KR20230095302A - Multiplex real-time polymerase chain reaction assay for differential identification of avian Chlamydia - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조류 클라미디아균 감별 동정용 실시간 유전자 진단법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 클라미디아속균, 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 또는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 프라이머 및 프로브 세트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 클라미디아속균, 클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 또는 클라미디아 갈리나시아 검출용 프라이머 및 프로브 세트는 각 대상을 민감하고 특이적으로 검출할 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 또한 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 함께 사용하여 분석할 경우 보다 정확하게 클라미디아속균을 감별 및 동정할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 조류 클라미디아균 감별/동정 분야 및 관련 질병의 진단 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.The present invention relates to a real-time genetic diagnosis method for differential identification of avian Chlamydia bacteria, and more particularly, Chlamydia genus bacteria, Chlamydia psittaci , Chlamydia avium ( Chlamydia avium ) or Chlamydia Galinasia ( Chlamydia gallinacea ) Primers for detection and It's about the probe set. It was experimentally confirmed that the primer and probe set for detecting Chlamydia genus bacteria, Chlamydia cytasi, Chlamydia avium, or Chlamydia galinacia according to the present invention can sensitively and specifically detect each target. In addition, it was confirmed that the bacteria of the genus Chlamydia can be discriminated and identified more accurately when analyzed using the primer and probe set of the present invention together. Therefore, the primer and probe set of the present invention can be usefully used in the field of discrimination/identification of avian Chlamydia bacteria and the field of diagnosis of related diseases.
Description
본 발명은 조류 클라미디아균 감별 동정용 실시간 유전자 진단법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 클라미디아속균, 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 또는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 프라이머 및 프로브 세트에 관한 것이다. The present invention relates to a real-time genetic diagnosis method for differential identification of avian Chlamydia bacteria, and more particularly, Chlamydia genus bacteria, Chlamydia psittaci , Chlamydia avium ( Chlamydia avium ) or Chlamydia Galinasia ( Chlamydia gallinacea ) Primers for detection and It's about the probe set.
조류 클라미디아증(Avian Chlamydiosis)은 애완조류, 야생조류, 가금 등 다양한 조류에서 클라미디아균의 감염으로 발생하는 급성 또는 만성의 전염성 질병이다. 현재 클라미디아균 속(genus)에는 11개의 균종(species)이 알려져 있으며, C. psittaci, C. avium 및 C. gallinacea가 조류에서 흔히 분리된다. 조류 클라미디증의 주 원인균은 C. psittaci이다. C. psittaci 감염은 원래 앵무새 및 앵무새와 접촉한 사람에서 발생하여 앵무병(psittacosis) 또는 앵무새열(parrot fever)로 불렸다. 이 질병은 조류 뿐만 아니라 다양한 포유동물에서도 발생한다. 조류에서 이 질병은 조류의 나이와 종, 균의 병원성 등에 따라 증상의 정도가 다양하게 나타날 수 있으나, 앵무새나 가금농장에서 전신성으로 발생하면 큰 경제적 손실을 일으킨다.Avian chlamydiosis (Avian Chlamydiosis) is an acute or chronic infectious disease caused by infection with Chlamydia bacteria in various birds such as pet birds, wild birds, and poultry. Currently, 11 species of the Chlamydia genus are known, and C. psittaci , C. avium and C. gallinacea are commonly isolated from algae. The main causative agent of avian chlamydia is C. psittaci . C. psittaci infection was originally called psittacosis or parrot fever because it occurred in parrots and in people who came into contact with parrots. This disease occurs not only in birds but also in various mammals. In birds, this disease may have varying degrees of symptoms depending on the age and species of the bird, the pathogenicity of the fungus, etc., but it causes great economic loss when it occurs systemically in parrots or poultry farms.
C. avium과 C. gallinacea는 상대적으로 최근에 밝혀진 균종이며, C. avium은 주로 비둘기와 앵무새에서 호흡기 증상을 일으킬 수 있는 것으로 알려져있고, C. gallinacea는 주로 가금에서 증체량 감소을 일으키고 사람에도 감염되는 것으로 알려져 있다. 따라서 이 2개의 균종 역시 조류 클라미디아증의 원인균으로 간주된다. 따라서, 조류 클라미디아증 진단에는 이러한 균종을 특이적으로 동정하는 과정이 요구된다. C. avium and C. gallinacea are relatively recently discovered strains. C. avium is known to cause respiratory symptoms mainly in pigeons and parrots, and C. gallinacea mainly causes weight loss in poultry and infects humans. It is known. Therefore, these two strains are also considered to be the causative agents of avian chlamydiasis. Therefore, a process for specifically identifying these strains is required for diagnosing avian chlamydiasis.
조류 클라미디아균은 조직시료, 인두스왑, 총배설강스왑, 분변 등의 생물학적 시료를 세포배양하거나 발육란에 접종하여 분리할 수 있다. 그러나, 이러한 균분리는 시간이 많이 소요되고 사람 감염의 위험성이 있기 때문에 현재 선호하는 검사방법이 아니다. 따라서 클라미디아 감염을 확인하기 위한 방법으로 균배양 없이 시료로부터 바로 균을 검출하는 유전자 진단법(PCR, real-time PCR, DNA microarray 등)이 권장되고 있다. 현재는 전 세계적으로 조류 클라미디아증 진단에 일반적으로 C. psittaci, C. avium 및 C. gallinacea를 특이적으로 검출할 수 있는 실시간 유전자 진단법(real-time PCR)이 적용되고 있다. 그런데, 현재까지 알려진 검사법은 모두 각 균종을 특이적으로 검사하는 개별 유전자 진단법으로, 정확한 균 동정을 위해 여러번의 PCR 반응을 필요로 할 수 있다. Chlamydia avian can be isolated by cell culture of biological samples such as tissue samples, pharyngeal swabs, total excretory swabs, and feces, or by inoculation into embryonated eggs. However, such bacterial isolation is not currently the preferred test method because it takes a lot of time and there is a risk of human infection. Therefore, as a method for confirming chlamydia infection, genetic diagnosis methods (PCR, real-time PCR, DNA microarray, etc.) that detect bacteria directly from samples without bacterial culture are recommended. Currently, real-time PCR, which can specifically detect C. psittaci , C. avium , and C. gallinacea , is generally applied to the diagnosis of avian chlamydiasis worldwide. However, all of the test methods known to date are individual genetic diagnosis methods that specifically test each strain, and may require multiple PCR reactions to accurately identify bacteria.
이에 본 발명자들은 클라미디아속균, 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 또는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 개발하고, 이를 이용하여 특이적이고 민감하게 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors developed primers and probe sets for detecting Chlamydia genus bacteria, Chlamydia psittaci , Chlamydia avium , or Chlamydia gallinacea , which can be specifically and sensitively detected. By confirming that there was, the present invention was completed.
따라서 본 발명의 목적은, 클라미디아속균, 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 또는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a primer set for detecting Chlamydia genus bacteria, Chlamydia psittaci , Chlamydia avium or Chlamydia gallinacea .
본 발명의 다른 목적은, 클라미디아속균, 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 또는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 프로브를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a probe for detecting Chlamydia genus, Chlamydia psittaci , Chlamydia avium or Chlamydia gallinacea .
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 프라이머 세트를 포함하는 클라미디아속균, 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 또는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for detecting Chlamydia genus bacteria, Chlamydia psittaci, Chlamydia avium or Chlamydia gallinacea including the primer set.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 클라미디아속균, 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 또는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting Chlamydia genus bacteria, Chlamydia psittaci , Chlamydia avium or Chlamydia gallinacea including the composition.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 시료의 지노믹(genomic) DNA를 상기 프라이머 세트로 증폭시키는 단계;를 포함하는 클라미디아속균, 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 또는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is, (a) amplifying the genomic DNA of the sample with the primer set; Chlamydia genus bacteria containing, Chlamydia psittaci ( Chlamydia psittaci ), Chlamydia avium ( Chlamydia avium ) or To provide a method for detecting Chlamydia gallinacea .
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트 제공하는 것이다.In order to achieve the above object, the present invention is a forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; And a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; to provide a primer set for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia comprising a.
또한 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention is a forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; And a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; Provides a primer set for detecting Chlamydia psittaci comprising a.
또한 본 발명은 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention is a forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; And a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; Provides a primer set for detecting Chlamydia avium including a.
또한 본 발명은 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention is a forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7; And a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8; Provides a primer set for detecting Chlamydia gallinacea comprising a.
또한 본 발명은 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 클라미디아속균 검출용 프로브를 제공한다.In addition, the present invention provides a probe for detecting Chlamydia genus bacteria represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
또한 본 발명은 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 클라미디아 시타시 검출용 프로브를 제공한다.In addition, the present invention provides a probe for detecting Chlamydia in situ represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
또한 본 발명은 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 클라미디아 아비움 검출용 프로브를 제공한다.In addition, the present invention provides a probe for detecting Chlamydia avium represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11.
또한 본 발명은 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 클라미디아 갈리나시아 검출용 프로브를 제공한다.In addition, the present invention provides a probe for detecting Chlamydia galinacia represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 클라미디아속균 검출용 조성물; 및 이를 포함하는 클라미디아속균 검출 키트;를 제공한다.In addition, the present invention is a composition for detecting Chlamydia genus bacteria comprising the primer set; and a Chlamydia genus bacteria detection kit comprising the same.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 및 클라미디아 갈리나시아로이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 클라미디아속균 검출용 조성물; 및 이를 포함하는 클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 및 클라미디아 갈리나시아로이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 클라미디아속균 검출 키트;를 제공한다.In addition, the present invention is a composition for detecting at least one Chlamydia genus bacteria selected from the group consisting of Chlamydia cytasi, Chlamydia avium and Chlamydia galinacia including at least one selected from the group consisting of the primer set; and at least one Chlamydia genus bacteria detection kit selected from the group consisting of Chlamydia cytasi, Chlamydia avium and Chlamydia gallinacia including the same.
또한 본 발명은 (a) 시료의 지노믹(genomic) DNA를 상기 프라이머 세트로 증폭시키는 단계;를 포함하는 클라미디아속균 검출방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia comprising (a) amplifying genomic DNA of a sample with the primer set.
또한 본 발명은 (a) 시료의 지노믹(genomic) DNA를 제1항의 프라이머 세트로 증폭시키는 단계;를 포함하는 클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 및 클라미디아 갈리나시아로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 클라미디아속균 검출방법을 제공한다.In addition, the present invention provides (a) amplifying the genomic DNA of the sample with the primer set of
본 발명에 따른 클라미디아속균, 클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 또는 클라미디아 갈리나시아 검출용 프라이머 및 프로브 세트는 각 대상을 민감하고 특이적으로 검출할 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 또한 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 함께 사용하여 분석할 경우 보다 정확하게 클라미디아속균을 감별 및 동정할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 조류 클라미디아균 감별/동정 분야 및 관련 질병의 진단 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.It was experimentally confirmed that the primer and probe set for detecting Chlamydia genus bacteria, Chlamydia cytasi, Chlamydia avium, or Chlamydia galinacia according to the present invention can sensitively and specifically detect each target. In addition, it was confirmed that the bacteria of the genus Chlamydia can be discriminated and identified more accurately when analyzed using the primer and probe set of the present invention together. Therefore, the primer and probe set of the present invention can be usefully used in the field of discrimination/identification of avian Chlamydia bacteria and the field of diagnosis of related diseases.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 multiplex PCR 및 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 multiplex real-time PCR 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브의 감별 효율성 및 검출한계를 조사하기 위해 작성한 표준 곡선을 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the results of multiplex PCR and electrophoresis using a primer set according to the present invention.
2 is a diagram showing multiplex real-time PCR results using a primer set and a probe according to the present invention.
Figure 3 is a diagram showing a standard curve prepared to investigate the discrimination efficiency and detection limit of the primer set and probe according to the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[클라미디아속균 검출용 프라이머 및 프로브 세트][Primer and probe set for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia]
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트를 제공한다.According to an aspect of the present invention, the forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; And a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; provides a primer set for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia comprising a.
본 발명에 있어서, 검출은 분석 분야에서 시료 속에 화학종이나 미생물 따위의 존재 유무를 알아내는 것으로, 본 발명에서는 미생물의 존재 유무를 알아내는 것을 의미한다.In the present invention, detection means finding out the presence or absence of chemical species or microorganisms in a sample in the field of analysis, and in the present invention, it means finding out the presence or absence of microorganisms.
본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.In the present invention, the primer is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary nucleic acid template and copy the strand of the nucleic acid template. A short nucleic acid sequence that serves as a starting point for A primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase) and four different nucleoside triphosphates in an appropriate buffer and temperature.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.When designing the primers, various restrictions are followed, such as the A, G, C, and T content ratio of the primers, prevention of primer dimer formation, and prohibition of repeating the same base sequence three or more times. (template) Conditions such as the amount of DNA, concentration of primer, concentration of dNTP, concentration of Mg 2+ , reaction temperature, and reaction time should be appropriate.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.The above primers can incorporate additional features that do not change the basic properties. That is, nucleic acid sequences can be modified using a number of means known in the art. Examples of such modifications are methylation, capping, substitution of nucleotides with one or more homologues, and uncharged linkages such as phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates or carbamates, or phosphorothioates or phosphorodithioates. Transformation of nucleotides into charged linkages such as Nucleic acids may also contain one or more nucleic acids, such as nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, proteins such as poly-L-lysine, intercalating agents such as acridine or psoralen, chelating agents and alkylating agents such as metals, radioactive metals, and iron oxidizing metals. It may have additional covalently linked moieties.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.In addition, the primer sequence of the present invention can be modified using a label that can directly or indirectly provide a detectable signal. The primer may include a label that can be detected using spectroscopy, photochemistry, biochemistry, immunochemistry, or chemical means. Useful labels include 32 P, fluorescent dyes, electron dense reagents, enzymes (commonly used in ELISA), biotin or haptens, and proteins for which antiserum or monoclonal antibodies are available.
본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.The primers of the present invention are suitable for cloning of appropriate sequences, digestion with restriction enzymes, and phosphotriester methods such as Narang (1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), diethylphosphoramidase such as Beaucage. (1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), and any other well-known method including direct chemical synthesis, such as the solid support method of US Pat. No. 4,458,066.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 클라미디아속균 검출용 프로브를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a probe for detecting Chlamydia genus bacteria represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
본 발명에 있어서, 프로브(probe)는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.In the present invention, the probe (probe) refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases to several hundred bases as short as possible to form a specific binding with a gene or mRNA, oligonucleotide probe , It can be produced in the form of a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, etc., and can be labeled for easier detection.
프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 상기 프로브는 주형이 되는 폴리뉴클레오티드 서열에 완전하게 상보적인 서열일 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열일 수도 있다.Oligonucleotides used as probes may also contain nucleotide analogs, such as phosphorothioates, alkylphosphorothioates or peptide nucleic acids, or intercalating agents ) may be included. The probe may be a sequence completely complementary to a polynucleotide sequence serving as a template, but may also be a sequence substantially complementary within a range that does not interfere with specific hybridization.
프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 본 출원의 고위험 병원체 또는 독소를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 또는 카바메이트와 같이하전되지 않은 연결체로의 변형을 포함할 수 있다. 또는 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트와 같은 하전된 연결체로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신과 같은 단백질; 아크리딘, 프로랄렌과 같은 삽입제; 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속과 같은 킬레이트화제; 및 알킬화제를 함유할 수 있다.Probes can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such probes can be modified using a number of means known in the art, as long as they are effective in detecting the high-risk pathogen or toxin of the present application. Examples of such modifications include methylation, capping, substitution of one or more homologs of the native nucleotide, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, or carbamates. Can include transformation into a sieve. or with a charged linkage such as phosphorothioate or phosphorodithioate. Nucleic acids include one or more additional covalently linked moieties, eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, proteins such as poly-L-lysine; intercalating agents such as acridine and proralene; chelating agents such as metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals; and an alkylating agent.
본 발명의 프로브는, 5’ 말단과 3’ 말단에 각각 형광물질과 소광제를 포함하고, 복수의 프로브를 포함할 때 각각의 프로브의 5' 말단에 포함된 형광물질이 모두 동일할 수 있다.The probe of the present invention includes a fluorescent material and a quencher at the 5' end and the 3' end, respectively, and when a plurality of probes are included, the fluorescent material included at the 5' end of each probe may be the same.
본 발명의 구체예에서, 상기 프로브는 5’ 말단에 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 형광물질을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.In an embodiment of the present invention, the probe is 6-FAM (6-carboxyfluorescein), 5-FAM (5-carboxyfluorescein), hexachloro-6-carboxyfluorescein (Hexachloro-6-carboxyfluorescein), tetra Chloro-6-carboxyfluorescein (Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX (2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein chlorotriazinyl ( Fluorescein chlorotriazinyl), Rhodamine green, Rhodamine red, Tetramethylrhodamine, FITC (Fluorescein isothiocyanate), Oregon green, Alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA (6-Carboxyl-X-Rhodamine) Contains one or more fluorescent substances selected from the group consisting of carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), Texas red, Cy3 (Cyanine-3) and Cy5 (Cyanine-5) It is preferable to do, but is not limited thereto.
본 발명의 구체예에서, 상기 프로브는 3’ 말단에 BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ(Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소광제를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.In an embodiment of the present invention, the probe has BHQ1 (Black hole quencher 1), BHQ2 (Black hole quencher 2), BHQ3 (Black hole quencher 3), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ (Nonfluorescent) at the 3' end. quencher), dabcyl, Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), Blackberry Quencher (Blackberry Quencher) and Iowa Black (Iowa black) It is preferable to include one or more types of matting agents selected from the group consisting of, Not limited.
본 발명에 따른 클라미디아속균 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용할 경우, 클라미디아속에 속하는 미생물을 특이적이고 민감하게 검출할 수 있는바, 조류 클라미디아속균 검출 및 동정 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.When using the primer and probe set for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia according to the present invention, microorganisms belonging to the genus Chlamydia can be specifically and sensitively detected, and thus can be usefully utilized in the field of detecting and identifying avian bacteria belonging to the genus Chlamydia.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 클라미디아속균 검출용 조성물; 및 상기 조성물을 포함하는 클라미디아속균 검출용 검출 키트;를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention is a composition for detecting Chlamydia genus bacteria comprising the primer set; And a detection kit for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia comprising the composition.
본 발명의 클라미디아속균 검출용 조성물 및 검출 키트는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소 연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소 연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역중합효소 연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR) 및 실시간 중합효소 연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQPCR)으로 이루어진 군에서 선택된 실험을 위한 용도일 수 있고, 바람직하게는 실시간 중합효소 연쇄반응용이나, 이에 제한되지 않는다.The composition and detection kit for detecting Chlamydia genus bacteria of the present invention are polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR), Gap-LCR, repair chain reaction (repair chain reaction), transcription - Transcription-mediated amplification (TMA), self sustained sequence replication, selective amplification of target polynucleotide sequences, consensus sequence priming polymerase chain reaction sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR), arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR), nucleic acid sequence based amplification (NASBA), strand displacement amplification amplification), loopmediated isothermal amplification (LAMP), multiplex polymerase chain reaction (multiplex PCR), nested polymerase chain reaction (nested-PCR), single tube single tube nested polymerase chain reaction (single tube nested-PCR), reverse transferase polymerase chain reaction (RT-PCR), inverse polymerase chain reaction; It may be used for an experiment selected from the group consisting of inverse PCR), real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and real-time quantitative polymerase chain reaction (RQPCR), , preferably for real-time polymerase chain reaction, but is not limited thereto.
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 프라이머 및 프로브 세트 외에, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 반응 완충액은 Taq 중합효소 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하고 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있다. PCR 완충액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 성분들의 안정성, 활성, 및/또는 지속성(longevity)을 변화시키는, 증폭 반응에 첨가되는 화합물이다. 완충제(buffering agent)는 PCR 증폭 및 부위-특이적 RNase H 절단 활성(site-specific RNase H cleavage activity)과 양립가능하다. 일부 완충제들이 해당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 트리스, 트리신, MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), 및 HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, PCR 완충액은 일반적으로 KCl, MgCl2, 및 각각의 뉴클레오티드 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 본 출원의 완충액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화하기 위한 첨가물질들을 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.Reagents for performing the amplification reaction may include, but are not limited to, a thermostable polymerase and a reaction buffer in addition to primers and probe sets. The reaction buffer includes both a Taq polymerase buffer and a PCR buffer, and EF Taq polymerase or the like can be used as a heat-resistant polymerase. A PCR buffer is a compound added to an amplification reaction that alters the stability, activity, and/or longevity of one or more components of the amplification reaction by adjusting the pH of the amplification reaction. The buffering agent is compatible with PCR amplification and site-specific RNase H cleavage activity. Some buffers are well known in the art and include Tris, Tricine, MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), and HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid). ), but is not limited thereto. In addition, the PCR buffer may generally contain KCl, MgCl2, and the respective nucleotides dATP, dCTP, dGTP and dTTP. The buffer of the present application may contain additives to optimize an efficient reverse transcriptase-PCR or PCR reaction. The kit may be manufactured in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 시료의 지노믹(genomic) DNA를 상기 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트로 증폭시키는 단계;를 포함하는 클라미디아속균 검출방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia comprising (a) amplifying genomic DNA of a sample with the primer set for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia.
본 발명의 구체예에서, 상기 시료는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the sample may be obtained from a clinical sample or an environmental sample. For example, the clinical sample may be a sample obtained from tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)는 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트와 함께 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프로브를 더 첨가할 수 있다.In an embodiment of the present invention, in the step (a), a probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 may be further added together with a primer set for detecting Chlamydia genus bacteria.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)의 증폭은 당업계에서 통상적으로 사용되는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소 연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소 연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역중합효소 연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 또는 실시간 중합효소 연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQPCR) 등의 방법을 이용하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In an embodiment of the present invention, the amplification of step (a) is performed by polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR), Gap-LCR, repair chain reaction, transcription-mediated amplification (TMA), self sustained sequence replication, selective amplification of target polynucleotide sequences , consensus sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR), arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR), nucleic acid sequence based amplification ; NASBA), strand displacement amplification, loopmediated isothermal amplification (LAMP), multiplex polymerase chain reaction (multiplex PCR), nested polymerase chain reaction chain reaction; nested-PCR), single tube nested Polymerase chain reaction (single tube nested-PCR), reverse transperase polymerase chain reaction (RT-PCR), reverse polymerization inverse polymerase chain reaction; inverse PCR), real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), or real-time quantitative polymerase chain reaction (Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQPCR). Preferably, it may be a polymerase chain reaction or a real-time polymerase chain reaction, but is not limited thereto.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 단계 (a)의 증폭은 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄반응일 수 있고, 상기 중합효소 연쇄반응은 91-97℃, 1-3분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 91-97℃에서 15-40초, 51-59℃에서 15-45초, 68-76℃에서 30초-1분 30초를 한 세트로 40 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하며, 68-76℃, 3-7분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것이 바람직하며,In a preferred embodiment of the present invention, the amplification of step (a) may be a polymerase chain reaction using a primer set for detecting genus Chlamydia, and the polymerase chain reaction is performed at 91-97 ° C. for 1-3 minutes. The reaction was carried out under the conditions of one cycle, sequentially at 91-97 ° C for 15-40 seconds, at 51-59 ° C for 15-45 seconds, and at 68-76 ° C for 30 seconds-1
더 바람직하게는 94℃, 2분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분를 한 세트로 40 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하며, 72℃, 5분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것일 수 있다.More preferably, the reaction is carried out under the condition of 1 cycle at 94 ° C. for 2 minutes as one set, and sequentially 40 cycles at 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute as one set. The reaction may be performed under conditions of a cycle, and the reaction may be performed under conditions of one cycle at 72° C. for 5 minutes as one set.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 단계 (a)의 증폭은 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응일 수 있고, 상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 91-97℃, 1-5분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 91-97℃에서 10-30초, 55-65℃에서 30초-1분 30초를 한 세트로 45 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것이 바람직하며,In a preferred embodiment of the present invention, the amplification of step (a) may be a real-time polymerase chain reaction using a primer set and a probe for detecting Chlamydia genus bacteria, and the real-time polymerase chain reaction is 91-97 ° C, 1-5 The reaction was carried out under the condition of one cycle with one set of minutes, and sequentially 45 cycles of 10-30 seconds at 91-97 ° C and 30 seconds-1
더 바람직하게는 95℃, 3분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 95℃에서 15초, 60℃에서 1분를 한 세트로 45 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것일 수 있다.More preferably, the reaction is carried out under the conditions of 1 cycle at 95 ° C. for 3 minutes as a set, and sequentially at 95 ° C. for 15 seconds and at 60 ° C. for 1 minute as a set for 45 cycles. It may be that the reaction proceeds.
[클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 및 클라미디아 갈리나시아로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 클라미디아속균 검출용 프라이머 및 프로브 세트][Primer and probe set for detecting at least one Chlamydia genus bacteria selected from the group consisting of Chlamydia trysi, Chlamydia avium, and Chlamydia galinacia]
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.According to an aspect of the present invention, the forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; And a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; Provides a primer set for detecting Chlamydia psittaci comprising a.
또한 본 발명은 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention is a forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; And a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; Provides a primer set for detecting Chlamydia avium including a.
또한 본 발명은 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention is a forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7; And a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8; Provides a primer set for detecting Chlamydia gallinacea comprising a.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci) 검출용 프로브; 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 검출용 프로브; 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 프로브;를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a probe for detecting Chlamydia psittaci represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; A probe for detecting Chlamydia avium represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11; And a probe for detecting Chlamydia gallinacea represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
본 발명의 프로브는, 5’ 말단과 3’ 말단에 각각 형광물질과 소광제를 포함하고, 복수의 프로브를 포함할 때 각각의 프로브의 5' 말단에 포함된 형광물질이 모두 동일할 수 있다.The probe of the present invention includes a fluorescent material and a quencher at the 5' end and the 3' end, respectively, and when a plurality of probes are included, the fluorescent material included at the 5' end of each probe may be the same.
본 발명의 구체예에서, 상기 프로브는 5’ 말단에 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 형광물질을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.In an embodiment of the present invention, the probe is 6-FAM (6-carboxyfluorescein), 5-FAM (5-carboxyfluorescein), hexachloro-6-carboxyfluorescein (Hexachloro-6-carboxyfluorescein), tetra Chloro-6-carboxyfluorescein (Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX (2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein chlorotriazinyl ( Fluorescein chlorotriazinyl), Rhodamine green, Rhodamine red, Tetramethylrhodamine, FITC (Fluorescein isothiocyanate), Oregon green, Alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA (6-Carboxyl-X-Rhodamine) Contains one or more fluorescent substances selected from the group consisting of carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), Texas red, Cy3 (Cyanine-3) and Cy5 (Cyanine-5) It is preferable to do, but is not limited thereto.
본 발명의 구체예에서, 상기 프로브는 3’ 말단에 BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ(Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소광제를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.In an embodiment of the present invention, the probe has BHQ1 (Black hole quencher 1), BHQ2 (Black hole quencher 2), BHQ3 (Black hole quencher 3), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ (Nonfluorescent) at the 3' end. quencher), dabcyl, Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), Blackberry Quencher (Blackberry Quencher) and Iowa Black (Iowa black) It is preferable to include one or more types of matting agents selected from the group consisting of, Not limited.
복수의 병원체나 동시 검출용 조성물의 경우 각각의 프로브는 모두 5' 말단에 FAM을 포함할 수 있다. 복수의 반응 챔버 또는 반응 채널마다 상이한 병원체가 동시에 반응이 이루어지는 방식을 사용하는 경우 복수의 병원체에 모두 동일한 리포터 형광표지를 사용하여도 검출이 용이한 장점이 있다.In the case of a plurality of pathogens or a composition for simultaneous detection, each probe may include FAM at its 5' end. When using a method in which different pathogens are simultaneously reacted in a plurality of reaction chambers or reaction channels, there is an advantage in that detection is easy even when the same reporter fluorescent label is used for all of the plurality of pathogens.
본 발명에 따른 각각의 프라이머 및 프로브 세트는 1종 이상을 동시에 사용할 수 있는바, 1종 이상의 클라미디아속균을 동시에 검출할 수 있다.Each of the primers and probe sets according to the present invention may be used in one or more types at the same time, and therefore, one or more types of bacteria of the genus Chlamydia can be simultaneously detected.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 프라이머 세트로 이루어진 군애서 선택된 1종 이상을 포함하는 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 및 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 클라미디아속균 검출용 조성물; 및 상기 조성물을 포함하는 클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 및 클라미디아 갈리나시아로 이루어진 군에서 선탁? 1종 이상의 클라미디아속균 검출 키트;를 제공한다.According to another aspect of the present invention, in the group consisting of Chlamydia psittaci , Chlamydia avium and Chlamydia gallinacea containing at least one selected from the group consisting of the primer set At least one selected composition for detecting Chlamydia genus bacteria; And selected from the group consisting of chlamydia cytasi, chlamydia avium and chlamydia galinacia comprising the composition? At least one Chlamydia genus bacteria detection kit; is provided.
본 발명의 조성물은 클라미디아 시타시 검출용 프라이머 세트, 클라미디아 아비움 검출용 프라이머 세트 및 클라미디아 갈리나시아 프라이머 세트를 일부 또는 모두 포함할 수 있으며, 프라이머 세트의 조합에 따라 대상 균주를 동시에 검출할 수 있다는 장점이 있다.The composition of the present invention may include some or all of a primer set for detecting chlamydia in situ, a primer set for detecting chlamydia avium, and a primer set for chlamydia galinacia, and the target strain can be simultaneously detected according to the combination of the primer sets. there is
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 서열번호 10 내지 12의 염기서열로 표시되는 프로브로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the composition may further include at least one selected from the group consisting of probes represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 10 to 12.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다. In an embodiment of the present invention, the composition comprises a forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; And a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; may further include a primer set for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프로브를 더 포함할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the composition may further include a probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
상기 조성물이 클라미디아속균 프라이머 및 프로브 세트(서열번호 1, 2, 9)를 더 포함할 경우 각 균주에 대한 검출과 함께 클라미디아속균임을 추가적으로 확인할 수 있는바, 조류 클라미디아균 검출 정확도를 현저히 향상시킬 수 있다.When the composition further includes Chlamydia genus primer and probe sets (SEQ ID NOs: 1, 2, 9), it is possible to additionally confirm that the Chlamydia genus bacteria are detected along with the detection of each strain, and thus the avian Chlamydia bacteria detection accuracy can be significantly improved. .
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 시료의 지노믹(genomic) DNA를 프라이머 세트로 증폭시키는 단계;를 포함하는 클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 및 클라미디아 갈리나시아로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 클라미디아속균 검출방법을 제공한다. 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 클라미디아 시타시 검출용 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 클라미디아 아비움 검출용 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 클라미디아 갈리나시아 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides (a) amplifying the genomic DNA of the sample with a primer set; selected from the group consisting of Chlamydia cytasi, Chlamydia avium and Chlamydia galinacia, including One or more methods for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia are provided. The primer sets include a primer set for detecting chlamydia infection represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, a primer set for detecting Chlamydia avium represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6, and a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 7 and 8 It may be one or more selected from the group consisting of a primer set for detecting Chlamydia Galinacia represented by .
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)는 프라이머 세트와 함께 서열번호 10 내지 12의 염기서열로 표시되는 프로브로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 더 첨가할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the step (a) may further add one or more probes selected from the group consisting of probes represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 10 to 12 together with a primer set.
본 발명의 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 검출 정확도를 높이기 위하여, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트를 더 포함할 수 있고, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프로브를 더 포함할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the primer set may further include a primer set for detecting Chlamydia genus bacteria represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 in order to increase detection accuracy, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 It may further include probes.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 단계 (a)의 증폭은 클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 및 클라미디아 갈리나시아로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄반응일 수 있고, 상기 중합효소 연쇄반응은 91-97℃, 1-3분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 91-97℃에서 15-40초, 51-59℃에서 15-45초, 68-76℃에서 30초-1분 30초를 한 세트로 40 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하며, 68-76℃, 3-7분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것이 바람직하며,In a preferred embodiment of the present invention, the amplification of step (a) may be a polymerase chain reaction using a primer set for detecting one or more bacteria of the genus Chlamydia selected from the group consisting of Chlamydia cytasi, Chlamydia avium and Chlamydia galinacia, , The polymerase chain reaction is carried out under the condition of one cycle of 91-97 ° C., 1-3 minutes as one set, and sequentially at 91-97 ° C. for 15-40 seconds and at 51-59 ° C. The reaction is carried out under conditions of 40 cycles at 15-45 seconds, 68-76 ° C for 30 seconds-1
더 바람직하게는 94℃, 2분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분를 한 세트로 40 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하며, 72℃, 5분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것일 수 있다.More preferably, the reaction is carried out under the condition of 1 cycle at 94 ° C. for 2 minutes as one set, and sequentially 40 cycles at 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute as one set. The reaction may be performed under conditions of a cycle, and the reaction may be performed under conditions of one cycle at 72° C. for 5 minutes as one set.
본 발명의 바람직한 다른 구체예에서, 상기 단계 (a)의 증폭은 클라미디아 시타시, 클라미디아 아비움 및 클라미디아 갈리나시아로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응일 수 있고, 상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 91-97℃, 1-5분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 91-97℃에서 10-30초, 55-65℃에서 30초-1분 30초를 한 세트로 45 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것이 바람직하며,In another preferred embodiment of the present invention, the amplification of step (a) is a real-time polymerase chain reaction using a primer set for detecting one or more bacteria of the genus Chlamydia selected from the group consisting of Chlamydia trysi, Chlamydia avium, and Chlamydia galinacia. In the real-time polymerase chain reaction, the reaction is carried out under the condition of one cycle of 91-97 ° C., 1-5 minutes as a set, and sequentially at 91-97 ° C. for 10-30 seconds, 55- It is preferable to proceed with the reaction under the conditions of 45 cycles at 65 ° C for 30 seconds to 1
더 바람직하게는 95℃, 3분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 95℃에서 15초, 60℃에서 1분를 한 세트로 45 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것일 수 있다.More preferably, the reaction is carried out under the conditions of 1 cycle at 95 ° C. for 3 minutes as a set, and sequentially at 95 ° C. for 15 seconds and at 60 ° C. for 1 minute as a set for 45 cycles. It may be that the reaction proceeds.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.Redundant content is omitted in consideration of the complexity of the present specification, and terms not otherwise defined in the present specification have meanings commonly used in the technical field to which the present invention belongs.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1. 조류 클라미디아균종 특이 염기서열 선정 및 프라이머와 프로브 제작Example 1. Algal Chlamydia Species Specific Base Sequence Selection and Primer and Probe Preparation
NCBI 데이터베이스(GenBank)에서 클라미디아균의 23S rRNA 유전자 염기서열을 확보하여 조류 클라미디아 3종 C. psittaci, C. avium, C. gallinacea를 포함하여 클라미디아속균에 특이적인 유전자 부위를 선발하였으며, 이를 토대로 클라미디아속균에 공통이며 특이적인 프라이머와 프로브를 제작하였다. The 23S rRNA gene sequence of Chlamydia was obtained from the NCBI database (GenBank), and gene regions specific to Chlamydia, including three species of Chlamydia, C. psittaci , C. avium , and C. gallinacea , were selected. Common and specific primers and probes were prepared.
아울러, NCBI genome 데이터베이스(GenBank)에 등록된 C. psittaci, C. avium, C. gallinacea 등의 완전한 유전체 염기서열 정보(C. psittaci 22개, C. avium 2개, C. gallinacea 2개)를 확보하였으며, 이들의 비교분석으로 각 균종에 특이적으로 존재하고 균종 감별에 유용한 후보 유전자 부위 영역을 선발하였으며, 이를 토대로 각 균종에 특이적인 프라이머와 프로브를 제작하였다.In addition, complete genome sequence information (22 C. psittaci, 2 C. avium , 2 C. gallinacea ) of C. psittaci , C. avium , and C. gallinacea registered in the NCBI genome database (GenBank) was secured. and, through comparative analysis, candidate gene region regions that are specific to each strain species and are useful for discrimination of strain types were selected. Based on this, primers and probes specific to each strain type were prepared.
제작된 클라다미마 속 균주에 대한 프라이머 및 프로브는 표 1에 나타내었고, 조류 클라미디아 3종(C. psittaci, C. avium, C. gallinacea)에 대한 프라이머 및 프로브는 표 1 내지 4에 나타내었다. Primers and probes for the prepared strains of the genus Cladamima are shown in Table 1, and primers and probes for three species of algae Chlamydia ( C. psittaci , C. avium , C. gallinacea ) are shown in Tables 1 to 4.
(bp)PCR product
(bp)
실시예 2. 가검균의 DNA 준비Example 2. DNA preparation of false bacteria
가검균으로는 시판되는 C. psittaci 6BC, C. pneumoniae CM-1 및 C. trachomatis ATCC VR-902B의 양성 대조 DNA(Vircell, Sapin); 및 제공받은 C. avium 10DC88 및 C. gallinacea 08DC62 양성 DNA(Friedrich-Loeffler-Institut, Germany);를 확보하였다. 확보된 가검균의 DNA를 DNeasy Blood and Tissue kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 준비하였다.Supplemental bacteria include positive control DNAs of commercially available C. psittaci 6BC, C. pneumoniae CM-1, and C. trachomatis ATCC VR-902B (Vircell, Sapin); and C. avium 10DC88 and C. gallinacea 08DC62 positive DNA provided (Friedrich-Loeffler-Institut, Germany); DNA of the obtained strains was prepared using the DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Germany).
실시예 3. 클라미디아속 검출과 Example 3. Chlamydia genus detection and C. psittaciC. psittaci , , C. aviumC. avium 및 and C. gallinaceaC. gallinacea 의 감별discrimination of
상기 실시예 2의 DNA 시료를 주형 DNA로 사용하였고, 실시예 1의 Csp-L 및 R, Cp-L 및 R, Ca-L 및 R, Cg-L 및 R로 구성된 4쌍의 프라이머를 이용하여 표 5 및 표 6에 기재된 조건으로 multiplex PCR을 수행하였으며, agarose gel에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동 결과는 도 1에 나타내었다.The DNA sample of Example 2 was used as template DNA, and four pairs of primers composed of Csp-L and R, Cp-L and R, Ca-L and R, and Cg-L and R of Example 1 were used. Multiplex PCR was performed under the conditions described in Tables 5 and 6, and electrophoresis was performed on an agarose gel. The electrophoresis results are shown in FIG. 1 .
도 1에 나타난 바와 같이, 클라미디아속균들의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 모두 약 212bp 크기의 DNA가 증폭된 것을 확인하였다. 또한 C. psittaci의 DNA를 주형 DNA로 사용하였을 경우에는 약 151bp, C. avium의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 약 166bp, C. gallinacea의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 약 100bp 크기의 DNA가 더 확인되었다. 다른 클라미디아속균의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 212bp 크기의 DNA만 확인되었고, 개별 균주에 대한 DNA 증폭은 확인되지 않았다. 다른 속 균주인 E.coli는 어떠한 밴드도 관찰되지 않았다.As shown in FIG. 1, when the DNA of Chlamydia genus bacteria was used as a template, it was confirmed that DNA of about 212 bp was amplified. In addition, when C. psittaci DNA was used as template DNA, about 151 bp, when C. avium DNA was used as template, about 166 bp, and when C. gallinacea DNA was used as template, DNA of about 100 bp was obtained. confirmed further. When DNA of other genus Chlamydia was used as a template, only 212 bp DNA was confirmed, and DNA amplification for individual strains was not confirmed. No bands were observed for E.coli , a strain of another genus.
이는 상기 표 1 내지 4의 프라이머를 조류 클라미디아균 검출용 유전자 진단 방법에 적용하게 되면, 생물학적 시료로부터 클라미디아속균 존재 여부에 대한 확인과 함께, C. psittaci, C. avium 및 C. gallinacea를 동시에 구별하여 검출할 수 있다는 것을 의미한다.When the primers in Tables 1 to 4 are applied to the genetic diagnosis method for detecting avian Chlamydia bacteria, C. psittaci , C. avium and C. gallinacea are simultaneously distinguished, along with confirmation of the presence of Chlamydia bacteria in biological samples. means that it can be detected.
실시예 4. 실시간 클라미디아속 검출과 Example 4. Real-time Chlamydia detection and C. psittaciC. psittaci , , C. aviumC. avium 및 and C. gallinaceaC. gallinacea 의 감별discrimination of
상기 실시예 2의 DNA 시료를 주형 DNA로 사용하였고, 표 1 내지 4의 프라이머 쌍 및 프로브(Csp-L, R 및 P, Cp-L, R 및 P, Ca-L, R 및 P, Cg-L, R 및 P)를 이용하여, 표 7 및 표 8에 기재된 조건으로 CFX96 real-time PCR Detection Systems(Bio-Rad, USA)을 이용하여 multiplex real-time PCR을 수행하였다. multiplex real-time PCR 결과는 도 2에 나타내었다.The DNA sample of Example 2 was used as template DNA, and the primer pairs and probes in Tables 1 to 4 (Csp-L, R and P, Cp-L, R and P, Ca-L, R and P, Cg- L, R and P), multiplex real-time PCR was performed using CFX96 real-time PCR Detection Systems (Bio-Rad, USA) under the conditions described in Tables 7 and 8. The multiplex real-time PCR results are shown in FIG. 2 .
도 2에 나타난 바와 같이, 클라미디아속균들의 DNA를 주형으로 사용한 경우, HEX dye에 의한 DNA 증폭곡선을 확인할 수 있었다. 또한 C. psittaci, C. avium 및 C. gallinacea의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우 각각 FAM; Texas Red; 및 Cy5 dye;에 의한 DNA 증폭곡선을 확인하였다. 다른 균의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우에는 DNA 증폭곡선이 확인되지 않았다.As shown in Figure 2, when the DNA of Chlamydia genus bacteria was used as a template, the DNA amplification curve by HEX dye could be confirmed. In addition, when the DNAs of C. psittaci , C. avium and C. gallinacea were used as templates, FAM, respectively; Texas Red; and Cy5 dye; the DNA amplification curve was confirmed. DNA amplification curves were not confirmed when DNA from other bacteria was used as a template.
이는 상기 표 1 내지 4의 프라이머 쌍과 프로브를 이용하여 조류 클라미디아균 검출용 실시간 유전자 진단 방법을 적용하게 되면, 생물학적 시료로부터 클라미디아속균 존재 여부에 대한 확인과 함께, C. psittaci, C. avium 및 C. gallinacea를 동시에 구별하여 검출할 수 있다는 것을 의미한다.When the real-time genetic diagnosis method for detecting Chlamydia bacteria is applied using the primer pairs and probes in Tables 1 to 4, C. psittaci, C. avium and C. psittaci , C. avium and C. This means that gallinacea can be simultaneously distinguished and detected.
실시예 5. 실시간 클라미디아속 검출과 Example 5. Real-time Chlamydia detection and C. psittaciC. psittaci , , C. aviumC. avium 및 and C. gallinaceaC. gallinacea 감별의 효율성과 검출한계 조사 Investigation of discrimination efficiency and detection limit
실시간 유전자 진단 방법의 효율성과 검출한계를 조사하기 위해, 표적 유전자 부위를 함유하는 양성시료(플라스미드)의 단계희석액을 이용한 실시간 유전자 검사로 표준곡선을 작성하였다. 표준 곡선은 도 3에 나타내었고, 구체적인 값은 표 9에 나타내었다.To investigate the efficiency and detection limit of the real-time genetic diagnosis method, a standard curve was prepared by real-time genetic testing using serial dilutions of positive samples (plasmids) containing the target gene region. The standard curve is shown in Figure 3, and the specific values are shown in Table 9.
b Ct value 는 3반복 실험의 결과를 ‘평균 ± 표준편차’로 나타냄. a A positive sample (plasmid) containing the target gene region is used as a DNA template.
b Ct value represents the result of triplicate experiments as 'mean ± standard deviation'.
도 3 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 표 1 내지 4의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용할 경우 94.8~100.7%의 높은 효율성(efficiency)과 높은 상관계수(R2 >0.99)를 나타내었으며, 양성시료의 10 copy 미만까지 검출할 수 있었다.As shown in Figure 3 and Table 9, when using the primer pairs and probes in Tables 1 to 4, high efficiency of 94.8 to 100.7% and high correlation coefficient (R 2 >0.99) were shown, and 10 of the positive samples It was possible to detect less than copy.
실시예 6. 다양한 균주를 이용한 조류 클라미디아균 감별동정법 타당성 입증Example 6. Proof of Feasibility of Algal Chlamydia Differential Identification Method Using Various Strains
본 발명 유전자 진단 방법의 민감성 및 특이성을 조사하기 위하여, 클라미디아균 표준 양성시료(5점), 야외 양성시료 20점(C. psittaci 14점, C. avium 3점, C. gallinacea 3점), 클라미디아 이외 10종의 다른 세균속 유래 음성시료 20점 등을 대상으로 상기 실시예 4와 동일한 방법을 사용하여 multiplex real-time PCR assay을 수행하였다. multiplex real-time PCR assay 결과는 표 10에 나타내었다.In order to investigate the sensitivity and specificity of the genetic diagnosis method of the present invention, chlamydia standard positive samples (5 points), 20 outdoor positive samples ( C. psittaci 14 points,
b 괄호안은 Ct value를 나타냄. a Vircell = Vircell Microbiologists (Spain), FLI = Friedrich-Loeffler-Institut (Germany), NCTC = National Collection of Type Cultures (UK), ATCC = The Global Bioresource Center (USA) and APQA = Amimal and Plant Quarantine Agency (Korea) ).
b Parentheses indicate Ct values.
표 10에 나타낸 바와 같이, 클라미디아균 양성시료(C. psittaci, C. avium, C. gallinacea 등 3균종)를 정확히 감별 동정되었으며(민감성 100%), 검출대상 3균종 이외의 클라미디아균은 균속 특이적인 반응(HEX)만 보였고, 다른 3균종에 특이적인 반응은 나타나지 않았으며, 기타 음성시료는 모두 증폭되지 않았다(특이도 100%).As shown in Table 10, positive samples of Chlamydia ( C. psittaci , C. avium , C. gallinacea , etc.) were accurately identified (
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다. In the above, specific parts of the present invention have been described in detail, and for those skilled in the art, it is clear that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Multiplex real-time polymerase chain reaction assay for differential identification of avian Chlamydia <130> 1.118P <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Csp-L <400> 1 ccctattcac aactcatcca aac 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Csp-R <400> 2 catgatgagc cagggagtta ag 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cp-L <400> 3 ttaccacatg catggaagcg 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cp-R <400> 4 cgttcgattt ctgctttttc tcta 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ca-L <400> 5 ggctgctttg tcaacctgtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ca-R <400> 6 ccccgcacta agtccaaata 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg-L <400> 7 gcattacggc aaaggactcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg-R <400> 8 tctcccctaa ccactctcca 20 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Csp-P <400> 9 cttcaacctg gtcataaata gmtcac 26 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cp-P <400> 10 cccagcccta cggatatgaa 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ca-P <400> 11 tgcttggggg ctggttactt ct 22 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg-P <400> 12 tgtttcatta actcaggagc ttcacc 26 <110> REPUBLIC OF KOREA (Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Multiplex real-time polymerase chain reaction assay for differential identification of avian Chlamydia <130> 1.118P <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Csp-L <400> 1 ccctattcac aactcatcca aac 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Csp-R <400> 2 catgatgagc cagggagtta ag 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Cp-L <400> 3 ttaccacatg catggaagcg 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Cp-R <400> 4 cgttcgattt ctgctttttc tcta 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ca-L <400> 5 ggctgctttg tcaacctgtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ca-R <400> 6 ccccgcacta agtccaaata 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Cg-L <400> 7 gcattacggc aaaggactcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Cg-R <400> 8 tctcccctaa ccactctcca 20 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Csp-P <400> 9 cttcaacctg gtcataaata gmtcac 26 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Cp-P <400> 10 cccagcccta cggatatgaa 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ca-P <400> 11 tgcttggggg ctggttactt ct 22 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Cg-P <400> 12 tgtttcatta actcaggagc ttcacc 26
Claims (20)
서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트.A forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; and
A primer set for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia comprising; a reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
서열번호 4의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci) 검출용 프라이머 세트.A forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; and
A reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; Chlamydia psittaci comprising a primer set for detection.
서열번호 6의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아 아비움(Chlamydia avium) 검출용 프라이머 세트.A forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; and
Reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; including Chlamydia avium ( Chlamydia avium ) A set of primers for detection.
서열번호 8의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아 갈리나시아(Chlamydia gallinacea) 검출용 프라이머 세트.A forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7; and
Reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8; Chlamydia Galinasia ( Chlamydia gallinacea ) comprising a primer set for detection.
상기 프로브는 5’ 말단에 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 형광물질을 포함하는, 프로브.According to any one of claims 5 to 8,
The probe is 6-FAM (6-carboxyfluorescein), 5-FAM (5-carboxyfluorescein), hexachloro-6-carboxyfluorescein (Hexachloro-6-carboxyfluorescein), tetrachloro-6-carboxyfluorescein at the 5' end Phosphorus (Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Fluorescein chlorotriazinyl, Rhodamine Green (Rhodamine green), Rhodamine red, Tetramethylrhodamine, FITC (Fluorescein isothiocyanate), Oregon green, Alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED( N- (1-Naphthyl) ethylenediamine), Texas red, Cy3 (Cyanine-3) and Cy5 (Cyanine-5), a probe comprising one or more fluorescent substances selected from the group consisting of.
상기 프로브는 3’ 말단에 BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ(Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소광제를 포함하는, 프로브.According to any one of claims 5 to 8,
The probe has BHQ1 (Black hole quencher 1), BHQ2 (Black hole quencher 2), BHQ3 (Black hole quencher 3), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ (Nonfluorescent quencher), Dabcyl , Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), Blackberry Quencher (Blackberry Quencher) and Iowa Black (Iowa black), a probe comprising at least one quencher selected from the group consisting of.
상기 조성물은 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프로브를 더 포함하는, 조성물.According to claim 11,
The composition further comprises a probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, composition.
상기 조성물은 서열번호 10 내지 12의 염기서열로 표시되는 프로브로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 조성물.According to claim 13,
The composition further comprises at least one member selected from the group consisting of probes represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 10 to 12.
상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및
서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머;를 포함하는 클라미디아속균 검출용 프라이머 세트를 더 포함하는 것인, 조성물.According to claim 13,
The composition comprises a forward primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; and
A reverse primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; further comprising a primer set for detecting bacteria belonging to the genus Chlamydia comprising a composition.
상기 조성물은 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프로브를 더 포함하는, 조성물.According to claim 15,
The composition further comprises a probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, composition.
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