KR102388144B1

KR102388144B1 - 방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법

Info

Publication number: KR102388144B1
Application number: KR1020200098275A
Authority: KR
Inventors: 정원중; 임종민; 인재선
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2022-04-19
Also published as: KR20220018155A

Abstract

본 발명은 방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법에 관한 것으로, 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성 단백질을 코딩하는 유전자를 난노클로롭시스 살리나에 과발현시킴으로써, 포피라-334(Porphyra-334)와 같은 MAAs를 산업적으로 이용가능하도록 대량 생산할 수 있다.

Description

방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법{Method for producing Nannochloropsis transformant producing mycosporine-like amino acids massively using gene from Pyropia yezoensis}

본 발명은 방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법에 관한 것이다.

마이코스포린 유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids: MAAs)은 자연 생물체에 존재하는 물질로, UVA 및 UVB를 효과적으로 흡수하는 것으로 알려져 있다. MAAs는 자연계에 35종 이상이 존재한다고 알려져 있으며, 대표적으로 포피라-334(porphyra-334), 시노린(shinorine) 등이 있다. 최근에는 다양한 당이 붙은 형태의 MAAs가 미세조류에 존재하며, 항산화 기능이 탁월하다고 보고되었다. 또한, MAAs는 자외선 차단능뿐만 아니라, 산화, 삼투 및 열 스트레스에 대한 저항성 등을 부여한다고 알려져 있다.

이러한 MAAs를 대량생산하기 위하여, MAAs를 생산하는 생물을 사용할 경우에 대상 생물의 생장속도가 느리고, MAAs 함량이 낮아서 생산성이 높지 않으며, 배양환경에 따라 그 생산성이 일정하지 않고 크게 변하는 한계를 가지고 있다. 특히 포피라-334를 생산하는 대부분의 김 속(Pyropia sp.)은 늦가을부터 초봄까지만 생장하는 등의 한계를 가지고 있다. 따라서 고속 생장이 가능하며 생명공학기술 적용이 가능한 숙주에서 MAAs의 생산성을 높이려는 기술이 개발되고 있다. 지금까지 개발된 기술에 의한 최대 생산성은 세균인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) SUKA22에서 13.9mg MAAs/g DCW(dry cell weight)와, 진핵생물인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 9.62 mg/g DCW의 시노린(shinorine)이다.

한편, 한국등록특허 제2003911호에는 '마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1606634호에는 'MAA 대량 생산 방법'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진, 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성 단백질을 코딩하는 유전자를 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)에서 과발현시킨 결과, 대조구인 야생형 방사무늬김에 비해 4~6배의 포피라-334(Porphyra-334)를 생산하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSAB 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSCD 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 PySHSAB 또는 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류를 형질전환시켜 PySHSAB 단백질 코딩 유전자 및 PySHSCD 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성 단백질을 코딩하는 유전자를 난노클로롭시스 살리나에 과발현시킴으로써, 포피라-334(Porphyra-334)와 같은 MAAs를 산업적으로 이용가능하도록 대량 생산할 수 있다.

도 1은 방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자의 존재 여부를 서던 블롯(Southern blot)을 통해 확인한 결과(a)이며, PySHSAB 및 PySHSCD 유전자의 구조 모식도(b)와 UV-B 노출 시간에 따른 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자의 발현 변화(c)를 확인한 결과이다.
도 2는 방사무늬김 유래의 MAAs 생합성을 조절하는 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자가 도입된 난노클로롭시스 살리나의 형질전환용 벡터의 모식도이다.
도 3은 형질전환된 난노클로롭시스 살리나에서 방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자 도입 여부를 서던 블롯(Southern blot) 및 노던 블롯(Northern blot)을 통해 확인한 결과이다. WT: 야생형 난노클로롭시스 살리나; 265, 286 및 287: 형질전환된 난노클로롭시스 살리나.
도 4는 방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 과발현하는 난노클로롭시스 살리나 형질전환체에서 추출된 MAAs의 흡수 파장을 확인한 결과이다. P. yezoensis 및 N. salina: 대조구(비형질전환체); NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287: NsSHSABCD 과발현 난노클로롭시스 살리나 형질전환체.
도 5는 방사무늬김 유래의 MAAs 생합성을 조절하는 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 이용하여 제조한 NsSHSABCD 과발현 형질전환체 추출물의 HPLC 결과이다. porphyra-334: 표준물질; P. yezoensis 및 N. salina: 대조구(비형질전환체); NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287: NsSHSABCD 과발현 난노클로롭시스 살리나 형질전환체.
도 6은 방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 과발현하는 난노클로롭시스 살리나 형질전환체의 추출물에서 포피라-334의 함량을 확인한 결과이다. Pyropia yezoensis: 대조구(비형질전환체); NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286, NsSHSABCD 287: NsSHSABCD 과발현 난노클로롭시스 살리나 형질전환체.
도 7은 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287)에서 생산되는 포피라-334의 UV 차단 효과를 확인하기 위해, NsSHSABCD 과발현 형질전환체에 UV-B 처리 후 생장 정도를 확인한 결과이다. WT: 야생형 N. salina.
도 8은 본 발명의 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287)의 최대 광합성 효율(Fv/Fm; Maximum PSII quantum yield)을 확인한 결과이다. WT: 야생형 N. salina. *은 UV-B 처리후 WT에 비해 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287의 값이 유의미하게 증가한다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 9는 본 발명의 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287)의 항산화 수준을 확인하기 위해, UV-B 처리후 각 형질전환체의 ROS(reactive oxygen species) 생성량을 확인한 결과이다. WT: 야생형 N. salina. WT: 야생형 N. salina. *은 UV-B 처리후 WT에 비해 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287의 값이 유의미하게 감소한다는 것을 의미하며, p<0.05이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSAB 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSCD 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 PySHSAB 및 PySHSCD 단백질의 범위는 각각 서열번호 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 및 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리 활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명은 또한, 상기 PySHSAB 및 PySHSCD 단백질을 코딩하는 각각의 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 PySHSAB 및 PySHSCD 단백질을 코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 3 또는 4의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 유전자에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 유전자 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 PySHSAB 및 PySHSCD 단백질을 코딩하는 각각의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E coli)이 이용되는 경우, E coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 75K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Rosetta, E. coli BL21, E. coli JM109, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주, 또는 미세조류 세포 등이 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는, 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 난노클로롭시스 그라뉼라타(Nannochloropsis granulata), 난노클로롭시스 림네티카(Nannochloropsis limnetica), 난노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica), 난노클로롭시스 오큘라타(Nannochloropsis oculata) 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D, J Mol Biol, 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 유효성분으로 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 난노클로롭시스 속 미세조류에 형질전환시킴으로써 난노클로롭시스 속 미세조류에서 MAAs를 대량 생산할 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 상기 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류는 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 난노클로롭시스 그라뉼라타(Nannochloropsis granulata), 난노클로롭시스 림네티카(Nannochloropsis limnetica), 난노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica), 난노클로롭시스 오큘라타(Nannochloropsis oculata) 등일 수 있으며, 바람직하게는 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 MAAs는 포피라 334(Porphyra-334, mycosporine-glycine-threonine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 숙주세포에서 MAAs를 생산하는 방법에서, 상기 숙주세포 및 MMAs는 전술한 바와 같다.

또한, PySHSAB 단백질 코딩 유전자와 PySHSCD 단백질 코딩 유전자는 하나의 벡터에 포함될 수도 있고, 각각 다른 벡터에 포함될 수도 있다.

또한, 본 발명의 생산 방법은, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양한 후, 배양물로부터 MMAs를 분리·동정하는 단계를 포함한다. 상기 배양 및 분리·동정 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류를 형질전환시켜 PySHSAB 단백질 코딩 유전자 및 PySHSCD 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체를 제공한다.

상기 MAAs 및 난노클로롭시스 속 미세조류는 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 방사무늬김의 Porphyra-334/shinorine 생합성 유전자 클로닝

방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 포피라-334(Porphyra-334), 시노린(shinorine) 등의 MAAs가 생산되는 것은 보고되어 있었으나 관련 유전자는 알려지지 않았다. 본 발명에서는 포피라 움빌리칼리스(P. umbilicalis, Pum0783s0002.1 및 Pum0783s0003.1)의 시노린 생합성 유전자의 단백질 서열을 이용하여 방사무늬김 전사체 정보를 대상으로 BLAST 수행하여 각각 87%, 83%의 높은 상동성(homology)을 가지는 2개의 전사체 정보를 확보하고 PySHSAB 및 PySHSCD로 명명하였다.

또한, 서던(Southern) 분석을 통하여 각각의 유전자가 방사무늬김 게놈에 단일 카피(single copy)로 존재하는 것을 확인하였다(도 1a). PySHSAB 유전자(서열번호 3)는 878개의 아미노산(서열번호 1)을 코딩하고 있으며 DHQ-S(dehydroquinate synthase) 도메인과 O-MT(O-methyltransferase) 도메인으로 이루어져 있으며(도 1b), PySHSCD 유전자(서열번호 4)는 923개의 아미노산(서열번호 2)을 코딩하고 있고 ATPgrasp(adenosine triphosphate (ATP)-grasp ligase) 도메인과 Dala-Dala-lig (D-alanine-D-alanine ligase) 도메인으로 이루어져 있다(도 1b). 이러한 결과는 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 다른 진핵조류(Condrus 속, Dinoflagellate 등)에서처럼 시노린 생합성에 2개의 유전자가 필요하며, 이는 남세균과 같은 원핵생물의 시노린 생합성 유전자 4개 중 2개씩 융합(fusion)된 형태를 보여 주었다. PySHSAB와 PySHSCD 유전자는 UV(UV-B)에 노출된 엽체에서 발현이 증가되었으며, 특히 PySHSCD 유전자는 UV(UV-B) 노출 2시간 후에 8배 이상 크게 발현양이 증가하였다(도 1c).

실시예 2. PySHSAB 및 PySHSCD 과발현 형질전환체 생산

방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD를 과발현하는 난노클로롭시스 형질전환체를 생산하기 위해, PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 하기 표 1에 개시된 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하여 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina) 형질전환용 벡터의 BamHI/EcoRV 자리에 도입하여 형질전환 벡터를 완성하였다(도 2). 그 후 난노클로롭시스 살리나에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환용 벡터를 도입하여 3주 동안 2.5mg/L의 블레오마이신이 첨가된 F2/N 배지에 배양하여 블레오마이신 저항성을 가지는 콜로니를 선발하였다. 선발된 콜로니는 PySHSAB 및 PySHSCD 프로브를 사용하여 서던 블롯 및 노던 블롯으로 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자의 형질전환 및 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 안정적으로 발현하는 265, 286, 287 라인을 선발하였다(도 3). 상기 PySHSAB 및 PySHSCD를 과발현하는 난노클로롭시스 살리나 형질전환체를 이하 NsSHSABCD 과발현 형질전환체로 명명하였다.

본 발명에 사용된 프라이머 정보

유전자	프라이머	염기서열 정보 5'-3'
PySHSAB	PySHSAB-F (BamHI)	AAGGATCCATGCATATTACTCTTGACAAGACGGT (서열번호 5)
	PySHSAB-R (EcoRV)	AAGATATCCTAAACGCGGCGCACAAGAAGGA (서열번호 6)
	PySHSAB-F3 (Probe)	CTTCTTCGTCGCTCATGGCGTCGA (서열번호 7)
	PySHSAB-R3 (Probe)	TAGCCCGTGAACGTGCCAATGTC (서열번호 8)
PySHSCD	PySHSCD-F (BamHI)	AAGGATCCATGACGTCCCCTGCGTCGGCC (서열번호 9)
	PySHSCD-R (EcoRV)	AAGATATCCTACCGCCCGAGGGCCTTCAT (서열번호 10)
	PySHSCD-F (Probe)	AACTACGGGTGGCAGTGGTGGAGA (서열번호 11)
	PySHSCD-R (Probe)	TTCAGCCATGAGCACCAGCACGCT (서열번호 12)

실시예 3. NsSHSABCD 과발현 형질전환체로부터 MAAs 추출 및 분석

MAAs를 추출하기 위해, 먼저 건조된 방사무늬김(P. yezoensis) 대조구 및 난노클로롭시스 살리나(N. salina) 대조구(WT)와 난노클로롭시스 살리나 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287) 100mg을 100% 메탄올(HPLC-grade)에 각각 녹여 4℃의 암 조건에서 하루 동안 보관하였다. 15분 동안 5,000 x g, 4℃에서 원심분리한 후, 깨끗한 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 메탄올 추출물은 회전진공농축기(rotary vacuum evaporator)를 이용하여 40℃에서 건조시켜 농축하였다. 농축된 물질들을 15㎖의 물:클로로포름(2:1, v/v)에 녹인 후 수용액상(aqueous phase)을 0.2μm 시린지 필터를 통해 여과하였다.

먼저 대조구인 P. yezoensis 및 N. salina(WT)와 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287)에서 각각 추출된 물질이 MAAs인지를 확인하고자 분광광도계를 이용하여 MAAs 흡수 파장인 300-360nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, N. salina 대조구에서는 MAAs 흡수 파장인 330nm에서는 피크가 검출되지 않은 반면, 또 다른 대조구인 P. yezoensis에서는 흡광 피크가 확인되었으나 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287)가 대조구인 P. yezoensis에 비해 4배 이상의 높은 흡광 피크를 보였다(도 4).

NsSHSABCD 과발현 형질전환체의 추출물에서 생산된 MAAs의 함량을 분석하고자 YMC Triart C18 column(5μm, 250mm x 4.6mm)이 장착된 HPLC system(Agilent 1200 series, USA)을 이용하였다. 추출된 샘플 10㎕를 주입하였고, 물:아세토니트릴(95:5, v/v)을 이동상으로 사용하였다. 35℃에서 0.5㎖/min의 유속으로 330nm 파장에서 분석하였다. 그 결과, 포피라-334 표준물질 및 P. yezoensis 대조구에서 머무름 시간(retention time) 5분에 피크가 나타났으며, NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287에서도 동일한 머무름 시간에 피크가 나타났다(도 5). 이는 NsSHSABCD 과발현 형질전환체에서 포피라-334가 생산됨을 보여준다.

또한, 포피라-334 표준물질을 이용하여 대조구인 P. yezoensis와 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287)의 추출물에서 포피라-334 성분을 정량 분석하였다. 그 결과, 야생형 대조구인 P. yezoenesis는 4.11±0.31mg/g DW(dry weight)의 포피라-334를 생산하였으며, NsSHSABCD 과발현 형질전환체인 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287에서는 대조구(P. yezoensis)보다 4-6배 높은 25.58±3.29, 19.86±2.42 및 21.35 3.31 mg/g DW의 포피라-334를 생산하는 것으로 확인되었다(도 6). 즉, 포피라-334 생산성이 지금까지 보고 대비 가장 높다는 것을 알 수 있다.

실시예 4. 재조합으로 생산된 MAAs의 성능 검정

본 발명의 재조합으로 생산된 MAAs가 천연생산 MAAs와 동등한 기능을 가지는 확인하고자 하였다. 형질전환된 난노클로롭시스 살리나(N. salina)에서 생산된 MAAs의 UV 차단 효과를 확인하기 위해, 형질전환 세포주에 UV-B를 처리한 후 spot growth test를 진행하였다. 그 결과, UV-B 처리 30분까지 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287)는 WT(N. salina)와 유사한 성장속도를 보였으나, UV-B 처리 1시간 이후부터 WT보다 높은 성장률을 보여주었다(도 7). 이는 NsSHSABCD 과발현 형질전환체들이 생산하는 MMAs, 즉 포피라-334가 자외선을 흡수하여 세포에 내성을 부여했음을 시사하였다.

또한, NsSHSABCD 과발현 형질전환체에서 PSII 활성을 나타내주는 지표인 최대 광합성 효율(Fv/Fm)을 확인하였다. Fv/Fm 측정은 1×10⁷세포/㎖를 Handy Plant Efficiency Analyzer(Hansatech, King’Lynn, United Kingdom)을 사용하여 측정하였다. 그 결과, WT(N. salina)의 경우, UV-B에 1시간 30분 노출시키면 UV-B 처리 전보다 Fv/Fm이 50% 감소된 반면, NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287의 경우, UV-B에 1시간 30분 노출 시 Fv/Fm이 UV-B 처리 전보다 각각 34%, 30%, 28% 감소되었음을 확인할 수 있었고(도 8), 이러한 결과는 UV 처리 후 NsSHSABCD 과발현 형질전환체들이 대조구(WT)에 비해 자외선에 대한 세포의 피해가 적어서 높은 광합성능을 유지하고 있음을 나타낸다.

UV에 노출 시 ROS 생산으로 인해 산화스트레스가 발생할 수 있다. MAAs는 UV 차단 효과뿐만 아니라 UV에 노출 시 생산된 ROS를 제거하는 항산화 효과가 있다고 알려져 있다. 따라서 NsSHSABCD 과발현 형질전환체인 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287에서 생산된 MAAs의 UV에 대한 항산화 효과를 확인하기 위해서 UV-B 처리 후 형질전환체에서 ROS 수준을 측정하였다.

ROS를 측정하기 위해 대조구인 WT(N. salina)와 NsSHSABCD 과발현 형질전환체 세포 배양액(1×10⁷cells/㎖) 2㎖에 UV-B를 각각 1시간 30분 처리하였고, 5μM의 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescein-diacetate)를 첨가하여 25℃의 암 조건에서 1시간 동안 교반하였다. 세포의 형광은 분광광도계(Model LS55; PerkinElmer, Norwalk, CT, United States)를 이용하여 상온에서 485nm의 excitation 파장과 500 and 600nm의 emission 파장을 측정하였다. 520nm(F520)의 형광 세기(fluorescence intensity)는 상대적인 ROS 생산을 결정하기 위해 사용되었다. UV-B 처리 전 WT 94.26±4.05, NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287에서는 각각 140.76±20.4, 172.23±22.93 및 161.81±8.37의 ROS가 측정되었다. UV-B 처리 후 WT은 ROS 양이 3.8배(361.1±37.19) 증가하였지만, 형질전환체 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286, NsSHSABCD 287에서는 각각 1.2배(168.36±15.23), 1.5배(255.12±33.35), 1.1배(178.37±4.29)로 WT에 비해 소폭 증가하였다(도 9). 이러한 결과는 NsSHSABCD 과발현 형질전환체에서 과량 생성된 MAAs가 ROS 수준을 명백히 감소시키고 ROS 제거제로서 기능함을 나타낸다.

상기와 같이, UV-B 처리 후 spot growth test에서의 높은 생장속도, Fv/Fm 분석에서의 높은 광합성능, 세포 내 ROS의 발생 감소 등의 결과는 NsSHSABCD 과발현 형질전환체에서 생산된 MAAs가 UV 손상으로부터 세포를 효과적으로 보호하는 효과가 있음을 보여주는 것으로 천연 MAAs와 동등한 기능을 가지는 것을 나타낸다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for producing Nannochloropsis transformant producing mycosporine-like amino acids massively using gene from Pyropia yezoensis <130> PN20154 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 878 <212> PRT <213> Pyropia yezoensis <400> 1 Met His Ile Thr Leu Asp Lys Thr Val Gly Ala Gln Val Val Gln Pro 1 5 10 15 Lys His Phe Ala Ala Phe Val Ala Asp Val Gln Glu Ala Gly Val Thr 20 25 30 Val Pro Asp Gly Asp Val Thr Ala Ala Leu Glu Ala Val Leu Ala Ser 35 40 45 Pro Ala Leu Ser Thr Phe Leu Leu Arg Cys Ser Arg Ala Asp Val Phe 50 55 60 Asp Gly Ser Val Ala Ala Asp Phe Ser Gly Asn Ile Lys Asp Leu Arg 65 70 75 80 Met Leu Arg Ser Leu Lys Gln Leu Lys Tyr Phe Tyr Asn Leu Pro Ala 85 90 95 Gly Gln Leu Thr Gln Val Leu Ala Gly Val Val Ala Ser Gly Asp Ala 100 105 110 Val Ala Ala Lys Pro Trp Asn Ala Leu Ala Glu Arg Val Leu Ala Ser 115 120 125 Asp Glu Leu Cys Thr Gly Leu Ile Lys Asn Leu Ile Ile Gly Lys Thr 130 135 140 Ala Ser Ala Asp Leu Lys 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Phe Arg Thr Leu Glu Lys Gly Trp Ile Arg 355 360 365 His Gly Ile Ala Glu Ile Ile Lys Met Ala Val Thr Lys Asp Asn Thr 370 375 380 Leu Phe Glu Ala Leu Glu Glu Ala Gly Asp Lys Leu Val Thr Ser Lys 385 390 395 400 Phe Gly Ile Glu Gly Val Glu Ala Gly Ser His Phe Asp Thr Leu Ser 405 410 415 Glu Ser Ile Ile Ala Lys Ala Met Asp Gly Tyr Val Arg Ser Glu Tyr 420 425 430 Gly Asn Leu Trp Glu Thr His Gln Cys Arg Pro His Ala Tyr Gly His 435 440 445 Thr Trp Ser Pro Gly Phe Glu Leu Gln Ala Gly Leu Leu His Gly His 450 455 460 Ala Val Ala Ile Gly Met Gly Tyr Gly Ala Tyr Leu Ser Phe Leu Glu 465 470 475 480 Gly Trp Ile Ser Glu Val Asp Phe His Arg Ile Leu Lys Val Ile Ser 485 490 495 Thr Val Gly Leu Ser Leu Val His Pro Ile Leu Asp Asn Pro Asn Ser 500 505 510 Leu Trp Gln Ser Gln Val Lys Met Thr Glu Lys Arg Gly Gly Asn Leu 515 520 525 Cys Ala Pro Leu Pro Arg Gly Ser Ile Gly Lys Cys Gly Tyr Leu Asn 530 535 540 Asp Leu Thr Arg Glu Arg Leu Glu Ser Thr Leu Ile Asp Tyr Lys Glu 545 550 555 560 Leu Cys Lys Ala Tyr Pro 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Ala Thr Ser Glu Leu Val Ala Pro Thr Arg Val Leu Leu Ser Asp Ala 515 520 525 Ala Ser Val Val Leu Gly Phe Asp Ala Glu Leu Thr Phe Leu Ala Pro 530 535 540 Arg Ser Pro Val Ala Pro Tyr Thr Tyr Tyr Arg Ile Pro Leu Arg Arg 545 550 555 560 Leu Lys Val Leu His Val Met Gly Ser Cys Thr Ser Lys Tyr Tyr Glu 565 570 575 Thr Val Ser Ala Tyr Tyr Gly Phe Asp Cys Ile Ala Ser Thr Thr Asp 580 585 590 Asp Val Arg Tyr Glu His Val Val Gly Tyr Val His Leu Thr Gly Glu 595 600 605 Trp Ser Val Ala Val Gly Lys Asp Ala Gln Tyr Met Arg Glu Lys Ala 610 615 620 Pro Arg Leu Ser Leu Ala Gln Ala Leu Ala Thr Phe Glu Ser Leu Ser 625 630 635 640 Leu Asp Leu Met Ile Pro His Met Phe Asp Tyr Ala Gly Leu Thr Ala 645 650 655 Tyr Arg Ser Val Phe Thr Met Leu Asp Leu Pro Thr Val Gly Cys Ser 660 665 670 Gly Glu Ala Leu Ala Leu Ser Thr Asn Lys Ala Arg Thr Lys Ala Cys 675 680 685 Ala Ala Met Asp Gly Val Pro Val Pro Ala Ser Glu Leu Leu Arg Arg 690 695 700 Gly Asp Lys Pro Thr Met Pro Leu Pro Phe Val Ile Lys Pro Thr Glu 705 710 715 720 Glu Asp Asn Ser Met Gly Val Asp Val Val Arg Glu Glu Ala Asp Val 725 730 735 Pro Ala Ala Leu Glu Ala Ala Phe Arg Phe Gly Asp Glu Val Met Val 740 745 750 Glu Gln Phe Ile Pro Leu Gly Arg Glu Leu Arg Val Ala Val Val Glu 755 760 765 Thr Pro Ala Gly Gly Phe Glu Leu Leu Pro Met Val Glu Tyr Phe Leu 770 775 780 Pro Ala Asp Lys Pro Ile Arg Leu Ser Ala Asn Lys Leu Thr Thr Asp 785 790 795 800 Ser Thr Gly Gln Pro Ser Gly Phe Ala Lys Thr Asp Arg Gln Val Pro 805 810 815 Ala Asp Val Asp Pro Val Leu Lys Glu Lys Leu Tyr Lys Met Ala Met 820 825 830 Val Ala His Arg Ala Thr Asp Cys Ala Asp Tyr Ser Ile Tyr Asp Val 835 840 845 Arg Val Asp Pro Ala Gly Glu Pro Tyr Met Leu Glu Ser Cys Leu Tyr 850 855 860 Cys Ser Phe Ser Phe Arg Ser Val Leu Val Leu Met Ala Glu Ala Ala 865 870 875 880 Gly Lys Lys His Pro Gln Leu Phe Val Glu Phe Ser Glu Arg Ala Val 885 890 895 Gly Arg Lys Ser Ala Ala Val Ala Ala Arg Ala Arg Gly Gly Ala Ala 900 905 910 Pro Gln Glu Phe Gly Met Lys Ala Leu Gly Arg 915 920 <210> 3 <211> 2637 <212> DNA <213> Pyropia yezoensis <400> 3 atgcatatta ctcttgacaa gacggtaggt gcgcaggtgg tgcaacccaa gcacttcgcc 60 gcgtttgtgg ccgacgtcca ggaggctggc gtgactgtgc ctgatggtga cgtgacggcc 120 gccctggagg cggtgctggc ctcgcccgcc ctttcaacct ttctgctgcg ctgctcccgg 180 gcggatgtct ttgacggctc ggtcgctgcc gacttttcgg gcaacatcaa ggacctacgc 240 atgctgcggt cgctcaagca gctgaagtac ttttacaacc tgcctgctgg gcagctgact 300 caggtgctgg cgggtgtggt ggcgtctggg gatgcagtgg cggccaagcc gtggaatgcc 360 ctggccgagc gggtgctcgc cagcgacgag ctgtgcactg ggctgatcaa gaacctgatc 420 attggcaaga cggccagcgc cgacctcaag gccatctatg aggacaatgc tgagtggctg 480 ctgcacaatg accctcacgc gctgtatccg acgtctatct accgccaggg cagcggccac 540 gtgacgtcgt cggaagactc atctcgcatt gagggcgtca tgtccactac catcaccacc 600 actattgaga ttgttcggga cgtgctcagc cccgacaacc accaactccg ggatatgtac 660 aagcctctca agcgctgcgt ggcggttgtt gatgagcgcc tggacaagct gtacgggacg 720 acgctggcca actactttgc cgcgcacgac attgagcttg tgcaactgac ctaccggtgc 780 atggaggtgg acaaggacat ctctacagtg gagaagatgc tggtggacct 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cctgggcgcg ctggtggcta cgtcagaact ggtggccccg 1560 acgcgggtgc tgctcagcga cgccgcgtcg gtggtgcttg ggtttgacgc ggagctaacc 1620 tttctggcac cccgctcccc cgttgccccc tacacctact accgcatccc gctgcggcgg 1680 ctcaaggtgc ttcacgtcat gggcagctgc acaagcaagt actacgagac ggtgtcggcg 1740 tactatgggt ttgattgcat tgcgagcacc acggacgatg tgcggtacga gcacgttgtg 1800 gggtatgtcc acctcactgg cgagtggagt gtggccgttg gcaaggacgc tcagtacatg 1860 cgggagaagg cgccccgctt gtctttggcc caggcgctgg ccaccttcga gtcactgtct 1920 ctggacctga tgatccccca catgtttgac tatgccggcc tcaccgccta tcggtcggtg 1980 ttcacgatgc tggacttgcc cacggtgggg tgctctggcg aggcgctggc cctgtcgacc 2040 aacaaggcac ggacaaaggc gtgcgcggcg atggacggcg ttcctgtgcc tgcgtcggag 2100 ctgctgcgcc gcggggacaa gccaacgatg cccctgccgt tcgtcatcaa gcccaccgag 2160 gaagacaact cgatgggcgt cgacgtggtg cgggaggagg cagacgtgcc ggcggcgctc 2220 gaggcggcat ttcggtttgg cgatgaggtg atggtggagc agttcatccc tctgggcagg 2280 gaactacggg tggcagtggt ggagaccccc gctggtggct ttgagctcct ccccatggtt 2340 gagtacttcc tgcccgcgga caagcccatt cggttgtctg cgaacaagct gaccaccgac 2400 tcgaccggcc agccgtctgg ctttgccaag accgaccggc aggtgcccgc ggacgtggac 2460 ccggtgctca aggagaagct gtacaagatg gcgatggtgg cgcaccgcgc caccgactgt 2520 gccgactaca gcatctatga cgtacgggtg gaccccgccg gagagccgta catgctcgag 2580 tcgtgcctct actgctcgtt tagcttccgc agcgtgctgg tgctcatggc tgaagcggcg 2640 ggcaagaaac acccgcagct gtttgtcgag tttagcgagc gcgccgtcgg ccgcaagagc 2700 gcggccgttg ctgcgcgcgc ccgggggggg gcggcgccgc aagagttcgg catgaaggcc 2760 ctcgggcggt ag 2772 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaggatccat gcatattact cttgacaaga cggt 34 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aagatatcct aaacgcggcg cacaagaagg a 31 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cttcttcgtc gctcatggcg tcga 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tagcccgtga acgtgccaat gtc 23 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aaggatccat gacgtcccct gcgtcggcc 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aagatatcct accgcccgag ggccttcat 29 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aactacgggt ggcagtggtg gaga 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttcagccatg agcaccagca cgct 24

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSAB 단백질.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSCD 단백질.
제1항 또는 제2항의 단백질을 코딩하는 유전자.
제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하기 위한 조성물.
제6항에 있어서, 상기 MAAs는 포피라-334(Porphyra-334, mycosporine-glycine-threonine)인 것을 특징으로 하는 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 방법.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류를 형질전환시켜 PySHSAB 단백질 코딩 유전자 및 PySHSCD 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체의 제조 방법.
제9항의 방법에 의해 제조된 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체.