KR100987639B1

KR100987639B1 - 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머로부터 멀티머를 분별검출하는 방법

Info

Publication number: KR100987639B1
Application number: KR1020077021499A
Authority: KR
Inventors: 성수 알렉산더 안; 임군택; 오현정
Original assignee: 주식회사 피플바이오
Priority date: 2005-02-19
Filing date: 2005-11-25
Publication date: 2010-10-13
Also published as: CN101124342A; KR20080000566A

Abstract

본 발명은 (a) 모노머형, 멀티머형 또는 모노머 및 멀티머형을 포획(capturing)하는 멀티머-형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 인식하는 포획 항체에 생시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 에피토프와 동일한 또는 오버래핑된 에피토프를 인식하는 검출 항체에 상기 포획된 모노머형, 멀티머형 또는 모노머 및 멀티머형을 접촉시키는 단계; 및 (b) 멀티머형-검출 항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 생시료(biosample)의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법에 관한 것이다.

모노머, 멀티머, 검출, 항체, 프라이온

Description

멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머로부터 멀티머를 분별 검출하는 방법{Method for Differentially Detecting Multimeric Form from Monomeric Form of Multimer-Forming Polypeptides}

본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법 및 이를 위한 면역분석 키트에 관한 것이다.

단백질을 구성하는 폴리펩타이드의 멀티머 형성은 단백질의 기능에 필요한 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러나 멀티머형은 몇몇 단백질에서 질환 또는 질병을 유발하는 경우가 많다. 특히, 단백질은 정상적인 상태에서는 모노머로 존재하다가 비정상적인 상태(예컨대, 미스폴딩 형으로 전환)가 되면 멀티머(또는 응집 형)로 전환된다.

미스폴딩되고 결국 응집된(또는 축적된) 즉, 기능적으로 관련 있는 구조(conformation)를 가지지 않는 단백질은 정상적인 생리활성을 나타내지 않는다는 것으로 알려져 있다. 올바르게 폴딩되지 않거나 올바르게 폴딩된 상태를 유지하지 못하는 경우 다양한 형태의 생리학적 기능부전을 유발하고 그 결과, 다양한 형 태의 질환을 유발한다(Massimo Stefani, et al., J. Mol . Med . 81:678-699(2003); and Radford SE, et al., Cell. 97:291-298(1999)). 올바르지 않은 구조, 즉 정상적으로 기능을 하는 것과는 다른 구조를 가지는 단백질 분자의 존재 때문에 생명체에서 많은 질환이 유발된다.

예를 들어, 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환 또는 질병은 알츠하이머 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 스폰지폼 뇌질환(Spongiform encephalopathies), 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 폐기종(emphysema), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloid angiopathy) 및 혈투석-관련 아밀로이드증을 포함한다.

응집-관련 질환의 초기 진단이 집중적으로 연구되었다. 그러나 모노머(정상) 형으로부터 멀티머(응집) 형을 분별 검출하는 방법 및 접근은 아직까지 제시되고 있지 않다.

인간의 산발성, 변종, 의인성, 및 가족성 크로이츠펠트-야콥병, 쿠루(kuru), 가족성 치명적 불면증, 및 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커병, 양 및 염소의 스크래피, 고양이의 스폰지폼 뇌질환(feline spongiform encephalopathy), 밍크 스폰지폼 뇌질환(mink spongiform encephalopathy), 사슴, 엘크 및 무스의 만성 소모성 질환, 및 가축의 광우병은 치명적인 신경 퇴행성 질환이고, 이는 전염성 해면상뇌증(TSE) 때문이다.(Prusiner S.B. Proc. Natl . Acad . Sci . USA 95:13363-13383(1998); and Hope J. Curr . Opin . Genet . Dev . 10, 568-57(2000)). 프라이온 단백질(PrP^Sc)의 비정상적인 이소형 또는 스크래피 형은 TSE의 주된 원인으로 알려져 왔다(Caughey B. Trends Biochem. Sci . 26:235-42(2001)).

프라이온 단백질(PrP^C)의 정상형은, α-나선 및 무질서한 부분을 포함하고 모노머형으로 존재하며(Zahn, R., et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 97:145-150(2000)), 스크래피형(PrP^Sc)은 고도의 β-쉬트 구조를 가지고 멀티머(응집) 형 또는 최소한 다이머 형으로 존재한다(Caughey, B., et al., J. Biol . Chem. 273:32230-35(1998)). α-나선에서 β-쉬트 구조로의 구조적인 변화는 신경병리학의 원인이 될 수 있는 질병의 중심 사건이다.

PrP^C가 단백질분해효소에 민감(PrP^sen)한 반면, PrP^Sc는 부분적으로 단백질 분해(PrP^res)에 저항성이 있고 고분자량의 응집체를 형성하기 쉽다(Bolton D. C. Lancet, 358:164-5 (2001)). 상기 후자의 특징은 PrP^res를 형성케 하는 구조적인 변화를 분석하기 어렵게 만들거나 또는 구조적인 변화를 특징짓는 것을 어렵게 한다.

단백질분해효소 K(PK)의 분해 방법은 ELISA로 검출되는 스크래피형만을 남기 고, 세포형을 분해함으로써 다양한 형태의 PrP(스크래피형)의 저항성을 구별하는데 이용되어 왔다. 그러나, 상기 PK 분해 방법에 대하여 문제가 제기 되었다. PrP 구조, 농도, 조직 항체, 분해 시간 및 완충액이 PK 민감도에 영향을 줄 수 있어, PK 분해 방법의 신뢰도를 크게 감소시킨다.

따라서, 보다 더 높은 신뢰도 및 편리성을 가지는 모노머형(예컨대, PrP의 세포 형)으로부터 멀티머형(예컨대, PrP의 스크래피형)을 분별 검출하는 새로운 접근법을 개발하는 것은 여전히 필요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

상기 배경 하에서, 본 발명자들은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머(응집)형의 신규한 분별 검출 방법을 개발하기 위하여 폭넓은 연구를 해왔고, 그 결과, 독특한 일단의 포획 및 검출 항체를 이용하는 신규한 면역분석 방법을 개발하였다.

따라서 본 발명의 목적은 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 응집반응(agglutination)에 기초한 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생시료(biosample)의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공 한다: (a) 상기 모노머형, 멀티머형 또는 모노머 및 멀티머형을 포획(capturing)하는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 인식하는 포획 항체에 생시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 에피토프와 동일한 또는 오버래핑된 에피토프를 인식하는 검출 항체에 상기 포획된 모노머형, 멀티머형 또는 모노머 및 멀티머형을 접촉시키는 단계; 및 (c) 멀티머형-검출 항체 복합체를 검출하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 인식하는 포획 항체; 및 (b) 상기 포획 항체가 인식하는 상기 에피토프와 동일한 또는 오버래핑된 에피토프를 인식하는 검출 항체를 포함하는, 생시료의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 항원-항체 반응과 관련된 면역분석법을 이용하여 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노머형으로부터 분별 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명 방법은 “멀티머 검출 방법”으로 명명한다(MDS로 축약).

본 명세서에서 용어 “멀티머-형성 폴리펩타이드”는 응집형을 형성할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 특히, 하기 구조적 변화는 다양한 질환을 유발한다. 예컨대, 알츠하이머 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 스폰지폼 뇌질환(Spongiform encephalopathies), 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 폐기종(emphysema), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloid angiopathy) 및 혈투석-관련 아밀로이드증을 포함한다. 따라서, 용어 “멀티머-형성 폴리펩타이드”는 용어“응집체-형성 폴리펩타이드”와 서로 바꾸어 사용할 수 있다.

일반적으로, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형(즉, 비-응집형)은 정상이고 멀티머형(즉, 응집형)은 질환, 특히 알츠하이머 질환 및 크로이츠펠트-야콥병과 같은 신경 퇴행성 질환을 유발한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 크로이츠펠트-야콥병 및 스폰지폼 뇌질환에 관여하는 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클레인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C , 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β₂-마이크로글로블린, 헌팅톤 병에 관여하는 헌팅틴, 근위축성 측삭경화증에 관여하는 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 서핀 결핍증, 폐기종, 및 경변증에 관여하는 서핀, 및 제 II형 당뇨병에 관여하는 아밀린을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 멀티머 형성 폴리펩타이드는 크로이츠펠트-야콥병 및 스폰지폼 뇌질환을 유발하는 프라이온 단백질이다. 본 발명 방법을 프라이온 단백질(PrP)에 적용하는 경우, 모노머형은 PrP^c(프라이온의 세포 또는 정상형)이고 멀티머형은 PrP^Sc(프라이온의 스그래피 또는 감염형) 이다.

본 발명의 방법은 두 가지 형태의 항체, 즉 포획 항체 및 검출 항체를 이용한다. 본 명세서에서 용어, “포획 항체”는 생시료에서 검출하고자 하는 멀티머-형성 폴리펩타이드에 결합 할 수 있는 항체를 의미한다. 용어, “검출 항체”는 에 상기 포획 항체에 의해 포획된 멀티머-형성 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. “항체”는 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 본 명세서에 이용된 항체는 검출하고자 하는 에피토프, 항원 또는 항원 단편에 결합할 수 있는 전체 항체뿐만 아니라 항체 단편(예컨대, F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv)을 포함한다.

본 발명의 가장 큰 특징은 멀티머-형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 한 세트의 포획 항체 및 검출 항체를 이용하는 것으로서, 상기 포획 항체 및 검출 항체가 특이적으로 인식하는 상기 에피토프는 서로 동일하거나 오버래핑 되어 있다.

포획 항체 및 검출 항체에 대한 에피토프를 언급하면서 사용되는 용어, “오버래핑(overlapped with)”은 완전히 또는 부분적으로 오버래핑된 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 포괄한다. 예를 들어, 실시예에서 확인할 수 있듯이, 3O8 및 3F4 항체에 대한 에피토프는 인간 프라이온 서열의 각각, 아미노산 106-126 및 109-112으로 이루어진 아미노산 서열을 가진다. 이러한 에피토프는 완전히 오버래핑된 에피토프로 설명될 수 있다.

본 발명의 구체적이고 바람직한 구현예에 따르면, 인간 프라이온 서열을 언급하면서 표현하는 경우, 상기 에피토프는 아미노산 109-112, 106-126, 132-147, 135-140, 146-151, 144-153, 143-151, 129-149 또는 112-125으로 이루어진 아미노산 서열을 가지고, 보다 바람직하게는, 아미노산 109-112, 106-126, 132-147, 135-140, 146-151 또는 143-151, 그리고 가장 바람직하게는, 아미노산 109-112, 106-126, 132-147 또는 135-140이다. 미국 특허 제4,806,627호에 기재된 바와 같이, PrP_109-112와 반응하는 가장 바람직한 항체는 3F4(Sigma)이다. Hisako Furukawa, et al., J. Biol . Chem., 279: 23661-23667(2004)에 기재된 바와 같이, PrP₁₀₆ _-126과 반응하는 가장 바람직한 항체는 308이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포획 항체가 특이적으로 인식하는 에피토프는 멀티머-형성 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열이다. 바람직하게는, 상기 검출 항체가 특이적으로 인식하는 에피토프는 멀티머-형성 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열이다. 본 발명 방법에 따르면, 포획 항체에 결합된 멀티머-형성 폴리펩타이드는 검출 항체와 더 이상 결합 할 수 없고, 이는 검출 항체가 인식하는 추가적인 에피토프가 존재하지 않기 때문이다.

상기 포획 및/또는 검출 항체를 제조하기 위하여 이용되는 에피토프는, 멀티머-형성 폴리펩타이드 상에서 한번만 발견될 수 있는 서열을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, gly-반복 서열은 프라이온의 몇몇 위치에 존재 한다; 따라서, 상기 서열은 본 발명의 에피토프로 부적절하다. 바람직하게는, 서열목록 제 1 서열로 기재된인간 프라이온 서열을 언급하면서 표현하는 경우, 상기 에피토프를 아미노산 95-180에서 선택한다. 보다 바람직하게는, 상기 에피토프를 아미노산 100-160에서 선택하고 가장 바람직하게는, 109-153이다.

본 발명의 구체적이고 바람직한 구현예에 따르면, 인간 프라이온 서열에 관한 것인 경우, 상기 에피토프는 아미노산 109-112, 106-126, 132-147, 135-140, 146-151, 144-153, 143-151, 129-149 또는 112-125으로 이루어진 아미노산 서열을 가지고, 보다 바람직하게는, 아미노산 109-112, 106-126, 132-147, 135-140, 146-151, 143-151, 그리고 가장 바람직하게는, 아미노산 109-112, 106-126, 132-147 또는 135-140이다. 미국 특허 제4,806,627호에 기재된 바와 같이, PrP₁₀₉ _-112와 반응하는 가장 바람직한 항체는 3F4(Sigma) 이다. Hisako Furukawa, et al., J. Biol . Chem ., 279: 23661-23667(2004)에 기재된 바와 같이, PrP₁₀₆ _-126과 반응하는 가장 바람직한 항체는 308(Cayman Chemical) 이다. PrP₁₃₂ _-147과 반응하는 항체로, Yoichi Matsunaga et al., Proteins, 44:110(2001) 기재된 MA1-750(Affinity BioReagents, Inc)이 가장 바람직하다. Hiroko Hayashi, et al., J. Vet. Med . Sci., 66(6):515(2004)에 기재된 T2가 PrP₁₃₅ _-140과 반응하는 가장 바람직한 항체이다. 가장 바람직하게는, PrP₁₄₆ _-151, PrP₁₄₄ _-153, PrP₁₄₃ _-151, PrP₁₂₉ _-149, 및 PrP₁₁₂ _-125를 특이적으로 인식하는 항체는 각각 1F5, SAF 항체(Cayman Chemical), 6H4(Prionics AG), 1E5/G6 (Novus Biologicals) 및 7B6/D2(Novus Biologicals) 이다.

본 발명의 방법을 소 생시료에 적용하는 경우, 아미노산 135-140(소 프라이온 서열을 언급하면서 표현하는 경우, 서열목록 제 2 서열의 아미노산 145-150) (예컨대, T2 항체) 또는 132-147(소 프라이온 서열을 언급하면서 표현하는 경우, 서열목록 제 2 서열의 아미노산 142-157)(예컨대, MA1-750 항체)의 에피토프를 인식하는 항체가 가장 바람직하다. 예컨대, 포획 항체 및 검출 항체의 한 세트로서, MA1-750/MA1-750, MA1-750/T2, T2/T2 또는 T2/MA1-750의 항체 세트가 소 시료에 적용되는 본 발명의 방법에 매우 유용하다.

인간의 생시료(특히, 혈장)를 분석하기 위하여 본 발명 방법을 이용하는 경우, 아미노산 109-112(예컨대, 3F4 항체), 106-126(예컨대, 3O8 항체), 135-140(예컨대, T2 항체) 또는 132-147 (예컨대, MA1-750 항체)의 에피토프에 대한 항체를 이용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 아미노산 109-112(예컨대, 3F4 항체), 106-126(예컨대, 3O8 항체) 및 135-140(예컨대, T2 항체)의 에피토프에 대한 항체, 그리고 가장 바람직하게는, 아미노산 109-112(예컨대, 3F4 항체) 및 106-126(예컨대, 3O8 항체)의 에피토프에 대한 항체이다. 예를 들어, 포획 항체 및 검출 항체의 한 세트로서, 3F4/3F4, 3F4/3O8, 3O8/3F4 또는 3O8/3O8의 항체 세트가 인간 시료 특히, 혈장에 적용되는 본 발명 방법에 매우 유용하다.

바람직하게는, 포획 항체 및 검출 항체는 서로 동일하다. 즉, 포획 항체 및 검출 항체에 특이적으로 결합되는 에피토프는 동일한 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포획 항체는 고체 기질에 결합된다. 이러한 형태의 공지의 물질은 폴리스티렌 및 폴리프로필렌, 유리, 금속, 및 젤과 같은 탄화수소 중합체를 포함한다. 상기 고체 기질은 딥스틱, 마이크로티터 플레이트, 입자(예컨대, 비드), 친화성 컬럼 및 이뮤노블롯 멤브레인(예컨대, 폴리비닐리덴 플로라이드 멤브레인) 형태로 있을 수 있다(참조: 미국 특허 제5,143,825호, 제5,374,530호, 제4,908,305호 및 제5,498,551호). 가장 바람직하게는, 상기 고체 기질은 마이크로티터 플레이트이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출 항체는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지를 가진다. 상기 표지는 화합물 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 알카린 포스파타아제, 페록시다아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, I¹²⁵ 및 C¹⁴), 형광 표지(예컨대, 플루오레세인), 발광 표지, 화학발광 표지 및 FRET(형광 공명 에너지 전달; fluorescence resonance energy transfer) 표지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체를 표지하기 위한 다양한 표지 및 방법은 당업계에 공지되어 있다(Harlow and Lane, eds. Antibodies : A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). 가장 바람직하게는, 상기 검출 항체를 바이오틴 또는 호스 래디쉬 페록시다아제로 표지하는 것이다.

본 발명에서, 멀티머-형성 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파지 항체 도서관(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991); 및 Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597(1991))과 같은 종래 기술에 따라 면역원으로 종전에 기재된 에피토프를 이용하여 준비할 수 있다. 상기 항체 제조를 위한 일반적인 방법은 Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1988; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 기재되어 있다. 단일클론 항체 제조를 위한 하이브리도마 세포주의 준비는 불멸 세포주(immortal cell line) 및 항체를 생산하는 임파구의 융합으로 실시된다. 상기 단일클론 항체의 제조는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 다클론 항체는, 상술한 항원을 적합한 동물에 주입하고, 항체를 포함하는 항혈청을 수집한 다음, 공지된 친화성 기술에 의해 항체를 분리하는 방법에 따라 제조될 수 있다.

“생시료(biosample)”는 분석하고자 하는 유기체-유래 시료를 의미한다. 상기 생시료는 생물원의 세포, 조직, 또는 생체액, 또는 본 발명에 따라 분석될 수 있는 다른 미디엄(medium)을 의미하고, 이는 인간으로부터 채취한 시료, 동물로부터 채취한 시료, 인간 또는 동물을 위한 식품으로부터 채취한 시료를 포함한다. 바람직하게는, 시험할 생시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 우유, 소변, 대변, 눈물, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 균질액), 척수액(SCF), 충수, 비장 및 편도 조직 추출물을 포함하는 체내 유체 시료이다. 보다 바람직하게는, 상기 생시료는 뇌 균질액 또는 혈장, 가장 바람직하게는, 혈장이다.

뇌 균질액을 생시료로 이용하는 경우, 바람직하게는 본 발명 방법은 상기 단계(a) 이전에 트립신으로 상기 생시료를 처리하는 단계를 추가적으로 포함한다. 상기 뇌 균질액 시료는, 응집체-형성 폴리펩타이드가 포획 항체 및/또는 검출 항체에 결합하는 것을 억제하는 다른 단백질 및 물질을 포함한다. 이와 같은 매트릭스 억제는 트립신 처리법에 의해 저해된다. 상기 트립신 처리의 이점은 하기된 실시예 Ⅳ로 입증된다. PK가 PrP^Sc를 분해함으로써 위 음성 데이터(false negative data)를 발생시킬 가능성이 있기 때문에, 프라이온 검출법에 종래 이용된 단백질분해효소 K(PK)의 처리는 바람직하지 않다. PrP^c로부터 PrP^Sc를 구별하기 위하여 종래 이용했던 PK를 처리할 필요성이 없다는 점은 본 발명 방법의 이점 중 하나이다. 본 발명의 MDS 방법 그 자체는, PK 처리 없이 PrP^c로부터 PrP^Sc를 충분히 구별할 수 있는 능력을 갖는다.

생시료로서 혈장을 이용하는 경우, 실시예 Ⅹ에 입증된 바와 같이 단백질분해효소 처리의 필요성을 완전히 피할 수 있으며, 이는 본 발명의 큰 이점이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 방법은 상기 단계 (a) 이전에 단백질 변성제로 상기 생시료를 처리하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이러한 단백질 변성제는 응집체-형성 폴리펩타이드의 에피토프를 노출시키기 때문에, 응집체-형성 폴리펩타이드에 포획/검출 항체가 결합하는 것을 크게 향상시킨다.

상기 단백질 변성제는 당업계에 공지된 다양한 단백질 변성제를 포함하고, 예를 들어, 요소, 테트라메틸요소, 구아니딘 하이드로클로라이드, 구아니딘 티오시나이드 및 소듐 도데실 설페이트를 포함한다. 바람직하게는, 상기 단백질 변성제는 요소, 구아니딘 하이드로클로라이드 및 구아니딘 티오시나이드이고, 가장 바람직하게는, 구아니딘 하이드로클로라이드이다. 상기 단백질 변성제의 농도는, 특히, 구아니딘 하이드로클로라이드는 0.3-4 M의 범위이고, 바람직하게는, 0.3-3 M, 보다 바람직하게는, 0.5-2 M, 그리고 가장 바람직하게는, 약 1 M이다. 상기 단백질 변성제의 처리 시간은, 특히, 구아니딘 하이드로클로라이드는 5-60분 범위이고, 바람직하게는, 10-50분, 보다 바람직하게는, 10-40분, 그리고 가장 바람직하게는, 15-20분이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 방법은 상기 단계 (a) 이전에 상기 생시료를 가열하는 단계를 추가적으로 포함한다. 뇌 균질액을 생시료로서 이용하는 경우, 상기 가열은 70-100℃의 온도에서 실시되고, 바람직하게는, 80-100℃, 보다 바람직하게는, 90-100℃, 그리고 가장 바람직하게는, 약 100℃이다. 혈장을 생시료로서 이용하는 경우, 상기 가열은 40-100℃의 온도에서 실시되고, 바람직하게는, 50-80℃, 보다 바람직하게는, 60-80℃, 그리고 가장 바람직하게는, 약 70℃이다.

바람직하게는, 상기 생시료는 계면활성제를 포함한다. 본 발명 방법에 유용한 계면활성제는 당업계에 공지된 다양한 계면활성제를 포함하고, 바람직하게는, 살코실(N-라유릴살코신), 트리톤 X-100 (폴리옥시에틸렌 알킬 페놀)과 같은 트리톤류, 소듐 데옥시콜레이트, zwittergent-16과 같은 양성이온성 계면활성제(zwitterionic surfactant) 및 이들의 조합 그리고 보다 바람직하게는, 살코실, 트리톤 X-100, 소듐 데옥시콜레이트, zwittergent-16 및 이들의 조합이다. 가장 바람직하게는, 뇌 균질액을 생시료로서 이용하는 경우에, 상기 생시료에 포함된 계면활성제는 트리톤 X-100 및 소듐 데옥시콜레이트의 조합이다. 가장 바람직하게는, 상기 혈장 시료에 포함된 계면활성제는 살코실, 트리톤 X-100, 소듐 데옥시콜레이트 및 zwittergent-16의 조합이다. 상기 계면활성제의 농도는 최소 0.5 중량%, 바람직하게는, 0.5-3 중량%이다. 뇌 균질액을 생시료로서 이용하는 경우, 상기 계면활성제의 농도는 1.0-3.5 중량%, 바람직하게는, 1.5-3.0 중량%, 보다 바람직하게는, 2.0-3.0 중량% 이고, 가장 바람직하게는, 약 2.5 중량%이다. 상기 혈장 시료는 뇌 균질액보다 보다 낮은 농도의 계면활성제를 포함하고, 바람직하게는, 0.2-2.5 중량%, 바람직하게는, 0.3-2.0 중량%, 보다 바람직하게는, 0.5-1.5 중량%이고, 가장 바람직하게는, 약 0.6-1.0 중량%이다. 혈장을 생시료로 이용하는 경우, 상기 살코실 계면활성제를 사용하는 것은 이점이 있으며, 그 이유는 본 발명의 방법의 최종 신호 발생에 살코실 계면활성제가 어느 정도 기여하기 때문이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혈장을 생시료로서 이용하는 경우, 본 발명 방법은 상기 단계 (a) 이전에 플라스미노겐 억제제로 상기 생시료를 처리하는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 명세서에서 용어, “플라스미노겐 억제제”는 플라스미노겐의 활성을 억제하는 물질, 예컨대, 스트렙토카나아제, 유로키나아제 또는 조직 활성제를 의미한다. 상기 억제는 플라스민과 피브린 단량체 간의 결합과 관련된 플라스미노겐 상에 라이신 결합 부위를 블록킹 함으로써 일반적으로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 플라스미노겐 억제제는 오메가-아미노카르복실산[예컨대, 4-아미노부틸산, 5-아미노펜탄산, 6-아미노헥산산(아미노 카프로산, ACA), 및 7-아미노헵탄산], L-라이신 및 유도체(N-아세틸-L-라이신, L-라이신-메틸 에스테르, 및 N-아세틸-L-라이신-메틸 에스테르), 양성이온[예컨대, 트랜스-(아미노메틸)사이클로핵산카르복실산(AMCHA), p-벤질아민술폰산, 및 양쪽이온성 감마-구아니디노부틸산), 벤질아민, 벤즈아미딘, L-아르기닌 및 이의 유도체(N알파-아세틸-L-아르기닌, N알파-아세틸-L-아르기닌 메틸 에스테르, 및 L-아르기닌 메틸 에스테르)를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 억제제는 아미노카프로산 또는 트랜스-(아미노메틸)사이클로핵산카르복실산 이고, 가장 바람직하게는, 트랜스-(아미노메틸)사이클로핵산카르복실산 이다. 플라스미노겐 억제제에 의한 시료의 전처리는 모노머로부터 멀티머(특히, PrP^Sc)의 분별 검출을 향상시킨다.

멀티머형-검출 항체 복합체의 검출은 당업계의 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 멀티머형-검출 항체 복합체의 형성은 생시료에 멀티머형의 존재를 나타낸다. 상기 단계는 종래의 방법에 따라, 예컨대, Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980 및 Harlow and Lane, eds. Antibodies : A Laboratory Manual(1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y에 기재된 바와 같이 다양한 검출할 수 있는 표지/기질 쌍을 이용하여, 정량적으로 또는 정성적으로 실시 할 수 있다.

상기 검출 항체를 알카린 포스파타아제로 표지하는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT) 및 ECF를 발색 반응을 위한 기질로서 이용할 수 있다; 호스 래디쉬 페록시다아제로 표지하는 경우, 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리딘이움 나이트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-테트라메틸벤즈이딘) 및 ABTS(2,2-아진-디[3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트]) 등이 이용된다. 다른 표지/기질 쌍은 바이오틴/스트랩타비딘, 및 루시페라아제/루시페린을 포함한다.

만일 칵테일된 포획 항체가 검출 항체에 대한 에피토프와 동일한 또는 오버래핑된 에피토프에 결합하는 경우에는, 본 발명은 포획 항체로서 다양한 종류의 항체들을 동시에 이용하는 것을 포괄한다. 실시예 ⅩⅠ에 기재된 바와 같이, 칵테일된 포획 항체, 예컨대, 3O8 및 3F4를 이용하는 본 발명은 PrP^c로부터PrP^Sc를 분별 검출 할 수 있다.

본 발명의 일 구체예를 보여주는 도 1을 참조하여, 본 발명의 방법을 보다 상세하게 설명한다. PrP^c 및 PrP^sc와 같은 PrP의 이소형을 포함하는 생시료를 포획 항체가 코팅된 마이크로플레이트에 적용시키는 경우, PrP^c 및 PrP^sc 모두 포획 항체에 결합한다. 상기 포획 항체가 특이적으로 인식하는 에피토프(밝은(light) 사다리꼴로 나타남)는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열이다. 그런 다음, 포획 항체에 대한 에피토프와 동일하거나 오버래핑 된 에피토프를 인식하는 HRP-표지된 검출 항체를 포획 항체에 의해 포획된 PrP^Sc 및 PrP^c와 접촉한다. PrP^c 상의 에피토프는 포획 항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 에피토프 서열을 하나만 가지고 있는 PrP^c에는 검출 항체가 결합하지 않는다. 반대로, PrP^sc에는 에피토프가 다수 존재하기 때문에, 검출 항체가 PrP^Sc 상의 비어있는 에피토프에결합하게 된다. 검출 항체 처리 후, 마이크로플레이트를 세척하고 HRP의 기질인 TMB(3,3,5,5-테트라메틸벤즈이딘)으로 반응시켜 발색반응을 유도한다. 최종적으로, 450 nm에서의 흡광도를 측정하여 PrP^sc-항체 복합체의 형성 유무를 결정한다.

또한, 본 발명은 응집반응(agglutination)에 기초한 분석 방법을 실시하도록 디자인할 수도 있다. 상기의 경우, 본 발명의 방법은 다음의 단계를 포함 한다: (a) 상기 모노머형, 멀티머형 또는 모노머형과 멀티머형을 포획(capturing)하기 위하여 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 인식하는 포획 항체에 생시료를 접촉시키는 단계로서, 상기 포획 항체는 고체 담체에 결합되어 있고 ; 및 (b) 상기 고체 담체에 결합된 포획 항체와 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드 사이의 응집반응 발생을 검출하는 단계로서, 상기 응집반응 발생은 상기 생시료에 멀티머형이 존재함을 나타낸다.

본 응집반응 방법은 상술한 본 MDS 방법의 변형예로서, 둘 사이에 공통적인 사항은 과도한 반복기재에 의한 본 명세서의 복잡성을 피하기 위해, 그 기재를 생략한다. 예를 들어, 멀티머-형성 폴리펩타이드, 포획 항체 및 생시료에 대한 사항은 이들 사이에 공통적이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포획 항체에 결합된 고체기질은 젤라틴, 라텍스, 폴리스티렌 및 콜로이드 골드 비드와 같은 비드이고, 보다 바람직하게는, 라텍스 비드이다. 상기 담체의 크기는 직경 0.3 nm-20 μm일 수 있고, 최적 크기는 응집반응의 평가 방법에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 응집반응의 거시적 평가를 위해서는, 거시적 판단이 보다 쉬운 직경 0.2-3 μm의 담체를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예를 나타낸 도 2를 참조하여, 본 발명의 응집반응(agglutination) 방법을 보다 상세하게 설명한다. 고체 기질로서 비드를 프라이온 단백질 상의 에피토프(바람직하게는, 비-반복 서열의 에피토프)에 결합하도록 하기 위하여 항체로 코팅한다. 비드를 PrP^Sc 및 PrP^c를 포함하는 생시료에 접촉시키는 경우, PrP^Sc 및 PrP^c 모두 비드에 결합된 항체에 결합한다. 또한, 다수의 에피토프를 운반하는 PrP^Sc는 비드 상의 항체에 결합하여 PrP^Sc/비드 복합체를 형성하며, 이는 응집반응을 초래한다. 그러나, PrP^c는 하나의 에피토프만을 가지고 있기 때문에 응집반응을 유발하지 않는다. 상기 응집반응의 발생은 당업계에 공지된 종래 방법에 따라 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 방법은 멀티머-특이적 항체를 요구하지 않는다. 예를 들어, 상기 방법은 PrP^Sc-특이적 항체에 의존적이지 않는다. PrP^Sc 및 PrP^c 간에교차-반응성을 가지는 항체를 생시료 내의 PrP^Sc를 분별 검출하기 위한 본 발명에 성공적으로 적용할 수 있다;

(ⅱ) 본 발명은 PrP^Sc 검출을 위하여 종래 이용해 온 단백질분해효소 K(PK) 처리를 필요로 하지 않는다. 본 발명의 MDS 방법 그 자체는, PK 처리 없이 PrP^c로부터 PrP^Sc를 충분히 구별할 수 있는 능력을 갖는다;

(ⅲ) 본 발명은 혈장 시료 내의 응집형(특히, PrP^Sc)을 면역분석 방법으로 검출할 수 있도록 한다. 혈장 내 PrP^Sc의 성공적인 검출에 관하여 알려진 경우는 거의 없었다; 및,

(ⅳ) 본 발명은 편리하고 신속한 방식으로 실시할 수 있으며, 이는 MDS의 자동화를 가능하게 한다.

도 1은 본 발명의 방법의 구체적인 일 구현예를 보여주는 개념도이다.

도 2는 응집반응(agglutination)에 기초한 본 발명의 방법의 구체적인 일 구현예를 보여주는 개념도이다.

도 3은 재조합 소 프라이온 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 보여준다.

도 4는 종래의 방법(SPIbio) 또는 본 발명의 방법(MDS)으로 프라이온 단백 질(PrP)의 분석 결과를 보여주는 그래프이다. 본 발명의 방법은 프라이온(PrP^Sc)의 멀티머(스크래피)형을 분별 검출할 수 있음을 보여준다.

도 5는 본 발명 방법에 따른 햄스터 뇌 균질액 내의 PrP^Sc멀티머 검출 결과를 나타낸다. 햄스터 뇌 균질액을 다른 단백질분해효소(단백질분해효소 K 및 트립신)를 이용하여 얻었다.

도 6a는 총 PrP 농도를 분석하기 위한 컨트롤 ELISA의 결과를 나타낸다. 야생형 및 PrP 녹-아웃(PrP KO) 마우스의 혈장 시료를 이용하였다.

도 6b는 야생형 및 PrP 녹-아웃(PrP KO) 마우스의 혈장 시료 내에 있는 프라이온의 멀티머형(PrP^Sc)을 검출하기 위한 본 발명 방법의 결과를 나타낸다.

도 6c는 컨트롤 ELISA의 정상 인간 혈장 내의 총 PrP 농도의 분석 결과를 나타낸다.

도 7a-7c는 각각 소, 마우스 및 인간의 재조합 프라이온 단백질 시료내의 프라이온의 멀티머형(PrP^Sc)을 검출하기 위한 본 발명 방법의 결과를 나타낸다.

도 8은 소 혈장에 스파이킹된 프라이온의 멀티머형(PrP^Sc)을 검출하기 위한 본 발명 방법의 결과를 보여주는 그래프이다.

도 9는 농축된 정상 소 혈장에 대한 컨트롤 ELISA 및 본 발명의 방법(멀티머 검출 시스템)에 따른 실험 결과를 나타낸다.

도 10a는 정상 또는 스크래피 햄스터의 혈장 시료 내의 프라이온 멀티머 형(PrP^Sc)을 검출하기 위한 본 발명 방법의 분석 결과를 보여준다.

도 10b는 정상 또는 CJD(크로이츠펠트-야콥병) 인간의 혈장 시료 내의 프라이온 멀티머형(PrP^Sc)을 검출하기 위한 본 발명 방법의 분석 결과를 보여준다.

도 11은 인간 혈장에 스파이킹된 프라이온의 멀티머형(PrP^Sc)을 검출하기 위하여 칵테일된 포획 항체를 이용한 본 발명 방법의 분석 결과를 보여준다.

도 12는 소 혈장에 스파이킹된 프라이온의 멀티머형(PrP^Sc)을 검출하기 위한 본 발명 방법의 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험재료

3F4 및 3F4-바이오틴 항체를 각각 Sigma(미국) 및 Abcam Ltd(영국)로부터 구입하였다. 3O8 및 MA1-750 항체를 Cayman Chemical Co. 및 Affinity BioReagents Inc.(미국)로부터 구입하였다. T2-HRP 및 1F5 항체를 동물보건 국립연구소(일본) 로 부터 기증 받았다. 소 및 햄스터 재조합(23-231) 프라이온 단백질을 각각 Prionics AG.(스위스) 및 Alicon AG(스위스) 로부터 구입하였다. 마우스 및 인간 재조합(23-231) 프라이온 단백질을 메릴랜드 대학(미국) 및 동물보건 국립연구소(일본) 로부터 기증 받았다. 연령을 일치시킨 정상 및 스크래피 햄스터의 뇌 균질액을 각각 SLC, Inc. (일본) 및 볼티모어 연구/교육 재단으로부터 구입하였다. HRP-접합 항-마우스 IgG 및 인핸스드 화학발광 키트를 Amersham Biosciences(영국)으로부터 구입하였다. PVDF 멤브레인을 Bio-Rad Inc.(미국)으로부터 구입하였다. Startingblock을 Pierce Biotechnology Inc.(미국)으로부터 구입하였다. X-레이 필름을 Fuji Inc.(일본)로부터 구입하였다. 화학발광 HRP 기질, 슈퍼시그널 웨스트 피코를 Pierce Biotechnology Inc.(미국)으로부터 구입하였다. TMB를 Sigma(미국)으로부터 구입하였다. 뇌 균질액으로부터 정제된 마우스 PrP^Sc를 동물보건 국립연구소(일본)으로부터 기증 받았다. 트립신을 Fluka(미국)으로부터 구입하였다. 단백질분해효소 저해제 칵테일을 Sigma(US)로부터 구입하였다.

실시예 Ⅰ: 재조합 프라이온 단백질의 웨스턴 블롯 분석

재조합 소 프라이온 단백질 0.2 ng(PrP 23-231, 메릴랜드 대학으로부터 입수)을 변성제 없이 네이티브 젤(12.5% SDS-PAGE)에 로딩 하였고 4℃에서 12시간 이상 전기영동 젤의 단백질 밴드를 PVDF 멤브레인(Bio-Rad)으로 전이시켰다. 상기 PVDF 블롯을 TBS 완충액 내 50% Startingblock(PIERCE)으로 블록킹하였다. 그런 다음, 6H4 항체(Prionics AG)를 일차항체로 사용하였고, HRP-결합 항-마우스 IgG(Amersham)를 이차항체로 사용하였다. X-레이 필름(Fuji)에 노출시켜 상기 블롯을 검출하기 위하여 인핸스드 화학발광(ECL)법을 이용하였다. 다이머, 트라이머 및 보다 큰 고분자량의 밴드로 나타나는 프라이온 멀티머를 검출하였다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 상기 결과는 다수의 프라이온 멀티머 및 모노머가 재조합 소 프라이온 단백질 시료에 존재하고 6H4 항-프라이온 항체에 의해 검출될 수 있음을 의미한다.

실시예 Ⅱ: 본 발명의 방법의 PrP ^sc 검출 가능성 평가

MA1-750 항체로 코팅된 플레이트를 제조하였다. MA1-750 항체(항-프라이온 단백질, Affinity bioreagents, Inc.) 30 ㎍을 200 mM MOPS 10 ㎕에 현탁시키고 이 현탁액의 100 ㎕ 분획을 이뮤노 모듈 플레이트(immuno module plates, Nunc-468667)의 각 웰에 넣은 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 상기 플레이트를 PBS로 세척하고 PBS에 녹인 오브알부민으로 실온에서 1시간 동안 블록킹 하였다.

4% zwittergent(Anaphase Inc., US) 내 10% 소 뇌 균질액을 4배씩 연속 희석하였고, MA1-750 항체가 코팅된 플레이트에 분주한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. MA1-750 항체는 PrP^c의 Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg 에피토프를 인식하는 것으로서, 상기 에피토프 서열은 프라이온에서 반복되지 않는다. 상기 플레이트를 TBST 완충액으로 5회 세척하고 MA1-750-HRP(1:2000 in TBST)로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 배양 후, 상기 플레이트를 PBS로 세척하고 상기 HRP의 활성을 HRP 기질인 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘(TMB, SIGMA Inc.)로 30분 동안 반응시킴으로써 정량하였다. 발색 신호는 SpectraMax Plus³⁸⁴(Moledular Device Inc.)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

한편, 비교예로서 SPIbio사에서 판매하고 있는 PrP^c 효소 면역분석 키트(카탈로그 # A05201)를 이용하여 분석하였다. 4% zwittergent(Anaphase Inc., US) 내 10% 소 뇌 균질액을 4배씩 연속 희석하였고, MA1-750 항체가 코팅된 플레이트에 분주한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST 완충액으로 5회 세척하고 SPIbio사의 키트에 있는 항-프라이온 트레이서(PrP^c의 N-말단에 있는 octo-리피트 부위를 인식함)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 SPIbio사의 세척 완충액으로 세척하고, Ellman's 시약 200 ㎕를 첨가하여 30분 동안 발색반응을 시켰다. 발색 신호는 SpectraMax Plus³⁸⁴(Moledular Device Inc.)를 이용하여 400 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

소 뇌 균질액 농도(%)	OD 값
소 뇌 균질액 농도(%)	MDS	SPIbio 키트
0.5	0.1206	1.0909
0.13	0.0928	0.4879
0.03	0.0719	0.2328
NSB	0.0923	0.1153
백그라운드	0.0839	0.0839

상기 표 1에서, NSB(비-특이적 결합)는 소 뇌 균질액이 없이 한 실험군을 나타내고 백그라운드는 항체 사용 없이 발색반응 기질만 첨가한 실험군을 나타낸다.

표 1 및 도 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 MDS는 최종 발색 신호에서 PrP^c 관여를 완전히 배제하였음을 알 수 있다. 이와 같은 결과는, 포획 항체 및 검출 항체로서 MA1-750 항체가 이중적으로 이용되기 때문이고, 이는 본 발명의 가장 큰 특징이다. 또한, MDS의 이러한 분별 능력을 결정하는 부분적 요인은, MA1-750가 인식한 에피토프 서열이 프라이온 내에서 반복되지 않는다는 것이다. 반대로, SPIbio사에서 판매하고 있는 키트를 이용한 경우에는, 보다 높은 OD 값이 측정되었는데, 이는 최종 발색 신호 결과에 PrP^c가 관여한다는 것을 보여준다.

결과적으로, 본 발명의 MDS를 이용하면 생시료 내의 PrP^Sc만을 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 Ⅲ: 응집반응( agglutination )에 의한 프라이온 단백질의 멀티머형 검출

멀티머형 재조합 소 프라이온 단백질을 제조하였다. 재조합 소 프라이온 단백질 3.1 ㎍을 커플링 완충액(5 mM 포타슘 포스페이트, 75 mM NaCl, pH 6.5) 700 ㎕에 용해하였고 이를 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드, Sigma E6383)용액과 실온에서 24시간 동안 반응시켰다.

MA1-750 항체를 라텍스 비드에 코팅하였다. MA1-750 항체 70 ㎕를 커플링 완충액(5 mM 포타슘 포스페이트, 75 mM NaCl, pH 6.5) 4 ㎖와 혼합하고 원심분리하여 농축하였다. 70 ㎕의 라텍스 비드(Carboxylate modified Latex beads, Sigma L5530)를 원심분리하여 침전시키고 상층액을 버린 후, 커플링 완충액을 첨가하였다. EDC 용액에 비드 용액 70 ㎕를 혼합하고 농축된 MA1-750 항체와 반응시키고, 이어 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 코팅된 비드를 원심분리로 침전시키고, 세척 완충액(10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% 오브알부민, pH 7.5)으로 재현탁시키고 재침전 시켰다. 상기 침전된 비드를 PBS 70 ㎕에 용해시켰다.

그리고 나서, MA1-750 코팅된 락테스 비드 10 ㎕에 EDC를 처리하거나 처리하지 않은 1% 소 뇌 균질액 10 ㎕, 또는 EDC를 처리하거나 처리하지 않은 재조합 소 프라이온 단백질 45 ng을 혼합한 다음, 상기 결과물을 형광 현미경(x 400, Carl Zeiss Axiovert 100)으로 관찰하였다.

실험 결과, 소 뇌 균질액에서는 EDC 처리 여부와 상관없이 아주 미소한 응집반응을 관찰하였다. 상기 미소한 응집반응은 소 뇌 균질액에 있는 극미량의 PrP^sc에 의해 형성된 멀티머형 프라이온 때문에 발생된 것으로 판단된다. 반면, 재조합 프라이온 단백질에서는 EDC를 처리한 멀티머 프라이온 시료에서만 응집 반응을 관찰하였다.

결과적으로, 본 발명의 응집반응 방법으로 생시료 내의 PrP^sc를 분별 검출할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 Ⅳ: 햄스터 뇌 균질액 내 PrP ^Sc 멀티머 검출

미리-제조된 햄스터 스크래피 뇌 균질액(10 중량%)을 구입하였다. 연령을 일치시킨 정상 뇌 균질액(10 중량%)을 PBS 및 균질기를 이용하여 제조하였다. 상기 뇌 균질액을 트립신(5 mg/ml)으로 37℃에서 1시간 동안 분해하고 상기 트립신 분해를 단백질분해효소 저해제 칵테일로 중지시켰다. 상기 시료를 8 M 구아니딘 하이드로클로라이드(Sigma, Gdn-HCl)로 처리하여 1.0 M로 만들고, 이어 주위 온도에서 15분 반응시켰다. 그런 다음, 상기 시료를 0.25 M Gdn-HCl로 만들기 위해서 TBST, 2 % 트리톤 X-100 및 0.5 % Na 데옥시콜레이트를 첨가하여 추가적으로 희석하였다. 상기 시료를 100℃에서 5-10분 동안 가열하였다. 상기 시료가 주위 온도에 도달한 후, 상기 시료를 MDS에 적용하였다. 상기 MDS 세트에 대하여, 플레이트 상에 코팅된 T2를 포획 항체로 이용하였고 T2-HRP를 검출 항체로 이용하였다.

상기 시료 100 ㎕를 T2가 코팅된 플레이트에 적용하였고 쉐이킹 하면서 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이어 TBST로 세척(4회)하였고, T2-HRP(1 ㎍/ml) 100 ㎕를 T2가 코팅된 플레이트 상에 포획된 멀티머 검출을 위하여 적용하였다. 상기 플레이트를 주위 온도에서 1시간 동안 반응시켰고, TBST로 4회 세척하였다. TMB 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였고, 신호를 나타나도록 하기 위하여 30분 동안 보관하였다. 1 N H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 상기 신호 발생을 중지시켰고, 플레이트 스펙트로포토미터를 이용하여 450 nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하였다.

도 5에서 볼 수 있듯이, 정상 시료보다도 훨씬 더 높은 신호를 스크래피 햄스터 뇌 균질액으로부터 관찰하였다. 단백질분해효소 K 또는 트립신의 처리는 결국 정상 PrP^c를완전히 분해하였다. 정상 및 스크래피 시료 간의 신호의 차이는 단백질분해효소 K 또는 트립신 분해를 이용하여 더욱 더 커졌다. 스크래피 시료가 단백질분해효소 K에 의해 부분적으로 분해되는 것이 관찰되었고, 이는 종전의 논문에서 논의 된 바와 같이 단백질분해효소 K-관련 프라이온 분석 방법의 위 음성 결과(false negative results)를 초래하는 요인이다. 반대로, 상기 트립신 처리는 스크래피 형을 분해하지 않는 것으로 규명되었고, 이는 결국 상당히 향상된 PrP^Sc의 검출을 가능하게 한다. PrP^Sc(멀티머)가 MDS에 의해 햄스터 스크래피 뇌 균질액에서 검출되었고, 정상 햄스터 시료에서는 검출되지 않았다.

실시예 Ⅴ: 혈장의 준비

혈액 시료를 정상 또는 산발성 CJD 환자로부터 채취하여 Na-시트레이트, EDTA 및 헤파린 튜브, 바람직하게는 헤파린에 넣었다. 혈장을 얻기 위해서, 일반적인 혈장 수집 과정을 이용하였다. 상기 튜브를 10-15분 동안 1000 X g 및/또는 2800 X g에서 원심 분리하였다. 투명한 상층액(혈장)을 분리하였고 -80℃에서 사용할 때까지 보관하였다. 연령-일치된 정상 및 스크래피 감염 햄스터 혈장을 5 마리 이상의 풀(pool)로부터 얻어 Na-시트레이트 튜브에 넣었다. 혈장을 상술한 바와 같이 얻었다. MDS에 적용되는 혈장 시료 처리를 위하여, 혈장을 구아니딘 하이드로클로라이드와 혼합하여(Sigma, Gdn-HCl), 최종 농도 1-2 M을 만들었고, 15-60분 동안 실온 또는 37℃에서 반응시켰다. 상기 시료를 계면활성제, 0.02% 살코실(Sigma), 0.5% 트리톤 X-100(Samchun Chemical), 0.125% 소듐 데옥시콜레이트(Sigma) 및 0.5% 또는 1% zwittergent-16(Anaphase Inc., 미국)을 포함하는 TBS 또는 PBS 완충액으로 희석하고, 실온에서 15분 동안 또는 15-60분 동안 37℃에서 반응시켜, 변성제의 최종농도를 0.125-0.5 M로 조절하였다. 그런 다음 상기 시료를 10-15분 동안 70℃에서 가열하였고 실온에 도달하도록 유지하였다.

실시예 Ⅵ: 컨트롤 ELISA 를 이용하여 총 PrP 농도에 대한 PrP ^Sc 검출

항체가 코팅된 플레이트를 하기 종래의 방법에 따라 준비하였다. 3O8(Cayman)의 에피토프는 KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG (106-126), 3F4(Sigma)의 에피토프는 MKHM (109-112)로서, 서로 오버-래핑되어 있다. 컨트롤 ELISA를 이용하여 인간 혈장 내 총 프라이온 단백질 검출을 하기 위해, 농도 1-5 ㎍/ml의 코팅 완충액(BupH Carbonate-Bicarbonate; PIERCE)을 이용하여 3O8, 3F4, 또는 3O8 및 3F4의 조합을 96-웰 폴리스티렌 마이크로티터 플레이트(NUNC) 상에 코팅하였다. 상기 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 보관하고, 이어 실온에서 30-60분 동안 TBS 또는 PBS(pH 7.4) 내 Startingblock(PIERCE) 또는 Block Ace (Serotec)로 블록킹하였다.

컨트롤 ELISA로 마우스 및 소 혈장 내 총 프라이온 단백질을 검출하기 위하여, 검출 항체로 T2-HRP, 포획 항체로 1F5 항-프라이온 항체를 이용하였다. 3F4 및 3O8이 마우스 또는 소의 프라이온 단백질에 결합 하지 않기 때문에, 마우스 및 소 프라이온 단백질에 결합할 수 있는, 1F5 항체를 이용하였다.

상기 혈장 시료를 마우스 프라이온을 검출하기 위하여 야생형 및 PrP 녹-아웃 마우스로부터, 그리고 인간 프라이온을 검출하기 위하여 정상 인간으로부터 얻었다. 상기 혈장 시료를 항체로 코팅된 플레이트 상에 분주하였고 37℃에서 60분 또는 그 이상의 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 0.05% Tween 20(Sigma)을 포함하는 TBS로 4회 세척하였다. 1-5 ㎍/ml 농도의 검출 항체, T2-HRP 또는 5G12-바이오틴(225-228)을 각 웰에 첨가하였고, 이어 37℃에서 1시간 반응시켰다. 상기 플레이트를 다시 세척하였고, 총 PrP를 스트렙타비딘/바이오틴/HRP 검출 시스템으로 검출하였다. TBST에 희석된 스트렙타비딘(2 ㎍/ml, Promega) 100 ㎕을, 각 웰에 첨가하였고, 주위 온도에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 0.05% Tween 20(Sigma)를 포함하는 TBS로 4회 세척하였다. TBST(Sigma)가 있는 10% Startingblock(PIERCE)를 이용하여 바이오틴-HRP(Molecular Probes)를 1 ㎍/ml까지 희석하였고, 이 희석액 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 주위 온도에서 1시간 반응시킨 후, 상기 플레이트를 0.05% Tween 20(Sigma)을 포함하는 TBS로 4회 세척하였다. TMB(100 ㎕, Sigma)를 상기 웰에 첨가하고 30분 동안 반응시켜 신호를 나타내게 하였다. 1 N H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 상기 신호 발생을 중지시켰고, 플레이트 스펙트로포토미터를 이용하여 450 nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하였다. HRP를 이용하였기 때문에, 많은 HRP 기질을 이용하여 광학 밀도, 형광, 화학발광, 방사능-동위원소, 전기화학 검출법을 실시할 수 있다.

도 6a에서 확인할 수 있듯이, 컨트롤 ELISA 시스템은 야생형 마우스로부터 얻은 혈장 시료로부터 농도-의존적으로 신호를 생성시키지만 프라이온 단백질이 없는 PrP 녹-아웃 마우스로부터는 신호를 생성시키지 않는다. 또한, 포획 및 검출 항체로서 각각 MA1-750 및 T2-HRP를 이용하는 본 발명의 MDS에 대한 실험에서, 야생형 및 PrP 녹-아웃 마우스의 혈장 시료에 대한 신호가 관찰되지 않았으며, 이는 혈장 시료가 멀티머형 PrP^Sc를 포함하고 있지 않기 때문이다(도 6b). 또한, 상기 컨트롤 ELISA 시스템은 정상 인간 혈장으로부터 농도-의존적인 신호를 보인다(도 6c).

실시예 Ⅶ: MDS 에 의한 재조합 프라이온 단백질 내의 PrP ^Sc 검출

소 및 마우스 재조합 프라이온 단백질의 PrP^Sc를 검출하기 위하여, MA1-750 항체를 포획 항체로 이용하였고 T2-HRP를 검출항체로 이용하였다. 인간 재조합 프라이온 단백질 내의 PrP^Sc를 검출하기 위하여, 3O8 및 3F4-바이오틴 항체를 각각포획 항체 및 검출 항체로 이용하였다.

상기 재조합 프라이온 단백질 시료를 0.05% Tween 20(Sigma)을 포함하는 TBS로 희석하였고, 3배씩 희석한, 2, 0.67, 0.22, 0.07, 0.02, 0.01 및 0 ㎍/ml의 단백질 시료를 포획항체로 코팅된 플레이트에 분주한 다음, 37℃에서 60분 또는 그 이상의 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 0.05% Tween 20(Sigma)을 포함하는 TBS로 4회 세척하였다. 1-5 ㎍/ml 농도로 상기 검출 항체를 각 웰에 첨가하였고, 이어 37℃에서 1시간 반응시켰다. 상기 플레이트를 다시 세척하였고 상기 멀티머를 스트렙타비딘/바이오틴/HRP 검출 시스템을 이용하여 검출하였다. TBST에 희석된, 스트렙타비딘 100 ㎕(2 ㎍/ml, Promega)를 각 웰에 첨가하였고, 주위 온도에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 0.05% Tween 20(Sigma)을 포함하는 TBS로 4회 세척하였다. 바이오틴-HRP(Molecular Probes)를 TBST(Sigma)로 10% Startingblock(PIERCE)에 1 ㎍/ml까지 희석하였고, 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 주위 온도에서 1시간 배양 이후, 상기 플레이트를 0.05% Tween 20(Sigma)을 포함하는 TBS로 4회 세척하였다. TMB(100 ㎕, Sigma)를 각 웰에 첨가하였고, 신호를 나타나도록 하기 위하여 30분 동안 보관하였다. 1 N H₂SO₄(50 ㎕)를 첨가하여 상기 신호 발생을 중지시켰고, 플레이트 스펙트로포토미터를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. HRP를 이용하였기 때문에, 많은 HRP 기질을 이용하여 광학 밀도, 형광, 화학발광, 방사능-동위원소, 전기화학 검출법을 실시할 수 있다. HRP를 이용하였기 때문에, 많은 HRP 기질을 이용하여 광학 밀도, 형광, 화학발광, 방사성 동위원소, 전기화학 검출법에서의 변화를 검출 할 수 있다.

도 7a-7c에서 볼 수 있듯이, 실시예 1의 웨스턴 블롯 결과와 일치되게, 농도-의존적으로 상기 MDS 방법에 의해 상기 멀티머를 소, 마우스 및 인간 재조합 프라이온 단백질 시료에서 검출하였다.

실시예 Ⅷ: 소 혈장에 스파이킹된 마우스 뇌의 정제된 PrP ^Sc 의 검출

스크래피 마우스 뇌로부터 정제된 PrP^Sc(프라이온의 멀티머형)를 100% 소 혈장에 스파이킹하고, 상기 MDS 프로토콜에 따라 MDS를 실시하였다. 간단하게 설명하면, 1.25, 0.42, 0.14, 0.05, 0.02 및 0% 정제된 PrP^Sc를100% 소 혈장에 첨가하여, 약 3.125, 1.04, 0.35, 0.12, 0.04, 0.01 및 0 ㎍/ml의 PrP^Sc를 얻었다. 스파이킹된 혈장 100 ㎕를 37℃에서 1시간 동안 MA1-750가 코팅된 플레이트 상에 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST로 4회 세척한 후, T2-HRP 검출 항체를 첨가하였고, 이어 주위 온도에서 1시간 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST로 4회 세척하였고 TMB를 30분 동안 신호를 나타내게 하기 위하여 첨가하였다. 정지용액(1 N H₂SO₄의 50 ㎕)을 첨가한 다음, 상기 플레이트를 450 nm에서 측정하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 상기 실험 결과는 100% 소 혈장 내 스크래피 마우스 뇌로부터의 정제된 PrP^Sc(프라이온의 멀티머형)를 MDS에 의해 농도-의존적으로 검출하였다. 스크래피 마우스 뇌로부터 정제된 PrP^Sc가 없는 소 혈장 시료는 어떠한 신호도 나타내지 않았다.

실시예 Ⅸ: 소 혈장의 농축

본 실험의 목적은 농축 후의 소 혈장 내의 프라이온 멀티머를 검출하기 위한 것이었다. 소 혈장을 Amino 원심분리 농축기를 이용하여 200, 400, 및 500%까지 농축하였다. 상기 농축된 시료를 상기 프로토콜에 따라 컨트롤 ELISA 및 MDS로 분석하였다. MA1-750 및 T2-HRP의 한 세트를 MDS를 위해 이용하였고 1F5 및 T2-HRP의 한 세트를 컨트롤 ELISA를 위해 이용하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 소 혈장 내 프라이온이 컨트롤 ELISA에 의해 검출되었으나; MDS에 의해서는 다양한 혈장 농축물에서 어떠한 신호도 관찰하지 않았고, 이 결과는 정상 소 혈장 내 프라이온 단백질이 모노머형으로 존재함을 나타내는 것이다.

실시예 Ⅹ: 혈장에서 PrP ^Sc 검출

3O8 항체를 포획 항체로, 그리고 3F4-바이오틴을 검출항체로 이용하였다. 혈장 시료를 3O8(Cayman)로 코팅된 플레이트상에 분주하였고 37℃에서 60분 또는 그 이상의 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 0.05% Tween 20(Sigma)을 포함하는 TBS로 4회 세척하였다. 1-5 ㎍/ml 농도로, 검출 항체인, 3F4-바이오틴을 각 웰에 첨가하였고, 이어 37℃에서 1시간 반응시켰다. 상기 플레이트를 다시 세척하였고 상기한 바와 같이 스트렙타비딘/바이오틴/HRP 검출 시스템을 이용하여 멀티머를 검출하였다. HRP를 이용하였기 때문에, 많은 HRP 기질을 이용하여 광학 밀도, 형광, 화학발광, 방사성 동위원소, 전기화학 검출법에서의 변화를 검출할 수 있다.

도 10a 및 10b에 나타난 바와 같이, 햄스터 및 인간의 혈장은 어떠한 신호도 나타내지 않았는데, 이는 프라이온 멀티머가 부 존재함을 의미한다. 한편, 신호를 스크래피 햄스터 및 인간 CJD 환자의 혈장으로부터 관찰하였는데, 이는 프라이온 멀티머가 존재함을 의미한다. 본 실시예에서 혈장(수율 24%) 24 ㎕를 이용한 경우에도 프라이온 멀티머형을 성공적으로 검출할 수 있다는 결과에 기초하여, 본 발명의 MDS의 민감도를 5 ㎕ 혈장까지 낮출 수 있음을 알 수 있다. 도 10에서, 완충액 1 및 완충액 2는 상기 코팅된 플레이트를 처리하는 서로 다른 블록킹 완충액을 나타낸다. 완충액 1 및 2는 각각 Block Ace(25%, Serotec) 및 50% Starting Block(Pierce Inc.)로 블록킹된 코팅 플레이트를 나타낸다. 정상 PrP^c로부터PrP^Sc 멀티머를 분별 검출하기 위하여 포획 항체 플레이트를 처리하는 데 이용되는 서로 다른 블록킹 완충액 간에는, 큰 차이가 없었다.

실시예 ⅩⅠ: 칵테일 된 포획 항체를 이용하여 PrP ^Sc 검출

3 ㎍/ml 또는 5 ㎍/ml(150 ㎕)의 3O8 항체를 이용하여 3O8-코팅 플레이트를 준비하였다. 3 ㎍/ml(150 ㎕)의 3F4 항체를 이용하여 3F4-코팅 플레이트를 만들었다. 2.5 ㎍/ml의 308 및 1.5 ㎍/ml의 3F4, 또는 3 ㎍/ml의 308 및 1 ㎍/ml의 3F4 150 ㎕를 이용하여 3O8/3F4 칵테일-코팅 플레이트를 만들었다. 모든 플레이트를 25% Block Ace(Serotec)로 블록킹 하고, PBS 300 ㎕로 세척하였다.

인간 혈장 시료(488.4 ㎕)를 200 ㎍/ml의 인간 재조합 PrP 11.4 ㎕ 및 8 M Gdn-HCl 71.4 ㎕와 혼합하고, 상기 혼합물을 주위 온도에서 15분 동안 반응시켰다. 상기 시료를 12% 트리톤 X-100, 6% Na-데옥시콜레이트 및 1% 살코실을 포함하는 PBS 228.5 ㎕로 희석하였고, 이어 추가적으로 PBS 1485 ㎕로 희석하였다. 상기 시료를 70℃에서 10분 동안 가열하고, 15분 동안 냉각하였다. 상기 시료를 가열 단계 없이 10분 동안 실온에서 유지하였다. 상기 전 처리된 시료는 2.28 ㎍ PrP, 0.25 M Gdn, 1.2% 트리톤 X-100, 0.6% Na-데옥시콜레이트, 0.1% 살코실 및 21.4% 혈장을 포함한다. 그런 다음, 시료 200 ㎕를 MDS에 적용하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 웰에 비결합된 시료를 TBST(Sigma)로 4회 세척한 후, 3F4-바이오틴(10% Startingblock을 함유하는 TBST 내 2.5 ㎍/ml) 150 ㎕를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST(Sigma) 300 ㎕로 4회 세척하고, KPL SA-HRP(10% Startingblock을 함유하는 TBST 내 2 ㎍/ml) 150 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST(Sigma) 300㎕로 4회 세척하였다. TMB(150 ㎕, Sigma)를 각 웰에 첨가하였고 신호를 나타나도록 30분 동안 보관하였다. 1 N H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 상기 신호 발생을 중지시켰고, 상기 신호를 플레이트 스펙트로포토미티를 이용하여 450 nm에서 흡광도로 측정하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, 상기 실험 결과는 3O8-코팅 플레이트 및 칵테일된 3O8/3F4-코팅 플레이트로부터 나타나는 신호에 있어 많은 차이점이 없음을 나타낸다.

실시예 ⅩⅡ: 플라스미노겐 저해제를 이용하여 PrP ^Sc 검출

플라스미노겐은 프라이온 단백질, 특히 PrP^Sc 에 결합하는 것으로 알려져 있다. 혈장은 프라이온 단백질(2-20 ng/ml)과 비교하여 볼 때 상대적으로 고농도의 플라스미노겐(300 ㎍/ml)을 포함한다. 프라이온은 혈장 또는 다른 생시료에서 플라스미노겐과 복합체로서 존재할 수 있다. PMCA에 플라스미노겐의 첨가는 PrP^Sc의 증폭을 억제하였고, 이는 플라스미노겐이 혈장의 PrP^Sc(멀티머) 검출을 방해할 수 있음을 나타낸다. 따라서 MDS를 인간 혈장에 스파이킹된 인간 재조합 프라이온 단백질을 이용하여 실시하였다.

3O8-코팅 플레이트를 5 ㎍/ml 3O8 항체 150 ㎕로 준비하였다. 플레이트를 25% Block Ace(Serotec)로 블록킹 하고, PBS 300 ㎕로 세척하였다.

0, 1, 10 및 100 mM 플라스미노겐 억제제, 아미노카프론산 또는 (트랜스-(아미노메틸)사이클로헥산카르복실산과 8 M Gdn-HCl 71.4 ㎕ 존재 하에서 인간 혈장 시료(488.4 ㎕)를 200 ㎍/ml의 인간 재조합 PrP 11.4 ㎕와 혼합하거나 또는 혼합하지 않은 다음, 상기 혼합물을 주위 온도에서 15분 동안 반응시켰다. 상기 시료를 12% 트리톤 X-100, 6% Na-데옥시콜레이트 및 1% 살코실을 함유하는 PBS 228.5 ㎕로 희석하고, 이어 PBS 1485 ㎕를 추가적으로 첨가하였다. 상기 시료를 70℃에서 10분 동안 가열하고 15분 동안 냉각하였다. 가열 단계 없이 상기 시료를 실온에서 10분 동안 유지하였다. 상기 전 처리된 시료는 2.28 ㎍ PrP, 0.25 M Gdn, 1.2% 트리톤 X-100, 0.6% Na-데옥시콜레이트 및 0.1% 살코실을 함유하는 21.4% 혈장을 포함한다. 그런 다음, 시료 중 200 ㎕를 MDS에 적용하였고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 웰에 비 결합된 시료를 TBST(Sigma)로 4회 세척한 후, 3F4-바이오틴(10% Startingblock을 함유하는 TBST 내 2.5 ㎍/ml) 150 ㎕를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST(Sigma) 300㎕로 4회 세척하고, KPL SA-HRP(10% Startingblock을 포함하는 TBST 내 2 ㎍/ml) 150 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음, 1시간 동안 주위 온도에서 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST(Sigma) 300 ㎕로 4회 세척하였다. TMB(150 ㎕, Sigma)를 각 웰이 첨가하고, 신호를 나타나도록 하기 위하여 30분 동안 보관하였다. 1 N H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 신호 발생을 중지시켰고, 상기 신호 발생을 중지시켰고, 상기 신호를 플레이트 스펙트로포토미터를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 실험은, 플라스미노겐 억제제인 아미노 카프론산(ACA) 또는 트랜스-(아미노메틸)사이클로헥산카르복실산(AMCHA)을 이용하여 실시된 본 발명 방법의 분석적인 결과를 보여주며, 이는 인간 혈장에 스파이킹 된 인간 재조합 프라이온 단백질의 멀티머형(PrP^Sc) 검출을 강화하기 위한 것이다(표 2). 표 2의 값은 450 nm에서의 광학 밀도 값이다. 시료 준비 완충액 내에 있는 ACA 및 AMCHA의 모든 농도에서, 인간 혈장에 스파이킹된 인간 재조합 프라이온 단백질의 검출이 개선되었다. ACA와 AMCHA 등과 같은 플라스미노겐 억제제는 시료 내의 PrP^Sc로부터 플라스미노겐을 치환함으로써 생시료 내의 PrP^Sc(멀티머) 검출을 강화한다.

플라스미노겐 억제제	인간 재조합 PrP와 혈장	혈장	비-특이적 결합	신호의 비^**
AMCHA 100 mM	0.751^*	0.4339^*	0.4933^*	1.7
AMCHA 10 mM	0.7155	0.453	0.4753	1.6
AMCHA 1 mM	0.711	0.3855	0.4499	1.8
ACA 100 mM	0.52	0.4036	0.4665	1.3
ACA 10 mM	0.5723	0.4098	0.4128	1.4
ACA 1 mM	0.6507	0.3737	0.4549	1.7
무처리	1.1961	1.1702	0.5325	1.0

^*는 450 nM에서의 광학 밀도 값을 나타낸다.

^**고정된 혈장 및 혈장만의 시료의 신호의 비를 나타낸다.

실시예 ⅩⅢ: 다른 항체 세트를 이용하여 소 혈장에 스파이킹된 마우스 뇌로부터 PrP ^Sc 검출

실시예 Ⅷ에 상술한 바와 같이 스크래피 마우스 뇌로부터 정제된 PrP^Sc를 100% 소 혈장에 스파이킹 하고, 상기 MDS 프로토콜에 따라 MDS를 실시하였다. 간단하게 설명하면, 0.0083, 0.0028, 0.0009, 0.0003 및 0% 정제된 PrP^Sc를 100% 소 혈장에 첨가하여, 약 0.0033, 0.0011, 0.0004, 0.0001 및 0 ㎍/ml의 PrP^Sc를 얻었다. 스파이킹된 혈장 100 ㎕를 37℃에서 1시간 동안 4E10-코팅 플레이트 상에 반응시켰다. 4E10 항체를 동물보건 국립연구소(일본)로부터 기증받았다. TBST로 상기 플레이트를 4회 세척한 후, 4E10-HRP 검출 항체를 첨가하였고, 이어 주위 온도에서 1시간 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST로 4번 세척하고 화학발광 기질(Femto, Pierce)을 첨가하였다. 상기 플레이트를 케미일루미노미터에서 측정하였다.

도 12에 나타난 바와 같이, 상기 실험 결과는 MDS를 이용하여 100% 소 혈장 내 스크래피 마우스 뇌로부터 정제된 PrP^Sc(프라이온의 멀티머형)을 농도-의존적으로 검출하였다. 스크래피 마우스로부터 정제된 PrP^Sc가 없는 소 혈장 시료는 어떠한 신호도 나타내지 않았다. 또한, 프라이온의 아미노산 187-197에 대한 4E10 항체를 MDS에 이용할 수 있고, 이는 MDS가 특별한 서열 및 영역을 요구하지 않는 시스템임을 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> PEOPLEBIO, Inc. <120> METHOD FOR DIFFERENTIALLY DETECTING MULTIMERIC FOMR FROM MONOMERIC FORM OF MULTIMER-FORMING POLYPEPTIDES <150> KR2005-0013877 <151> 2005-02-19 <150> PCT/KR2005/000733 <151> 2005-03-11 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 253 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp 1 5 10 15 Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 50 55 60 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 65 70 75 80 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His 85 90 95 Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met 100 105 110 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 115 120 125 Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp 130 135 140 Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln 145 150 155 160 Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val 165 170 175 His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr 180 185 190 Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg 195 200 205 Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala 210 215 220 Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val 225 230 235 240 Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 <210> 2 <211> 263 <212> PRT <213> bovine <400> 2 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala 1 5 10 15 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly 20 25 30 Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly 35 40 45 Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 50 55 60 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 65 70 75 80 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro 100 105 110 Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met 130 135 140 Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr 145 150 155 160 Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val 165 170 175 Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile 180 185 190 Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe 195 200 205 Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys 210 215 220 Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Asp Gln Gly Ala 225 230 235 240 Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe 245 250 255 Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 260

Claims

다음의 단계를 포함하는 생시료(biosample)의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법:

(a) 상기 모노머 및 멀티머형을 포획(capturing)하는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 인식하는 포획 항체에 생시료를 접촉시키는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 에피토프와 오버래핑된 에피토프를 인식하는 검출 항체에 상기 포획된 모노머형, 멀티머형 또는 모노머 및 멀티머형을 접촉시키는 단계; 및

(c) 멀티머형-검출 항체 복합체를 검출하는 단계;

상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 Aβ 펩타이드, β-아밀로이드 또는 프라이온이다.
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제 1 항에 있어서, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 프라이온 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 모노머형은 PrP^c이고, 멀티머형은 PrP^sc인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 포획 항체가 인식하는 에피토프는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 검출 항체가 인식하는 에피토프는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 포획 항체는 고체 기질에 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 검출 항체는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 검출 항체에 결합된 표지는 화합물 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 또는 FRET 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 생시료는 뇌 균질액 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 방법은 생시료로서 뇌 균질액을 이용하는 경우, 상기 단계 (a) 이전에 트립신으로 상기 생시료를 처리하는 단계를 추가적으로 포함하 는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a) 이전에 단백질 변성제로 상기 생시료를 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a) 이전에 상기 생시료를 가열하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 방법은 생시료로서 혈장을 이용하는 경우, 상기 생시료는 살코실 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 방법은 생시료로서 혈장을 이용하는 경우, 단백질분해효소 처리 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 방법은 생시료로서 혈장을 이용하는 경우, 상기 단 계 (a) 이전에 플라스미노겐 억제제로 상기 생시료를 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 플라스미노겐 억제제는 오메가-아미노카르복실산, L-라이신 및 이의 유도체, 양성이온(zwitterions), 벤질아민, 벤즈아미딘, L-아르기닌 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 포획 및/또는 검출 항체는 인간 프라이온 서열로 기재된 서열목록 제 1 서열의 아미노산 109-112, 106-126, 132-147 또는 135-140으로 이루어진 아미노산 서열을 가지는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 생시료는 소 뇌 균질액이고 상기 포획 및/또는 검출 항체는 소 프라이온 서열로 기재된 서열목록 제 2 서열의 아미노산 145-150 또는 142-157으로 이루어진 아미노산 서열을 가지는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 생시료는 인간 혈장이고 상기 포획 및/또는 검출 항체는 인간 프라이온 서열로 기재된 서열목록 제 1 서열의 아미노산 109-112 또는 106-126으로 이루어진 아미노산 서열을 가지는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 멀티머-형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 인식하는 포획 항체; 및 (b) 상기 포획 항체가 인식하는 상기 에피토프와 오버래핑된 에피토프를 인식하는 검출 항체를 포함하는, 상기 제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 방법을 실시하기 위한, 생시료의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하기 위한 키트로서, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 Aβ 펩타이드, β-아밀로이드 또는 프라이온인 것을 특징으로 하는 키트.
삭제
제 22 항에 있어서, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 프라이온 단백질인 것을 특징으로 하는 키트.
제 24 항에 있어서, 상기 모노머형은 PrP^c이고, 멀티머형은 PrP^sc인 것을 특징으로 하는 키트.
제 22 항에 있어서, 상기 포획 항체가 인식하는 에피토프는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
제 22 항에 있어서, 상기 검출 항체가 인식하는 에피토프는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 22 항에 있어서, 상기 포획 항체는 고체 기질에 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
제 22 항에 있어서, 상기 검출 항체는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지를 가지는 것을 특징으로 하는 키트.
제 30 항에 있어서, 상기 검출 항체에 결합된 표지는 화합물 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 또는 FRET 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
제 22 항에 있어서, 상기 생시료는 뇌 균질액 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 키트.
제 22 항에 있어서, 상기 키트는 트립신, 단백질 변성제, 계면활성제 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 22 항에 있어서, 상기 포획 및/또는 검출 항체는 인간 프라이온 서열로 기재된 서열목록 제 1 서열의 아미노산 109-112, 106-126, 132-147 또는 135-140으로 이루어진 아미노산 서열을 가지는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 34 항에 있어서, 상기 생시료는 소 뇌 균질액이고 상기 포획 및/또는 검출 항체는 소 프라이온 서열로 기재된 서열목록 제 2 서열의 아미노산 145-150 또는 142-157으로 이루어진 아미노산 서열을 가지는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 34 항에 있어서, 상기 생시료는 인간 혈장이고 상기 포획 및/또는 검출 항체는 인간 프라이온 서열로 기재된 서열목록 제 1 서열의 아미노산 109-112 또는 106-126으로 이루어진 아미노산 서열을 가지는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 키트.
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