KR101001368B1 - Probe for Detection of Rifampin Resistance of Mycobacterium leprae and the kit - Google Patents
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Abstract
본 발명은 나병의 치료법인 다항나제복합요법(MDT, Multidrug therapy)의 주요 약제인 리팜핀에 대한 내성 여부를 신속하게 진단하기 위한 프로브, 그 키트 및 그 진단법에 관한 것이다. 본 발명의 프로브 및 키트를 이용하면, 주요 항나제인 리팜핀에 대한 나균의 약제내성여부를 신속하게 진단함으로써 나병환자들의 보다 효과적인 치료를 위해 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a probe, a kit thereof, and a diagnostic method for rapidly diagnosing resistance to rifampin, which is a main agent of multidrug therapy (MDT), which is a treatment for leprosy. Using the probes and kits of the present invention, it is possible to quickly diagnose whether or not drug resistance of the bacterium to rifampin, which is a major antinase, can be utilized for more effective treatment of leprosy patients.
나균, 리팜핀, 약제내성, 돌연변이, 진단 Bacillus, rifampin, drug resistance, mutation, diagnosis
Description
본 발명은 나병의 치료법인 다항나제복합요법(MDT, Multidrug therapy)의 주요 약제인 리팜핀에 대한 내성 여부를 신속하게 진단하기 위한 프로브, 그 키트 및 그 진단법에 관한 것이다. The present invention relates to a probe, a kit thereof, and a diagnostic method for rapidly diagnosing resistance to rifampin, which is a main agent of multidrug therapy (MDT), which is a treatment for leprosy.
일반적으로 나병의 치료방법은 피부도말검사에서 균이 많이 발견되는 다균나병(MB, MultiBacillary leprosy)에는 리팜핀(Rifampicin), 클로파지민(Clofazimine), 댑손(Dapsone)을 복합처방하고 균이 발견되지 않은 희균나병(PB, Paucibacillary leprosy)에는 리팜핀(Rifampicin), 댑손(Dapsone)을 복합처방하는, 다항나제복합요법(MDT, Multidrug therapy)이며 1995년 이후 WHO에서 다항나제복합요법(MDT, Multidrug therapy)을 무료지원하면서 전 세계 평균 발병률은 약 20%씩 꾸준히 감소하고 있다.In general, the method of treatment of leprosy is a combination of rifampin, clofazimine, and dapsone in multi-Bacillus leprosy (MB, MultiBacillary leprosy). Non-fungal leprosy (PB, Paucibacillary leprosy) is a multidrug therapy (MDT) that combines rifampin (Dapsone) and multidrug therapy (MDT) since 1995. The global average incidence rate has steadily declined by approximately 20%, with free support.
다항나제복합요법(MDT, Multidrug therapy)중에서 리팜핀은 가장 효과적인 약제로 다균나병(MB)과 희균나병(PB)의 치료에 모두 사용되고 있다. 리팜핀이 매우 효과적인 약제였으므로 나균의 리팜핀 내성문제는 한동안 중요하게 여겨지지 않았으며 실제로 보고된 사례도 적었으나, 댑손과 클로파지민에 이미 내성을 갖고 있는 환자의 경우 리팜핀 내성을 쉽게 얻을 수 있으므로 나균의 리팜핀 내성문제를 간과할 수 없게 되었다(Araoz, et al, Infect. Immun. 74(1)175-182, 2006; Beenhouwer, Tuberc. Lung. Dis. 76: 425-430, 1995; Brosch, et al, Res. Microbiol.151:135142,2000; Cambau, E., Lancet. 349: 103-104, 1997; Frieden, et al, N. Eng. J. Med. 328: 521-526, 1993; Goble, et al, N. Eng. J. Med. 328:527-532, 1993; Grosset, et al, Int. J. Lepr. 57:607-614, 1990).
리팜핀의 내성은 rpoB 유전자가 암호화하고 RNA polymerase ß-subunit의 아미노산 변화와 연관이 있다고 밝혀졌다. 역시 리팜핀이 주요 치료약제로 사용되고 있는 결핵의 원인균인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에서의 관련 연구와 다른 균종들에서의 연구를 참조하면, 리팜핀 내성 균주의 95% 이상이 rpoB 유전자의 81-bp rifampin-resistance determining region(RRDR)내에 돌연변이를 가지고 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 RRDR에서의 돌연변이는 RNA polymerase ß-subunit의 구조적인 변화를 가져와 리팜핀 약제와의 결합을 억제함으로써 리팜핀에 대한 내성을 갖게 한다.
한편 나병의 원인균인 나균(Mycobacterium leprae)은 천천히 증식하는 대표적인 Mycobacteria이며, 더욱이 인공배지에서의 배양이 불가능한 균으로 아마딜로(armadillo) 등의 몇몇 종의 동물을 통한 감염에 의해서만 확인이 가능하다. 이는 리팜핀 내성을 확인하기 위해 매우 긴 시간과 많은 비용이 소모됨을 뜻하며 그러므로 분자생물학방법을 이용한 리팜핀 내성 진단법의 개발은 필수불가결한 사항이다.Rifampin is the most effective drug in multidrug therapy (MDT) and is used for the treatment of multi-naposis (MB) and mycelial leprosy (PB). Since rifampin was a very effective drug, the rifampin resistance problem of the bacillus was not considered important for some time, and there have been few reported cases. However, since rifampin resistance can be easily obtained in patients who are already resistant to dapsone and clofazimin, The rifampin resistance problem cannot be overlooked ( Araoz, et al, Infect. Immun. 74 (1) 175-182, 2006; Beenhouwer, Tuberc. Lung. Dis. 76: 425-430, 1995; Brosch, et al, Res. Microbiol. 151: 135142,2000; Cambau, E., Lancet. 349: 103-104, 1997; Frieden, et al, N. Eng. J. Med. 328: 521-526, 1993; Goble, et al , N. Eng. J. Med. 328: 527-532, 1993; Grosset, et al, Int. J. Lepr. 57: 607-614, 1990).
Rifampin resistance was found to be encoded by the rpoB gene and associated with amino acid changes in the RNA polymerase ß-subunit. Relevant studies in Mycobacterium tuberculosis , which is also the causative agent of tuberculosis, in which rifampin is also used as the main therapeutic agent, and in other strains, more than 95% of the rifampin-resistant strains are 81-bp rifampin-resistance determining the rpoB gene. It was found to have mutations in the region (RRDR). These mutations in the RRDR result in structural changes in the RNA polymerase ß-subunit, resulting in resistance to rifampin by inhibiting binding to rifampin drugs.
Meanwhile, Mycobacterium leprae , a causative agent of leprosy, is a representative Mycobacteria that grows slowly, and it is impossible to cultivate in artificial media, and can only be confirmed by infection with some species of animals such as amadillo. This means that a very long time and a high cost are required to confirm rifampin resistance, and therefore, the development of rifampin resistance diagnostic method using molecular biology methods is indispensable.
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본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 나균의 리팜핀 감수성 검사를 신속하게 수행할 수 있는 분자생물학적 진단법을 제공하는 것이다.The present invention has been made in view of the above problems, and the object of the present invention is to provide a molecular biological diagnostic method capable of quickly performing rifampin susceptibility test of bacteria.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 5 내지 16 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 나균의 리팜핀 내성 진단용 유전자 탐침을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a gene probe for diagnosing rifampin resistance of bacteria having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 5-16.
본 발명에 있어서, 상기 유전자 탐침은 나균의 리팜핀 내성과 관련된 rpoB유전자와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the gene probe specifically binds to the rpoB gene associated with rifampin resistance of the bacterium , but is not limited thereto.
또 본 발명은 상기의 유전자 탐침 및 나균을 증폭할 수 있는 프라이머를 함유하는 나균의 리팜핀 내성 진단용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing rifampin resistance of bacteria containing a primer capable of amplifying the gene probe and bacteria.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In the present invention, the primer is preferably a primer described in SEQ ID NOs: 1 to 4, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 a) 상기의 유전자 탐침을 고체 서포트에 부착하는 단계;In another aspect, the present invention comprises the steps of: a) attaching the gene probe to the solid support;
b) 증폭된 나균의 PCR 산물을 상기 유전자 탐침과 교잡하는 단계; 및b) hybridizing the PCR product of the amplified bacterium with the gene probe; And
c) 상기 교잡된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 나균의 리팜핀 내성 진단방법을 제공한다.c) providing a method for diagnosing rifampin resistance of the bacterium comprising detecting the hybridized product.
본 발명에 있어서 상기 나균의 PCR 산물은 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머에 의하여 수득된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In the present invention, the PCR product of the bacterium is preferably obtained by the primers described in SEQ ID NOs: 1 to 4, but is not limited thereto.
또한 본 발명에 있어서, 상기 검출단계는 발광 또는 발색반응을 이용하여 검출하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. In addition, in the present invention, the detection step is preferably detected using a luminescence or color reaction, but is not limited thereto.
본 발명은 검체로부터 세포를 얻어서 그 세포로부터 핵산을 추출하고, PCR 증폭을 수행하였다. 세포로부터 핵산을 추출하는 방법 및 PCR 방법은 Sambrook 등의 Molecular cloning(1989)에 기재된 방법과 같은 당업계에 주지된 방법을 통하여 수행하였다.In the present invention, cells were obtained from a sample, nucleic acids were extracted from the cells, and PCR amplification was performed. Methods of extracting nucleic acids from cells and PCR methods were performed through methods well known in the art, such as those described in Molecular cloning (1989) by Sambrook et al.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 프라이머를 사용하였다. 일반적으로 프라이머는 약 10에서 25bp 길이의 올리고뉴크레오타이드가 바람직하나 더 긴 것도 가능하며, 프라이머는 단일 가닥이 바람직하나 이중 또는 단일 가닥 형태로 존재할 수도 있으며, 본 발명에서 사용한 특정 프라이머는 본 발명의 실시예에 기재하였다.The nucleic acid amplification method of the present invention used a primer. Generally, the primer is preferably about 10 to 25 bp in length oligonucleotide, but may be longer. The primer is preferably single stranded but may be present in double or single stranded form. It described in the Example.
본 발명의 프라이머는 통상의 올리고뉴크레오타이드 합성법에 의하여 제조되었으며, 그러한 합성 방법은 미국 특허 제 4,659,774, 4,816,571, 5,141,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744, 5,574,146, 및 5,602,244 등에 개재된다.Primers of the invention were prepared by conventional oligonucleotide synthesis methods, and such synthesis methods are disclosed in US Pat.
본 발명의 프라이머와 같은 서열들은 샘플로부터 유래한 DNA와 같은 상보적인 서열들과 선택적으로 이중 나선을 형성하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 타겟 서열에 대한 프라이머의 선택성을 변화시키기 위하여 교잡 조건을 변경할 수 있다. Sequences such as primers of the invention can be used to form a double helix optionally with complementary sequences, such as DNA derived from a sample. One skilled in the art can alter the hybridization conditions to change the selectivity of the primer for the target sequence.
일부 실시예에서는 교잡을 결정하기 위하여 표지와 같은 적당한 수단과 결합하여 본 발명의 한정된 서열의 핵산을 채택할 수 있다. 적당한 표지수단은 형광, 방사성동위원소 효소 또는 다른 리간드를 포함하는 다양한 표지 수단이 가능하다.In some embodiments, nucleic acids of defined sequences of the invention may be employed in combination with appropriate means such as labels to determine hybridization. Suitable labeling means are various labeling means including fluorescence, radioisotope enzymes or other ligands.
다양한 주형 의존적인 과정들이 주어진 세포 샘플에 존재하는 특정 유전자 산물을 증폭하는데 가능하다. 가장 공지된 증폭 방법 중 하나가 중합효소 연쇄반응(PCR)이다 이 방법은 미국특허 제 4,683,202 및 4,800,159 등에 기재된다.Various template dependent processes are possible to amplify specific gene products present in a given cell sample. One of the most known amplification methods is polymerase chain reaction (PCR), which is described in US Pat. Nos. 4,683,202 and 4,800,159 and the like.
일반적으로 한 단계 또는 또 다른 단계에서 증폭산물을 주형 또는 초과 프라이머 또는 다른 증폭산물로부터 분리하는 것이 바람직하다. 예를 들어 증폭 산물은 Sambrook 등의 Molecular cloning(1989)에 기재된 표준 방법을 아가로스, 아가로스-아크릴아마이드 또는 PAGE를 사용하여 분리될 수 있다. It is generally desirable to separate the amplification product from the template or excess primer or other amplification product in one or another step. For example, the amplification products can be separated using agarose, agarose-acrylamide or PAGE using the standard method described in Molecular cloning (1989) by Sambrook et al.
또 흡착, 분배, 이온교환 등과 같은 크로마토그래피도 효과적인 분리방법으로 채택될 수 있다. 이들 분리방법들은 대량의 샘플을 가공하기 위하여 임상 셋팅에서 기능하도록 채택될 수 있으며, 수천개의 샘플을 한번에 분리하거나 검출할 수 있는 새로운 방법인 FMAT (fluorometric microvolume assay technique), chemiluminescence, sequence detection systems (Applied Biosystems) 및 질량 분광법 등이 있다.Chromatography, such as adsorption, partitioning and ion exchange, can also be employed as an effective separation method. These separation methods can be adapted to function in clinical settings to process large volumes of samples, and new methods for separating or detecting thousands of samples at once, FMAT (fluorometric microvolume assay technique), chemiluminescence, and sequence detection systems (Applied) Biosystems) and mass spectroscopy.
본 발명에 따른 핵산은 검출되고 정량화될 것이다. 일 실시예에서 그 검출은 시각적 수단에 의하여 수행될 수 있다. 전형적인 시각적 수단 방법은 ethidium bromide로 젤을 염색하고, UV 광 하에서 밴드들을 시각화하는 것이다. 또 만약 증폭 산물이 방사선 또는 형광으로 표지된 뉴크레오타이드이면 분리된 증폭산물은 삽입된 방사선동위원소 표지의 방사성 신티그램 촬영 또는 형광 검출을 수행한다.Nucleic acids according to the invention will be detected and quantified. In one embodiment the detection can be performed by visual means. Typical visual means method is to dye the gel with ethidium bromide and visualize the bands under UV light. If the amplification product is nucleotides labeled with radiation or fluorescence, the isolated amplification product performs radiosynthesis or fluorescent detection of the inserted radioisotope label.
본 발명은 상기 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 비한정적인 실시예에서 본 발명의 키트는 프라이머들, 증폭을 위한 효소 및 부가적인 시약을 포함할 수 있다. 따라서 본 키트들은 적당한 용기 수단들에 이들 하나 이상의 시약들을 포함할 것이다. 그 키트들은 또한 핵산을 분리하고 증폭 산물을 정제하는 시약들을 포함할 수도 있다. 키트들의 구성성분은 수용성 매체 또는 동결건조 형태로 포장될 수 있고, 키트의 적당한 용기 수단은 구성성분이 들어갈 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병 등을 포함한다. 키트에 하나 이상의 구성요소가 존재한다면 부가적인 구성요소들이 따로 위치될 수 있는 제2, 제3 등의 다른 부가적인 용기를 포함할 수 있다. 그러나 여러 구성요소의 조합이 하나의 용기에 포함될 수도 있다.The present invention includes a kit for carrying out the method. In a non-limiting embodiment the kit of the invention can comprise primers, enzymes for amplification and additional reagents. Thus, the kits will include these one or more reagents in suitable container means. The kits may also include reagents for isolating nucleic acids and purifying amplification products. The components of the kits may be packaged in an aqueous medium or lyophilized form, and suitable container means of the kit include at least one vial, test tube, flask, bottle, etc. into which the components may be placed. If one or more components are present in the kit, they may include other additional containers, such as second, third, etc., where the additional components may be located separately. However, a combination of components may be included in one container.
이하 본 발명을 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described.
본 발명자들은 리팜핀에 대한 내성 여부를 신속하게 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 나균의 RRDR부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하였으며 또한 내성균과 감성균을 구별할 수 있는 와일드 타입 프로브와 돌연변이 타입 프로브를 제작하였다. 와일드 타입의 rpoB 유전자 부위를 클로닝을 통해 클론을 확보해 놓고 mutagenesis를 통해 각 돌연변이 타입에 해당하는 클론을 확보하였다. 확보된 클론의 PCR 증폭산물을 이용, Reverse blot hybridization법에 적용된 와일드 프로브와 돌연변이 프로브의 유용성을 확인하였다(도 2).In order to develop a method for rapidly diagnosing resistance to rifampin, the present inventors prepared primers capable of amplifying the RRDR region of the bacterium, and also produced wild-type and mutant-type probes capable of distinguishing between resistant and sensitive bacteria. It was. Clones were obtained by cloning the wild type rpoB gene region and clones corresponding to each mutation type were obtained through mutagenesis. Using the PCR amplification products of the clones confirmed the usefulness of the wild and mutant probes applied to the reverse blot hybridization method (Fig. 2).
또 한센 병원에서 나병환자로부터 분리된 임상시료를 이용하여 본 발명의 방법으로 리팜핀에 대한 내성을 신속하게 진단할 수 있음을 확인하였다(도 4).In addition, it was confirmed that resistance to rifampin can be quickly diagnosed by the method of the present invention using a clinical sample isolated from a leprosy patient in Hansen Hospital (FIG. 4).
즉 본 발명에서는 나균에서 리팜핀 내성 관련 유전자인 rpoB에서 RRDR을 포함하여 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하여 RRDR에서의 와일드 타입에 해당하는 프로브와 돌연변이 프로브들을 개발하였으며, 이를 나이트로셀루로스 막에 결합시킨 프로브와 PCR 산물을 결합시키는 reverse line blot hybridization법에 적용하여 나균의 리팜핀 내성 여부를 판별할 수 있도록 하였다.In other words, the present invention has developed a wild type probe and mutant probes in the RRDR including a primer capable of amplifying the rampB resistance-related gene rpoB including RRDR in the bacterium, and then coupled to the nitrocellulose membrane The reverse line blot hybridization method, which combines the probe and the PCR product, was used to determine the resistance of rifampin to leprosy.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 주요 항나제인 리팜핀에 대한 내성 관련 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 및 해당 유전자의 내성 관련 돌연변이를 검출할 수 있는 프로브를 포함하는 나균의 리팜핀 내성 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 키트를 이용하면, 나균의 리팜핀에 대한 감수성검사를 신속하게 수행할 수 있으므로 나병환자의 효과적인 치료에 이바지할 수 있을 것이다. As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a rifampin resistance diagnostic kit of Nacillus comprising a primer capable of amplifying a gene related to resistance to rifampin, a major antinase, and a probe capable of detecting a resistance related mutation of the gene. do. With the kit of the present invention, the susceptibility test for rifampin of the bacterium can be performed quickly, thus contributing to the effective treatment of leprosy patients.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
실시예 1: 나균의 DNA 수득 Example 1 Obtaining DNA of Bacteria
표준균주로 사용된 M. leprae strain 4264는 Colorado State University에서 정제된 100 mg (평균 2.9×109 bacilli/mg 포함) 을 제공받아 QIAamp DNA Mini Kit (Tissue protocol; Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA를 분리하고, 최종농도를 50 ng/㎕로 하여 사용하였다. 임상검체 평가에 이용된 DNA는 한센병연구원에서 나병 환자들로부터 채취한 피부생검조직을 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 추출한 DNA를 제공받아 사용하였다. M. leprae strain 4264, used as a standard strain, was supplied with 100 mg (including an average of 2.9 × 10 9 bacilli / mg) purified from Colorado State University using QIAamp DNA Mini Kit (Tissue protocol; Qiagen GmbH, Hilden, Germany). DNA was isolated and the final concentration was used at 50 ng / μl. The DNA used for the evaluation of clinical specimens was obtained by using DNA extracted from the leprosy patients from the leprosy patients using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany).
실시예 2: 나균의 rpoB 유전자의 증폭 Example 2 rpoB of Bacillus Gene amplification
나균의 genomic DNA로부터 rpoB 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인하고 이 중 역방향 프라이머의 3' 말단에 바이오틴(biotin)을 표지하여 제작하였다:RpoB from genomic DNA of bacillus A primer was designed to amplify the gene region and was prepared by labeling biotin at the 3 'end of the reverse primer:
상기 표는 rpoB 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머에 대한 내용이다.The table above shows rpoB It is about the primer for amplifying the gene region.
상기 수득한 각 DNA를 5㎕를 주형으로 하고 [표 1]의 서열번호 1-4의 2쌍의 프라이머 중에서 1차 프라이머를 이용, PCR을 수행하여(95℃ 5분, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초, 35cycle, 72℃ 7분) 나균의 rpoB(220bp)유전자 부위를 1차로 증폭하였다.5 μl of each obtained DNA was used as a template, and PCR was performed using primary primers from two pairs of primers of SEQ ID NOs: 1-4 in Table 1 (95 ° C., 5 minutes, 95 ° C., 30 seconds, 58). 30 seconds, 72 ℃ 30 seconds, 35 cycles, 72 ℃ 7 minutes) The rpoB (220bp) gene region of the bacterium was amplified first.
1차 증폭산물 2㎕를 주형으로 하고 [표 1]의 서열번호 1-4의 2쌍의 프라이머 중에서 2차 프라이머를 이용, PCR을 수행하여(95℃ 5분, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초, 35cycle, 72℃ 7분) 나균의 rpoB(185bp)유전자 부위를 2차로 증폭하였다.2 μl of the primary amplification product was used as a template, and PCR was performed using a second primer among two pairs of primers of SEQ ID NOs: 1-4 in Table 1 (95 ° C., 5 minutes, 95 ° C., 30 seconds, and 58 ° C. 30). Sec, 72 ° C. 30 sec, 35 cycles, 72 ° C. 7 minutes). The rpoB (185bp) gene region of the bacterium was amplified secondarily.
실시예 3: 리팜핀 내성 여부를 진단할 수 있는 프로브를 이용한 나균의 리팜핀 내성 진단 Example 3 Rifampin Resistance Diagnosis of Bacteria Using a Probe That Can Diagnose Rifampin Resistance
나균의 rpoB 유전자 부위의 RRDR을 바탕으로 하여 각각의 와일드 타입과 돌연변이 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 설계하고 각 프로브의 5‘ 말단에 아민기를 결합하여 제작하였다(참조: 표 2Bacillus rpoB Based on the RRDR of the gene region, a probe that can specifically bind to each wild type and mutant sequence was designed and prepared by binding an amine group to the 5 'end of each probe (see Table 2).
상기 표는 나균의 리팜핀 내성 여부를 진단할 수 있는 프로브의 염기서열에 관한 것이다.The table relates to the nucleotide sequence of the probe capable of diagnosing the rifampin resistance of the bacterium.
이어, 전기 제작한 각각의 프로브를 이용한 리버스 블랏 하이브리다이제이션 (reverse blot hybridization) 방법을 수행하였다: 먼저, 리버스 블랏 하이브리다이제이션용 멤브레인(Biodyne C binding membrane, Pall Biosupport, MI, USA)을 16%(w/v) EDAC(1-ethyl-3-dimethyl-aminopropyl- cardiimide, Sigma Chem., Co., USA) 용액 10㎖에 침지하여 실온에서 10분 동안 방치하여 멤브레인 표면의 카르복실기(carboxyl group)를 활성화시킨 후, 증류수로 세척하고, 이를 블랏장치(MN45 minblotter, Immunetics, USA)에 장착시켰다. Subsequently, a reverse blot hybridization method was performed using each of the electroproduced probes. First, a 16% reverse blot hybridization membrane (Biodyne C binding membrane, Pall Biosupport, MI, USA) was used. (w / v) immersed in 10 ml of EDAC (1-ethyl-3-dimethyl-aminopropyl- cardiimide, Sigma Chem., Co., USA) solution and left at room temperature for 10 minutes to remove carboxyl groups on the membrane surface. After activation, it was washed with distilled water and mounted on a blot (MN45 minblotter, Immunetics, USA).
전기 5 말단에 아민기(amino group)를 포함하도록 제작한 각각의 프로브를 500mM NaHCO3(pH 8.4)에 최종부피가 150㎕이 되도록 희석하고, 이를 전기 블랏장치에 채운 다음, 상온에서 70분간 반응시켜서, 전기 프로브를 전기 멤브레인에 결합시켰다. 반응이 종결된 다음, 프로브를 포함하는 용액을 제거하고, 전기 블랏장치에서 멤브레인을 이탈시킨 후, 실온상태의 100㎖의 0.4N NaOH용액에 9분 동안 침지하여 프로브의 결합이 더 이상 진행되지 않도록 멤브레인 표면의 카프복실기 (carboxyl group)를 불활성화시킨다. 이를 100mM, 최종적으로는 0.1%(w/v) SDS가 포함된 2× SSPE로 60℃에서 5분간 세척하였다. 전기 세척된 멤브레인을 프로브가 결합된 방향과 수직이 되도록 블랏장치에 다시 장착하였다.Each probe prepared to include an amine group at the 5 terminals was diluted in 500 mM NaHCO 3 (pH 8.4) so that the final volume was 150 μl, filled in an electric blot, and then reacted at room temperature for 70 minutes. The electrical probe was coupled to the electrical membrane. After the reaction was completed, the solution containing the probe was removed, the membrane was removed from the electric blot, and then immersed in 100 ml of 0.4N NaOH solution at room temperature for 9 minutes to prevent the probe from further binding. Inactivates the carboxyl group on the membrane surface. It was washed for 5 min at 60 ° C. with 2 × SSPE containing 100 mM, finally 0.1% (w / v) SDS. The electrowashed membrane was remounted in the blot to be perpendicular to the direction in which the probe was coupled.
한편, 상기 실시예 2에서 증폭된 나균의 PCR 산물을 15㎕를 2× SPPE/ 0.1%(w/v) SDS 용액으로 희석하였으며, 전기 희석액을 100℃에서 5분간 가열하여 변성시키고, 이를 냉각시킨 다음, 전기 블랏장치에 가하였다. 그런 다음, 50℃에서 70분간 하이브리다이제이션 반응을 수행하였다. 전기 희석액을 제거한 다음, 멤브레인을 분리하여, 2× SPPE/ 0.5%(w/v) SDS 용액으로 62℃에서 15분간 2회 세척하였다. 전기 세척된 멤브레인에 2× SPPE/ 0.5%(w/v) SDS 용액에 1:2000(v/v)으로 희석한 알칼라인포스파타아제(스트렙타비딘 표지)(alkaline phosphatase- labeled streptavidin, Boehringer Mannheim, Germany)을 처리하여 42℃에서 40분간 반응시키고, 이를 2× SPPE/ 0.5%(w/v) SDS 용액으로 42℃에서 10분간 2회 세척한 다음, 알칼라인포스파타아제에 반응하는 기질 용액(1 또는 2)을 넣어주어 발광반응 또는 발색반응을 유도함으로써 표지된 바이오틴을 검출하였다.Meanwhile, 15 μl of the PCR product of the amplified bacterium in Example 2 was diluted with 2 × SPPE / 0.1% (w / v) SDS solution, and the electric dilution was denatured by heating at 100 ° C. for 5 minutes, and the resultant was cooled. Next, an electric blot was added. Then, hybridization reaction was performed at 50 ° C. for 70 minutes. After the electrical dilution was removed, the membrane was separated and washed twice with 2 × SPPE / 0.5% (w / v) SDS solution at 62 ° C. for 15 minutes. Alkaline phosphatase-labeled streptavidin, Boehringer Mannheim, diluted 1: 2000 (v / v) in 2 × SPPE / 0.5% (w / v) SDS solution on electro washed membranes Germany) and reacted for 40 minutes at 42 ℃, which was washed twice with 2 × SPPE / 0.5% (w / v) SDS solution at 42 ℃ for 10 minutes, and then reacted with alkaline phosphatase substrate solution (1 Or 2) was added to detect the labeled biotin by inducing luminescence or color reaction.
발광반응을 위하여는 알칼라인포스파타아제에 반응하는 기질 용액 1(Gene Images CDP-starTM detection kit, Amersham Bioscience, UK)을 넣어 발광시킨 후 감광필름에 감응시켜 표지된 바이오틴을 검출하였다(참조: 도 2). 발색반응을 위하여는 알칼라인포스파타아제에 반응하는 기질 용액 2(NBT/BCIP, Roche, Germany)을 넣어 발색으로 표지된 바이오틴을 검출하였다(참조: 도 3). 도 2와 3은 리버스 블랏 하이브리다이제이션 방법을 이용한 나균의 리팜핀내성 진단 결과를 나타내는 사진이다.For the luminescence reaction, the substrate solution 1 (Gene Images CDP-starTM detection kit, Amersham Bioscience, UK) reacting with alkaline phosphate was luminescent and then sensitized to a photosensitive film to detect labeled biotin (see FIG. 2). ). For the color reaction, substrate solution 2 (NBT / BCIP, Roche, Germany) reacting with alkaline phosphatase was added to detect the biotin labeled with color development (see FIG. 3). 2 and 3 are photographs showing the results of the diagnosis of rifampin resistance of the bacterium using reverse blot hybridization method.
도 1은 DNA를 사용하여 PCR을 한 그림, M.100 bp DNA ladder (M&D, Wonju, Korea), 레인 1에서 4는 검체 PCR 산물, 레인 5는 레퍼런스 균주 M. leprae (strain 4264) DNA를 사용한 positive control 산물, N, 음성 대조군을 나타냄;Figure 1 shows the PCR using DNA, M.100 bp DNA ladder (M & D, Wonju, Korea),
도 2는 나균의 리팜핀 내성진단 키트의 발광반응을 보여주는 사진이고, Figure 2 is a photograph showing the luminescence reaction of rifampin resistance diagnostic kit of Na,
도 3은 나균의 리팜핀 내성진단 키트의 발색반응을 보여주는 사진이며, Figure 3 is a photograph showing the color reaction of the rifampin resistance diagnostic kit of Na,
도 4는 임상시료를 대상으로 한 나균의 리팜핀 내성진단 키트의 발광반응을 나타내는 사진이다.Figure 4 is a photograph showing the luminescence reaction of the rifampin resistance diagnostic kit of leukemia in clinical samples.
<110> Molecules and Diagnostics Inc. <120> Probe for Detection of Rifampin Resistance of Mycobacterium leprae and the kit <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1220-F <400> 1 aggacgtcga ggcgatca 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1464-R <400> 2 tagtgcgaag ggtgcacgtc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1240-F <400> 3 ccgcagacgc tgatcaata 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1424-R <400> 4 acgtcacgga cctctagcc 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT1 <400> 5 gaattcttcg gcaccagc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT2 <400> 6 aaccagctgt cgcagttc 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT3 <400> 7 atggatcaga acaaccct 18 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT4 <400> 8 ctctgtcggg cctgacc 17 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT5 <400> 9 ctgacccaca agcgccgg 18 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT6 <400> 10 ctgtcggcgc tgggcc 16 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB MT1 <400> 11 aaggaattct tcagcaccag 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB MT2 <400> 12 cagccagctg tcggtgttc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB MT3 <400> 13 gtcgcagttc atgtatcaga 20 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB MT4 <400> 14 ccggctgatg gcgctg 16 <210> 15 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB MT5 <400> 15 ccggctgttc gcgc 14 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB lepare <400> 16 tccggtggtc gccgct 16 <110> Molecules and Diagnostics Inc. <120> Probe for Detection of Rifampin Resistance of Mycobacterium leprae and the kit <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1220-F <400> 1 aggacgtcga ggcgatca 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1464-R <400> 2 tagtgcgaag ggtgcacgtc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1240-F <400> 3 ccgcagacgc tgatcaata 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1424-R <400> 4 acgtcacgga cctctagcc 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT1 <400> 5 gaattcttcg gcaccagc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT2 <400> 6 aaccagctgt cgcagttc 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ML-rpoB WT3 <400> 7 atggatcaga acaaccct 18 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT4 <400> 8 ctctgtcggg cctgacc 17 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT5 <400> 9 ctgacccaca agcgccgg 18 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB WT6 <400> 10 ctgtcggcgc tgggcc 16 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ML-rpoB MT1 <400> 11 aaggaattct tcagcaccag 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ML-rpoB MT2 <400> 12 cagccagctg tcggtgttc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ML-rpoB MT3 <400> 13 gtcgcagttc atgtatcaga 20 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ML-rpoB MT4 <400> 14 ccggctgatg gcgctg 16 <210> 15 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ML-rpoB MT5 <400> 15 ccggctgttc gcgc 14 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ML-rpoB lepare <400> 16 tccggtggtc gccgct 16
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| KR20030041415A (en) * | 2001-11-20 | 2003-05-27 | 주식회사 바이오메드랩 | Diagnosis kit for mycobacterium species identification and drug-resistance detection and manufacturing method thereof |
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Patent Citations (2)
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