KR101015979B1 - 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는비만 또는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 토별충(Eupolyphaga sinensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 토별충 추출물 또는 이의 분획물은 체중, 체지방 및 지방세포크기 증가를 억제하고, 혈중 콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키며, 지방조직에서 지방산화 및 에너지 소비에 관련된 유전자 및 이를 촉진시키는 역할을 하는 전사인자의 발현을 증가시키며, 지방산 합성에 관련된 효소 및 단백질 유전자의 발현을 감소시키며, 지방산을 분해하는 단백질 유전자의 발현을 감소시키며, 지방조직에서 에너지 소비에 관련된 유전자의 발현을 촉진하는 전사인자의 발현을 증가시키며, 지방조직의 분화를 촉진하는 단백질 유전자의 발현을 감소시키며, 지방세포에서 발현이 증가하는 유전자의 발현을 감소시키며, 결핍시 비만을 초래하는 단백질 유전자의 발현을 증가시키며, 식욕촉진을 담당하는 단백질 유전자의 발현을 감소시키며, 저밀도 지질 단백질(Low-density lipoprotein; LDL)의 산화에 대한 항산화 활성이 우수할 뿐만 아니라 아실 코에이: 콜레스테롤 아실 전이효소(acyl-CoA: cholesterol acyltransferase; ACAT)의 활성 및 지질단백질-결합 포스포리파아제 A2(lipoprotein-associated phospholipase A2; Lp-PLA2)의 활성을 억제하고, 활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)의 생성을 효과적으로 억제함으로써 비만 또는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물의 유효성분 으로 유용하게 사용될 수 있다.
토별충 추출물, 비만, 동맥경화, 체중, 체지방, 지방세포 크기, LDL, ACAT, ROS

Description

토별충 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물{Compositions for the prevention and treatment of obesity or atherosclerosis comprising extracts or fractions of Eupolyphaga sinensis as an active ingredient}
본 발명은 토별충(Eupolyphaga sinensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 토별충 추출물 또는 이의 분획물은 체중, 체지방 및 지방세포크기 증가를 억제하고, 혈중 콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키며, 비만 관련 단백질 유전자의 발현을 조절하며, 동맥경화 유발인자의 활성 및 생성을 억제함으로써 비만 또는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는 것에 관한 것이다.
현대인의 만성질환 중의 하나인 비만은 산업화와 소득 수준 향상에 따른 식습관 및 생활습관 변화로 전세계적으로 가장 심각한 건강 문제의 하나로 대두되고 있으며, 1996년에는 세계보건기구(WHO)에 의하여 질병으로 규정되었다. 또한, 비만은 당뇨, 고혈압, 고지혈증, 심장병 등의 성인병과 각종 암 유발에 직간접적으로 연관되어 있는 것으로 알려지고 있다.
현재까지 알려진 비만 치료제의 작용기전으로는 식욕억제, 열대사촉진, 소화억제, 호르몬 조절 등이 있다. 이와는 구별되게 전구지방세포가 지방세포로 분화되는 과정을 저해하면, 체내의 지방세포수를 조절할 수 있으며, 따라서 이러한 작용기전을 바탕으로 비만 치료에 이용할 수 있다(Harp J. B., Curr. Opin. Lipidol., 15: 303-307, 2004; Tong Q., et al ., Science, 290: 134-138, 2000).
토별충(Eupolyphaga sinensis)은 왕바퀴과(Blattidae)에 속한 곤충이며, 중국 각지에 분포하는 흙바퀴 또는 중국의 하북성에 분포하는 하북 흙바퀴의 암컷 벌레의 몸이다. 암컷 흙바퀴의 각질등판은 자갈색으로 반짝거리며, 달걀형으로 둥글납작하게 생겼는데, 길이가 1 ~ 3 ㎝, 너비가 1.2 ~ 2.4 ㎝이다. 등판의 앞쪽은 조금 좁게 둥글면서 약간 뾰족하게 머리를 덮고 있으며, 등판의 뒤쪽은 더 넓게 둥글면서 꼬리부위가 약간 뾰족하다. 등판의 앞부분은 간격이 좀 넓은 가로줄 무늬 3개가 있고, 그 뒷부분은 간격이 좁은 가로줄 무늬가 7개가 있는데 번데기의 주름과 흡사하다. 온몸을 덮고 있는 등판 안쪽에는 적갈색으로 반짝이는 작은 얼굴과 비교적 큰 가슴과 복부가 있다. 머리에는 실과 같은 촉각이 1쌍 있고, 가슴에는 3쌍의 긴 다리가 접혀서 달려있는데 가시 같은 잔털이 붙어있다. 복부에도 주름과 흡사한 가로줄 무늬가 여러 개 있다. 토별충의 건조된 몸은 바삭바삭 소리를 내면 서 잘 부서지는 질이다.
현재까지 알려진 토별충의 약리작용으로는 혈액순환촉진, 항혈전작용, 보간작용, 지방조절작용, 항산소결핍작용 및 광견병 치료에 사용되는 것이 보고된바 있다(중국비방험방전선속집, 1984; 중화인민공화국약전, 1995). 그러나 토별충이 항비만에 작용한다는 보고는 전무하다.
이에, 본 발명자들은 토별충의 추출물 및 이의 분획물이 체중, 체지방 및 지방세포크기 증가를 억제하고, 혈중 콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키며, 동맥경화 및 비만 관련 효소 또는 단백질의 활성 및 단백질 유전자의 발현을 조절함으로써 동맥경화 또는 비만 예방 및 치료에 사용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 토별충(Eupolyphaga sinensis) 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물, 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토별충(Eupolyphaga sinensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 토별충 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 토별충 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 토별충 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 토별충 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 토별충 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제 조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 토별충 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 토별충 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 동맥경화에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동맥경화 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동맥경화 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 비만인 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 치료 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 토별충 추출물 또는 이의 분획물은 체중, 체지방 및 지방세포크기 증가를 억제하고, 혈중 콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키며, 지방조직에서 지방 산화 및 에너지 소비에 관련된 유전자 및 이를 촉진시키는 역할을 하는 전사인자의 발현을 증가시키며, 지방산 합성에 관련된 효소 및 단백질 유전자의 발현을 감소시키며, 지방산을 분해하는 단백질 유전자의 발현을 감소시키며, 지방조직에서 에너지 소비에 관련된 유전자의 발현을 촉진하는 전사인자의 발현을 증가시키며, 지방조직의 분화를 촉진하는 단백질 유전자의 발현을 감소시키며, 지방세포에서 발현이 증가하는 유전자의 발현을 감소시키며, 결핍시 비만을 초래하는 단백질 유전자의 발현을 증가시키며, 식욕촉진을 담당하는 단백질 유전자의 발현을 감소시키며, 저밀도 지질 단백질(Low-density lipoprotein; LDL)의 산화에 대한 항산화 활성이 우수할 뿐만 아니라 아실 코에이: 콜레스테롤 아실 전이효소(acyl-CoA: cholesterol acyltransferase; ACAT)의 활성 및 지질단백질-결합 포스포리파아제 A2(lipoprotein-associated phospholipase A2; Lp-PLA2)의 활성을 억제하고, 활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)의 생성을 효과적으로 억제함으로써 비만 또는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물, 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 토별충(Eupolyphaga sinensis) 추출물 및 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 토별충 추출물은
1) 건조한 토별충을 분쇄한 후 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하는 단계; 및
2) 단계 1)의 추출물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)에서는 토별충은 생산한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 알코올은 C1 내지 C4 저급 알코올을 이용하는 것을 특징으로 하며, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 한다. 유기물질은 100% 알코올에서 용출이 더 잘 되고 배당체는 알코올 수용액에서 용출이 더 잘 되므로 필요에 따라 알코올 또는 알코올 수용액으로 선택하여 사용할 수 있다. 특히, 에탄올을 이용하는 경우에는 전분으로부터 제조되는 주정을 이용하는 것이 바람직하다. 추출시 용매를 건조된 토별충 분량의 5 내지 15배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 10배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 상온에서 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 아울러 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 감압농축 및 건조과정은 당 업계에서 사용되는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 토별충 추출물의 분획물은
1) 상기 토별충 추출물을 유기용매로 용해시키는 단계;
2) 단계 1)의 용해물을 분리하여 분획물을 수득하는 단계; 및
3) 단계 2)의 분획물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 토별충 추출물은 상기 기재된 추출물 제조 방법에 따라 제조가 가능하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 유기용매는 헥산, 클로로포름 및 에틸 아세테이트산 순으로 가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 분획물은 분별깔대기를 이용하여 분획하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 각 층에서 분리한 분획물들 중 헥산 분획물과 에틸아세테이트 분획물을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명자들은 토별충 추출물 및 이의 분획물이 세포독성이 있는지 알아보기 위해, 대식세포에 대조군(DMSO), 본 발명의 추출물들 및 이의 분획물들을 각각 처리한 후 배양한 다음 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과, 토별충의 추출물은 100 ㎍/㎖, 및 상기 토별충 추출물의 헥 산 및 에틸 아세체이트 분획물은 200 ㎍/㎖까지 세포독성이 없었다. 따라서, 본 발명의 토별충 추출물들 및 이의 분획물들은 세포독성에 안전한 물질임을 알 수 있다.
본 발명자들은 토별충 추출물 및 이의 분획물이 LDL에 대한 항산화 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances)법을 이용하여 저밀도지단백질(low density lipoprotein; LDL)-산화(oxidation) 정도를 조사하였다(Packer, L. Ed., Methods in Enzymology Vol. 234, 1994). 그 결과, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 LDL-산화에 대해 낮은 농도에서 높은 저해활성(20 ㎍/㎖에서 13 ~ 81%)을 나타내었다(표 1 참조). 따라서, 본 발명의 토별충 추출물 및 이의 분획물은 LDL 산화를 저해하여 동맥경화로 인한 혈액 순환 장애의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명자들은 토별충 추출물 및 이의 분획물이 ACAT 활성을 가지는지 알아보기 위하여, 사람 간 cDNA 라이브러리 스크리닝(library screening)을 통하여 얻어진 hACAT-1 및 hACAT-2를 이용하여 Brecher & Chan의 방법(Brecher, P. and Chan, C., Biochim. Biophys. Acta, 617: 458, 1980)을 통해 ACAT 활성을 측정하였다. 그 결과, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 hACAT1 및 hACAT2에 대해 높은 저해활성(100 ㎍/㎖에서 8 ~ 50%)을 나타내었다(표 2 참조).
본 발명자들은 토별충 추출물 및 이의 분획물이 Lp-PLA2 활성에 미치는 영향 을 알아보기 위하여, 인간의 혈장으로부터 분리한 LDL을 효소원으로 사용하여 보이드(Boyd) 등의 방법(Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2557-2561, 2000)을 이용하여 Lp-PLA2 저해 효과를 측정하였다. 그 결과, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 Lp-PLA2에 대해 높은 저해활성(100 ㎍/㎖에서 15 ~ 53%)을 나타내었다(표 3 참조).
본 발명자들은 토별충 추출물 및 이의 분획물이 항염증 활성의 효능이 있는지 알아보기 위하여, 대식세포에 대조군(DMSO), 본 발명의 추출물들 및 이의 분획물들을 각각 처리한 후 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)로 세포를 자극한 다음, 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(dichlorofluorescein diacetate)를 이용하여 활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)의 생성 정도를 조사하였다. 그 결과, 세포독성을 갖지 않는 범위 내에서 토별충의 추출물들은 50 ~ 60%, 토별충의 추출물의 헥산 분획물은 50 ~ 80%, 및 토별충의 추출물의 에틸 아세테이트 분획물은 50 ~ 100%의 저해효과를 나타내었다.
따라서, 본 발명의 토별충 추출물 및 이의 분획물은 ACAT, Lp-PLA2 및 ROS를 저해함으로써 동맥경화의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 토별충 추출물 및 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 토별충 추출물 및 이의 분획물이 고지방식이에 의한 체중, 체지방 및 지방세포크기의 증가를 억제할 수 있는지 알아보기 위하여, 실험모델동물 을 이용하여 정상식이를 섭취하는 대조군, 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취하는 대조군, 및 상기 고지방고콜레스테롤 식이와 본 발명의 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 함께 섭취하는 시험군들로 분리하여 사육한 후 각 동물의 체중, 체지방 및 지방세포크기를 측정하였다. 체중 변화를 측정한 결과, 기본식이를 섭취한 대조군에 비해 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취한 대조군이 2.5 ~ 3.0배 증가한 반면, 시험군들은 1.5 ~ 2.0배 정도 증가하였다(표 4 및 도 1 참조). 상기 각 실험동물을 복부(Abdominal), 부고환(Epididymal) 및 사타구니(Inguinal)의 지방조직(adipose tissue)을 부위별로 적출하여, 지방조직들의 중량 변화를 측정하였다. 그 결과, 기본식이를 섭취한 대조군에 비해 고지방식이를 섭취한 대조군이 2.0 ~ 3.0배 증가한 반면, 시험군들은 1.0 ~ 1.5배로 현저히 감소하였다(표 5 및 도 3 참조). 상기 각 지방조직의 표본을 제작하여 염색한 후 광학현미경 및 컴퓨터 영상분석프로그램을 이용하여 지방세포 크기를 측정하였다. 그 결과, 각 지방조직에서 고지방 식이에 의해 지방세포의 크기가 현저히 증가되었으나 토별충 추출물 및 이의 분획물이 지방세포의 크기 증가를 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다(표 6, 도 4 및 도 5 참조).
따라서, 본 발명의 토별충 추출물 또는 이의 분획물은 고지방식이에 의한 체중, 체지방 및 지방세포크기 증가를 억제할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명자들은 토별충 추출물 및 이의 분획물이 콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키는지 알아보기 위하여, 상기 시험군 및 대조군으로부터 분리한 혈장(plasma)의 GOT 및 GPT 함량, 및 혈장과 간 조직의 콜레스테롤 및 중성지방을 생 화학 자동분석기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 혈중 콜레스테롤은 기본식이를 섭취한 대조군에 비해 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취한 대조군이 1.5 ~ 2.0배 증가한 반면, 시험군들은 1.0 ~ 1.2배로 현저히 감소하였다. 중성지방은 기본식이를 섭취한 대조군에 비해 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취한 대조군이 1.2 ~ 1.5배 증가한 반면, 시험군들은 0.8 ~ 1.0배로 현저히 감소하였다(도 2 참조). 또한, 간조직 내 총콜레스테롤은 차이가 없었지만 시험군이 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취한 대조군에 비해 총콜레스테롤 당 HDL-콜레스테롤의 비율을 증가시키고, 중성지방을 감소시켰다. GOT 및 GPT 함량은 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취한 대조군에 비해 시험군에서 감소되었으나 유의성은 없었다.
따라서, 본 발명의 토별충 추출물들 및 이의 분획물들은 고지방고콜레스테롤 식이에 의한 혈중 및 간의 콜레스테롤 및 중성지방 증가를 억제할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명자들은 토별충 추출물 및 이의 분획물이 비만관련 유전자들의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 시험군 및 대조군으로부터 적출한 뇌 및 소장, 및 복부, 부고환 및 사타구니의 지방조직들의 유전자 발현 양상을 역전사 PCR을 사용하여 알아보았다(표 7 참조). 그 결과, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 지방산화 및 에너지 소비에 관련된 유전자들, 및 그들을 촉진시키는 역할을 하는 전사인자의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 6 내지 도 11 참조).
구체적으로, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 결합저지 단백질(uncoupling protein; UCP)-1, UCP-2 및 UCP-3의 발현을 증가시켰다.
상기 UCP-1는 갈색지방조직(brown adipose tissue; BAT)에서 발열반응에서 역할을 하여 에너지 소비에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 단백질로써, 갈색지방세포(brown fat cell)에서 발열반응은 온전히 UCP-1에 의존적이며(Matthias et al., J Biol Chem . 275: 25073-25081, 2000), UCP-1의 BAT의 발현은 상당부분 b3AR 신호(signaling)에 의존적이다(Lehr et al ., FEBS Lett . 580: 4661-2666, 2006). b3AR 경로의 자극에 의한 항비만 효과 또한 UCP-1의 작용을 통해 나타난다는 사실은 b3AR 효능제(agonist)의 작용이 UCP-1 적중(knockout)시 나타나지 않는다는 사실에서 잘 알 수 있다(Inokuma et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 290: E1014-E1021, 2006). UCP 단백질들의 조직 분포는 BAT에서는 UCP-1, UCP-2 및 UCP-3가 모두 발현되고, 백색지방세포(white adipose tissue; WAT)에서는 주로 UCP-2가 발현되며, 근육조직에서는 UCP-2 및 UCP-3가 발현되고, 뇌에서는 UCP-4 및 UCP-5가 발현되는 것으로 보고되고 있다(Maeda et al., Diabetes Res Clin Pract. 77 Suppl 1:S17-S22, 2007). UCP-1은 주로 BAT에서 발현되는 것으로 알려져 있지만 Foxc2가 발현되는 WAT에서도 발현이 되는 것으로 보고된 바 있어 WAT에서의 UCP-1의 발현가능성이 제시되고 있다(Maeda et al., Diabetes Res Clin Pract. 77 Suppl 1:S17-S22, 2007). 시험관 내(In vitro) 실험결과 WAT 세포주인 3T3L1 세포에 UCP-1을 과발현시켰을 때 지방합성이 저해되고 지방산화가 촉진되는 결과를 보였으며(Si et al., J Lipid Res. 48: 826-836, 2007), 해초에서 분리한 갈조소(fucoxanthin)라는 물질이 3T3L1 세포에서 UCP-1의 발현을 높임으로써 지방생성(adipogenesis) 과정을 저해한다는 보고가 있다(Maeda et al., Diabetes Res Clin Pract. 77 Suppl 1:S17-S22, 2007). 생체 내(In vivo) 실험에서도 생쥐와 사람에서 WAT에 UCP1을 유도하였을 때 지방산 산화를 증진시키면서 비만에 저항성을 가진다고 보고되었다(Boisvert et al., J Lipid Res. 40: 806-813, 1999). UCP-1을 결핍시켜도 사타구니의 지방조직의 여러 가지 유전자의 변화에 의한 보완을 통하여 적응이 가능하였다는 실험결과(Ukropec et al., J Biol Chem. 281: 31894-31908, 2006)와 UCP-1을 적중시켜도 온도를 낮추면(20℃) 비만에 저항력이 생긴다는 연구(Liu et al., J Clin Invest. 111: 399-407, 2003)는 생체 내 발열반응을 담당할 수 있는 또 다른 단백질이 있음을 의미하며, 특히, 조건에 따라 UCP-2 또는 UCP-3와 같은 UCP-1의 유도체들이 발열반응에 참여할 수 있음을 시사해 준다. 실제로 UCP-2와 UCP-3를 적중시켰을 때는 별 영향이 없었지만, 과발현시켰을 때는 항비만 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다(Fisler et al., Nutr Metab ( Lond ). 3: 38, 2006). UCP-2는 UCP-1과는 달리 항비만 효과보다는 당뇨에 관련된 연구가 많이 진행되어 있다. UCP-2 및 UCP-3는 미토콘드리아에서 ROS 생성을 저해하여 산화적 스트레스를 감소시켜주며, 이러한 효과 때문에 UCP-2의 신경보호적(neuroprotective)인 결과가 소개된 바 있다(Fisler et al ., Nutr Metab ( Lond ). 3: 38, 2006). UCP-2 저해시 지방조직에서의 인슐린 신호가 향상되었다는 연구 결과는 UCP-2가 당뇨의 좋은 타겟이 된다는 사실을 의미한다(De Souza et al ., FASEB J. 21: 1153-1163, 2007). 또한 UCP-2 유전자 적중시 에디포넥틴(adiponectin)의 수준이 감소한다고 보고되었다(Chevillotte et al ., Diabetes . 56: 1042-1050, 2007). 이는 에디포넥틴의 발현은 ROS가 증가함에 따라 감소하는 것으로 알려져 있는데, 여기서 UCP-2가 ROS 소거의 기능이 있기 때문으로 설명될 수 있다.
또한, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 호르몬 민감성 지질분해효소(hormone sensitive lipase; HSL) 및 지방산 결합 단백질 4(Fatty acid binding protein 4; FABP4)의 발현을 증가시켰으며, HSL의 작용을 방해하는 포스포디에스테라아제 3B(phosphodiesterase 3B; PDE3B) 및 페리리핀(perilipin)의 발현을 감소시켰다.
베타 아드레노셉터 수용체(beta adrenoceptor receptor 3; b3AR) 경로를 통해 나오는 식이성 발열효과(diet-induced thermogenesis)는 매우 중요한 항비만 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다(Bachman et al., Science . 297: 843-845, 2002). 이는 베타(1)/베타(2)/베타(3)-아드레노셉터 결핍 마우스에서 비만과 추위에 견디지 못하는 현상이 관찰된 것으로부터 알려지게 되었다(Jimenez et al ., FEBS Lett . 530: 37-40, 2002). B3AR 경로를 통해 여러 신호들이 자극을 받지만 가장 중요한 것을 HSL 및 UCP라고 할 수 있다. HSL는 지방세포의 특정지역에 존재하며 지방의 분해를 담당하고 있는 효소로써 활성의 증가는 지방조직의 감소를 가져온다. 인슐린은 포스포디에스테라아제(phophodiesterase) 활성 증가, cAMP 분해 증가, cAMP 감소에 이은 PKA 불활성화의 단계를 통해 HSL의 활성을 방해한다고 하였으며(Carmen and Victor, Cell Signal. 18: 401-408, 2006), 페리리핀(perilipin)은 지방조직에서 PPARδ에 의해 조절되어 발현되는 주요 지질 코트(lipid coat) 단백질로서(Moore et al., J Biol Chem . 280: 43109-43120, 2005) 지방분해 과정에서 HSL이 지방포(lipid droplet)로 전좌(translocation)되는 과정에서 조절자로 참여하고 지방조직 내의 주요 지질 저장 장소와는 구별된 지방분해 가 일어나는 특별한 부위에만 HSL과 함께 페리리핀이 존재한다고 알려져 있다(Sztalryd et al ., J Cell Biol . 161: 1093-1103, 2003). FABP4는 HSL가 지방포에서 작용할 때 접근성을 용이하게 해주는 역할을 한다고 알려져 있다(Collins et al., Mol Endocrinol. 18: 2123-2312, 2004).
또한, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 렙틴(leptin) 및 렙틴 수용체(leptin receptor)로 알려진 OB 수용체의 발현을 증가시켰다.
상기 렙틴은 체내 에너지 수준이 높을 때 발현되어 포만감을 느끼도록 하며, 식욕을 생기게 하는 신경펩티드 Y(neuropeptide Y; NPY)/아구티관련 펩티드(Agouti-related peptide, AGRP) 뉴런(neuron)을 억제하고 반대로 포만감을 느끼게 하는 프로오피오메라노코르틴(Proopiomelanocortin, POMC)/코카인 및 암페타민 조절 전사체(***e and amphetamine regulated transcript; CART) 뉴런을 자극하여 식이섭취를 줄이게 된다(Wilding, Diabet Med. 19: 619-27, 2002). 또한, 렙틴은 지방산의 합성을 낮추고, 조직과 혈중의 TG 함량도 낮추며(Gallardo et al ., Endocrinology . 148: 5604-5610, 2007), 혈관내피세포의 기능을 보호하는 기능이 있다(Elbatarny et al., Eur J Pharmacol . 558: 7-13, 2007). 따라서 렙틴/인슐린의 활성이 감소하면 비만이 초래되는데, 이론적으로는 지방이 과량으로 존재할 경우 렙틴의 생성량이 증가하므로 식이섭취가 줄어들고 에너지 소비가 증가해야 하나 비만인 사람의 경우 이러한 작용이 일어나지 않는데, 이는 렙틴이 저항성을 가져 원래의 기능을 하지 못하기 때문이다(Bays, Obes Res. 12: 1197-1211, 2004). 따라서 렙틴은 비만 및 동맥경화의 좋은 표적으로 연구되고 있으며 렙틴의 저항성을 줄이기 위한 연구가 많이 진행되고 있다.
또한, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 지방산 합성효소(fatty acid synthase; FAS), 아세틸 코에이 합성효소(acetyl-CoA synthase; ACS), 포스포에놀 피부르산 카르복시 키나아제(phosphoenol pyruvate carboxy kinase; PEPCK-c)의 발현을 감소시켰으나, 지방산 분해에 관련된 글리세롤 키나아제(glycerol kinase; Gyk)의 발현은 증가시켰다.
상기 FAS는 지방산 합성의 주요 효소로 에너지 저장의 역할을 하므로 비만에 있어 주요 표적 효소이다. 반대로, 지방산 산화 경로와 그의 조절효소(rate-limiting enzyme)인 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제-1(carnitine palmitoyltransferase-1; CPT-1) 또한 비만의 매우 중요한 표적으로 생각되고 있다. CPT-1의 조절은 즉각적으로 에너지대사와 식이섭취에 영향을 미쳐 비만과 직접적인 관련을 맺고 있으며(Kuhajda and Ronnett, Curr Opin Investig Drugs. 8: 312-317, 2007), FAS/CPT1의 발현, 활성정도로 체내 에너지 상태를 알 수 있다(Ronnett et al., Obesity ( Silver Spring ). 14 Suppl 5: 201S-207S, 2006). FAS 억제제인 C75는 생체 내에서 체중감소 효과가 있다(Ronnett et al ., Obesity ( Silver Spring ). 14 Suppl 5: 201S-207S, 2006). C75는 지방산합성 저해와 더불어 근육 등의 말초조직에서 CPT1을 활성화시켜서 지방산의 산화를 촉진하며, 중추신경계(central nerve system: CNS)의 FAS에도 작용하여 섭취 행동을 변화시킨다. 그 작용 기작은 두 가지로 설명될 수 있으며, 직접적으로 뇌의 NPY/AgRP 뉴런을 억제하고 CART 뉴런을 활성화시켜 식욕을 억제하는 것과 간접적으로 FAS의 저해로 인해 말로닐(malonyl) Co-A의 양이 증가되어 CPT1을 저해하면 상대적으로 산화에 쓰이지 못한 긴 사슬의 지방산들의 양이 증가하게 되고 이는 곧 영양상태의 포화신호가 되어 식욕을 억제하는 기전을 들 수 있다(Ronnett et al., Obesity ( Silver Spring ). 14 Suppl 5: 201S-207S, 2006). 뇌에 FAS와 NPY/AgRP가 함께 위치(colocalized)되어있다는 사실이 FAS가 지방조직뿐만 아니라 뇌에서도 직접적으로 작용할 수 있음을 반증해 준다(Lepez et al., Peptides . 26: 1753-1758, 2005). FAS 억제제인 C75는 신경의(neuronal) ATP 수준을 증가시켜 AMP-활성화 단백질 카이네이즈 (AMP-activated protein kinase; AMPK)를 저해하는데, 상기 AMPK는 acetyl-CoA carboxylase (ACC)의 방해자이기 때문에 역으로 ACC는 활성이 증가하여 말로닐-CoA의 수준을 증가시켜 식욕억제 기능이 더 강화되도록 하는 기능이 있다(Lepez et al., Peptides . 26: 1753-1758, 2005). 상기 AMPK의 활성 조절에 있어서도 말초와 뇌에서의 조절이 다른데, 렙틴의 시사하부 작용(hypothalamic action)에서는 AMPK의 방해자로 기능하여 식욕억제의 기능을 가지지만 근육 등의 말초조직에서는 렙틴이 AMPK의 활성은 증가시키나 carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1)의 발현을 증가시켜 지방산화 과정이 일어나도록 한다(Lepez et al., Peptides. 26: 1753-1758, 2005). PEPCK는 글리세롤 신생과정(glyceroneogenesis)을 담당하는 효소로 지방조직에서 PEPCK가 과발현되면 지방산 재-에스테르화(re-esterification)가 증가되어 비만이 유도되고, 지방조직에서 PEPCK를 적중시키면 글리세롤 신생과정이 제대로 일어나지 않아 지방산의 재-에스테르화가 잘 일어나지 않아서 지방이영양증(lipodystrophy)이 생긴다는 보고가 있다(Beale et al., Cell Biochem Biophys. 48: 89-95, 2007). 특히 지방조직에서 PEPCK가 과발현되면 식이성 인슐린 억제(diet-induced insulin resistance)가 유도된다는 보고(Franckhauser et al ., Diabetes . 55: 273-280, 2006)는 PEPCK가 비만뿐만 아니라 당뇨 연구에서도 중요한 인자임을 시사한다. ACS가 지방산 수송체 1(fatty acid transporter 1; FATP1)과 상호작용을 통해 long-chain fatty acid (LCFA)가 세포 내로 잘 들어올 수 있도록 하여 궁극적으로는 에스테르화를 촉진시킨다. ACS는 지방산의 간으로 흡수를 증진시키고, 비만 ob/ob 마우스에서 간과 지방세포 모두에서 지방산 수송체(fatty acid translocase; FAT), 지방산 결합 단백질(fatty acid binding protein; FABP) 및 FATP가 증가하였고, 지방세포의 ACS가 증가하였다(Memon et al., Diabetes . 48: 121-127, 1999).
또한, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 에너지 소비에 관련된 유전자들의 발현을 촉진하는 전사인자인 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 알파(peroxisome proliferator-activated receptor alpha; PPARα), 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마 공동활성체 1 알파(PPAR gamma coactivator 1 alpha; PGC1α) 및 백시니아 바이러스 성장인자(Vaccinia virus growth factor; VGF)의 발현을 증가시켰고, 반대로 지방세포 분화를 촉진하는 CCAAT/증진제 결합 단백질 알파(CCAAT/enhancer binding protein alpha; C/EBPα)의 발현을 감소시켰다.
상기 VGF는 비만동물모델에서 적중시켰을 때 야윈(lean) 및 대사항진(hypermetabolic) 현상을 보이며 항비만 효과가 있다는 연구결과가 발표되었 고(Hahm et al., J Neurosci. 22: 6929-6938, 2002), 더욱이 VGF-/- 동물모델에서는 인슐린 민감성(insulin sensitivity)이 올라갔으며, 공복시의 혈당 또한 낮추어 당뇨에도 좋은 영향을 나타낸다(Watson et al ., Endocrinology. 146: 5151-63, 2005). VGF는 NPY 발현부위인 내측궁형뉴런(medial arcuate neuron)에서 발현되며 NPY와 비슷한 작용을 하며 금식(fasting)시 발현되고 렙틴에 의해서 저해되는 특성을 가지고 있다(Hahm et al., J Neurosci. 22: 6929-6938, 2002).
또한, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 대사질환과 관련하여 그 발현이 증가하는 리지스틴(resistin), adipose fatty acid binding protein (aP2), 종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor alpha; TNFα), interlukin-6 (IL-6) 및 안지오텐시노겐(angiotensinogen; ANTG) 유전자들의 발현을 감소시켰다.
상기 ANTG은 비만인 사람의 복부지방조직에서 발현이 증가하였고(Van Harmelen et al., Obes Res . 8: 337-341, 2000), 쥐 비만 모델동물(obese fa/fa Zucker rat)의 사타구니 자방조직에서 발현과 분비가 증가하였으나, 간과 부고환 지방조직에서는 그 효과가 나타나지 않았다(Hainault et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 282: E59-E66, 2002). 비만 개체에서 beta-adrenergic(bAR) 자극시 국소적으로 생산이 늘어난 ANTG은 지방조직에 ANTG을 안지오텐신 Ⅱ(angiotensin Ⅱ; Ang Ⅱ)로 전환시키는 효소가 존재(Karlsson et al ., J Clin Endocrinol Metab . 83: 3925-3929, 1998)함에도 불구하고 ANTG 형태로 방출되고 결국은 혈중에서 Ang II의 농도의 증가로 이어진다고 하였다(Goossens et al., Hypertension. 49: 542-547, 2007). 따라서 bAR 경로를 통한 ANTG 발현 증가가 고찰될 수 있다.
또한, 토별충 추출물 및 이의 분획물은 유전자 결핍시 비만을 초래하는 뉴로메딘 B(neuromedin B; NMB)의 발현을 증가시켰고, 소장에서 발현되어 식욕촉진을 담당하는 신경전달물질(neurotransmitter)인 그렐린(ghrelin)의 발현을 감소시켰다.
상기 그렐린은 식욕을 유도하고 렙틴 및 인슐린의 분비를 조절하는 기능으로 여러 신체기관의 정상적 기능 유지를 위해 중요한 역할을 한다(Sun et al., Mol Cell Biol . 23: 7973-7981, 2003). 그렐린 처리시 BAT-UCP-1과 WAT(epidydymal)-UCP-2의 발현이 감소하였다는 연구결과가 보고되었다(Tsubone et al., Regul Pept. 130: 97-103, 2005). 그렐린은 blood-brain barrier에 특이적으로 결합하여 포화적 수송(saturable transport)을 통해 RBE4 대뇌 미세혈관 내피세포(cerebral microvessel endothelial cells) 내로 세포내이입(endocytosis)되기 때문에(Pan et al., Peptides . 27: 911-916, 2006) 식욕에 직접적으로 영향을 미칠 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명의 토별충 추출물 및 이의 분획물은 상기 유전자들의 발현을 조절함으로써 항비만, 항당뇨 및 항대사질환에 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 동맥경화 또는 비만의 예방 및 치료용 조성물은 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏이고, 바람직하기로는 0.0001 g ~ 5 g/kg이며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 동맥경화 또는 비만의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 또는 비만의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물은 열수 및 에탄올을 이용하여 추출하는 것이 바람직하다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 토별충 추출물 또는 이의 분획물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상 의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 토별충 추출물 또는 이의 분획물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 토별충 추출물 또는 이의 분획물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 동맥경화에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동맥경화 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동맥경화 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 비만인 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 치료 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 예방 방법을 제공한다.
상기 토별충 추출물 또는 이의 분획물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 투여는 경구 투여, 또는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통한 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 투여 단위는, 개별 투여량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투여량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏이고, 바람직하기로는 0.0001 g ~ 5 g/kg이며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 토별충의 추출물 제조
<1-1> 토별충의 에탄올 추출물
중국 곤명산에서 채집하여 건조된 토별충을 한약재 도매상인 무림건재를 통해 구입하였으며, 토별충(1 Kg)을 적당한 크기로 분쇄 후 95% 에탄올(주정) 5 L를 가하고 교반하면서 하루 동안 실온에서 추출한 후, 여과지를 사용하여 에탄올 가용부만을 회수하였다. 여과물은 동일한 방법으로 1회 더 반복 실시한 후 에탄올 가용부를 모아 감압농축하여 115 g의 에탄올 추출물을 수득하였다.
<1-2> 토별충의 열수 추출물
한약 건재상에서 구입한 토별충(100 g)을 적당한 크기로 분쇄 후 증류수 1 L를 가하고 2 시간 동안 85 ~ 90℃에서 추출하였다. 상기 추출을 2회 반복하였다. 상기에서 수득한 추출물을 여과지로 여과하여 침전물을 제거하고 여과액을 수득하였다. 상기 여과액을 감압하에서 농축하여 토별충 열수 추출물 9 g을 얻었다.
<1-3> 토별충의 메탄올 추출물
상기 실시예 <1-1>에서 95% 에탄올 대신 95% 메탄올을 이용한 것을 제외하고 동일하게 추출하여 109 g의 메탄올 추출물을 수득하였다.
<실시예 2> 토별충 추출물의 분획물 제조
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 토별충 에탄올 추출물 115 g에 물 500 ㎖를 가하고 현탁시키고 동량의 헥산을 넣어 물층과 헥산층으로 분리하였다. 같은 방법으로 클로로포름 및 에틸 아세테이트 순으로 분획하고 감압농축하여 헥산 가용추출물(40 g), 클로로포름 가용추출물(14 g) 및 에틸 아세테이트 가용추출물(12 g)을 각각 얻었다.
< 실험예 1> 토별충 추출물 및 이의 분획물의 항산화 활성 측정
본 발명에서는 Cu2 +가 LDL의 산화를 유도하므로써 생성된 불포화 지방산의 산화산물인 디알데하이드(dialdehyde)를 TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances)법으로 측정하여, 본 발명에 따른 토별충 추출물 및 이의 분획물의 항산화 활성을 조사하였다(Packer, L. Ed., Methods in Enzymology Vol. 234, 1994).
<1-1> LDL 의 분리
LDL은 표준 방법을 약간 변형하여 분리하였다. 먼저, 대한적십자혈액원을 통해 건강한 정상인 지원자로부터 전혈을 채취하였다. 상기 혈액을 4℃에서 3,000 분당회전(revolution per minute; rpm)으로 30분간 원심분리하여 혈장을 얻은 후, 지단백질(lipoprotein)의 변성을 방지하기 위해 EDTA(0.1%), NaN3(0.05%), PMSF(0.015%)를 첨가하여 20시간 동안 베크만 T8-M 초원심분리기에서 43,800 rpm(100,000 g)으로 원심분리하였다. 상층에 부유된 킬로마이크론(chylomicron)과 VLDL(very low-density lipoprotein)을 제거하고, 나머지 용액을 수집한 후, NaBr 용액을 이용하여 용액의 비중을 1.063 g/㎖로 조정하였다. 이후, 4℃에서 20 시간 동안 43,800 rpm으로 원심분리하여 상층 부분에 있는 LDL(1.006<d<1.063 g/㎖)을 분리하였으며, 이를 10 mM의 PBS(pH 7.4)를 이용하여 4℃에서 투석하였다. 투석된 LDL을 4℃에서 저장하면서 4주 이내에 사용하였다. LDL의 순도는 아가로즈 젤 전기영동과 SDS-PAGE로 확인하였고(Chapman MJ, et al., J. Lipid Res. 22: 339-358, 1981), LDL 단백질의 함량은 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 하여 정량하였다(Mahley, RW, et al., J. Lipid Res. 25: 1277-1294, 1984).
<1-2> TBARS ( thiobarbituric acid - reactive substances ) 측정
상기와 같이 분리한 LDL 20 ㎕(단백질 농도, 50 ~ 100 ㎍/㎖)를 10 mM 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS) 210 ㎕와 혼합하고, 상기 실시예에서 제조한 토별충 추출물 및 이의 분획물을 각각 10 ㎕씩 첨가하였다. 상기 토별충 추출물 및 이의 분획물은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 사용하였으며, 실험에 사용하기 전에 여러 농도로 희석하였다. 음성 대조군으로는 용매만을 첨가한 것을 사용하였다. 상기 용액에 0.25 mM의 황산구리 10 ㎕를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시키고, 20% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA) 용액 1 ㎖를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 0.05 N의 수산화나트륨 용액에 녹인 0.67% TBA 용액 1 ㎖를 첨가하고 10초간 교반시킨 후 95℃에서 5분 동안 가열하여 발색반응이 일어나도록 하고 얼음물로 용액을 냉각하였다. 이 용액을 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하였으며, 자외선-가시광선 분광기로 540 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 상기 발색반응으로 생성된 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)의 양을 구하였다. 테트라메톡시프로판{말론알데히드비스(디메틸아세탈)}(tetramethoxy-propane(malonaldehyde bis(dimethylacetal))의 저장용액을 이용하여, 말론디알데히드를 인산완충용액으로 0 ~ 10 n㏖로 희석하여 표준물질을 250 ㎕씩 만들었다. 이 표준물질을 상기와 같은 방법으로 발색시켜 540 ㎚에서의 흡광도를 측정하고, 말론디알데히드의 표준곡선을 구하였다. 말론디알데히드의 양은 상기 표준곡선을 이용하여 정량하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 보는 바와 같이 토별충 추출물 및 이의 분획물은 LDL-산화(oxidation)에 대해 높은 저해활성(20 ㎍/㎖에서 13 ~ 81%)을 나타내었다(표 1).
시료 억제율(%)
LDL-산화(20 ㎍/㎖)
토별충 에탄올 추출물 35
토별충 물 추출물 25
토별충 메탄올 분획물 32
토별충 헥산 분획물 13
토별충 클로로포름 분획물 15
토별충 에틸아세테이트 분획물 81
< 실험예 2> 토별충 추출물 및 이의 분획물의 ACAT 활성
<2-1> ACAT 효소원의 제조
사람 ACAT-1 및 ACAT-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 베큘로바이러스 발현체제를 이용하여 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 단백질을 얻었다. 사람 간 cDNA 라이브러리 스크리닝(library screening)을 통하여 얻어진 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 cDNA를 베큘로바이러스 전달 벡터에 삽입하고, 곤충세포인 sf9 세포에 도입하여 바이러스를 제조하였다. 다음으로, 플라크 정제(plaque purification) 방법으로 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 재조합 바이러스를 분리한 후, 3차례의 증폭과정을 거쳐 저장용 바이러스(viral stock)의 역가(titer)를 높였다. 단백질 발현 효율이 좋은 Hi5 곤충세포에 재조합 바이러스를 감염다중도(mutiplicity of infection)가 1이 되도록 감염시킨 후, 27℃에서 하루 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양된 hACAT-1 및 hACAT-2가 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 마이크로좀 분획을 분리하기 위하여, 500 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포들을 모으고 저장완충액(hypotonic buffer)에서 급냉동, 급해동 방법으로 세포를 깬 후, 100000 rpm에서 한 시간 동안 초원심분리하였다. 상기 얻어진 마이크로좀 분획들은 단백질 농도가 8 ㎎/㎖이 되도록 저장완충액으로 현탁하여 -70℃ 저온냉동기에 보관하면서 사용하였다.
<2-2> ACAT 활성 측정
ACAT 활성의 측정은 [1-14C] 올레오일-코에이(oleoyl-CoA)(56.0 μCi/μmol; Amersham)를 기질로 하여 Brecher & Chan의 방법(P. Brecher and C. Chan, Biochim. Biophys . Acta , 617: 458, 1980)을 일부 수정하여 사용하였다. 상기 실시예에서 수득한 토별충 추출물 및 이의 분획물을 각각 10 ㎕, 상기 실험예 <2-1>에서 수득한 마이크로좀 용액 4.0 ㎕, 활성분석 완충액(0.5 M KH2PO4, 10 mM DTT, pH 7.4; Sigma) 20.0 ㎕, 지방이 제거된 우혈청알부민(BSA; bovine serum albumin, 저장액 농도 40 ㎎/㎖; Sigma) 15.0 ㎕, 콜레스테롤(저장액 농도 20 ㎎/㎖; Sigma) 2.0 ㎕, 증류수 41.0 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15 분간 예비 반응시켰다. 이 반응액에 [1-14C] 올레오일-코에이(0.05 μCi, 최종농도: 10 μM) 8 ㎕를 첨가하여 다시 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 이소프로판올:헵탄 혼합물(4:1(v/v)) 1 ㎖을 가하여 반응을 정지시켰다. 여기에 600 ㎕의 헵탄과 200 ㎕의 0.1 M KH2PO4(pH 7.4)을 첨가하고, 혼합물을 볼텍서(vortexer)로 격렬하게 혼합한 후, 300 rpm에서 5분 동안 원심분리를 하였다. 상기 원심분리하여 얻은 100 ㎕의 상층액을 신틸레이션 병(scintillation bottle)에 넣고, 신틸레이션 액(Lipoluma) 4 ㎖을 가하였다. 상기 혼합물의 방사선량은 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기(1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy)로 측정하였다. ACAT 활성은 측정된 방사선량으로부터 시간당 방사선량을 계산하여 1분 동안 단백질 1 ㎎당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰(피코몰/분/㎎ 단백질)로 계산하였다.
그 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 토별충 추출물 및 이의 분획물은 hACAT1 및 hACAT2에 대해 높은 저해활성(100 ㎍/㎖에서 8 ~ 50%)을 나타내었다(표 2).
시료 억제율(%)
hACAT1(100 ㎍/㎖) hACAT2(100 ㎍/㎖)
토별충 에탄올 추출물 30 32
토별충 물 추출물 22 20
토별충 메탄올 분획물 27 30
토별충 헥산 분획물 50 38
토별충 클로로포름 분획물 35 14
토별충 에틸아세테이트 분획물 28 10
< 실험예 3> 토별충 추출물 및 이의 분획물의 Lp - PLA 2 활성
인간의 혈장으로부터 분리한 LDL을 효소원으로 사용하여 보이드(Boyd) 등의 방법(Boyd, et al., Bioorg . Med . Chem . Lett . 10: 2557-2561, 2000)을 일부 수정하여 Lp-PLA2 저해 효과를 측정하였다. Lp-PLA2 활성 측정의 표준조건은 반응액 200 ㎕에 2.7 mM EDTA, 10 mM PBS(pH 7.4)와 80 μM PAF([3H]PAF, 0.05 μCi/tube)를 포함한다. 즉, 기질은 유기용매에 용해되어 있는 10 ㎕[3H]PAF(250 μCi, 21.50 Ci/mmole)와 12.5 μM Cold-PAF 20 ㎕을 질소가스 하에서 용매를 완전히 제거한 후, 3.4 mM EDTA를 포함하는 10 mM PBS(pH 7.4) 3.2 ㎖를 첨가하여 마이셀(micelle) 형태로 준비하였다(A 용액). 시험관에 LDL(0.5~0.8 ㎎/㎖) 40 ㎕와 PAF 80 ㎕를 포함하는 A 용액 160 ㎕, DMSO에 녹인 시료 20 ㎕를 를 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 클로로포름/메탄올(2:1, 부피비) 용액 600 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 다음 1,500 rpm에서 3분간 원심분리하여 유기용매층과 물층을 분리하였다. 상층액(물층) 250 ㎕를 취한 후 클로로포름 250 ㎕를 첨가하여 상기 분액 실험을 반복하였다. 최종 상층액 100 ㎕를 취하여 섬광 바이알(vial)에 넣고 섬광 칵테일(Lumagel, Lumac Co.) 3 ㎖를 첨가하여 액체 섬광계수기(1450 Microbeta Trilux, Wallac Oy, Finland)를 이용하여 [3H]PAF(1-O-hexadecyl-acetyl-3H(N)-phosphatidylcholine)로부터 생성된 [3H]아세테이트(acetate)의 양을 측정하였다.
그 결과, 하기 표 3에서 보는 바와 같이 토별충 추출물 및 이의 분획물은 Lp-PLA2에 대해 높은 저해활성(100 ㎍/㎖에서 15 ~ 53%)을 나타내었다(표 3).
시료 억제율(%)
Lp-PLA2(100 ㎍/㎖)
토별충 에탄올 추출물 52
토별충 물 추출물 35
토별충 메탄올 분획물 48
토별충 헥산 분획물 15
토별충 클로로포름 분획물 37
토별충 에틸아세테이트 분획물 43
< 실험예 4> 토별충 추출물 및 이의 분획물의 항염증 활성
<4-1> 세포배양
대식세포주 RAW264.7 세포(ATCC® No. TIB-71)는 10% FBS(fetal bovine serum), 2 mM L-글루타민(glutamine), 100 units/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 습윤 배양기에서 배양하였다.
<4-2> 세포독성 측정
상기 실험예 <4-1>의 5×104 cells/100 ㎕ RAW264.7 세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 넣고 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. DMSO의 농도가 DMEM 배지에 대하여 0.005% 이하가 되도록 대조군(DMSO), 본 발명의 추출물들 및 이의 분획물들을 각각 처리한 DMEM 배지 100 ㎕를 1 ㎎/㎖의 MTT 용액을 10%가 되게 조심스럽게 첨가한 후 4시간 동안 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 10% SDS, 0.01 M HCI 용액을 100 ㎕씩 첨가한 후 12시간 반응시킨 후에, 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader)를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 다음의 계산식을 이용하여 계산하여 농도별 세포독성을 평가하였다.
세포의 생존율(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100
그 결과, 토별충의 추출물들은 100 ㎍/㎖까지 세포독성이 없었고 토별충 추출물의 헥산 분획물 및 에틸 아세체이트 분획물은 200 ㎍/㎖까지 세포독성이 없었으며, 토별충 추출물의 클로로포름 분획물은 100 ㎍/㎖에서 세포독성이 있었다.
<4-3> 활성산소종( Reactive Oxygen Species; ROS )의 측정
지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)에 의해 유도되는 ROS의 생성을 RAW264.7 세포에서 보기 위해 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(dichlorofluorescein diacetate)(DCFH2-DA, 분자 프로브)를 사용하여 수산라디칼(hydroxyl radical)을 측정하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 1x104 개의 세포를 넣어 키운 후 80% 이상 채워지게 되면 본 발명의 토별충 추출물들 및 이의 분획물들을 상승 농도 순으로 처리하였다. 이 후 1 ㎍/㎖의 LPS로 16 시간 전후로 세포를 자극한 후, DCFH2-DA를 10 μM로 넣어주고 1 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 PBS로 5회 수세한 후, 이어 485 nm 여기(excitation) 및 530 nm 방출(emission) 파장에서 형광 마이크로플레이트 리더기(fluorescence microplate reader)(1420 VICTOR, Perkin-Elmer, Belgium)를 사용하여 측정하여 농도별 ROS 생성 저해효과를 평가하였다(Xu et al., Bioorg. Med. Chem. 14: 7826-7834, 2006). 모든 활성에 대한 결과는 평균치±표준편차로 나타내었으며, 대조군과 실험군의 결과 변화에 대해 T-검정(paired t-test)을 실시하여 유의차가 5% 미만(P<0.05)일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
그 결과, 세포독성을 갖지 않는 범위 내에서 토별충의 에탄올 추출물들은 100 ㎍/㎖에서 54%, 에탄올 추출물의 헥산 분획물은 50 ㎍/㎖에서 54% 및 200 ㎍/㎖에서 78%, 및 에탄올 추출물의 에틸 아세테이트 분획물은 200 ㎍/㎖에서 100%의 저해효과를 나타내었다.
< 실험예 5> 토별충 추출물 및 이의 분획물의 지질강하
<5-1> 동물의 사육
실험동물은 C57BL/6J 5주령 마우스를 중앙실험동물(주)를 통해 구입하여 사용하였다. 분양받은 실험동물은 2주간 기본사료(AIN-76A diet)와 물을 자유롭게 공급하면서 실험실 환경에 적응시킨 후, 건강상태가 양호한 7 주령의 마우스를 실험에 사용하였다. 기본식이(AIN76A diet)를 섭취하는 Chow diet 대조군(또는 ND군), 고지방고콜레스테롤 식이(western-type diet with 21% milk fat and 0.15% cholesterol; Dyets Inc.)를 섭취하는 HFHC 대조군, 고지방 식이(45% fat diet, Research Diets. co. Ltd.)를 섭취하는 HFD 대조군, HFHC 대조군에 본 발명의 토별충 에탄올 추출물(1%, wt/wt diet)을 보충한 시험군 1, HFHC 대조군에 본 발명의 토별충 물 추출물(1%, wt/wt diet)을 보충한 시험군 2, HFHC 대조군에 본 발명의 토별충 추출물의 헥산 분획물(1%, wt/wt diet)을 보충한 시험군 3, 및 HFHC 대조군에 본 발명의 토별충 추출물의 에틸 아세체이트 분획물(1%, wt/wt diet)을 보충한 시험군 4로 나누어 6주간(지질강하) 또는 11주간(항비만) 실험하였다. 동물 사육실의 환경은 항온(25± 2℃), 항습(50± 5%) 및 12시간 간격의 광주기(light on 07:00 ~ 19:00)로 일정한 조건을 유지하였고, 실험동물은 3 ~ 4 마리씩 분리하여 사육하였으며, 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 식이섭취량 및 체중은 매주 일정한 시간에 측정하여 기록하였으며, 일주일마다 후안과 정맥총으로부터 모세관(capillary tube)을 사용하여 채혈한 후 EDTA를 사용하여 응고를 방지하였고, 혈액생화학적 검사를 실시하기 위하여 채혈 후 30분 이내에 3,000 rpm, 4 ℃에서 15분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하여 -70℃에 보관하였다가 분석하였다. 사육이 끝난 실험동물은 희생 전 3시간 동안 절식시킨 후 혈액을 채취하여 동일한 방법으로 처리하였고, 각 실험동물의 장기조직(동맥, 간 및 소장 조직)은 혈액 채취 후 즉시 적출하여 칭량 후, RNA 실험용은 RNA 안정액(stbilization solution)(Qiagen)에 보관하여 일주일 안에 RNA을 뽑고, 나머지 부분은 액체질소로 급냉시켜 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
<5-2> 장기의 중량 측정
상기 실험예 <5-1>의 각 실험동물을 부검한 후 장기 중량을 측정하여 체중대비 간 중량 변화율을 산출하였다. 대조군과 시험물질 투여군 간의 결과는 평균치± 표준편차로 나타내었으며, 각 군 간의 차이에 대해 T-검정(paired t-test)를 실시하여 유의차가 5% 미만(P<0.05)일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
그 결과, 6주 후의 체중은 계속 기본식이(AIN76A diet)를 섭취한 Chow 대조군은 21.9± 0.9 g에서 25.3± 1.6 g으로 3.4 g 증가하였고, 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취한 대조군(HFHC)이 22.0± .2 g에서 30.4± .2 g으로 8.4 g 증가한 반면, 토별충 에탄올 추출물을 섭취한 시험군 1은 22.2± 1.0 g에서 28.3± 1.0 g으로 6.2 g 증가하였다(도 1). 이를 체중증가율로 환산하면 Chow군은 15.7%이고 HFHC군이 36.7%에 비해 시험군 1은 27.8%로 체중증가율을 유의적으로 현저히 감소시켰다. 상기 에탄올 이외 토별충 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1과 유사하게 체중증가율을 현저히 감소시켰다(표 4).
고지방식이를 섭취한 마우스의 체중에 토별충 추출물 및 이의 분획물의 효과
시료 체중 증가율(%)
Chow 15.7±3.7
HFHC 36.7±6.0**
HFHC + 토별충 에탄올 추출물 27.8±4.8*
HFHC + 토별충 물 추출물 30.4±4.5*
HFHC + 토별충 헥산 분획물 28.2±4.8*
HFHC + 토별충 에틸 아세테이트 분획물 27.4±4.9*
체중 증가율(%) = (증가된 체중 (g) / 체중 (g)) x 100;
** Chow와 비교하여 P<0.01; 및 *HFHC와 비교하여 P<0.05.
<5-3> 지방조직의 중량 측정
상기 실험예 <5-1>의 각 실험동물을 복부(Abdominal), 부고환(Epididymal) 및 사타구니(Inguinal)의 지방조직(adipose tissue)를 부위별로 적출하여, 지방조직들의 총 중량을 측정하여 체중 당 지방조직의 중량 변화율을 산출하였다. 대조군과 시험물질 투여군 간의 결과는 평균치±표준편차로 나타내었으며, 각 군 간의 차이에 대해 T-검정(paired t-test)를 실시하여 유의차가 5% 미만(P<0.05)일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
그 결과, Chow 대조군이 0.5± 0.1 g이고 HFHC 대조군이 1.3± 0.2 g에 비해 시험군 1은 0.7± 0.2 g으로 유의적으로 현저히 감소하였으며, 체중 당 지방조직(adipose tissue) 중량의 비율을 비교하였을 때도 Chow 대조군이 17.3± 2.3이고 HFHC군이 38.3± 5.1에 비해 토별충군은 25.6± 4.1로 유의적으로 감소하였다 (도 3). 상기 에탄올 이외 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1과 유사하게 지방조직 중량의 비율을 현저히 감소시켰다(표 5).
고지방식이를 섭취한 마우스의 지방조직 중량에 토별충 추출물 및 이의 분획물의 효과
시료 지방조직 중량 증가율(g/kg 체중)
Chow 17.3±2.3
HFHC 38.3±5.1**
HFHC + 토별충 에탄올 추출물 25.6±4.1*
HFHC + 토별충 물 추출물 29.0±4.5*
HFHC + 토별충 헥산 분획물 27.4±4.2*
HFHC + 토별충 에틸 아세테이트 분획물 25.5±4.1*
** Chow와 비교하여 P<0.01; 및 *HFHC와 비교하여 P<0.05.
<5-4> 지방세포 크기 측정
상기 실험예 <5-1>의 각 실험동물을 복부(Abdominal), 부고환(Epididymal) 및 사타구니(Inguinal)의 지방조직(adipose tissue)를 부위별로 적출한 후 10% 포르말린(formalin)에 24시간 보관하였다. 이 후 지방의 일부를 Bouin's solution에 8시간 동안 재고정한 후 흐르는 물에서 충분히 세척하고 파라핀(paraffin) 자동 침투기를 이용하여 프로그램된 시간 동안 처리를 한 후 파라핀에 포매(embedding)하였다. 조직 절편기(microtome)를 이용하여 8 μm 두께의 조직 절편을 만들어 헤마토자일린-에오신(hematoxyline-eosin) 이중염색을 시행하여 부위별 지방조직 표본을 제작하였다. 상기 염색된 지방 조직을 카메라가 부착된 광학현미경(BX61, Olympus, Japan)으로 200배와 400배의 대물렌즈를 사용하여 개체 당 한 장의 사진을 얻은 후, 컴퓨터 영상분석프로그램(Image analysis program, Metamorph, Japan)을 이용하여 조직표본상에서 한 장의 사진 당 무작위로 10개의 지방세포 크기를 측정하였다. 통계적 분석은 Student's t-test를 이용하여 수행되었고, P<0.05의 값은 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
그 결과, 세 부위의 지방조직에서 고지방 식이에 의해 지방세포의 크기가 현저히 증가됨이 확인되었다. 복부 지방조직은 정상식이군(ND)의 경우 지방세포의 크기(면적)가 444± 178 ㎛2이었고, 고지방식이군(HFD)의 경우는 1578± 207 ㎛2로 3배 이상 지방세포의 크기가 증가된 반면, 토별충 에탄올 추출물 처리군(EES)인 경우 지방세포의 크기가 1208± 325 ㎛2(P<0.05)로 고지방식이에 의해 유도되는 세포크기의 증가를 억제하였다(도 4-I). 또한, 부고환 지방조직의 경우 ND군에서는 620± 76 ㎛2의 크기를 가진 지방세포들이 관찰되었고, HFD군에서는 1650± 317 ㎛2로 2배 이상 증가된 반면, EES군에서는 1361± 162 ㎛2(P<0.05)로 세포크기 증가에 대한 유의적인 억제효과를 확인할 수 있었다(도 4-II). 아울러, 사타구니 지방조직에서는 ND군은 310± 102 ㎛2 크기를 가진 지방세포들이 확인되었고, HFD군의 경우 879± 181 ㎛2로 2배 정도 증가된 반면, EES군에서는 708± 250 ㎛2 로 유의적이진 않지만 약간 감소되어, 토별충 주정 추출물은 복부지방 및 부고환 지방에서 고지방 식이에 의해 유도되는 지방세포의 크기 증가를 효과적으로 억제하였다(도 4-III). 상기 에탄올 이외 토별충 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1과 유사하게 지방세포의 크기 증가를 효과적으로 억제하였다(표 6).
고지방식이를 섭취한 마우스의 지방세포 크기에 토별충 추출물 및 이의 분획물의 효과
시료 복부 부고환 사타구니
ND(Chow) 444±178 620±76 310±102
HFD 1578±207 1650±317 879±181
EES(HFD + 토별충 에탄올 추출물) 1208±325* 1361±162* 708±250
HFD + 토별충 물 추출물 1255±304* 1413±140* 742±245
HFD + 토별충 헥산 분획물 1226±312* 1385±148* 720±255
HFD + 토별충 에틸 아세테이트 분획물 1205±313* 1360±156* 708±250
< 실험예 6> 토별충 추출물 및 이의 분획물의 지질생화학적 분석
상기 실험예 <5-1>의 각 실험동물로부터 분리한 혈장(plasma)으로 간 기능의 지표인 GOT 및 GPT를, 혈장 및 간의 지질함량의 지표인 총콜레스테롤, HDL 및 중성지방(triglyceride)을 생화학자동분석기(Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다.
<6-1> 혈중 지질 측정
6주 동안 기본식이(AIN76A diet)를 섭취한 Chow군, HFHC군 및 시험군들의 혈중 총콜레스테롤(total cholesterol), HDL-콜레스테롤(HDL-cholesterol) 및 중성지방(Triglyceride)의 함량을 측정하였다.
그 결과, 총콜레스테롤은 Chow군이 153.2 mg/dl이고 HFHC군이 218.9 mg/dl에 비해 토별충 에탄올 추출물을 섭취한 시험군 1은 194.2 mg/dl로 감소되었다(도 2). 총콜레스테롤 당 HDL-콜레스테롤의 비율은 Chow군이 49.6%이고 HFHC군이 53.3%에 반해 시험군 1은 55.2%로 증가하였다. 또한, 중성지방은 Chow군이 81.3± 9.2 mg/dl이고 HFHC군이 108.2± 32.1 mg/dl에 반해 시험군 1은 78.5± 10.3 mg/dl로 감소시켰다. 상기 에탄올 이외 토별충 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1과 유사하게 총콜레스테롤 당 HDL-콜레스테롤의 비율을 증가(55 ~ 60%)시키고, 중성지방을 감소(75 ~ 80 mg/dl)시켰다.
<6-2> 간조직 내 지질 측정
6주 동안 기본식이(AIN76A diet)를 섭취한 Chow군, HFHC군 및 시험군들로부터 부검한 간 조직 내의 총지질(total lipid), 총콜레스테롤(total cholesterol) 및 인지질(phospholipid)의 함량을 측정하였다.
그 결과, 간 중량당 총지질량은 Chow군이 50.5 mg/g 간(liver)이고 HFHC군이 105.3 mg/g 간(P<0.05)에 반해 토별충 에탄올 추출물을 섭취한 시험군 1은 95.3 mg/g 간으로 감소되었다. 간 중량당 총콜레스테롤은 Chow 대조군이 1.4 mg/g 간이고 HFHC 대조군이 1.7 mg/g 간에 반해 시험군 1은 1.6 mg/g 간으로 큰 차이가 없었다. Chow 대조군의 간 중량당 인지질은 8.7 mg/g 간이고 HFHC 대조군은 9.7 mg/g 간으로 증가한데 반해 시험군 1은 9.6 mg/g 간으로 HFHC군과 큰 차이가 없었다. 상기 에탄올 이외 토별충 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1과 유사하게 총콜레스테롤 당 HDL-콜레스테롤의 비율을 증가(55 ~ 60%)시키고, 중성지방을 감소(75 ~ 80 mg/dl)시켰다.
<6-3> 혈중 간독성 지표 효소
6주 동안 기본식이(AIN76A diet)를 섭취한 Chow군, HFHC군 및 시험군들의 혈중 GOT, GPT 함량을 측정하였다.
그 결과, GOT 함량은 Chow 대조군이 77.8± 13.4 mg/dl이고 HFHC군이 97.0± 28.5 mg/dl인데 반해 토별충 에탄올 추출물을 섭취한 시험군 1은 90.5± 30.3 mg/dl로 감소되었으며, GPT 함량은 Chow 대조군이 29.2± 8.2 mg/dl이고 HFHC군이 36.9± 13.7 mg/dl인데 반해 시험군 1은 33.7± 14.3 mg/dl로 감소되었으나, 전체적으로 큰 차이는 없었으며 유의성 또한 없었다. 상기 에탄올 이외의 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1과 유사하게 GOT 함량(85 ~ 95 mg/dl) 및 GPT 함량(30 ~ 36 mg/dl)이 감소되었으나 유의성이 없었다.
<실험예 7> 토별충 에탄올 추출물을 투여한 동물조직의 유전자 발현 분석을 통한 항비만 활성
상기 실험예 <5-1>의 실험군 및 대조군으로부터 적출한 뇌와 소장, 및 상기 실험예 <5-3>에서 적출한 복부, 부고환 및 사타구니의 지방조직들의 유전자 발현 양상을 역전사 PCR 증폭법을 사용하여 알아보았다. 지방조직(adipose tissue) 및 뇌(brain)는 RNeasy lipid tissue kit(Qiagen)을 사용하고 나머지 조직은 Trizol(Intron) 용액을 사용하여 각 조직으로부터 RNA를 추출한 뒤 Quantitect Reverse transcriptase kit(Qiagen)를 사용하여 cDNA를 만들고, 이를 주형(template)으로 하여 각각의 유전자를 증폭시킬 수 있도록 합성된 올리고(oligo)들과 함께 dsDNA에 끼어들어가는 SYBR Green의 특성을 이용한 Quantitect SYBR Green PCR kit(AB science)를 사용하여 reverse transcriptase PCR(RT-PCR, Applied Bioscience)에서 실시간으로 cDNA의 증폭과정을 확인하였다. 이때 사용된 올리고들은 PCR 증폭과정에서 150 ~ 200 bp정도의 단일 앰플리콘(single amplicon)을 형성함을 확인하였고, 이들의 염기서열은 하기 표 7과 같다.
유전자 명칭 유전자 번호 센스 안티-센스
ACC1
 NM_133360
 AGTTTCCCAGCCAGCAGATT
(서열번호 1)		 ATCCATCACCACAGCCTTCA
(서열번호 2)
ACC2
 NM_133904
 CCCATCACCACTCCTTCTGA
(서열번호 3)		 GTCCGAGTCTCCACAGCAAT
(서열번호 4)
ACS
 NM_007981
 ACCAGCCCTATGAGTGGATT
(서열번호 5)		 GGACGACCACCATTGAGTAA
(서열번호 6)
ANTG
 NM_007428
 TCTCACCACCAGCTCTCTTT
(서열번호 7)		 CACCACAATGGACTGTAGCA
(서열번호 8)
aP2
 NM_024406
 TTTCTCACCTGGAAGACAGC
(서열번호 9)		 TGATGCTCTTCACCTTCCTG
(서열번호 10)
C/EBPb
 NM_009883
 AAGCTGAGCGACGAGTACAA
(서열번호 11)		 AGCTGCTTGAACAAGTTCCG
(서열번호 12)
CART
 NM_013732
 CTGCTGCTACTGCTACCTTT
(서열번호 13)		 GCCGTACTTCTTCTCGTAGA
(서열번호 14)
DGAT1
 NM_010046
 ACAACCTGACCTACCGAGAT
(서열번호 15)		 AGTAGGGACCATCCACTGTT
(서열번호 16)
FABP4
 NM_024406
 TTTGTGGGAACCTGGAAGCT
(서열번호 17)		 CACGCCCAGTTTGAAGGAAA
(서열번호 18)
FAS
 NM_007988
 TGTGAGTGGTTCAGAGGCAT
(서열번호 19)		 TTCTGTAGTGCCAGCAAGCT
(서열번호 20)
FATP
 NM_011977
 CTTTCTGCGTATCGTCTGCA
(서열번호 21)		 GTGCGAAGGTCCAGCATATA
(서열번호 22)
Ghrelin
 NM_021488
 AGGACAGAGGACAAGCAGAA
(서열번호 23)		 CTGTCCGTGGTTACTTGTCA
(서열번호 24)
HSL
 NM_010719
 TTCGAGGGTGATGAAGGACT
(서열번호 25)		 ACTCTGGGTCTATGGCGAAT
(서열번호 26)
Leptin
 NM_008493
 CTGCAAGGTGCAAGAAGAAG
(서열번호 27)		 TCCAGGTCATTGGCTATCTG
(서열번호 28)
MC4R
 NM_016977
 GGTCGGAAACCATCGTCATT
(서열번호 29)		 TGAAATACCTGTCCACCGCA
(서열번호 30)
PDE3B
 NM_011055
 CAGCTTCTTCTTCCACCTCT
(서열번호 31)		 GTGAGGAAGAAGAAGGCACA
(서열번호 32)
PEPCK-C
 NM_011044
 TCATCACCCAAGAGCAGAGA
(서열번호 33)		 GGCGAGTCTGTCAGTTCAAT
(서열번호 34)
PGC1
 NM_008904
 GTGCAGCCAAGACTCTGTAT
(서열번호 35)		 GGTCGCTACACCACTTCAAT
(서열번호 36)
PPARa
 NM_011144
 CCTGAACATCGAGTGTCGAA
(서열번호 37)		 GTACTGGCATTTGTTCCGGT
(서열번호 38)
Resistin
 NM_022984
 CCAGTGTGCAAGGATAGACT
(서열번호 39)		 CACACACCCTTCTCCACTAA
(서열번호 40)
TRH
 NM_009426
 CCTTGGTGCTGCCTTAGATT
(서열번호 41)		 ATCCTTGTCTTGGTTGGCAC
(서열번호 42)
UCP1
 NM_009463
 CCAGGCTTCCAGTACCATTA
(서열번호 43)		 GCCACACCTCCAGTCATTAA
(서열번호 44)
UCP2
 NM_011671
 GCCTCTACGACTCTGTCAAA
(서열번호 45)		 CTTCGACAGTGCTCTGGTAT
(서열번호 46)
UCP3
 NM_009464
 AGACCCGATACATGAACGCT
(서열번호 47)		 TAAGGCCCTCTTCAGTTGCT
(서열번호 48)
VGF
 NM_001039385
 ATAATGGGCAGGTAGCTGAG
(서열번호 49)		 AGAGCTTCTGCTGCTTCTTC
(서열번호 50)
GAPDH
 NM_001001303
 CAGTGGCAAAGTGGAGATTG
(서열번호 51)		 GTTGTCATGGATGACCTTGG
(서열번호 52)
유전자의 발현 수치는 cDNA가 증폭되어 형광이 포화상태에 이르는 지점의 PCR 사이클(cycle) 횟수로써 표시되는데, 이를 갭디에이치(GAPDH)에 대한 값으로 보정한 뒤 최종적으로 대조군에 대한 상대적인 수치로 산출하였다.
실험결과, 토별충 에탄올 추출물을 투여한 시험군의 지방조직에서 지방산화 및 에너지 소비에 관련된 유전자들, 및 그들을 촉진시키는 역할을 하는 전사인자의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
구체적으로, 에너지 소비에 있어서 중요한 역할을 하는 결합저지 단백질(uncoupling protein; UCP)-1, UCP-2 및 UCP-3가 복부, 부고환 및 사타구니의 지방조직 모두에서 HFD 대조군에 비해 시험군에서 2 ~ 3배 정도의 발현 증가를 보였다(도 6 및 도 7).
또한, 항비만 효과를 나타내는 베타 아드레노셉터 수용체(beta adrenoceptor receptor 3; b3AR) 경로의 신호에 중요한 역할을 하는 호르몬 민감성 지질분해효소(hormone sensitive lipase; HSL)가 HFD 대조군의 복부 지방에서의 발현이 줄어든 반면, 시험군에서는 발현이 현저히 증가되었다(도 6). 상기 HSL의 지방포(lipid droplet)로의 접근을 용이하게 해주는 지방산 결합 단백질 4(Fatty acid binding protein 4; FABP4)의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 6). 상기 시험군의 부고환 및 사타구니의 지방조직에서는 HSL의 발현은 별 차이가 없었으나, HSL의 작용을 방해하는 포스포디에스테르 가수분해효소 3B(phosphodiesterase 3B; PDE3B) 및 페리리핀(perilipin)의 경우는 그 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 7 및 도 8).
또한, 식욕억제 작용을 하면서 지방세포에서는 지방산 합성에 관련된 효소들의 발현을 줄여주는 것으로 알려진 렙틴(leptin)의 경우, 시험군의 사타구니 지방조직에서는 HFD 대조군에 비해 발현이 증가하였고(도 10), 복부 및 부고환 지방조직에서는 렙틴 수용체(leptin receptor)로 알려진 OB 수용체(ObR)의 발현이 현저히 증가함을 볼 수 있었다(도 6 및 도 8).
또한, 지방산 합성효소(fatty acid synthase; FAS), 아세틸 코에이 합성효소(acetyl-CoA synthase; ACS), 포스포에놀 피부르산 카르복시 키나아제(phosphoenol pyruvate carboxy kinase; PEPCK-c) 등의 지방산 합성에 관련된 여러 가지 효소 및 단백질들의 발현은 HFD 대조군에 비해 시험군에서 감소하였고, 지방산 분해에 관련된 글리세롤 키나아제(glycerol kinase; Gyk) 등의 효소의 발현은 HFD 대조군에 비해 시험군에서 증가함을 보였다(도 7).
또한, 복부 지방에서 에너지 소비에 관련된 유전자들의 발현을 촉진하는 전사인자인 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 알파(peroxisome proliferator-activated receptor alpha; PPARα), 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마 공동활성체 1 알파(PPAR gamma coactivator 1 alpha; PGC1α) 및 백시니아 바이러스 성장인자(Vaccinia virus growth factor; VGF)의 발현은 대조군에 비해 시험군에서 증가하고(도 7), 반대로 지방세포 분화를 촉진하는 CCAAT/증진제 결합 단백질 알파(CCAAT/enhancer binding protein alpha; C/EBPα)의 발현은 HFD 대조군에 비해 시험군에서 감소함을 볼 수 있었다(도 8).
또한, 리지스틴(resistin), aP2, 종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor alpha; TNFα), IL-6, 안지오텐시노겐(angiotensinogen; ANTG) 등의 대사질환과 관련하여 지방세포에서 그 발현이 증가하는 유전자들의 발현이 HFD 대조군에 비해 실험군에서 감소하였다(도 8 및 도 10). 따라서 토별충 추출물 및 이의 분획물은 항비만 효과와 더불어 항대사 질환 효과도 있다는 것을 알 수 있다.
아울러, 뇌신경 회로와 관련하여 섭취행동(feeding behavier) 및 열발생(thermogenesis)에도 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 뇌와 소장에서의 유전자들의 발현양상을 알아본 결과, 유전자 결핍 시 비만을 초래하는 뉴로메딘 B(neuromedin B; NMB)의 발현이 HFD 대조군에 비해 실험군에서 증가하였고, 소장에서 발현되어 식욕촉진을 담당하는 신경전달물질(neurotransmitter)인 그렐린(ghrelin)의 발현이 HFD 대조군에 비해 실험군에서 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 11).
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
< 제조예 1> : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
실시예 <1-1>의 추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
실시예 <1-1>의 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
실시예 <1-1>의 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 환의 제조
실시예 <1-1>의 추출물 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
5. 과립의 제조
실시예 <1-1>의 추출물 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
< 제제예 2> : 식품의 제조
1. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 실시예 <1-2>의 추출물을 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
2. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 실시예 <1-2>의 추출물을 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
3. 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 실시예 <1-2>의 추출물의 추출물을 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 실시예 <1-2>의 추출물을 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
5. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 실시예 <1-1>의 추출물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 실시예 <1-1>의 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
실시예 <1-1>의 추출물(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
< 제제예 3> : 음료의 제조
1. 건강음료의 제조
액상과당(0.5 %), 올리고당(2 %), 설탕(2 %), 식염(0.5 %), 물(75 %)과 같은 부재료와 본 발명의 실시예 <1-2>의 추출물 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
2. 야채쥬스의 제조
본 발명의 실시예 <1-2>의 추출물 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
3. 과일쥬스의 제조
본 발명의 실시예 <1-2>의 추출물 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖ 에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.
도 1은 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델의 체중 변화를 나타낸 그래프이다:
Chow: 기본 식이를 섭취한 대조군;
HFHC: 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취한 대조군; 및
HFHC + E. sinensis: 고지방고콜레스테롤 식이와 토별충 에탄올 추출물을 섭취한 시험군.
도 2는 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방고콜레스테롤 식이로 유도된 비만 마우스 모델의 혈중 총콜레스테롤의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방고콜레스테롤 식이로 유도된 비만 마우스 모델의 지방조직의 무게 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방 식이로 유도된 비만 마우스 모델의 지방조직(복부지방, 부고환지방, 사타구니지방)의 세포 크기 변화를 나타낸 그림이다:
ND: 기본 식이를 섭취한 대조군;
HFD: 고지방 식이를 섭취한 대조군; 및
EES: 고지방식이와 토별충 에탄올 추출물을 섭취한 시험군.
도 5는 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델의 지방조직의 세포 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델의 복부 지방조직에서 비만 관련 에너지 소비 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델의 부고환 지방조직에서 비만 관련 에너지 소비 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델의 부고환 지방조직에서 비만 관련 지질대사 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델의 사타구니 지방조직에서 비만 관련 에너지 소비 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델의 사타구니 지방조직에서 비만 관련 지질대사 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 토별충 에탄올 추출물의 투여에 따른 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델의 뇌와 소장에서 비만 관련 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Compositions for the prevention and treatment of obesity or atherosclerosis comprising extracts or fractions of Eupolyphaga sinensis as an active ingredient <130> 8p-04-25 <160> 52 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 sense primer <400> 1 agtttcccag ccagcagatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 antisense primer <400> 2 atccatcacc acagccttca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 sense primer <400> 3 cccatcacca ctccttctga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 antisense primer <400> 4 gtccgagtct ccacagcaat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACS sense primer <400> 5 accagcccta tgagtggatt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACS antisense primer <400> 6 ggacgaccac cattgagtaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANTG sense primer <400> 7 tctcaccacc agctctcttt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANTG antisense primer <400> 8 caccacaatg gactgtagca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2 sense primer <400> 9 tttctcacct ggaagacagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2 antisense primer <400> 10 tgatgctctt caccttcctg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBPb sense primer <400> 11 aagctgagcg acgagtacaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBPb antisense primer <400> 12 agctgcttga acaagttccg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CART sense primer <400> 13 ctgctgctac tgctaccttt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CART antisense primer <400> 14 gccgtacttc ttctcgtaga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGAT1 sense primer <400> 15 acaacctgac ctaccgagat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGAT1 antisense primer <400> 16 agtagggacc atccactgtt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP4 sense primer <400> 17 tttgtgggaa cctggaagct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP4 antisense primer <400> 18 cacgcccagt ttgaaggaaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS sense primer <400> 19 tgtgagtggt tcagaggcat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS antisense primer <400> 20 ttctgtagtg ccagcaagct 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FATP sense primer <400> 21 ctttctgcgt atcgtctgca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FATP antisense primer <400> 22 gtgcgaaggt ccagcatata 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ghrelin sense primer <400> 23 aggacagagg acaagcagaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ghrelin antisense primer <400> 24 ctgtccgtgg ttacttgtca 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSL sense primer <400> 25 ttcgagggtg atgaaggact 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSL antisense primer <400> 26 actctgggtc tatggcgaat 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leptin sense primer <400> 27 ctgcaaggtg caagaagaag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leptin antisense primer <400> 28 tccaggtcat tggctatctg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC4R sense primer <400> 29 ggtcggaaac catcgtcatt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC4R antisense primer <400> 30 tgaaatacct gtccaccgca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDE3B sense primer <400> 31 cagcttcttc ttccacctct 20 <210> 32 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Artificial Sequence <220> <223> Resistin antisense primer <400> 40 cacacaccct tctccactaa 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRH sense primer <400> 41 ccttggtgct gccttagatt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRH antisense primer <400> 42 atccttgtct tggttggcac 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP1 sense primer <400> 43 ccaggcttcc agtaccatta 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP1 antisense primer <400> 44 gccacacctc cagtcattaa 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP2 sense primer <400> 45 gcctctacga ctctgtcaaa 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP2 antisense primer <400> 46 cttcgacagt gctctggtat 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP3 sense primer <400> 47 agacccgata catgaacgct 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP3 antisense primer <400> 48 taaggccctc ttcagttgct 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGF sense primer <400> 49 ataatgggca ggtagctgag 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGF antisense primer <400> 50 agagcttctg ctgcttcttc 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 51 cagtggcaaa gtggagattg 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 52 gttgtcatgg atgaccttgg 20

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  11. 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출한 토별충(Eupolyphaga sinensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 치료용 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 토별충 추출물을 추가적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트를 순차적으로 이용하여 분획한 핵산 추출물, 클로로포름 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 조성물.
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  15. 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출한 토별충 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 토별충 추출물을 추가적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트를 순차적으로 이용하여 분획한 헥산 추출물, 클로로포름 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품.
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  21. 약학적으로 유효한 양의 제 11항 또는 제 13항의 토별충 추출물 또는 이의 분획물을 비만인 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 비만 예방 및 치료 방법.
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