KR101035085B1

KR101035085B1 - 담배거세미나방 유래의 ｏｄｃ 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101035085B1
Application number: KR1020090063586A
Authority: KR
Inventors: 정성은
Original assignee: (주)넥스젠바이오텍; 한남대학교 산학협력단
Priority date: 2009-07-13
Filing date: 2009-07-13
Publication date: 2011-05-19
Also published as: KR20110006104A

Abstract

본 발명은 담배거세미나방 (Spodoptera litura) 유래의 ODC (ornithine decarboxylase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 효모에서 ODC 유전자를 녹아웃시켜 효모 세포의 증식을 저해하고, 폴리아민류 합성을 감소시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 효모, 및 ODC 녹아웃 효모에 상기 재조합 벡터로 형질전환시켜 효모 세포 증식 및 폴리아민류 합성을 정상적으로 회복시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 효모에 관한 것이다.

담배거세미나방, ornithine decarboxylase, 효모, 녹아웃, 폴리아민류

Description

담배거세미나방 유래의 ＯＤＣ 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도{Gene encoding ornithine decarboxylase protein from Spodoptera litura and uses thereof}

본 발명은 담배거세미나방 유래의 ODC 단백질 코딩 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

유해한 해충 및 병원균에 의한 농작물의 침해로 인한 식량난으로 인류는 생존까지도 위협받고 있다. 이러한 문제를 해결하고 나날이 진화되어 새롭게 등장하고 있는 해충 및 병원균으로부터 식물체를 보호하기 위한 다양한 방제법 중 가장 쉽고 간편한 식물병 방제법은 농약을 살포하는 것인데, 이는 맹독성이므로 유해 해충 및 병원균뿐만 아니라 주변 생태계 생물까지도 살상함으로써 생태계를 파괴시키고 토양 및 수질을 산성화시키는 등의 폐해가 있었다. 그에 따라 농약 살포 등의 화학적 방제수단 뿐만 아니라 식물의 환경 및 조건을 고려하여 무공해적인 생물학적 해충 방제기술의 개발에 대한 시급성과 필요성은 점차 증대되고 있다.

스퍼미딘(spermidine)과 스퍼민(spermine) 등 폴리아민류는 단백질과 핵산의 합성에서 필수적인 물질로서, 특히 신속히 분화하는 정소 등의 동물 조직에서 매우 높은 수준이 요구된다. 대부분의 생체 폴리아민류는 ODC (ornithine decarboxylase)의 작용으로 오르니틴으로부터 푸트레신(putrescine)이 만들어진 다음, 푸트레신으로부터 각종 폴리아민류가 합성된다. ODC Az (antizyme)은 ODC와 heterodimer를 형성함으로써 ODC 고유의 homodimer 형성을 방해하여 ODC를 불활성화시키는 한편, ODC-ODC Az heterodimer가 proteosome에 의해 분해됨에 따라 폴리아민류 생합성 과정이 차단된다.

ODC Az를 암호화하는 유전자는 그 open reading frame (ORF)의 전반 도메인 내에 종결 코돈 (TGA)이 존재하여 전 길이에 걸친 mRNA의 해독이 이루어지지 않다가, 스퍼미딘이 일정 수준 이상으로 상승할 경우에만 리보좀 상에서 염기 T가 제거되는 frame-shifting이 일어나면서 해독이 진행된다.

따라서, 곤충의 생체에서 ODC Az는 스퍼미딘의 수준이 과도하게 상승하지 않는 한 해독되어 발현되지 않으나, 만일 종결 코돈의 염기 T가 제거된 ORF가 이입된다면, ODC Az의 해독이 제어되지 않음에 따라 ODC의 활성이 억제되고 폴리아민류의 결핍 현상이 유도되어 정상적인 발생을 교란시킬 수 있다.

특히, 폴리아민류의 결핍 효과는 신속한 세포의 분열과 분화가 진행되는 정소에서의 정자형성 과정에 심각한 지장을 초래하여 생식기능에 장애를 갖는 불임성 개체를 발생시킬 수도 있다.

한국특허등록 제10-0722001호에는 오르니틴 데카복실라제 억제제의 모낭 전달용 국소 조성물이 개시되어 있으며, 미국특허 제5811634호에는 오르니틴 데카복실라제를 코딩하는 형질전환 동물이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 ODC Az를 이용하여 특정 해충 종의 ODC 활성을 억제시킴에 따라 생물학적으로 해충을 방제하는 기술을 개발하고자, 우선적으로 채소류의 주요 해충인 담배거세미나방 (Spodoptera litura)에서 ODC를 암호화하는 cDNA를 분리하고 이를 ODC 결핍 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에 형질도입시켜 곤충 ODC의 작용에 의해 유지되는 효모 균주를 제작함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 담배거세미나방 (Spodoptera litura) 유래의 ODC (ornithine decarboxylase) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 효모에서 ODC 유전자를 녹아웃시켜 효모 세포의 증식을 저해하고, 폴리아민류 합성을 감소시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 효모를 제공한다.

또한, 본 발명은 ODC 녹아웃 효모에 상기 재조합 벡터로 형질전환시켜 효모 세포 증식 및 폴리아민류 합성을 정상적으로 회복시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 효모를 제공한다.

본 발명을 통해 개발하고자 하는 새로운 아이디어의 해충방제 기술은 아직 전 세계적으로도 시도된 바 없는 것으로서, 성공적으로 과제가 수행될 경우 농업 현장에서 즉각적으로 사용 가능한 생물학적 살충제가 생산됨에 따라 세계적으로도 큰 경제적 가치가 있는 시장이 형성될 수 있다.

또한, 즉각적인 살충 효과는 기존의 화학적 살충제에 비해 다소 떨어질 수 있으나, 토양 및 환경에 잔존하여 반복적이고 만성적인 살충효과를 나타낼 수 있는 점에서 장기적으로는 기존의 살충제에 비해 한층 더 우수한 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 담배거세미나방 (Spodoptera litura) 유래의 ODC (ornithine decarboxylase) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 ODC 단백질의 범위는 담배거세미나방으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 ODC 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 ODC 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 ODC 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 효모 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사 용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백 시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는 상기 숙주세포는 효모(Saccharomyce cerevisiae)이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 효모의 ODC 유전자가 녹아웃되어 세포 증식이 저해되고, 폴리아민류 합성이 감소된 효모를 제공한다. 효모의 ODC 유전자(SPE1)를 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 녹아웃(knock-out)시킨 결과, 효모 세포의 증식이 저해를 받았으며, 폴리아민류의 합성이 감소되었다. 따라서, 본 발명은 또한, 효모에서 ODC 유전자를 녹아웃시키는 단계를 포함하는 효모 세포의 증식을 저해하고, 폴리아민류 합성을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 ODC 녹아웃 효모에 본 발명의 ODC 유전자 함유 재조합 벡터로 형질전환시켜 ODC 유전자를 과발현시킴으로써 세포 증식 및 폴리아민류 합성이 정상적으로 회복된 효모를 제공한다. 상기 효모의 ODC 유전자가 녹아웃되어 세포 증식이 저해되고, 폴리아민류 합성이 감소된 효모에 본 발명의 ODC 유전자를 과발현시킨 결과, 세포 증식 및 폴리아민류 합성이 정상적으로 회복되었다. 따라서, 본 발명은 또한, 효모에서 ODC 유전자를 녹아웃시키는 단계; 및 상기 ODC 녹아웃 효모에 본 발명의 ODC 유전자 함유 재조합 벡터로 형질전환시켜 ODC 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 효모 세포 증식 및 폴리아민류 합성을 정상적으로 회복시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 곤충 시료

각종 채소류 작물의 주요 해충인 담배거세미나방 (Spodoptera litura)의 유충을 growth chamber 내에서 배추를 먹이로 온도 25±1℃, 상대습도 60 % 및 광주기 16 : 8 (L : D)에서 사육하면서, 번데기 시기에 정소를 적출하고 100 mg 당 1 ml의 TRIzol reagent (Gibco BRL, USA)를 가하여 -70℃에서 보관하였다.

TRIzol reagent 속에 있는 정소 조직을 micro-pestle을 사용하여 파쇄한 후, TRIzol 1 ml 당 0.2 ml의 클로로포름을 가하여 15초 동안 강하게 shaking 한 다음, 원심분리 (12,000 xg, 15 min)를 실시하여 상층액을 분리하였다. 상층액에 이소프로판올을 가하여 진탕한 후, 다시 원심분리 (12,000 xg, 10 min) 하여 total RNA를 확보하였다. Total RNA 펠렛에 75 % 에탄올을 가하여 볼텍싱한 후 원심분리 (7,500 xg, 5 min) 하여 상층액을 제거한 다음, total RNA 펠렛을 실온에서 공기 건조시켰 다. Total RNA의 농도는 DEPC-H₂O로 total RNA 펠렛을 용해하여 spectrophotometer (Spectronic Genesys 5)를 이용하여 파장 260 nm에서 측정하였다.

Total RNA 200 ug을 1 ug Oligo (dT) 프라이머와 70℃에서 10 분간 반응시킨 후, 얼음 위에서 5 분간 정치한 다음, 제1가닥 5X 버퍼, RNasin ribonuclease inhibitor (40 유닛), 소듐 피로포스페이트(40 mM) 및 AMV 역전사효소 (30 유닛)를 첨가하여 42℃에서 1 시간 동안 반응시켜 제1가닥 cDNA를 합성하였다. 합성된 제1가닥 반응물 20 ul에 제2가닥 2.5X 버퍼, DNA 중합효소 (23 유닛) 및 RNase H (0.8 유닛)를 가하고 증류수를 이용 총 부피를 100 ul로 맞추어 14℃에서 2 시간 동안 반응시켰으며, 이 반응액을 다시 70℃에서 10 분간 가열한 다음 얼음에 정치시킨 상태에서 T4 DNA 중합효소 (2 유닛)를 가하여 37℃에서 10 분간 반응시킨 후, 200 mM의 EDTA (10 ul)를 첨가하여 반응을 종결시켰다. cDNA의 회수를 위하여 반응액에 동량의 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알콜 (25 : 24 : 1)을 첨가하여 볼텍싱 한 후, 원심분리 (15,000 rpm, 2 min) 하여 얻은 상등액에 0.1 부피의 2.5 M 소듐 아세테이트 (pH 5.2)와 2.5 부피의 100 % EtOH (-20℃)를 넣어 -70℃에서 30 분간 정치시켰다. 이어 원심분리 (15,000 rpm, 10 min)를 통해 침전시킨 cDNA 펠렛을 70 % EtOH (-20℃)로 washing 한 후 최종적으로 적정양의 DW에 용해시켰으며, spectrophotometer 파장 260 nm에서 cDNA의 농도를 측정하였다.

2. 담배거세미나방 ODC 코딩 cDNA 의 분리

2-1. ODC 코딩 cDNA의 partial domain 제작

ODC의 partial domain을 증폭시키기 위해 기존에 보고된 곤충류 ODC들의 염기 서열을 토대로 cDNA 주형 상에서 타겟 서열들을 혼성화하도록 5′유전자 특이적 프라이머 (5'-GGGCACTGGCTTCGATTGCGC-3'; 서열번호 3) 및 3′degenerate 프라이머 (5'-YYAYTTSAGSGCRCAYTCSAC-3'; 서열번호 4)를 제작하였다.

PCR은 표 1의 조건으로 MJ Resaech, Inc의 Model PTC-100 Programmable Thermal Cycler를 사용하여 0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl₂, 각 10 uM과 20 uM의 5' 및 3' 프라이머 pool및 100 ng cDNA 주형으로 이루어진 50 ul의 반응 부피로 실시하였으며, 이때 주형으로는 정소 조직에서 추출한 total RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 5 분간 preincubation 한 후 80℃에서 0.4 ul Taq 중합효소 (TaKaRa Ex-Taq)를 가함으로써 개시하였다. 증폭된 cDNA를 아가로스 겔 상에서의 전기영동을 통해 확인 (도 1) 및 정제한 다음, TA 클로닝 키트 (Invitrogen)를 사용하여 플라스미드 pCR 2.1 벡터에 삽입하여 그 염기서열을 분석함으로써 담배거세미나방 정소조직의 ODC cDNA (Slit ODC) 임을 확인하였다.

표 1. 담배거세미나방에서 ODC 코딩 cDNA의 partial domain을 증폭하기 위한 PCR thermal cyclization 프로파일

Preheating		95℃ for 5min	1 cycle
Annealing		80℃ for 5min	1 cycle
Reaction	Denaturation	95℃ for 1min	39 cycles
	Annealing	58℃ for 1min
	Extension	72℃ for 2min
Last extension		72℃ for 5min	1 cycle

2-2. ODC 코딩 cDNA의 5′및 3′말단 제작

구조 분석을 통해 ODC Az를 암호화하는 것으로 확인된 cDNA partial domain의 염기서열을 토대로, ORF의 5′및 3′말단들을 증폭시키기 위해 유전자 특이적 RACE 프라이머들을 제작하였다 (5' 프라이머, 5'-TGTCATTCCACGTGGGTAGCG-3'(서열번호 5); 3' 프라이머, 5'-GGGGAAGTGCTCCTCCAAAGC-3'(서열번호 6)).

RACE PCR은 Marathon cDNA 증폭 키트 (Clontech)를 이용하여 만든 Ap1 어댑터가 부착된 cDNA를 주형으로 하여 Hot Start Taq DNA 중합효소 (Takara)를 사용하여 수행하였다 (0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl₂, 각 10 uM 5′및 3′프라이머, 100 ng cDNA) (표 2). 양 말단을 충족하는 충분한 길이의 PCR 산물들을 전기영동을 통해 확인 (도 2) 및 정제하였으며, 이를 pCR2.1 벡터에 삽입하고 E. coli 에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

표 2. RACE PCR에서 thermal cyclization 프로파일

Preheating		94℃ for 5min	1 cycle
Annealing		80℃ for 5min	1 cycle
Preheating		94℃ for 30sec	1 cycle
Reaction	Denaturation	94℃ for 30sec	5 cycles
	Annealing	67℃ for 4min	5 cycles
	Denaturation	94℃ for 30sec	5 cycles
	Annealing	65℃ for 4min	5 cycles
	Denaturation	94℃ for 20sec	35 cycles
	Annealing	62℃ for 4min	35 cycles
Last extension		72℃ for 5min	1 cycle

2-3. ODC 코딩 cDNA의 전장(full length)- ORF cDNA 제작

RACE PCR을 통해 확인된 개시 코돈 (ATG)과 정지 코돈 (TGA)이 포함된 5' 및 3' 말단의 염기서열을 토대로 전장 ORF cDNA를 증폭시키기 위해 각 ORF들의 개 시 및 종결 부위에 상응하는 유전자 특이적 프라이머들을 제작하였으며 (5' 프라이머, 5'-ATGAAGGTCGTGGAA-3'(서열번호 7); 3' 프라이머, 5'-TCACTTGAGCGCGCACTC-3'(서열번호 8)), 이들을 이용하여 표 3의 조건으로 PCR을 실시하였다. 증폭된 전장 ORF cDNA들의 크기를 아가로스 겔 상에서 확인하고 (도 3), 각각 pCR2.1 벡터에 삽입 및 E. coli 에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다.

표 3. 전장 ODC ORF cDNA의 증폭을 위한 PCR thermal cyclization 프로파일

Preheating		95℃ for 5min	1 cycle
Annealing		80℃ for 5min	1 cycle
Reaction	Denaturation	95℃ for 1min	39 cycles
	Annealing	54℃ for 1min
	Extension	72℃ for 2min
Last extension		72℃ for 5min	1 cycle

2-4. 효모 발현 벡터로의 Slit ODC의 클로닝

pCR 벡터에 삽입되어 있는 Slit ODC cDNA를 EcoRI으로 절단하여 1.3 kb의 단편을 분리한 다음, EcoRI으로 절단한 p413GAL1 벡터에 라이게이션 하였다 (p413GAL-Slit ODC, 도 4). Slit ODC 유전자는 P413GAL1 벡터의 GAL1 프로모터에 의하여 갈락토스가 포함된 배지에서 전사되며, CYC1 터미네이터에 의하여 전사가 종결된다.

3. 담배거세미나방 ODC Az 코딩 cDNA 의 분리

3-1. ODC Az 코딩 cDNA의 partial domain 제작

ODC Az의 약 430 bp conserved core domain을 제작하기 위하여 기존에 보고 된 곤충류 ODC Az들의 염기 서열을 토대로 cDNA로부터 타겟 서열들을 혼성화하도록 프라이머들을 제작하였다 (5′프라이머, 5'-CTGTGGTGGTCCTGATGTTCC-3'(서열번호 9); 3′프라이머, 5'-CTCTTCGGCGAAATCCAGAG-3'(서열번호 10)). PCR은 표 4의 조건으로 0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl₂, 각 4 uM의 5' 및 3' 프라이머 pool과 100 ng cDNA 주형으로 이루어진 50 ul의 반응 부피로 실시하였고, 주형으로는 정소 조직에서 추출한 total RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하였으며, 95℃에서 5 분간 preincubation 한 후 80℃에서 0.4 ul Taq 중합효소 (TaKaRa Ex-Taq)를 가함으로써 개시하였다. 증폭된 cDNA를 아가로스 겔 상에서의 전기영동을 통해 확인한 후 (도 5), 상기와 같은 방법으로 염기서열을 분석하여 담배거세미나방 정소 조직의 ODC Az cDNA (Slit ODC Az) 임을 확인하였다.

표 4. 담배거세미나방에서 ODC Az 코딩 cDNA의 340 bp core domain을 증폭하기 위한 PCR thermal cyclization 프로파일

Preheating		95℃ for 5min	1 cycle
Annealing		80℃ for 5min	1 cycle
Reaction	Denaturation	95℃ for 1min	39 cycles
	Annealing	62℃ for 1min
	Extension	72℃ for 2min
Last extension		72℃ for 5min	1 cycle

3-2. ODC Az 코딩 cDNA의 5′및 3′말단 제작

구조 분석을 통해 ODC Az를 암호화하는 것으로 확인된 core domain cDNA의 염기서열을 토대로 유전자 특이적 RACE 프라이머들을 제작하고 (5' 프라이머, 5'-TCACCGAGTCCCAGTCTCCCA-3'(서열번호 11); 3' 프라이머; 5'-GCTTCTCTGCGTTGCTGGTGG- 3'(서열번호 12)), 상기와 같은 방법으로 RACE PCR을 수행하였다 (0.25 mM dNTPs, 0.2 mM MgCl₂, 각 10 uM 5′및 3′프라이머, 50 ng cDNA) (표 5). ORF의 양 말단을 충족하는 충분한 길이의 PCR 산물들을 전기영동을 통해 확인한 후 (도 6), 상기와 동일한 방법으로 pCR2.1 벡터에 삽입하고 E. coli 에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

표 5. RACE PCR에서 thermal cyclization 프로파일

Preheating		94℃ for 5min	1 cycle
Annealing		80℃ for 5min	1 cycle
Preheating		94℃ for 30sec	1 cycle
Reaction	Denaturation	94℃ for 30sec	5 cycles
	Annealing	68℃ for 4min	5 cycles
	Denaturation	94℃ for 30sec	5 cycles
	Annealing	66℃ for 4min	5 cycles
	Denaturation	94℃ for 20sec	35 cycles
	Annealing	64℃ for 4min	35 cycles
Last extension		72℃ for 5min	1 cycle

3-3. ODC Az 코딩 cDNA의 전장 ORF cDNA 제작

RACE PCR을 통해 확인된 개시 코돈 (ATG)과 정지 코돈 (TAA)이 정상적으로 포함된 5' 말단과 3' 말단의 염기서열을 토대로 전장 ORF cDNA를 증폭시키기 위해 각 ORF들의 개시 부위와 종결 부위의 염기서열에 상응하는 각 서열들에 BamHI 및 SacI 서열들을 5' 및 3' 말단에 첨가시킨 유전자 특이적 프라이머 쌍들을 제작하고 (5' 프라이머, 5'-GGGGGATCC ATGACGAAGTTAATACAACAA-3'(서열번호 13); 3' 프라이머, 5'-GGGGAGCTC TTACTGCATATTGTAGTGCAG-3'(서열번호 14)), 표 6의 조건에서 PCR을 실시하였다. PCR을 통해 증폭된 전장 ORF cDNA들의 크기를 아가로스 겔 상에서 확인하고 (도 7), pCR 2.1 벡터에 삽입 및, E. coli 에 클로닝 하여 염기서열을 분석하 였다.

표 6. 전장 ODC Az ORF cDNA의 증폭을 위한 PCR thermal cyclization 프로파일

3-4. 효모 발현 벡터로의 Slit ODC Az의 클로닝

pCR 벡터에 삽입되어 있는 Slit ODC Az cDNA를 BamHI과 Sal1으로 절단하여 단편을 분리한 다음, 동일한 제한효소들로 절단한 pG1 벡터에 라이게이션 하였다 (pG1-Slit ODC Az).

4. 담배거세미나방 ODC Az cDNA 의 변형( Modification )

ODC Az ORF cDNA의 223~225 번 염기에 존재하는 정지 코돈 (TGA)에서 223번 염기인 T (223-T) 를 site-directed mutagenesis 키트 (Stratagene)를 이용하여 제거하기 위해 T가 결실된 유전자 특이적 프라이머 (point mutated 프라이머 #1, 5'-CCTCTGTGGTGGTCCGATGTTCCGGCTCAG-3'(서열번호 15); point mutated 프라이머 #2, 5'-GTCACGCGGAACATCGGACCACCACAGAGG-3'(서열번호 16)) 들을 제작하였다. 표 7의 조건으로 5 ul 10x 버퍼, 1 ul dNTP mix, 3 ul quicksolution, 각 125 ng의 프라이머 #1 및 #2와 50 ng dsDNA 주형으로 이루어진 50 ul의 반응 부피로 PCR을 실시하여 223-T가 제거된 담배거세미나방 정소 조직 유래 구조변경 ODC Az cDNA (Slit ODC AzM)을 증폭하였다.

표 7. 담배거세미나방에서 point mutated ODC Az (ODC AzM) cDNA 를 증폭하기 위한 PCR thermal cyclization 프로파일

Preheating		95℃ for 5min	1 cycle
Reaction	Denaturation	95℃ for 50sec	18 cycles
	Annealing	60℃ for 50sec
	Extension	68℃ for 5min
Last extension		68℃ for 7min	1 cycle

5. ODC 및 ODC Az 결핍 효모 균주의 제작

5-1. 효모 균주

W303-1A ( MATa ade2 , ura3 , his3 , trp1 , leu2 , can1)의 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하였으며, YPD (효모 extract - peptone - dextrose), 또는 synthetic complete minimal medium (0.67 % yeast nitrogen base w/o a.a, 2 % 글루코스 및 아미노산, 선발에 필요한 것 제외)에서 배양하였다.

5-2. ODC 유전자 (SPE1)의 녹아웃

ODC 유전자 (SPE1)를 효모 W303-1A의 염색체 DNA로부터 SPE1-5와 SPE1-3 프라이머를 사용하여 PCR 반응으로 증폭하고, 증폭된 1.4 kb의 DNA를 BamHI와 XhoI로 절단하여 pBluescript SK(+) 벡터에 클로닝 하였다 (pSPE1). pSPE1 플라스미드를 HincII와 HindIII로 절단하여 아가로스 겔에서 용출한 다음, Klenow 단편으로 Fill-In하고, 여기에 PvuII로 절단한 URA3 유전자를 라이게이션 하였다 (pSPE1::URA3) (도 8).

URA3 유전자가 삽입된 단편을 SPE1-5와 SPE1-3 프라이머로 증폭하여 2.5 kb크기의 PCR 단편을 분리한 다음, W303-1A 또는 W303-1A OAZ1::Hy 균주에 형질전환하여 염색체 상의 SPE1 유전자와 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 염색체 상의 SPE1 유전자를 녹아웃 시켰다 (도 9). 형질전환체로부터 DNA를 분리하고 SPE1-5와 SPE1-3 프라이머로 PCR 하여 1.4 kb의 SPE1 유전자 대신 2.5 kb의 녹아웃된 유전자의 존재를 확인하였다 (도 10).

5-3. ODC Az 유전자 (OAZ1)의 녹아웃

효모의 ODC antizyme 1 유전자 (OAZ1 )를 W303-1A 균주의 염색체 DNA로부터 AZ1-5와 AZ1-3 프라이머를 사용하여 PCR 반응으로 증폭하였다. 증폭된 1.2 kb의 DNA를 pHNT-T 벡터에 클로닝 하고, BamHI와 XhoI로 절단하여 pBluescript SK(+) 벡터에 다시 클로닝하였다 (pBAZ1). pBAZ1 플라스미드를 EcoRV와 HindIII로 절단하여 아가로스 겔에서 용출한 다음, glycerate phosphate dehydrogenase 프로모터와 phosphoglycerate kinase 터미네이터를 포함한 하이그로마이신 저항성 유전자를 pG1-Hy 플라스미드로부터 동일한 제한효소로 절단 및 추출하여 EcoRV-HindIII 절단된 pBAZ1 DNA에 라이게이션하였다 (pBAZ1::Hy) (도 11).

AZ1-5와 AZ1-3 프라이머를 이용하여 하이그로마이신 저항성 유전자 (Hy )가 삽입된 3.5 kb 크기의 PCR 단편을 증폭한 다음, W303-1A 균주에 형질전환하여 염색체 상의 OAZ1 유전자와 상동 재조합이 일어나게 함으로써 염색체 상의 OAZ1 유전자 를 녹아웃시켰으며 (도 12), 형질전환체로부터 DNA를 분리하고 AZ1-5와 AZ1-3 프라이머로 PCR 하여 1.2 kb의 OAZ1 유전자 대신 Hy가 삽입된 3.5 kb의 녹아웃된 유전자를 확인하였다 (도 13).

6. 효모의 형질전환

밤새 배양한 W303-1A 효모 균주를 YPD 배지에 접종하고 (10⁵~10⁶ 세포/ml), 30℃, 180 rpm에서 약 5 시간 동안 배양하여 세포 수가 약 10 배 증가하였을 때 원심분리 (5,000 rpm, 10 min)를 통해 세포를 회수하여 증류수로 세척한 다음, 0.1 M LiOAc 용액 1 mL에 세포를 현탁하였으며, 이후 30 초간 12,000 rpm에서 원심분리하고 다시 동일 용액 450 ㎕에 현탁하였다. 50 ㎕의 세포 용액을 원심분리 튜브에 넣어 원심분리하여 얻은 세포 펠렛에 순서대로 형질전환 혼합물 (240 ㎕ 50 % PEG3350, 36 ㎕ 1 M LiOAc, 5 ㎕ 10 mg/ml ss DNA, 60 ㎕ DW, 10 ㎕ 플라스미드 DNA)를 넣어 vortex 하였다. 이를 30℃에서 30 분 동안 반응시키고 42℃에서 25 분간 열 충격을 가한 다음, 원심분리 (12,000 rpm, 30 sec)를 통해 세포 펠렛을 회수하였다. 증류수에 재현탁한 세포들을 합성 최소 배지 플레이트에 도말하여 30℃에서 2 일간 배양하였다.

7. 구조변경 담배거세미나방 ODC AZ ( Slit ODC AzM )의 발현 확인

7-1. 형질전환 효모의 배양 및 증식률 분석

담배거세미나방의 ODC 및 ODC Az 코딩 cDNA들에 의해 형질전환된 효모 세포들에서의 유전자 발현 양상을 확인하기 위해, 각 실험 군에 따라 선택배지 (+Ura/ 글루코스, -Ura/글루코스, -Ura/갈락토스 및 -Leu -Ade/갈락토스)에 10⁴ 세포/ml씩을 접종하여 30℃, 180 rpm에서 24~72 시간 진탕 배양하였으며, 각 세포 배양액 1 ml를 50 배로 희석한 후 hemacytometer를 이용하여 현미경 (x 400) 하에서 세포 수를 계수하였다.

7-2. 세포 폴리아민류 함량 분석

효모의 세포 내 폴리아민 수준은 배양된 효모 세포 10 mg에 20 % perchloric acid 2 ml을 가하여 1~2분간 용해한 후, 원심분리 (3,000rpm) 한 상층액을 Bio-Rad AG 50W-X4 음이온 교환 수지 (H⁺ form, 200~400 mesh)가 충진된 Kontes Econoflex 10 ml 칼럼 (Biorad)에 로딩한 다음, 0.1 M 인산나트륨 중의 0.7 M NaCl(pH 8.0), DW, 1 N HCl로 차례로 washing 한 후 6 N HCl로 용출하여 폴리아민 시료를 제작하였다.

폴리아민 시료 200 ul에 25 ul의 OPT (o-phthaldehyde-mercaptoethanol) reagent를 가해 1 분간 반응시켜 유도체화 하였으며, 100 ul를 고성능액체크로마토그래피 (HPLC, Waters system 600 controller, 474 Scanning fluorescence detector - 340/455 nm excitation/emission filter)에 injection 하여 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민의 수준을 측정하였다. HPLC 분석은 C₁₈ Brownlee lab guard 칼럼 이 장착된 Altex Ultrasphere-ODS 칼럼 (5um, 4.6mm x 15cm)을 사용하여, 메탄올 (용매 A)과 0.05 M DCMA (N,N-dimethylcyclohexylamine)가 첨가된 0.1 M 인산염 버퍼 (pH 4.0) (용매 B)를 용출액으로 하여 1 ml/min의 속도에서 gradient program (0~2 min, 20 % A 에서 80 % B; 2~10 min, 80 % A 에서 20 % B linear gradient; 2.3 min hold, 12.3~12.5 min linear to initial condition)으로 실시하였다.

실시예 1: 효모의 ODC 유전자 ( SPE1 ) 녹아웃 효과

1. 증식률

W303-1A 균주에서 ODC 유전자 (SPE1)을 녹아웃시킨 ODC 결핍 균주 (SPE1::Ura3)의 증식률을 야생형 균주과 비교한 결과 (표 8, 도 14), 배양액 내 세포의 수가 배양 24 시간과 48 시간에서 각각 야생형 균주의 53 %와 79 %의 수준으로 감소하는 것으로 나타나, SPE1의 녹아웃으로 인한 ODC 발현 중단에 따라 세포의 증식이 저해되는 현상이 확인되었다.

표 8. 야생형 및 ODC 결핍 효모 균주의 액체 배양에서 세포 수

균주	24 hrs	48 hrs
야생형	2.20 × 10⁸ 세포/ml	2.54 × 10⁸ 세포/ml
ODC 결핍(SPE1 :: Ura3)	1.16 × 10⁸ 세포/ml	2.01 × 10⁸ 세포/ml

2. 폴리아민 수준

W303-1A 균주에서 ODC 유전자 (SPE1)을 녹아웃시킨 ODC 결핍 균주 (SPE1::Ura3)의 세포 폴리아민 수준을 배양 48 시간에서 야생형 균주과 비교한 결 과 (표 9, 도 15 및 도 16), SPE1 녹아웃 균주에서 푸트레신은 56 %, 스퍼미딘은 28 %, 스퍼민은 29 %의 수준으로 각각 감소하여, ODC의 결핍으로 인한 폴리아민 합성 감소 효과가 뚜렷이 확인되었다.

표 9. 야생형 및 ODC 결핍 효모 균주의 폴리아민 함량

균주	함량* (pg/mg 세포)
균주	푸트레신	스퍼미딘	스퍼민
야생형	8.60	62.49	215.43
ODC 결피 (SPE1 :: Ura3)	4.89	17.49	62.33

* 배양 48시간에 측정함

실시예 2: 효모에서의 담배거세미나방 ODC cDNA 발현 효과

1. 증식률

ODC 유전자 (SPE1)을 녹아웃시킨 ODC 결핍 균주 (SPE1 :: Ura3)을 p413Gal 벡터에 삽입된 담배거세미나방 ODC (Slit ODC) cDNA로 형질전환시킨 균주 (SEP1::Ura3/p413Gal-Slit ODC)과 Slit ODC cDNA가 삽입되지 않은 벡터로 형질전환시킨 균주 (SEP1 :: Ura3/p413Gal)의 증식률을 비교한 결과 (표 10, 도 17), Slit ODC가 도입된 균주의 세포의 수가 배양 48 시간과 72 시간에서 각각 대조군의 약 1.8 배 및 1.6 배 수준으로 증가하여, 효모에 형질도입된 담배거세미나방의 ODC가 SPE1 녹아웃에 따른 효모 ODC의 결핍을 성공적으로 complementation 하는 것으로 확인되었다.

표 10. Slit ODC cDNA로 형질전환된 효모 균주 또는 형질전환되지 않은 효모 균주의 액체 배양에서 세포 수

균주	48 hrs	72 hrs
SEP1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC ^A	6.44 ×10⁷ 세포/ml	9.44 ×10⁷ 세포/ml
SEP1 :: Ura3/p413Gal ^B	3.63 ×10⁷ 세포/ml	5.81 ×10⁷ 세포/ml

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환됨;

B, 단지 p413Gal 벡터로 형질전환됨

2. 폴리아민 수준

Slit ODC cDNA를 도입시킨 균주 (SEP1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC)의 세포 폴리아민류를 배양 72 시간에서 분석한 결과 (표 11, 도 18 및 도 19), 대조군 (SEP1::Ura3/p413Gal)에 비해 푸트레신은 44.9 배, 스퍼미딘은 4.2 배, 스퍼민은 38.8 배 높은 수준을 나타내어, 담배거세미나방 ODC cDNA의 효모 ODC 유전자 (SPE1)에 대한 complementation 효과가 명확히 확인되었다.

표 11. Slit ODC cDNA로 형질전환된 효모 균주 또는 형질전환되지 않은 효모 균주의 폴리아민 함량

균주	함량* (pg/mg 세포)
균주	푸트레신	스퍼미딘	스퍼민
SEP1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC ^A	275.25	172.74	326.92
SEP1 :: Ura3/p413Gal ^B	6.13	41.38	8.43

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환됨;

B, 단지 p413Gal 벡터로 형질전환됨;

* 배양 72시간에 측정됨

실시예 3: 구조변경 Slit ODC Az ( ODC AzM )의 Slit ODC 에 대한 저해 효과

1. 증식률

담배거세미나방 ODC (Slit ODC) cDNA로 complementation 된 효모 균주 (SEP1::Ura3/p413Gal-Slit ODC)을 담배거세미나방의 구조변경 ODC Az (Slit ODC AzM) cDNA가 삽입된 PG1 벡터로 형질전환시킨 균주 (SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC AzM)과 구조를 변경치 않은 담배거세미나방 고유의 ODC Az (Slit ODC Az) cDNA가 삽입된 PG1 벡터로 형질전환시킨 균주 (SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC Az)의 증식률을 비교한 결과 (표 12, 도 20), 구조변경 Slit ODC Az cDNA가 도입된 균주의 세포의 수가 배양 24 시간과 48 시간에서 각각 고유의 Slit ODC Az가 도입된 대조군의 43 % 및 56 %의 수준으로 감소하여, 담배거세미나방의 구조변경 ODC Az cDNA 발현이 담배나방의 ODC에 대해 저해 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

표 12. 변형된 또는 원래의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 효모 균주의 액체 배양에서 세포 수

균주	24 hrs	48 hrs
SPE1 :: Ura3/p413Gal-SlitODC/pG1-ODC AzM ^A	1.87×10⁷ 세포/ml	8.37×10⁷ 세포/ml
SPE1 :: Ura3/p413Gal-SlitODC/pG1-ODC Az ^B	4.31×10⁷ 세포/ml	1.48×10⁸ 세포/ml

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC AzM cDNA로 형질전환됨;

B, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환됨

2. 폴리아민 수준

담배거세미나방의 구조변경 ODC Az (Slit ODC AzM) cDNA가 도입된 균주 (SPE1::Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC AzM)의 세포 폴리아민류를 배양 48 시간에서 분석한 결과 (표 11, 도 18 및 도 19), 구조를 변경치 않은 담배거세미나방 고유의 ODC Az (Slit ODC Az) cDNA가 도입된 대조군 (SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC Az)에 비해, 푸트레신은 40.1 %, 스퍼미딘은 64.1 %, 스퍼민은 58.6 %의 수준으로 각각 감소하였다. 이는 폴리아민 대사에서의 frame-shifting과 관련된 ODC Az ORF 내에 존재하는 종결 코돈에서 염기 T를 제거하는 구조변경이 ODC Az가 상시 발현될 수 있도록 하며, 발현된 ODC Az가 효과적으로 ODC의 활성을 저해한다는 사실을 입증하는 것이다.

표 13. 변형된 또는 원래의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 효모 균주의 폴리아민 함량

균주	함량* (pg/mg 세포)
균주	푸트레신	스퍼미딘	스퍼민
SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC AzM ^A	7.71	52.53	10.84
SPE1 :: Ura3/p413Gal-Slit ODC/pG1-ODC Az ^B	19.21	82.02	18.50

B, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA 및 pG1 벡터의 Slit ODC Az cDNA로 형질전환됨;

* 배양 48시간에 측정됨

도 1은 담배거세미나방의 정소 cDNA로부터 증폭된 ODC의 코아 도메인(1,110 bp)을 코딩하는 PCR 산물을 보여준다.

1, partial domain 단편;

M, 크기 마커

도 2는 담배거세미나방의 정소에서 ODC cDNA의 RACE PCR 산물을 보여준다.

3', pCR2.1 벡터에 3' 말단의 삽입;

5', pCR2.1 벡터에 5' 말단의 삽입;

M, 크기 마커

도 3은 담배거세미나방의 정소 cDNA로부터 증폭된 Slit ODC 의 ORF cDNA를 보여준다.

1, 전장 ORF cDNA;

M, 크기 마커

도 4는 재조합 효모 발현 벡터 p413GAL-Slit ODC 의 모식도이다.

도 5는 담배거세미나방의 정소 cDNA로부터 증폭된 ODC Az의 core domain(1,110 bp)을 코딩하는 PCR 산물을 보여준다.

1, partial domain 단편;

M, 크기 마커

도 6은 담배거세미나방의 정소에서 ODC Az cDNA 의 RACE PCR 산물을 보여준다.

3', pCR2.1 벡터에서 3' 말단의 삽입;

5', pCR2.1 벡터에서 5' 말단의 삽입;

M, 크기 마커

도 7은 담배거세미나방의 정소 cDNA로부터 증폭된 Slit ODC Az의 ORF cDNA를 보여준다.

1, 전장 ORF cDNA;

M, 크기 마커

도 8은 효모 (Saccharomyces cerevisiae) ODC 유전자(SPE1)에 URA3 의 삽입을 보여준다.

도 9는 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에서 ODC 유전자 (SPE1)의 녹아웃을 보여준다.

도 10은 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에서 URA3 인서트를 갖는 녹아웃된 ODC 유전자 (SPE1)의 확인 결과이다.

도 11은 효모 (Saccharomyces cerevisiae)의 ODC Az 유전자 (OAZ1) 내로 Hy의 삽입을 보여준다.

도 12는 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에서 ODC Az 유전자 (OAZ1)의 녹아웃을 보여준다.

도 13은 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에서 Hy 인서트를 갖는 녹아웃된 ODC Az 유전자 (OAZ1) 확인 결과이다.

도 14는 야생형 (A) 및 ODC 결핍 (B) 균주 사이의 성장 속도의 비교 결과이 다.

도 15는 야생형 (A) 및 ODC 결핍 (B) 효모 균주의 폴리아민의 HPLC 크로마토그램이다.

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민

도 16은 야생형 (A) 및 ODC 결핍 (B) 효모 균주 사이의 세포 폴리아민 함량의 비교 결과이다.

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민

도 17은 Slit ODC cDNA로 형질전환된 균주 (A) 또는 형질전환되지 않은 균주 (B) 사이의 세포 수의 비교 결과이다.

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환됨;

B, 단지 p413Gal 벡터로 형질전환됨

도 18은 p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환된 효모 균주 (A) 및 단지 p413Gal 벡터로 형질전환된 효모 균주 (B)의 폴리아민의 HPLC 크로마토그램이다.

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민

도 19는 Slit ODC cDNA로 형질전환된 효모 균주 (A) 또는 형질전환되지 않은 효모 균주 (B) 사이의 세포 폴리아민 함량의 비교 결과이다.

A, p413Gal 벡터의 Slit ODC cDNA로 형질전환됨;

B, 단지 p413Gal 벡터로 형질전환됨

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민

도 20은 변형된 (A) 또는 원래의 (B) Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 배양된 효모 균주의 세포 수의 비교 결과이다.

도 21은 변형된 (A) 또는 원래의 (B) Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 효모 균주의 폴리아민의 HPLC 크로마토그램이다.

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민

도 22는 변형된 (A) 및 원래의 (B) Slit ODC Az cDNA로 형질전환된 효모 균주 사이의 세포 폴리아민 함량 비교 결과이다.

PUT, 푸트레신; SPD, 스퍼미딘; SPM, 스퍼민

<110> Hannam University Institute for Industry-Academia Cooperation Nexgen Biotechnologies, Inc. <120> Gene encoding ornithine decarboxylase protein from Spodoptera litura and uses thereof <130> PN09141 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1347 <212> DNA <213> Spodoptera litura <400> 1 atgaaggtcg tggaagaaga acagcttatt actgtgatgg acgggccttg gtctacgacc 60 gacctgatcc gtgagatcgt ggagtctggc acccaggagg atcccttcta cgtgatggac 120 ctcggcgagg tggtggccag gtaccaccgc tggaaggaac tcatgccgcg cgtcgagcct 180 ttctatgcgg tgaaatgcaa cgacgacaag ctcctagtga gcacgctggc tgctctcggc 240 actggattcg actgcgcgtc caaagccgag attgaactcg tcacctccat tggagtagcg 300 cctgaccgca ttatattcgc gaaccctgct aagatggcgt ctcacatccg tttcgcgtcc 360 gccgtcggcg tcgacgtgat gactttcgac tcggagaccg agctcatgaa gatcaaacaa 420 tatatgcctc acgcacagct cgtgatccgc atccgctgcg acgctgcatc ggctcaatgt 480 ccgttgggca tcaagttcgg ttgcgacccc gtcactgagg ctcctcgact cctcaaactg 540 gccgctgtct tcggtcttga cgtgatcggc gtgtcattcc acgtgggtag cggtgcttcc 600 gagacagatg tgtacgcgcg agccatcgca ctgtcgcggg ctctgttcct ggtcgggcac 660 aacgtcggac acaaggccat gcgcatactg gacatcggag gaggattccc tggagggacc 720 cacacctcta tccaggaggt gtctgcagtg ataaacagtg ctttggagga gcacttcccc 780 gagcggtcgg tgcgagtgat cgcggagccg ggccggtact tcgccgccgc cgcctacacc 840 ctcgccgcca tggtgcacgc taaacgagag gtgacgtcga aggagtgcgc ggatgagacc 900 cacacgatgt acttcatcaa cgacggcgtg tacggctcct tcaactgcgt gctctacgac 960 caccaacacg tagtggccga accactcaat gacaacggct cagtgccggc tccgtgttca 1020 gtttggggcc cgacgtgtga cggactggac tgcgtgctgc ccgcgactcg cctgcccagc 1080 ctggccatcg gcgactggct catattccgc gacatgggcg cctacactct gcccgtcgcc 1140 tctcctttca acgggttccc cgtacccacc gtgcggcctg tcgtcgatgc tagacttgcg 1200 tgcattctga aggagttgcg gccgctgagc gcgtctcagt tcgcggcggg tcgtgttgtg 1260 gagtccccgg ccctgggtac cagtcgcccg gccagccgag ccgcgtcacc gtgccgcgca 1320 gtgttcgtgg agtgcgcgct caagtga 1347 <210> 2 <211> 448 <212> PRT <213> Spodoptera litura <400> 2 Met Lys Val Val Glu Glu Glu Gln Leu Ile Thr Val Met Asp Gly Pro 1 5 10 15 Trp Ser Thr Thr Asp Leu Ile Arg Glu Ile Val Glu Ser Gly Thr Gln 20 25 30 Glu Asp Pro Phe Tyr Val Met Asp Leu Gly Glu Val Val Ala Arg Tyr 35 40 45 His Arg Trp Lys Glu Leu Met Pro Arg Val Glu Pro Phe Tyr Ala Val 50 55 60 Lys Cys Asn Asp Asp Lys Leu Leu Val Ser Thr Leu Ala Ala Leu Gly 65 70 75 80 Thr Gly Phe Asp Cys Ala Ser Lys Ala Glu Ile Glu Leu Val Thr Ser 85 90 95 Ile Gly Val Ala Pro Asp Arg Ile Ile Phe Ala Asn Pro Ala Lys Met 100 105 110 Ala Ser His Ile Arg Phe Ala Ser Ala Val Gly Val Asp Val Met Thr 115 120 125 Phe Asp Ser Glu Thr Glu Leu Met Lys Ile Lys Gln Tyr Met Pro His 130 135 140 Ala Gln Leu Val Ile Arg Ile Arg Cys Asp Ala Ala Ser Ala Gln Cys 145 150 155 160 Pro Leu Gly Ile Lys Phe Gly Cys Asp Pro Val Thr Glu Ala Pro Arg 165 170 175 Leu Leu Lys Leu Ala Ala Val Phe Gly Leu Asp Val Ile Gly Val Ser 180 185 190 Phe His Val Gly Ser Gly Ala Ser Glu Thr Asp Val Tyr Ala Arg Ala 195 200 205 Ile Ala Leu Ser Arg Ala Leu Phe Leu Val Gly His Asn Val Gly His 210 215 220 Lys Ala Met Arg Ile Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Pro Gly Gly Thr 225 230 235 240 His Thr Ser Ile Gln Glu Val Ser Ala Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu 245 250 255 Glu His Phe Pro Glu Arg Ser Val Arg Val Ile Ala Glu Pro Gly Arg 260 265 270 Tyr Phe Ala Ala Ala Ala Tyr Thr Leu Ala Ala Met Val His Ala Lys 275 280 285 Arg Glu Val Thr Ser Lys Glu Cys Ala Asp Glu Thr His Thr Met Tyr 290 295 300 Phe Ile Asn Asp Gly Val Tyr Gly Ser Phe Asn Cys Val Leu Tyr Asp 305 310 315 320 His Gln His Val Val Ala Glu Pro Leu Asn Asp Asn Gly Ser Val Pro 325 330 335 Ala Pro Cys Ser Val Trp Gly Pro Thr Cys Asp Gly Leu Asp Cys Val 340 345 350 Leu Pro Ala Thr Arg Leu Pro Ser Leu Ala Ile Gly Asp Trp Leu Ile 355 360 365 Phe Arg Asp Met Gly Ala Tyr Thr Leu Pro Val Ala Ser Pro Phe Asn 370 375 380 Gly Phe Pro Val Pro Thr Val Arg Pro Val Val Asp Ala Arg Leu Ala 385 390 395 400 Cys Ile Leu Lys Glu Leu Arg Pro Leu Ser Ala Ser Gln Phe Ala Ala 405 410 415 Gly Arg Val Val Glu Ser Pro Ala Leu Gly Thr Ser Arg Pro Ala Ser 420 425 430 Arg Ala Ala Ser Pro Cys Arg Ala Val Phe Val Glu Cys Ala Leu Lys 435 440 445 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' gene-specific primer <400> 3 gggcactggc ttcgattgcg c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' degenerate primer <400> 4 yyayttsags gcrcaytcsa c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 5 tgtcattcca cgtgggtagc g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 6 ggggaagtgc tcctccaaag c 21 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 7 atgaaggtcg tggaa 15 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 8 tcacttgagc gcgcactc 18 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 9 ctgtggtggt cctgatgttc c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 10 ctcttcggcg aaatccagag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 11 tcaccgagtc ccagtctccc a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 12 gcttctctgc gttgctggtg g 21 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 13 gggggatcca tgacgaagtt aatacaacaa 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 14 ggggagctct tactgcatat tgtagtgcag 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> point mutated primer #1 <400> 15 cctctgtggt ggtccgatgt tccggctcag 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> point mutated primer #2 <400> 16 gtcacgcgga acatcggacc accacagagg 30

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 담배거세미나방 (Spodoptera litura) 유래의 ODC (ornithine decarboxylase) 단백질.
제1항의 ODC 단백질을 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제5항에 있어서, 효모인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
효모의 ODC 유전자가 녹아웃되어 세포 증식이 저해되고, 폴리아민류 합성이 감소된 효모.
제7항의 ODC 녹아웃 효모에 제4항의 재조합 벡터로 형질전환시켜 ODC 유전자 를 과발현시킴으로써 세포 증식 및 폴리아민류 합성이 정상적으로 회복된 효모.
효모에서 ODC 유전자를 녹아웃시키는 단계를 포함하는 효모 세포의 증식을 저해하고, 폴리아민류 합성을 감소시키는 방법.
효모에서 ODC 유전자를 녹아웃시키는 단계; 및

상기 ODC 녹아웃 효모에 제4항의 재조합 벡터로 형질전환시켜 ODC 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 효모 세포 증식 및 폴리아민류 합성을 정상적으로 회복시키는 방법.