CN102584976B - 一种人血清淀粉样蛋白a1及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人血清淀粉样蛋白A1及其制备方法和应用。本发明还公开了人血清淀粉样蛋白A1的多聚体及人血清淀粉样蛋白A1的多肽片段。本发明的人血清淀粉样蛋白A1、多聚体、多肽片段均具有抑制炎性细胞因子表达的能力,可用于抑制炎症及治疗炎症相关疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种人血清淀粉样蛋白A1及其制备方法和应用。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(Serum Amyloid A,SAA)是机体受到感染和损伤时分泌的一种主要的急性期蛋白。SAA是一个多态性蛋白的总称,由相关但各具独立基因的蛋白(SAA1-SAA4)组成。其中,人血清淀粉样蛋白A1(SAA1)由104个氨基酸组成,主要由肝细胞合成,人SAA2与人SAA1有7个氨基酸的差别,它们均为急性期蛋白,在炎症反应中作用相近。人SAA3是一个假基因,人SAA4在急性期反应中变化不大,在机体中持续少量产生。
研究表明,SAA1在急性和慢性炎症患者血清内含量均有变化,因此是一个反映感染性和非感染性炎症疾病的重要生物检测指标。SAA1不仅是慢性阻塞性肺病急性加重期的生物标志物,也是急性心梗患者在接受急诊冠状动脉介入手术后发生心脏破裂的预期因子,这为早期发现心脏破裂患者提供了重要参考指标。其他大量研究也表明,在胰腺炎、肝炎、冠心病、糖尿病、慢性肾脏疾病、类风湿性关节炎及肥胖病例中,SAA1升高与疾病活动和病程发展有非常密切的关系。目前临床研究还认为,所有急性期反应蛋白中,SAA1对急性炎症反应最敏感,升值幅度最大。同时研究还表明SAA1与甲胎蛋白等肿瘤相关蛋白相似,其在血清中的浓度与癌症发生呈正相关。因此,在临床上对SAA1在病人血清中含量的检测具有辅助诊断价值。
同时,SAA1不仅是一种简单的炎症标志物,还积极介入疾病的相关过程。在急性感染或者炎症发生时,血清内SAA1的水平可提升1000倍。高水平的SAA1将导致淀粉样病变,而且低密度脂蛋白LDL与SAA1的结合物(LDL-SAA)可提高心血管疾病的风险;同时,SAA1还具有促炎反应的特性,促进多种细胞因子的分泌,如IL-1β,IL-6,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),CCL20等,这些细胞因子都参与炎症导致的疾病的发病过程,如,风湿性关节炎,肌肉萎缩,痛风,动脉粥样硬化等。由于SAA1与多种疾病的发生相关,针对SAA1的治疗方法已越来越受到重视。
目前,已知SAA1与四种受体结合,Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)包括TLR2和TLR4,CD36(B类清道夫受体,a class B scavenger receptor),及其G蛋白偶联受体甲酰肽受体2/脂氧素A4受体(formyl peptide receptor2/lipoxin A4receptor,FPR2/LXA4R)。SAA1与不同的受体结合所发挥的生物学活性不一样,例如,SAA1与甲酰肽受体2结合可诱导滑液超常增生及其内皮细胞的增殖,从而导致类风湿性关节炎的发生;SAA1与CD36结合可促进胆固醇的代谢;SAA1与TLR2结合可产生炎症诱发因子,导致动脉粥样硬化等疾病;SAA1与TLR4结合可诱导NO的产生。
由此可见,SAA1在机体中发挥多种生物学活性。目前,SAA1均采用大肠杆菌表达获得,结合了革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖即LPS,由于SAA1与脂多糖及其脂类有极强的结合作用,一旦结合就难于分离,难以获得不含脂多糖的SAA1。
此外,本领域还需要开发能够抑制天然SAA活性的物质,用于治疗SAA过高所造成的炎症及其疾病。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种新型的hSAA1的制备方法,获得的hSAA1不受脂多糖干扰,并对其生物学功能进行研究。
本发明的第一方面,提供一种重组人血清淀粉样蛋白A1,所述重组人血清淀粉样蛋白A1为以酵母为宿主所表达的重组人血清淀粉样蛋白A1。
在另一优选例中,所述重组人血清淀粉样蛋白A1具有以下一个或多个特征:
(a)分子量为12~14KD的单体;
(b)抑制天然人血清淀粉样蛋白A的活性;
(c)具有抑制炎性细胞因子表达的能力。
在另一优选例中,所述炎性细胞因子包括IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-12、MMP9。
本发明的第二方面,提供一种人血清淀粉样蛋白A1的多聚体,所述多聚体为第一方面所述的重组人血清淀粉样蛋白A1的多聚体。
在另一优选例中,所述多聚体具有以下一个或多个特征:
(a)所述多聚体是二聚体,三聚体、四聚体或其组合;
(b)抑制天然人血清淀粉样蛋白A的活性;
(c)具有抑制炎性细胞因子表达的能力。
在另一优选例中,所述二聚体的分子量为约25~27KD;所述三聚体的分子量为约38~40KD;所述四聚体的分子量为约41~43KD。
在另一优选例中,所述炎性细胞因子包括IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-12、和MMP9。
在另一优选例中,所述多聚体为以酵母为宿主所表达的人血清淀粉样蛋白A1的多聚体。
本发明的第三方面,提供一种人血清淀粉样蛋白A1多肽片段,所述的多肽片段同时具有以下特征:
(i)该多肽片段的序列来源于人血清淀粉样蛋白A1的氨基酸序列;
(ii)该多肽片段的长度为20-100个氨基酸;
(iii)该多肽片段抑制天然人血清淀粉样蛋白A的活性;
(iv)该多肽片段具有抑制炎性细胞因子表达的能力。
在另一优选例中,所述多肽片段为以酵母为宿主所表达的多肽片段。
在另一优选例中,所述多肽具有野生型人血清淀粉样蛋白A1氨基酸序列的第7-30位、第11-45位、第27-72位、第27-90位、第29-104位、第27-104位、第9-72位、或第72-104位的氨基酸序列。
在另一优选例中,野生型人血清淀粉样蛋白A1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中,所述多肽片段的N端和/或C端还带有用于纯化分离等目的的标签序列(如6His、或HIS6-SUMO-TEV片段)。
本发明的第四方面,提供一种酵母表达载体,含有编码人血清淀粉样蛋白A1的基因;或
该载体含有第三方面所述的多肽片段的多核苷酸。
在另一优选例中,所述载体为含有编码人血清淀粉样蛋白A1基因或含有编码第三方面所述的多肽片段的多核苷酸的酵母表达载体pPIC9K,编码人血清淀粉样蛋白A1基因位于pPIC9K载体上XhoI和EcoRI酶切位点之间。
本发明的第五方面,提供一种酵母宿主细胞,所述宿主细胞选自下组:
(a)含有第四方面所述的载体的宿主细胞;
(b)染色体中整合有编码hSAA1蛋白的基因的宿主细胞;
(c)染色体中整合有编码第三方面所述的多肽片段的多核苷酸的宿主细胞。
本发明的第六方面,提供一种重组人血清淀粉样蛋白A1、或重组人血清淀粉样蛋白A1多聚体、或人血清淀粉样蛋白A1多肽片段的制备方法,包括,
(i)在适合表达的条件下,培养第五方面所述的宿主细胞,从而表达本发明的重组人血清淀粉样蛋白A1、或本发明的多聚体、或本发明的多肽片段;和
(ii)从培养产物中分离出所述的重组人血清淀粉样蛋白A1、或其多聚体、或其多肽片段。
本发明的第七方面,提供一种药物组合物,它含有药学上可接受的载体或赋形剂;以及选自下组的活性成分:
(a1)本发明的重组人血清淀粉样蛋白A1;
(a2)本发明的人血清淀粉样蛋白A1的多聚体;
(a3)本发明的人血清淀粉样蛋白A1多肽片段。
在另一优选例中,所述的药物组合物的剂型为注射制剂、透皮制剂、冻干粉剂。
本发明的第八方面,提供一种重组人血清淀粉样蛋白A1,或者重组人血清淀粉样蛋白A1多聚体,或者人血清淀粉样蛋白A1多肽片段的用途,用于制备抑制炎症和/或治疗炎症相关疾病的药物。
在另一优选例中,所述的炎症相关疾病选自下组:风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心血管疾病、胰腺炎、肝炎、糖尿病、慢性肾脏疾病、肥胖病、肌肉萎缩、和痛风。
在另一优选例中,所述炎症为SAA过高所造成的炎症。
本发明的第九方面,提供一种重组的人血清淀粉样蛋白A1或其多肽片段、或其多聚体,所述重组人血清淀粉样蛋白A1或其多肽片段、或其多聚体是在酵母中表达的,并且抑制天然人血清淀粉样蛋白A的活性。
在另一优选例中,所述的抑制为竞争性抑制。
在另一优选例中,所述重组人血清淀粉样蛋白A1或其多肽片段、或其多聚体具有抑制炎性细胞因子表达的能力,并且具有以下特征之一:
(a)人血清淀粉样蛋白A1单体的分子量为12~14KD;
(b)所述的多聚体为二聚体,三聚体、四聚体或其组合;
(c)该多肽片段的序列来源于人血清淀粉样蛋白A1的氨基酸序列,且该多肽片段的长度为20-100个氨基酸。
在另一优选例中,所述炎性细胞因子包括IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-12、和MMP9。
在另一优选例中,所述二聚体的分子量为约25~27KD;所述三聚体的分子量为约38~40KD;所述四聚体的分子量为约41~43KD。
本发明的第十方面,提供一种抑制炎症或治疗炎症相关疾病的方法,包括给需要的对象施用选自下组的组分的步骤:
(a)本发明的重组人血清淀粉样蛋白A1;
(b)本发明的人血清淀粉样蛋白A1的多聚体;
(c)本发明的人血清淀粉样蛋白A1多肽片段。
在另一优选例中,所述的对象为哺乳动物。更佳地,所述对象为人。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为dot-blotting检测酵母表达的hSAA1的表达水平图。
图2为酵母表达的hSAA1纯化产物的SDS-PAGE及其Western-blotting检测图。
图3为酵母表达的hSAA1多肽片段纯化后SDS-PAGE图。
图4为酵母表达的hSAA1刺激THP-1细胞,IL-6细胞因子分泌的检测图。
图5为酵母表达的hSAA1刺激THP-1细胞,TNFα细胞因子分泌的检测图。
图6为酵母表达的hSAA1单体刺激THP-1细胞,IL-1β细胞因子分泌的检测图。
图7为酵母表达的hSAA1多肽片段刺激THP-1细胞,IL-6细胞因子分泌的检测图。
图8为酵母表达的hSAA1多肽片段刺激THP-1细胞,IL-1β细胞因子分泌的检测图。
图9为酵母表达的hSAA1多聚体刺激THP-1细胞,IL-1β细胞因子分泌的检测图。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究,意外发现,将hSAA1蛋白或其片段通过酵母***表达时,不仅可获得糖基化的重组hSAA1或其片段,而且这种特定的hSAA1或其片段居然是天然hSAA的抑制剂,与天然hSAA合用时,可以显著降低(或抑制)天然hSAA的活性。在此基础上,完成了本发明。
具体地,本发明采用含有编码hSAA1蛋白的基因酵母表达载体转染的酵母细胞,经培养、筛选、诱导分泌、纯化可得到hSAA1及其多聚体,没有脂多糖干扰。试验表面,由酵母作为宿主表达的hSAA1或多聚体,具有抑制炎性细胞因子的能力。
进一步地,为了研究hSAA1与受体结合的结构域和功能域,发明人合成了多种编码hSAA1的多肽的氨基酸序列,使用酵母作为宿主表达获得hSAA1的多肽片段,结果表明由酵母作为宿主表达的hSAA1多肽片段也具有抑制炎性细胞因子的能力。
术语
如本文所用,术语“炎症相关疾病”指伴随有炎症或由炎性细胞因子表达过高引起的疾病,包括但不限于,风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心血管疾病、胰腺炎、肝炎、糖尿病、慢性肾脏疾病、肥胖病、肌肉萎缩、和痛风。
重组人血清淀粉样蛋白A1及其多聚体
本发明的重组人血清淀粉样蛋白A1(重组hSAA1),是以酵母为宿主所表达的重组人血清淀粉样蛋白A1。
在另一优选例中,所述重组人血清淀粉样蛋白A1具有以下一个或多个特征:
(a)分子量为12~14KD的单体;
(b)抑制天然人血清淀粉样蛋白A的活性;
(c)具有抑制炎性细胞因子表达的能力。
在另一优选例中,所述炎性细胞因子包括IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-12、MMP9。
本发明的重组人血清淀粉样蛋白A1,没有结合脂多糖。
在另一优选例中,所述抑制为竞争性抑制。
编码重组人血清淀粉样蛋白A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
重组人血清淀粉样蛋白A1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
本发明提供的人血清淀粉样蛋白A1的多聚体为本发明的重组人血清淀粉样蛋白A1的多聚体。
在另一优选例中,所述多聚体具有以下一个或多个特征:
(a)所述多聚体是二聚体,三聚体、四聚体或其组合;
(b)抑制天然人血清淀粉样蛋白A的活性;
(c)具有抑制炎性细胞因子表达的能力。
在另一优选例中,所述二聚体的分子量为约25~27KD;所述三聚体的分子量为约38~40KD;所述四聚体的分子量为约41~43KD。
在另一优选例中,所述炎性细胞因子包括IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-12、MMP9。
在另一优选例中,所述多聚体为以酵母为宿主所表达的人血清淀粉样蛋白A1的多聚体。
在另一优选例中,所述抑制为竞争性抑制。
本发明的重组人血清淀粉样蛋白A1及其多聚体的制备方法,包括步骤:
(a)提供含有编码人血清淀粉样蛋白A1的基因的酵母表达载体;
(b)提供含有所述酵母表达载体的酵母宿主细胞;
(c)在适合表达的条件下,培养所述的酵母宿主细胞,从而表达本发明的重组人血清淀粉样蛋白A1、或本发明的多聚体;和
(d)从培养产物中分离出所述的重组人血清淀粉样蛋白A1、或其多聚体。
在另一优选例中,将编码人血清淀粉样蛋白A1的基因经扩增、双酶切后连接到市售载体(如pPIC9K),获得步骤(a)所述的酵母表达载体。pPIC9K为一个高效表达外源蛋白质的分泌型载体,其上带有信号肽α-factor,能将hSAA1分泌到培养基中。
在另一优选例中,利用XhoI和EcoRI双酶切将hSAA1基因连接到经XhoI和EcoRI双酶切载体pPIC9K的α-factor下游,中间接有Kex2signal cleavage(载体自身携带),可在分泌表达的过程中将α-factor切除,释放hSAA1的N末端。
在另一优选例中,步骤(b)中采用酵母表达载体转染酵母GS115。
在另一优选例中,步骤(b)中采用电转化方法进行转染。
在另一优选例中,步骤(c)中采用组氨酸营养缺陷型平板培养酵母,筛选酵母单克隆。
在另一优选例中,所述步骤(d)采用G418进行筛选。
在另一优选例中,所述步骤(e)采用甲醇进行诱导表达,得到所述重组人血清淀粉样蛋白A1及其多聚体。
在另一优选例中,所述方法还包括对表达量较高的单克隆进行大量发酵及纯化的步骤。
在另一优选例中,所述纯化是指利用亲和层析进行纯化。
人血清淀粉样蛋白A1的多肽片段
一种人血清淀粉样蛋白A1多肽片段,具有以下特征:
(i)该多肽片段的序列来源于人血清淀粉样蛋白A1的氨基酸序列;
(ii)该多肽片段的长度为20-100个氨基酸;
(iii)该多肽片段抑制天然人血清淀粉样蛋白A的活性;
(iv)该多肽片段具有抑制炎性细胞因子表达的能力。
在另一优选例中,所述多肽片段为以酵母为宿主所表达的多肽片段。
本发明的多肽片段,包括但不限于P7-30、P11-45、P27-72、P27-90、P29-104、P27-104、P9-72、P72-104或其组合。其中数字代表在人血清淀粉样蛋白A1的氨基酸序列中始端和末端氨基酸位置。即所述多肽具有野生型人血清淀粉样蛋白A1氨基酸序列的第7-30位、第11-45位、第27-72位、第27-90位、第29-104位、第27-104位、第9-72位、或第72-104位的氨基酸序列。
在另一优选例中,野生型人血清淀粉样蛋白A1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
本发明的多肽可以是重组多肽、合成多肽,优选重组多肽。本发明的多肽可以是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。
在另一优选例中,本发明的多肽片段是重组多肽,为酵母为宿主进行表达获得的多肽片段。
本发明的人血清淀粉样蛋白A1的多肽片段的制备方法,包括步骤:
(a)提供含有编码人血清淀粉样蛋白A1的多肽片段的多核苷酸的酵母表达载体;
(b)提供含有所述酵母表达载体的酵母宿主细胞;
(c)在适合表达的条件下,培养酵母宿主细胞,从而表达本发明的多肽片段;和
(ii)从培养产物中分离出所述的多肽片段。
在另一优选例中,将编码人血清淀粉样蛋白A1的多肽片段的多核苷酸经扩增、双酶切后连接到pPIC9K,获得步骤(a)所述的酵母表达载体。
在另一优选例中,利用XhoI和EcoRI双酶切将编码人血清淀粉样蛋白A1的多肽片段的多核苷酸连接到经XhoI和EcoRI双酶切载体pPIC9K上。
在另一优选例中,步骤(b)中采用酵母表达载体转染酵母GS115。
在另一优选例中,步骤(b)中采用电转化方法进行转染。
在另一优选例中,步骤(c)中采用组氨酸营养缺陷型平板培养酵母,筛选酵母单克隆。
在另一优选例中,所述步骤(d)采用G418进行筛选。
在另一优选例中,所述步骤(e)采用甲醇进行诱导表达,得到所述重组人血清淀粉样蛋白A1及其多聚体。
在另一优选例中,所述方法还包括对表达量较高的单克隆进行大量发酵及纯化的步骤。
在另一优选例中,所述多肽片段的N端带有HIS6-SUMO-TEV片段,既可增强多肽的表达产量,还可方便纯化,纯化产物可用TEV酶切释放多肽片段。
在另一优选例中,本发明的酵母表达***,表达没有脂多糖干扰的重组人SAA1及其结构类似的多肽。这种以酵母为宿主的表达方式不仅摆脱了多年来SAA1研究中所碰到的脂多糖困扰的问题,实现体内外研究不受脂多糖干扰的SAA1的生物学作用,还可利用酵母表达***表达多种SAA1结构类似的多肽进行功能研究,从而发现SAA发挥活性的结构域和功能域。同时还可利用详尽的人SAA1不同肽段所发挥的生物学活性的研究结果,设计相应的阻断剂,为临床治疗提供潜在的候选药物。
以上所表达的重组hSAA1也可用常规方法,在C末端添加HIS6亲和标签,所表达的蛋白及其多肽经过SDS-PAGE,Western-blotting确认为目的蛋白质后,利用亲和层析进行纯化。
用途
本专利用纯化后的重组hSAA1及其多肽刺激THP-1细胞株,检测这些产物对细胞因子(如IL6,TNFα,IL-1β,IL12P40,MMP9等)分泌的影响。结果表明,本发明的重组hSAA1、多聚体、多肽片段具有抑制炎性细胞因子表达的能力,能用于制备治疗炎症导致的疾病的药物。
进一步地,对纯化产物与商品化的SAA(可诱导炎症因子的产生,诱发炎症)共同刺激细胞进行活性检测,表明酵母表达的hSAA1单体和多聚体显著降低商品化的SAA的致炎作用。由于酵母表达的hSAA1单体和多聚体及其多肽对多种细胞因子的表达有显著抑制作用,因此可以用于治疗炎症反应过程中SAA过量分泌所导致的疾病。同时,酵母表达的hSAA1单体、多聚体和多肽可以抑制LPS刺激细胞分泌一些致炎的细胞因子(如IL-1β),也可以用于治疗炎症反应所引起的疾病。
所述的炎症导致的疾病选自下组:风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心血管疾病、胰腺炎、肝炎、糖尿病、慢性肾脏疾病、肥胖病、肌肉萎缩、痛风。
药物组合物和施用方式
本发明重组人血清淀粉样蛋白A1、多聚体、多肽片段,可配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明重组人血清淀粉样蛋白A1、多聚体、多肽片段可直接用于炎症导致的疾病的治疗,例如,用于类风湿关节炎疾病的治疗。在使用本发明重组人血清淀粉样蛋白A1、多聚体、多肽片段时,还可同时使用其他治疗剂或与其他疗法联用。
本发明还提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明重组人血清淀粉样蛋白A1、多聚体、多肽片段或其组合;以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明重组人血清淀粉样蛋白A1、多聚体、多肽片段还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的本发明重组人血清淀粉样蛋白A1、多聚体、多肽片段或其组合施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于:
(1).本发明人出乎意料地发现重组人血清淀粉样蛋白A1、多聚体、多肽片段对多种炎性细胞因子的表达抑制作用。
(2).动物实验确定,本发明的重组人血清淀粉样蛋白A1、多聚体、多肽片段可降低LPS的小鼠致死率。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。
实施例1
重组hSAA1的制备
合成如下引物:
上游引物(SEQ ID NO:3):
5’GTCG CTC GAG AAA AGA GAG GCT CGAAGCTTCTTTTCGTTC3’;
下游引物(SEQ ID NO:4):
5’GTCG GAA TTC TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTATTTCTCAGGCAG3’;
用常规方法抽提人mRNA,经反转录后获得的cDNA,作为模板。用上述引物,通过常规PCR方法,扩增获得人hSAA1全长基因。对PCR扩增产物,用XhoI/EcoRI双酶切后,***到经过同样酶切的载体pPIC9k(购自Invitrogen公司)的α-factor信号肽下游,获得载体pPIC9k-hSAA1。当hSAA1分泌表达时,α-factor信号肽会被切除,从而释放hSAA1的N末端。
利用电转化方法,将上述的重组表达载体pPIC9k-hSAA1转入常规的毕赤酵母GS115,并如下进行选择转化的重组子:
采用组氨酸营养缺陷型平板培养转染的酵母,筛选酵母单克隆,将所获得的单克隆涂布G418筛选平板,G418浓度分别为0.5mg/mL,1mg/mL,2mg/mL,30℃培养3-4天,选取G418浓度2mg/mL平板上所生长的单克隆培养,甲醇诱导表达重组人hSAA1蛋白质,其C末端带有便于亲和纯化的HIS6亲和标签(通过引物引入)。
采用DOT-BLOTTING检测上清液中目的蛋白质的表达产量。图1为6个酵母单克隆表达hSAA1的DOT-BLOTTING检测结果,选取表达产量较高单克隆进行下一步的大量发酵及其纯化。
实施例2
hSAA1多肽片段的制备
采用常规方法基因合成his6-sumo-tev序列,如SEQ ID NO:5所示,利用酶切位点XhoI接入载体pPIC9k(Invitrogen公司)的α-factor信号肽下游,获得带有his6-sumo-tev的pPIC9k载体pPIC9k-his6-sumo-tev。
采用表1中片段名称为P27-72的引物,通过常规PCR方法,分别扩增获得编码多肽片段P27-72的人hSAA1基因片段。对PCR扩增产物,用XhoI/EcoRI双酶切后,***到经过同样酶切的载体pPIC9k-his6-sumo-tev中的his6-sumo-tev下游,获得载体pPIC9k-his6-sumo-tev-hSAA1P27-72。
利用电转化方法,将上述的重组表达载体pPIC9k-his6-sumo-tev-hSAA1P27-72转入常规的毕赤酵母GS115,并如下进行选择转化的重组子:
采用组氨酸营养缺陷型平板培养转染的酵母,筛选酵母单克隆,将所获得的单克隆涂布G418筛选平板,G418浓度分别为0.5mg/mL,1mg/mL,2mg/mL,30℃培养3-4天,选取G418浓度2mg/mL平板上所生长的单克隆培养,甲醇诱导表达重组人hSAA1多肽片段P27-72(对应于SEQ ID NO.:2中第27-72位)。
采用上述方法制备重组人hSAA1多肽片段P27-90、重组人hSAA1多肽片段P29-104,不同之处在于引物,如表1所示。
表1引物序列表
实施例3
重组hSAA1及其多肽片段的纯化
将实施例1及实施例2得到的酵母发酵液上清经超滤浓缩,与Ni Sepharose HP4℃混合1-2小时,装柱。采用洗涤缓冲液(20mM磷酸钠(sodium phosphate),25mM咪唑(imidazole),500mM NaCl,pH7.4)洗涤柱子,洗脱缓冲液(20mM磷酸钠sodium phosphate,500mM咪唑imidazole,500mM NaCl,pH7.4)洗脱目的蛋白质,采用SDS-PAGE及其Western-blotting检测,结果分别如图2和图3所示。
目前现有的大肠杆菌表达***,仅能获得单体。令人意外的是,采用酵母表达***,可以获得新的、多聚体形式的hSAA1,即hSAA1的多聚体。
如图2所示,为酵母表达的hSAA1纯化产物的SDS-PAGE及其Western-blotting检测图,其中,泳道1是酵母表达的hSAA1单体(≈13KD,分子量大于基于氨基酸序列推算的分子量12KDa),泳道2是酵母表达的hSAA1多聚体(二聚体≈26KD,三聚体≈39KD,四聚体≈52KD)。
如图3所示,为酵母表达的hSAA1多肽片段纯化后SDS-PAGE图,其中,泳道3为酵母表达的SUMO-hSAA1(P27-72)(连接有SUMO的hSAA1多肽片段P27-72,≈21KD),泳道2为酵母表达的SUMO-hSAA1(P27-90)(连接有SUMO的hSAA1多肽片段P27-90,≈23KD),泳道1为酵母表达的SUMO-hSAA1(P27-104)(连接有SUMO的hSAA1多肽片段P27-104,≈24KD)
实施例4
hSAA1及其多肽片段对THP-1细胞株细胞因子分泌的影响
将商品化的SAA、hSAA1、hSAA1多聚体、多肽片段(tev酶切后产物)以0.5μM的终浓度加入到无血清培养的常规的人THP-1细胞(ATCC TIB-202TM人急性单核细胞株性白血病细胞株)培养液(106细胞/毫升)中,5小时后收集细胞,TRIzol裂解,提取RNA,反转录为cDNA,real-time PCR检测细胞因子的表达水平。
图4所示,分别用酵母表达的hSAA1单体和多聚体刺激THP-1细胞5小时后,检测细胞内IL-6RNA的表达水平。结果表明,商品化的SAA(0.5μM)刺激THP-1细胞后,IL-6升高的水平高于酵母表达的hSAA1单体和hSAA1多聚体;将商品化的SAA(0.5μM)与酵母表达的hSAA1单体(0.5μM)和多聚体(0.5μM)分别混合后刺激细胞,与商品化的SAA单独刺激THP-1细胞相比,IL-6表达水平下降。表明,酵母表达的hSAA1单体和多聚体抑制商品化的SAA的致炎作用。
另外,采用微量LPS(5ng/mL)刺激THP-1后,IL-6表达水平提高,且与酵母表达的hSAA1单体(0.5μM)混合刺激后,IL-6提高水平高于两者单独刺激。提示,LPS可与酵母表达的hSAA1协同作用,导致THP-1细胞分泌IL-6水平提高。
图5为刺激THP-1细胞后TNFα水平的检测,结果与IL-6一致,酵母表达的hSAA1单体和多聚体具有抑制商品化的SAA的活性的作用。但是,与微量LPS(5ng/mL)共同刺激THP-1后,TNFα水平下降,提示,酵母表达的hSAA1单体具有竞争性抑制LPS刺激THP-1细胞分泌TNFα的作用。
图6为刺激THP-1细胞后IL-1β水平的检测,酵母表达的hSAA1单体具有抑制商品化的SAA的作用,同时,对LPS刺激细胞分泌IL-1β也具有抑制作用。
图7和图8分别为多肽片段刺激THP-1细胞后IL-6及其IL-1β的表达水平检测,发现hSAA1(27-72)诱导IL-6及其IL-1β水平为最低,且可抑制商品化SAA的作用,同时与LPS也存在一些协同作用。hSAA1(27-90),hSAA1(29-104)诱导水平相应提高,但也存在与抑制商品化SAA的活性的作用。
以图8和hSAA1(27-72)为例,单用商品化的SAA(0.5μM)时,IL-1β的表达水平为75倍,单用hSAA1(P27-72多肽)(0.5μM)时,IL-1β的表达水平为40倍。令人意外的是,将SAA(0.5μM)和P27-72多肽(0.5μM)合用时,可将IL-1β的表达水平从75倍下降至37倍。这表明P27-72多肽可降低SAA造成的IL-1β的升高(IL-1β升高可导致多种炎症性疾病的发生)。
图6为刺激THP-1细胞后IL-1β水平的检测,酵母表达的hSAA1多聚体具有抑制商品化的SAA的作用,同时,对LPS刺激细胞分泌IL-1β也具有抑制作用。
由于酵母表达的hSAA1单体和多聚体及其多肽对多种细胞因子的表达有抑制作用,因此可以作为潜在的药物,用于治疗炎症反应过程中SAA过量分泌所导致的疾病。同时,酵母表达的hSAA1单体、多聚体和多肽可以抑制LPS刺激细胞分泌一些致炎的细胞因子(如IL-1β),也可以作为潜在的药物,用于治疗炎症反应所引起的疾病。
对比例1
用常规方法,采用大肠杆菌表达体系,制备氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示的hSAA1。对于该原核表达的非糖基化的hSAA1,用实施例4相同的方法测定其对对THP-1细胞株细胞因子分泌的影响。
结果表明,单独使用大肠杆菌表达的hSAA1(0.5μM),或者与商品化的SAA(0.5μM)混合后使用,都能促进炎性因子IL-6、TNFα、IL-1β的表达,大肠杆菌表达的hSAA1对商品化的SAA的活性不具有抑制作用。
实施例5
hSAA1及其多肽片段与LPS及其SAA腹腔注射BALB/c小鼠引起小鼠炎症反应
本实施例设计了酵母表达的hSAA1、多聚体及多肽在小鼠体内对LPS所导致的炎症反应的抑制作用的实验。选择5-7周的雄性BALB/c小鼠,每组3只,一共五组,分别为LPS组(LPS15mg/Kg),LPS/hSAA1低剂量组(LPS15mg/Kg,hSAA115mg/Kg),LPS/hSAA1中剂量组(LPS15mg/Kg,hSAA130mg/Kg),LPS/hSAA1高剂量组(LPS15mg/Kg,hSAA1100mg/Kg),对照组(PBS),腹腔注射,记录小鼠的存活时间。
表2小鼠存活时间
如表2所示,根据小鼠死亡率检测实验发现,酵母表达的hSAA1单体及其多聚体能够缓解LPS所造成的小鼠死亡,延长小鼠生存时间,其中hSAA1(27-72)片段对抑制LPS小鼠致死率活性是最好的,可完全抑制小鼠的死亡。
实施例6
建立小鼠关节炎模型,关节腔注射hSAA1及其多肽片段,检测关节炎的发展
通过常规方法,用胶原蛋白诱导小鼠关节炎模型。然后,在关节腔内注射hSAA1及其多肽片段,观察hSAA1及其多肽片段对小鼠关节炎发展的作用(给药组和未给药组,n=6)。
关节炎的临床表症严重程度将使用量化分级评估。基于肿胀,红斑和变形分为0-4:0,无肿胀;1,在一个足趾肿胀或轻度水肿;2,中度肿胀影响一些足趾;3,一些肿胀影响大部分足趾;4,最严重的肿胀和/或强直。
结果表明,与小鼠关节炎模型组(未给药组)相比,hSAA1试验组和hSAA1多肽片段组(P27-72多肽)关节炎症状有明显缓解(分值显著低于未给药的对照组)。
实施例7
药物组合物
制备一药物组合物,所述组合物包括:
(a)P27-72多肽(或P27-90多肽);和
(b)生理盐水。
实施例8
药物组合物
制备一药物组合物,所述组合物包括:
(a)实施例1制备的hSAA1蛋白;和
(b)生理盐水。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (13)
1.一种重组人血清淀粉样蛋白A1,其特征在于,所述重组人血清淀粉样蛋白A1为以酵母为宿主所表达的重组人血清淀粉样蛋白A1,所述酵母为毕赤酵母GS115。
2.一种人血清淀粉样蛋白A1的多聚体,其特征在于,所述多聚体为权利要求1所述的重组人血清淀粉样蛋白A1的多聚体,且所述多聚体为二聚体、三聚体或四聚体。
3.一种人血清淀粉样蛋白A1多肽片段,其特征在于,所述的多肽片段为以毕赤酵母GS115为宿主所表达的重组多肽片段,且所述的多肽片段同时具有以下特征:
(i)该多肽片段的序列来源于人血清淀粉样蛋白A1的氨基酸序列;
(ii)该多肽片段的长度为20-100个氨基酸;
(iii)该多肽片段抑制天然人血清淀粉样蛋白A的活性;
(iv)该多肽片段具有抑制炎性细胞因子表达的能力,
其中,所述炎性细胞因子选自:IL-6、IL-1β、TNF-α;
且所述多肽片段的氨基酸序列为野生型人血清淀粉样蛋白A1氨基酸序列的第27-72位、第27-90位或第29-104位的氨基酸序列。
4.一种酵母表达载体,其特征在于,该载体含有编码权利要求3所述的多肽片段的多核苷酸。
5.一种酵母宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞选自下组:
(a)含有权利要求4所述的载体的宿主细胞;
(b)染色体中整合有编码人血清淀粉样蛋白A1蛋白的基因的宿主细胞毕赤酵母GS115;
(c)染色体中整合有编码权利要求3所述的多肽片段的多核苷酸的宿主细胞。
6.一种权利要求1所述的重组人血清淀粉样蛋白A1、或权利要求2所述的多聚体、或权利要求3所述的多肽片段的制备方法,其特征在于,包括步骤:
(i)在适合表达的条件下,培养权利要求5所述的宿主细胞,从而表达权利要求1所述的重组人血清淀粉样蛋白A1、或权利要求2所述的多聚体、或权利要求3所述的多肽片段;和
(ii)从培养产物中分离出所述的重组人血清淀粉样蛋白A1、或其多聚体、或其多肽片段。
7.一种药物组合物,其特征在于,它含有药学上可接受的载体或赋形剂;以及选自下组的活性成分:
(a1)权利要求1所述的重组人血清淀粉样蛋白A1;
(a2)权利要求2所述的人血清淀粉样蛋白A1的多聚体;
(a3)权利要求3所述人血清淀粉样蛋白A1多肽片段。
8.一种权利要求1所述的重组人血清淀粉样蛋白A1的用途,其特征在于,用于制备抑制炎症反应和/或治疗炎症相关疾病的药物。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述炎症相关疾病为关节炎。
10.一种权利要求2所述的人血清淀粉样蛋白A1的多聚体的用途,其特征在于,用于制备抑制炎症反应和/或治疗炎症相关疾病的药物。
11.如权利要求10所述的用途,其特征在于,所述炎症相关疾病为关节炎。
12.一种权利要求3所述的人血清淀粉样蛋白A1多肽片段的用途,其特征在于,用于制备抑制炎症反应和/或治疗炎症相关疾病的药物。
13.如权利要求12所述的用途,其特征在于,所述炎症相关疾病为关节炎。
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