KR101023251B1 - 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서 및 이를 이용한 모니터링 방법 - Google Patents

세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서 및 이를 이용한 모니터링 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서 및 이를 이용한 모니터링 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 본 발명은 전극 사이에 세포를 부착하여 시간의 경과에 따라 전극 간의 커패시턴스를 실시간으로 측정함으로써 생체 분자가 세포 표면의 수용체를 통해 엔도시토시스 되는 과정을 모니터링 할 수 있는 셀센서 및 이를 이용한 모니터링 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일례에 따른 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서는 기판, 상기 기판상에 서로 이격되어 형성되며, 상기 이격된 공간에 주입된 적어도 하나 이상의 세포가 부착되도록 하는 제 1 전극과 제 2 전극; 및 상기 제 1 전극 및 제 2 전극 각각의 상부에 형성되어 상기 세포가 상기 제 1 전극 및 제 2 전극의 상부에 부착되는 것을 방지하기 위한 패시베이션 레이어를 포함한다.
본 발명의 일례에 따른 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서 및 이를 이용한 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법은 전극 사이에 특정 생체 분자의 수용체를 가지는 세포를 부착시킨 뒤 시간의 경과에 따라 전극 간의 커패시턴스를 실시간으로 측정함으로써 생체 분자가 세포 표면의 수용체를 통하여 엔도시토시스 되는 과정을 실시간으로 모니터링 할 수 있는 효과가 있다.
셀센서, 커패시턴스, 엔도시토시스, 특이 결합

Description

세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서 및 이를 이용한 모니터링 방법{Realtime monitoring sensor of cell capacitance and Monitoring method}
본 발명은 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서 및 이를 이용한 모니터링 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 본 발명은 전극 사이에 세포를 부착하여 시간의 경과에 따라 전극 간의 커패시턴스를 실시간으로 측정함으로써 생체 분자가 세포 표면의 수용체를 통해 엔도시토시스 되는 과정을 모니터링 할 수 있는 셀센서 및 이를 이용한 모니터링 방법에 관한 것이다.
생체분자의 표적(target) 세포 수용체(receptor)로의 흡착(adsorption)에는 항체와 이것에 대응하는 항원 사이에 일어나는 특이적인 반응인 항원 항체 반응이 있다. 항원항체반응은 선택성이 높아 항원과 항체 중 어느 한쪽이 조금이라도 다르면 반응하지 않는다.
또 한 예로 일반적 바이러스는 세포 표면에 있는 리셉터(단백질 혹은 당질)에 붙으면서 세포감염이 시작된다. 예를 들어, 아데노바이러스의 주된 수용체는 coxsackie/adenovirus receptor(CAR)이며, 아데노바이러스는 CAR 수용체에 결합하여 바이러스가 수용체와 상호작용(interaction) 하면 바이러스는 클라트린 매개 엔도시토시스(clathrin-mediated endocytosis) 에 의해 세포 내로 들어오게 된다
일반적으로 세포 내로 유입되는 생체분자의 활동 과정을 측정하는 방법으로는 생체분자를 형광으로 표지하여 형광 현미경을 이용해 관찰하는 방법을 이용한다. 그러나 바이러스의 경우 바이러스 내부에 함유되어있는 형광이 발현되는데 오랜 시간(24시간 이상)이 걸려 즉각적인 생체분자의 흡착 순간을 포착하기에 알맞지 않고 생체분자의 외피부착용 형광 단백질들은 생산 효율이 낮아 비용이 높다는 단점을 지닌다. 그리고 형광 현미경을 통한 관찰은 형광이 세포막을 통과하는지의 여부를 정확히 알 수 없어 실시간으로 생체분자의 활동을 모니터링 하기 어려운 문제점이 있다.
본 발명은 셀센서의 전극 사이의 이격된 공간에 적어도 하나 이상의 세포가 부착되도록 함으로써, 세포의 포텐셜(Potential)변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있는 셀센서를 제공하고, 이를 이용하여 세포 표면의 표적 수용체와 생체 분자 혹은 바이러스와 같은 물질이 특이 결합(Specific binding)을 하는 흡착(adsorption)과 엔도시토시스(Endocytosis) 과정 중의 세포의 포텐셜 변화를 커패시턴스 변화를 통하여 실시간으로 모니터링 하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기의 설명에 의해서 이해될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 의해 보다 분명하게 알게 될 것이다. 또한, 본 발명의 목적 및 장점들은 특허 청구 범위에 나타낸 수단 및 그 조합에 의해 실현될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 발명의 일례에 따른 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서는 기판, 상기 기판상에 서로 이격되어 형성되며, 상기 이격된 공간에 주입된 적어도 하나 이상의 세포가 부착되도록 하는 제 1 전극과 제 2 전극; 및 상기 제 1 전극 및 제 2 전극 각각의 상부에 형성되어 상기 세포가 상기 제 1 전극 및 제 2 전극의 상부에 부착되는 것을 방지하기 위한 패시베이션 레이어를 포함한다.
이와 같은 셀센서는 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 커패시턴스(capacitance) 또는 임피던스(impedance)를 측정함으로써 상기 세포의 상태를 실시간으로 모니터링할 수 있다.
또한, 셀센서는 상기 이격된 공간을 포함하여 형성되고, 상기 이격된 공간에 상기 세포와 항원 항체 반응을 하는 생체분자 또는 세포 사멸 유도 물질 중 적어도 하나를 주입하기 위한 입구(Inlet) 및 상기 이격된 공간으로부터 상기 생체분자 또는 상기 세포 사멸 유도 물질 중 적어도 하나를 추출하기 위한 출구(Outlet)를 포함하는 플루이딕 채널(Fluidic channel);을 더 포함할 수 있고, 상기 플루이딕 채널은 아크릴(acryl) 또는 PDMS(Polydimethylsiloxane) 중 적어도 하나를 포함하며, 상기 기판 및 상기 제 1, 2 전극에 탈부착이 가능하다.
또한, 셀센서는 상기 이격된 공간에 주입된 세포를 배양하기 위한 세포 배양액이 외부로 누출되는 것을 방지하기 위한 웰;을 더 포함할 수 있고, 상기 웰은 아크릴(acryl) 또는 PDMS(Polydimethylsiloxane) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
또한, 셀센서는 상기 기판을 공통으로 하고, 상기 기판상에 상기 제1 전극과 상기 제2 전극으로 이루어진 복수 개의 전극 쌍이 어레이(array)될 수 있다.
또한, 본 발명의 일례에 따른 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법은 (a)전술한 셀센서의 상기 이격된 공간에 상기 세포를 주입하고 상기 세포 배양을 위한 세포 배양 미디아(medium)를 주입하여 배양시키는 단계, (b) 상기 세포 배양액에 의해 배양된 세포에 상기 세포와 특이 결합(Specific binding)을 하는 생체 분자를 주입하는 단계 및 (c) 상기 (b)단계를 거친 상기 세포를 배양하면서 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 커패시턴스를 실시간으로 측정하는 단계;를 포함한다.
여기서, 상기 세포는 아데노바이러스와 Car-antibody의 표적 수용체(Receptor)인 CAR(coxsackie and adenovirus receptor)가 발달되어 있는 HEP1 세포 또는 허셉틴(herceptin)의 표적 수용체인 ErbB-2 (HER2/neu) 과발현 되어있는 유방암 세포주인 435 세포 중 어느 하나일 수 있고, 상기 세포 배양 미디아는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI(Rosewell Park Memorial Institue) 1640 Medium, MEM(Minimum Essential Medium) 중 적어도 어느 하나를 포함하고, 상기 생체 분자는 아데노바이러스, Car-antibody 또는 허셉틴(herceptin) 중 어느 하 나일 수 있다.
그리고, 상기 (c)단계는 커패시턴스를 실시간으로 측정하여 상기 세포 표면의 수용체를 통하여 상기 생체 분자가 상기 세포 내로 엔도시토시스(endocytosis) 되는 시점을 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 상기 (c)단계 이전에 상기 세포 배양액을 이용하여 상기 생체 분자의 농도를 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일례에 다른 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법은 (a) 전술한 셀센서의 상기 이격된 공간에 상기 세포를 주입하고 상기 세포 배양을 위한 세포 배양 미디아(medium)를 주입하여 배양시키는 단계 (b) 상기 세포 배양액에 의해 배양된 세포에 사멸 유도 물질을 주입하는 단계 및 (c) 상기 (b)단계를 거친 상기 세포를 배양하면서 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 커패시턴스를 실시간으로 측정하는 단계를 포함한다.
여기서, 상기 사멸 유도 물질은 TRAIL(Tumor necrosis factor Related Apoptosis Inducing Ligand)을 포함하는 바이러스, 박테리아, 핵산, 약물, 금속 입자 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 (c)단계는 커패시턴스와 임피던스를 실시간으로 측정하여 상기 세포 표면의 수용체를 통하여 또는 흡착(adsorption)을 통하여 상기 생체 분자가 상기 세포 내로 엔도시토시스(endocytosis)되는 시점을 실시간으로 모니터링 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일례에 따른 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법은 (a) 전술한 셀센서의 상기 이격된 공간에 상기 세포를 주입하고 상기 세포 배 양을 위한 세포 배양 미디아(medium)를 주입하여 배양시키는 단계, (b) 상기 세포 배양액에 의해 배양된 세포에 생체 분자와 사멸 유도 물질을 함께 주입하는 단계 및 (c) 상기 (b)단계를 거친 상기 세포를 배양하면서 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 커패시턴스를 실시간으로 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일례에 따른 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서 및 이를 이용한 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법은 전극 사이에 특정 생체 분자의 수용체를 가지는 적어도 하나 이상의 세포를 부착시킨 뒤 시간의 경과에 따라 전극 간의 커패시턴스를 실시간으로 측정함으로써 생체 분자가 세포 표면의 수용체를 통하여 엔도시토시스 되는 과정을 실시간으로 모니터링 할 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세히 설명한다.
우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되 는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일례에 따른 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서는 바이러스 및 항체와 같이 세포 표면의 표적 수용체(receptor), 즉 바이러스 수용체(receptor) 혹은 항원등과 특이 결합(specific binding)을 하는 생체분자의 엔도시토시스(endocytosis) 과정과 흡착(adsorption)을 실시간으로 모니터링하기 위해 사용한다.
보다 상세하게는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서는 전극 사이의 이격된 공간에 특정 생체 분자의 수용체를 가지는 세포를 전극 사이에 부착시킨 뒤 시간의 경과에 따라 전극 간의 커패시턴스를 실시간으로 측정함으로써 생체분자가 세포 표면의 수용체를 통하여 엔도시토시스(endocytosis)되는 시점을 실시간으로 모니터링하기 위한 것이다. 이와 같은 실시간 모니터링을 통하여 바이러스 감염여부의 확인, 장체 스크리닝 연구 등을 수행할 수 있다.
이하에서는 먼저 셀센서를 설명하고, 이후에 셀센서를 이용하여 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법 및 이에 따른 실험 결과를 상세하게 설명한다.
도 1a 내지 1d는 본 발명에 따른 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서의 일례를 설명하기 위한 도이다.
도 1a에 도시된 바와 같이 세포(200)의 포텐셜(Potential)변화를 실시간으로 모니터링하는 셀센서(100)는 기판(110), 제 1 전극(121)과 제 2 전극(122) 및 패시베이션 레이어(131, 132)를 포함한다.
기판(110)은 글라스와 같은 부도체를 포함할 수 있으며, 제 1 전극(121)과 제 2 전극(122)은 기판(110)상에 서로 이격되어 형성되며, 상기 이격된 공간에 삽입된 세포(200)가 부착되도록 하는 기능을 한다.
이와 같은 제 1 전극(121)과 상기 제 2 전극(122) 사이의 이격 간격은 8um(마이크로미터)이상 100um이하, 제 1 전극(121)과 상기 제 2 전극(122) 각각의 높이는 80nm(나노미터)이상 200nm이하, 폭은 18um이상 100um이하가 되도록 할 수 있고, 재질은 전기 전도성을 가지는 금, 백금, 전도성 폴리머 중 어느 하나일 수 있으며, 이외에도 전기 전도성을 가지는 다른 물질도 가능하다.
도 1a에서는 일례로 제 1 전극(121)과 상기 제 2 전극(122) 사이의 이격 간격은 10um, 높이는 100nm, 폭은 20um, 재질은 금이 포함되는 것으로 하였다.
여기서,제 1 전극(121)과 상기 제 2 전극(122) 사이의 이격 간격은 8um(마이크로미터)이상 12um이하가 되도록 하는 것은 도 1 b와 같이 통상 세포(200) 하나의 크기와 비슷하게 하도록 함으로써 세포(200) 하나가 이격된 간격 사이에 부착되도록 하기 위함이다.
도 1a에서는 제 1 전극(121)과 상기 제 2 전극(122) 사이의 이격 간격이 10um인 경우를 일례로 설명하였지만, 이와 다르게 제 1 전극(121)과 상기 제 2 전극(122) 사이의 이격 간격이 8um(마이크로미터)이상 100um이하가 되도록 하여 복수 개의 세포에 대해서 한꺼번에 모니터링 할 수도 있는 것이다. 이와 같이 제 1 전극(121)과 상기 제 2 전극(122) 사이의 이격 간격은 다양하게 구현될 수 있는 것이다. 이하에서는 제 1 전극(121)과 상기 제 2 전극(122) 사이의 이격 간격이 10um인 경우를 일례로 설명한다.
이와 같이 적어도 하나 이상의 세포(200)가 한 쌍의 전극 사이의 이격된 공간에 부착되도록 함으로써 생체분자가 표적 수용체에 부착하여 세포(200) 내로 엔도시토시스(endocytosis) 될 때의 세포(200)막의 퍼텐셜의 변화를 실시간으로 모니터링 할 뿐만 아니라 생체분자의 엔도시토시스(endocytosis)로 인한 세포(200)질 및 세포(200)내의 단백질 합성 등에 관계되는 퍼텐셜(potential)변화를 실시간으로 모니터링할 수 있는 것이다.
보다 상세하게는 이와 같은 셀 센서는 한 쌍의 전극 사이에 세포(200)를 놓고 배양함으로써 세포(200)를 측정하는 전극이 커패시터로(capacitor) 작용할 수 있게 한다. 세포(200)는 이중 지질 막으로 이루어진 세포(200)벽이 전하를 가지는 분자가 많은 세포(200)내부와 세포(200)외부의 미디아를 분리시키며 절연하는 역할을 한다.
이러한 세포(200)벽의 존재로 인해 세포(200)는 전기적으로 부도체의 특성을 나타내나 미디아 속에서 교류전기장에 노출되게 되면 쌍극성이 세포(200)에 유도되게 된다. 또한, 세포(200)의 유전특성은 세포(200)의 크기와 형태, 세포(200)막의 표면 전하, 세포(200)내부의 전도도 등에 영향을 받게 되는데 이러한 유전 특성은 낮은 주파수 영역대 (3kHz)에서 커패시턴스를 통해 측정될 수 있다.
이를 이용하여 수용체를 통해 생체분자가 표적 수용체에 부착하여 세포(200) 내로 엔도시토시스(endocytosis) 될 때의 세포(200)막의 퍼텐셜의 변화를 실시간으로 모니터링 할 뿐만 아니라 생체분자의 엔도시토시스(endocytosis)로 인한 세포(200)질 및 세포(200)내의 단백질 합성 등에 관계되는 퍼텐셜(potential)변화 또는 세포(200)내부의 전도도 변화를 커패시턴스 변화를 통하여 실시간으로 모니터링 할 수 있는 것이다.
패시베이션 레이어(131, 132)는 상기 세포(200)가 상기 제 1 전극(121) 및 제 2 전극(122)의 상부에 부착되는 것을 방지하기 위해 상기 제 1 전극(121) 및 제 2 전극(122) 각각의 상부에 형성된다.
이와 같은 패시베이션 레이어(131, 132)는 패시베이션 레이어(131, 132) 사이의 이격 간격은 8um이상 100um이하, 각각의 높이는 45nm이상 55nm이하, 각각의 폭은 18um이상 100um이하가 되도록 할 수 있고, 세포(200)가 제 1 전극(121) 및 제 2 전극(122)의 상부에 부착되는 것을 방지하기 위해 패시베이션 레이어(131, 132)는 비전도성 물질로 형성될 수 있으며, PMMA(Polymethyl Methacrylate) 또는 실리콘 옥사이드(Si02) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 이와 같은 제 1 전극과 상기 제 2 전극 각각의 상부에 형성되는 상기 패시베이션 레이어 사이의 이격 간격, 높이, 폭은 전극 사이의 간격과 높이 폭에 따라 다향하게 구현될 수 있다.
도 1a에서는 이와 같은 패시베이션 레이어(131, 132)의 일례로, 패시베이션 레이어(131, 132) 사이의 이격 간격이 10um, 각각의 높이는 50nm, 각각의 폭은 20um인 것으로 하였고, 패시베이션 레이어(131, 132)의 물질이 실리콘 옥사이드(Si02)인 것을 일례로 하였다.
이와 같이 세포(200)의 포텐셜(Potential)변화를 실시간으로 모니터링하는 셀센서(100)는 도 1c에 도시된 바와 같이 플루이딕 채널(140)(Fluidic channel)을 더 포함할 수 있다.
이와 같은 플루이딕 채널(140)은 제 1 전극(121) 및 제 2 전극(122) 사이의 이격된 공간을 포함하여 형성되고, 이격된 공간에 상기 세포(200)와 항원 항체 반응을 하는 생체분자 또는 세포(200) 사멸 유도 물질 중 적어도 하나를 주입하기 위한 입구(141)(Inlet) 및 상기 이격된 공간으로부터 상기 생체분자 또는 상기 세포(200) 사멸 유도 물질 중 적어도 하나를 추출하기 위한 출구(142)(Outlet)를 포함한다. 이와 같은 플루이딕 채널(140)은 소정의 두께까지는 투명성이 유지되며 내구성이 유지되는 아크릴(acryl) 또는 PDMS (Polydimethylsiloxane) 중 적어도 하나를 포함하여 형성될 수 있으며, 상기 플루이딕 채널(140)이 없는 상태에서 셀센서(100)의 전극 쌍을 살균 세척한 후 생체분자나 세포(200) 사멸 유도 물질을 주입하기 위해 상기 기판(110) 및 상기 제 1, 2 전극에 탈부착이 가능하도록 설계할 수 있다.
도 1d는 세포(200)의 포텐셜(Potential)변화를 실시간으로 모니터링하는 셀센서(100)를 실제 구현한 일례이다.
도시된 바와 같이 셀센서(100)는 이격된 공간에 주입된 세포(200)를 배양하기 위한 세포(200) 배양액이 외부로 누출되는 것을 방지하기 위한 웰(150)이 더 형성될 수 있다.
이와 같은 웰(150)은 도시된 바와 같이 플루이딕 채널(140) 내부에 형성될 수 있으며, 플루이딕 채널(140)과 동일한 재질인 아크릴(acryl) 또는 PDMS(Polydimethylsiloxane) 중 적어도 하나를 포함하여 형성될 수 있다. 이와 같은 웰(150)은 도시된 바와 같이 전술한 플루이딕 채널(140)내부에 일체형으로 형성될 수도 있다.
이와 같은 셀센서(100)는 커패시턴스의 측정이 가능한 LCR meter(LCR 측정기)에 연결되어 세포(200)의 포텐셜(Potential)변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있는 것이다. 이때 이와 같은 셀센서(100)에는 3KHz의 주파수를 지니는 10mV 교류 전압이 공급된다. 여기서, 셀센서(100)에 공급되는 교류 전압의 주파수는 제 1 전극(121)과 제 2 전극(122) 사이의 간격에 따라 달라질 수 있으므로, 저주파 영역의 주파수라면 3KHz의 주파수가 아닌 다른 주파수라도 가능하다.
이와 같은 셀센서(100)는 기판(110)을 공통으로 하고, 기판(110)상에 제 1 전극(121)과 제 2 전극(122)으로 이루어진 복수 개의 전극 쌍이 어레이(Array)될 수도 있다.
또한, 복수 개의 전극 쌍이 하나의 기판(110) 상에 어레이 되도록 함으로써 한 번에 다량의 샘플 측정이 가능하고, 측정 효율을 극대화시킬 수 있는 것이다.
도 2a 내지 2c는 복수 개의 전극 쌍이 하나의 기판 상에 어레이 된 일례를 설명하기 위한 도이다.
이하에서는 한 쌍의 전극으로 이루어진 셀센서(100)를 "단위 셀센서(100)", 다수의 단위 셀센서(100)를 배열하여 집적시킨 셀센서(100)를 "어레이 셀센서"라 하기로 한다.
어레이 셀센서는 다수의 단위 셀센서(100)를 도 2a와 같이 각각의 전극 쌍에 서로 다른 전압이 인가될 수 있도록 배열하고 각 단위 셀센서(100)의 배선 패턴을 한 방향으로 집중시켜 각 단위 셀센서(100)의 측정이 용이하도록 구현될 수 있다. 각 단위 셀센서(100)는 기판(110)을 공통으로 사용하며, 일체형의 웰(150)이 구비된다. 이러한 웰(150)은 사출성형 등의 방법을 이용하여 간단하게 제조될 수 있으며, 탈부착이 가능하도록 구비될 수도 있다.
또한, 어레이 셀센서는 이와 다르게 도 2b와 같이 형성될 수도 있다.
또한, 어레이 셀 센서는 도 2c와 같이 다수의 단위 셀센서(100)의 전극 쌍이 서로 공통된 전압이 인가되도록 배열할 수도 있다.
이와 같은 어레이 셀센서의 각 단위 셀센서(100)에 형성되는 웰(150)은 포토리소그래피(photolithgraphy) 방법에 의해 얼마든지 형성할 수 있다.
이와 같이 단위 센센서를 하나의 기판 상에 복수 개 집적시킨 어레이 셀센서를 통하여 복수의 세포에 대해 한꺼번에 모니터링이 가능하게 할 수 있는 것이다.
도 3은 셀센서에서의 세포 배양을 위한 인큐베이터를 비롯한 측정 장비를 도 시한 도이다.
세포 배양용 인큐베이터(I) 내부는 세포가 배양하기에 적당한 온도와 이산화탄소 농도로 유지된다. 셀센서(100)의 각 전극은 LCR 미터(L)의 단자와 전기적으로 연결되며, LCR 미터(L)를 통해 측정된 전극간 커패시턴스는 컴퓨터(C)를 통해 플로팅(plotting)될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따른 셀센서를 이용하여 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 전술한 바와 같은 셀센서를 제작한다. 제작한 전극을 오토 클래이브(autoclave) 장비 및 에탄올을 이용하여 살균한 후, 세포 배양을 위해 전극 상에 아크릴 또는 PDMS로 제작된 웰을 부착한다.
다음, 일정한 밀도로 성장된 세포를 트립신-EDTA를 이용하여 하비스트(harvest)한 후 파이펫을 이용해 전극 사이의 이격된 공간에 세포를 주입하여 부착시킨다. 이후 세포가 전극 사이에 단단히 부착되게 하기 위하여 세포를 로딩한 전극을 온도가 37 oC, CO2 농도가 5%로 조절되는 세포배양용 인큐베이터에 넣고 12시간 정도 배양한다. 배양 중 실험에 적합한 세포의 상태를 광학 현미경을 통해 체크해준다.
이후, 세포가 단단히 부착된 전극 위에 플루이딕 채널을 부착시키고 이것을 바닥온도가 37 oC로 유지되는 광학현미경의 스테이지에 고정시킨다. 그리고, 플루이딕 채널의 입구(inlet)을 통하여 세포 배양 미디아 및 엔도시토시스(endocytosis) 또는 흡착(adsorption) 반응을 관찰하고자 하는 생체분자 또는 세포 사멸 유도 물질 또는 금속 입자 중 적어도 하나를 넣어준다. 여기서, 세포 배양액을 이용하여 상기 생체 분자 또는 상기 사멸 유도 물질 중 적어도 하나의 농도를 조절할 수도 있다.
이후, 세포를 배양하면서 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 커패시턴스를 실시간으로 측정하여, 세포 표면의 수용체를 통하여 상기 생체 분자가 상기 세포 내로 엔도시토시스(endocytosis) 또는 흡착(adsorption)되는 시점을 실시간으로 모니터링한다.
여기서, 세포는 수용체(Receptor)인 CAR(coxsackie and adenovirus receptor)가 발달되어 있는 HEP1 세포 또는 수용체인 ErbB-2(HER2/neu)가 과발현되어있는 유방암 세포주인 435 세포 중 어느 하나일 수 있다.
여기서, 세포 배양 미디아는 10% 송아지 태아 혈청(fetal calf serum; FCS)을 포함한 동물세포배양용 배지(Dulbeco's Modified Eagle's Medium;DMEM), RPMI(Rosewell Park Memorial Institue) 1640 Medium, MEM(Minimum Essential Medium) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 생체 분자는 아데노바이러스(adenovirus), CAR항체(Car-antibody) 또는 허셉틴(herceptin) 중 어느 하나일 수 있다. 여기서, Herceptin은 ErbB-2(HER2/neu)에 대한 항체로 전이성 유방암, 골육종 등에 사용되는 항암제이다.
또한, 사멸 유도 물질은 TRAIL(Tumor necrosis factor Related Apoptosis Inducing Ligand)을 포함하는 바이러스, 박테리아, 핵산, 약물 중 어느 하나를 포 함할 수 있다.
그리고 금속 입자는 나노미터 단위의 금속 입자가 될 수 있으며, 본 발명에서는 일례로 금속 입자로 직경이 10nm인 금 나노입자(Gold nanoparticle)를 일례로 들었다.
도 4 내지 도 16b에서는 셀센서를 이용하여 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과이다.
도 4는 HEP-1 세포가 성장할 때의 커패시턴스와 세포 사멸 유도 물질인 TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)에 의해 사멸될 때의 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과이다. 이때 TRAIL은 세포배양 미디아를 이용하여 최종 농도가 50ng/ml이 되도록 조정하였다.
도시된 바와 같이 본 발명의 일례에 따른 셀센서를 이용하여 세포의 커패시턴스를 측정할 경우 세포가 성장하는 경우(410)에는 세포의 포텐셜 에너지가 증가하여 커패시턴스가 증가하고 반대로 세포가 사멸하는 경우(420)에는 커패시턴스가 감소하는 경향을 지님을 알 수 있다.
도 5a는 Ad-Δ19바이러스와 dl-ΔE1 바이러스, dl-ΔE1/ΔE3 바이러스를 챔버(chamber) 당 1*105 개의 농도로 처리해줬을 때의 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과이다.
여기서, 510은 HEP1 세포를 성장하는 경우 커패시턴스 변화량이고, 520은 HEP1 세포에 dl-ΔE1 바이러스를 챔버(chamber) 당 1*105 개의 농도로 처리해줬을 때의 커패시턴스 변화량, 530은 HEP1 세포에 Ad-Δ19바이러스를 챔버(chamber) 당 1*105 개의 농도로 처리해줬을 때의 커패시턴스 변화량, 540은 HEP1 세포에 dl-ΔE1/ΔE3 바이러스를 챔버(chamber) 당 1*105 개의 농도로 처리해줬을 때의 커패시턴스 변화량이다.
여기서, Ad-Δ19바이러스는 세포를 죽이는 사멸 인자(death factor)를 가지는 바이러스이고, dl-ΔE1 바이러스는 내부에 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)발현 단백질을 가지는 바이러스이고, dl-ΔE1/ΔE3 바이러스는 내부에 아무것도 포함하지 않는 바이러스껍질만 가진 형태이다.
1*105 개의 농도는 Ad-Δ19바이러스의 사멸 인자(death factor)가 세포의 생장에 큰 영향을 미치지 못하는 농도이므로 dl-ΔE1 바이러스, dl-ΔE1/ΔE3 바이러스와 비교하기 용이하다. 세 가지 종류의 바이러스 모두 바이러스 주입 후 커패시턴스가 증가하여 30분에서 50분 사이에 피크점을 가진 뒤 커패시턴스가 다시 감소하는 경향성을 가진다. 30분에서 50분 사이의 피크가 생기고 난 후 세가지 경우 모두 커패시컨스가 증가하는 모습을 보여준다. 이때의 커패시턴스 기울기는 컨트롤로 제시된 HEP1 세포의 성장결과와 비슷한 기울기를 가지므로 피크점을 가진 이후 세포가 제대로 성장함을 알 수 있다.
이와 같이 세 가지 종류의 바이러스 모두에서 피크점을 가지는 것은 세 가지 바이러스(Ad-Δ19바이러스, dl-ΔE1 바이러스, dl-ΔE1/ΔE3 바이러스)는 모두 아데노바이러스의 일종으로, 도 5b와 같이 HEP1 세포의 표면 막(membrane)에 발현되어 있는 CAR 섬유 수용체(CAR fiber Receptor)에 바이러스의 섬유봉(Fiber knob)이 특이 결합(specific binding)함으로써 세포 내부로 엔도시토시스(endocytosis)되어 내재화(Internalization)되는 과정에서 세포의 포텐셜 에너지가 증가하기 때문이다. 이는 이후의 실험 결과에서도 확인할 수 있다.
도 6은 CAR에 특이결합을 하는 항체인 Car-antibody, 세포 내의 모든 단백질합성을 저해 시키는 단백질 억제제(protein inhibitor), 바이러스의 RNA 복제를 막아 세포 내 바이러스 합성을 막는 항바이러스제(antiviral agent)의 일종인 리바비린(Ribavirin)을 사용했을 때 (a) Ad-Δ19바이러스와 (b) dl-ΔE1 바이러스, (c) dl-ΔE1/ΔE3 바이러스를 각각 처리하여 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과이다.
도 6의 (a)에서 610은 HEP1 세포를 성장시키는 경우의 커패시턴스 변화량이고, 611은 HEP1 세포에 사멸 인자(death factor)를 가지는 Δ19바이러스를 추가로 더 주입한 경우, 612는 Car-antibody와 Δ19바이러스, 613은 단백질 억제제(protein inhibitor)와 Δ19바이러스, 614는 리바비린과 Δ19바이러스를 함께 주입한 경우의 커패시턴스 변화량이다.
(b)에서 621은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)발현 단백질 을 가지는 dl-ΔE1 바이러스를 추가한 경우, 622는 dl-ΔE1 바이러스와 Car-antibody, 623은 단백질 억제제와 dl-ΔE1 바이러스, 624는 리바비린과 dl-ΔE1 바이러스를 함께 주입한 경우커패시턴스 변화량이다.
(c)에서 631은 바이러스 껍질만 가지는 dl-ΔE1/ΔE3 바이러스를 추가한 경우, 632는 dl-ΔE1/ΔE3 바이러스와 Car-antibody, 623은 단백질 억제제와 dl-ΔE1/ΔE3 바이러스, 624는 리바비린과 dl-ΔE1/ΔE3 바이러스를 함께 주입한 경우커패시턴스 변화량이다.
이 실험에서는 Car-antibody가 세포에 충분히 붙을 수 있도록 Car-antibody용액을 세포에 처리하여 20분간 방치한 뒤 바이러스를 넣어준 뒤 측정한다. 이때 각각의 Δ19바이러스, dl-ΔE1 바이러스, dl-ΔE1/ΔE3 바이러스는 각 챔버당 1*105개로 세포의 성장에 영향을 주지 않는 농도를 이용하였다
그 결과 611,621, 631에서와 같이 바이러스만 넣었을 때에는 30~50분 사이 초기 피크치가 나타나 특이 결합을 하는 것을 알 수 있고, 612, 622, 632에서 알 수 있듯이 Car-antibody와 바이러스를 함께 주입했을 때 초기 30~50분사이의 피크가 관찰되지 않으며 200~300분 사이에 커패시턴스가 서서히 증가했다가 감소하는 것을 알 수 있다. 이와 같이 초기 피크치가 나타나지 않는 것은 Car-antibody가 세포의 바이러스 표적 수용체인(CAR)에 붙어서 바이러스가 수용체를 통하여 세포 내로 엔도시토시스(endocytosis)되는 것을 방해하기 때문이다. 그러나 시간이 흐른 후 Car-antibody 역시 CAR에 붙어서 세포 내로 들어갈 수 있으므로 일정 시간이 지 나게 되면 HEP1 세포는 바이러스 수용체가 다시 바이러스를 받아들일 수 있는 상태로 회복하게 된다. 이는 단백질 억제제와 리바비린을 첨가했을 때와 비교하면 더욱 명백해진다.
즉, Car-antibody를 세포 내로 전달한 뒤 다시 그 기능을 회복한 HEP1 세포는 바이러스 수용체에 의해 바이러스가 원래의 시간대보다 늦은 시간대에 세포 내로 서서히 엔도시토시스(endocytosis) 된 것을 알 수 있다. 이 결과는 Ad-Δ19바이러스, dl-ΔE1 바이러스, dl-ΔE1/ΔE3 모두에서 동일하게 관찰된다.
단백질 억제제(protein inhibitor)을 세포에 전 처리하여 바이러스의 엔도시토시스(endocytosis) 반응을 관찰했을 경우(613, 623, 633)와 Ribavirin을 세포에 전 처리하여 바이러스의 엔도시토시스(endocytosis) 반응을 관찰했을 경우(614, 624, 634)에는 car-antibody를 사용했을 때와는 달리 초기 피크는 관찰되나 피크 후의 반응은 세포 내 단백질 합성 저하로 인한 세포 기능 저하로 커패시턴스가 감소하는 것을 알 수 있다.
따라서 바이러스와 표적 수용체의 결합을 방해하는 Car-antibody 실험을 근거로 했을 때 바이러스를 세포에 넣어준 경우 나타나는 초기 피크는 세포에 존재하는 바이러스 수용체와 바이러스의 특이 결합(specific binding)에 의한 엔도시토시스(endocytosis) 피크임을 알 수 있는 것이다.
도 7의 (a)는 HEP1 세포에 Δ19바이러스와 Car-antibody를 각각 처리하고, (b)는 HEP1 세포에 Δ19바이러스와 Car-antibody를 처리하고 허셉틴(herceptin)의 표적 수용체인 ErbB-2 (HER2/neu) 과발현 되어있는 유방암 세포주인 435 세포에 허셉틴(herceptin)을 각각 처리하여 서로 비교할 수 있도록 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과이다.
(a)에서 710은 HEP1 세포를 성장시킨 경우, 711은 Δ19바이러스를 세포의 성장에 영향을 주는 농도인 1X108개로 처리한 경우, 712는 Δ19바이러스를 세포의 성장에 영향을 주지 않는 농도인 1X105개로 처리한 경우, 713은 Car-antibody-1을 714는 Car-antibody-2를 처리한 경우이고, (b)에서 720은 HEP1 세포를 성장시킨 경우, 721은 721은 Δ19바이러스를 세포의 성장에 영향을 주는 농도인 1X108개로 처리한 경우, 722는 Δ19바이러스를 세포의 성장에 영향을 주지 않는 농도인 1X105개로 처리한 경우, 713은 Car-antibody-1을 714는 Car-antibody-2를 처리한 경우, 725는 ErbB-2 (HER2/neu) 과발현 되어있는 유방암 세포주인 435 세포에 허셉틴(herceptin)을 처리한 경우이다.
도 7의 (a)에 나타난 바와 같이 커패시턴스 측정 결과를 통해 아데노바이러스와 마찬가지로 CAR수용체에 부착되는 Car-antibody를 바이러스와 같은 방법으로 HEP1세포에 처리해준 결과가 초기 피크가 생체분자의 표적 수용체와의 결합에 의한 엔도시토시스(endocytosis)임을 알 수 있다. Car-antibody를 사용했을 경우에도 바이러스와 비슷한 시간대에 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있다.
또한 도 7의 (b)와 같이, 단일 클론 항체 약물로서 ErbB-2 (HER2/neu) 수용 체를 표적으로 하는 허셉틴(Herceptin)을 이용하여 ErbB-2 (HER2/neu)수용체가 과발현되어있는 유방암 세포주 435 세포를 이용하여 같은 방법으로 처리해준 결과 바이러스, Car-antibody와 비슷한 피크를 나타내는 것을 관찰할 수 있다. 따라서 본 발명의 일례에 따른 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서는 커패시턴스 측정으로 생체 분자와 세포 수용체의 결합을 측정할 수 있음을 아데노바이러스와 Car-antibody, Herceptin 결과로 알 수 있는 것이다.
도 8은 유방암 세포주 435 세포에 허셉틴(Herceptin)의 농도를 각각 다르게 처리한 경우 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과이다.
도시된 바와 같이, 435 세포에 발현되어 있는 ErbB-2 (HER2/neu)수용체에 허셉틴(Herceptin)이 특이 결합(specific binding)을 하게되므로 허셉틴의 농도에 따라 초기 피크치가 각각 다르게 나타남을 알 수 있는 것이다.
도 9는 흡착(adsorption)에 의한 엔도시토시스(endocytosis)가 이루어지는 경우 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과이다.
도 9의 (a)에 도시된 바와 같이, 세포에 표적 수용체에 의한 엔도시토시스(endocytosis)가 아닌 흡착(adsorption)에 의한 엔도시토시스(endocytosis)를 하는 레트로바이러스 계열의 렌티바이러스(lentivirus)를 세포에 처리해준 결과, 표적 수용체에 의한 엔도시토시스(endocytosis)와는 다르게 초기 피크가 관찰되지 않는다.
도 9의 (b)에 도시된 바와 같이, 흡착(adsorption)에 의해 세포 내로 유입되는 폴리스타일렌 비드(polystyrene bead)와 PLGA((polylactic-co-glycolic acid)) 파티클을 각각 세포에 처리한 결과, 바이러스를 처리해줬을 때 와는 달리 폴리스타이렌 비드(polystyrene bead)와 PLGA 파티클을 사용했을 경우는 렌티바이러스(lentivirus)와 마찬가지로 초기 피크가 관찰되지 않는다.
이를 통해서, 엔도시토시스에 의한 세포의 포텐셜 에너지 증가는 특이 결합(specific binding)을 하는 표적 수용체에 의한 엔도시토시스에만 나타나고, 특이 결합(specific binding)이 없이 흡착에 의한 엔도시토시스의 경우에는 발생하지 않음을 알 수 있다. 이는 도 10의 경우에 더 명확해 진다.
도 10은 세포에 주입되는 폴리스타일렌 비드(polystyrene bead)의 농도를 각각 다르게 하여 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과이다.
리셉터(Receptor)를 통해 들어가는 경우와 같은 특이 결합이 없는 폴리스타일렌 비드의 경우 초기 피크치가 관찰되지 않는다. 그리고 농도에 따른 커패시터스를 볼때 커패시턴스가 감소하는 부분이 비드가 세포 내로 흡착되어 엔도시토시스되는 과정으로 볼 수 있으며, 농도가 작을수록 커패시턴스의 감소 시간이 짧아지는 것을 알 수 있다.
도 11은 세포에 주입되는 금 나노입자의 농도를 각각 다르게 하여 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과이다.
세포의 리셉터와 특이 결합 없이 흡착되어 세포 내로 들어가는 금 나노 입자의 경우에도 초기 피크지를 관찰할 수 없으며, 커패시턴스가 감소하는 시간 동안 금나노 입자가 세포 내부로 들어가는 과정으로 볼 수 있으며, 농도가 작을수록 커패시턴스의 감소 시간이 짧아짐을 알 수 있다.
도 12는 녹색 형광 단백질이 붙어있는 바이러스가 세포의 수용체에 의해 내부로 엔도시토시스 되는 과정을 전반사형광(Total Internal Reflection Fluorescence;TIRF) 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도시된 바와 같이, 바이러스는 녹색의 형광점으로 표현되는데 시간에 따라 세포의 외각을 따라 형광점의 밝기가 점점 선명해 지는 것을 알 수 있다. 이것은 32분에 해당하는 이미지에서 가장 밝게 관찰되며 그 이후로는 점점 흐려진다. 즉, 바이러스가 32분까지는 엔도시토시스(endocytosis)을 위하여 세포벽에 발달한 표적 수용체(CAR)에 붙게 되고 32분 이후에는 세포 내로 들어가게 되어 형광이 서서히 사라진다고 할 수 있다. TIRF상에서 형광점의 밝기가 가장 밝은 시점과 LCR 측정 장치로 측정시에 초기 피그가 나타나는 시간대가 비슷한 것으로 우리가 측정한 피크가 생체분자가 세포 수용체와 특이 결합을 할 때임을 알 수 있다.
도 13은 세포에 적색 염료인 로다민이 붙어있는 폴리스타이렌 비드(polystyrene bead)를 처리한 경우 흡착(adsorption)에 의한 엔도시토시스 되는 과정을 전반사형광(Total Internal Reflection Fluorescence;TIRF) 현미경으로 촬 영한 이미지이다.
도시된 바와 같이, 비드에 해당되는 붉은 형광색이 끝까지 나타나는 것으로 보아 표적 수용체에 의한 엔도시토시스(endocytosis)이 아닌 흡착(adsorption)에 의한 엔도시토시스임을 알 수 있다.
이와 같이 본 발명의 일례에 따른 셀센서를 이용하여 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 방법은 일반 형광 현미경 방식으로는 포착하기 힘든 생체분자의 엔도시토시스(endocytosis)과정을 커패시턴스 센서를 이용하여 실시간으로 측정할 수 있다. 또한, 본 셀센서를 이용하여 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 방법에 의하면 생체분자가 표적 수용체(CAR)에 흡착되어 엔도시토시스endocytosis)되는 순간 커패시턴스 세포의 퍼텐셜 변화로 인하여 피크값이 발생하게 된다. 이와 같은 모니터링 방법에 사용되는 생체 분자는 아데노바이러스, Car-antibody, Herceptin 뿐만 아니라 유전자 전달목적으로 사용되는 여러 종류의 바이러스를 실험 대상으로 할 수 있어 생물학적 메커니즘을 전기적 신호로 분석하여 기초 연구에 도움이 될 수 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도 면에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
도 1a 내지 1d는 본 발명에 따른 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서의 일례를 설명하기 위한 도.
도 2a 내지 2c는 복수 개의 전극 쌍이 하나의 기판 상에 어레이 된 일례를 설명하기 위한 도.
도 3은 셀센서에서의 세포 배양을 위한 인큐베이터를 비롯한 측정 장비를 도시한 도.
도 4는 HEP-1 세포가 성장할 때의 커패시턴스와 세포 사멸 유도 물질인 TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)에 의해 사멸될 때의 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과.
도 5a는 Ad-Δ19바이러스와 dl-ΔE1 바이러스, dl-ΔE1/ΔE3 바이러스를 챔버(chamber) 당 1*105 개의 농도로 처리해줬을 때의 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과.
도 5b는 엔도시토시스를 설명하기 위한 도.
도 6은 Car-antibody, 단백질 억제제(protein inhibitor), 리바비린(Ribavirin)을 사용했을 때 (a) Ad-Δ19바이러스와 (b) dl-ΔE1 바이러스, (c) dl-ΔE1/ΔE3 바이러스를 각각 처리하여 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과.
도 7의 (a)는 HEP1 세포에 Δ19바이러스와 Car-antibody를 각각 처리하고, (b)는 HEP1 세포에 Δ19바이러스와 Car-antibody를 처리하고 허셉틴(herceptin)의 표적 수용체인 ErbB-2 (HER2/neu) 과발현 되어있는 유방암 세포주인 435 세포에 허셉틴(herceptin)을 각각 처리하여 서로 비교할 수 있도록 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과.
도 8은 유방암 세포주 435 세포에 허셉틴(Herceptin)의 농도를 각각 다르게 처리한 경우 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과.
도 9는 흡착(adsorption)에 의한 엔도시토시스(endocytosis)가 이루어지는 경우 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과.
도 10은 세포에 주입되는 폴리스타일렌 비드(polystyrene bead)의 농도를 각각 다르게 하여 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과.
도 11은 세포에 주입되는 금 나노입자의 농도를 각각 다르게 하여 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링한 결과.
도 12는 녹색 형광 단백질이 붙어있는 바이러스가 세포의 수용체에 의해 내부로 엔도시토시스 되는 과정을 전반사형광(Total Internal Reflection Fluorescence;TIRF) 현미경으로 촬영한 이미지.
도 13은 세포에 적색 염료인 로다민이 붙어있는 폴리스타이렌 비드(polystyrene bead)를 처리한 경우 흡착(adsorption)에 의한 엔도시토시스 되는 과정을 전반사형광(Total Internal Reflection Fluorescence;TIRF) 현미경으로 촬영한 이미지.
<도면의 주요 부분에 대한 도면 부호의 설명>
100 : 셀센서 110 : 기판
121 : 제 1 전극 122 : 제 2 전극
131, 132 : 패시베이션 레이어
140 : 플루이딕 채널
150 : 웰

Claims (24)

  1. 기판;
    상기 기판상에 서로 이격되어 형성되며, 상기 이격된 공간에 주입된 적어도 하나 이상의 세포가 부착되도록 하는 제 1 전극과 제 2 전극; 및
    상기 제 1 전극 및 제 2 전극 각각의 상부에 형성되어 상기 세포가 상기 제 1 전극 및 제 2 전극의 상부에 부착되는 것을 방지하기 위한 패시베이션 레이어;
    를 포함하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 전극과 상기 제2 전극은 금, 백금, 전도성 폴리머 중 어느 하나의 재질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 커패시턴스(capacitance)를 측정함으로써 상기 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 전극과 상기 제 2 전극 각각의 상부에 형성되는 상기 패시베이션 레이어 사이의 이격 간격은 상기 제 1 전극과 상기 제 2 전극 사이의 이격 간격과 동일한 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 패시베이션 레이어는 비전도성 물질로 형성되는 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 패시베이션 레이어는 PMMA(Polymethyl Methacrylate) 또는 실리콘 옥사이드(Si02) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서는
    상기 이격된 공간을 포함하여 형성되고, 상기 이격된 공간에 상기 세포와 항원 항체 반응을 하는 생체분자 또는 세포 사멸 유도 물질 중 적어도 하나를 주입하기 위한 입구(Inlet) 및 상기 이격된 공간으로부터 상기 생체분자 또는 상기 세포 사멸 유도 물질 중 적어도 하나를 추출하기 위한 출구(Outlet)를 포함하는 플루이 딕 채널(Fluidic channel);
    을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 플루이딕 채널은
    아크릴(acryl) 또는 PDMS(Polydimethylsiloxane) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 플루이딕 채널은 상기 기판 및 상기 제 1, 2 전극에 탈부착이 가능한 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서는
    상기 이격된 공간에 주입된 세포를 배양하기 위한 세포 배양액이 외부로 누출되는 것을 방지하기 위한 웰;
    을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 웰은 아크릴(acryl) 또는 PDMS(Polydimethylsiloxane) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 기판을 공통으로 하고, 상기 기판상에 상기 제1 전극과 상기 제2 전극으로 이루어진 복수 개의 전극 쌍이 어레이(array)된 것을 특징으로 하는 세포의 커패시턴스를 실시간으로 모니터링하는 셀센서.
  13. 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법에 있어서,
    (a) 제1항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 셀 센서의 상기 이격된 공간에 표적 수용체가 있는 세포를 주입하고 상기 세포 배양을 위한 세포 배양 미디아(medium)를 주입하여 배양시키는 단계;
    (b) 상기 세포 배양액에 의해 배양된 상기 세포의 표적 수용체와 특이 결합(Specific binding)을 하는 생체 분자를 주입하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계를 거친 상기 세포를 배양하면서 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 커패시턴스를 실시간으로 측정하는 단계;
    를 포함하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포는
    아데노바이러스와 Car-antibody의 표적 수용체(Receptor)인 CAR(coxsackie and adenovirus receptor)가 발달되어 있는 HEP1 세포 또는 허셉틴(herceptin)의 표적 수용체인 ErbB-2 (HER2/neu) 과발현 되어있는 유방암 세포주인 435 세포 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포 배양 미디아는
    DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI(Rosewell Park Memorial Institue) 1640 Medium, MEM(Minimum Essential Medium) 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 생체 분자는
    아데노바이러스, Car-antibody 또는 허셉틴(herceptin) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서,
    상기 (c)단계는
    커패시턴스를 실시간으로 측정하여 상기 세포 표면의 수용체를 통하여 상기 생체 분자가 상기 세포 내로 엔도시토시스(endocytosis) 되는 시점을 실시간으로 모니터링하는 것을 특징으로 하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  18. 제 13 항에 있어서,
    상기 (c)단계 이전에 상기 세포 배양액을 이용하여 상기 생체 분자의 농도를 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  19. 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법에 있어서,
    (a) 제1항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 셀센서의 상기 이격된 공간에 표적 수용체가 있는 세포를 주입하고 상기 세포 배양을 위한 세포 배양 미디아(medium)를 주입하여 배양시키는 단계;
    (b) 상기 세포 배양액에 의해 배양된 세포에 금속 입자 또는 사멸 유도 물질을 주입하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계를 거친 상기 세포를 배양하면서 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 커패시턴스를 실시간으로 측정하는 단계;
    를 포함하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 사멸 유도 물질은
    TRAIL(Tumor necrosis factor Related Apoptosis Inducing Ligand)을 포함하는 바이러스, 박테리아, 핵산, 약물 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 (c)단계는
    커패시턴스를 실시간으로 측정하여 상기 세포 표면의 수용체를 통하여 또는 흡착(adsorption)을 통하여 상기 사멸 유도 물질이 상기 세포 내로 엔도시토시스(endocytosis)되는 시점을 실시간으로 모니터링하는 것을 특징으로 하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서,
    상기 (c)단계 이전에 상기 세포 배양액을 이용하여 상기 사멸 유도 물질의 농도를 조절하거나 상기 금속 입자의 농도를 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  23. 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법에 있어서,
    (a) 제1항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 셀센서의 상기 이격된 공간 에 표적 수용체가 있는 세포를 주입하고 상기 세포 배양을 위한 세포 배양 미디아(medium)를 주입하여 배양시키는 단계;
    (b) 상기 세포 배양액에 의해 배양된 세포의 표적 수용체와 특이 결합을 하는 생체 분자와 사멸 유도 물질을 함께 주입하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계를 거친 상기 세포를 배양하면서 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 커패시턴스를 실시간으로 측정하는 단계;
    를 포함하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 (c)단계 이전에 상기 세포 배양액을 이용하여 상기 생체 분자 또는 상기 사멸 유도 물질 중 적어도 하나의 농도를 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101420916B1 (ko) 2012-05-22 2014-07-17 한양대학교 산학협력단 세포 계수 장치 및 세포 계수 방법

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120087933A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Samson Tom Enhanced msc preparations
CN104898871B (zh) * 2014-03-05 2018-10-26 宸鸿光电科技股份有限公司 触控模块的制造方法
US10495560B2 (en) * 2015-02-06 2019-12-03 Korea Research Institute Of Standards And Science Method of screening drugs
KR101646629B1 (ko) * 2015-02-06 2016-08-16 한국표준과학연구원 약물 스크리닝 방법
WO2018119003A1 (en) * 2016-12-19 2018-06-28 The Regents Of The University Of California Virus composite biosensor
CN107219274B (zh) * 2017-05-27 2019-05-17 江南大学 一种分析真菌毒素联合毒性的细胞电化学传感器

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010011212A (ko) * 1999-07-26 2001-02-15 구자홍 동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법
KR20020086625A (ko) * 2001-01-09 2002-11-18 마쯔시다덴기산교 가부시키가이샤 세포외 전위 측정용 디바이스, 그것을 사용한 세포외 전위측정 방법 및 그것을 구비한 고속 약품 스크리닝 장치
KR20070077320A (ko) * 2006-01-23 2007-07-26 삼성전자주식회사 세포 배양을 실시간으로 모니터링 가능한 세포 배양 칩 및그를 이용한 세포 배양 모니터링 방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8154093B2 (en) * 2002-01-16 2012-04-10 Nanomix, Inc. Nano-electronic sensors for chemical and biological analytes, including capacitance and bio-membrane devices
CA2527024C (en) * 2003-05-28 2012-08-21 Paul Anziano Compositions and methods for inhibiting an isoform of human manganese superoxide dismutase
US20060160157A1 (en) * 2005-01-19 2006-07-20 Zuckerman Mathew M Method, compositions and classification for tumor diagnostics and treatment
CN101063657A (zh) * 2006-04-29 2007-10-31 中国科学院上海生命科学研究院 在活体细胞中筛选配体与受体结合的方法和***

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010011212A (ko) * 1999-07-26 2001-02-15 구자홍 동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법
KR20020086625A (ko) * 2001-01-09 2002-11-18 마쯔시다덴기산교 가부시키가이샤 세포외 전위 측정용 디바이스, 그것을 사용한 세포외 전위측정 방법 및 그것을 구비한 고속 약품 스크리닝 장치
KR20070077320A (ko) * 2006-01-23 2007-07-26 삼성전자주식회사 세포 배양을 실시간으로 모니터링 가능한 세포 배양 칩 및그를 이용한 세포 배양 모니터링 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101420916B1 (ko) 2012-05-22 2014-07-17 한양대학교 산학협력단 세포 계수 장치 및 세포 계수 방법

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