KR100995835B1 - 탯줄 유래의 중간엽 줄기세포를 이용한 간-특이기능이 있는간세포의 제조방법 및 이로부터 제조된 탯줄 유래 간세포 - Google Patents

탯줄 유래의 중간엽 줄기세포를 이용한 간-특이기능이 있는간세포의 제조방법 및 이로부터 제조된 탯줄 유래 간세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (1) 중간엽 줄기세포를 세포증식 배지에서 배양하는 단계; (2) 단계 (1)에서 배양된 세포를 세포 성장인자가 첨가된 혈청 배지에서 간세포로 유도시키는 단계; 및 (3) 후속하여 단계 (2)에서 유도된 세포를 온코스타틴 엠(Oncostatin M), 글루카곤, 니코틴 아마이드 및 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로부터 선택된 하나 이상의 간세포 성숙 유도 물질이 첨가된 혈청 배지에서 간세포를 성숙시키는 단계를 포함하는, 탯줄 유래의 중간엽 줄기세포 유래 간세포의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법으로 제조한 간세포는 정상적인 간세포와 유사한 알부민 합성능, 암모니아 제거능, 우레아 합성능, 싸이토케라틴 18(CK 18) 합성능, 싸이토크롬 P450 1B1 합성능 및 엑스비피-1(XBP-1) 합성능을 가짐으로써, 다양한 간세포 치료제, 체외순환형 생인공간 시스템 및 체외 독성평가 시스템의 세포원으로 이용할 수 있다.

Description

탯줄 유래의 중간엽 줄기세포를 이용한 간-특이기능이 있는 간세포의 제조방법 및 이로부터 제조된 탯줄 유래 간세포{METHOD FOR PREPARATION OF HEPATOCYTES WITH LIVER-SPECIFIC FUNCTIONS USING MESENCHYMAL STEM CELLS AND UMBILICAL CORD-DERIVED HEPATOCYTES PREPARED THEREBY}
본 발명은 탯줄(umbilical cord)로부터 유래한 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)를 이용하여 간-특이기능을 갖는 간세포(hepatocyte)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 탯줄의 왓튼 젤리(wharton's jelly)로부터 유래한 중간엽 줄기세포를 이용하여 혈청이 포함된 배지에서 세포 성장인자 및 간세포 성숙 유도 물질을 첨가하여 배양함으로써 알부민 합성능, 우레아 합성능 및 암모니아 제거능과 같은 간-특이기능을 갖는 간세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
간(liver) 내에 존재하지 않지만 간의 실질 세포인 간세포로 분화할 수 있는 세포의 존재가 근래에 들어 밝혀지기 시작하였다. 쥐를 이용한 생체 내 실험을 통 하여 골수세포가 간세포로 분화될 수 있다는 연구가 최초로 보고되었고(문헌[Petersen BE., Science 284:1168-70, 1999] 참고), 이어 이러한 현상을 인간세포에서도 적용할 수 있다는 연구가 보고된 후(문헌[Theise ND., Hepatology 31:235-40, 2000] 참고), 골수세포 중 어떠한 세포가 간세포로 분화할 수 있는지에 관한 다양한 연구들이 보고되고 있다. 특히, 라가세의 문헌[Lagasse E., Nature Medicine 6:1229-34, 2000]과 사토의 문헌[Sato Y., Blood 106:756-63, 2005]에 의해 공지된 생체 내 이식 연구로 시작되는 일련의 연구들로 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)와 중간엽 줄기세포가 간세포로 분화할 수 있는 유력한 세포로 고려되고 있다.
하지만, 아직까지도 이식된 세포가 진정으로 간세포로 분화된 것인지, 또는 세포 융합에 의해 발생하는 현상인지에 관하여 이견이 있는 실정이다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 생체 외에서 직접 분화시키려는 연구들이 시도되어져 왔는데, 간세포로 분화할 수 있는 유력한 세포들을 간의 발생과 재생에 중요한 역할을 하는 성장인자, 싸이토카인 등이 첨가된 배양 배지에서 분화시키는 것이 그것이다.
대표적인 성장인자로서, 발생학적으로 전장 내배엽(foregut endoderm)으로부터 간원기(liver primordium)를 유도하는 섬유모세포 성장인자-4(fibroblast growth factor-4, FGF-4)(문헌[Wells JM., Annu Rev Cell Dev Biol 15:393-40, 1999] 참고)와 간을 성장시키는 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)가 있다(문헌[Michalopoulos GK., Science 276:60-6, 1997] 참고). 출산 말기에 혈액세포로부터 분비되는 온코스타틴 엠(oncostatin M, OSM)은 간을 성숙시키는 역할을 한다(문헌[Kinoshita T., Proc Natl Acad Sci USA 96:7265-70, 1999] 참고). 또한 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 전환성장인자-알파(transforming growth factor-α, TGF-α) 및 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)은 간의 손상을 재생시키는 역할을 한다(문헌[Michalopoulos GK., Science 276:60-6, 1997] 참고).
그 외에도 니코틴 아마이드(NA), 나트륨 부티레이트, 다이메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 화학물질은 간세포나 간암세포주의 간기능을 향상 또는 성숙시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(문헌[Sakai Y., Cell Transplant 11:435-41, 2002; Zvibel I., Differentiation 63:215-23, 1998] 참고).
이와 같은 성장인자를 이용하여 생체 외에서 중간엽 줄기세포를 간세포로 분화시키는 연구들이 진행되어 왔다. 스와츠(Schwartz RE.)의 문헌[Schwartz RE., J Clin Invest 109:1291-302, 2002]과 지앙(Jiang Y.)의 문헌[Jiang Y., Nature 418:41-9, 2002]에서는 중간엽 줄기세포의 하위세포군의 하나인 다능성 성체 전구세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC)가 생체 외에서 섬유모세포성장인자-4와 간세포 성장인자가 있는 배지 내에서 간세포로 분화할 수 있다는 것을 최초로 보고하였다.
상기의 보고 후에 골수(bone marrow) 유래 중간엽 줄기세포를 생체 외에서 간세포로 분화시키는 연구들이 보고되었다(문헌[Luk JM, J Immunol Methods. 305:39-47, 2005]; [Oyagi S, J Hepatol. 44:742-8, 2006]; [Ong SY, Biomaterials. 27:4087-97, 2006]; [Chen Y, J Cell Biochem. 102:52-63, 2007]; [Wang PP, Biochem Biophys Res Commun. 320:712-6, 2004]; [Cai YF, World J Gastroenterol. 10:3308-12, 2004]; [Shu SN, World J Gastroenterol. 10:2818-22, 2004]; [Kang XQ, World J Gastroenterol. 11:3479-84, 2005]; [Lee KD, Hepatology. 40:1275-84, 2004]; [Lange C, World J Gastroenterol. 11:4497-504, 2005]; [Talens-Visconti R, World J Gastroenterol. 12:5834-45, 2006]; [Lange C, World J Gastroenterol. 12:2394-7, 2006]; [Li W, World J Gastroenterol. 12:4866-9, 2006]; [Snykers S, Toxicol Sci. 94:330-41, 2006] 및 [Snykers S, BMC Dev Biol. 7:24-38, 2007] 참고).
또한 지방(adipose tissue) 유래 중간엽 줄기세포를 생체 외에서 간세포로 분화시키는 연구들이 보고되었으며(문헌 [Seo MJ, Biochem Biophys Res Commun. 328:258-64, 2005] 및 [Talens-Visconti R, World J Gastroenterol. 12:5834-45, 2006] 참고), 제대혈(umbilical cord blood) 유래 중간엽 줄기세포를 생체 외에서 간세포로 분화시키는 연구들도 보고된 바 있다(문헌[Lee KD, Hepatology. 40:1275-84, 2004]; [Lee OK, Blood. 103:1669-75, 2004]; [Hong SH, Biochem Biophys Res Commun. 330:1153-61, 2005]; [Kang XQ, World J Gastroenterol. 11:7461-5, 2005] 및 [Kang XQ, Cell Biol Int. 30:569-75, 2006] 참고).
최근에는 간세포 분화에 관련된 성장인자들을 먼저 처리하고, 이후 싸이토카인 및 화학물질을 단계적으로 처리하는 연구가 보고되었다(문헌[Lee KD, Hepatology. 40:1275-84, 2004]; [Ong SY, Biomaterials. 27:4087-97, 2006]; [Talens-Visconti R, World J Gastroenterol. 12:5834-45, 2006]; [Lee OK, Blood. 103:1669-75, 2004] 및 [Hong SH, Biochem Biophys Res Commun. 330:1153-61, 2005] 참고). 특히 스나이커스(Snykers)의 문헌[Snykers S, Toxicol Sci. 94:330-41, 2006]에서는, 설치류의 골수 유래 중간엽 줄기세포를 섬유모세포 성장인자-4, 간세포 성장인자 및 덱사메타손을 단계별로 처리했을 때 간-특이기능이 통계적으로 유의하게 향상된다는 것을 보고하고 있다.
하지만 아주 중요하게, 스나이커스의 후속연구 문헌[Snykers S, BMC Dev Biol. 7:24-38, 2007]에 의하면 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 상기에서 언급한 섬유모세포 성장인자-4, 간세포 성장인자, 덱사메타손을 일괄적으로 처리하든, 단계적으로 처리하든 간세포로 분화시킬 수 없고, 다만 단계적 처리를 한 후 트리코스타틴 A(trichostatin A)와 같은 히스톤 디아세틸레이즈 저해제(histone deacetylase inhibitor)를 처리한 경우에서만 간세포 기능이 나타난다는 것을 보고하였다.
이를 통해 중간엽 줄기세포를 간세포로 분화시키는데 있어서 성장인자, 싸이토카인 및 화학물질을 시간에 따라 처리하는 방법이 아주 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이 대부분의 중간엽 줄기세포는 골수, 지방, 제대혈로부터 유래된 것들로서, 골수와 지방의 경우, 영리를 목적으로 하는 경우 상업적으로 대량 공급이 어려우며, 제대혈의 경우, 대부분 배치(batch)별로 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 확률이 10% 이하이다(문헌[Kang TJ, Acta Haematol 112:230-233, 2004] 및 [Yang SE, Cytotherapy 6:476-486, 2004] 참고). 웨그너(Wagner W)의 문헌[Wagner W, Exp Hematol 33:1402-1416, 2005]에서는 중간엽 줄기세포를 34%의 수율로 수득하였으나, 이것은 골수나 지방을 이용하여 수득할 수 있는 100%보다 상당히 낮다는 단점을 가진다.
이에 본 발명자는 탯줄의 왓튼 젤리로부터 중간엽 줄기세포를 분리하고 배양하여 간세포 분화에 적합한 배지에 섬유모세포 성장인자-4(FGF-4) 및 간세포 성장인자(HGF)를 첨가하여 간세포를 유도한 후, 온코스타틴 엠(OSM), 글루카곤, 니코틴 아마이드(NA) 및 다이메틸 설폭사이드(DMSO)의 조합물을 첨가하여 간세포를 성숙시킴으로써 알부민 합성능, 우레아 합성능, 암모니아 제거능, 싸이토케라틴 18(CK 18) 합성능, 싸이토크롬 P450 1B1 합성능 및 엑스비피-1(XBP-1) 합성능을 보이는 간세포를 제조하여 본 발명을 완성하게 되었다.
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따라서, 본 발명의 목적은 탯줄의 왓튼 젤리로부터 유래한 중간엽 줄기세포를 분화시켜 간-특이기능을 갖는 간세포를 제조하는 방법 및 이러한 방법에 의해 제조된 탯줄 유래 간세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해,
(1) 중간엽 줄기세포를 세포증식 배지에서 배양하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 배양된 세포를 세포 성장인자가 첨가된 혈청 배지에서 간세포로 유도시키는 단계; 및
(3) 후속하여 단계 (2)에서 유도된 세포를 온코스타틴 엠(Oncostatin M), 글루카곤, 니코틴 아마이드 및 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로부터 선택된 하나 이상의 간세포 성숙 유도 물질이 첨가된 혈청 배지에서 간세포를 성숙시키는 단계를 포함하는, 탯줄 유래의 중간엽 줄기세포 유래 간세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 간세포의 제조방법은 생체 외에서 충분한 양의 간세포를 제조함으로써, 세포 이식을 통한 간질환 치료나 체외순환형 생인공간 시스템 또는 체외 독성평가를 위한 간세포원으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 간세포의 제조방법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
<단계 (1)>
단계 (1)에서는, 탯줄의 왓튼 젤리로부터 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하기 위하여 탯줄의 왓튼 젤리를 2mm × 2mm의 크기로 작게 절단한 후, 배양 용기에 부착시켜 1시간 동안 인큐베이터에서 방치한 조직을 세포 증식이 유도되는 조건에서 배양한다. 조직 배양을 위한 기본 배지 및 시약은 해당분야에 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 배양에 있어서, 기본 배지로는 바람직하게는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM/F-12, F-12, McCoy's 5A, RPMI1640, 윌리엄 배지 E(Williams' medium E) 또는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지가 사용될 수 있다.
상기의 배지에는 항생제, 성장인자, 아미노산, 저해제 또는 그 유사물질 뿐만 아니라 우아 혈청(fetal calf serum, FCS) 또는 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 등이 첨가될 수 있다.
본 발명에서는 10%의 우태아 혈청이 첨가된 저농도 글루코스(1000 ㎎/ℓ)의 DMEM 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
상기 배양은 일반적으로 세포가 유래된 종의 세포들을 배양하기 위해 사용하는 조건(온도, 대기), 예를 들면 37℃에서, 100% 상대습도에서, 5%의 이산화탄소를 포함하는 대기조건에서 수행된다. 또한, 상기 배양은 원하는 세대만큼 수행될 수 있으며, 원하는 세포수에 달하면 즉시 종료될 수 있다. 본 발명에서는 일차 배양 및 연속 배양을 통하여 바람직하게는 1 내지 10 세대까지 배양할 수 있다. 상기 배양시간(한 세대 동안의)은 세포가 성장하는데 필요한 적절한 시간이며, 일반적으로는 약 하루 내지 수일, 예를 들어 약 7일 또는 약 8일 동안 수행되며, 어떠한 경우에도 이에 국한되는 것은 아니다.
<단계 (2)>
단계 (2)에서는, 단계 (1)에서 배양된 세포를 세포 성장인자가 첨가된 혈청 배지에서 간세포로 유도시킨다.
상기 혈청 배지는 단계 (1)에서 언급한 기본 배지들로부터 선택된 기본 배지에 혈청, 바람직하게는 우아 혈청 또는 우태아 혈청이 첨가된 것이며, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레니움으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 함유할 수 있다.
상기 우태아 혈청은 0.1 내지 50%, 바람직하게는 0.5 내지 30%의 양으로 배지에 첨가할 수 있다.
상기 덱사메타손은 1 내지 1000 nM, 바람직하게는 10 내지 100 nM의 양으로 배지에 첨가될 수 있다.
상기 인슐린은 0.5 내지 50 ㎍/ml, 바람직하게는 1 내지 10 ㎍/ml의 양으로 배지에 첨가될 수 있다.
상기 트렌스페린은 0.5 내지 50 ㎍/ml, 바람직하게는 1 내지 10 ㎍/ml의 양으로 배지에 첨가될 수 있다.
상기 셀레니움은 0.1 내지 50 ng/ml, 바람직하게는 0.5 내지 10 ng/ml의 양으로 배지에 첨가될 수 있다.
특히, 본 발명에서는 간세포 유도를 위한 혈청 배지로 100 nM 덱사메타손, 5 ㎍/ml 인슐린, 5 ㎍/ml 트랜스페린, 5 ng/ml 셀레니움, 및 2% 우태아 혈청을 함유한 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지가 바람직하다.
본 발명에서 세포 성장인자는 바람직하게는 간세포 성장인자, 섬유모세포 성장인자-4, 또는 이들의 조합물이다.
상기 섬유모세포 성장인자-4 및 간세포 성장인자는 1 내지 1000 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml의 양으로 첨가할 수 있다.
본 발명의 간세포 유도 배지를 이용하여 통상적인 세포 배양 조건하에 간세포로 분화시킬 수 있으며, 예를 들어 36 내지 38℃에서, 100% 상대습도에서, 5%의 이산화탄소 존재하에 배양하는 것이 바람직하다. 배양은 14 내지 42일 동안, 예를 들어 4주 동안 수행하는 것이 바람직하다.
<단계 (3)>
단계 (3)에서는, 단계 (2)에서 간세포로 유도된 세포를 상기 단계 (2)에서 설명한 바와 같은 혈청 배지에 온코스타틴 엠, 글루카곤, 니코틴 아마이드 및 다이메틸 설폭사이드로부터 선택된 하나 이상의 간세포 성숙 유도 물질이 첨가된 배지에서 통상적인 세포 배양 조건하에 간세포로 성숙시킬 수 있다.
상기 배양은 예를 들어 36 내지 38℃에서, 100% 상대습도에서, 5%의 이산화탄소 존재하에서 14 내지 42일 동안, 예를 들어 4주 동안 수행하는 것이 바람직하다.
상기 온코스타틴 엠은 바람직하게는 0.1 내지 1000 ng/ml, 보다 바람직하게는 1 내지 100 ng/ml의 양으로 배지에 첨가될 수 있다.
상기 글루카곤은 바람직하게는 10-8 내지 10-6 M의 양으로 배지에 첨가될 수 있다.
상기 니코틴 아마이드는 바람직하게는 1 내지 100 mM, 보다 바람직하게는 10 내지 50 mM의 양으로 배지에 첨가될 수 있다.
상기 다이메틸 설폭사이드는 바람직하게는 0.01% 내지 1%의 양으로 배지에 첨가될 수 있다.
통상 간세포 분화를 위한 유도 및 성숙단계는 크게 유도와 성숙단계를 함께 하는 일괄 처리법(one-shot protocol)과 유도와 성숙단계를 분리하여 수행하는 단계 처리법(stepwise protocol)으로 수행할 수 있다(도 3 참조).
일괄 처리법은 일정기간 동안 배지에 세포의 성장인자와 간세포 성숙 유도 물질을 한번에 첨가하여 간세포의 유도 및 성숙단계를 수행하여 간세포를 제조하는 방법이다.
단계 처리법은 혈청 배지에 세포 성장인자를 첨가하여 간세포로 유도하고, 후속하여 간세포 성숙 유도 물질을 첨가하여 간세포로 성숙시키는 단계를 포함하는 간세포의 제조방법이다.
본 발명에서는 단계 처리법에 따라 상기 단계 (2)의 간세포 유도 단계와 상기 단계 (3)의 간세포 성숙 단계를 나누어 수행한다.
본 발명의 방법을 통하여 생체 외에서 분화된 중간엽 줄기세포는 실제 간세포와 유사한 알부민 합성능, 우레아 합성능, 암모니아 제거능과 같은 간-특이기능이 있는 간세포로 분화되었음을 확인하였고, 향후 간질환 치료를 위한 세포 이식제, 생인공간 시스템의 세포원, 체외독성평가 시스템의 세포원 등에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 한정하지는 않는다.
실시예
실시예 1: 탯줄의 왓튼 젤리로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
탯줄은 제왕절개 수술 후 건강한 산모로부터 적출된 태반조직으로부터 회수하고, 멸균된 상태로 DMEM 배지가 들어있는 보관용기로 이송하여 세포 분리전까지 2 내지 12시간 동안 4℃에서 냉장 보관하였다. 탯줄을 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 3회 세척하고, 탯줄의 혈관에 남아있는 잔여 혈액도 인산염 완충용액으로 관류시켜 제거하였다. 이후, 제대정맥과 제대동맥과 같은 혈관 조직을 수술용 칼과 가위로 완전히 제거하고, 탯줄의 왓튼 젤리를 약 2mm×2mm의 크기로 자른 다음, 배양 용기에 부착시켜 약 4시간 동안 인큐베이터에 방치시켰다. 상기의 배양 용기에 부착된 왓튼 젤리를 10% 우태아 혈청이 포함된 저농도 글루코스(1000 ㎎/L)의 DMEM 배지에 넣어 배양하였다. 1주일 후 세포가 성장해 나왔으며, 섬유모세포와 유사한 형태로, 증식능의 감소 없이 10세대까지 유지되었다. 그 사진을 도 1에 나타내었다.
실시예 2: 중간엽 줄기세포의 확인
실시예 1에서 10세대까지 배양된 중간엽 줄기세포를 확인하기 위하여, (1) 형태학적 관찰, (2) 유세포 분석(Fluorescence activated cell sorter, FACS) (3) 연결조직 분화능 확인, (4) 신경세포 분화능 관찰을 수행하였다.
먼저 역광현미경(inverted microscope)을 이용하여 육안 검사와 계대별 세포수 검사를 수행하여 중간엽 줄기세포가 형태학적으로 섬유모세포와 유사한 형태를 증식능의 감소없이 유지하고 있음을 확인하였다(도 2a 참고).
그리고 골수 유래의 중간엽 줄기세포의 표지자인 CD90, CD73 및 CD105의 발현을 확인하기 위하여, 1x105개의 세포를 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC) 또는 피코에리트린(phycoerythrin; PE)이 결합된 항-CD73 항체(BD Bioscience, USA), 항-CD90 항체(BD Bioscience, USA) 및 항-CD105 항체(Ancell, USA)와 상온에서 20분 동안 반응시킨 후, 유세포 분석기(FACScan, BD Bioscience)를 이용하여 검사하고, 데이터의 분석은 CELLQUEST 소프트웨어(BD Bioscience)를 이용하였다. 그 결과, 상기 표지자에 대하여 모두 양성을 나타냄을 확인하였다(도 2b 참고).
또한, 신경세포 분화능을 확인하기 위하여, 골세포로 분화시키기 위해 밀집 배양한 후 고농도 포도당(4000 ㎎/ℓ)이 포함된 DMEM 배지에 100 nM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르브산 2-포스페이트(ascorbic acid 2-phosphate), 10 mM 베타-글리세로포스페이트(Sigma-Aldrich Co.)와 10% 우태아 혈청을 첨가하여 4주 동안 배양하였고, 연골세포로 분화시키기 위해 2x105 세포를 원심 분리하여 펠렛(pellet)을 제조한 후 고농도 포도당(4000 ㎎/ℓ)이 포함된 DMEM 배지에 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM 아스코르브산 2-포스페이트, 10-7 M 덱사메타손, 5 μg/ml 인슐린, 5 μ g/ml 트랜스페린, 0.5 ng/ml 셀레니움(ITS; Sigma-Aldrich Co.), 10 ng/ml 전환성장인자(transforming growth factor-β, TGF-β, R&D Systems Inc.)를 첨가하여 4주 동안 배양하였다.
지방세포로 분화시키기 위해 밀집 배양된 세포에 고농도 포도당이 포함된 DMEM 배지에 1 μM 덱사메타손, 0.5 mM 메틸 이소부틸잔틴(methyl-isobutylxanthine), 10 ㎍/ml 인슐린, 100 μM 인도메타신(Sigma-Aldrich Co.) 및 10% 우태아 혈청이 첨가된 배지에서 3일, 10 ㎍/ml 인슐린과 10% 우태아 혈청이 첨가된 배지에서 1일 동안 번갈아 가며 4주 동안 배양하였다.
또한, 신경세포로 분화시키기 위해 10 ng/ml 표피성장인자(Sigma-Aldrich Co.), 10 ng/ml 염기성 섬유모세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF, R&D Systems Inc.)와 10% 우태아 혈청이 첨가된 뉴로바살 배지(Neurobasal Medium, Gibco BRL)에서 4주 동안 배양하였다.
그 결과 각각 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화한 것을 각각 본 코사 염색(von Kossa staining), 톨루이딘 블루 염색(Toluidine blue staining), 오일 레드 O 염색(Oil red O staining)으로 확인하고 그 결과를 도 2c에 나타내었다.
또한, 본 발명의 실시예 1에서 배양한 세포가 신경세포로 분화하는지 확인하기 위하여 뉴로필라멘트(neurofilament, NF), 글라이알 파이브릴라 엑시딕 프로테인(glial fibrillar acidic protein, GFAP), S-100으로 면역 형광염색하여 NF, GFAP 및 S-100을 발현하는 신경세포로 분화되었음을 확인하고 그 결과를 도 2d에 나타내었다.
실시예 3: 간세포로의 분화
배양된 중간엽 줄기세포를 간세포로 분화시키기 위해 크게 유도와 성숙단계를 함께 하는 일괄 처리법(one-shot protocol)과 유도와 성숙단계를 분리한 단계 처리법(stepwise protocol)을 실시하였다.
일괄 처리법 및 단계 처리법의 기본 배지로 100 nM 덱사메타손, 5 ㎍/ml 인슐린, 5 ㎍/ml 트랜스페린, 5 ng/ml 셀레니움, 및 2% 우태아 혈청이 포함된 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지를 사용하였다.
일괄 처리법으로는, 상기의 배지에 온코스타틴 M(OSM) 10 ng/ml, 글루카곤 10-7 M, 니코틴 아마이드 10 mM 및 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 0.1%를 첨가하고 동시에 HGF, EGF 및 FGF-4를 하기 표 1의 1-8번에서 나타낸 것과 같은 조건(1번(HGF, EGF 및 FGF-4 미첨가), 2번(FGF-4 첨가), 3번(EGF 첨가), 4번(EGF 및 FGF-4 첨가), 5번(HGF 첨가), 6번(HGF 및 FGF-4 첨가), 7번(HGF 및 EGF 첨가), 8번(HGF, EGF 및 FGF-4 첨가))으로 첨가하여 한번에 간세포를 유도 및 성숙시키는 방법으로 8주 동안 37℃에서, 100% 상대습도에서, 5%의 이산화탄소를 포함하는 대기조건에서 배양하였다.
단계 처리법으로는, 기본 배지에 HGF 20 ng/ml, EGF 10 ng/ml, FGF-4 20 ng/ml를 하기 표 1의 1-8번에서 나타낸 것과 같은 조건에 따라 첨가하여 4주 동안 37℃에서, 100% 상대습도에서, 5%의 이산화탄소를 포함하는 대기조건 하에서 배양 하여 간세포를 유도하고, 후속하여 온코스타틴 M(OSM) 10 ng/ml, 글루카곤 10-7 M, 니코틴 아마이드 10 mM, 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 0.1%가 첨가된 기본 배지에서 4주 동안 37℃에서, 100% 상대습도에서, 5%의 이산화탄소를 포함하는 대기조건 하에서 배양하여 간세포를 성숙시켰다.
Figure 112007091041916-pat00001
실시예 4: 간세포로의 분화 결과
형태학적 분화
실시예 3에서 처리한 방법에 따른 결과를 형태학적으로 확인하기 위하여 역광현미경으로 촬영하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 그중 일괄 처리법으로 처리한 경우에는 섬유모세포 유사 형태를 여전히 유지하였으며, 단계 처리법으로 처리한 경우 중 2, 3, 6, 7번만 형태학적으로 간세포와 유사하게 변화하였다.
싸이토케라틴 18의 발현능
배양된 세포를 커버글라스 위에서 4% 파라포름알데히드로 30분간 고정하고 1차 항체인 항-CK18 항체(DAKO, USA)와 반응시킨 후 인비젼(Envision+; DAKO, USA)으로 면역세포화학검사를 수행함으로써 싸이토케라틴 18의 발현여부를 확인하였다. 도 5에 도시된 바와 같이 단계 처리법 6번의 조건에 의해 제조된 세포에서만 싸이토케라틴 18(cytokeratin 18, CK18)이 발현됨을 알 수 있었다.
우레아 합성능 및 암모니아 제거능
또한 본 발명의 일괄 처리법 및 단계 처리법 모두에서 다이메틸 설폭사이드(DMSO)의 첨가 여부에 따른 우레아 합성능과 암모니아 제거능을 화학적으로 분석하였는데, 1mM 암모니아가 포함된 MEM(Minimum essential medium) 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 배지를 회수하여 각각 우레아 및 암모니아 키트(아산제약)로 측정하였다. 우레아 합성능 분석의 경우, 3 ml의 발색시약(1/6의 다이아세틸모노옥심(diacetylmonoxime, 6 g/L)과 티오세미카바사이드(thiosemicarbaxide, 0.3 g/L) 및 5/6의 5 M H3PO4 혼합액)에 100 μL의 표준액 또는 시료액을 넣고 잘 혼합한 후, 100℃에서 10분 동안 가열하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 후 표준액을 기준으로 우레아 농도를 계산하였다. 암모니아 합성능 분석의 경우, 160 μL의 표준액 또는 시료액에 640 μL의 소듐 텅스테이트(sodium tungstate, 100 g/L)를 첨가한 후, 페놀(10 g/L) 및 나이트로푸루사이드(nitroprusside, 50 mg/L)가 포함된 발색시약 I과 NaOH(5 g/L), NaHPO4·12H2O(53.6 g/L), 소듐 하이포클로라이트(sodium hypochlorite, 1%)가 포함된 발색시약 II를 첨가한 후, 37℃에서 20분 동안 반응시켜 발색하고 630 nm에서 흡광도를 측정하여 표준액을 기준으로 암모니아 농도를 계산하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6에 도시된 바와 같이, 우레아의 농도가 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 처리한 단계 처리법 6번의 조건에서 가장 높은 것으로 나타났다. 이로부터 우레아 합성능을 유지시키는데는 다이메틸 설폭사이드가 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었다.
도 7에 도시된 바와 같이, 암모니아 농도는 단계 처리법 6번의 조건에서 가장 낮은 것으로 확인되어, 단계 처리법 6번의 조건에 의해 제조된 세포가 암모니아 제거능이 가장 뛰어난 것을 알 수 있었다.
알부민 합성능, 싸이토크롬 P450 1B1 및 XBP-1의 발현능
단계 처리법 6번의 조건으로 제조된 세포에 트리졸 시약(Gibco BRL, USA)을 처리하여 전령 리보핵산(messenger RNA, mRNA)을 회수 및 분리하여 알부민 프라이머(F:TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGG; 서열번호 1, R:AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC; 서열번호 2), 싸이토크롬 P450 1B1 프라이머(F:GAGAACGTACCGGCCACTATCACT; 서열번호 3, R:GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT; 서열번호 4) 및 XBP-1 프라이머(F:GAGTAGCAGCTCAGA CTGCC; 서열번호 5, R:GTAGACCTCTGGGAGCTCCT; 서열번호 6)를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 알부민, 싸이토크롬 P450 1B1 및 XBP-1의 발현을 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
따라서, 본 발명의 방법에 따라 중간엽 줄기세포를 실제 간세포와 유사하게 간-특이기능을 갖는 간세포로 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
도 1은 탯줄의 왓튼 젤리로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 외식법으로 일차 배양한 0세대 및 계대 배양한 10세대의 세포의 사진이다.
도 2a는 탯줄의 왓튼 젤리로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 형태학적으로 확인한 사진이다.
도 2b는 탯줄의 왓튼 젤리로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 CD90, CD73, CD105로 유세포 분석(FACS)을 통해 확인한 결과이다.
도 2c는 탯줄의 왓튼 젤리로부터 분리한 중간엽 줄기세포가 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화한 것을 확인한 결과이다.
도 2d는 탯줄의 왓튼 젤리로부터 분리한 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화하는지 확인하기 위하여 뉴로필라멘트(NF), 글라이알 파이브릴라 에시딕 프로테인(GFAP) 및 S-100으로 면역 형광염색한 사진이다.
도 3은 일괄 처리법 및 단계 처리법을 도식화한 그림이다.
도 4는 실시예 3에서 처리한 조건에 따른 결과를 형태학적으로 확인한 사진이다.
도 5는 실시예 3에서 처리한 조건에 따른 싸이토케라틴 18의 발현 유무를 나타낸 사진이다.
도 6은 일괄 처리법 및 단계 처리법에 따른 중간엽 줄기세포의 DMSO 첨가 유무에 대한 우레아 합성능을 화학적으로 분석한 그래프이다.
도 7은 단계 처리법에 따른 중간엽 줄기세포의 암모니아 제거능을 화학적으 로 분석한 그래프이다.
도 8는 알부민, CYP1B1, XBP-1 및 GAPDH의 발현여부를 확인하기 위해 표 1의 조건 6에서 단계 처리법에 의해 제조된 세포를 면역 형광염색한 사진이다.
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for preparation of hepatocytes with liver-specific functions using mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived hepatocytes prepared thereby <130> FPD/200709-0068 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin primer for rt-pcr <400> 1 tgcttgaatg tgctgatgac aggg 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin primer for rt-pcr <400> 2 aaggcaagtc agcaggcatc tcatc 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cytochrome P450 1B1 primer for rt-pcr <400> 3 gagaacgtac cggccactat cact 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cytochrome P450 1B1 primer for rt-pcr <400> 4 gttaggccac ttcagtgggt catgat 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP-1 primer for rt-pcr <400> 5 gagtagcagc tcagactgcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP-1 primer for rt-pcr <400> 6 gtagacctct gggagctcct 20

Claims (10)

  1. (1) 중간엽 줄기세포를 세포증식 배지에서 배양하는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 배양된 세포를 간세포 성장인자(HGF) 및 섬유모세포 성장인자-4(FGF-4)가 첨가된 혈청 배지에서 배양하여 간세포로 유도시키는 단계; 및
    (3) 단계 (2)에서 유도된 세포를 온코스타틴 엠(Oncostatin M), 글루카곤, 니코틴 아마이드 및 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)가 첨가된 혈청 배지에서 배양하여 간세포를 성숙시키는 단계를 포함하는,
    알부민 합성능, 암모니아 제거능, 우레아 합성능, 싸이토케라틴 18(CK 18) 합성능, 싸이토크롬 P450 1B1 합성능 및 엑스비피-1(XBP-1) 합성능을 보이는 중간엽 줄기세포 유래 간세포의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    중간엽 줄기세포가 탯줄의 왓튼 젤리로부터 유래된 것임을 특징으로 하는, 간세포의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)에서 세포를 1 내지 10 세대까지 배양하는 것을 특징으로 하는, 간세포의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)에서 세포증식 배지가 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM/F-12, F-12, McCoy's 5A, RPMI1640, 윌리엄 배지 E(Williams' medium E) 또는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지인 것을 특징으로 하는 간세포의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)에서 세포증식 배지가 우태아 혈청이 첨가된 DMEM 배지인 것을 특징으로 하는, 간세포의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    단계 (2) 및 단계 (3)의 혈청 배지가 우태아 혈청, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페 린 및 셀리니움이 첨가된 IMDM 배지인 것을 특징으로 하는, 간세포의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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