KR100994422B1 - Broad host range disease resistance gene OsRBI1 and use thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 광역기주 병 방어 유전자 OsRBI1 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsRBI1 폴리펩티드의 세포내 수준을 조절하여 식물의 병-저항성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 따라 제조된 식물에 관한 것이다. 본 발명의 OsRBI1은 식물의 병-저항성에 관여하며, NPR1 등과 상호작용하여 여러 하위 유전자의 발현을 촉진한다. 따라서, 본 발명의 OsRBI1의 세포내 수준을 조절하는 경우 식물의 병-저항성을 증진할 수 있으며, 병-저항성이 증진된 식물 및 이의 종자를 얻을 수 있다.The present invention relates to the rice broad host disease defense gene OsRBI1 and its use, and more particularly, to a method for enhancing the disease-resistance of plants by controlling intracellular levels of OsRBI1 polypeptides having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, It relates to a plant produced according to the method. OsRBI1 of the present invention is involved in plant disease-resistance and interacts with NPR1 and the like to promote the expression of several subgenes. Therefore, when controlling the intracellular level of OsRBI1 of the present invention can improve the disease-resistance of the plant, it is possible to obtain a plant and its seeds with improved disease-resistance.

벼, OsRBI1 ,광역기주 병저항성, 형질전환 Rice, OsRBI1, broad host disease resistance, transformation

Description

벼 광역기주 병방어 유전자 ＯｓＲＢＩ1 및 이의 용도{Broad host range disease resistance gene OsRBI1 and use thereof}Broad host range disease resistance gene OsRBI1 and use approximately

본 발명은 벼 광역기주 병 방어 유전자 OsRBI1 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsRBI1 폴리펩티드의 세포내 수준을 조절하여 식물의 병-저항성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 따라 제조된 식물에 관한 것이다. The present invention relates to the rice broad host disease defense gene OsRBI1 and its use, and more particularly, to a method for enhancing the disease-resistance of plants by controlling intracellular levels of OsRBI1 polypeptides having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, It relates to a plant produced according to the method.

작물은 생육기간 중 여러 종류의 병원균 공격을 받아 수량감소, 품질저하 등의 피해를 받는다. 종자를 식용으로 이용하는 작물에서 병원균이 감염된 종자는 병원균오염으로 소비자의 건강에도 문제가 될 뿐 아니라 다음세대의 작물 재배 시 병발생의 원인이 되기도 한다. 작물은 다양한 환경에서 계속 살아남기 위해 방어시스템이 진화되어 왔으며 그중 병원균에 의해 침입을 받으면 식물체는 저항성 시스템에 관련된 유전자의 발현이 작동된다.Crops are attacked by various pathogens during the growing season and are damaged by yield and quality deterioration. Seeds infected with pathogens in crops that use seeds as food are not only a health problem for consumers due to pathogen contamination, but also cause disease in the next generation of crops. Crops have evolved their defense systems to survive in a variety of environments, among which, when invaded by pathogens, plants activate the expression of genes related to the resistant system.

한편, 병충해에 의한 농작물의 손실은 인류 농업생산의 20%에 달한다. 이에, 병에 대한 저항성을 높이고자 품종육성으로 저항성 품종을 개발하고자 하였으나 유전적으로 유사한 품종들이 저항성 모본으로 사용되어 저항성인자가 다양하지 못하다. 육성되어 널리 재배되는 작물은 특정 저항성 유전자가 도입된 품종으로서 쉽게 저항성이 무너지는 사례가 많았다. 따라서 작물의 방어기작을 증진시키고 병저항성을 지속적으로 유지하고자 작물의 병 방어에 관련된 마스터 스위치 (master switch) 유전자를 이용하여 병저항성 작물을 개발하고 실용화하려는 노력이 있어왔다.Meanwhile, crop losses due to pests account for 20% of human agricultural production. Therefore, in order to increase resistance to disease, we tried to develop resistant varieties by breeding varieties, but genetically similar varieties are used as a resistance model and resistance factors are not varied. The crops grown and widely cultivated are varieties with specific resistance genes, and in many cases, resistance is easily broken down. Therefore, there have been efforts to develop and put into practice crop-resistant crops by using master switch genes related to crop defense in order to improve crop defense mechanisms and maintain disease resistance.

이에 본 발명자들은 식물의 광역기주 병-저항성에 관여하는 새로운 인자를 찾기 위해 연구를 거듭한 결과, 식물의 병-저항성의 증진에 관여하는 신규의 유전자를 찾아내고 이를 이용하여 식물의 병-저항성을 증진하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors conducted a study to find a new factor involved in the plant-wide disease-resistance of the plant, and as a result, finds a new gene involved in the improvement of the disease-resistance of the plant and uses the disease-resistance of the plant. The present invention has been completed by developing a method of promoting it.

따라서 본 발명의 목적은 광역의 병원균에 대하여 방어효과를 나타내는 OsRBI1 폴리펩티드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide OsRBI1 polypeptides and their use which have a protective effect against widespread pathogens.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 OsRBI1 폴리펩티드의 세포내 수준을 조절하여 식물의 병-저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for improving the disease-resistance of plants by controlling the intracellular level of OsRBI1 polypeptide.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 OsRBI1 폴리펩티드의 세포내 수준이 조절되도록 과발현시키는 발현 벡터로 식물을 형질전환시켜 병-저항성이 증진된 식물의 제조방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for producing a plant having enhanced disease resistance by transforming the plant with an expression vector that overexpresses the intracellular level of OsRBI1 polypeptide to be regulated.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 병-저항성이 증진된 식물의 제조방법으로 제조된 식물을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a plant prepared by the method for producing a plant having improved disease resistance.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a plant seed obtained from the plant.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail.

본 발명은 OsRBI1의 세포내 수준(level)을 조절하여 식물의 병-저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for enhancing disease-resistance of a plant by regulating the intracellular level of OsRBI1.

본 발명의 OsRBI1 (Oryzae sativa RBI1, Rice blast induced gene 1)은 332개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드로서 식물이 병원균에 대하여 저항하는 데에 관여하며, 종래에 병 저항성 신호전달과정에서 주요 조절자로 알려진 NPR1과 상호작용하여 병원균과 관련된 유전자(pathogenesis-related gene)의 발현에 관여한다. 이러한 OsRBI1의 기능은 본 발명자들에 의해 최초로 밝혀진 것이다. OsRBI1은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. OsRBI1 (Oryzae sativa RBI1, Rice blast induced gene 1) of the present invention is a polypeptide consisting of 332 amino acids, which is involved in the resistance of plants to pathogens, and is mutually associated with NPR1, which is known as a major regulator in pathogenic signaling. It is involved in the expression of pathogenesis-related genes. This function of OsRBI1 was first revealed by the inventors. OsRBI1 is preferably a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

한편, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 OsRBI1과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 식물의 병-저항성에 관여하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 OsRBI1의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 OsRBI1의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP(Green Fluorescent Protein)와　같은　다른　단백질과　융합으로　만들어진　융합단백질　등이 이에 포함된다. On the other hand, the polypeptide may be a functional equivalent to the polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The term 'functional equivalent' refers to a sequence homology with at least 60%, preferably 70%, more preferably 80% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO. 1 as a result of the addition, substitution or deletion of amino acids. A polypeptide exhibiting substantially homogeneous activity with OsRBI1 of the present invention. Here, 'substantially homogeneous activity' means to be involved in the disease-resistance of the plant. Such functional equivalents include, for example, amino acid sequence variants in which some of the amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted or added. Substitutions of amino acids are preferably conservative substitutions. Examples of conservative substitutions of amino acids present in nature are as follows; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn ) And sulfur-containing amino acids (Cys, Met). Deletion of amino acids is preferably located in portions not directly involved in the activity of OsRBI1 of the present invention. The functional equivalents also include polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide have been modified while maintaining the basic backbone of OsRBI1 and its physiological activity. For example, fusion proteins made by fusion with other proteins, such as Green Fluorescent Protein (GFP), while maintaining structural alterations and physiological activities to alter the stability, shelf life, volatility or solubility of the polypeptides of the present invention. .

상기 ‘병-저항성’이란 식물체가 병원성 세균, 균, 바이러스 등에 대한 방어를 나타내며, 구체적으로 증상의 완화로 병변의 감소, 생장 저해의 감소, 병 감염속도의 저하, 병 진행속도의 저하 등의 효과를 나타내는 것을 말한다. 상기에서 식물체에 대한 병원성 세균, 균, 바이러스는 이에 한정되지는 않으나, 도열병균(Magnaporthe grisea), 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 담배 역병균 (Phytophthora nicotianae)일 수 있다.The term 'disease-resistant' refers to the defense of pathogenic bacteria, bacteria, viruses, and the like, and specifically, the effect of the reduction of lesions, the inhibition of growth, the reduction of disease infection rate, the progression of disease, etc., by the relief of symptoms. Say that. The pathogenic bacteria, bacteria, and viruses for the plant may be, but are not limited to, Magnaporthe grisea, Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, and Phytophthora nicotianae.

　　

상기 ‘세포내 수준’이란 세포내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 세포내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1 또는 서열번호 1에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자 의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1 또는 서열번호 1에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다.The 'intracellular level' refers to the amount present in the cell, which can be adjusted by various methods known to those skilled in the art. For example, but not limited to, intracellular levels can be regulated through regulation at the transcriptional stage or regulation at the post-transcriptional stage. Modulation at the transcriptional stage can be achieved by a method for enhancing expression of a gene known to those skilled in the art, for example, by preparing a recombinant expression vector linking a gene encoding a functional equivalent to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 1 to a promoter. It may be carried out by a method of enhancing the expression of the gene or by inserting an expression control sequence to enhance the expression of the gene around the gene encoding the functional equivalent to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 1.

상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy , 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제 5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. The term 'promoter' refers to a DNA sequence that regulates the expression of a nucleic acid sequence operably linked in a particular host cell. 'Operably linked' means that one nucleic acid fragment is combined with another nucleic acid fragment. Its function or expression is affected by other nucleic acid fragments. In addition, it may further comprise any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation. The promoter may be a promoter (constitutive promoter) to induce the expression of the gene of interest at all times at all times or a promoter (inducible promoter) to induce the expression of the gene of interest at a specific position, time, for example, SV40 promoter , CMV promoter, CAG promoter (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108: 193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy , 7: 24-30, 2000), CaMV 35S promoter (Odell et al ., Nature 313: 810-812, 1985), Rsyn7 promoter (US Patent Application Serial No. 08 / 991,601), rice actin promoter (McElroy et. al ., Plant Cell 2: 163-171, 1990), ubiquitin promoter (Christensen et al ., Plant Mol. Biol. 12: 619-632, 1989) and ALS promoters (US Patent Application No. 08 / 409,297). In addition, U.S. Patents 5,608,149; Promoters disclosed in 5,608,144 5,604,121 5,569,597 5,466,785, 5,399,680 5,268,463, 5,608,142, and the like can all be used.

전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 1에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다Modulation at the post-transcriptional stage is a method for enhancing protein expression known to those of skill in the art, for example, to enhance the stability of mRNA transcribed with a gene encoding a functional equivalent to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 1. It may be carried out by a method, a method of enhancing the stability of the protein or polypeptide or a method of enhancing the activity of the protein or polypeptide.

바람직하게는 본 발명에서 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 이와 동등물의 세포내 수준을 조절하는 것은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가시키는 방법은 각각 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 이와 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시킬 수 있다. 이 때 상기 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 이와 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.Preferably, in the present invention, adjusting the intracellular level of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 or the equivalent thereof may be performed by a method of increasing the expression of the polynucleotide encoding the polypeptide. Each of these methods of increasing may use methods known to those skilled in the art, but for example, a recombinant expression vector may be prepared by linking a promoter having a polypeptide of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the equivalent thereof to enhance its expression. Can be. In this case, the polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 or an equivalent thereof may preferably have a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명의 OsRBI1는 NPR1과 상호작용하며, 병-저항성과 관련된 유전자의 발현을 촉진하여 식물의 병-저항성을 증진시킨다.OsRBI1 of the present invention interacts with NPR1 and promotes plant-resistance by promoting expression of genes associated with disease-resistance.

상기 식물은 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스일 수 있다. The plant is not limited thereto, but rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, red beans, oats, sorghum, baby pole, cabbage, radish, red pepper, strawberries, tomatoes, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, Green onions, onions, carrots, ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, beets, perilla, peanuts, rapeseed, apple trees, pears, jujube trees, peaches, leeks, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots, bananas , Roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies, tulips, lygras, red clover, orchardgrass, alphaalpha, tolsque cue or perennialgrass.

상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 OsRBI1은 식물의 병-저항성에 관여하므로 본 발명은 OsRBI1을 과발현시키는 발현 벡터를 제조하는 단계 및 상기 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 병-저항성이 증진된 식물의 제조방법을 제공한다. As described above, since OsRBI1 of the present invention is involved in the disease-resistance of plants, the present invention provides a disease-resistant method comprising preparing an expression vector overexpressing OsRBI1 and transforming the plant with the expression vector. Provided are methods for producing enhanced plants.

본 발명에서 OsRBI1을 과발현시키는 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아 침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있으며, 더 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법을 이용할 수 있다. 이 때 상기 폴리뉴클레오티드는 형질전환된 식물에서 발현될 수 있도록 프로모터에 작동가능하게 연결된 상태, 예를 들면 프로모터와 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터의 형태일 수 있다.In the present invention, transforming a plant with an expression vector overexpressing OsRBI1 may be performed by transformation techniques known to those skilled in the art. Preferably, transformation method using Agrobacterium, microprojectile bombardment, electroporation, PEG-mediated fusion, microinjection, liposome mediation (liposome) mediated method, In planta transformation, Vacuum infiltration method, floral meristem dipping method, Agrobacteria spraying method. More preferably, a transformation method using Agrobacterium can be used. At this time, the polynucleotide may be in the form of a recombinant expression vector operably linked to a promoter, for example, operably linked to a promoter to be expressed in the transformed plant.

상기 발현 벡터는, 이에 한정되지는 않으나, OsRBI1의 과발현을 위하여 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다. 이 때, 상기에서 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.The expression vector may be, but is not limited to, a vector comprising a polynucleotide encoding a promoter and a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 operably linked thereto for overexpression of OsRBI1. In this case, the polynucleotide encoding the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 may preferably have a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

아울러, 본 발명은 상기에서 기재된 병-저항성이 증진된 식물의 제조방법에 따라 제조된 식물을 제공한다.In addition, the present invention provides a plant prepared according to the method for producing a disease-improved plant described above.

상기 식물은 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스일 수 있으며, 식물 전체(whole plant) 뿐만아니라, 그 일부분에 해당하는 식물의 세포, 조직, 기관을 비롯하여, 이들의 액체 배양물, 캘러스, 원형질 배양물 등일 수 있다.The plant is not limited thereto, but rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, red beans, oats, sorghum, baby pole, cabbage, radish, red pepper, strawberries, tomatoes, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, Green onions, onions, carrots, ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, beets, perilla, peanuts, rapeseed, apple trees, pears, jujube trees, peaches, leeks, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots, bananas , Roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies, tulips, lygras, red clover, orchardgrass, alphaalpha, tolsfeque or perennialgrass, as well as parts of the whole plant. Cells, tissues, organs of the plant, as well as their liquid culture, callus, plasma culture and the like.

식물세포의 배양은 식물의 일부를 모체로부터 분리하여 적당한 조건 아래에서 무균적으로 배양하여 생육시키는 것으로 조직 절편의 액체 배양, 조직 절편의 캘러스 배양, 원형질체 배양 등 당업자에게 공지된 어떠한 방식의 것에 의할 수 있으며, 그 배양 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다. Cultivation of plant cells may be carried out by any method known to those skilled in the art, such as separating a part of a plant from a mother and cultivating it aseptically under suitable conditions, such as liquid culture of tissue sections, callus culture of tissue sections, and protoplast culture. The culture conditions and methods may be carried out by conditions and methods known to those skilled in the art.

상기 배양된 식물세포를 식물로 분화시키는 것은 캘러스, 원형질체 형태의 배양된 식물세포를 적당한 조건아래에서 분화를 유도하여 식물의 조직 또는 식물로 분화시키는 것으로 그 분화 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다. Differentiating the cultured plant cells into plants is to induce differentiation of cultured plant cells of callus, protoplast form under appropriate conditions to differentiate into plant tissues or plants. It may be carried out by the method.

아울러, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자(seed)를 제공하여, 식물 종자를 수득하기 위한 재배 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.In addition, the present invention is well known in the art for cultivation methods for obtaining plant seeds by providing plant seeds obtained from the plants.

본 발명의 실시예에서는 OsRBI1 유전자를 선발하기 위하여, 병원균 처리한 벼에서 cDNA 유전자 은행을 작성하여 병원균 특이 발현 유전자은행을 이용해 EST를 분석하고 병원균에 의해 발현되는 특정 유전자를 추출한 다음, 유전자 염기서열분석 및 상동성 분석을 통하여 병방어 유전자로 추정되는 유전자를 선발하고, 이를 흰잎마름병균과 도열병균을 처리하여 발현 키네틱스(kinetics)를 분석하였다. In the embodiment of the present invention, in order to select the OsRBI1 gene, cDNA gene bank was prepared from the pathogen-treated rice, EST was analyzed using a pathogen specific expression gene bank, and the specific gene expressed by the pathogen was extracted, followed by gene sequencing analysis. The genes presumed to be pathogen genes were selected through homology analysis, and the expression kinetics were analyzed by treating the leaf blight and blast bacteria.

상기와 같이 선발된 유전자는 벼에서 흰잎마름병균, CN(Cantharidin), 에테폰(Ethephon). 살리실산 (Salicylic acid) 등이 처리될 때 발현이 증폭되는 유전자로서, "OsRBI1 유전자"로 명명하였다. Genes selected as described above are rice leaf blight bacteria, CN (Cantharidin), Ethephon (Ethephon). As a gene whose expression is amplified when salicylic acid or the like is treated, it is named "OsRBI1 gene."

본 발명의 상기 OsRBI1 유전자는 식물형질전환을 위한 게이트웨이 시스템(Gateway system)의 바이너리 벡터(Binary vector)인 pB7WG2D벡터에 35S promoter의 조절을 받도록 제작하여 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)에 형질전환 후 한국농업미생물자원센터(KACC)에 KACC95062P로 기탁하였다.The OsRBI1 gene of the present invention was produced to be controlled by a 35S promoter in a pB7WG2D vector, which is a binary vector of a gateway system for plant transformation, to Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Agrobacterium tumefaciens LBA4404). After transformation, it was deposited with KACC95062P at Korea Agricultural Microbial Resources Center (KACC).

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). For reference, reference may be made to the above-mentioned nucleotide and protein operations (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Sambrook et al. ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA (1990). )).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 OsRBI1은 식물의 병-저항성에 관여하며, NPR1 등과 상호작용하여 여러 하위 유전자의 발현을 촉진한다. 따라서, 본 발명의 OsRBI1의 세포내 수준을 조절하는 경우 식물의 병-저항성을 증진할 수 있으며, 병-저항성이 증진된 식물 및 이의 종자를 얻을 수 있다.As described above, OsRBI1 of the present invention is involved in the disease-resistance of plants, and interacts with NPR1 and the like to promote the expression of several subgenes. Therefore, when controlling the intracellular level of OsRBI1 of the present invention can improve the disease-resistance of the plant, it is possible to obtain a plant and its seeds with improved disease-resistance.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<< 실시예Example 1> 1>

벼에서 In rice 병방어Defense 전사인자의 선발 Selection of Warrior Factors

<1-1> 벼의 재배 및 시료 채취 방법<1-1> Rice cultivation and sampling method

시료는 암 상태로 28℃ 생장상에서 동진벼 종자를 2 ～ 3일 동안 발아시킨 후 수도용 상토에 파종하여 온실에서 2주간 자란 어린잎을 사용하였다. 본 연구에 사용한 균주는 벼흰잎마름병균 (Xoo 10331과 K3, PSA media; peptone 10 g, Na- glutamate 1 g, sucrose 20 g/ℓ, 30℃에서 2 ～ 3일 배양 후 10⁸/㎖로 희석)과 벼도열병균(Pyricuraria grisea KJ-301과 101, 쌀겨 20 g, sucrose 20 g, agar 24 g /ℓ, 30℃에서 3 ～ 4일 간 배양 후 5 x 10⁵ spore/㎖으로 0.01% Triton X-100에 희석)이며, 스프레이 방법(spray method)에 의해 처리하였다. 처리 후 듀 챔버(Dew chamber, 25℃, dark)에서 24시간 배양 후 온실로 옮겨 배양하면서 시간대별로 샘플링(sampling)하였다.The samples were germinated for 2 to 3 days in the growth of 28 ℃ at 28 ℃ in the dark state, and then seeded in water for the soil was used young leaves grown for 2 weeks in the greenhouse. Strains used in this study is huinip rice blight fungus (Xoo 10331 and K3, PSA media; 10 g of peptone, 1 g of Na-glutamate, 20 g / l of sucrose, diluted to 10 ⁸ / ml after incubation at 30 ° C for 2 to 3 days), Pyricuraria grisea KJ-301 and 101, 20 g of rice bran, sucrose 20 g, agar 24 g / L, incubated for 3 to 4 days at 30 ℃ and diluted in 0.01% Triton X-100 to 5 x 10 ⁵ spore / ㎖) and was treated by the spray method (spray method). After treatment, the cells were sampled at different time periods while incubated in a dew chamber (Dew chamber, 25 ° C., dark) for 24 hours and then transferred to a greenhouse.

<1-2> 벼에서 <1-2> in rice 병방어전사인자의Defense Warrior Factor 선발 및 염기서열 분석 Selection and Sequencing

흰잎마름병균을 가위접종한 후 3시간 된 벼에서 mRNA를 분리하여 다음과 같이 cDNA 라이브러리를 제작하였다: 동진벼 종자를 파종하여 3주 키운 벼에 흰잎마름병균을 가위접종한 것과 병원균을 빼고 물만 접종한 후 22℃의 95%의 항습장치속에 3시간 처리하였다. 이 후 벼의 지상부를 회수하여 액체질소로 마쇄하고 트리졸(Trizol) 시약으로 RNA를 추출하였고 cDNA 유전자 은행작성은 상용의 키트(Stratagene, Lambda ZAP II cDNA synthesis kit 및 Gigapack II gold packaging extract)를 사용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 제작하였다. 트리졸로 분리된 전체 RNA를 oligotex(Qiagen)로 폴리 A⁺ RNA를 분리하고, 분리된 폴리 A⁺ RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 EcoRI 어댑터를 연결(ligation)시키고 XhoI을 처리하여 EcoRI과 XhoI 제한효소 부위를 만들어 EcoRI과 XhoI이 처리된 Uni-zap XR vector에 연결(ligation)시켰다. 이를 In vitro packaging kit (Stratagene사)를 사용하여 패키징(packaging)한 후 E. coli에 감염시켜 파지 타이터(Phage titer)를 측정 한 후 증폭하여 사용하였는데, 측정된 플라크(plaque) 수는 약 만개였다. MRNA was isolated from 3 hours old rice after scissoring the leaf blight germ and the cDNA library was prepared as follows: seeded with Dongjin rice seed, and inoculated with water with germ seed germ, and inoculated with water without the pathogen. After 3 hours in a 95% humidity device of 22 ℃. After that, the rice was harvested, ground with liquid nitrogen, RNA was extracted with Trizol reagent, and cDNA gene bank was prepared using commercial kits (Stratagene, Lambda ZAP II cDNA synthesis kit and Gigapack II gold packaging extract). Was prepared according to the method suggested by the manufacturer. Poly A ⁺ RNA was isolated from oligotex (Qiagen) by total RNA isolated with Trizol, and cDNA was synthesized using the isolated Poly A ⁺ RNA as a template. The EcoRI adapter was linked to the synthesized cDNA and treated with XhoI to create an EcoRI and XhoI restriction enzyme site and ligation to an EcoRI and XhoI treated Uni-zap XR vector. This was packaged using an in vitro packaging kit (Stratagene) and infected with E. coli to measure phage titers and then amplified. The number of plaques measured was approximately 10,000. It was.

제조된 흰잎마름병원균처리 cDNA 라이브러리의 EST를 대량분리하여 염기서열을 분석하고 NCBI에서 Blast 검정을 실시하였다. 얻어진 후보 병방어 관련 유전자(OsRBI1, OsRBI2, OsRBI3)들의 전체길이의 유전자를 분리하기 위하여 OsRBI1에 대해서는 서열번호 3(OsRBI1-F; 5'-ATGGCTGATACAAGTCCAAGGACTG-3') 및 서열번호 4(OsRBI1-R; 5'-TTATTCCCTTGGACGGGCGAGCC-3')의 프라이머를, OsRBI2에 대해서는 서열번호 5(OsRBI2-F; ATGGCAGATGCTAGTTCGAGGAC-3') 및 서열번호 6(OsRBI2-R; 5'-TTACTCCCGTGGCCTAGCAAGC-3')의 프라이머를, OsRBI3에 대해서는 서열번호 7(OsRBI3-F; ATGGCAGATATGAGCCCTAGGAC-3') 및 서열번호 8(OsRBI3-R; CTATTCTTTCGGCCGAGCAAGCC-3')의 프라이머를 각각 제작하여 흰잎마름병균을 처리한 동진벼에서 RT-PCR로 cDNA를 분리하고 염기서열을 조사하였다. The EST of the prepared white leaf blight pathogen-treated cDNA library was subjected to mass separation, and the nucleotide sequence was analyzed and subjected to a Blast assay in NCBI. In order to isolate genes of the full length of the candidate disease-related genes (OsRBI1, OsRBI2, OsRBI3) obtained, SEQ ID NO: 3 (OsRBI1-F; 5'-ATGGCTGATACAAGTCCAAGGACTG-3 ') and SEQ ID NO: 4 (OsRBI1-R; A primer of 5'-TTATTCCCTTGGACGGGCGAGCC-3 '), and a primer of SEQ ID NO: 5 (OsRBI2-F; ATGGCAGATGCTAGTTCGAGGAC-3') and SEQ ID NO: 6 (OsRBI2-R; 5'-TTACTCCCGTGGCCTAGCAAGC-3 ') for OsRBI3 For cDNA, the primers of SEQ ID NO. 7 (OsRBI3-F; ATGGCAGATATGAGCCCTAGGAC-3 ') and SEQ ID NO. The nucleotide sequence was examined.

그 중, 분리된 OsRBI1 유전자는 999 bp의 구조 유전자가 분자량 약 36.8 kDa의 단백질을 코드하는 332개의 아미노산으로 이루어진 것으로 추정되었으며 N 말단 부위에 bZIP 도메인을 지니고 있는 것으로 추정된다.Among them, the isolated OsRBI1 gene is estimated to have a 999 bp structural gene consisting of 332 amino acids encoding a protein having a molecular weight of about 36.8 kDa and a bZIP domain at the N-terminal region.

<< 실시예Example 2> 2>

병원균에 의한 Caused by pathogens OsRBI1OsRBI1 유전자의 발현 유도 확인 Confirmation of gene expression induction

<2-1> 병원균에 의한 <2-1> caused by pathogens OsRBI1OsRBI1 유전자의 발현 확인 Confirmation of gene expression

상기에서 실시예 1에서 분리된 OsRBI1 유전자의 발현이 병원균에 의해 유도되는지 확인하기 위하여, 도열병균(Magnaporthe grisea KJ-301과 KJ-101)과 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo K1과 K3)의 병원성 균주(compatible) 및 비병원성 균주(incompatible)를 각각 벼(동진벼)에 처리한 다음 1, 6, 12, 24, 48시간 후 시료를 채취하여 트리졸로 RNA를 분리하였다. 각 RNA을 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 내지 8 및 액틴에 대해서는 서열번호 9(Actin-F; 5'-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3') 및 서열번호 10(Actin-R; 5'- AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3')의 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 OsRBI 유전자의 발현 여부를 확인하였다.In order to confirm whether the expression of the OsRBI1 gene isolated in Example 1 is induced by a pathogen, Magnaporthe grisea KJ-301 and KJ-101 and Bacterial bacterium (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo K1 and K3 ) Pathogenic strains (compatible) and non-pathogenic strains (incompatible) were treated with rice (dongjinbyeong), respectively, and samples were taken after 1, 6, 12, 24, and 48 hours, and RNA was isolated by trizol. Each RNA is used as a template, and SEQ ID NOs: 9 (Actin-F; 5'-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3 ') and SEQ ID NOs: 10 (Actin-R; 5'- AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3') for the above SEQ ID NOs: 3 to 8 and Actin RT-PCR was performed using primer pairs to confirm the expression of OsRBI gene.

그 결과, 도 1에서 보듯이, OsRBI1 유전자는 병원균 처리 후 1시간부터 발현이 증폭되고 12시간에 최고에 달한 후 유전자의 발현이 감소됨을 관찰하였다.As a result, as shown in Figure 1, the OsRBI1 gene expression was amplified from 1 hour after the pathogen treatment and reached the peak at 12 hours, it was observed that the expression of the gene is reduced.

<2-2> 병원균 및 호르몬 처리에 따른 발현 확인<2-2> Confirmation of expression according to pathogen and hormone treatment

각종 병원균 및 호르몬 처리에 따른 OsRBI1의 발현을 노던 블럿을 통해 다음과 같이 확인하였다: 동진벼에 무처리, Xoo(Xanthomonas oryzae pv . oryzae 10331) 처리, 100 μM BTH(benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothioic acid), 100 μM CN(Cantharadin), 1 mM 에테폰(Ethephon), 100 μM JA(Jasmonic acid), 100 μM SA(Salicylic acid)를 각각 처리하고, 6시간 후 시료를 채취하였다. 액체질소를 이용하여 시료를 곱게 간 후, 2 ㎖ 튜브에 100 ㎎ 넣고, 800 ㎕ TRI-reagent (MRC, USA)를 넣어 시료와 잘 혼합하였다. 200 ㎕ 클로로포름을 첨가하고 잘 섞은 후 12,000 g로 4℃에서 10분간 원심분리 후 상등액을 새 튜브에 옮겼다. 여기에 500 ㎕ 이소프로판올을 넣고 잘 섞은 후 원심분리하고 펠렛에 75% 에탄올 1 ㎖을 넣고 세척한 후 공기 중에서 말렸다. 말린 펠렛은 RNase가 없는 물에 녹인 후 농도를 측정하고 분주하여 -70℃에 보관하면서 필요시 사용하였다. 20 ㎍의 전체 RNA 시료를 전기영동한 후 이를 hybond-N⁺ 멤브레인(Amersham, USA)에 옮기고, OsRBI1 탐침으로 혼성화하였다. The expression of OsRBI1 according to various pathogens and hormones was confirmed by Northern blot as follows: No treatment on Dongjin rice, Xoo ( Xanthomonas oryzae pv . oryzae 10331) treatment, 100 μM BTH (benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid), 100 μM CN (Cantharadin), 1 mM Ethephon, 100 μM Jasmonic acid, 100 μM Each SA (Salicylic acid) was treated, and after 6 hours a sample was taken. After the sample was finely divided using liquid nitrogen, 100 mg was placed in a 2 ml tube, and 800 µl TRI-reagent (MRC, USA) was added and mixed well with the sample. 200 μl chloroform was added and mixed well, followed by centrifugation at 12,000 g for 10 min at 4 ° C. and the supernatant was transferred to a new tube. 500 μl isopropanol was added thereto, mixed well, followed by centrifugation. 1 mL of 75% ethanol was added to the pellet, washed, and dried in air. The dried pellets were dissolved in RNase-free water, measured in concentration, dispensed, and stored at -70 ° C. 20 μg of total RNA samples were electrophoresed and then transferred to hybond-N ⁺ membranes (Amersham, USA) and hybridized with OsRBI1 probes.

그 결과, 도 2에서 보듯이, Xoo, BTH, 에테폰, JA, SA 등 다양한 스트레스에 의해 OsRBI1 유전자가 발현됨을 확인 할 수 있었다. As a result, as shown in Figure 2, it was confirmed that the OsRBI1 gene is expressed by a variety of stress, such as Xoo, BTH, etepon, JA, SA.

<< 실시예Example 3> 3>

OsRBI1OsRBI1 의 과발현 형질전환체의 제조 및 특성 확인And Characterization of Overexpressing Transformants

<3-1> <3-1> OsRBI1OsRBI1 과발현 벡터의 제작 Fabrication of Overexpression Vectors

벡터에 삽입할 수 있도록 상기 서열번호 1의 OsRBI1 유전자의 양 말단에 서 열번호 11(OsRBI1-addF; 5'-AAAAAGCAGGCTATGGCTGATAC-3') 및 서열번호 12(OsRBI1-addR; 5'-AGAAAGCTGGGTTTTATTCCCTTGG-3')의 프라이머를 이용하여 1차 PCR을 수행하고 서열번호 13(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3') 및 서열번호 14(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3') attB1 및 attB2 어댑터 프라이머를 이용하여 2차 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 게이트웨이 시스템(GATEWAY system)을 이용하여 BP clonase (Invitrogen)와 LR clonase (Invitrogen)를 이용하여 35S 프로모터를 포함하는 pB7WG2D 벡터에 삽입하여 OsRBI1/pB7WG2D 벡터를 제작하였다(도 3 참조). SEQ ID NO: 11 (OsRBI1-addF; 5'-AAAAAGCAGGCTATGGCTGATAC-3 ') and SEQ ID NO: 12 (OsRBI1-addR; 5'-AGAAAGCTGGGTTTTATTCCCTTGG-3' at both ends of the OsRBI1 gene of SEQ ID NO: 1 for insertion into a vector Primary PCR using primers) and secondary PCR using SEQ ID NO: 13 (5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 ') and SEQ ID NO: 14 (5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3') attB1 and attB2 adapter primers. It was. The amplified PCR product was inserted into a pB7WG2D vector containing a 35S promoter using BP clonase (Invitrogen) and LR clonase (Invitrogen) using a GATEWAY system to prepare OsRBI1 / pB7WG2D vectors (see FIG. 3). .

<3-2> <3-2> OsRBI1OsRBI1 과발현 형질전환 벼 제작  Manufacture of Overexpressed Transgenic Rice

제조된 OsRBI1/pB7WG2D 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)에 도입한 다음 벼(품종 : 동진)에 다음과 같이 형질전환하였다: 외피를 제거한 벼를 70% 에탄올 25㎖ 넣고 5분간 소독한 후 1/2락스 25㎖ 넣고 15분간 소독하였다. 이를 멸균수 25㎖로 3분씩 4회 헹궈낸 후 다시 1/2락스 25㎖ 넣고 15분간 소독하고 멸균수 25㎖로 3분씩 6회 헹군 다음 약 2시간 가량 건조시켰다. 건조시킨 벼를 2N6배지에 올린 다음 27℃에서 3～4주간 암배양하였다. 캘러스를 선별하여 2N6배지에 올린 다음 27℃에서 4일～1주간 암배양하고 아그로박테리움도 AAM배지에서 혼합하여 OD값을 맞춘 후(OD 1.5～2.0 at 600nm) 아세토실린곤(Acetosylingone, 100nM)을 첨가한다. 캘러스를 아그로박테리움이 혼합된 AAM-AS배지에 혼합하여 20분간 감염시킨 후에 배지를 제거하고 완전 히 마르기전에 2N6-AS배지에 올려놓고 25℃에서 3일간 암배양하였다. 이를 세포탁심(cefotaxime)을 첨가한 멸균수에 넣어 육안으로 아그로박테리움이 보이지 않을 때까지 세척한 다음 2N6-cp배지에서 27℃, 3주간 암배양하였다. 갈변되지 않고 살아남은 캘러스를 2N6-cp배지에서 27℃ 2주간 암배양한 다음 저항성을 띤 캘러스를 MSR 배지에 치상하여 27℃에서 1달간 명배양하였다. 줄기가 나온(shooting) 개체를 MSO 배지에 옮겨 27～29℃/light 조건에서 배양하여 뿌리가 내리고 1주일이 지나면 옮겨 심어 온실에서 배양하여Te(Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., and Kumashiro, T. 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J, 6(2): 271-82.).The prepared OsRBI1 / pB7WG2D vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 and then transformed into rice (variety: Dongjin) as follows: 25 ml of de-skinned rice was added to 25 ml of ethanol for 5 minutes. After disinfection, 25 ml of 1/2 lax was added and sterilized for 15 minutes. This was rinsed four times for three minutes with 25 ml of sterile water, and then 25 ml of 1/2 lax was added again and sterilized for 15 minutes, and rinsed six times for three minutes with 25 ml of sterile water, followed by drying for about 2 hours. The dried rice was placed in 2N6 medium and then cultured at 27 ° C. for 3-4 weeks. Callus was screened and placed on 2N6 medium, then cultured for 4 days to 1 week at 27 ° C. Agrobacterium was also mixed in AAM medium to adjust the OD value (OD 1.5∼2.0 at 600nm), and then acetosylinone (Acetosylingone, 100nM). Add. Callus was mixed with Agro-bacterium mixed AAM-AS medium and infected for 20 minutes, and then the medium was removed and placed on 2N6-AS medium before drying completely, and cultured at 25 ° C. for 3 days. This was added to sterile water added with cefotaxime, washed with naked eyes until no Agrobacterium was visible, and then cultured in 2N6-cp medium at 27 ° C. for 3 weeks. The unchanged callus was cultured in 2N6-cp medium for 2 weeks at 27 ° C for 2 weeks, and then the resistant callus was placed in MSR medium and cultured for 1 month at 27 ° C. The shoots of stems were transferred to MSO medium and cultured at 27∼29 ℃ / light conditions, and after 1 week of rooting, they were transplanted and planted in a greenhouse. ., and Kumashiro, T. 1994. Efficient transformation of rice ( Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J , 6 (2): 271-82.).

그 결과 8개의 형질전환체를 얻었으며, 그 중 하나의 형질전환체(#5 클론)는 생육이 저조하여 고사하였다(도 4 참조).As a result, eight transformants were obtained, and one of the transformants (# 5 clone) was killed due to low growth (see FIG. 4).

상기에서 얻어진 7개의 형질전환체들을 대상으로 구조유전자 부위가 삽입되었는지의 여부를 확인하기 위해 게놈 DNA를 분리하여 이를 주형으로 하고 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 및 서열번호 15(pBIN35S-F; 5'-CAAGGCTTGCTTCACAAACC-3') 및 서열번호 16(pBIN35S-R; 5'-TTATTCCCTTGGACGGGCGAGCC-3')의 pBIN35S 프라이머를 각각 이용하여 PCR로 확인하였다.Genomic DNA was isolated and used as a template to confirm whether the structural gene region was inserted into the seven transformants obtained above, and the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 15 (pBIN35S-F 5'-CAAGGCTTGCTTCACAAACC-3 ') and pBIN35S primers of SEQ ID NO: 16 (pBIN35S-R; 5'-TTATTCCCTTGGACGGGCGAGCC-3') were identified by PCR.

그 결과, 도 5(상위 패널)에서 보듯이, 7개의 형질전환체 모두에서 OsRBI1에 해당하는 밴드가 확인되어 7개의 형질전환체가 모두 OsRBI1를 가지고 있음을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 5 (top panel), a band corresponding to OsRBI1 was confirmed in all seven transformants, indicating that all seven transformants had OsRBI1.

아울러, 형질전환된 클론들에서 OsRBI1가 잘 발현되는지 확인하기 위하여 각각의 형질전환체에서 트리졸(Trizol)을 이용하여 RNA를 분리한 다음 이를 주형으로 하여 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.In addition, in order to confirm that OsRBI1 is well expressed in the transformed clones, RNA was isolated from each transformant using Trizol, and then the primer pairs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were used as templates. RT-PCR was performed using.

그 결과, 도 5(하위 패널)에서 보듯이, #1, #7, #8 클론은 발현이 강하고 #2, #4 클론은 발현이 중간 정도이고 #3과 #6 클론은 발현이 약함을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 5 (lower panel), clones # 1, # 7, and # 8 showed strong expression, # 2 and # 4 clones showed moderate expression, and # 3 and # 6 clones showed weak expression. Could.

<3-3> 형질전환 벼에서 병원성 검정<3-3> Pathogenicity Assay in Transgenic Rice

상기에서 제조한 OsRBI1 과발현 형질전환체를 수도용 상토를 넣은 포트에 파종하여 온실에서 3주간 키웠다. 흰잎마름병균 2종(Xoo KACC 10331(K1) 및 Xoo KACC 10385(K3))을 OD₆₀₀=0.5의 농도로 가위 접종을 하고 14일 후 흰잎마름병균에 의한 병반 길이를 측정하였다. 대조군으로는 야생형인 동진벼를 사용한 것과 병원균이 없는 시료를 처리한 군(mock)을 사용하였다.OsRBI1 overexpressing transformants prepared above were seeded in pots containing tap water and grown in a greenhouse for 3 weeks. Two leaf blight bacteria (Xoo KACC 10331 (K1) and Xoo KACC 10385 (K3)) were inoculated with scissors at a concentration of OD ₆₀₀ = 0.5, and 14 days later, the lesion length was measured by the leaf blight bacteria. As a control group, a wild type Dongjin rice was used and a mock treated sample without pathogens was used.

그 결과, 하기 표 1(단위 : cm)에서 보듯이, 대조군인 동진벼에서는 병반의 길이가 긴 것에 비해 본원발명의 형질전환 벼는 병반 길이가 짧아 흰잎마름병균에 대한 저항성을 가지고 있음을 알 수 있었다.As a result, as shown in Table 1 (unit: cm), it was found that the transgenic rice of the present invention has a short path length in the Jindong rice which is a control group, and has a resistance to the white leaf blight bacteria because of the short path length. .

클론Clone MOCKMOCK Xoo10331(K1)Xoo10331 (K1) Xoo10385(K3)Xoo10385 (K3) Control(wild,동진)-1Control (wild) 00 2525 1515 Control(wild,동진)-2Control (wild) 00 3535 2525 RBI1-1RBI1-1 00 22 22 RBI1-2RBI1-2 00 55 1One RBI1-3RBI1-3 00 22 00 RBI1-4 RBI1-4 00 55 22 RBI1-6RBI1-6 00 1010 1One RBI1-7RBI1-7 00 55 00

<3-4> <3-4> OsRBI1OsRBI1 과발현 형질전환 담배 제조 및 병원성 검정 Overexpressed Transgenic Tobacco Preparation and Pathogenicity Assay

OsRBI1 과발현 형질전환 담배는 다음과 같이 제조하였다: 배양실에서 무균상태로 자란 담배 (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) 잎을 대략 5 x 5 mm 크기로 잘라서 200 ㎕의 아그로박테리움 (Agrobacterium)이 포함된 MSO 액체배지 (MS염 4.3g, sucrose 30 g/l, pH 5.6～5.8)에 넣었다가 암조건에서 2～3일 동안 배양하였다. 배양된 잎 절편을 500 ㎍/㎕의 세포탁심 (cefotaxime)이 포함된 증류수로 2～3회 세척한 후 켈러스-슈트 (callus-shoot) 유도배지(MSO배지에 100㎍ NAA, 1mg BA, 500㎍ 세포탁심, 1 mg 포스피노트리신 (phospinothricin), 0.7% 피토 한천 (phyto agar), pH 5.6)으로 옮기고, 2주마다 새로운 배지로 옮겨 주었다. 유도된 발아는 1.5～2cm 정도 자라면 루트-인덕션 배지 (MSO배지에 250㎍ 세포탁심, 10mg 포스피노트리신, 0.7% 피토 한천, pH 5.6)로 옮겨 주어 형질전환체를 제조하였다. OsRBI1 overexpressing transgenic tobacco was prepared as follows: Tobacco grown aseptically in the culture chamber ( Nicotiana tabacum cv. The Xanthi) leaves were placed in approximately 5 x 5 mm MSO broth cut into a size that contains the Agrobacterium (Agrobacterium) of 200 ㎕ (MS salt 4.3g, sucrose 30 g / l, pH 5.6 ~ 5.8) in a dark condition Incubated for 2-3 days. The cultured leaf sections were washed 2-3 times with distilled water containing 500 μg / μl of cefotaxime, followed by callus-shoot induction medium (100 μg NAA, 1 mg BA, 500 in MSO medium). Μg Cytoxim, 1 mg phosphinothricin, 0.7% phyto agar, pH 5.6) and transfer to fresh medium every two weeks. Induced germination was transferred to root-induction medium (250 μg Celltaxim, 10 mg phosphinothricin, 0.7% phyto agar, pH 5.6) when grown to 1.5 ~ 2cm to prepare a transformant.

제조된 형질전환체는 형질전환 담배의 게놈 DNA를 추출한 후 서열번호 17(bar-F; 5‘-CCGTACCGAGCGCAGGAACC-3’) 및 서열번호 18(bar-R; 5‘-GGCAGCCCGATGACAGCGACCAC-3’) bar 유전자(제초제 저항성 유전자) 특이 프라이머를 이용하여 PCR (중합효소연쇄반응) 방법으로 확인하였다(결과 미도시)The prepared transformants were extracted from genomic DNA of transgenic tobacco, followed by SEQ ID NO: 17 (bar-F; 5'-CCGTACCGAGCGCAGGAACC-3 ') and SEQ ID NO: 18 (bar-R; 5'-GGCAGCCCGATGACAGCGACCAC-3') bar gene. (Herbicide resistance gene) was confirmed by PCR (polymerase chain reaction) method using a specific primer (result not shown)

한편, 포화 상태로 습도가 조절되도록 하고, 멸균된 여지와 함께 형질전환된 담배의 잎을 놓고 잎위에 파이토프토라 니코티아나(Phytophthora nicotianae)균을 접종한 후 3일후 균의 생장 반경을 조사하였다.Meanwhile, the humidity was controlled to be saturated, and the leaves of the transformed tobacco were inoculated with sterilized place and inoculated with Phytophthora nicotianae on the leaves, and the growth radius of the bacteria was examined after 3 days.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 형질전환되지 않은 야생형 담배(Xanthi, Nicotiana tabacum cv. Xanthi) 및 본 발명의 OsRBI1 유전자가 삽입되지 않은 pB7WG2D 벡터로 형질전환한 형질전환체(pBI-5)에서는 병변의 길이가 길게 나오는데 비해, 본원발명의 형질전환체(RBI1(3-1), RBI1(4-1))는 병변의 길이가 감소하여 본원발명의 형질전환 담배는 파이토프토라 니코티아나에 대한 저항성을 가지고 있음을 알 수 있었다.As a result, as shown in Figure 6, in the transformed wild type tobacco (Xanthi, Nicotiana tabacum cv. Xanthi) and transformants (pBI-5) transformed with the pB7WG2D vector not inserted into the OsRBI1 gene of the present invention In contrast to the long length of the present invention, the transformants of the present invention (RBI1 (3-1), RBI1 (4-1)) reduced the length of the lesion, the transgenic tobacco of the present invention is resistant to phytophthora nicotiana I could see that it has.

<< 실시예Example 4> 4>

OsRBI1OsRBI1 의 작용 기작의 확인Confirmation of mechanism of action

<4-1> <4-1> OsRBI1OsRBI1 와 Wow OsNPR1OsNPR1 과의 상호작용 분석Interaction with

병 저항성 신호전달 과정에서 주요 조절자로 알려진 NPR1과 OsRBI1의 상호작용을 분석하기 위하여 이스트-투 하이브리드 시스템을 이용하였다. OsNPR1 유전자에 EcoRI, BamHI 제한효소 부위를 가지는 서열번호 19(OsNPR1-EcoRI; 5'-GAATTCATGCCGGCGCGTAGCGCGG-3') 및 서열번호 20(OsNPR1-BamHI; 5'-GGATCCTCATTTCTTTGCAACCTTG-3')의 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하고 이 산물을 pGEMT-easy 벡터(Promega)에 삽입 한 후 염기서열을 분석하여 확인한 후 두 제한효소로 절단하여 pGBKT7 벡터(Clontech)의 해당 제한효소부위에 삽입하였다. OsRBI1 유전자는 SmaI, BamHI 제한효소 부위를 가지는 서열번호 21(OsRBI1-SmaI; 5'-CCCGGGATGGCTGATACAAGTCCAAGG-3') 및 서열번호 22(OsRBI1-BamHI; 5'-GGATCCTTATTCCCTTGGACGGGCGAG-3')의 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하고 이 산물을 pGEMT-easy 벡터(Promega)에 삽입 한 후 염기서열을 분석하여 확인한 후 두 제한효소로 절단하여 pGADT7 벡터(Clontech)의 해당 제한효소부위에 삽입하였다. 두 벡터 구축물을 각각 대장균 DH5α에 형질전환 하여 얻어진 콜로니에 대하여 각 유전자의 센스 프라이머와 안티센스 프라이머, 즉 OsNPR1에 대해서는 서열번호 23(OsNPR1-F; 5'-ATGCCGGCGCGTAGCGCGGTGGTG-3') 및 서열번호 24(OsNPR1-R; 5'-TCATTTCTTTGCAACCTTGGGAGGTGG-3')의 프라이머를, OsRBI1에 대허슨 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR 및 염기서열을 분석하고 제한효소로 절단하여 두 벡터가 완성되었음을 확인하였다.East-to-hybrid system was used to analyze the interaction of NPR1 and OsRBI1, which are known as key regulators in disease-resistant signaling. Making primers of; '(5'- GGATCC TCATTTCTTTGCAACCTTG-3 OsNPR1-BamHI) and SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: in OsNPR1 gene with EcoRI, BamHI restriction site 19 (OsNPR1-EcoRI 5'- GAATTC ATGCCGGCGCGTAGCGCGG -3)' PCR was carried out, and the product was inserted into the pGEMT-easy vector (Promega), and then analyzed by nucleotide sequence. The fragment was cut by two restriction enzymes and inserted into the corresponding restriction enzyme site of the pGBKT7 vector (Clontech). OsRBI1 gene was prepared by primers of SEQ ID NO: 21 (OsRBI1-Sma; 5'-CCCGGGATGGCTGATACAAGTCCAAGG-3 ') and SEQ ID NO: 22 (OsRBI1-BamHI; 5'-GGATCCTTATTCCCTTGGACGGGCGAG-3') having SmaI and BamHI restriction enzyme sites. The product was inserted into the pGEMT-easy vector (Promega), analyzed by nucleotide sequence, and confirmed by cleavage with two restriction enzymes, and inserted into the corresponding restriction enzyme site of the pGADT7 vector (Clontech). For the colonies obtained by transforming the two vector constructs into E. coli DH5α, respectively, the sense primers and antisense primers of each gene, SEQ ID NO: 23 (OsNPR1-F; 5'-ATGCCGGCGCGTAGCGCGGTGGTG-3 ') and SEQ ID NO: 24 (OsNPR1 -R; 5'-TCATTTCTTTGCAACCTTGGGAGGTGG-3 '), using the primers of Daherson SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in OsRBI1, colony PCR and sequencing were analyzed and digested with restriction enzymes to confirm that the two vectors were completed. It was.

이 두 유전자의 상호작용을 분석하기위해 이스트 AH109에 형질전환하여 SD/ Trp, Leu, His w/o의 선택배지에서 배양한 결과, 다수의 콜로니를 확인하였다. 얻어진 콜로니들 중에서 상호작용을 확인하기 위하여 X-gal이 첨가된 SD/ Trp, Leu, His, Ade w/o의 선택배지에서 배양하여 β-갈락토시다아제 활성을 가지는 콜로니를 선별하였다. In order to analyze the interaction between these two genes, yeast AH109 was transformed and cultured in a selection medium of SD / Trp, Leu, and His w / o. In order to confirm the interaction among the obtained colonies, colonies having β-galactosidase activity were selected by culturing in X / gal-added SD / Trp, Leu, His, Ade w / o medium.

그 결과, 도 7에서 보듯이, RBI1 및 NPR1을 각각 포함하고 있는 pGADT7-RBI1 벡터 및 pGBKT7-NPR1 벡터로 형질전환된 경우 효모가 생장하여 RBI1 및 NPR1 단백질이 서로 상호작용을 하는 것을 알 수 있었다(양성 대조군 : pGADT7-T/pGBKT7-53; 음성대조군 : pGADT7-T/pGBKT7-Lam, pGADT7/pGBKT7)As a result, as shown in Figure 7, it was found that when transformed with pGADT7-RBI1 vector and pGBKT7-NPR1 vector containing RBI1 and NPR1, yeast grows and RBI1 and NPR1 proteins interact with each other ( Positive control group: pGADT7-T / pGBKT7-53; negative control group: pGADT7-T / pGBKT7-Lam, pGADT7 / pGBKT7)

<4-2> <4-2> OsRBI1OsRBI1 유전자의 과발현 벡터 제작 및  Gene overexpression of genes and OsRBI1OsRBI1 의 발현Expression of

OsRBI1 유전자를 6개의 히스티딘을 암호화하는 히스티딘 태그(His tag)과 융합되도록 BamHI과 KpnI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 25(OsRBI1-BamHI; 5'-GGATCCATGGCTGATACAAGTCCAAGG-3') 및 서열번호 26(OsRBI1-KpnI; 5'-GGTACCTTATTCCCTTGGACGGGCGAG-3')의 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하고 이 산물을 pGEMT-easy 벡터(Promega)에 삽입 한 후 염기서열을 분석하여 확인한 후 두 제한효소로 절단하여 pQE30 벡터(Qiagen)의 해당 제한효소 부위에 클로닝하여 형질전환 벡터(OsRBI1/pQE30 벡터)를 제조하고 이를 대장균 M15에 도입하였다.SEQ ID NO: 25 (OsRBI1-BamHI; 5'-GGATCCATGGCTGATACAAGTCCAAGG-3 ') and SEQ ID NO: 26 (OsRBI1-) containing a BamHI and KpnI restriction site to fuse the OsRBI1 gene with a histidine tag encoding six histidines PCR was performed by preparing primers of KpnI; 5'-GGTACCTTATTCCCTTGGACGGGCGAG-3 '), and the product was inserted into the pGEMT-easy vector (Promega), and then analyzed by sequencing. The transformation vector (OsRBI1 / pQE30 vector) was prepared by cloning to the corresponding restriction enzyme site of E. coli and introduced into E. coli M15.

한편, OsNPR1 유전자(Genbank Accession No. NM_001050898.1)를 GST와 융합되도록 BamHI과 SmaI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 27(OsNPR1-BamHI; 5'-GGATCCATGCCGGCGCGTAGCGCGG-3') 및 서열번호 28(OsNPR1-SmaI; 5'-CCCGGGTCATTTCTTTGCAACCTTG-3')를 제작하여 PCR을 수행하고 이 산물을 pGEMT-easy 벡터(Promega)에 삽입한 후 염기서열을 분석하여 확인한 후 두 제한효소로 절단하여 pGEX4T-1 벡터(Amersham)의 해당 제한효소부위에 클로닝하여 형질전환 벡터(pGEX4T-1/NPR1 벡터)를 제조하고 이를 대장균 BL21에 도입하였다.On the other hand, the SEQN 27 (OsNPR1-BamHI; 5'-GGATCCATGCCGGCGCGTAGCGCGG-3 ') and SEQ ID NO: 28 (OsNPR1- gene containing the BamHI and SmaI restriction enzyme sites to fuse the OsNPR1 gene (Genbank Accession No. NM_001050898.1) with GST PCR was performed by constructing SmaI; 5'-CCCGGGTCATTTCTTTGCAACCTTG-3 '), inserting the product into the pGEMT-easy vector (Promega), analyzing the nucleotide sequence, and confirming by cleavage with two restriction enzymes. ) Was transformed into the corresponding restriction enzyme site to prepare a transformation vector (pGEX4T-1 / NPR1 vector) and introduced into E. coli BL21.

각각의 형질전환된 대장균을 LB 배지, 37℃에서 배양하고, OD₆₀₀=0.5 정도일때, IPTG 10 mM을 처리하여 각각의 단백질을 발현시켰다. 발현된 OsRBI1 및 OsNPR1 단백질을 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 분리하였다(도 8 참조)Each transformed E. coli was cultured in LB medium, 37 ℃, and when the OD ₆₀₀ = 0.5 or so, treated with IPTG 10 mM to express each protein. Expressed OsRBI1 and OsNPR1 proteins were separated using a Ni-NTA column (see FIG. 8).

<4-3> <4-3> OsRBI1OsRBI1 와 Wow NPR1NPR1 단백질과의 상호작용 확인 Confirm interaction with protein

상기 실시예 4-2에서 분리한 OsRBI1 단백질 및 OsNPR1 단백질이 서로 결합하는지를 풀다운 분석(pulldown assay)을 통해서 확인하였다(Moon, H.J., Lee, B.Y., Choi, G.T., Shin, D.J., Theertha Prasad, Lee, O.S., Kwak, S.S., Kim, D.H., Nam, J.S., Bahk, J.D., Hong, J.C., Lee, S.Y., Cho, M.J., Lim, C.O. and Yun, D.J. (2003) NDP kinase 2 interacts with two oxidative stress-activated MAPKs to regulate cellular redox state and enhances multiple stress tolerance in transgenic plants. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 100, 358-363). Whether the OsRBI1 protein and OsNPR1 protein isolated in Example 4-2 bind to each other was confirmed by a pulldown assay (Moon, HJ, Lee, BY, Choi, GT, Shin, DJ, Theertha Prasad, Lee, OS, Kwak, SS, Kim, DH, Nam, JS, Bahk, JD, Hong, JC, Lee, SY, Cho, MJ, Lim, CO and Yun, DJ (2003) NDP kinase 2 interacts with two oxidative stress-activated MAPKs to regulate cellular redox state and enhances multiple stress tolerance in transgenic plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 358-363).

그 결과, 도 9에서 보듯이, OsRBI1이 OsNPR1 단백질과 결합하는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 점을 종합하면, 본원발명의 OsRBI1 단백질이 NPR1 단백질과 상호작용하여 하부유전자들의 발현을 조절하며, 결과적으로 식물의 병저항성을 증진시키는 것으로 생각된다.As a result, as shown in Figure 9, it was found that OsRBI1 binds to OsNPR1 protein. Taken together, it is thought that the OsRBI1 protein of the present invention interacts with the NPR1 protein to regulate the expression of subgenes and consequently enhance the disease resistance of plants.

<4-4> 형질전환체의 유전자 발현 패턴 확인<4-4> Confirmation of Gene Expression Pattern of Transformant

본원발명의 OsRBI1 유전자의 발현으로 형질전환체에서 어떠한 유전자의 발현이 증진되는지를 알아보기 위하여, 얻어진 형질전환체 중 발현이 강했던 #1번 클론과 대조군으로 야생형 벼(동진벼)를 이용하여 마이크로어레이(microarray) 분석으로 유전자 발현 패턴을 확인하였다.In order to find out which gene expression is enhanced in the transformant by the expression of OsRBI1 gene of the present invention, clone # 1, which was strongly expressed in the transformant, and a microarray using wild-type rice (Dongjin rice) as a control. Microarray analysis confirmed the gene expression pattern.

형질전환체 #1 클론과 동진벼를 온실에서 3주간 키운후 지상부를 각각 채취하여 트리졸을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 전체 RNA에서 mRNA를 분리하고 이들을 이용하여 cy5와 cy3로 표지(labelling)하였다. 이를 affimetrix 벼 cDNA 25K 칩을 이용하여 제조사의 지침에 따라 그 양을 측정하였고, 대조군인 동진벼에 비해서 형질전환체에서 발현이 증폭되는 클론들을 분석하였다. Transformants # 1 clone and Dongjin rice were grown in the greenhouse for 3 weeks, and then the ground portions were collected and RNA was isolated using trizol. MRNA was isolated from the isolated total RNA and labeled with cy5 and cy3 using them. This amount was measured according to the manufacturer's instructions using affimetrix rice cDNA 25K chip, and the clones amplified expression in the transformant compared to the control Dongjin rice.

그 결과, 하기 도 10와 같은 유전자의 발현이 증폭됨을 알 수 있었으며, 다수의 질병 관련 단백질(pathogenesis-related protein)의 발현이 증폭됨을 알 수 있었다.As a result, it was found that the expression of the gene as shown in Figure 10 is amplified, it was found that the expression of a number of disease-related proteins (pathogenesis-related protein) is amplified.

본 발명의 OsRBI1은 식물의 병-저항성에 관여하며, NPR1 등과 상호작용하여 여러 하위 유전자의 발현을 촉진한다. 따라서, 본 발명의 OsRBI1의 세포내 수준을 조절하는 경우 식물의 병-저항성을 증진할 수 있으며, 병-저항성이 증진된 식물 및 이의 종자를 얻을 수 있다.OsRBI1 of the present invention is involved in plant disease-resistance and interacts with NPR1 and the like to promote the expression of several subgenes. Therefore, when controlling the intracellular level of OsRBI1 of the present invention can improve the disease-resistance of the plant, it is possible to obtain a plant and its seeds with improved disease-resistance.

도 1은 벼 OsRBI1 유전자를 도열병균과 흰잎마름병균 처리시 발현 정도를 RT-PCR 분석으로 확인한 결과이다.Figure 1 shows the results of RT-PCR analysis of the expression level of rice OsRBI1 gene when the germ and leprosy bacteria.

도 2는 벼 OsRBI1 유전자를 병원균 여러 화학물질에 의한 발현유도를 노던(Northern) 분석으로 확인한 결과이다. (BTH : benzo-(1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid), CN : Cantharidin, JA : Jasmonic acid, SA : Salicylic acid)Figure 2 is a result of confirming the expression of the rice OsRBI1 gene by various pathogens by Northern (Northern) analysis. (BTH: benzo- (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid), CN: Cantharidin, JA: Jasmonic acid, SA: Salicylic acid)

도 3는 본원발명의 pB7WG2D-OsRBI1 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.Figure 3 shows a schematic diagram of the pB7WG2D-OsRBI1 vector of the present invention.

도 4는 OsRBI1이 도입된 7개의 형질전환 벼의 형태적 모습을 나타낸 것이다.Figure 4 shows the morphological appearance of the seven transgenic rice introduced OsRBI1.

도 5는 형질전환 벼의 OsRBI1 유전자의 함유여부를 게놈 DNA에 대한 PCR로 확인한 것(상위 패널) 및 OsRBI1 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인한 것(하위 패널)이다.5 is confirmed by PCR for genomic DNA containing the OsRBI1 gene of the transformed rice (top panel) and the expression of the OsRBI1 gene by RT-PCR (lower panel).

도 6은 형질전환 담배에서의 병원균의 발병속도를 확인한 것이다.Figure 6 confirms the pathogenesis of pathogens in transgenic tobacco.

도 7은 OsNPR1과 OsRBI1 단백질의 상호작용을 이스트 투-하이브리드(Yeast Two-hybrid)로 확인한 것이다.Figure 7 confirms the interaction of OsNPR1 and OsRBI1 protein by two-hybrid (Yeast Two-hybrid).

도 8은 대장균에서 발현시킨 OsRBI1 단백질 발현 벡터의 모식도와 발현된 단백질을 순수분리한 것을 나타낸 것이다.FIG. 8 shows the schematic diagram of the OsRBI1 protein expression vector expressed in Escherichia coli, followed by pure separation of the expressed protein.

도 9은 OsNPR1 단백질과 OsRBI1 단백질의 상호작용을 풀다운 분석(pulldown assay)로 확인한 것이다.Figure 9 confirms the interaction of OsNPR1 protein and OsRBI1 protein by a pulldown assay (pulldown assay).

도 10은 마이크로어레이 분석을 통해 야생형인 동진벼에 비해서 본원발명의 형질전환체에서 발현이 증폭된 유전자를 탐색한 결과이다.10 is a result of searching for a gene whose expression is amplified in the transformant of the present invention as compared to wild type Dongjin rice through microarray analysis.

<110> Republic of Korea <120> Broad host range disease resistance gene OsRBI1 and use thereof <130> NP08-0038 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 332 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Ala Asp Thr Ser Pro Arg Thr Asp Thr Ser Thr Asp Pro Asp Thr 1 5 10 15 Asp Glu Arg Asn Gln Met Phe Glu Gln Gly Gln Leu Ala Ala Pro Thr 20 25 30 Ala Ser Asp Ser Ser Asp Arg Ser Lys Asp Lys Leu Asp His Lys Thr 35 40 45 Leu Arg Arg Leu Ala Gln Asn Arg Glu Ala Ala Arg Lys Ser Arg Leu 50 55 60 Arg Lys Lys Ala Tyr Ile Gln Asn Leu Glu Ser Ser Arg Leu Lys Leu 65 70 75 80 Thr Gln Ile Glu Gln Glu Leu Gln Arg Ala Arg Gln Gln Gly Ile Phe 85 90 95 Ile Ser Thr Ser Ser Asp Gln Ser His Ser Ala Ser Gly Asn Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Phe Asp Met Glu Tyr Ala Arg Trp Leu Glu Glu His Asn Lys 115 120 125 His Ile Asn Glu Leu Arg Ala Ala Val Asn Ala His Ala Gly Asp Asn 130 135 140 Asp Leu Lys Ser Thr Val Asp Ser Ile Met Ala His Tyr Asn Glu Ile 145 150 155 160 Phe Lys Leu Lys Gly Val Ala Ala Lys Ala Asp Val Phe His Val Leu 165 170 175 Ser Gly Met Trp Lys Thr Pro Ala Glu Arg Cys Phe Met Trp Leu Gly 180 185 190 Gly Phe Arg Ser Ser Glu Leu Leu Lys Leu Leu Ala Gly Gln Leu Glu 195 200 205 Pro Leu Thr Glu Gln Gln Leu Ala Gly Ile Ala Asn Leu Gln Gln Ser 210 215 220 Ser Gln Gln Ala Glu Asp Ala Leu Ser Gln Gly Met Glu Ala Leu Gln 225 230 235 240 Gln Ser Leu Ala Glu Thr Leu Ala Ser Gly Ser Leu Gly Pro Ala Gly 245 250 255 Ser Ser Gly Asn Val Ala Asn Tyr Met Gly Gln Met Ala Met Ala Met 260 265 270 Gly Lys Leu Gly Thr Leu Glu Asn Phe Leu Arg Gln Ala Asp Asn Leu 275 280 285 Arg Leu Gln Thr Leu Gln Gln Met Gln Arg Ile Leu Thr Thr Arg Gln 290 295 300 Ser Ala Arg Ala Leu Leu Ala Ile Ser Asp Tyr Phe Ser Arg Leu Arg 305 310 315 320 Ala Leu Ser Ser Leu Trp Leu Ala Arg Pro Arg Glu 325 330 <210> 2 <211> 999 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 atggctgata caagtccaag gactgataca tcaacagatc cagacactga tgagaggaat 60 cagatgtttg aacaaggaca gttagctgct cccactgctt ctgattctag tgacaggtca 120 aaggacaaac tagatcataa gacacttcgc cgccttgccc aaaatcgtga agctgctagg 180 aaaagccgtt taagaaagaa ggcatatatc caaaaccttg agagtagcag attgaaactt 240 actcagatag agcaagagct tcagcgggct cgtcaacagg gcatttttat atcaacatcg 300 agtgatcagt cccactcagc gagtggaaat ggagctttgg catttgacat ggagtatgca 360 cggtggttgg aggagcataa caaacatata aatgagttga gggctgcagt taatgcacac 420 gctggtgata atgatctcaa aagtacagtt gatagtatta tggcacacta caatgaaatt 480 ttcaagctca agggtgtggc agccaaagca gacgtttttc atgtgctgtc gggaatgtgg 540 aaaacccctg ctgagaggtg cttcatgtgg ctaggtggct tccgatcatc tgagcttctt 600 aagttactgg cagggcaatt agagcctctt acagagcagc agcttgctgg catagccaac 660 ctgcaacaat cctcccaaca ggctgaagat gctctttctc aagggatgga agcactacaa 720 cagtcgcttg cagagaccct ggcatcagga tctctcggcc ctgcaggatc ttctggtaat 780 gttgcaaact acatgggaca aatggcaatg gctatgggga aacttggtac cctagaaaac 840 ttcctacggc aggctgataa tctgcggctt cagactcttc agcaaatgca gcgcatatta 900 accactcgcc agtcagcacg agctctactt gcaataagtg actacttctc ccggcttcgt 960 gccctgagtt ctctttggct cgcccgtcca agggaataa 999 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-F <400> 3 atggctgata caagtccaag gactg 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-R <400> 4 ttattccctt ggacgggcga gcc 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI2-F <400> 5 atggcagatg ctagttcgag gac 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI2-R <400> 6 ttactcccgt ggcctagcaa gc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI3-F <400> 7 atggcagata tgagccctag gac 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI3-R <400> 8 ctattctttc ggccgagcaa gcc 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-F <400> 9 tgctatgtac gtcgccatcc ag 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-R <400> 10 aatgagtaac cacgctccgt ca 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-addF <400> 11 aaaaagcagg ctatggctga tac 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-addR <400> 12 agaaagctgg gttttattcc cttgg 25 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 <400> 13 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 <400> 14 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBIN35S-F <400> 15 caaggcttgc ttcacaaacc 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBIN35S-R <400> 16 ttattccctt ggacgggcga gcc 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bar-F <400> 17 ccgtaccgag cgcaggaacc 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bar-R <400> 18 ggcagcccga tgacagcgac cac 23 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-EcoRI <400> 19 gaattcatgc cggcgcgtag cgcgg 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-BamHI <400> 20 ggatcctcat ttctttgcaa ccttg 25 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-SmaI <400> 21 cccgggatgg ctgatacaag tccaagg 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-BamHI <400> 22 ggatccttat tcccttggac gggcgag 27 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-F <400> 23 atgccggcgc gtagcgcggt ggtg 24 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-R <400> 24 tcatttcttt gcaaccttgg gaggtgg 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-BamHI <400> 25 ggatccatgg ctgatacaag tccaagg 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-KpnI <400> 26 ggtaccttat tcccttggac gggcgag 27 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-BamHI <400> 27 ggatccatgc cggcgcgtag cgcgg 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-SmaI <400> 28 cccgggtcat ttctttgcaa ccttg 25 <110> Republic of Korea <120> Broad host range disease resistance gene OsRBI1 and use <130> NP08-0038 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 332 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Ala Asp Thr Ser Pro Arg Thr Asp Thr Ser Thr Asp Pro Asp Thr   1 5 10 15 Asp Glu Arg Asn Gln Met Phe Glu Gln Gly Gln Leu Ala Ala Pro Thr              20 25 30 Ala Ser Asp Ser Ser Asp Arg Ser Lys Asp Lys Leu Asp His Lys Thr          35 40 45 Leu Arg Arg Leu Ala Gln Asn Arg Glu Ala Ala Arg Lys Ser Arg Leu      50 55 60 Arg Lys Lys Ala Tyr Ile Gln Asn Leu Glu Ser Ser Arg Leu Lys Leu  65 70 75 80 Thr Gln Ile Glu Gln Glu Leu Gln Arg Ala Arg Gln Gln Gly Ile Phe                  85 90 95 Ile Ser Thr Ser Ser Asp Gln Ser His Ser Ala Ser Gly Asn Gly Ala             100 105 110 Leu Ala Phe Asp Met Glu Tyr Ala Arg Trp Leu Glu Glu His Asn Lys         115 120 125 His Ile Asn Glu Leu Arg Ala Ala Val Asn Ala His Ala Gly Asp Asn     130 135 140 Asp Leu Lys Ser Thr Val Asp Ser Ile Met Ala His Tyr Asn Glu Ile 145 150 155 160 Phe Lys Leu Lys Gly Val Ala Ala Lys Ala Asp Val Phe His Val Leu                 165 170 175 Ser Gly Met Trp Lys Thr Pro Ala Glu Arg Cys Phe Met Trp Leu Gly             180 185 190 Gly Phe Arg Ser Ser Glu Leu Leu Lys Leu Leu Ala Gly Gln Leu Glu         195 200 205 Pro Leu Thr Glu Gln Gln Leu Ala Gly Ile Ala Asn Leu Gln Gln Ser     210 215 220 Ser Gln Gln Ala Glu Asp Ala Leu Ser Gln Gly Met Glu Ala Leu Gln 225 230 235 240 Gln Ser Leu Ala Glu Thr Leu Ala Ser Gly Ser Leu Gly Pro Ala Gly                 245 250 255 Ser Ser Gly Asn Val Ala Asn Tyr Met Gly Gln Met Ala Met Ala Met             260 265 270 Gly Lys Leu Gly Thr Leu Glu Asn Phe Leu Arg Gln Ala Asp Asn Leu         275 280 285 Arg Leu Gln Thr Leu Gln Gln Met Gln Arg Ile Leu Thr Thr Arg Gln     290 295 300 Ser Ala Arg Ala Leu Leu Ala Ile Ser Asp Tyr Phe Ser Arg Leu Arg 305 310 315 320 Ala Leu Ser Ser Le Le Trp Leu Ala Arg Pro Arg Glu                 325 330 <210> 2 <211> 999 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 atggctgata caagtccaag gactgataca tcaacagatc cagacactga tgagaggaat 60 cagatgtttg aacaaggaca gttagctgct cccactgctt ctgattctag tgacaggtca 120 aaggacaaac tagatcataa gacacttcgc cgccttgccc aaaatcgtga agctgctagg 180 aaaagccgtt taagaaagaa ggcatatatc caaaaccttg agagtagcag attgaaactt 240 actcagatag agcaagagct tcagcgggct cgtcaacagg gcatttttat atcaacatcg 300 agtgatcagt cccactcagc gagtggaaat ggagctttgg catttgacat ggagtatgca 360 cggtggttgg aggagcataa caaacatata aatgagttga gggctgcagt taatgcacac 420 gctggtgata atgatctcaa aagtacagtt gatagtatta tggcacacta caatgaaatt 480 ttcaagctca agggtgtggc agccaaagca gacgtttttc atgtgctgtc gggaatgtgg 540 aaaacccctg ctgagaggtg cttcatgtgg ctaggtggct tccgatcatc tgagcttctt 600 aagttactgg cagggcaatt agagcctctt acagagcagc agcttgctgg catagccaac 660 ctgcaacaat cctcccaaca ggctgaagat gctctttctc aagggatgga agcactacaa 720 cagtcgcttg cagagaccct ggcatcagga tctctcggcc ctgcaggatc ttctggtaat 780 gttgcaaact acatgggaca aatggcaatg gctatgggga aacttggtac cctagaaaac 840 ttcctacggc aggctgataa tctgcggctt cagactcttc agcaaatgca gcgcatatta 900 accactcgcc agtcagcacg agctctactt gcaataagtg actacttctc ccggcttcgt 960 gccctgagtt ctctttggct cgcccgtcca agggaataa 999 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-F <400> 3 atggctgata caagtccaag gactg 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-R <400> 4 ttattccctt ggacgggcga gcc 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI2-F <400> 5 atggcagatg ctagttcgag gac 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI2-R <400> 6 ttactcccgt ggcctagcaa gc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI3-F <400> 7 atggcagata tgagccctag gac 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI3-R <400> 8 ctattctttc ggccgagcaa gcc 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-F <400> 9 tgctatgtac gtcgccatcc ag 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-R <400> 10 aatgagtaac cacgctccgt ca 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-addF <400> 11 aaaaagcagg ctatggctga tac 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-addR <400> 12 agaaagctgg gttttattcc cttgg 25 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 <400> 13 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 <400> 14 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBIN35S-F <400> 15 caaggcttgc ttcacaaacc 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBIN35S-R <400> 16 ttattccctt ggacgggcga gcc 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bar-F <400> 17 ccgtaccgag cgcaggaacc 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bar-R <400> 18 ggcagcccga tgacagcgac cac 23 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-EcoRI <400> 19 gaattcatgc cggcgcgtag cgcgg 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-BamHI <400> 20 ggatcctcat ttctttgcaa ccttg 25 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-SmaI <400> 21 cccgggatgg ctgatacaag tccaagg 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-BamHI <400> 22 ggatccttat tcccttggac gggcgag 27 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-F <400> 23 atgccggcgc gtagcgcggt ggtg 24 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-R <400> 24 tcatttcttt gcaaccttgg gaggtgg 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-BamHI <400> 25 ggatccatgg ctgatacaag tccaagg 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRBI1-KpnI <400> 26 ggtaccttat tcccttggac gggcgag 27 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-BamHI <400> 27 ggatccatgc cggcgcgtag cgcgg 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsNPR1-SmaI <400> 28 cccgggtcat ttctttgcaa ccttg 25  

Claims (10)

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포내 수준(level)을 증가시켜 식물의 병-저항성을 증진시키는 방법.A method of enhancing disease-resistance of a plant by increasing the intracellular level of a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 제1항에 있어서, 상기 세포내 수준을 증가시키는 것은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것임을 특징으로 하는 식물의 병-저항성을 증진시키는 방법.The method of claim 1, wherein increasing the intracellular level increases the expression of a polynucleotide encoding the polypeptide. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물의 병-저항성을 증진시키는 방법.The method of claim 2, wherein the polynucleotide has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. 제1항에 있어서, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스, 레드 클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스에서 선택된 것임을 특징으로 하는 식물의 병-저항성을 증진시키는 방법.The method of claim 1, wherein the plant is rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, red beans, oats, sorghum, baby pole, Chinese cabbage, radish, red pepper, strawberries, tomatoes, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, Green onions, onions, carrots, ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, beets, perilla, peanuts, rapeseed, apple trees, pears, jujube trees, peaches, leeks, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots, bananas , Rose, gladiolus, gerbera, carnation, chrysanthemum, lily, tulip, lygras, red clover, orchardgrass, alphaalpha, tolfescue and perennialgrass. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과발현시키는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및(a) preparing an expression vector that overexpresses a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; And (b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 벼 또는 담배를 형질전환하는 단계를 포함하는 도열병, 흰잎마름병 및 역병(Phytophthora) 균에 의한 질병으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 병 저항성이 증진된 벼 또는 담배의 제조방법.(b) rice with enhanced disease resistance any one selected from the group consisting of diseases caused by bacteria, white leaf blight and late blight (Phytophthora) bacteria comprising the step of transforming rice or tobacco with the expression vector of step (a) Or a method for producing tobacco. 제5항에 있어서, 상기 발현 벡터는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터임을 특징으로 하는 제조방법.The method of claim 5, wherein the expression vector is a vector comprising a promoter and a polynucleotide encoding a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 operably linked thereto. 제6항에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.The method according to claim 6, wherein the polynucleotide has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 도열병, 흰잎마름병 및 역병(Phytophthora) 균에 의한 질병으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 병-저항성이 증진된 벼 또는 담배.Rice or tobacco with enhanced disease-resistance of any one selected from the group consisting of diseases caused by the bacterium caused by the method of any one of claims 5-7. 삭제delete 제8항의 벼 또는 담배에서 수득한 종자(seed).Seeds obtained from the rice or tobacco of claim 8.

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