KR100968664B1 - 항체 발현 및 조립을 위한 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 원핵 세포 및 진핵 세포 발현 시스템과 같은 숙주 세포 시스템에서 재조합 항체를 발현 및 제조하는 방법 및 이를 위한 조성물을 제공한다. 본 발명에는 특히 항체의 경쇄 및 중쇄의 발현을 일시적으로 분리하기 위한 재조합 시스템이 포함된다. 항체 단편을 포함하는 본 발명의 항체 생성물은 생물학적 연구, 진단 및 의학적 처리의 다양한 측면에서 사용될 수 있다.
기능성 항체, 세포 발현 시스템, 재조합 벡터, 경쇄, 중쇄, 숙주 세포.

Description

항체 발현 및 조립을 위한 시스템 {A System for Antibody Expression and Assembly}
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야 및 단백질 기술 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합 방법으로 생산된 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.
최근 수년간, 각종 질환 및 질병에 있어서 항체를 진단제 및 치료제로 사용하는 것은 점점 더 촉망받아 왔다. 많은 연구 및 임상에서의 이용을 위해 기능성 항체 또는 항체 단편이 대량으로 필요하며, 따라서 대규모이되 경제적인 항체 생산 시스템이 필요하다. 이. 콜라이 (E. coli) 또는 비. 서브틸리스 (B. subtilis)와 같은 원핵 세포로부터 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포에 이르기까지 범위의 다양한 발현 숙주를 사용하는 재조합 항체 제조 방법이 특히 유용하다 [Kipriyanov and Little (1999) Mol. Biotech. 12:173-201].
박테리아, 특히 이. 콜라이는 다른 항체 제조 시스템에 비해 여러 특별한 이점을 제공한다. 사용되는 원료 물질 (즉, 박테리아 세포)는 저렴하고 배양하기 쉽기 때문에 생산 비용이 줄어든다. 원핵 생물 숙주는 예를 들어 포유동물 세포보다 훨씬 빠르게 성장하며, 이로서 유전자 조작을 더 빠르게 분석할 수 있다. 또한, 박테리아 발효는 세대 (generation) 시간이 보다 짧고, 규모를 늘리기 쉽기 때문에 단백질을 대량으로 제조하는 데 있어서 보다 매력적인 수단이 된다. 이. 콜라이를 비롯한 많은 박테리아 종의 게놈 구조 및 생물학적 활성에 대한 연구는 충분히 수행되어 왔으며, 바람직한 항체를 보다 편리하게 발현시킬 수 있는 넓은 범위의 적합한 벡터를 이용할 수 있다. 재조합 유전자의 조작, 다수 카피에 의한 숙주의 안정한 형질전환, 발현 유도 및 생성물의 특성화를 포함하는 상기 제조 방법에는 원핵 생물에 비해 적은 단계들이 포함된다 [Pluckthun and Pack (1997) Immunotech 3:83-105]. 또한, 이. 콜라이는 특이적으로 어떤 방법에서도 사용할 수 있다. 플라스미드에 의한 형질전환 또는 파아지 (phage)에 의한 형질감염의 효율에 비할 바가 아니기 때문에, 이. 콜라이 시스템은 많은 유형의 항체 변이체에 대한 파아지 라이브러리 구성에서 사용될 수 있으며, 이는 기능성 게놈 연구에서 특히 중요하다.
박테리아에서 재조합 항체를 제조하는 데는 다양한 방법이 이용되어 왔다. 항체 분자는 다른 이종 단백질과 유사하게 박테리아로부터, 세포질에서 발현된 봉입체 (inclusion body)의 리폴딩 (refolding)을 통해 또는 발현 이후 박테리아의 원형질막주변 공간 (periplasm)으로의 분비를 통해 얻을 수 있다. 분비와 리폴딩 사이의 선택은 일반적으로 여러 사항에 의해 좌우된다. 분비는 항체를 제조하는 데 있어서 더 빠르고, 보다 통상적으로 이용되는 전략이다 [Kipriyanov and Little (1999), supra].
오퍼 (Opper) 등의 미국 특허 제6,008,023호는 항체 단편 (예, Fab)이 표적 화된 종양 요법에서 사용되는 효소와 융합되는 이. 콜라이 세포질 발현 시스템을 개시한다. 제멜-드레아센 (Zemel-Dreasen) 등의 문헌 [(1984) Gene 27:315-322]은 이. 콜라이에서 항체 경쇄의 분비 및 프로세싱에 대하여 보고하였다. 로 (Lo) 등의 PCT 공개 제WO 93/07896호는 이. 콜라이에서 중쇄내 CH2 영역이 결여된 사합체 항체를 제조하는 것에 대하여 보고하였다. 경쇄 및 CH2-결실된 중쇄를 코딩하는 유전자들이 동일한 발현 벡터내에서 하나의 단일 프로모터 조절하에 있도록 구성한다.
원핵 생물 시스템에서의 항체 발현은 다른 규모로 수행될 수 있다. 진탕-플라스크 배양 (2 리터 내지 5 리터 범위)은 통상적으로 리터 당 5 mg 미만의 생성물을 발생시킨다. 카터 (Carter) 등은 그의 문헌 [(1992) Bio/Technology 10:12-16]에서 항체 단편을 높은 수준 (리터 당 2 g 이하)으로 발현시킨 고밀도 세포 발효 시스템을 개발하였음을 보고하였다. 카터 등에 의해 얻어진 Fab'의 리터 당 그램 (g) 역가는 주로 더 높은 세포 밀도로 인한 것이며, 이러한 높은 밀도는 발효기의 환경이 단순한 진탕 플라스크의 환경보다 더 정밀하게 조절되기 때문이다. 상기 시스템은 경쇄 및 중쇄 단편을 공동 발현하도록 고안된 디시스트론 (dicistronic)성 오페론을 포함한다. 디시스트론성 오페론은 포스페이트 결핍에 의해 유도될 수 있는 단일 이. 콜라이 phoA 프로모터의 조절하에 있다. 각 항체 쇄는 원형질막주변 공간으로의 분비를 지시하는, 이. 콜라이의 열-안정성 장독소 II (stII) 신호 서열의 앞쪽에 있다. 카터 등에 의해 1992년에 기술된 이러한 시스템은 하기에서 추가로 논의된다.
이. 콜라이에서의 항체 제조에 대한 전체적인 검토를 위해서는 문헌 [Pluckthun and Pack (1997) Immunotech 3:83-105; Pluckthun et al. (1996) in Antibody Engineering: A Practical Approach, pp 203-252 (Oxford Press); Pluckthun (1994) in Handbook of Exp Pharmcol vol 3: The Pharmcol of Monoclonal Antibodies, pp269-315 (ed. M. Rosenberg and G.P. Moore; Springer-Verlag, Berlin]을 참조한다.
많은 생물학적 분석법 (예, 엑스선 결정학) 및 임상적 이용 (예, 단백질 요법)은 다량의 항체를 필요로 한다. 따라서, 적절하게 조립된 가용성의 기능성 항체를 높은 수율로 간단하게 제조하는 시스템이 필요한 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 숙주 세포, 예를 들어 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포에서 기능성 항체 또는 항체 단편을 재조합 방법으로 제조하는 새로운 방법 및 이를 위한 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 원핵 세포와 같은 숙주 세포에서 항체의 경쇄 및 중쇄의 발현을 일시적으로 분리하는 방법을 제공함으로써 조립된 기능성 항체 분자의 수율을 증가시킨다. 특히, 본 발명의 방법은 숙주 세포를, 경쇄 및 중쇄를 각각 코딩하는 2개의 별도의 번역 단위로 형질전환시키는 단계, 상기 세포를 경쇄 및 중쇄가 연속적인 방식으로 발현되도록 적합한 조건하에 배양함으로써 경쇄 및 중쇄의 생산을 일시적으로 분리하는 단계; 및 경쇄 및 중쇄가 기능성 항체 또는 항체 단편으로 조립되도록 하는 단계를 포함한다. 바람직한 한 측면에서, 경쇄 및 중쇄의 일시적으로 분리된 발현은 경쇄 및 중쇄를 개별적으로 조절하는 2개의 상이한 프로모터를 사용하여 이 상이한 프로모터들이 다른 조건하에 활성화됨으로써 실현된다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA들이 단일 플라스미드 벡터내에 도입될 수 있지만, 이들 DNA는 각각 상이한 프로모터에 의해 조절되는 2개의 번역 단위로 분리되어 도입된다. 하나의 프로모터 (예, 제1 프로모터)는 구성적 (constitutive) 프로모터 또는 유도가능한 (inducible) 프로모터이며, 다른 프로모터 (예, 제2 프로모터)는 유도가능한 프로모터이다. 그래서, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 하나의 프로모터 (예, 제1 프로모터)를 활성화하는 데 적합한 조건하에 배양되는 경우, 단지 하나의 쇄 (예, 경쇄)만이 발현된다. 이어서, 제1 쇄 (예, 경쇄)의 발현에 대한 바람직한 기간이 경과된 후, 배양 조건을 다른 프로모터 (예, 제2 프로모터)의 활성화에 적합한 조건으로 변화시킴으로써 제2 쇄 (예, 중쇄)의 발현을 유도한다. 바람직한 한 실시양태에서, 경쇄가 먼저 발현된 다음, 중쇄가 발현된다. 또 다른 실시양태에서는 중쇄가 먼저 발현된 다음, 경쇄가 발현된다.
또한, 본 발명은 경쇄에 작동가능하게 연결되는 분비 신호를 코딩하는 제1 번역 단위 앞쪽의 제1 프로모터 및 중쇄에 작동가능하게 연결되는 분비 신호를 코딩하는 제2 번역 단위 앞쪽의 제2 프로모터를 포함하는, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 조립된 기능성 항체 또는 항체 단편의 제조를 위한 재조합 벡터를 제공한다. 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 상이한 조건하에 유도될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 발현을 위한 숙주로서 많은 원핵 생물 및 진핵 생물 종을 사용할 수 있다. 바람직하게, 원핵 생물 숙주는 그람 (gram)-음성 박테리아이다. 보다 바람직하게, 숙주는 이. 콜라이이다. 한 측면에서, 숙주 세포는 이종 단백질을 대량 제조하는 데 적합한, 유전적으로 변형된 이. 콜라이 균주이다. 예를 들어, 숙주 세포는 프로테아제에 대한 돌연변이 대립유전자 및(또는) dsb 유전자의 여분 카피들을 포함하는 이. 콜라이 균주일 수 있다. 구성적이거나 유도가능한 다수의 공지된 프로모터는 이들이 다른 프로모터와 조합되어 효과적으로 사용될 수 있다면 본 발명에 사용하기에 적합하다.
본 발명의 방법 및 조성물은 원형 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')2-루이신 지퍼 융합체, Fv 및 dsFv를 포함하는, 넓은 범위의 조립된 항체 분자를 대량 생산하는 데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 분자는 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 친화성-성숙된 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 임의의 적합한 항원, 바람직하게는 생물학적으로 중요한 폴리펩티드에 대해 특이적일 수 있다. 항체 단편은 이합체화 (dimerization) 도메인, 예를 들어 루이신 지퍼 도메인에 융합될 수 있다.
본 발명에는 본 발명에서 기술된 방법에 따라 제조된 항체의 다양한 진단 및 치료적 용도가 포함된다. 한가지 치료적 용도에서, 재조합 방법으로 제조된 항체 또는 그의 단편은 치료에서 다른 치료제와 조합되어 사용된다.
도 1은 항-CD18 F(ab')2(-루이신 지퍼) 플라스미드 pS1130 (단일 프로모터) 및 pxCD18-7T3 (이중 프로모터)의 구조에 대한 개요도이다.
도 2는 이중 프로모터 구조물 pxCD18-7T3의 삽입체 핵산 서열을 나타낸다.
도 3은 pxCD18-7T3 구조물내의 2개의 번역 단위들에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. N-말단의 STII 분비 신호 서열에는 밑줄이 그어져 있다.
도 4는 단일 프로모터 시스템 (pS1130/59A7) 및 이중 프로모터 시스템 (pxCD18-7T3/59A7) 사용시의 조립된 F(ab')2의 수율 비교를 나타낸다.
도 5는 단일 프로모터 발현 시스템 (pS1130) 사용시의 항-CD18 발현 프로필을 나타낸다.
도 6은 이중 프로모터 발현 시스템 (pxCD18-7T3) 사용시의 항-CD18 발현 프로필을 나타낸다.
도 7은 단일 프로모터 시스템 (pS1130) 및 이중 프로모터 시스템 (pxCD18-7T3)의 총 중쇄 수율 및 조립 효율의 비교를 나타낸다. 조립 효율은 중쇄 합성의 처음 10시간 동안 F(ab')2로 조립된 중쇄의 비율을 나타낸다.
도 8은 항-조직 인자 IgG1 플라스미드 paTF130 (PhoA/PhoA 프로모터) 및 pxTF-7T3FL (PhoA/TacII-프로모터)의 개요도이다.
도 9는 PhoA/TacII-프로모터 작제물 pxTF-7T3FL의 삽입체 핵산 서열을 나타낸다.
도 10은 pxTF-7T3FL 작제물내 2개의 번역 단위들에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. N-말단의 STII 분비 신호 서열에는 밑줄을 그었다.
도 11A 및 11B는 동일한 프로모터 시스템 (PhoA/PhoA) 및 이중 프로모터 시스템 (PhoA/TacII) 사용시 항-조직 인자 IgG1의 발현을 비교하는, 환원 (11A) 조건 또는 비환원 (11B) 조건하 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
바람직한 실시양태의 상세한 설명
본 발명의 주요 실시양태는 이. 콜라이 발현 시스템과 같은 숙주 세포 시스템에서 적절하게 조립된 가용성 항체의 수율이 경쇄 및 중쇄 발현의 유도를 일시적으로 분리함으로써 크게 증가될 수 있다는 놀라운 발견을 기초로 한다. 하나의 쇄 (예, 경쇄)가 제2 쇄 (예, 중쇄) 발현의 유도에 앞서 발현되는 신규 재조합 시스템을 사용하여, 조립된 항체의 역가를 경쇄 및 중쇄가 동시에 발현되는 필적하는 시스템에 비해 약 2배 증가시켰다.
종래에는 항체를, 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자가 단일 프로모터의 조절하에 있는 디시스트론성 벡터를 사용하여 이. 콜라이와 같은 숙주 세포에서 제조하여 왔다. 상기 프로모터의 활성화에 적합한 배양 조건하에서 경쇄 및 중쇄 유전자는 둘 다 동시에 발현된다. 예를 들어, 카터 (Carter) 등의 문헌 [(1992) Bio/Technology 10:163-167]은 포스페이트 결핍에 의해 유도될 수 있는 단일 이. 콜라이 phoA 프로모터의 조절하에 있는, 경쇄 및 중쇄 단편에 대한 디시스트론성 오페론을 기술한다. 각 항체 쇄는 원형질막주변 공간으로의 분비를 지시하는, 이. 콜라이의 열-안정성 장독소 II (stII) 신호 서열의 앞쪽에 있다. 이 벡터를 사용하여 특정 항체 제조를 수행한 경우, 특히 경쇄 및 중쇄의 발현 수준이 둘 다 높았던 경우, 가용성의 기능성 항체로 조립될 수 없는 상당량의 개별 쇄 분자들이 집단 을 형성하였다. 디시스트론성 벡터 (경쇄 및 중쇄 둘 다의 발현을 위한 단일 프로모터를 보유함)에서 집단 형성의 문제는 본원의 하기에 제시된 실시예에서 추가로 설명된다.
특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 집단 형성의 문제는 적어도 부분적으로는 각 쇄가 상기 기술된 조건하에 폴딩되는 능력이 제한되기 때문일 수 있다. 항체의 각 쇄는 발현, 분비 및 기능성 항체로의 조립 과정 동안 상이하게 거동할 수 있다. 예를 들어, 하나의 쇄 (예, 경쇄)는 숙주 세포의 원형질막주변 공간으로 단독으로 분비된 후에 주로 가용성으로 남아있을 수 있지만, 다른 쇄 (예, 중쇄)는 조립된 항체 복합체의 일부로서 존재하지 않는다면 분비 이후에 주로 집단을 형성하거나 불용성으로 된다. 따라서, 보다 가용성인 쇄가 더 일찍 발현되는 것은 덜 가용성인 쇄의 폴딩 및 이후 두 쇄의 조립을 용이하게 할 수 있다. 또한, 숙주 세포는 발현된 폴리펩티드를 그의 분비 기구를 통해 전위시키는 능력이 제한될 수 있다. 분비 능력의 제한은 여러 상황, 예를 들어 여러 폴리펩티드가 동시에 발현되는 경우, 많은 양의 전구체 단백질이 벡터에 의해 강한 번역 강도로 발현되거나 큰 크기의 단백질이 발현되는 경우, 또는 이들이 임의로 조합된 경우에서 초과될 수 있다. 그 결과, 덜 성숙한 단백질이 분비되며, 항체 복합체로의 조립에 이용될 수 있다.
메카니즘과는 무관하게, 본 발명은 조립된 가용성의 기능성 항체 분자의 수율을 상당히 증가시키는, 항체 제조를 위한 신규 (원핵 생물 또는 진핵 생물) 시스템을 제공한다. 본 발명의 이중 프로모터 발현 벡터를 사용하여, 하나의 쇄를 먼 저 합성한다. 소정량의 제1 쇄가 발현된 후, 제2 쇄의 발현은 변화된 배양 조건에 대해 반응성인 제2 프로모터하에 유도될 수 있다. 이후, 새로 발현된 제2 쇄는 앞서 제조된 이용가능한 제1 쇄와 복합체를 이루어 가용성 항체 또는 그의 단편을 형성시킬 수 있다. 이와 같이, 2가지 쇄의 발현 시기를 조절함으로써 더 많이 발현된 항체 쇄가 가용성 항체 복합체로 지시되게끔 하여 가용성 항체 복합체의 총 수율을 증가시킬 수 있다.
일시적으로 분리된 본 발명의 발현 시스템은 항체 및 그의 단편의 제조에 의해 주로 설명되지만, 본원에 기술된 방법은, 여러 단백질의 단위/쇄가 제조되고, 중간체 또는 최종 단백질 복합체가 기능을 나타내기 위해 각 단위/쇄가 적절하게 조립되어야 하는 임의의 시스템에서 이용할 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 방법은 이뮤노글로불린-유사 도메인, 예를 들어 항체, T-세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자, 인테그린, CD8 및 CD28 분자, 및 그의 관련 단편, 유도체, 변이체 및 융합 단백질을 포함하는 단백질 복합체를 제조하는 데 특히 유용하다.
항체
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 천연 발생 항체는 4개의 폴리펩티드 쇄, 즉 디술피드 결합에 의해 내부적으로 연결된 두 개의 동일한 중(H)쇄 및 두 개의 동일한 경(L)쇄를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성되며, 중쇄 불변 영역은 그의 천연 형태에서 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, 즉 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 부르는, 보다 보존된 영역들이 산재해 있는 상보성 결정 영역 (CDR)이라 부르는 초가변성 영역들로 보다 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 부르는 분명하게 다른 2개의 유형들 중 하나로 지정될 수 있다.
항체 (이뮤노글로불린)는 그의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 여러 클래스 (class)로 지정될 수 있다. 5가지 주요 이뮤노글로불린 클래스는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이며, 이들 중 여럿은 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgA-1 및 IgA-2 등으로 추가로 세분될 수 있다. 여러 이뮤노글로불린 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 여러 이뮤노글로불린 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 구조는 잘 알려져 있으며, 일반적으로는 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 개시되어 있다.
항체는 항체 또는 항체 일부와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 형성된 큰 융합 분자의 일부일 수 있다. 이러한 융합 단백질의 예는 스트렙타비딘 코어 영역을 사용하여 사합체 scFv 분자를 제조하는 것 [Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101] 및 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단의 폴리히스티딘 태그를 사용하여 2가의 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하는 것 [Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058]을 포함한다.
본 발명은 모노클로날 항체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원성에 대해 지시된다. 또한, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정자에 대해 지시된다.
본 명세서에서 모노클로날 항체에는 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래된 항체 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이와 상동성이 있지만, 상기 쇄의 나머지 부분이 또 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 뿐만 아니라, 목적하는 활성을 나타낸다면 상기 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이와 상동성이 있는 "키메라" 항체가 특별히 포함된다 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)].
"기능성" 또는 "생물학적 활성" 항체는 구조, 조절, 생화학 또는 생물리학적 반응에서 그의 본래 활성의 하나 이상을 발휘할 수 있는 항체이다. 예를 들어, 기능성 항체는 항원과 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있으며, 이 결합은 달리말하면 세포 또는 분자 반응, 예를 들어 신호 전달 또는 효소 활성을 유도 또는 변경할 수 있다. 기능성 항체는 또한 수용체의 리간드 활성화를 차단하거나 아고니스트 항체로 작용할 수도 있다. 항체가 그의 본래 활성의 하나 이상을 발휘하는 능력은 폴리펩티드 쇄의 적절한 폴딩 및 조립을 비롯한 여러 인자들에 따라 달라진다. 본원에 사용된 바와 같이, 개시된 방법에 의해 생성된 기능성 항체는 전형적으로는, 여러 디술피드 결합에 의해 연결되고 적절하게 폴딩된 2개의 동일한 L 쇄 및 2개의 동일한 H 쇄를 갖는 이종사합체이다. 어떤 측면에서, 본 발명은 차단성 항체, 항체 길항제 및(또는) 항체 아고니스트를 포함한다. "차단성" 항체 또는 항체 "길항제"는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 것이다. 이러한 차단은 임의의 수단으로, 예를 들어 리간드와 수용체의 결합, 수용체 복합체의 형성, 수용체 복합체에서 티로신 키나제 수용체의 티로신 키나제 활성 및(또는) 수용체내 또는 수용체에 의한 티로신 키나제 잔기(들)의 인산화를 방해함으로써 일어날 수 있다. 예를 들어, VEGF 길항제 항체는 VEGF와 결합하여 VEGF가 혈관 내피 세포의 증식을 유도하는 능력을 저해한다. 바람직한 차단성 항체 또는 길항체 항체는 항원의 생물학적 활성을 완전하게 억제한다.
"항체 아고니스트"는 수용체 등의 항원과 결합하여 그를 활성화하는 항체이 다. 일반적으로, 아고니스트 항체의 수용체 활성화 능력은 수용체의 천연 아고니스트 리간드와 적어도 질적으로 유사할 것이다 (본질적으로는 상기 리간드와 양적으로 유사할 수 있음).
항원 특이성
본 발명은 임의의 적절한 항원 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편에 적용가능하다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 생물학적으로 중요한 폴리펩티드인 항원에 대해 특이적이다. 보다 바람직하게, 본 발명의 항체는 포유동물에서 질병 또는 질환의 치료 또는 진단에 유용하다. 본 발명에 따라 얻어지는 항체 또는 항체 단편은 치료제, 예를 들어 차단성 항체, 항체 아고니스트 또는 항체 접합체로서 특히 유용하다. 치료 항체의 비제한적 예로는 항-VEGF, 항-IgE, 항-CD11, 항-CD18, 항-조직 인자, 및 항-TrkC 항체를 들 수 있다. 비-폴리펩티드 항원 (예, 종양-관련 당지질 항원)에 대해 지시되는 항체가 또한 고려된다.
"항원"이라는 용어는 당업계에서 충분히 이해되는 것이며, 면역원성 물질, 즉 면역원, 및 면역학적 비반응 또는 면역성 결여 (anergy)를 유도하는 물질, 즉 아너겐 (anergen)을 포함한다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 항원은 막횡단 분자 (예, 수용체) 또는 리간드, 예를 들어 성장 인자일 수 있다. 항원의 예로는 레닌과 같은 분자; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형 성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 (TF), 및 폰 빌레브란트 (von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C; 심방 나트륨배설증가 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성자, 예를 들어 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 활성화된 T-세포에 의한 발현 및 분비를 조절); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민; 뮬러리안 (Muellerian)-억제성 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예를 들어 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예를 들어 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티즘성 인자; 신경영양성 인자, 예를 들어 골-유도 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 변형 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 쇠퇴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 엔벨로프의 부분; 운반 단백질; 호밍 (homing) 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 나열된 임의의 폴리펩티드의 단편이 포함된다.
본 발명에 의해 포함되는 항체에 대한 바람직한 항원으로는 CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD34 및 CD46; ErbB 수용체 군의 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, α4/β7 인테그린, 및 αv/β3 인테그린 (그의 α또는 β서브유닛 포함); 성장 인자, 예를 들어 VEGF, 조직 인자 (TF), 및 TGF-β알파 인터페론 (α-IFN); 인터루킨, 예를 들어 IL-8; IgE; 혈액형 항원 Apo2, 사멸 수용체; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등을 들 수 있다. 여기서 가장 바람직한 표적은 VEGF, TF, CD19, CD20, CD40, TGF-β, CD11a, CD18, Apo2 및 C24이다.
임의로 다른 분자와 연결된 가용성 항원 또는 그의 단편이 항체를 발생시키기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예를 들어 수용체의 경우, 그의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)을 면역원으로 사용할 수 있다. 또는, 막횡단 분자를 발현시키는 세포를 면역원으로 사용할 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예를 들어, 암세포주)으로부터 유래하거나, 막횡단 분자를 발현시키 기 위한 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태는 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 항체는 단일 특이적 항체, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 그 이상의 다중 특이적 항체일 수 있다. 다중 특이적 항체는 단일 분자의 여러 에피토프에 대해 특이적이거나, 여러 분자들 상의 에피토프에 대해 특이적일 수 있다. 다중 특이적 항체를 설계 및 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Millstein et al. (1983) Nature 305:537-539; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553; WO 93/17715]을 참조한다.
항체 단편
본 발명은 원핵 생물 또는 진핵 생물에 의한 항체 또는 항체 단편의 제조를 포함한다. 많은 형태의 항체 단편이 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명에 포함된다. "항체 단편"은 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 부위를 비롯한 무손상 항체의 일부만을 포함하므로, 항원에 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 본 정의에 포함되는 항체 단편의 예에는 (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편; (ii) CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; (iv) VH 및 CH1 도메인을 갖고, CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편; (v) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341,544-546 (1989)); (vii) 단리된 CDR 영역; (viii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 결합된 두 개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ix) 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, 단일쇄 Fv; scFv) (Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); and Huston et al., PNAS (USA) 85: 5879-5883 (1988)); (x) 동일한 폴리펩티드쇄에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결되어 있는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 두 개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디 (diabody)" [EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]; (xi) 상보적인 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는, 일렬로 된 한 쌍의 Fd 단편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체" [Zapata et al. Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995); 및 미국 특허 제5,641,870호]가 포함된다.
또한, 본 발명은 안정성을 향상시키거나 다가 항체 복합체를 생성시키기 위해 변형된 항체 단편을 포함한다. 많은 의학적 용도에서, 항체 단편은 변성 또는 단백질분해 조건에 대하여 충분히 안정해야 하며, 이상적으로는 항체 단편이 표적 항원과 고 친화성으로 결합한다. 안정되고(되거나) 다가의 항체 단편을 제공하기 위해 다양한 기술 및 재료가 개발되어 왔다. 본 발명의 항체 단편은 이합체화 도메인에 융합시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 단편은 이합체화 도메인, 예를 들어 루이신 지퍼의 부착에 의해 이합체를 이룬다.
"루이신 지퍼"는 다수의 진핵 세포 전사 인자에 존재하는 단백질 이합체화 모티프이며, 2개의 DNA 결합 도메인을 전사 인핸서 서열로의 결합을 위해 적절하게 병렬 (juxtaposition)로 위치시키는 작용을 한다. 루이신 지퍼의 이합체화는 한쌍의 α-나선구조가 초나선구조의 비틀림 구조로 서로의 주위를 둘러싸는, 짧고 평행한 감겨진 코일을 형성함으로써 일어난다 [Zhu et al. (2000) J. Mol. Biol. 300:1377-1387]. 이와 같이 감겨진 코일 구조는 모든 7번 위치에 루이신이 주로 존재함으로 인해 "루이신 지퍼"라고 불리우며, 항체를 비롯한 다른 단백질의 이합체화 수단으로서 사용되어 왔다 [Hu et al. (1990) Science 250:1400-1403; Blondel and Bedouelle (1991) Protein Eng. 4:457]. 여러가지 종류의 루이신 지퍼가 이합체 및 사합체 항체 구조물의 경우에 특히 유용한 것으로 확인되었다 [Pluckthun and Pack (1997) Immunotech. 3:83-105; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553].
항체 변이체
항체 또는 항체 단편의 아미노산 서열 변형물(들)이 고려된다. 예를 들면, 이러한 항체의 결합 친화도 및(또는) 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드를 변화를 상기 항체 핵산에 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형에는 예를 들면 항체의 아미노산 서열내의 잔기로부터의 결실 및(또는) 잔기로의 삽입 및(또는) 잔기의 치환이 포함된다. 최종 구조물에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합도 가능한데, 단 최종 구조물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 이러한 아미노산 변화는 서열이 만들어지는 시기에 대상 항체 아미노산 서열내에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발에 바람직한 위치인, 항체의 특정 잔기 또는 영역을 동정하는 데 유용한 방법이 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리운다. 여기서는, 표적 잔기 또는 잔기 그룹을 동정하고 (예를 들면, 하전된 잔기, 예를 들면 arg, asp, his, lys 및 glu), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시킴으로써, 상기 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 이러한 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 부위들은, 추가의 또는 기타 변이체를 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 도입함으로써 정련된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되긴 하지만, 돌연변이 자체의 성질은 예정될 필요가 없다. 예를 들면, 소정의 부위에서의 돌연변이의 수행을 분석하기 위해서, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발을 수행하고, 발현된 항체를 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입체에는 길이가 1개의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합물 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입체가 포함된다. 말단 삽입체의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체가 포함된다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예: ADEPT용 효소)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합물이 포함된다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기에 의해 대체된, 항체 분자내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이 유발에 가장 큰 관심을 끄는 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변형도 또한 고려된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환"이라는 표제하에 표 1에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 1에서 "예시적 치환"으로 명명되거나 아미노산 부류를 참조하여 다음에 추가로 기재된 바와 같은 보다 실제적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물을 스크리닝하게 된다.
본래의 잔기 예시적 치환 바람직한 치환
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gln; his; asp; lys; arg gln
Asp (D) glu; asn glu
Cys (C) ser; ala ser
Gln (Q) asn; glu asn
Glu (E) asp; gln asp
Gly (G) ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; 노르루이신 leu
Leu (L) 노르루이신; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro (P) ala ala
Ser (S) Thr thr
Thr (T) Ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; 노르루이신 leu

항체의 생물학적 특성에 있어서의 실제적인 변화는 (a) 치환 영역내의 폴리펩티드 주쇄의 구조, 예를 들면 시트 (sheet) 또는 나선 형태를 유지하는 데 있어 서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는 데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는 데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 발생 잔기는 공통의 측쇄 특성에 기초하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다.
항체의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 반대로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 항체에 부가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다.
특히 바람직한 유형의 치환 변이체에는 모 항체 (예: 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 지닐 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성시키는 편리한 방법 은 파아지 디스플레이를 이용하는 친화도 성숙화 과정을 포함한다. 요컨대, 몇 개의 초가변 영역 부위 (예: 6 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에 가능한 모든 아미노산 치환부를 생성시킨다. 이로써 생성된 항체 변이체는, 각 입자내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 필라멘트상 파아지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서, 파아지 디스플레이된 변이체를 본원에 기재된 바와 같이 이들의 생물학적 활성 (예: 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형에 적합한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위해서는, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여, 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 상기 항체와 항원 간의 접촉점을 동정하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기와 이에 이웃하는 잔기가 본원에서 검토된 기술에 따른 치환 대상 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 분석법에서 탁월한 특성을 나타내는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조된다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연의 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 올리고뉴클레오티드 매개된 (또는 부위 지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나 이상의 아미노산 변형을 본 발명의 항체의 Fc 영역내에 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역 변이체는 변화된 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 이러한 변이체 Fc 영역은 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 또는 447 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다. FcRn에 대한 결합이 감소된 Fc 영역 변이체는 Fc 영역의 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 또는 447 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다. 또는, 상기 언급된 Fc 영역 변이체가 FcRn에 대한 결합 증가를 나타낼 수 있고, 이 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
FcγR에 대한 결합이 감소된 Fc 영역 변이체는 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
예를 들어, Fc 영역 변이체는 FcγRI에 대해 결합 감소를 나타낼 수 있고, Fc 영역의 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 327 또는 329 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
Fc 영역 변이체는 FcγRII에 대해 결합 감소를 나타낼 수 있고, Fc 영역의 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 또는 439 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
대상 Fc 영역 변이체는 FcγRIII에 대해 결합 감소를 나타낼 수 있고, Fc 영역의 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 또는 437 중 임의의 한곳 이상에서 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이 Fc 영역에서 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
변화된 (즉, 향상 또는 감소된) C1q 결합 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖는 Fc 영역 변이체는 W099/51642에 기재되어 있다. 이러한 변이체는 Fc 영역의 아미노산 위치 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 또는 334 중 한곳 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 또한, Fc 영역 변이체에 관하여는 문헌 [Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260호; 동 제5,624,821호; 및 W0 94/29351]을 참조한다.
인간 항체, 인간화 항체 또는 친화성 성숙된 항체
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고(하거나) 본 명세서에 개시된 인간 항체를 제조하기 위한 기술 중 임의의 기술을 이용하여 제조한 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외된다.
본 발명은 인간 항체 및 인간화 항체 둘 다를 포함한다. 비-인간 (예: 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않은 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 증진시키도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 초가변 루프의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고, FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로, 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조할 수 있다. 또한, 조사 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)] 및 이 문헌들에 인용된 참고 문헌을 참조한다.
"친화성 성숙된" 항체는 하나 이상의 CDR에서 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는 하나 이상의 변형을 갖지 않는 모 항체에 비해 상기 변형을 갖는 항체이다. 바람직한 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 단위의 친화도를 가질 것이다. 친화성 성숙된 항체는 당업계에 알려진 방법에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al., BiolTechnology 10: 779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙이 기재되어 있다. CDR 및(또는) 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
비인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화는 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)]에 따라 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 유사한 부위로부터 유래된 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
경쇄 및 중쇄 둘 다에 대해 인간 가변 도메인이 인간화 항체를 제조하는 데 사용되도록 선택하는 것은 항원성을 감소시키는 데 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트 (best-fit)" 방법에 따라, 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리를 대상으로 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 스크리닝한다. 설치류의 서열과 매우 유사한 인간 서열은 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크로서 허용된다 [Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 이와 동일한 프레임워크를 여러가지 다른 인간화 항체를 위해 사용할 수 있다 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)].
항원에 대한 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 항체를 인간화하는 것도 중요하다. 이 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 인간화 생성물의 분석 방법으로 인간화 항체를 제조한다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용되고 있고 당업자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 보여주는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이 디스플레이의 검사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가능한 역할 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이 방식으로, FR 잔기는 원하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 달성되도록 수용 서열과 임포트 서열로부터 선별 및 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 주는 데 있어서 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 관여한다.
항체 유도체
본 발명의 항체 및 항체 변이체가 당업계에 공지되어 있으며 쉽게 이용할 수 있는 추가의 비단백질성 잔기를 포함하도록 상기 항체 및 항체 변이체를 추가로 변형시킬 수 있다. 유도체화는 항체 또는 그의 단편의 생물학적 특성을 향상시키거나 복구하는 데 특히 유용하다. 예를 들어, 항체 단편의 PEG 변형은 안정성, 생체내 순환 반감기, 결합 친화도, 용해도 및 단백질분해에 대한 내성을 변화시킬 수 있다.
바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프로필프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 수중에서 그의 안정성으로 인해 제조상의 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있고, 하나 이상의 중합체가 부착되어 있는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및(또는) 유형은, 항체 유도체를 한정된 조건하에 치료법에서 사용하든지 그렇지 않든지간에, 향상시킬 항체의 특정한 특성 또는 기능을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 고려 사항을 기초로 하여 결정할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 원핵 생물 발현 시스템에 의해 제조된 항체 또는 항체 단편은 비글리코실화되어 있고, Fc 영역의 검출가능한 이펙터 활성이 결여되어 있다. 몇몇 경우에서, 천연 항체의 하나 이상의 이펙터 기능을 적어도 부분적으로 복귀시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명은 적합한 잔기를 비글 리코실화 항체의 Fc 영역내의 동정된 잔기 부위에 부착시킴으로써 이펙터 기능(들)을 복귀시키는 방법을 고려한다. 상기 목적에 바람직한 잔기는 PEG이지만, 다른 탄수화물 중합체를 또한 사용할 수도 있다. 페길화 (pegylation)는 당해 분야에 공지된 임의의 페길화 반응에 의해 수행할 수 있다 [참조예: EP 0401384; EP 0154316; WO 98/48837]. 한 실시양태에 있어서, 시스테인 잔기를 항체의 동정된 위치, 예를 들어 항체 또는 항체 변이체가 정상적으로 글리코실화된 동정된 위치 또는 항체의 표면 상에서의 동정된 위치에서의 잔기에 치환시킨다. 바람직하게는, 시스테인을 아미노산 위치 297, 298, 299, 264, 265 및 239 (Kabat에서의 EU 인덱스에 따르는 넘버링)의 하나 이상에서의 잔기(들)에 치환시킨다. 발현 후, 시스테인 치환된 항체 변이체는 유리 시스테인 잔기에 화학적으로 결합되어 있는 다양한 형태의 PEG (또는 예비 합성된 탄수화물)를 가질 수 있다.
항체 제조
벡터 작제
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하려는 것이다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 고리형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 또 다른 유형은 파아지 벡터이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 절편을 바이러스 게놈에 라이게이션할 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터)내에서 자율 복제를 할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)를 숙주 세포내로 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합시킬 수 있으며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제한다. 또한, 특정한 벡터는 이들이 작동가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "재조합 벡터")로서 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성을 갖는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에 있어서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에 서로 바꾸어 쓸 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "번역 단위"는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 인접한 조절 영역을 포함하는 유전자 요소를 의미하기 위한 것이다. "인접한 조절 영역"은 예를 들어 번역 개시 영역 (TIR; 본원의 하기에 정의한 바와 같음) 및 종결 영역을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "번역 개시 영역" 또는 TIR은 대상 유전자의 번역 개시의 효율을 제공하는 핵산 영역을 의미한다. 일반적으로, 특정 번역 단위내에서의 TIR은 리보좀 결합 부위 (RBS) 및 RBS에 대한 5' 및 3' 서열을 포함한다. RBS는 최소한 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 영역 및 개시 코돈 (AUG)을 함유하는 것으로 정의된다. 따라서, TIR은 또한 번역될 핵산 서열의 적어도 일부분을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 TIR은 번역 단위내에서 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 서열의 앞에 위치하는 분비 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. TIR 변이체는 TIR의 효율, 예를 들어 본원에서 아래에 정의한 바와 같은 번역 강도를 변화시키는 TIR 영역내의 서열 변이체(특히 치환)를 함유한다. 바람직하게, 본 발명 의 TIR 변이체는 번역 단위내에서 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 서열의 앞에 위치하는 신호 서열 중 처음 2 내지 약 14개, 바람직하게는 약 4 내지 12개, 보다 바람직하게는 약 6개의 코돈내에 서열 치환을 함유한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "번역 강도"는 TIR의 하나 이상의 변이체가 폴리펩티드의 분비를 지시하는 데 사용되는 조절 시스템에서 분비된 폴리펩티드의 측정 및 동일한 배양 및 분석 조건하에 야생형 TIR 또는 특정한 다른 조절과 비교한 결과를 의미한다. 어떠한 특정 이론에 한정되지 않으면서, 본원에서 사용된 바와 같은 "번역 강도"는, 예를 들어 mRNA 안정성의 정도, 리보좀 결합 부위로의 리보좀 결합의 효율 및 막을 가로지르는 전좌 방식을 포함할 수 있다.
"분비 신호 서열" 또는 "분비 신호 펩티드"는 세포 막, 예를 들어 원핵 생물의 내막 또는 내막과 외막 모두를 통해 새롭게 합성된 대상 단백질을 지시하는 데 사용할 수 있는 짧은 아미노산 서열을 의미한다. 이와 같이, 경쇄 또는 중쇄 폴리펩티드와 같은 대상 단백질은 원핵 생물 숙주 세포의 원형질막주변 공간 또는 배양 배지내로 분비된다. 분비 신호 서열은 숙주 세포에 대해 내인성일 수 있거나, 발현될 폴리펩티드에 고유한 신호 서열을 포함하여 외인성일 수 있다. 분비 신호 서열은 전형적으로는 폴리펩티드의 N 말단 부위에 존재하고, 전형적으로는 세포질로부터 폴리펩티드의 생합성 및 분비 사이에서 효소에 의해 제거된다. 이와 같이, 분비 신호 서열은 통상적으로는 최종 단백질 생성물내에 존재하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"(또는 "재조합 숙주 세포")는 유전자 변형되었거나, 재조합 플라스미드 또는 벡터와 같은 외인성 폴리뉴클레오티 드의 도입에 의해 유전자 변형시킬 수 있는 세포를 의미하고자 한다. 상기 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라, 상기 세포의 자손을 의미하고자 한다. 특정한 변형은 변이 또는 환경적 영향으로 인해 연속적인 세대에서 발생하기 때문에, 상기 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않으나, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위내에 여전히 포함된다.
본 발명의 항체 분자의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 서열은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 목적하는 DNA 서열을 항체 제조 세포, 예를 들어 하이브리도마 세포로부터 단리하여 서열화할 수 있다. 또는, DNA를 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 일단 수득되면, 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 원핵 생물 또는 진핵 생물 숙주내에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현시켜 분비할 수 있는 재조합 벡터내로 삽입한다. 당해 분야에서 입수가능하고 공지된 다수의 벡터를 본 발명의 목적을 위해 사용할 수 있다. 적합한 벡터의 선택은 주로 벡터내로 삽입할 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환시킬 특정한 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
일반적으로는, 숙주 세포와 적합한 종으로부터 유도된 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 재조합 벡터를 본 발명의 특정 벡터의 작제를 위한 모 벡터로 사용한다. 벡터는 통상적으로는 주쇄 성분으로서 복제 기점 부위, 및 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 표지 서열을 보유한다. 복제 기점 부위는 벡터가 선택된 하나 이상의 숙주 세포에서 복제할 수 있게끔 하는 핵산 서열이다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있게끔 하는 서열이며, 복제 기점 또는 자동 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 각종 박테리아, 효모 및 바이러스의 경우에 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 (Gram)-음성 박테리아에 대해 적합하다.
또한, 발현 및 클로닝 벡터는 선택가능한 마커로도 부르는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하거나, (b) 영양요구주 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양원을 공급하는 단백질을 코딩하며, 예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자가 있다. 선별 기구의 한가지 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하며, 따라서 선별 요법에서 생존하게 된다. 이. 콜라이 형질전환에 적합한 플라스미드 벡터의 예는 pBR322이다. pBR322는 앰피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 포함하며, 따라서 형질전환된 세포를 확인하는 용이한 수단을 제공한다. 또한, pBR322 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파아지의 유도체를 모 벡터로 사용할 수도 있다. 특정 항체의 발현에 사용되는 pBR322 유도체의 예는 카터 (Carter) 등의 미국 특허 제5,648,237호에 상세히 기재되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 적합한 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 파아지 벡터를 이들 숙주와 관련하여 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, λGEM.TM.-11과 같은 박테리오파아지를, 이. 콜라이 LE392와 같은 감응성 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용할 수 있는 재조합 벡터를 제조하는 데 이용할 수 있다.
한 실시양태에 따라, 본 발명의 재조합 벡터는 적어도 2개의 번역 단위, 즉 경쇄 발현을 위한 번역 단위 및 중쇄 발현을 위한 번역 단위를 포함한다. 또한, 경쇄 및 중쇄에 대한 2개의 번역 단위는 상이한 프로모터의 조절하에 있다. 프로모터는 코딩 서열 개시 부위의 5' 상류 (일반적으로 약 100 내지 1,000 bp 이내)에 위치하는 비번역 서열로서, 코딩 서열의 발현을 조절한다. 이러한 프로모터는 전형적으로는 2종의 부류, 즉 유도가능한 프로모터 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도가능한 프로모터는 배양 조건에서의 어떤 변화, 예를 들어 영양물질의 존재 또는 부재, 또는 온도 또는 pH의 변화에 반응하여 그의 조절하에 DNA로부터의 전사를 증가된 수준으로 개시하는 프로모터이다.
본 발명에 있어서, 구성적 프로모터 또는 유도가능한 프로모터는 제1 쇄 발현을 적절히 조절하는 제1 프로모터로 사용할 수 있으며, 유도가능한 프로모터는 추후 제2 쇄의 발현을 조절하는 제2 프로모터로서 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 둘 다 엄격한 조절하에 있는 유도가능한 프로모터이다. 다수의 잠재성 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 선택된 프로모터 서열을 제한 효소 절단을 통해 공급원 DNA로부터 분리하여 본 발명의 벡터에 삽입할 수 있다. 또는, 선택된 프로모터 서열을 합성할 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터 둘 다를 사용하여, 표적 유전 자의 증폭 및(또는) 발현을 지시할 수 있다. 그러나, 이종 프로모터는 이들이 일반적으로 표적 유전자를 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 더 많이 전사시키고 더 높은 수율로 발현시키기 때문에 바람직하다.
원핵 생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 박테리아내에서 기능성인 다른 프로모터 (예를 들어, 공지된 다른 박테리아 프로모터 또는 파아지 프로모터)가 또한 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열이 공개되어 있으며, 이로써 당업자는 임의의 필요한 제한 부위를 제공하는 링커 또는 어댑터를 사용하여 상기 뉴클레오티드 서열을, 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 번역 단위에 작동가능하게 라이게이션시킬 수 있다 [참조: Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269]. 본 발명에서 사용하기에 보다 바람직한 프로모터는 PhoA 프로모터 및 TacII 프로모터이다. 진핵 숙주 세포에서 기능성인 프로모터는 예를 들어 미국 특허 제6,331,415호에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 프로모터의 예로는 폴리오마, 아데노바이러스 (Adenovirus) 2 또는 원숭이 (Simian) 바이러스 40 (SV40)으로부터 유래된 것을 들 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 각 번역 단위는 삽입된 유전자의 충분한 발현에 필요한 추가의 비번역 서열을 포함한다. 재조합 벡터의 이러한 필수 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 개시 코돈의 5'에 위치하는 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 영역 및 번역 단위의 3' 말단에 위치하는 전사 종결자 (예, λto)를 포 함한다.
재조합 벡터의 각 번역 단위는 발현된 쇄 폴리펩티드가 막을 통해 분비될 것을 지시하는 신호 서열 성분을 추가로 포함한다. 일반적으로, 분비 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터내로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 분비 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세스되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 서열이다. 이종 폴리펩티드 고유의 신호 서열을 인식하여 프로세스하지 않는 원핵 생물 숙주 세포의 경우, 신호 서열을, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 원핵 생물 신호 서열에 의해 치환시킨다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 발현 시스템의 두 번역 단위에서 사용된 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다. 바람직하게, 이러한 신호 서열을 코딩하는 DNA를 리딩 프레임에서 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA의 5' 말단에 라이게이션하여 융합 폴리펩티드를 생성시킨다. 일단 숙주 세포의 세포질로부터 분비되면, 신호 펩티드 서열은 성숙 폴리펩티드로부터 효소에 의해 절단된다.
본 발명의 어떤 측면에서, 발현 시기를 조절하는 것 이외에도 분비 및 정확하게 조립된 항체 또는 그의 단편의 수율을 최대화하기 위해 경쇄 및 중쇄의 정량적인 발현 비율을 조절한다. 이러한 조절은 본 발명의 재조합 벡터상에서 경쇄 및 중쇄에 대한 번역 강도를 동시에 조절함으로써 달성된다. 번역 강도를 조절하기 위한 한가지 기술은 문헌 [참조: Simmons et al. 미국 특허 제5,840,523호]에 개시 되어 있다. 요컨대, 이 방법은 번역 단위내 번역 개시 영역 (TIR)의 변이체를 이용한다. 주어진 TIR의 경우, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체를 번역 강도의 범위로 생성시킴으로써 특정 쇄의 목적하는 발현 수준을 위해 이들 인자를 조정하는 편리한 수단을 제공한다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변화시킬 수 있는 코돈 변화를 생성시키는 통상의 돌연변이 유발 기술에 의해 생성시킬 수 있더라도, (하기 기술된 바와 같은) 뉴클레오티드 서열에서의 잠재성 변화가 바람직하다. TIR에서의 변화가, 예를 들어 신호 서열에서의 변화와 함께 샤인-달가노 서열의 수 또는 간격의 변화를 포함할 수 있다. 돌연변이체 신호 서열을 생성시키는 한가지 바람직한 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 (즉, 변화가 사일런트 (silent)임) 코딩 서열의 개시에서의 "코돈 뱅크"의 생성이다. 이는 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치를 변화시킴으로써 달성할 수 있으며; 또한 특정 아미노산, 예를 들어 루이신, 세린 및 아르기닌은 뱅크를 제조하는 데 있어서 복잡성을 부가할 수 있는 다중의 제1 및 제2 위치를 가진다. 이러한 돌연변이 유발 방법은 문헌 [참조: Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기술되어 있다.
바람직하게는, 한 세트의 벡터를 이의 내부에서 각각의 번역 단위에 대한 TIR 강도의 범위로 생성시킨다. 이러한 한정된 세트는 각각의 쇄의 발현 수준의 비교뿐만 아니라, 다양한 TIR 강도 조합하에 항체 생성물의 수율을 제공한다. TIR 강도는 문헌[참조: Simmons et al. 미국 특허 제5,840,523호]에 기술되어 있는 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 측정할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 벡터내에서 TIR의 특정한 쌍에 대한 번역 강도 조합을 (N-경쇄, M-중쇄)(여기서, N은 경쇄의 상대적 TIR 강도이고, M은 중쇄의 상대적 TIR 강도이다)에 의해 나타낸다. 예를 들어, (7-경쇄, 3-중쇄)는 벡터가 경쇄 발현에 대해 약 7의 상대적 TIR 강도 및 중쇄 발현에 대해 약 3의 상대적 TIR 강도를 제공하는 것을 의미한다. 번역 강도 비교를 기초로 하여, 목적하는 각각의 TIR이 본 발명의 발현 벡터 작제물내에서 조합되도록 선택한다.
상기 나열된 성분들의 하나 이상을 포함하는 적합한 벡터의 작제는 당업계에 공지된 표준 라이게이션 기술 또는 기타 분자 클로닝 기술을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단하고, 재단하고, 원하는 플라스미드를 생성시키는 데 필요한 형태로 리-라이게이션 (re-ligation)한다.
작제된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위한 분석의 경우, 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 균주를 형질전환시키고, 경우에 따라 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 성공적인 형질전환체를 선별한다. 형질전환체로부터의 플라스미드를 제조하고, 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 분석하고(하거나) 문헌 [Sanger et al.(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 or Messing et al.(1981) Nucleic Acids Res. 9:309]의 방법 또는 문헌 [Maxam et al.(1980) Methods in Enzymology 65:499.]의 방법에 의해 서열화한다. 시판되는 다수의 자동화 서열분석기를 사용하여 플라스미드를 서열화할 수 있다. 예를 들어, ABI PRISM 3700 DNA 분석기 (Applied Biosystems, Foster City, CA)는 형광으로 표지된 DNA 단편을 분석하는 자동화 모세관 전기영동 서열분석기이다. 샘플의 제조를 위한 지침은 상기 장치에 포함되어 있는 서열분석 화학 안내서 (Sequencing Chemistry Guide)에 제시되어 있다.
본 발명의 항체를 발현시키는 데 적합한 원핵 생물 숙주 세포로는 고세균 (Archaebacteria) 및 진정세균 (Eubacteria), 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 생물이 포함된다. 유용한 박테리아의 예로는 이셰리키아 (Escherichia)(예, 이. 콜라이), 바실러스 (예, 비. 서브틸리스 (B. subtilis)), 엔테로박테리아, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 (예, 피. 에루기노사 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 시겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla) 또는 파라코쿠스 (Paracoccus)를 들 수 있다. 바람직하게는 그람-음성 세포가 사용된다. 보다 바람직하게는, 이. 콜라이 세포가 본 발명을 위한 숙주로서 사용된다.
다수의 이. 콜라이 균주가 본원의 발현 숙주, 또는 변형된 발현 숙주가 생성될 수 있는 모 숙주로서 적합하다. 당업계에 공지되어 있으며 이용가능한 이. 콜라이 균주로는 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325), 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 언급된 박테리아 중 어떤 것의 돌연변이 세포를 사용할 수도 있다. 물론, 박테리아의 세포내 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 박테리아를 선택할 필요가 있다. 예를 들어, 잘 알려진 플라스미드, 예를 들어 pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410을 사용하여 레플리 콘을 공급하는 경우, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종을 숙주로서 적합하게 사용할 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비해야 하며, 원한다면 추가의 프로테아제 저해제를 세포 배양물내에 혼입시킬 수 있다.
또한, 적합한 진핵 숙주 세포가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 숙주 세포로는 효모, VERO, HeLa, CHO, W138, BHK, COS-7 및 MDCK 세포를 들 수 있다.
숙주 세포의 형질전환 및 배양
숙주 세포를 상기 기술한 재조합 벡터로 형질전환 또는 형질감염 ("형질전환" 및 "형질감염"이라는 용어는 본원에서 서로 바꾸어 쓸 수 있음)시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적절한 것으로 개질된 통상의 영양 배지에서 배양한다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 복제되거나 또는 염색체내에 통합되어 복제될 수 있도록 DNA를 원핵 생물 숙주에 도입하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라, 이러한 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 형질전환을 수행한다. 염화 칼슘을 사용하는 칼슘 처리는 일반적으로는 실질적인 세포벽 장벽을 포함하는 박테리아 세포의 경우에 이용된다. 다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공법 (electroporation)이다. 형질감염은 어떤 코딩 서열이 실제 발현되는지의 여부와는 무관하게 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 다수의 형질감염 방법이 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 CaPO4 침전법 및 전기천공법이 있다. 상기 벡터가 숙주 세포 내에서 작동한다는 어떤 표시가 있는 경우, 형질감염은 일반적으로 성공적인 것으로 인식된다.
본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 데 사용되는 원핵 세포는 당업계에 공지되어 있으며 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 배양한다. 적합한 배지의 예로는 필요한 영양 보충물을 부가한 루리아 브로쓰 (Luria Broth; LB)를 들 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 배지는 또한 발현 벡터의 작제를 기초로 하여 발현 벡터를 포함하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하도록 선택되는 선별제를 포함한다. 예를 들어, 앰피실린은 앰피실린 내성 유전자를 발현시키는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가한다. 탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외에도 임의의 필요한 보충물을, 단독으로 또는 다른 보충물 또는 배지, 예를 들어 복합 질소 공급원과의 혼합물로서 적정 농도로 포함시킬 수도 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리쓰리톨 및 디티오쓰레이톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 환원제를 포함할 수 있다.
원핵 생물 숙주 세포는 적절한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이 배양의 경우, 예를 들어 바람직한 온도 범위는 약 20 ℃ 내지 약 39 ℃, 보다 바람직하게는 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 보다 더 바람직하게는 약 30 ℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 생물에 따라 pH 약 5 내지 약 9의 특정 pH 범위일 수 있다. 이. 콜라이의 경우, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4이고, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.
본 발명의 항체를 제조하는 데 사용되는 진핵 숙주 세포는 당업계에 공지된 각종 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 햄스 (Ham's) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 시판 배지가 포유동물 진핵 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 동 제4,657,866호; 동 제4,927,762호; 동 제4,560,655호; 또는 동 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 제30,985호, 이들 문헌의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함됨]에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 상기 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중의 어떠한 것에도 필요에 따라, 호르몬 및(또는) 기타 성장 인자 (예를 들면, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예를 들면, HEPES), 뉴클레오시드 (예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들면, 겐타마이신 (등록상표) 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원을 보충할 수 있다. 기타 필요한 임의의 보충물을, 당업자에게 공지되어 있는 적당한 농도로 포함시킬 수도 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것이며, 이는 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.
경쇄 및 중쇄의 일시적으로 분리된 발현
숙주 세포가 특정 밀도로 배양되면, 배양 조건을 변화시켜 단백질의 합성을 촉진시킨다. 본 발명에 따라, 경쇄 및 중쇄는 합성 단계 동안 다른 시기에서 유도된다. 한 측면에서, 경쇄 및 중쇄의 일시적으로 분리된 발현은 상기 기재된 바와 같이 이중 프로모터 벡터를 사용함으로써 실현된다. 유도가능한 프로모터가 본 발명의 이중 프로모터 벡터로 사용되는 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에 유도된다. 바람직한 실시양태에서, 두 프로모터는 유도가능한 프로모터이다. 보다 바람직하게, 이중 프로모터는 각각 phoA 및 TacII이다. 예를 들어, phoA 프로모터가 경쇄의 전사를 조절하는 데 사용되고, TacII 프로모터가 중쇄의 전사를 조절하는 데 사용되는 벡터를 제작할 수 있다. 제1 유도 단계 동안, phoA/TacII 이중 프로모터 벡터로 형질전환된 원핵 생물 숙주 세포를, phoA 프로모터의 유도 및 경쇄의 발현을 위한 인산염-제한 배지에서 배양한다. 경쇄 발현을 위한 필요한 기간 후, TacII 프로모터의 유도 및 중쇄의 발현을 위해 충분량의 IPTG를 배양물에 첨가한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 숙주 박테리아 세포의 세포질에서 발현시킬 수 있다. 다양한 방법을 이용하여 이. 콜라이 세포질내에서 가용성의 기능성 항체 또는 항체 단편의 제조를 향상시킬 수 있다. 예를 들어, trxB 유전자가 결실된 이. 콜라이 균주는 세포질에서 디술피드 결합의 형성을 증대시키며, 따라서 세포질내에서 디술피드 결합이 적절히 형성된 기능성 항체 분자의 발현을 촉진시키는 데 유용한 것으로 밝혀졌다 [Proba et al. (1995) Gene 159:203-207]. 항체 단편 변이체가 VH 및 VL 둘 다에서 디술피드 결합의 형성을 필요로 하지 않도록 시스테인 잔기를 대체할 수 있으며, 따라서 종종 "인트라바디 (intrabody)"라고도 부르는 상기 항체 단편 변이체는 박테리아 세포질에서와 같이 효과적인 디술피드 결합 형성에 적합하지 않은 환원성 환경에서 제조될 수 있다 [Proba et al. (1998) J. Mol. Biol. 275:245-253].
분비 신호 서열이 본 발명의 벡터에서 사용되는 경우, 발현된 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드는 숙주 세포의 원형질막주변 공간으로 및 이 공간으로부터 분비된다. 전형적으로, 단백질 회수는 일반적으로 미생물을 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 파괴하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 파편 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 또는, 단백질을 배양 배지로 전달하고, 이 배지에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거할 수 있으며, 제조된 단백질의 추가의 정제를 위해 배양물 상청액을 여과한 다음, 농축시킨다. 발현된 폴리펩티드를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석법과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 추가로 단리하고 동정할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 항체를 발효 공정에 의해 대량으로 제조한다. 다양한 대규모 유가식 (fed-batch) 발효 방법을 재조합 단백질의 제조에 이용할 수 있다. 대규모 발효는 1,000 리터 이상의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양물질, 특히 글루코스(바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분포시키는 교반기용 임펠러 (impeller) 또는 다른 적합한 수단을 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 체적 용량이 약 100 리터 이하인 발효기내에서의 발효를 의미하고, 약 1 리터 내지 약 100 리터의 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로는 세포를 바람직한 밀도, 예를 들어 약 180 내지 270의 OD550으로 적합한 조건하에 성장시킨 후에 개시한다. 각종 유도제를 당해 분야에 공지되고 상기한 바와 같이 사용되는 벡터 작제물에 따라 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로는 약 12 내지 50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간을 이용할 수 있다.
본 발명의 항체 분자의 제조 수율 및 품질을 더 향상시키기 위해, 다양한 발효 조건을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적합한 조립 및 폴딩을 향상시키기 위해, 샤페론 (chaperone) 단백질, 예를 들어 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및(또는) DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성을 갖는 펩티딜프로필 시스,트랜스-이소머라제)를 과발현시키는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 생물 세포를 공동 형질전환시킬 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 제조된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 가용성을 촉진시키는 것으로 입증되어 있다[참조: Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., 미국 특허 제6,083,715호; Georgiou et al., 미국 특허 제6,027,888호; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210]. 충분한 디술피드 결합이 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전장 2가 항체의 형성 및 폴딩에 특히 중요하다.
예를 들어, 원핵 생물 숙주 세포에서 발현된 이종 단백질 (특히 단백질분해에 민감한 것들)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 단백질분해 효소가 결여된 특정의 숙주 균주를 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 원핵 숙주 세포 균주를, 공지된 박테리아 프로테아제, 예를 들어 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합을 코딩하는 유전자에서 유전자 돌연변이를 초래하도록 변형시킬 수 있다. 특정한 이. 콜라이 프로테아제-결여 균주가 이용가능하며, 예를 들어 문헌 [참조예: Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., 미국 특허 제5,264,365호; Georgiou et al., 미국 특허 제5,508,192호; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기술되어 있다.
항체 정제
숙주 세포로부터 제조된 항체 조성물을 바람직하게는 하나 이상의 정제 단계로 처리한다. 적합한 정제 단계의 예는 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 포함하며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 특정 단백질의 친화성 리간드로서의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 좌우된다. 예를 들어, 단백질 A를 이용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제할 수 있다 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 추천된다 [Guss et al., EMBO J 5:1567-1575 (1986)]. 친화성 리간드가 부착될 매트릭스로는 가장 흔하게는 아가 로스가 사용되지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 조절된 공극을 갖는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스 사용시 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 단축된 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX (등록상표) 수지 (J.T. Baker; Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라서 이온 교환 컬럼 상에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE (등록상표) 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산 암모늄 침전과 같은 다른 단백질 정제 기술이 이용될 수도 있다.
바람직한 실시양태에서, 여기서 제조된 항체를 추가로 정제하여 추가의 분석 및 사용을 위해 실질적으로 보다 균일한 제제를 얻는다. 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 특히 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 낮은 pH HIC (LPHIC)를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 특히, LPHIC는 정확하게 폴딩되고 디술피드 결합을 갖는 항체를 원치않는 오염 물질 (예, 부정확하게 결합된 경쇄 및 중쇄 단편)로부터 제거하는 방법을 제공한다.
활성 분석
본 발명의 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 그의 물리적/화 학적 특성 및 생물학적 기능에 대해 특성화할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 이중 프로모터 시스템에서 제조된 항체를 상이한 발현 벡터 설계 또는 상이한 숙주 세포 시스템과 같은 다른 발현 시스템에서 제조된 유사한 항체와 비교하는 것이 중요하다. 특히, 본 발명의 이중 프로모터 벡터에 의해 발현되는 조립된 항체 복합체의 양을 다양한 폴리시스트론성 벡터에 의해 발현된 것과 비교할 수 있다. 단백질 정량화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 발현된 단백질의 샘플을 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 상에서의 이들의 정량적 강도에 대해 비교할 수 있다. 또는, 대상의 특정 밴드 (예를 들어, 조립된 밴드)를 예를 들어 웨스턴 블롯 겔 분석에 의해 검출할 수 있다.
정제된 전장 항체를 N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광계, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 절단을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 일련의 분석법에 의해 추가로 특성화할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 본원에서 제조된 전장 항체를 그의 생물학적 활성에 대해 분석한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다. 당업계에 공지되어 있고 본원에서 사용할 수 있는 항원 결합 분석법으로는 웨스턴 블롯, 방사성 면역 분석법, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 분석법, 형광 면역분석법 및 단백질 A 면역분석법과 같은 기술을 이용하는 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 분석법을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 항원 결합 분석법은 아래 실시예란에서 제공한 다.
항체의 용도
본 발명의 항체를 사용하여, 예를 들어 그가 인식하는 특정 폴리펩티드를 정제, 검출 및 표적화할 수 있다 (각종 질환 또는 질병의 시험관내 및 생체내 진단, 예방 또는 치료 방법 포함).
"질환"은 항체로 치료하여 효과를 얻을 수 있는 임의의 증상이다. 이 질환에는 포유동물이 해당 질환을 앓기 쉽게 하는 병리학적 증상을 비롯한 만성 및 급성 질환 또는 질병이 포함된다. 본 명세서에서 치료할 질환의 비-제한적 예에는 양성 및 악성 종양; 비-백혈병 및 림프성 악성종양; 신경, 아교, 성상세포, 시상하부 및 다른 내분비선, 대식세포, 상피세포, 간질 및 포배강 질환; 및 염증, 혈관신생 및 면역학적 질환이 포함된다.
본 명세서에서 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직으로부터 발생되어 개체 자신에 대해 유도되는 비-악성 질환 또는 질병이다. 본원에서 자가면역 질병은 특히 악성 또는 암성 질병 또는 증상, 특히 B 세포 림프종, 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 모발 세포 백혈병 및 만성 골수모세포성 백혈병을 배제한다. 자가면역 질환 또는 질병의 예에는 염증 반응, 예를 들어 건선 및 피부염 (예를 들어, 아토피성 피부염)을 비롯한 염증성 피부 질환; 전신성 피부경화증 및 경화증; 염증성 장 질환과 관련된 반응 (예컨대, 크론병 및 위궤양); 호흡 곤란 증후군 (성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS)을 포함함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 결장염; 사구체신염; 습진 및 천식과 같은 알레르기성 증상, 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증성 반응을 수반하는 다른 증상; 죽상경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스성 관절염; 전신홍반성 루프스 (SLE); 당뇨병 (예를 들어 타입 I 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이나우드 (Reynaud) 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 연소기 발병성 당뇨병; 및 전형적으로 결핵, 유육종증, 다발성근염, 육아종 및 혈관염에서 발견되는 사이토킨 및 T 림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민반응과 관련된 면역반응; 악성빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출증을 수반하는 질환; 중추신경계 (CNS) 염증 질환; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (한랭글로불린혈증 또는 쿰즈 (Coombs) 양성 빈혈을 포함하나, 이에 제한되지 않음); 중증근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항-인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브 병; 램버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발성내분비병증; 레이터병 (Reiter's disease); 스티프-만 (stiff-man) 증후군; 베세트병 (Behcet disease); 거대세포 동맥염; 면역복합체 신염; IgA 신병증; IgM 다발성신경병증; 및 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 생장을 특징으로 하는, 포유동물의 생리학적 증상을 말한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평세포암, 소(小)세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 세포암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"는 치료할 개체 또는 세포의 자연 경과를 변화시키고자 하는 시도에서의 임상적 중재를 의미하고, 예방 동안 또는 임상 병리 기간 동안 수행할 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적이거나 간접적인 병리학적 예후의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 예후의 경감 또는 호전을 포함한다.
"유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 시간 동안에 유효한 양을 의미한다. 항체의 "치료학적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 항체의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 항체의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료학적으로 유익한 효과에 의해 해소되는 양이다. "예방학적 유효량"은 목적하는 예방학적 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 시간 동안에 유효한 양을 의미한다. 전형적으로는, 예방학적 투여량은 질환의 보다 초기 단계 이전에 또는 보다 초기 단계에서 환자에서 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
한 측면에서, 본 발명의 항체를 생물학적 샘플 중의 특정 항원을 정성적으로 및 정량적으로 측정하기 위한 면역분석법에서 사용할 수 있다. 항원-항체 결합을 검출하기 위한 통상의 방법은, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사성면역분석법 (RIA) 또는 조직 면역조직화학법을 포함한다. 다수의 방법은 검출 목적을 위해 항체에 결합된 표지를 사용할 수 있다. 항체와 함께 사용되는 표지는 항체에 대한 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 관능기이다. 방사성 동위원소 32P, 32S, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어 희토류 킬레이트제 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 락토퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파아지 표지, 안정한 유리 라디칼, 이미지형성 방사성핵종 (예를 들어, 테크네슘) 등을 포함한 다수의 표지가 공지되어 있다.
상기 표지를 항체 폴리펩티드에 공유 결합시키는 통상의 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 커플링제, 예를 들어 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화 벤지딘 등을 사용하여, 항체를 상기한 형광, 화학발광 및 효소 표지로 태그시킬 수 있다 [참조예: 미국 특허 제3,940,475호 (형광측 정) 및 미국 특허 제3,645,090호(효소); Hunter et al. Nature 144:945 (1962); David et al. Biochemistry 13:1014-1021 (1974); Pain et al. J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981); 및 Nygren Histochem. and Cytochem 30:407-412 (1982)]. 본원에서 바람직한 표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제와 같은 효소이다. 효소를 포함한 상기 표지의 항체 폴리펩티드에의 접합은 면역분석 기술에서의 숙련가에 대해서는 표준 조작 방식이다 [참조예: O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp. 147-166]. 이러한 결합 방법은 본 발명의 항체 폴리펩티드와 함께 사용하기에 적합하다.
항체의 표지화 대신에, 항원을 생물학적 유체 중에서 검출가능한 물질 및 비표지된 항체로 표지된 경쟁적 항원 표준물을 사용하는 경쟁 면역분석법에 의해 분석할 수 있다. 당해 분석법에 있어서, 생물학적 샘플, 표지된 항원 표준물 및 항체를 합하여, 비표지된 항체에 결합되어 있는 표지된 항원 표준물의 양을 측정한다. 생물학적 샘플 중의 시험된 항원의 양은 항체에 결합되어 있는 표지된 항원 표준물의 양에 반비례한다.
한 측면에 있어서, 본 발명의 항체가 시험관내 또는 생체내에서 특이적 표면 항원의 발현을 검출하고 프로파일하는 데 특히 유용하다. 표면 항원은 특정 세포 또는 조직 유형에 대해 특이적일 수 있으며, 따라서 세포 또는 조직 유형의 마커로서 작용할 수 있다. 바람직하게는, 표면 항원 마커는 특정 세포 또는 조직 유형의 다양한 분화 단계에서 차별적으로 발현된다. 따라서, 이러한 표면 항원에 대해 지시되는 항체는 마커를 발현시키는 세포 또는 조직 집단의 스크리닝에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 줄기 세포, 예를 들어 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포의 스크리닝 및 단리에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 사용하여, 종양-관련 표면 항원, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체를 발현시키는 종양 세포를 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 친화성 정제 제제로서 사용할 수 있다. 당해 방법에 있어서, 당해 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 항체를 고상, 예를 들어, Sephadex 수지 또는 여과지 상에 고정시킨다. 고정된 항체를 정제할 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합되어 있는 정제할 항원을 제외한 샘플 중의 거의 모든 물질을 제거하는 적합한 용매로 지지체를 세척한다. 최종적으로, 항체로부터 항원을 해리시킬 수 있는 글리신 완충액 (pH 5.0)과 같은 또 다른 적합한 용매로 지지체를 세척한다.
본 발명의 항체를 시험관내 및 생체내 둘 다에서 특이적 항원 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하기 위한 길항제로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 중 적어도 일부는 다른 종으로부터의 항원 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체를 사용하여, 예를 들어 항원을 함유하는 세포 배양물에서, 인간 대상체에서 또는 본 발명의 항체가 교차 반응하는 항원을 보유하는 다른 포유동물 대상체 (예를 들어, 침팬지, 비비, 마모셋, 시노몰구스 및 레서스 원숭이, 돼지 또는 마우스)에서 특이적 항원 활성을 저해할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 유해한 질환을 앓고 있는 대상체에게 이 대상체에서 항원 활성이 억제되도록 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 당해 대상체에서 항원을 억제하는 방법에서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 항원은 인간 단백질 분자이고, 대상체는 인간 대상체이다. 또는, 대상체는 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현시키는 포유동물일 수 있다. 또 다른 추가의 대상체는 (예를 들어, 항원의 투여에 의해 또는 항원 형질전환 유전자의 발현에 의해) 항원이 도입된 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적을 위해 사람 대상체에 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의학용 목적을 위해 또는 사람 질환의 동물 모델로서 항체가 교차 반응하는 항원을 발현시키는 비인간 포유동물 (예를 들어, 영장류, 돼지 또는 마우스)에게 투여할 수 있다. 후자와 관련하여, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는 데 (예를 들어, 투여량 및 투여 시간을 시험하는 데) 유용할 수 있다. 치료학적으로 유용한 본 발명의 차단 항체는, 예를 들어 VEGF, 항-IgE, 항-CD11 및 항-조직 인자 항체를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 차단성 항체는 비제한적으로 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프계 악성 종양; 신경세포, 아교세포, 성상세포, 시상하부 및 또 다른 선상, 대식세포, 상피, 간질 및 포배 질환; 및 염증성, 혈관형성성 및 면역 질환을 포함한, 1종 이상의 항원 분자의 비정상적 발현 및(또는) 활성과 관련된 질병, 질환 또는 증상을 진단하거나, 치료하거나, 저해하거나 예방하는 데 사용할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 차단 항체는 리간드 항원에 대해 특이적이고, 리간 드 항원을 포함한 리간드-수용체 상호작용을 차단하거나 방해하여 항원 활성을 저해함으로써, 상응하는 신호 경로 및 다른 분자 또는 세포 반응을 저해한다. 본 발명은 또한 리간드 결합을 반드시 방해하지는 않지만, 수용체 활성화를 방해함으로써, 통상적으로 리간드 결합에 의해 개시되는 임의의 반응을 저해하는 수용체-특이적 항체를 특징으로 한다. 본 발명은 또한 바람직하게 또는 전적으로 리간드-수용체 복합체에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 또한 특정의 항원 수용체의 아고니스트로서 작용함으로써, 리간드-매개된 수용체 활성화의 전체 또는 부분 활성을 강화시키거나, 증강시키거나 활성화시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포독성제와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체를 제조하여 사용한다. 바람직하게는, 면역접합체 및(또는) 그가 결합하는 항원은 세포에 의해 내재화되어, 면역접합체가 결합하는 표적 세포를 사멸시키는 데 있어서의 면역접합체의 증가된 치료학적 효능을 초래한다. 바람직한 실시양태에서, 세포독성제는 표적 세포내에서 핵산을 표적화하거나 방해한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고(하거나) 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들면 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 (이들의 단편 및(또는) 변이체 포함)를 포괄한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학요법제의 예로는 티오테파 및 사이클로스포스파미드 (CYTOXAN (상표명)) 등의 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판 등의 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파 등의 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체인 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘루테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로로에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드 등의 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴 등의 니트로스우레아; 에네딘 (enediyne) 항생제 등의 항생제 (예를 들어, 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 γI 1 및 칼리케아마이신 θI 1, 예를 들어 문헌 [Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)] 참조; 디네마이신 (디네마이신 A 포함); 에스페라마이신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 (chromoprotein) 에네딘 항생제 발색단); 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레 오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU) 등의 항-대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트 등의 폴산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌 등의 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU 등의 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤 등의 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄 등의 항부신제; 프롤린산 등의 폴산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄신 및 안시미토신 등의 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK (등록상표); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠 온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면 파클리탁셀 [TAXOL (등록상표), Brisol-Meyers Squibb Oncology, Princeton, NJ] 및 독세탁셀 (TAXOTERE (등록상표), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카르보플라틴 등의 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 및 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 있다. 또한, 이러한 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들면 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타네 억제성 4(5)-이미다졸, 4-히드록실아목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (Fareston)을 포함한 항-에스테로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 루이프롤리드 및 고세렐린 등의 항안드로겐; 및 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
항체 및 하나 이상의 소분자 독소의 접합체, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄신 (미국 특허 제5,208,020호), 트리코텐 및 CC1065가 또한 본원에서 고려된다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 항체를 하나 이상의 메이탄신 분자(예 를 들어, 항체 분자당 약 1 내지 약 10개의 메이탄신 분자)에 접합시킨다. 메이탄신은, 예를 들어 May-SS-Me으로 전환시킬 수 있으며, 이는 May-SH3으로 환원시키고, 변형된 항체 [참조: Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)]와 반응시켜, 메이탄시노이드-항체 면역접합체를 생성시킬 수 있다.
또 다른 대상 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신계 항생제는 피코몰 이하의 농도에서 이중 가닥 DNA 절단물을 생성시킬 수 있다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다[참조: Hinman etal. Cancer Research 53:3336-3342 (1993) 및 Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]. 또한, 미국 특허 제5,714,586호, 제5,712,374호, 제5,264,586호 및 제5,773,001호를 참조한다.
사용할 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사 ( Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨락카 아메리카나 (Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노 마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다 [참조예: 1993년 10월 28일에 공개된 WO 93/21232].
본 발명은 항체와 핵분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제; DNase)간에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.
다양한 방사성 동위원소를 방사성접합 항체의 제조에 이용할 수 있다. 이의 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188 , Sm153, Bi2l2, P32 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트, 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [참조: Vitetta et al. Science 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트 리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드의 항체로의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다 [참조: W094/11026]. 링커는 세포내에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시키는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커[참조: Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)]를 사용할 수 있다.
또는, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체를, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후, 제거제를 사용하여 비결합된 접합체를 순환계로부터 제거한 다음, 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합되어 있는 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여하는 종양 예비표적화에서 사용하기 위해 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 요법에 있어서 단독으로 또는 다른 조성물과 배합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체는 또 다른 항체, 화학요법제(들)(화학요법제의 혼합물 포함), 다른 독성제(들), 항-혈관형성제(들), 사이토킨 및(또는) 성장 억제제(들)와 함께 공동 투여할 수 있다. 항체가 종양 성장을 억제하는 경우에, 항체를 종양 성장을 또한 억제하는 하나 이상의 다른 치료제(들)와 병용하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 예를 들어, VEGF 활성을 차단하는 항-VEGF 항체는 전이성 유방암의 치료에 있어서 항-ErbB 항체 (예: HERCEPTIN (등록상표) 항-HER2 항체)와 병용할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 환자에게 병용 방사선 요법(예: 외부 빔 조사 또는 방사성 표지된 제제, 예를 들어 항체를 사용한 요법)을 제공할 수 있다. 위에서 언급된 이와 같은 병용 요법은 병용 투여(여기서, 2종 이상의 제제가 동일 또는 별도의 제제에 포함된다), 및 항체의 투여를 보조 치료제 또는 치료제들의 투여 전 및(또는) 후에 수행할 수 있는 개별 투여를 포함한다.
항체 (및 보조 치료제)를 비경구, 피하, 복막내, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 위해 필요한 경우에, 병소내 투여를 포함한 임의의 적합한 방식에 의해 투여한다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 특히 항체의 감소된 투여량으로 펄스 주입에 의해 적합하게 투여한다. 바람직하게는, 투약은 주사, 가장 바람직하게는 부분적으로 투여가 단기간 또는 장기간인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공한다.
본 발명의 항체 조성물은 바람직한 의료 시행에 따르는 방식으로 제제화하고, 투약하고, 투여할 것이다. 이와 관련된 고려 인자는 치료할 특정 질환, 치료할 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 예정 투여 일정 및 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 해당 질환을 예방하거나 치료하는 데 통상적으로 사용되는 1종 이상의 제제와 함께 제제화할 필요는 없지만, 임의로 이들과 함께 제제화한다. 이와 같은 다른 제제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료 유형 및 위에서 논의한 다른 인자에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 상기에서 사용된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로 또는 이전에 사용된 투여량의 약 1 내지 99％로 사용한다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 또는 화학요법제와 같은 다른 제 제와 조합하여 사용할 경우에) 항체의 적정 투여량은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체를 예방 또는 치료 목적으로 투여할 것인지의 여부, 이전의 요법, 항체에 대한 환자의 임상적 이력 및 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 일시에 또는 일련의 치료로 환자에게 적합하게 투여한다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)이, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의하든지 또는 연속 주입에 의하든지간에 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 위에서 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 것이다. 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복된 투여의 경우, 상태에 따라, 질환 증상이 목적하는 정도로 억제될 때까지 치료를 지속한다. 항체의 바람직한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위내일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합)의 1종 이상의 투여량을 환자에게 투여할 수 있다. 이와 같은 투여량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 (예를 들어, 환자에게 약 2회 내지 약 20회, 예를 들어, 약 6회의 항체 투여량을 제공하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 많은 부하 투여량, 이어서 1회 이상의 보다 적은 투여량을 투여할 수 있다. 예시적인 투여 섭생법은 약 4 mg/kg의 초기 부하 투여량에 이어서 약 2 mg/kg의 항체를 유지 투여량으로 매주 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 또 다른 투여 섭생법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링한다.
약제 제제
항체의 치료 제제는 보관을 위해 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합함으로써 수용액, 동결건조되거나 다른 건조된 제제의 형태로 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 대해 무독성이고, 완충액, 예를 들어 인산염, 시트르산염, 히스티딘 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (잔기 약 10개 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN (등록상표), PLURONICS (등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서 제제는 또한 치료할 특정 적응증에 필요로 하는 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부작용을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자를 의도하는 목적에 유효한 양으로 배합물로 적합하게 제공한다.
또한, 활성 성분을, 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용할 제제는 무균적이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성한다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트와의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT (등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤 라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정한 하이드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 장시간 동안 체내에 체류하는 경우, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과로서 변성하거나 응집할 수 있으며, 이로써 생물학적 활성의 손실 및 면역원성에서의 가능한 변화가 유발된다. 관련된 메카니즘에 따라 안정화를 위해 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교체를 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지는 경우, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로서 달성할 수 있다.
제품
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기한 질환의 치료에 유용한 재료를 함유하는 제품을 제공한다. 제품은 용기 및 당해 용기상에 또는 이와 결부된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 각종 재료로부터 성형할 수 있다. 용기는 증상을 치료하는 데 효과적인 조성물을 수용하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 액제 백 또는 피하 주사침에 의해 관통가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 1종 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 증상, 예를 들어 암의 치료에 사용됨을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 항체를 포함하는 조성물이 수용되어 있는 제1 용기 및 (b) 추가의 독성제를 포함하는 조성물이 수용되어 있는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시양태에서 제품은 제1 및 제2 항체 조성물이 암을 치료하는 데 사용될 수 있음을 지시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 제품은 주사용 정균화수(BWFI), 인산염-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 주사침 및 주사기를 포함한, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
다음의 실시예는 단지 본 발명의 실시를 예시하고자 하는 것이지, 한정하기 위해 제공하는 것은 아니다. 본원에 인용된 모든 특허 명세서 및 과학 문헌은 그의 전체 개시내용이 명시적으로 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1. 항-CD18 항체 단편의 제조
재료 및 방법
플라스미드 작제
대조군 플라스미드인 pS1130은 항-CD18 F(ab')2의 디시스트론성 발현을 위해 설계하였으며, 카터 (Carter) 등의 문헌 [(1992) Bio/Technology 10:163-167]에 기 술된 벡터를 기초로 한다. 이러한 설계에 의해 C-말단에 루이신 지퍼를 갖는 경쇄 및 중쇄 단편 둘 다에 대한 유전자가 단일 phoA 프로모터의 조절하에 전사되게끔 위치하였다. λt0 전사 종결자를 갖는 전사 말단부는 중쇄-루이신 지퍼에 대한 코딩 서열의 하류에 위치하였다 [Scholtissek and Grosse (1987) Nucleic Acids Res. 15(7): 3185)]. 열 안정성 장독소 II 신호 서열 (STII)은 각 쇄의 코딩 서열의 앞쪽에 있으며, 폴리펩티드가 원형질막주변 공간으로 분비되도록 지시한다 [Lee et al. (1983) Infect. Immun. 42: 264-268; Picken et al. (1983) Infect. Immun. 42: 269-275)]. 루이신 지퍼는 2개의 Fab' 아암의 이합체 형성을 촉진시키기 위해 중쇄 단편의 C-말단에 부착시켰다.
2개의 별도의 번역 단위를 포함하는 이중 프로모터 플라스미드인 pxCD18-7T3은 경쇄의 전사를 중쇄의 전사로부터 일시적으로 분리시킨다. pS1130에서와 같이, 경쇄는 phoA 프로모터의 조절하에 있다. 그러나, pxCD18-7T3에서, λt0 전사 종결자는 경쇄 코딩 서열의 뒤쪽에 있다. 중쇄 단편/C-말단의 루이신 지퍼의 전사를 조절하기 위해 이 종결자의 하류에 TacII 프로모터를 부가하였다 [DeBoer, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25)]. 제2 λt0 전사 종결자는 이 코딩 서열의 뒤쪽에 존재한다. STII 신호 서열의 사일런트 (silent) 코돈 변이체를 사용하여 두 쇄의 분비를 지시하였다 [Simmons and Yansura (1996) Nature Biotechnology 14:629-634].
단일 프로모터 조절 플라스미드 대 이중 프로모터 플라스미드의 개요도 비교 를 도 1에 나타내었다. pxCD18-7T3의 발현 카세트 서열은 도 2 (서열 3)에 제시되어 있으며, 2개의 번역 단위의 아미노산 서열은 도 3 (서열 4)에 나타나 있다.
발효
발효에 사용된 숙주 세포는 59A7로 명명되는 이. 콜라이 W3110 유도체이었다. 59A7의 완전한 유전자형은 W3110 △fhuA phoA△E15 △(argF-lac)169 deoC2 degP41(△pstI-Kan r ) IN(rrnD-rrnE) 1 ilvG2096(Val r ) △prc prc-서프레서 (suppressor)이다. 59A7 숙주 세포를 pS1130 또는 pxCD18-7T3 플라스미드로 형질전환시키고, 성공적인 형질전환체를 선별하여 배양하였다. 이중 프로모터 플라스미드의 경우, 추가의 플라스미드인 pMS421을 pxCD18-7T3과 함께 공동 형질전환시켰다. 추가의 플라스미드인 pMS421은 TacII 프로모터의 조절을 향상시키는 lacIq를 제공하며 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성을 부여하는 pSC101-계 플라스미드이다.
각각의 10 리터 발효에서, 10-15％ DMSO 중 배양물을 1.5 ml 함유하는 단일 바이알을 해동시켜, 0.5 ml 테트라사이클린 (5 mg/ml) 및 2.5 ml 1 M 인산나트륨 용액이 보충된 500 ml LB 배지를 함유하는 1 L 진탕 플라스크에 넣었다. 이러한 시드 (seed) 배양물을 30℃에서 약 16시간 동안 배양한 다음, 10 리터 발효기를 접종시키는 데 사용하였다.
발효기는 4.4 g 글루코스, 100 ml 1 M 황산마그네슘, 10 ml 미량 원소 용액 (100 ml 염산, 27 g 염화제2철 육수화물, 8 g 황산아연 칠수화물, 7 g 염화코발트 육수화물, 7 g 몰리브덴산나트륨 이수화물, 8 g 황산구리 오수화물, 2 g 붕산, 5 g 황산망간 일수화물, 최종 용적 1 리터), 20 ml 테트라사이클린 용액 (에탄올 중 5 mg/ml), 10 ml 퍼맥스 (Fermax) 보조제 27 (또는 어떤 등가의 소포제), HCD 염 1 백 (37.5 g 황산암모늄, 19.5 g 이염기성 인산칼륨, 9.75 g 일염기성 인산나트륨 이수화물, 7.5 g 시트르산나트륨 이수화물, 11.3 g 일염기성 인산칼륨), 200 g NZ 아민 A (단백질 가수분해물)을 함유하는 약 6.5 리터 배지로 처음 시작하였다. 발효를 기류 10 slpm하에 30℃에서 수행하고, pH 7.0 ±0.2 (어떤 경우, 이 범위를 벗어난 몇몇 이탈이 발생하였지만)로 조절하였다. 발효기의 배압 (back pressure) 및 교반 속도를 변화시켜, 발효기내의 산소 전달 속도를 조절하고, 결과적으로 세포 호흡 속도를 조절하였다.
진탕 플라스크로부터의 세포-함유 배지로 발효기를 접종한 후, 농축된 글루코스 용액을 발효기에 공급하는 컴퓨터-기초 알고리즘을 이용하여 배양물을 발효기내에서 높은 세포 밀도로 성장시켰다. 또한, 수산화암모늄 (58％ 용액) 및 황산 (24％ 용액)을 필요한 경우에 pH를 조절하기 위해 발효기에 공급하였다. 몇몇 경우, 소포제를 추가로 첨가하여 포말형성을 조절하였다. 배양물이 약 40 OD550에 이르렀을 때, 1 M 황산마그네슘 100 ml를 추가로 발효기에 가하였다. 또한, 배양물이 OD550 약 20에 이르렀을 때, 농축된 염 공급물 (물 1 L 중 10 g 황산암모늄, 26 g 이염기성 인산칼륨, 13 g 일염기성 인산나트륨 이수화물, 2 g 시트르산나트륨 이수화물, 15 g 일염기성 인산칼륨으로 구성됨)을 발효기에 가하여 2.5 ml/분의 속도 로 개시하고, 약 1,250 ml가 발효물에 가해질 때까지 계속하였다. 발효는 전형적으로는 72 내지 80시간 동안 계속하였다.
발효 동안, 발효에 대한 용해된 산소 기준점에 이르면, 기준점에서의 용해된 산소 농도를 조절하기 위해 농축된 글루코스 용액을 용해된 산소 프로브 신호을 기준으로 하여 공급하였다. 결과적으로, 이러한 조절 체계에 있어서, 발효물내의 산소 전달 능력에 영향을 미치는 교반 속도 또는 배압과 같은 발효기 작동 파라미터의 조작은 상응하게는 세포의 산소 섭취 속도 또는 대사 속도를 조작하였다.
질량 분광계를 사용하여, 발효물로부터의 방출 기체의 조성을 모니터링하였고, 이는 발효물 중의 산소 섭취 속도 및 이산화탄소 방출 속도의 계산을 가능하게 한다.
배양물이 OD550 약 220의 세포 밀도에 도달했을 때, 교반 속도를 초기 속도 약 1,000 rpm에서 약 725 rpm으로 약 12시간에 걸쳐 감소시켰다. pxCD18-7T3 시스템 발효의 경우 (여기서는 TacII 프로모터를 사용하여 중쇄 발현을 조절하였음), 배양물이 OD550 220의 세포 밀도에 도달한 후, 200 mM IPTG 50 ml를 가하여 약 12시간 동안 중쇄 합성을 유도하였다.
생성물 분석
발효에서 생산된 항체 단편의 양을 평가하기 위해, 다수의 단백질 분석법을 이용하였다. 조립된 항-CD18 F(ab')2-루이신 지퍼 복합체의 양을 결정하기 위해, 단백질 G 분석법을 이용하였다 [Derrich and Wigley (1992) Nature 359:752-4]. 이 분석을 위한 샘플을 제조하기 위해, 전체 발효 브로쓰를 먼저 초음파처리하고, 50 mM 황산 마그네슘으로 2.4배 희석하였다. 폴리에틸렌이민 (PEI)을 0.1％의 최종 농도로 첨가하였다. 20분 동안 인큐베이션한 다음, 샘플을 미세원심분리기로 약 14,000 ×g에서 약 20분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 인산염 완충 염수로 2회 희석시키고, HP1090 또는 HP1100 HPLC 시스템을 사용하여 단백질 G 컬럼 (Poros G/M 컬럼)에 로딩하였다. 컬럼을 먼저 10 mM PO4/300 mM NaCl (pH 8)로 평형화하는 7분 분석을 이용하였다. 샘플 주입 후, 컬럼을 평형 완충액으로 약 5.5분 동안 씻어낸 다음 (2.1 ×30 mm 컬럼에서 완충액 약 3 ml를 사용함), 30 mM PO4/150 mM NaCl/0.01％ TFA (pH 1.9)를 사용하여 용출 단계를 수행하였다.
단백질 G 결과가 조립된 F(ab')2 복합체를 실제로 나타냈는지를 확인하기 위해, 이온 교환 컬럼 및, 고정된 펩신을 사용하여 루이신 지퍼 부위를 제거한 후, 추가의 이온 교환 컬럼 및 페닐 세파로스 HIC 컬럼을 포함하는 다중 크로마토그래피 단계를 통해 생성물을 정제하였다. 정제된 생성물을 통상적인 다수의 방법, 예를 들어 양이온 교환 분석, 모세관 대역 전기영동 비-겔 시빙 (sieving) 분석법, 및 SDS-PAGE 겔에 의해 특성화하였다.
발효물에서 생산된 경쇄 및 중쇄 단편의 총량을 평가하기 위해, 다른 역상 HPLC 분석법을 이용하였다. 이 분석에 사용된 샘플을 상기 단백질 G 분석법에서 기술된 바와 같이 제조하였다. 가용성 용해물 샘플을 6 M 구아니딘-HCl, 50 mM TRIS, pH 9 중에서 희석하였다 (통상적으로, 샘플 100 ㎕를 구아니딘 용액 650 ㎕ 로 희석하였다). 이후, 2 M 디티오쓰레이톨 (새로 해동시킴) 50 ㎕를 가하였다. HPLC 상에 로딩하기에 앞서, 아세토니트릴 200 ㎕를 가하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하였다.
역상 방법의 경우, 휴렛-팩커드 (Hewlett-Packard (등록상표)) 1100 HPLC를 퍼셉티브 포러스 (Perseptive Poros (등록상표)) R-1 역상 컬럼과 함께 사용하였다. 60 내지 80 ℃로 가열된 컬럼을 사용하여 분석을 수행하였으며, 278 nm에서 UV 흡광도를 모니터링하였다. 컬럼을 0.1％ 트리플루오로아세트산을 함유하는 28％ 아세토니트릴 수용액 중에서 평형화하였다. 이후, 샘플 25 ㎕를 컬럼에 로딩하고, 28％ 내지 38％ 아세토니트릴 선형 농도 구배를 사용하여 20분 동안 용출시킨 다음, 95％ 아세토니트릴에서 17분 동안 재생시키고, 28％ 아세토니트릴에서 재평형화하였다. 경쇄 및 중쇄-관련 종에 대한 피크는 확인을 위해 질량 분광법을 이용하여 표준물과 분석물을 비교함으로써 확인하였다. 중쇄 및 경쇄에 대한 서열을 포함하지 않는 플라스미드를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 숙주를 사용하는 블랭크 런 (blank run)으로부터의 발효 샘플을 유사하게 제조하여 분석함으로써 분석을 위한 적절한 기저 수준을 결정하였다. 휴렛-팩커드 (등록상표) 1100 소프트웨어를 사용하여 피크 면적의 적분을 수행하였으며, 표준물을 블랭크 런 샘플로 스파이킹 (spiking)함으로써 샘플 중 다양한 종의 상대적인 양을 정량하기 위한 검량 그래프를 생성시켰다.
또한, 세포 용해물로부터 얻은 불용성 펠릿을 950 ㎕의 6 M 구아니딘/HCl, 50 mM TRIS, pH 9 + 50 ㎕의 2 M 디티오쓰레이톨 중에 재현탁시킴으로써 불용성 용 해물 샘플을 유사하게 분석하였다. 초음파처리 (5 내지 10 펄스)를 통상적으로 수행하여 펠릿의 재용해를 보조한 다음, 재현탁된 펠릿 100 ㎕를 650 ㎕의 구아니딘 용액 + 50 ㎕의 2 M 디티오쓰레이톨 + 200 mM 아세토니트릴 중에서 희석시켰다. 이어서, 가용성 용해물 샘플의 경우와 동일한 방법을 이용하여 샘플을 여과하고, 분석하였다.
결과
pS1130 단일 프로모터 시스템 또는 pxCD18-7T3 이중 프로모터 시스템을 사용하여 일련의 항-CD18 F(ab')2 발효 런을 수행하였다. 조립된 항-CD18 F(ab')2 복합체의 수율은 상기 재료 및 방법 부분에 기술된 단백질 분석을 이용하여 측정 및 계산하였다. 발효 수율 (g/L)을 나타내는 막대 그래프인 도 4에 나타낸 바와 같이, 균주 59A7에서 phoA-tac 이중 프로모터 벡터를 사용하여, 조립된 F(ab')2의 수율을 최적 pS1130/59A7 형질전환체에 대한 약 2.5 g/L로부터 약 4.6 ±0.5 g/L로 거의 2배 향상시켰다.
이중 프로모터 시스템의 향상된 특성을 추가로 설명하기 위해, 전체 중쇄, 가용성 경쇄 및 조립된 F(ab')2 복합체의 발현 프로필을 단일 프로모터 시스템 (pS1130/59A7) 및 이중 프로모터 시스템 (pxCD18-7T3/59A7)에 대하여 확립하였으며, 결과는 각각 도 5 및 6에 나타나 있다. 유의하게, 경쇄가 먼저 발현되어 원형질막주변 공간으로 분비된 다음, 중쇄가 장기간 생산되는 이중 프로모터 시스템에서 F(ab')2 조립은 중쇄 발현이 유도된 거의 직후에 일어났지만 (도 6), 단일 프로 모터 시스템에서 경쇄 및 중쇄가 둘 다 유도된 다음의 초기 F(ab')2 조립은 상대적으로 불량하였다 (도 5). 한가지 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 결과는 유의한 수준의 가용성 경쇄가 원형질막주변 공간에 축적될 때까지는 F(ab')2 조립이 비효율적임을 시사한다.
2가지 시스템을, F(ab')2 복합체 중 중쇄 대 합성된 중쇄의 총량의 비율로서 정의되는 이들의 조립 효율에 대하여 추가로 비교하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 이중 프로모터 시스템은 특히 중쇄 합성의 초기 기간 (처음 10시간) 동안 종래의 단일 프로모터 시스템에 비해 증가된 조립 효율을 제공한다. 이러한 두 시스템에 대한 중쇄 발현 수준의 비교는 이중 프로모터 시스템의 사용이, 도 7에서 입증된 바와 같이, 합성된 중쇄의 총량을 증가시켰음을 보여준다.
따라서, 상기 결과는 경쇄 및 중쇄 합성을 일시적으로 분리함으로써 조립된 항-CD18 F(ab')2가 상당히 증가된 수율로 얻어졌음을 보여준다. 이러한 신규 시스템 및 관찰 결과는 여러 단백질 단위가 발현되고 조립되는 다른 시스템에서 다양한 용도를 갖는다.
실시예 2. 항-조직 인자 IgG1의 제조
이 실시예는 이. 콜라이 시스템에서 전장 항체를 제조하는 지속적인 노력을 나타낸다. 강력한 TIR을 사용하여 경쇄 및 전장 중쇄를 동시에 공동 발현시킨 경우, 발현된 전구체 폴리펩티드가 상당량 축적되어 성숙한 경쇄와 중쇄 및 적절하게 조립된 전장 항체의 양이 줄어든다. 이 실시예는 이러한 전구체의 축적이 경쇄 및 중쇄의 발현을 일시적으로 분리함으로써 극복될 수 있음을 보여준다. 각 쇄를 상이한 프로모터의 조절하에 놓으면 각 쇄가 서로 다른 시기에 발현됨으로써 분비성 차단을 막을 수 있다. 이러한 방법은 동시적인 발현에서 사용될 수 있는 것보다 더 강력한 TIR을 사용함으로써 잠재적으로는 각 쇄를 더 높은 수준으로 분비할 수 있게 된다. 각 쇄를 더 높은 수준으로 발현하는 이러한 발현 구성은 적절하게 조립된 전장 항체의 수율을 향상시키는 이점이 있다.
재료 및 방법
플라스미드 작제
대조군 플라스미드인 paTF130에 대한 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 (1) phoA 프로모터 (Kikuchi et al., Nucleic Acids Res. 9(21):5671-5678 (1981)); (2) trp 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno)(Yanofsky et al., Nucleic Acids Res. 9:6647-6668 (1981)); (3) STII 신호 서열의 TIR 변이체 (TIR 상대적 강도 약 7) (Simmons and Yansura, Nature Biotechnology 14:629-634 (1996)); (4) 항-조직 인자 경쇄에 대한 코딩 서열; (5) λt0 터미네이터 (Scholtissek and Grosse, Nucleic Acids Res. 15:3185 (1987)); (6) 제2 phoA 프로모터; (7) 제2 trp 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno); (8) STII 신호 서열의 제2 사일런트 코돈 변이체 (TIR 상대적 강도 약 3); (9) 항-조직 인자의 전장 중쇄에 대한 코딩 서열; 및 (10) 제2 λt0 터미네이터를 포함한다. 이 발현 카세트를 이. 콜라이 플라스미드 pBR322의 프레임 워크에 클로닝하였다 [Sutcliffe (1978) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90]. 따라서, 상기 플라스미드에서 각 유전자를 그 자신의 phoA 프로모터의 조절하에 놓음으로써 경쇄가 중쇄와 독립적으로 전사되지만, 두 phoA 프로모터는 동일한 조건하에 유도될 수 있기 때문에 상기 두 쇄는 동시에 발현된다.
또는, pxTF-7T3FL의 벡터 설계는 2개의 동일한 프로모터 보다는 2가지 상이한 프로모터를 사용함으로써 각 쇄의 발현을 일시적으로 분리할 수 있다. 이 플라스미드에서, 경쇄는 phoA 프로모터의 조절하에 있다. 그러나, tacII 프로모터 (DeBoer, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983))는 중쇄의 전사를 조절하는 데 사용된다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, phoA 및 tacII 프로모터는 실질적으로 상이한 조건하에 유도된다. paTF130 및 pxTF-7T3FL의 개요도 비교는 도 8에 나타나 있다. pxTF-7T3FL의 핵산 서열 및 그가 코딩하는 폴리펩티드 서열은 각각 도 9 및 도 10에 제시되어 있다.
발현 유도, 샘플 제조 및 분석
각 작제물의 소규모 발현의 경우, 유전자형 (W3110 kan R △fhuA (△tonA) ptr3 phoA△E15 lacIq lacL8 ompT △(nmpc-fepE) deg P)을 갖는 이. 콜라이 균주 33D3을 숙주 세포로 사용하였다. 형질전환 후, 선별된 형질전환체 채집물 (pick)을 카르베니실린 (50 ㎍/ml)이 보충된 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) 배지 5 ml에 접종하고, 배양 휠 (wheel)에서 30 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 각 배양물을 C.R.A.P. 인산염-제한 배지 (3.57 g (NH4)2SO4, 0.71 g NaCitrate-2H 2O, 1.07 g KCl, 5.36 g 효모 추출물 (보증됨), 5.36 g HycaseSF-Sheffield, KOH를 사용하여 pH를 7.3으로 조정, SQ H2O를 적정량 가하여 872 ml로 만들고 고압증기멸균함; 55 ℃로 냉각시키고, 110 ml 1 M MOPS pH 7.3, 11 ml 50％ 글루코스, 7 ml 1 M MgSO4를 보충)내로 희석 (1:50)시켰다. 이어서, 카르베니실린을 유도 배양물에 50 ㎍/ml의 농도로 첨가하고, 달리 지시받지 않는다면, 모든 진탕 플라스크 유도를 2 ml 부피로 수행하였다.
유도 배지에 접종시킨 후, 사용된 프로모터 및 프로모터 유도 기간에 따라 각 샘플에 대하여 조건을 달리하였다. 경쇄 및 중쇄 유전자 모두의 전사를 조절하는 phoA 프로모터를 사용하는 벡터인 paTF130의 경우, 배양물에 다른 것을 첨가하지 않은채로 30 ℃에서 약 24시간 동안 진탕하여 유도를 행하였다. 이 샘플에서 포스페이트를 충분히 고갈시켜 경쇄 및 중쇄의 전사를 둘 다 조절하는 phoA 프로모터를 동시에 유도하였다. 경쇄의 발현을 조절하는 phoA 프로모터를 사용하지만 중쇄의 발현을 조절하는 tacII 프로모터도 사용하는 벡터인 pxTF-7T3FL의 경우, 먼저 paTF130에 대하여 사용된 것과 동일한 배양 조건에서 유도를 행하였다. 30 ℃에서 진탕하면서 약 16시간 후, 인산염 칼륨 완충액 (pH 7.4)을 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 약 45분 후, IPTG를 배양물에 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 tacII 프로모터를 유도하였다. 이어서, 30 ℃에서 진탕하면서 약 8시간 더 유도를 지속하였다. 따라서, paTF130 시스템은 경쇄 및 중쇄 둘 다의 전사가 동시에 유도되는 상황을 나타낸다. 한편, pxTF-7T3FL 시스템은 먼저 phoA 프로모터를 유도하고, 경쇄 전사를 조절한 다음, 이후 시점에서 tacII 프로모터를 유도하고, 중쇄 전사를 조절함으로써 각 쇄의 발현을 일시적으로 분리하도록 고안된 조건하에 배양하였다.
유도된 배양물로부터의 환원되지 않은 전체 세포 용해물을 다음과 같이 제조하였다: (1) 1 OD600 -ml 펠릿을 미세원심분리 튜브에서 원심분리함; (2) 각 펠릿을 90 ㎕ TE (10 mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA)에 재현탁시킴; (3) 100 mM 아이오도아세트산 (Sigma I-2512) 10 ㎕를 각 샘플에 첨가하여 임의의 유리 시스테인을 차단하고, 디술피드 셔플링 (shuffling)을 방지함; (4) 10％ SDS 20 ㎕를 각 샘플에 가함. 샘플을 볼텍싱 (vortexing)하고, 약 90 ℃로 약 3분간 가열한 다음, 다시 볼텍싱하였다. 샘플을 실온으로 냉각시킨 다음, 아세톤 약 750 ㎕를 가하여 단백질을 침전시켰다. 샘플을 볼텍싱하고, 실온에서 약 15분간 두었다. 미세원심분리기로 5분간 원심분리한 다음, 각 샘플의 상청액을 흡출해내고, 각 단백질 펠릿을 50 ㎕ dH20 + 50 ㎕ 2X NOVEX 샘플 완충액에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 약 90 ℃에서 3 내지 5분 동안 가열하고, 충분히 볼텍싱하고, 실온으로 냉각시켰다. 이후, 최종적으로 5분간 원심분리를 행하고, 상청액을 깨끗한 튜브에 옮겼다.
1 M DTT 10 ㎕를 단계 (2)의 세포 재현탁 용액에 가하고, IAA의 첨가를 단계 (3)에서 생략한 것을 제외하면 비-환원 샘플에 대하여 상기 기술된 것과 유사한 단계를 수행하여 환원된 샘플을 제조하였다. 또한, 단백질 침전물이 2×샘플 완충액 + dH2O 중에 재현탁되었을 때 환원제를 100 mM의 농도로 첨가하였다.
침전 후, 각 샘플 5 ㎕를 10웰, 1.0 mm NOVEX 제조된 12％ Tris-글리신 SDS- PAGE 상에 로딩하고, 약 120 볼트로 1.5 내지 2시간 동안 전기영동하였다. 생성된 겔을 이뮤노블롯 (immunoblot) 분석에서 사용하였다.
이뮤노블롯 분석의 경우, SDS-PAGE 겔을 니트로셀룰로스 막 (NOVEX) 상에 전기로 블롯팅하였다. 이어서, 실온에서 락킹 (rocking)하는 약 30분 내지 1시간 동안 1X NET (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.4, 0.05％ 트리톤 (Triton) X-100) + 0.5％ 젤라틴의 용액을 사용하여 막을 차단하였다. 차단 단계 후, 막을 비-환원 샘플의 경우 1X NET + 0.5％ 젤라틴 + 항-Fab 항체 (퍼옥시다제-연결된 염소 IgG 비율 대 인간 IgG Fab; CAPPEL #55223)의 용액 또는 환원 샘플의 경우 1X NET + 0.5％ 젤라틴 + 항-Fab 항체 + 항-Fc 항체 (Jackson Immuno Research Labs #109-035-008)의 용액에 놓았다. 항-Fab 항체 희석액은 항체의 로트 (lot)에 따라 1:50,000 내지 1:1,000,000의 범위였으며, 항-Fc 항체를 1:1,000,000으로 희석시켰다. 막을 실온에서 락킹하면서 밤새 항체 용액 중에 놓아두었다. 다음날 아침, 막을 1X NET + 0.5％ 젤라틴 중에서 최소한 10분 동안 3회 세척한 다음, TBS (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl) 중에서 15분 동안 1회 세척하였다. 항체에 의해 결합된 단백질 밴드를 아머샴 파마시아 바이오텍 (Amersham Pharmacia Biotech) ECL 검출기를 이용하고, 막을 엑스선 필름에 노출시킴으로써 시각화하였다.
결과
항-조직 인자 IgG1의 제조를 위한 플라스미드인 paTF130 및 pxTF-7T3FL을 작제하고, 균주 33D3을 형질전환시키고, 상기 기술한 바와 같이 유도하였다. 이후, 비-환원 및 환원된 전체 세포 용해물 샘플을 제조하고, 이뮤노블롯에 의해 분석하 였다. 결과는 도 11A 및 도 11B에 나타나 있다. 경쇄에 대한 7개의 TIR 및 중쇄에 대한 3개의 TIR을 사용하여 상기 유전자를 조절하는 프로모터를 동시에 유도하자 paTF130에 대한 환원 샘플에 의해 입증된 바와 같이 분비 블록이 나타났다 (도 11A). 중쇄 및 경쇄 전구체 둘 다의 축적은 이 레인에서 뚜렷하게 분명하였다. 성숙한 경쇄 및 성숙한 중쇄가 매우 적게 검출되었으며, 단백질의 대부분은 전구체로서 축적되었다. 그러나, pxTF-7T3FL에서와 같이 중쇄 및 경쇄의 발현이 일시적으로 분리된 경우, 상당량의 성숙한 경쇄가 축적되었다 (도 11A). 소량의 경쇄 전구체가 상기 샘플에서 여전히 검출되었지만, 이 수준은 경쇄 또는 중쇄의 분비에 대한 문제를 일으키는 것으로 보이지 않는다. 또한, 일시적인 발현으로 성숙한 중쇄가 paTF130에서 얻어진 것보다 상당히 더 높은 수준으로 효과적으로 분비되었으며, 전구체 축적의 증거는 없었다.
전장 항체의 효율적인 분비와 조립의 상관관계가 비-환원 샘플에 의해 나타났다 (도 11B). 전장 항체는 두 샘플에서 검출되었지만, 양은 크게 달랐다. 화살표가 나타내는 바와 같이, 희미한 전장 밴드만이 paTF130 샘플에서 검출되었다. 이 밴드는 pxTF-7T3FL 샘플에서 훨씬 더 분명해졌다.
실시예 3. 항-조직 인자 F(ab') 2 의 제조
이 실시예에서, 단일 프로모터 플라스미드인 pCYC56을 대조군으로 사용하였다. pCYC56은 삽입체 서열이 항-조직 인자 항체의 경쇄 및 중쇄 단편을 코딩한다 는 것을 제외하면 pS1130과 구조적으로 유사하다. 이중 프로모터 플라스미드인 pxTF-7T3을 실시예 1의 이중 프로모터 플라스미드인 pxCD18-7T3과 유사하게 생성하였으며, 이를 사용하여 항-조직 인자 경쇄 및 중쇄의 발현을 일시적으로 분리할 수 있었다. 또한, 플라스미드 pMS421로부터의 lacI 서열을 pxTF-7T3에 포함시켜 신규한 이중 프로모터 pJVG3IL을 생성시켰다. lacI를 부가하여 pMS421과의 공동 발현에 대한 필요성을 방지하였다.
이 발효에서 사용된 숙주 균주는 60H4로 명명되는 이. 콜라이 W3110 유도체였다. 60H4의 완전한 유전자형은 W3110 △fhuA△manA phoA△E15 △(argF-lac)169 deoC2 degP41(△pstI-Kan r ) IN(rrnD-rrnE) 1 ilvG2096(Val r ) △prc prc-서프레서였다. 60H4 숙주 세포를 pCYC56, pJVG3IL, 또는 pxTF-7T3과 pMS421의 조합으로 형질전환시키고, 성공적인 형질전환체를 선별하여 배양하였다.
런 길이가 약 72시간 내지 114시간인 점을 원칙적으로 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 항-CD18 F(ab')2에 대한 조건과 유사한 조건하에 발효를 수행하였으며, 배양물의 OD550이 220이 된 다음 약 4시간 내지 12시간 동안 IPTG를 사용하여 중쇄를 유도하였다.
또한, 항-조직 인자 F(ab')2 표준물을 사용하여 표준 그래프를 생성시킨 것을 제외하면, 항-CD18 F(ab')2에 대하여 사용된 단백질 G 분석을 이용하여 항-조직 인자 F(ab')2 생성물을 분석하였다.
상기 기술된 프로모터 시스템을 사용하여 일련의 항-조직 인자 F(ab')2 발효 런을 수행하였다. pJVG3IL를 포함하는 이중 프로모터 시스템을 사용하여, 조립된 항-조직 인자 F(ab')2 복합체의 수율을 단일 프로모터 시스템의 1 g/L로부터 2.6 ±0.3 g/L (n=13)로 증가시켰다.
따라서, 이러한 결과는 경쇄 및 중쇄의 합성을 일시적으로 분리함으로써 조립된 항-조직 인자 F(ab')2를 상당히 증가된 수율로 수득하였음을 보여준다.
상기 내용은 본 발명의 특정 실시양태를 언급한 것이지만, 본 발명이 이로서 한정되는 것으로 이해해서는 안된다. 당업자라면 본 발명의 전체적인 개념을 벗어남이 없이 개시된 실시양태를 다양하게 변형시킬 수 있을 것이다. 이러한 모든 변형은 본 발명의 범위내인 것으로 의도된다.



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Asn Phe Tyr Pro Arg 155 160 165 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 170 175 180 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 185 190 195 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 200 205 210 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 215 220 225 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 230 235 <210> 2 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 35 40 45 Ala Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Met 50 55 60 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Asn 65 70 75 Pro Lys Asn Gly Gly Thr Ser His Asn Gln Arg Phe Met Asp Arg 80 85 90 Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gln 95 100 105 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 110 115 120 Arg Trp Arg Gly Leu Asn Tyr Gly Phe Asp Val Arg Tyr Phe Asp 125 130 135 Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 140 145 150 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 155 160 165 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 170 175 180 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 185 190 195 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 200 205 210 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 215 220 225 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 230 235 240 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 245 250 255 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Arg Met Lys 260 265 270 Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His 275 280 285 Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 290 295 300 <210> 3 <211> 2700 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 gaattcaact tctccatact ttggataagg aaatacagac atgaaaaatc 50 tcattgctga gttgttattt aagcttgccc aaaaagaaga agagtcgaat 100 gaactgtgtg cgcaggtaga agctttggag attatcgtca ctgcaatgct 150 tcgcaatatg gcgcaaaatg accaacagcg gttgattgat caggtagagg 200 gggcgctgta cgaggtaaag cccgatgcca gcattcctga cgacgatacg 250 gagctgctgc gcgattacgt aaagaagtta ttgaagcatc ctcgtcagta 300 aaaagttaat cttttcaaca gctgtcataa agttgtcacg gccgagactt 350 atagtcgctt tgtttttatt ttttaatgta tttgtaacta gtacgcaagt 400 tcacgtaaaa agggtatcta gaattatgaa aaagaatatc gcatttcttc 450 ttgcatctat gttcgttttt tctattgcta caaacgcgta cgctgatatc 500 cagatgaccc agtccccgag ctccctgtcc gcctctgtgg gcgatagggt 550 caccatcacc tgtcgtgcca gtcaggacat caacaattat ctgaactggt 600 atcaacagaa accaggaaaa gctccgaaac tactgattta ctatacctcc 650 accctccact ctggagtccc ttctcgcttc tctggttctg gttctgggac 700 ggattacact ctgaccatca gcagtctgca accggaggac ttcgcaactt 750 attactgtca gcaaggtaat actctgccgc cgacgttcgg acagggcacg 800 aaggtggaga tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc 850 gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc 900 tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 950 gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa 1000 ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact 1050 acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 1100 tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttaat taaatcctct 1150 acgccggacg catcgtggcg agctcggtac ccggggatct aggcctaacg 1200 ctcggttgcc gccgggcgtt ttttattgtt gccgacgcgc atctcgactg 1250 cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta 1300 tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca 1350 ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca 1400 aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agtttaatgt 1450 gtggaattgt gagcggataa caattaagct taggatctag aattatgaag 1500 aagaatattg cgttcctact tgcctctatg tttgtctttt ctatagctac 1550 aaacgcgtac gctgaggttc agctggtgga gtctggcggt ggcctggtgc 1600 agccaggggg ctcactccgt ttgtcctgtg caacttctgg ctacaccttt 1650 accgaataca ctatgcactg gatgcgtcag gccccgggta agggcctgga 1700 atgggttgca gggattaatc ctaaaaacgg tggtaccagc cacaaccaga 1750 ggttcatgga ccgtttcact ataagcgtag ataaatccac cagtacagcc 1800 tacatgcaaa tgaacagcct gcgtgctgag gacactgccg tctattattg 1850 tgctagatgg cgaggcctga actacggctt tgacgtccgt tattttgacg 1900 tctggggtca aggaaccctg gtcaccgtct cctcggcctc caccaagggc 1950 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac 2000 agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg 2050 tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 2100 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc 2150 ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc 2200 ccagcaacac caaggtcgac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 2250 actcacacat gcccgccgtg cccagcacca gaactgctgg gcggccgcat 2300 gaaacagcta gaggacaagg tcgaagagct actctccaag aactaccacc 2350 tagagaatga agtggcaaga ctcaaaaagc ttgtcgggga gcgctaagca 2400 tgcgacggcc ctagagtccc taacgctcgg ttgccgccgg gcgtttttta 2450 ttgttaactc atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt aatgcggtag 2500 tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca ggcaccgtgt atgaaatcta 2550 acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc 2600 ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca 2650 ttccgacagc atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt 2700 <210> 4 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 20 25 30 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 35 40 45 Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 50 55 60 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr 65 70 75 Ser Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 80 85 90 Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 95 100 105 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp Thr 110 115 120 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 125 130 135 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 140 145 150 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 155 160 165 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 170 175 180 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 185 190 195 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 200 205 210 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 215 220 225 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 230 235 <210> 5 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 35 40 45 Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Glu Tyr Tyr Met His Trp Val 50 55 60 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Leu Ile Asp 65 70 75 Pro Glu Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Asp Arg 80 85 90 Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 95 100 105 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 110 115 120 Arg Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 125 130 135 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 140 145 150 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 155 160 165 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 170 175 180 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 185 190 195 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 200 205 210 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 215 220 225 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 320 325 330 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 335 340 345 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 350 355 360 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 365 370 375 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 380 385 390 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 395 400 405 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 410 415 420 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 425 430 435 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 440 445 450 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 455 460 465 Leu Ser Pro Gly Lys 470 <210> 6 <211> 3100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 gaattcaact tctccatact ttggataagg aaatacagac atgaaaaatc 50 tcattgctga gttgttattt aagcttgccc aaaaagaaga agagtcgaat 100 gaactgtgtg cgcaggtaga agctttggag attatcgtca ctgcaatgct 150 tcgcaatatg gcgcaaaatg accaacagcg gttgattgat caggtagagg 200 gggcgctgta cgaggtaaag cccgatgcca gcattcctga cgacgatacg 250 gagctgctgc gcgattacgt aaagaagtta ttgaagcatc ctcgtcagta 300 aaaagttaat cttttcaaca gctgtcataa agttgtcacg gccgagactt 350 atagtcgctt tgtttttatt ttttaatgta tttgtaacta gtacgcaagt 400 tcacgtaaaa agggtatcta gaattatgaa aaagaatatc gcatttcttc 450 ttgcatctat gttcgttttt tctattgcta caaacgcgta cgctgatatc 500 cagatgaccc agtccccgag ctccctgtcc gcctctgtgg gcgatagggt 550 caccatcacc tgcagagcca gtcgcgacat caagagctat ctgaactggt 600 atcaacagaa accaggaaaa gctccgaaag tactgattta ctatgctact 650 agtctcgctg aaggagtccc ttctcgcttc tctggatccg gttctgggac 700 ggattacact ctgaccatca gcagtctgca gccagaagac ttcgcaactt 750 attactgtct tcagcacgga gagtctccat ggacatttgg acagggtacc 800 aaggtggaga tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc 850 gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcttctgtt gtgtgcctgc 900 tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 950 gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa 1000 ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact 1050 acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 1100 tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttaat taaatcctct 1150 acgccggacg catcgtggcg agctcggtac ccggggatct aggcctaacg 1200 ctcggttgcc gccgggcgtt ttttattgtt gccgacgcgc atctcgactg 1250 cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta 1300 tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca 1350 ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca 1400 aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agtttaatgt 1450 gtggaattgt gagcggataa caattaagct taggatctag aattatgaag 1500 aagaatattg cgttcctact tgcctctatg tttgtctttt ctatagctac 1550 aaacgcgtac gctgaggttc agctggtgga gtctggcggt ggcctggtgc 1600 agccaggggg ctcactccgt ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaatatt 1650 aaggagtact acatgcactg ggtccgtcag gccccgggta agggcctgga 1700 atgggttgga ttgattgatc cagagcaagg caacacgatc tatgacccga 1750 agttccagga ccgtgccact ataagcgctg acaattccaa aaacacagca 1800 tacctgcaga tgaacagcct gcgtgctgag gacactgccg tctattattg 1850 tgctcgagac acggccgctt acttcgacta ctggggtcaa ggaaccctgg 1900 tcaccgtctc ctcggcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca 1950 ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt 2000 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc 2050 tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 2100 tactccctca gcagcgtggt gactgtgccc tctagcagct tgggcaccca 2150 gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca 2200 agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 2250 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa 2300 acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg 2350 tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 2400 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta 2450 caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 2500 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 2550 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc 2600 acaggtgtac accctgcccc catcccggga agagatgacc aagaaccagg 2650 tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 2700 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc 2750 cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 2800 acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2850 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 2900 taaataagca tgcgacggcc ctagagtccc taacgctcgg ttgccgccgg 2950 gcgtttttta ttgttaactc atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt 3000 aatgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca ggcaccgtgt 3050 atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga 3100

Claims (57)

  1. (a) 기능성 항체 또는 그의 단편의 경쇄 및 중쇄를 각각 코딩하며 상이한 프로모터에 의해 조절되는 2개의 별도의 번역 단위로 형질전환된 숙주 세포를, 상기 경쇄 및 중쇄가 연속 방식으로 발현되도록 적합한 조건하에 배양함으로써 경쇄 및 중쇄의 생산을 일시적으로 분리하는 단계, 및
    (b) 상기 경쇄 및 중쇄가 조립되어 상기 기능성 항체 또는 그의 단편이 형성되도록 하는 단계
    를 포함하는, 상기 숙주 세포에서 기능성 항체 또는 그의 단편을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 원핵 세포이며, 각 번역 단위가 경쇄 또는 중쇄의 N'-말단에 작동가능하게 연결되는 원핵 세포 분비 신호 또는 그의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 2개의 번역 단위가 단일 재조합 벡터상에 위치하는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 분비 신호가 STII, OmpA, PhoE, LamB, MBP 및 PhoA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 분비 신호가 STII인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 각 번역 단위에 대한 프로모터가 phoA, TacI, TacII, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp, trc 및 T7 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 하나의 프로모터가 phoA 프로모터이며, 다른 프로모터는 TacII 프로모터인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')2-루이신 지퍼, Fv 및 dsFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 항체가 VEGF, IgE, CD11, CD18 및 조직 인자 (TF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 대해 특이적인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항체가 항-CD18 항체 또는 항-TF 항체인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 숙주 세포가 이. 콜라이 (E. coli) 균주 유래의 원핵 세포인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 이. 콜라이 균주를 유전적으로 조작하여 DsbA, DsbC, DsbG 및 FkpA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 샤페론 (chaperone) 단백질을 과발현시키는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 이. 콜라이 균주가 내인성 프로테아제 활성에 결함이 있는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 이. 콜라이 균주의 유전자형이 △prc prc-서프레서 (suppressor)를 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 항체의 중쇄가 전장 (full length) 중쇄인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 경쇄가 먼저 발현된 다음, 전장 중쇄가 발현되는 것인 방법.
  21. 항체 또는 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 각각 코딩하며 상이한 프로모터에 작동가능하게 각각 연결된 2개의 별도의 번역 단위를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함하며, 적합한 조건하에 상기 2개의 번역 단위의 활성화가 일시적으로 분리됨으로써 경쇄 및 중쇄가 연속 발현될 수 있는 것인, 항체 또는 그의 단편의 경쇄 및 중쇄의 연속 발현을 위한 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 숙주 세포가 원핵 세포이며, 각 번역 단위가 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 핵산의 5'-말단에 작동가능하게 연결된 원핵 세포 분비 신호를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 시스템.
  23. 제22항에 있어서, 분비 신호가 STII, OmpA, PhoE, LamB, MBP 및 PhoA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  24. 제23항에 있어서, 분비 신호가 STII인 시스템.
  25. 제24항에 있어서, 2개의 STII 변이체를 2개의 번역 단위에서 각각 사용하여 약 (7-경쇄, 3-중쇄)의 번역 강도 조합을 제공하는 시스템.
  26. 제21항에 있어서, 각 번역 단위가 유도가능한 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 유도가능한 프로모터가 phoA, TacI, TacII, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp, trc 및 T7 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  28. 제27항에 있어서, 하나의 프로모터가 phoA 프로모터이며, 다른 프로모터는 TacII 프로모터인 시스템.
  29. 제21항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')2-루이신 지퍼, Fv 및 dsFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  30. 제21항에 있어서, 항체가 VEGF, IgE, CD11, CD18 및 조직 인자 (TF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 대해 특이적인 시스템.
  31. 제30항에 있어서, 항체가 항-CD18 항체 또는 항-조직 인자 항체인 시스템.
  32. 제21항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 시스템.
  33. 제21항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 시스템.
  34. 제21항에 있어서, 항체가 인간 항체인 시스템.
  35. 제21항 또는 제22항에 있어서, 숙주 세포가 이. 콜라이 균주 유래의 원핵 세포인 시스템.
  36. 제35항에 있어서, 이. 콜라이 균주가 유전적으로 조작되어 DsbA, DsbC, DsbG 및 FkpA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 샤페론 단백질을 과발현시키는 것인 시스템.
  37. 제35항에 있어서, 이. 콜라이 균주가 내인성 프로테아제 활성에 결함이 있는 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 이. 콜라이 균주의 유전자형이 △prc prc-서프레서를 포함하는 시스템.
  39. 제21항에 있어서, 항체의 중쇄가 전장 중쇄인 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 경쇄가 먼저 발현된 다음, 전장 중쇄가 발현되는 시스템.
  41. (a) 경쇄에 작동가능하게 연결되는 분비 신호를 코딩하는 제1 번역 단위의 앞쪽에 있는 제1 프로모터 및 (b) 중쇄에 작동가능하게 연결되는 분비 신호를 코딩하는 제2 번역 단위의 앞쪽에 있는 제2 프로모터를 포함하며, 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터가 상이한 조건하에 유도가능한 것인, 숙주 세포에서 기능성 항체 또는 그의 단편을 제조하기 위한 재조합 벡터.
  42. 제41항에 있어서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터가 phoA, TacI, TacII, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp, trc 및 T7 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 벡터.
  43. 제42항에 있어서, 제1 프로모터가 phoA 프로모터이며, 제2 프로모터는 TacII 프로모터인 재조합 벡터.
  44. 제41항에 있어서, 분비 신호가 STII, OmpA, PhoE, LamB, MBP 및 PhoA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 벡터.
  45. 제44항에 있어서, 분비 신호가 STII인 재조합 벡터.
  46. 제41항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 dsFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 벡터.
  47. 제46항에 있어서, 항체 단편이 이합체화 (dimerization) 도메인에 융합되는 것인 재조합 벡터.
  48. 제41항에 있어서, 항체가 VEGF, IgE, CD11, CD18 및 조직 인자 (TF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 대해 특이적인 재조합 벡터.
  49. 제48항에 있어서, 항체가 항-CD18 항체인 재조합 벡터.
  50. 제49항에 있어서, 항체가 항-CD18 F(ab')2-루이신 지퍼 융합체인 재조합 벡터.
  51. 제50항에 있어서, 상기 항체가 서열 1의 경쇄를 갖는 항체인 재조합 벡터.
  52. 제50항에 있어서, 상기 항체가 서열 2의 중쇄를 갖는 항체인 재조합 벡터.
  53. 제50항에 있어서, 서열 3의 핵산 서열을 포함하는 pxCD18-7T3 벡터인 재조합 벡터.
  54. 제48항에 있어서, 항체가 항-TF 항체인 재조합 벡터.
  55. 제54항에 있어서, 상기 항체가 서열 4의 경쇄를 갖는 항체인 재조합 벡터.
  56. 제54항에 있어서, 상기 항체가 서열 5의 중쇄를 갖는 항체인 재조합 벡터.
  57. 제54항에 있어서, 서열 6의 핵산 서열을 포함하는 pxTF-7T3FL 벡터인 재조합 벡터.
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