。FIG. 13 is a scanned image of Northern blot analysis of Ced-9 expression in an indigenous transgenic tobacco plant. Lanes 1-4 are individual progeny plants.

【図１４Ａ】 図１４Ａは、自植の遺伝子導入タバコ・プラントの葉の形態の写真である。１
４Ａは、Bcl-2 を含むプラントのＴＭＶに対する抵抗性を示し、中央の葉はポジ
ティブ対照である。１４Ｂは、Ced-9 を含むプラントのＴＭＶに対する抵抗性を
示し、１４Ｃは、Ced-9 を含むプラントのＴＳＷＶに対する抵抗性を示している
。FIG. 14A is a photograph of a leaf morphology of a self-planted transgenic tobacco plant. 1
4A shows the resistance of plants containing Bcl-2 to TMV, the middle leaf is the positive control. 14B shows the resistance of the plant containing Ced-9 to TMV, and 14C shows the resistance of the plant containing Ced-9 to TSWV.

【図１４Ｂ】 図１４Ｂは、自植の遺伝子導入タバコ・プラントの葉の形態の写真である。１
４Ａは、Bcl-2 を含むプラントのＴＭＶに対する抵抗性を示し、中央の葉はポジ
ティブ対照である。１４Ｂは、Ced-9 を含むプラントのＴＭＶに対する抵抗性を
示し、１４Ｃは、Ced-9 を含むプラントのＴＳＷＶに対する抵抗性を示している
。FIG. 14B is a photograph of the leaf morphology of a self-planted transgenic tobacco plant. 1
4A shows the resistance of plants containing Bcl-2 to TMV, the middle leaf is the positive control. 14B shows the resistance of the plant containing Ced-9 to TMV, and 14C shows the resistance of the plant containing Ced-9 to TSWV.

【図１４Ｃ】 図１４Ｃは、自植の遺伝子導入タバコ・プラントの葉の形態の写真である。１
４Ａは、Bcl-2 を含むプラントのＴＭＶに対する抵抗性を示し、中央の葉はポジ
ティブ対照である。１４Ｂは、Ced-9 を含むプラントのＴＭＶに対する抵抗性を
示し、１４Ｃは、Ced-9 を含むプラントのＴＳＷＶに対する抵抗性を示している
。FIG. 14C is a photograph of a leaf morphology of a self-planted transgenic tobacco plant. 1
4A shows the resistance of plants containing Bcl-2 to TMV, the middle leaf is the positive control. 14B shows the resistance of the plant containing Ced-9 to TMV, and 14C shows the resistance of the plant containing Ced-9 to TSWV.

【図１５】 図１５は、S. sclerotiorum が接種された葉の形態の写真である。下の葉は野
生株の対照、上の葉はCed-9 を含むものである。FIG. 15 is a photograph showing the form of leaves inoculated with S. sclerotiorum. The lower leaf contains a wild-type control, and the upper leaf contains Ced-9.

【図１６Ａ】 図１６Ａは、Sclerotinia を接種した後の、自植の遺伝子導入Bcl-2 を含むプ
ラント（Ａ）及びCed-9 を含むプラント（Ｂ）の葉の形態の写真である。FIG. 16A is a photograph of leaf morphology of a plant (A) containing self-planted transgenic Bcl-2 and a plant (B) containing Ced-9 after inoculation with Sclerotinia.

【図１６Ｂ】 図１６Ｂは、Sclerotinia を接種した後の、自植の遺伝子導入Bcl-2 を含むプ
ラント（Ａ）及びCed-9 を含むプラント（Ｂ）の葉の形態の写真である。FIG. 16B is a photograph of leaf morphology of a plant (A) containing self-transplanted transgenic Bcl-2 and a plant (B) containing Ced-9 after inoculation with Sclerotinia.

【図１７Ａ】 図１７Ａは、Botrytis cinerea を接種されたBcl-2 を含むタバコ・ライン（
Ａ）及びCed-9 を含むタバコ・ライン（Ｂ）の葉の形態の写真である。FIG. 17A shows a tobacco line containing Bcl-2 inoculated with Botrytis cinerea (
FIG. 3A is a photograph of the leaf morphology of a tobacco line (A) containing Ced-9.

【図１７Ｂ】 図１７Ｂは、Botrytis cinerea を接種されたBcl-2 を含むタバコ・ライン（
Ａ）及びCed-9 を含むタバコ・ライン（Ｂ）の葉の形態の写真である。FIG. 17B shows a tobacco line containing Bcl-2 inoculated with Botrytis cinerea (
FIG. 3A is a photograph of the leaf morphology of a tobacco line (A) containing Ced-9.

【図１７Ｃ】 図１７Ｃは、Botrytis cinerea を接種されたBcl-2 を含むタバコ・ライン（
Ａ）及びCed-9 を含むタバコ・ライン（Ｂ）の葉の形態の写真である。FIG. 17C shows a tobacco line containing Bcl-2 inoculated with Botrytis cinerea (
FIG. 3A is a photograph of the leaf morphology of a tobacco line (A) containing Ced-9.

【図１８】 図１８は、Sclerotinia に抵抗性を有するプラント（レーン５−７）及び抵抗
性のないプラント（レーン１−４）におけるCed-9 発現のノーザン・ブロット分
析の走査画像である。FIG. 18 is a scanning image of Northern blot analysis of Ced-9 expression in a plant resistant to Sclerotinia (lanes 5-7) and a plant without resistance (lanes 1-4).

【図１９】 図１９は、Cercospora nicotianae を接種した後の、Bcl-2, IAP, Ced-9, E1B 19K 及び対照（ベクターのみ）の、それぞれ左から右に、葉の形態の写真であ
る。FIG. 19 is a photograph of the leaf morphology of Bcl-2, IAP, Ced-9, E1B 19K and a control (vector only) after inoculation with Cercospora nicotianae, from left to right.

【図２０Ａ】 図２０Ａは、Bcl-xL を含むタバコ・プラントの葉の形態の写真である。２０
Ａでは、一番上の葉はBcl-xLでG138A 突然変異を含み、一番下の葉は野生株のBc
l-xLを含む。２０Ｂでは、左側の葉はBcl-xLにG138A 突然変異を含み、右側の葉
は野生株のBcl-xLを含む。FIG. 20A is a photograph of a leaf morphology of a tobacco plant containing Bcl-xL. 20
In A, the top leaf is Bcl-xL containing the G138A mutation and the bottom leaf is the wild-type Bc
Including l-xL. In 20B, the left leaf contains the G138A mutation in Bcl-xL and the right leaf contains the wild-type Bcl-xL.

【図２０Ｂ】 図２０Ｂは、Bcl-xL を含むタバコ・プラントの葉の形態の写真である。２０
Ａでは、一番上の葉はBcl-xLでG138A 突然変異を含み、一番下の葉は野生株のBc
l-xLを含む。２０Ｂでは、左側の葉はBcl-xLにG138A 突然変異を含み、右側の葉
は野生株のBcl-xLを含む。FIG. 20B is a photograph of a leaf morphology of a tobacco plant containing Bcl-xL. 20
In A, the top leaf is Bcl-xL containing the G138A mutation and the bottom leaf is the wild-type Bc
Including l-xL. In 20B, the left leaf contains the G138A mutation in Bcl-xL and the right leaf contains the wild-type Bcl-xL.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 CA06 CA17 CA19 CD06 CD14 4B024 AA08 BA21 BA80 CA04 CA05 DA01 EA04 FA02 GA11 HA01 HA20 4B063 QA06 QA07 QQ08 QQ09 QQ42 QR32 QR55 QS34 4B065 AA11X AA11Y AA88X AA99Y AB01 AC20 BA02 CA53 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12R 1:91) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI) , FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN , TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, S, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU , LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF terms (reference) 2B030 AA02 AB03 AD04 CA06 CA17 CA19 CD06 CD14 4B024 AA08 BA21 BA80 CA04 CA05 DA01 EA04 FA02 GA11 HA01 HA20 4B063 QA06 QA07 QQ08 QQ QQ QR55 QS34 4B065 AA11X AA11Y AA88X AA99Y AB01 AC20 BA02 CA53

Claims (79)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 生物学的に機能的なアポトーシス経路タンパク質又はその機
能的な変異体をコード化する少なくとも一つの異種ヌクレオチド配列を含む植物
細胞を有する遺伝子導入植物。1. A transgenic plant comprising a plant cell comprising at least one heterologous nucleotide sequence encoding a biologically functional apoptotic pathway protein or a functional variant thereof. 【請求項２】 さらに、前記ヌクレオチド配列によってコード化される生物
学的に機能的なアポトーシス経路タンパク質を有する、請求項１に記載の遺伝子
導入植物。2. The transgenic plant according to claim 1, further comprising a biologically functional apoptosis pathway protein encoded by the nucleotide sequence. 【請求項３】 前記ヌクレオチド配列が抗アポトーシス・タンパク質をコー
ド化していることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子導入植物。3. The transgenic plant according to claim 1, wherein the nucleotide sequence encodes an anti-apoptotic protein. 【請求項４】 該抗アポトーシス・タンパク質が、Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL,
IAP,及びE1B 19Kから成る群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載
の遺伝子導入植物。4. The method of claim 1, wherein the anti-apoptotic protein is Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL,
The transgenic plant according to claim 3, wherein the plant is selected from the group consisting of IAP, and E1B 19K. 【請求項５】 前記抗アポトーシス・タンパク質が、Ced-9又はBcl-2である
ことを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子導入植物。5. The transgenic plant according to claim 3, wherein the anti-apoptotic protein is Ced-9 or Bcl-2. 【請求項６】 前記ヌクレオチド配列が組織特異的なプロモーターを含むこ
とを特徴とする、請求項１又は３に記載の遺伝子導入植物。6. The transgenic plant according to claim 1, wherein the nucleotide sequence contains a tissue-specific promoter. 【請求項７】 前記組織特異的なプロモーターが、アルファ・アミラーゼ・
プロモーター、パタチン・プロモーター、及びグルテニン・プロモーターから成
る群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の遺伝子導入植物。7. The method according to claim 7, wherein the tissue-specific promoter is alpha-amylase.
The transgenic plant according to claim 6, wherein the plant is selected from the group consisting of a promoter, a patatin promoter, and a glutenin promoter. 【請求項８】 前記ヌクレオチド配列が誘導プロモーターを含むことを特徴
とする、請求項１又は３に記載の遺伝子導入植物。8. The transgenic plant according to claim 1, wherein the nucleotide sequence contains an inducible promoter. 【請求項９】 前記誘導プロモーターが傷誘導プロモーター、アルコール・
デヒドロゲナーゼ・プロモーター、及びチャルコン・シンターゼ・プロモーター
から成る群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の遺伝子導入植物
。9. The inducible promoter is a wound-inducible promoter,
The transgenic plant according to claim 8, wherein the plant is selected from the group consisting of a dehydrogenase promoter and a charcon synthase promoter. 【請求項１０】 前記ヌクレオチド配列が構成プロモーターを含むことを特
徴とする、請求項１又は３に記載の遺伝子導入植物。10. The transgenic plant according to claim 1, wherein the nucleotide sequence contains a constitutive promoter. 【請求項１１】 前記構成プロモーターがアデニン・メチル・トランスフェ
ラーゼ・プロモーター、３５Ｓプロモーター、及びユビキチン・プロモーターか
ら成る群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の遺伝子導入植物
。11. The transgenic plant according to claim 10, wherein the constitutive promoter is selected from the group consisting of an adenine methyltransferase promoter, a 35S promoter, and a ubiquitin promoter. 【請求項１２】 該アポトーシス経路タンパク質が、caspase、rev-caspase
、Bcl-2ファミリー・メンバー、Apaf-1、Bad、Bax、Ced-9 及びCed-4 から成る
群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子導入植物。12. The apoptosis pathway protein is caspase, rev-caspase.
The transgenic plant according to claim 1, wherein the plant is selected from the group consisting of: Bcl-2 family member, Apaf-1, Bad, Bax, Ced-9 and Ced-4. 【請求項１３】 前記植物が双子葉植物であることを特徴とする、請求項１
に記載の遺伝子導入植物。13. The method according to claim 1, wherein the plant is a dicotyledonous plant.
2. The transgenic plant according to item 1. 【請求項１４】 前記植物が単子葉植物であることを特徴とする、請求項１
に記載の遺伝子導入植物。14. The plant according to claim 1, wherein the plant is a monocotyledonous plant.
2. The transgenic plant according to item 1. 【請求項１５】 前記植物が生物的攻撃抵抗性であることを特徴とする、請
求項１に記載の遺伝子導入植物。15. The transgenic plant according to claim 1, wherein the plant is resistant to biological attack. 【請求項１６】 該生物的攻撃が昆虫によって誘発されることを特徴とする
、請求項１５に記載の遺伝子導入植物。16. The transgenic plant according to claim 15, wherein said biological attack is induced by an insect. 【請求項１７】 該生物的攻撃が病原体によって誘発されることを特徴とす
る、請求項１５に記載の遺伝子導入植物。17. The transgenic plant according to claim 15, wherein said biological attack is induced by a pathogen. 【請求項１８】 前記病原体が、カビ、線虫、バクテリア、及びウイルスか
ら成る群から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の遺伝子導入植物
。18. The transgenic plant according to claim 17, wherein said pathogen is selected from the group consisting of molds, nematodes, bacteria, and viruses. 【請求項１９】 前記病原体がウイルスであることを特徴とする、請求項１
７に記載の遺伝子導入植物。19. The method according to claim 1, wherein the pathogen is a virus.
8. The transgenic plant according to 7. 【請求項２０】 前記ウイルスがタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）、
タバコ壊死ウイルス（ＴＮＶ）、タバコ・エッチ・ウイルス（ＴＥＶ）、及びト
マト斑点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）から成る群から選択されることを特徴
とする、請求項１９に記載の遺伝子導入植物。20. The virus according to claim 1, wherein the virus is tobacco mosaic virus (TMV);
20. The transgenic plant according to claim 19, wherein the plant is selected from the group consisting of tobacco necrosis virus (TNV), tobacco etch virus (TEV), and tomato spot blight virus (TSWV). 【請求項２１】 前記病原体が真菌（カビ）であることを特徴とする、請求
項１７に記載の遺伝子導入植物。21. The transgenic plant according to claim 17, wherein the pathogen is a fungus (mold). 【請求項２２】 前記カビがSclerotinia sclerotiorum であることを特徴
とする、請求項２１に記載の遺伝子導入植物。22. The transgenic plant according to claim 21, wherein the mold is Sclerotinia sclerotiorum. 【請求項２３】 前記カビが、Sclerotinia sclerotiorum、 Botrytis cine
rea、 Cercospora nicotianae、及びGlomerella cingulata から成る群から選択
されることを特徴とする、請求項２１に記載の遺伝子導入植物。23. The method according to claim 20, wherein the mold is Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cine.
The transgenic plant according to claim 21, which is selected from the group consisting of rea, Cercospora nicotianae, and Glomerella cingulata. 【請求項２４】 前記植物が非生物的攻撃抵抗性であることを特徴とする、
請求項１に記載の遺伝子導入植物。24. The plant, wherein the plant is resistant to abiotic attack.
The transgenic plant according to claim 1. 【請求項２５】 該非生物的攻撃が、高水分、低水分、塩分、栄養欠乏、大
気汚染、温度、土壌毒性、除草剤、及び殺虫剤から成る群から選択される作用因
によって誘発されることを特徴とする、請求項２４に記載の遺伝子導入植物。25. The abiotic attack is triggered by an agent selected from the group consisting of high moisture, low moisture, salt, nutrient deficiency, air pollution, temperature, soil toxicity, herbicides, and insecticides. The transgenic plant according to claim 24, characterized by the following. 【請求項２６】 前記植物の少なくとも一部は老化レベルの低下を示すこと
を特徴とする、請求項１に記載の遺伝子導入植物。26. The transgenic plant of claim 1, wherein at least some of said plants exhibit reduced levels of senescence. 【請求項２７】 生物学的に機能的なアポトーシス経路タンパク質又はその
機能的な変異体をコード化する異種ヌクレオチド配列を含む植物細胞。27. A plant cell comprising a heterologous nucleotide sequence encoding a biologically functional apoptotic pathway protein or a functional variant thereof. 【請求項２８】 さらに、前記ヌクレオチド配列によってコードー化される
生物学的に機能的なアポトーシス経路タンパク質を有する、請求項２７に記載の
植物細胞。28. The plant cell of claim 27, further comprising a biologically functional apoptosis pathway protein encoded by said nucleotide sequence. 【請求項２９】 前記ヌクレオチド配列が抗アポトーシス・タンパク質をコ
ード化することを特徴とする、請求項２７に記載の植物細胞。29. The plant cell according to claim 27, wherein said nucleotide sequence encodes an anti-apoptotic protein. 【請求項３０】 前記抗アポトーシス・タンパク質が、Ced-9, Bcl-2, Bcl-
xL,IAP, 及びE1B 19Kから成る群から選択されることを特徴とする、請求項２９
に記載の植物細胞。30. The anti-apoptotic protein is Ced-9, Bcl-2, Bcl-
30. The method of claim 29, wherein the member is selected from the group consisting of xL, IAP, and E1B 19K.
A plant cell according to item 1. 【請求項３１】 前記抗アポトーシス・タンパク質が、Ced-9 又は Bcl-2
であることを特徴とする請求項２９に記載の植物細胞。31. The anti-apoptotic protein is Ced-9 or Bcl-2.
30. The plant cell according to claim 29, wherein 【請求項３２】 前記ヌクレオチド配列が組織特異的なプロモーターを含む
ことを特徴とする、請求項２７又は２９に記載の植物細胞。32. The plant cell according to claim 27, wherein the nucleotide sequence contains a tissue-specific promoter. 【請求項３３】 前記組織特異的なプロモーターが、アルファ・アミラーゼ
・プロモーター、パタチン・プロモーター、及びグルテニン・プロモーターから
成る群から選択されることを特徴とする、請求項３２に記載の植物細胞。33. The plant cell according to claim 32, wherein said tissue-specific promoter is selected from the group consisting of an alpha amylase promoter, a patatin promoter, and a glutenin promoter. 【請求項３４】 前記ヌクレオチド配列が誘導プロモーターを含むことを特
徴とする、請求項２７又は２９に記載の植物細胞。34. The plant cell according to claim 27, wherein the nucleotide sequence includes an inducible promoter. 【請求項３５】 前記誘導プロモーターが傷誘導プロモーター、アルコール
・デヒドロゲナーゼ・プロモーター、及びチャルコン・シンターゼ・プロモータ
ーから成る群から選択されることを特徴とする、請求項３４に記載の植物細胞。35. The plant cell of claim 34, wherein the inducible promoter is selected from the group consisting of a wound inducible promoter, an alcohol dehydrogenase promoter, and a charcon synthase promoter. 【請求項３６】 前記ヌクレオチド配列が構成プロモーターを含むことを特
徴とする、請求項２７又は２９に記載の植物細胞。36. The plant cell according to claim 27, wherein the nucleotide sequence contains a constitutive promoter. 【請求項３７】 前記構成プロモーターがアデニン・メチル・トランスフェ
ラーゼ・プロモーター、３５Ｓプロモーター、及びユビキチン・プロモーターか
ら成る群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載の植物細胞。37. The plant cell according to claim 36, wherein said constitutive promoter is selected from the group consisting of an adenine methyltransferase promoter, a 35S promoter, and a ubiquitin promoter. 【請求項３８】 前記アポトーシス経路タンパク質が、caspase、rev-caspa
se、Bcl-2ファミリー・メンバー、Apaf-1、Bad、Bax、Ced-9 及びCed-4 から成
る群から選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の植物細胞。38. The apoptosis pathway protein comprises caspase, rev-caspa
28. The plant cell according to claim 27, which is selected from the group consisting of se, Bcl-2 family member, Apaf-1, Bad, Bax, Ced-9 and Ced-4. 【請求項３９】 前記植物細胞が双子葉植物細胞であることを特徴とする、
請求項２７に記載の植物細胞。39. The plant cell is a dicot plant cell,
A plant cell according to claim 27. 【請求項４０】 前記植物細胞が単子葉植物細胞であることを特徴とする、
請求項２７に記載の植物細胞。40. The plant cell is a monocotyledonous plant cell,
A plant cell according to claim 27. 【請求項４１】 前記植物細胞が生物的攻撃抵抗性であることを特徴とする
請求項２７に記載の植物細胞。41. The plant cell according to claim 27, wherein said plant cell is resistant to biological attack. 【請求項４２】 該生物的攻撃が昆虫によって誘発されることを特徴とする
、請求項４１に記載の植物細胞。42. The plant cell according to claim 41, wherein said biological attack is induced by an insect. 【請求項４３】 該生物的攻撃が病原体によって誘発されることを特徴とす
る、請求項４１に記載の植物細胞。43. The plant cell according to claim 41, wherein said biological attack is induced by a pathogen. 【請求項４４】 前記病原体が、カビ、線虫、バクテリア、及びウイルスか
ら成る群から選択されることを特徴とする、請求項４３に記載の植物細胞。44. The plant cell according to claim 43, wherein said pathogen is selected from the group consisting of molds, nematodes, bacteria, and viruses. 【請求項４５】 前記病原体がウイルスであることを特徴とする、請求項４
３に記載の植物細胞。45. The method according to claim 4, wherein the pathogen is a virus.
4. The plant cell according to 3. 【請求項４６】 前記ウイルスがタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）、
タバコ壊死ウイルス（ＴＮＶ）、タバコ・エッチ・ウイルス（ＴＥＶ）、及びト
マト斑点立ち枯れ病ウイルス（ＴＳＷＶ）から成る群から選択されることを特徴
とする請求項４５に記載の植物細胞。46. The virus, wherein the virus is tobacco mosaic virus (TMV);
46. The plant cell of claim 45, wherein the plant cell is selected from the group consisting of tobacco necrosis virus (TNV), tobacco etch virus (TEV), and tomato spot blight virus (TSWV). 【請求項４７】 前記病原体がカビであることを特徴とする請求項４３に記
載の植物細胞。47. The plant cell according to claim 43, wherein the pathogen is a mold. 【請求項４８】 前記カビが、Sclerotinia sclerotiorum、 Botrytis cine
rea、 Cercospora nicotianae、及びGlomerella cingulata から成る群から選択
されることを特徴とする、請求項４７に記載の植物細胞。48. The fungus is Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cine
49. The plant cell according to claim 47, wherein the plant cell is selected from the group consisting of rea, Cercospora nicotianae, and Glomerella cingulata. 【請求項４９】 前記病原体がカビSclerotinia sclerotiorum であること
を特徴とする、請求項４３に記載の植物細胞。49. The plant cell according to claim 43, wherein the pathogen is mold Sclerotinia sclerotiorum. 【請求項５０】 前記植物細胞が非生物的攻撃抵抗性であることを特徴とす
る、請求項２７に記載の植物細胞。50. The plant cell according to claim 27, wherein the plant cell is abiotic attack resistant. 【請求項５１】 該非生物的攻撃が、高水分、低水分、塩分、栄養欠乏、大
気汚染、温度、土壌毒性、除草剤、及び殺虫剤から成る群から選択される作用因
によって誘発されることを特徴とする、請求項５０に記載の植物細胞。51. The abiotic attack is triggered by an agent selected from the group consisting of high moisture, low moisture, salt, nutrient deficiency, air pollution, temperature, soil toxicity, herbicides, and insecticides. The plant cell according to claim 50, wherein: 【請求項５２】 前記植物細胞が老化レベルの低下を示すことを特徴とする
、請求項２７に記載の植物細胞。52. The plant cell of claim 27, wherein said plant cell exhibits a reduced level of senescence. 【請求項５３】 発芽して植物になることができる種子であって、生物学的
に機能的なアポトーシス経路をコード化することができる異種核酸配列をそのゲ
ノム内に有する種子。53. A seed that can germinate and become a plant, having a heterologous nucleic acid sequence in its genome that can encode a biologically functional apoptotic pathway. 【請求項５４】 生物学的に機能的な抗アポトーシス・タンパク質をコード
化する異種核酸配列を含む遺伝子導入生物的攻撃抵抗性植物。54. A transgenic, biologically resistant plant comprising a heterologous nucleic acid sequence encoding a biologically functional anti-apoptotic protein. 【請求項５５】 前記抗アポトーシス・タンパク質が、Ced-9, Bcl-2, Bcl-
xL, IAP, E1B 19K, 及びその相同体から成る群から選択されることを特徴とする
、請求項５４に記載の植物。55. The anti-apoptotic protein is Ced-9, Bcl-2, Bcl-
55. The plant of claim 54, wherein the plant is selected from the group consisting of xL, IAP, E1B 19K, and homologs thereof. 【請求項５６】 該生物的攻撃が病原体であることを特徴とする、請求項５
４に記載の植物。56. The method according to claim 5, wherein the biological attack is a pathogen.
4. The plant according to 4. 【請求項５７】 生物学的に機能的な抗アポトーシス・タンパク質をコード
化する異種核酸配列を含む遺伝子導入非生物的攻撃抵抗性植物。57. A transgenic abiotic challenge-resistant plant comprising a heterologous nucleic acid sequence encoding a biologically functional anti-apoptotic protein. 【請求項５８】 前記抗アポトーシス・タンパク質が、Ced-9, Bcl-2, Bcl-
xL, IAP, E1B 19K, 及びその機能的変異体から成る群から選択されることを特徴
とする、請求項５７に記載の植物。58. The anti-apoptotic protein is Ced-9, Bcl-2, Bcl-
58. The plant of claim 57, wherein the plant is selected from the group consisting of xL, IAP, E1B 19K, and functional variants thereof. 【請求項５９】 生物的又は非生物的抵抗性の遺伝子導入植物を生成する方
法であって： （ａ）生物学的に機能的なアポトーシス経路タンパク質をコード化する少なく
とも一つの異種核酸配列を含むベクターで植物細胞を形質転換させるステップ、
前記核酸配列はプロモーターと作用可能な状態で会合する； （ｂ）前記形質転換された植物細胞から植物を産生するステップ；及び （ｃ）生物的又は非生物的抵抗性を有する形質転換された植物を選択するステ
ップ； を含む方法。59. A method for producing a transgenic plant of biological or abiotic resistance comprising: (a) comprising at least one heterologous nucleic acid sequence encoding a biologically functional apoptotic pathway protein. Transforming a plant cell with the vector,
The nucleic acid sequence is operably associated with a promoter; (b) producing a plant from the transformed plant cell; and (c) a transformed plant having biological or abiotic resistance. Selecting the method. 【請求項６０】 該遺伝子導入植物が病原体抵抗性であることを特徴とする
、請求項５９に記載の方法。60. The method of claim 59, wherein said transgenic plant is pathogen resistant. 【請求項６１】 該形質転換するステップが物理的手段によるものであるこ
とを特徴とする、請求項５９に記載の方法。61. The method of claim 59, wherein said transforming is by physical means. 【請求項６２】 該形質転換するステップが化学的手段によるものであるこ
とを特徴とする、請求項５９に記載の方法。62. The method of claim 59, wherein said transforming is by chemical means. 【請求項６３】 前記植物細胞が、プロトプラスト、生殖体生成細胞、及び
完全植物にまで再生できる細胞から成る群から選択されることを特徴とする、請
求項５９に記載の方法。63. The method of claim 59, wherein the plant cells are selected from the group consisting of protoplasts, germ-forming cells, and cells that can regenerate into whole plants. 【請求項６４】 該プロモーターが構成プロモーターであることを特徴とす
る、請求項５９に記載の方法。64. The method of claim 59, wherein said promoter is a constitutive promoter. 【請求項６５】 該プロモーターが誘導プロモーターであることを特徴とす
る、請求項５９に記載の方法。65. The method of claim 59, wherein said promoter is an inducible promoter. 【請求項６６】 該プロモーターが組織特異的プロモーターであることを特
徴とする、請求項５９に記載の方法。66. The method according to claim 59, wherein said promoter is a tissue-specific promoter. 【請求項６７】 該植物が双子葉植物であることを特徴とする、請求項５９
に記載の方法。67. The plant according to claim 59, wherein said plant is a dicotyledonous plant.
The method described in. 【請求項６８】 該植物が単子葉植物であることを特徴とする、請求項５９
に記載の方法。68. The plant according to claim 59, wherein the plant is a monocotyledonous plant.
The method described in. 【請求項６９】 請求項５９の方法によって産生される植物。69. A plant produced by the method of claim 59. 【請求項７０】 請求項５９の方法によって産生される植物から得られる植
物組織。70. A plant tissue obtained from a plant produced by the method of claim 59. 【請求項７１】 植物におけるアポトーシスを修飾する方法であって： （ａ）植物細胞を、該植物細胞によっては通常産生されない生物学的に機能的
なアポトーシス経路タンパク質をコード化する核酸配列を含むベクターによって
形質転換させるステップ、前記核酸配列は誘導プロモーターと作用可能な状態で
会合する； （ｂ）該形質転換された植物細胞を、植物を形成するに適当な条件の下で培養
するステップ；及び （ｃ）該植物を、前記核酸配列の転写を誘発するに十分な条件及び時間、栽培
するステップ； を含む方法。71. A method for modifying apoptosis in a plant, comprising: (a) converting a plant cell to a nucleic acid sequence encoding a biologically functional apoptotic pathway protein not normally produced by the plant cell. (B) culturing the transformed plant cells under conditions suitable for forming a plant; and (b) culturing the transformed plant cells under conditions suitable for forming a plant. c) cultivating said plant under conditions and for a time sufficient to induce transcription of said nucleic acid sequence. 【請求項７２】 アポトーシス経路活性を有する植物遺伝子を同定する方法
であって： （ａ）動物細胞（単数又は複数）を植物ｃＤＮＡライブラリーによって形質転
換させるステップ、該ｃＤＮＡライブラリーの各メンバーはプロモーターと作用
可能な状態で会合する； （ｂ）形質転換された細胞（単数又は複数）にアポトーシス誘発因子を接触さ
せるステップ；及び （ｃ）前記細胞（単数又は複数）におけるアポトーシス活性を検出し、この活
性を対照細胞ラインと比較するステップ； を含み、アポトーシス活性の増加又は減少が該植物ｃＤＮＡライブラリーにおけ
るアポトーシス経路タンパク質をコード化する遺伝子の存在を示すことを特徴と
する方法。72. A method for identifying a plant gene having apoptotic pathway activity, comprising: (a) transforming animal cell (s) with a plant cDNA library, wherein each member of the cDNA library is a promoter. (B) contacting the transformed cell (s) with an apoptosis-inducing factor; and (c) detecting apoptotic activity in said cell (s); Comparing the activity to a control cell line, wherein an increase or decrease in apoptotic activity is indicative of the presence of a gene encoding an apoptotic pathway protein in the plant cDNA library. 【請求項７３】 該動物細胞が細胞死に対して身構えていることを特徴とす
る請求項７２に記載の方法。73. The method of claim 72, wherein said animal cells are prepared for cell death. 【請求項７４】 植物で機能するアポトーシス遺伝子を同定する方法であっ
て： （ａ）一つ以上の植物細胞を少なくとも一つの異種核酸分子によって形質転換
させるステップ、前記核酸分子は作用的にプロモーターと会合する； （ｂ）該形質転換された細胞にアポトーシス誘発因子を接触させるステップ；
及び （ｃ）前記細胞でアポトーシス活性を検出し、この活性を対照細胞ラインと比
較するステップを含み、アポトーシス活性の増加又は減少が、植物において機能
するアポトーシス経路遺伝子の存在を示すことを特徴とする方法。74. A method for identifying an apoptotic gene that functions in a plant, comprising: (a) transforming one or more plant cells with at least one heterologous nucleic acid molecule, wherein the nucleic acid molecule is operatively associated with a promoter. (B) contacting the transformed cell with an apoptosis-inducing factor;
And (c) detecting apoptotic activity in said cells and comparing this activity to a control cell line, wherein an increase or decrease in apoptotic activity is indicative of the presence of a functioning apoptotic pathway gene in the plant. Method. 【請求項７５】 該異種核酸分子が異種ｃＤＮＡライブラリーを含み、該ｃ
ＤＮＡライブラリーの各メンバーが作用的にプロモーターと関連していることを
特徴とする請求項７４に記載の方法。75. The heterologous nucleic acid molecule comprises a heterologous cDNA library;
75. The method of claim 74, wherein each member of the DNA library is operatively associated with a promoter. 【請求項７６】 アポトーシスの誘発因子は生物的攻撃であることを特徴と
する請求項７４に記載の方法。76. The method of claim 74, wherein the inducer of apoptosis is a biological attack. 【請求項７７】 該生物的攻撃が病原体であることを特徴とする請求項７６
に記載の方法。77. The method of claim 76, wherein said biological attack is a pathogen.
The method described in. 【請求項７８】 アポトーシスの誘発因子は非生物的攻撃であることを特徴
とする請求項７４に記載の方法。78. The method of claim 74, wherein the inducer of apoptosis is an abiotic attack. 【請求項７９】 生物学的に機能的なアポトーシス経路タンパク質の機能
的変異体をコード化する少なくとも一つの異種ヌクレオチド配列を含む植物細胞
を含む遺伝子導入植物。79. A transgenic plant comprising a plant cell comprising at least one heterologous nucleotide sequence encoding a functional variant of a biologically functional apoptosis pathway protein.
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