KR100964330B1 - 당흡수 조절제 및 당뇨병 또는 당뇨병 합병증의 치료방법 - Google Patents

당흡수 조절제 및 당뇨병 또는 당뇨병 합병증의 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당흡수 조절제(glucose uptake modulator), 이를 포함하는 약학적 조성물, 및 상기 조성물의 유효량을 포유류에 투여하여 포유류의 당뇨병 또는 당뇨병 합병증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

당흡수 조절제 및 당뇨병 또는 당뇨병 합병증의 치료방법{GLUCOSE UPTAKE MODULATOR AND METHOD FOR TREATING DIABETES OR DIABETIC COMPLICATIONS}
본 발명은 당흡수 조절제(glucose uptake modulator), 이를 포함하는 약학적 조성물, 및 상기 조성물의 유효량을 포유류에 투여하여 포유류의 당뇨병 또는 당뇨병 합병증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
인슐린에 함께, 다양한 호르몬 또는 생리학적 인자들은 당흡수를 촉진할 수 있다. 예를 들면, 운동은 인슐린에 독립적인 경로를 통하여 골격근에 당흡수를 유도하며, α1-아드레날린 또는 엔도셀린A 수용체 또한 인슐린과 독립적인 경로를 통하여 당흡수율을 증가시킨다. 이러한 물질대사반응에 관여하는 신호전달기작 중 일부는 인슐린의 것과 유사하나, 대부분은 인슐린의 것과 상이하다. 예를 들어, 퍼록시좀 증식체 활성화 수용체 γ 작용제(peroxisome proliferators activated receptor γ agonist)인, 아라키돈산(arachidonic acid)으로 처리된 지방세포(adipocyte)에서는 당흡수의 촉진이 발생하는데, 이는 특이적이며 인슐린과 독립 적인 신호전달기작과 관련되어 있다.
수년 동안 지방조직(adipose tissue)은 신체의 전반적 지질 및 에너지 항상성에 중요한 역할을 해왔다. 신체내의 순환으로부터 초과된 당의 제거를 통하여 지방조직 및 근육조직내로 당 수송이 촉진된다. 타입 2 당뇨병(type 2 diabete)에서 당내성(glucose intolerance)은 지방조직내로 당 수송이 원할하지 않아 나타난 것이라고 여겨지고 있다. 그러므로, 지방세포에서 당 수송을 조절하는 새로운 내재적 인자들을 찾는 것은 당뇨병의 발생과정을 보다 더 잘 이해하고, 개선된 치료전략을 통한 치료제를 개발하는데 필요하다.
호르몬, 신경전달물질, 및 사이토카인 등의 생체활성분자들은 생물체내의 많은 조절과정에서 중요한 역할을 수행하며, 세포간의 신호전달에 필수구성요소이며, 더욱이 인간의 질병을 진단 및 치료하는데 이용되고 있다. 새로운 생체활성분자들을 스크리닝하는 방법으로는, 일반적으로 연속 컬럼-크로마토그래피가 사용되고 있으나, 많은 컬럼 단계로 인해 불충분한 목적 분자들의 회수율이 낮다는 한계가 있었다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 본 발명에 앞서 다양한 내재적 리간드들을 스크리닝할 수 있는 새로운 통합 방법인, 리간드 검출 및 동정(Profiling and Identification, LPI)법을 개발하였다. 평행 컬럼 크로마토그래피 및 고감도 MS 분석 방법을 기초로 한 이러한 방법은, 신속하면서도 동시에 불충분한 생체활성분자들을 스크리닝하는데 적합하다. 최근에는, 상기 생체활성분자들을 효율적으로 정제하기 위하여, 프로테아제 필터링 공정을 추가하여 상기 LPI 기 술을 발전시켰다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 체계적이며 고감도의 분석기술이 조직 또는 체액내의 신규한 생체활성분자들을 스크리닝하는데 효과적으로 사용될 수 있다고 생각하였다.
이러한 분석기술은 선행문헌에 참조로서 포함되어 있으므로 본 명세서에서는 구체적으로 언급하거나, 식욕 억제제와 인슐린 민감화제를 결합시켜 결합에 따른 효능에 대해서는 언급하지 않았다. 부작용이 없으며 우수한 당뇨병 치료효과를 가진 약으로서 충분히 개량된 우수한 약을 개발하는 것은 바람직하다.
<발명의 요약>
본 발명에서는 혈청으로부터 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진하는 새로운 리간드를 스크리닝하였고, 당흡수를 촉진하는 신규한 리간드인 리소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine, LPC)을 검출하였다. 본 발명에서는 또한 상기 LPC가 지방세포의 당흡수를 촉진시켜 당뇨병 마우스 모델의 혈당 수치를 낮출 수 있음을 최초로 확인하였고, 더욱이 이러한 LPC의 물질대사조절에는 PKCδ의 활성이 필요함을 밝혔다.
본 발명의 일 측면에서, 주변의 유로코르틴(urocortin, UCN)의 역할에 대해서는 당 항상성에서 조사되었다. UCN은 인간 인슐린 수용체가 과발현된 Rat-1 세포(hIRcB 세포) 및 C2C12 섬유아세포에서 인슐린에 의해 유도된 IR의 인산화 및 이후 세포내 신호전달을 촉진시켰다. 더욱이, 본 발명의 생체외(in vitro) 실험결과와 마찬가지로, UCN을 STZ 마우스의 꼬리정맥내로 투여할 경우 인슐린에 의하여 유 도된 혈당 수치의 감소가 촉진되었다. 따라서, 본 발명에서는 내재적 펩타이드를 스크링하여 인슐린 민감화제(sensitizer)를 검출하였다.
본 발명의 목적은 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC), 리소포스파티딜세린(lysophosphatidylserine, LPS), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid, LPA), 및 유로코르틴(urocortin, UCN)으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 화합물을 포함하는 당흡수 촉진제를 제공하는 것이다. 상기 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜세린, 및 리소포스파티딘산은 인슐린 없이도 당흡수를 촉진시키며, 유로코르틴은 당 항상성 조절에서 인슐린의 활성을 위한 보조제로서 작용한다.
상기 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine)은 Akt 인산화에 어떠한 영향도 미치지 않으며, 리소포스파티딜의 아실기는 14개 내지 16개의 탄소수를 가진다. 미리스토일(myristoyl) LPC와 팔미토일(palmytoyl) LPC는 당흡수를 촉진시키나, 반면 스테아로일(stearoyl) LPC는 여러 개의 리소포스포리피드(lysophospholipid)가 처리된 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진시키지 않았다. 팔미토일 리소포스파티딜에탄올아민(palmytoyl lysophosphatidylethanolamine, LPE), 팔미토일 리소포스파티딜글리세롤(palmytoyl lysophosphatidylglycerol,LPG) 및 팔미토일 리소포스파티딜이노시톨(palmytoyl lysophosphatidylinositol, LPI)은 모두 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진시키지 않았는데, 이는 LPC의 헤드기(head group)가 3T3-L1 지방세포에서 LPC에 의한 당흡수의 촉진과 관련된 구조적 선택성에 영향을 준 것이라고 여겨진다.
Figure 112008000802260-pct00001
본 발명의 또 다른 목적은 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 리소포스파티딜세린(lysophosphatidylserine), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 및 유로코르틴(urocortin)으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 약학적 조성물은 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하며, 인슐린 분비 강화제, 바이구아나이드제(biguanide), 및 α-글루코시다제 억제제로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 화합물을 더욱 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유로코르틴과 인슐린을 혼합한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 리소포스파티딜세린(lysophosphatidylserine), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 및 유로코르틴(urocortin)으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 인슐린 민감화제의 유효량을 포유류에 투여하여 포유류의 당뇨병 또는 당뇨병 합병증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 당뇨병 합병증은 비만(obesity), 고지혈증(hyperlipidemia), 동맥경화증(arteriosclerosis), 고혈압(hypertension) 또는 심장병(heart disease)이다. 상기 방법은 인슐린 분비 강화제, 바이구아나이드제(biguanide), 및 α-글루코시다제 억제제로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 화합물을 혼합하여 제조된 인슐린 민감화제의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1A 내지 1E는 혈청으로부터 신규한 당흡수 촉진제를 동정한 것을 나타낸 것이다.
도 2A 내지 2D는 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진하는 LPC의 효능을 나타낸 것이다.
도 3A 및 3B는 3T3-L1 지방세포에서 GLUT4의 전좌(translocation)를 촉진하는 LPC를 나타낸 것이다.
도 4A 및 4B는 PKCδ를 활성화시켜 당흡수를 촉진하는 LPC를 나타낸 것이다.
도 5A 내지 5E는 정상 마우스와 타입 I 및 타입 II 당뇨병 마우스 모델에서 각각 꼬리정맥내로 투여된 LPC의 항-당뇨 효과를 나타낸 것이다.
도 6A는 3T3-L1 지방세포에서 특이적으로 당흡수를 촉진하는 LPS를 나타낸 것이고, 도 6B는 3T3-L1 지방세포에서 농도에 따른 당흡수를 촉진하는 LPS를 나타낸 것이다.
도 7A 내지 7D는 정상 마우스 및 타입 I 당뇨병 마우스 모델에서 혈당 수치를 낮추는 LPC를 나타낸 것이다.
도 8A 및 8B는 3T3-L1 지방세포에서 농도 및 시간에 따른 당흡수를 촉진하는 LPA를 나타낸 것이다.
도 9A 및 9B는 3T3-L1 지방세포에서 LPA 수용체 및 Gαi를 활성화시켜 당흡수를 촉진하는 LPA를 나타낸 것이다.
도 10A 및 10B는 3T3-L1 지방세포에서 PI3-키나아제 의존형 신호전달경로를 통하여 당흡수를 촉진하는 LPA를 나타낸 것이다.
도 11A 내지 11D는 정상 마우스에서 LPA 수용체를 활성화시켜 혈당 수치를 낮추는 LPA를 나타낸 것이다.
도 12A 내지 12D는 hIRcB 세포에서 IR 자가인산화(autophophorylation)에 대한 UCN의 효능을 나타낸 것이다.
도 13A 및 13B는 C2C12 섬유아세포에서 IR 인산화 및 당흡수에 대한 UCN의 효능을 나타낸 것이다.
도 14A 및 14B는 정상 마우스 및 STZ 마우스 혈당 조절에 대한 UCN의 효능을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
본 명세서에서 당흡수 조절제란 인슐린에 대한 조직반응을 증가시켜 혈당 수치를 낮추는 물질을 의미한다.
인슐린 내성 고혈압(insulin resistant hypertension)에 민감한 환자들이란 인슐린에 내성을 나타내어 고혈압에 걸리기 쉬운 환자들을 의미하며, 이러한 환자들은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 의사에게 잘 알려지고 쉽게 판단된다. 치료란 인슐린 내성 및/또는 고순환 인슐린 수치에 의해 초래된 혈압을 낮추는 것을 의미하며, 예방이란 질병의 심각성에 따라, 인슐린 내성 환자에서 나타나는 고혈압을 나타나지 않게 하는 것을 의미한다.
"단위 투여량"이란 의학적 또는 수의학적 용도로 투여하기 위하여 적절한 형태로 당흡수 조절제를 분리한 양을 의미한다. 따라서, 실제 단위 투여량은, 예를 들어, 항-당뇨병 치료제 사용 후 초래된 비만을 예방 또는 치료하는 특정 용도로 사용되는 당흡수 조절제의 정량을 포함하는 하나의 단위, 또는 이의 전체 양을 의미한다. 약제학을 전공한 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하듯이, 당흡수 조절제는 종래의 단위 투여량으로 공식화될 수 있다. 이러한 단위 투여량은 다양한 제형, 예를 들어, 타블릿(tablet), 경질 젤라틴 캡슐(hard gelatin capsule), 포일 패킷(foil packet), 및 유리 앰플(glass ampule) 등으로 제조될 수 있다. 유사하게, 상기 단위 투여량은 약품 점적기(medicine dropper) 또는 펌프 스프레이(pump spray)로 전달될 수 있다. 그런 다음, 상기 다양한 단위 투여량은 약학적으로 허용가능한 다양한 형태의 액상물로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 예를 들면, 일정량의 포일 패킷을 물에 녹여 구강투여할 수 있고, 일정량의 유리 앰플을 투여할 수 있다. 유사하게, 약품 점적기 또는 펌프 스프레이와 같은 불연속적인 양의 제형은 물에 용해될 수 있다.
"포유동물"이란 젖샘에서 분비되는 우유로 새끼를 기르고, 통상적으로 피부가 털로 어느 정도 덮여 있는 사람과 이외 다른 모든 동물을 포함하는 고등척추동물의 한 부류(포유류)를 의미한다. 특히, 이러한 정의에 포함되는 사람은 인내심, 정력 또는 운동능력이 포유류 중 최적의 상태는 아니다. 이러한 사람 및 사람을 제외한 동물은 해당 기술분야의 의사 또는 수의사에 의해 쉽게 진단될 수 있다.
당 항상성(glucose homeostasis)은 간의 당생산과 세포의 당흡수의 멋진 조화를 통하여 유지되며, 만약 우리 몸에서 당 항상성이 유지되지 않는다면, 우리 몸은 고혈당증(hyperglycemia) 또는 다양한 대사적 불균형 상태가 될 수 있다. 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진하는 새로운 인자를 스크링하는데 있어서, 본 발명자들은 체계적인 평행 컬럼 크로마토그래피, 프로테아제 필터링, 고감도 MS 분석 및 동정된 LPC를 기초로 한 새로운 통합 방법을 이용하였다.
본 발명자들은 LPC가 농도 및 시간에 따라 당흡수를 촉진한다는 사실을 밝혀냈다. LPC 처리에 따른 당흡수의 촉진은 아실기의 길이 변화 및 LPC의 극성 헤드기 차이에 민감하게 반응한다. 3T3-L1 지방세포에 LPC를 처리할 경우 세포막에서의 GLUT4 수치는 현저하게 증가되고, 당흡수에 대한 LPC의 이러한 효능은 PKCδ 억제제인 로틀레린, 및 우성 음성적 PKCδ의 발현에 의해 저해된다. 또한, LPC를 마우스에 투여할 경우 혈당 수치는 현저하게 감소되며, 특히 타입 I 당뇨병(인슐린-의존성 당뇨병) 및 타입 II 당뇨병(인슐린-비의존성 당뇨병)의 마우스 모델에서 혈당 수치가 개선되었다. 이러한 결과는 LPC가 당 항상성 및 당뇨병의 치료 인자로서 새롭게 제시될 수 있음을 의미한다.
리소포스포리피드(lysophospholipid)는 세포증식, 종양세포의 침윤, 및 염증을 포함한 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 포스포리파아제 A2(PLA2)의 활성에 의해 생산된 LPC는 막 지질의 주요 구성성분이며, 지방산과 콜린을 조직내로 수송한다. 또한, LPC는 당 항상성 조절과 밀접하게 관련되어 있다고 알려져 있다. 최근에는, LPC가 췌장세포에서 당 의존성 인슐린의 분비를 촉진한다는 보고가 있다. 지금까지 보고된 LPC의 생리학적 활성 중 하나는 췌장세포로부터 인슐린의 분비를 유도하는 것이다. 최근에, Takatoshi et al은 LPC에 대한 신규한 Gs-단백질 결합 수용체로서, 고아 G-단백질 결합 수용체인 GPR 119를 동정하였다. 상기 GPR 119는 췌장세포에서 현저하게 발현되며, LPC에 의해 활성화되어 당-의존성 인슐린의 분비를 유도한다.
LPA는 특이적인 G-단백질 결합 수용체를 경유하는 수많은 세포상의 이벤트를 조절한다고 알려져 있는 강력하고 다면적인 생체활성 인지질이다. LPA는 혈소판 응집(platelet aggregation), 액틴 세포골격 활성(actin cytoskeleton activation), 섬유아세포 증식(fibroblast proliferation), 및 신경돌기 수축(neurite retraction)을 조절할 수 있다. LPA는 2가지의 주된 경로를 통하여 세포외에서 생산되는 것으로 여겨지고 있다. 첫번째 경로로서, LPA는 활성화된 혈소판에 의해 방출되며, 두번째 경로로서, 상기 LPA는 오토톡신(lyso-PLD)에 의해 리소포스포리피드로부터 생산된다. 최근에, LPA는 오토톡신의 분비에 의해 지방세포의 세포외 배양액에서 생산된다고 보고되었다. 따라서, LPA는 전반적인 에너지 균형을 조절하는데 중요한 역할을 하는 지방조직의 발달을 조절하는데 관여할 수 있다.
생체활성 리소포스포리피드 중 하나로서, 리소포스파티딜세린(lysophosphatidylserine, LPS)은 면역조절과 관련되어 있다고 여겨지고 있다. 그러나, 세포활성에 대한 LPS의 효능 및 LPS의 표적 분자의 동정에 대해서는 명확하게 조사된 바가 없다. LPS는 또한 난소암 환자의 복수에서 발견되며, 난소암 및 유방암 세포주에서 세포내 칼슘 농도를 일시적으로 증가시킨다는 보고가 있다. LPS는 또한 Jurkat T 세포에서 인터루킨-2의 생산을 촉진하며, 더욱이 신경촉진인자(nerve growth factor)로 유도된 랫트의 비만세포에서의 히스타민 방출과, 신경촉진인자로 유도된 PC12 세포의 분화를 촉진한다. 이처럼 몇몇 생물학적 반응을 조절하는 LPS의 기능에 대해서는 제한적으로 연구되어져 왔기 때문에, 다양한 세포활성에 대한 LPS의 기능 및 그의 활성 기작에 대하여 조사되어야 한다.
본 발명은 당 항상성을 조절하는 인슐린의 활성을 위한 보조인자로서 유로코르틴(UCN)의 신규한 기능을 조사하였다. UCN은 혈당 강화제로서 잘 알려져 있으나, UCN이 인슐린 수용체(IR)가 과발현된 hIRcB 세포 및 C2C12 섬유아세포에서 인슐린 수용체(insulin receptor, IR), 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrate, IRS) 및 단백질 키나아제 B(protein kinase B, AKT)와 같은 인슐린에 의해 유도된 신호전달분자들의 활성을 촉진할 수 있다는 것에 대해서는 알려진 바가 없으므로, 이에 대하여 조사하였다. 흥미롭게도, 생체내(in vivo)에서 유로코르틴의 효능은 혈당 수치를 조절하는데 있어서 그 투여량과 차이가 있었다. 즉, 유로코르틴을 낮은 농도(0.1 pM)로 투여할 경우, 유로코르틴은 혈당 수치를 낮추어 마우스의 골격근에서 인슐린 수용체(IR)의 인산화를 증가시켰다. 결론적으로, 본 발명자들은 인슐린에 대한 민감성을 강화시키는 유로코르틴의 생리적인 현상을 보여주면서, 이를 통해 유로코르틴이 당뇨병 치료의 표적으로서 유용하게 사용될 수 있음을 제시하고자 하였다.
유로코르틴(Urocortin, UCN)은 코르티코트로핀 방출 인자(corticotrophin release factor, CRF)류 중 하나로서 40개의 아미노산을 가진 펩타이드이며, 시상하부 뇌하수체 부신(hypothalamic-pituitary adrenal, HPA) 축 조절에 관여하는 주요 시상하부 인자로서 알려져 있다. UCN은 식욕을 억제하고, 카테콜아민성 시스템을 통한 체열발생, 및 공복 상태를 활성화하며, 그리고 다양한 동물 모델에서 결장의 모터 기능을 촉진한다. 최근에는, 골격근과 같은 주변 조직에서도 UCN이 발현된다고 보고되고 있으나, 이러한 UCN의 발현이 당 조절과 관련되어 있는지에 대해서는 여전히 알려진 바가 없다.
리소포스포리피드(lysophospholipid)는 세포증식 및 종양세포의 침윤을 포함한 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 포스파티딜콜린상에서 포스포리파아제 A2(PLA2)의 활성에 의해 생산된 리소포스파티딜콜린(LPC)은, 혈관내피세포 고착 분자(endothelial cell adhesion molecule)의 발현 증가와, 성장 인자(growth factor), 단핵구 주화성(monocyte chemotaxis), 및 대식세포(macrophage)의 활성을 포함한 염증 효능을 촉진한다. 본 발명은 LPC가 당 항상성과 관련된 혈관 매개 호르몬이라는 것을 최초로 증명하고자 하였고, 이를 위해, 본 발명자들은 평행 컬럼 크로마토그래피, 프로테아제 필터링 및 고감도 MS 분석을 포함하는 새로운 통합 방법을 이용하였다(Baek, M. C., et al., Proteomics 6, pp1741-1749, 2006). 3T3-L1 지방세포에 LPC를 처리할 경우, PI3-키나아제에 독립적인 PKCδ 활성을 통하여 3T3-L1 지방세포에서의 당흡수는 신속하게 촉진되었고, 더욱이 당뇨병 마우스 모델에 LPC를 투여할 경우, 혈당 수치가 현저하게 감소되었다. LPC 이외에도, 많은 리소포스포리피드(LPL)들은 다양한 생리적 및 병리적 기능을 가지고 있다고 알려져 있으나, 이들이 당흡수의 조절과 관련되어 있다는 것은 보고된 바가 없었다. 당 대사와 관련된 내재적 지질로는, 부신피질생식호르몬(dehydroepiandrosterone, DHEA)이 보고된 바 있으며, 최근 연구결과들에 의하면 DHEA가 지방세포에서 당흡수율을 증가시킨다고 보고하였으나, 동물 모델에서 DHEA의 효능을 증명하지는 못했다. 따라서, 본 발명자들은 LPC가 정상 마우스뿐만 아니라 당뇨병 마우스 모델에서 혈당 수치를 조절하는 최초의 내재적 지질임을 제시하였다.
새로운 활성 리간드를 스크리닝하기 위하여, 본 발명자들은 본 발명에 앞서 평행 HPLC 및 MS 분석을 이용한 활성 절편 검출에 기초한 LPI라고 불리는 새로운 방법을 고안하였다. 상기 평행 HPLC는 앞선 발명에 기재된 바와 같이 수율을 증가시켜 활성분자들을 동정하는 효과적인 방법으로, 본 발명자들은 상기 활성분자들을 보다 효율적으로 정제하기 위하여, 상기 평형 HPLC에 프로테아제 필터링 공정을 추가하였다. 프로테아제는 단백질 맵핑(mapping) 또는 단백질 동정에 통상적으로 사용되나, 상기 프로테아제 필터링 공정에서는 컬럼 크로마토그래피와 같은 정제 도구로서 프로테아제가 사용된다. 특히, 프로테아제 필터링은 활성분자들과 유사한 물리화학적 특징을 가진 비활성 펩타이드를 제거하는데 효과적이다. 비록 상기 비활성 펩타이드는 통상의 연속 크로마토그래피에 의해 쉽게 제거되지는 않으나, 프로테아제의 처리에 따른 비활성 펩타이드가 절단되어 비활성 펩타이드의 구조적인 변화가 초래되며, 이어지는 컬럼 크로마토그래피에 의하여 활성분자들로부터 분리될 수 있다. 이러한 프로테아제 필터링 공정 및 평행 HPLC를 결합하여, 본 발명자들은 신규한 리간드의 동정 방법을 고안하여 LPC를 보다 쉽게 동정하였다. 따라서, 이러한 통합 방법은 적은 양의 출발 물질을 이용하여, 고아 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 연구와 같은 다양한 생체활성분자들을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.
LPC 처리에 따른 3T3-L1 지방세포에서의 당흡수 촉진과 마우스에서의 혈당 감소는 LPC 아실기의 길이 변화에 민감하게 반응한다. 팔미토일(palmytoyl) LPC 및 미리스토일(myristoyl) LPC는 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진시켰으나, 스테아로일(stearoyl) LPC는 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진시키지 않았다. 팔미토일(palmytoyl) LPC와 극성 헤드기가 구조적으로 다른 몇몇 리소포스포리피드를 3T3-L1 지방세포에 처리했을 때에도 당흡수가 촉진되지 않았는데, 이러한 LPC의 구조적 특이성 또한 마우스 모델에서 확인되었다. 이러한 결과는 LPC의 아실기 길이 및 포스파티딜콜린의 헤드기가 모두 3T3-L1 지방세포에서의 당흡수 촉진 및 마우스에서의 혈당 수치 감소에 매우 중요함을 의미한다.
LPC 작용에서의 빠른 시작과 구조적 특이성을 기초로 하여, 본 발명자들은 LPC의 생물학적 활성은 LPC와 세포 표면에 있는 특이적인 LPC 수용체의 결합에 의하여 설명될 수 있다고 생각하였다. 이러한 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 부류에 대한 리간드로 몇몇 리소포스포리피드들이 보고되었으며, LPC는 G2A 및 GPR4에 직접 결합하여 활성화시키는 리간드로서 알려져 있다. 그러나, 최근 다른 연구결과에 의하면, LPC는 G2A 및 GPR4와 직접 결합하지 않는 투여량에서도 활성화될 수 있다고 보고되었다. 따라서, LPC가 G2A 및 GPR4와 직접 결합하는 경로를 통하여 당흡수를 촉진하는지 또는 알려지지 않은 또 다른 경로를 통하여 당흡수를 촉진하는지에 대한 미해결 문제가 남아있다.
지방세포 및 근육세포에서 당흡수의 촉진과 PKCζ 활성의 연관성은 오랫동안 잘 알려져 있으나, PKCδ의 활성 또한 당 수송을 조절한다. 당 수송의 활성과 PKCδ와의 연관성은 약제 및 인슐린을 이용하는 연구에서 본래 평가되었다. 인슐린을 랫트의 골격근 세포에 처리할 경우, 인슐린에 의한 상기 세포의 세포막에 대한 GLUT4의 전좌 및 당흡수의 촉진은 로틀레린에 의해 저해되었다. 더욱이, 인슐린에 의해 과발현된 PKCδ는 세포막에 대한 GLUT4의 전좌를 유도하였고, 당흡수 수치를 증가시켰다. 본 발명에서, LPC에 의해 유도된 당흡수의 촉진은 로틀레린 및 우성 음성적 PKCδ의 발현에 의해 저해되었으나, 종래의 PKC 억제제인 Go6976를 전처리하거나 또는 우성 음성적 PKCζ를 발현시킬 경우, LPC에 의한 당흡수의 촉진에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 이는 PKCδ가 LPC에 의한 당흡수의 촉진에 필수적인 요소임을 의미한다.
지금까지 보고된 LPC의 생리학적 활성 중 하나는 췌장 β-세포로부터 인슐린의 분비를 유도하는 것이다. 최근에, Takatoshi et al은 LPC에 대한 신규한 Gs-단백질 결합 수용체로서, 고아 G-단백질 결합 수용체인 GPR 119를 동정하였다(Soga, T., et al., Biochem Biophys Res Commun 326, pp744-751, 2005). 상기 GPR 119는 췌장 β-세포에서 현저하게 발현되며, LPC에 의해 활성화되어 당-의존성 인슐린의 분비를 유도한다. 본 발명에서, 본 발명자들은 단식상태(fasting condition)에 있는 마우스에 LPC를 투여하였고, 투여 후 혈청내에서 인슐린의 농도 변화가 거의 없음을 확인하였다. 이는 마우스에서의 혈당 감소는 인슐린의 분비에 의한 것이 아니라, LPC의 촉진에 따른 LPC의 직접적인 기능에 의한 것임을 의미한다.
요약하면, 본 발명은 LPC가 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진한다는 것을 보여주는 것으로, 이러한 효능은 PI3-키나아제에 독립적인 PKCδ 의존성 신호전달경로에 의하여 이루어진다. 더욱이, LPC는 당뇨병 마우스 모델에서 혈당 수치를 직접적으로 감소시켰는데, 이러한 LPC의 신규한 기능은 당 항상성 및 당 대사관련 생물학 분야에서 새롭게 인식될 수 있다. LPC와 대사 증후군간의 연관성 또한 더욱 연구될 가치가 있다. 끝으로, 본 발명의 결과들은 LPC가 당뇨병에 대한 약물 치료법을 개발하는데 유용한 타겟이 될 수 있는 보다 높은 가능성을 제시한다. UCN은 혈당 강화제로 알려져 있으나, 본 발명에서는 정상 ICR 마우스에 UCN을 투여할 경우 혈당 수치가 감소되었고(도 14A), 특히 스트렙토조토신(STZ)-마우스에 UCN과 인슐린을 함께 투여할 경우 인슐린을 단독으로 투여한 경우에 비해 혈당 수치가 더욱 감소되었다(도 14B). 더욱이, 본 발명에서는 UCN과 관련된 혈당 수치 감소의 분자적 기작을 조사하고자 하였고, 그 결과 본 발명자들은 UCN이 인슐린 수용체(IR)가 과발현된 Rat-1 세포(hIRcB 세포) 및 분화하는 C2C12 섬유아세포에서 IR의 활성화에 영향을 주는, 인슐린에 의한 IR의 인산화를 촉진한다는 것을 확인하였다(도 12, 13). 그리고, 이러한 효과들은 C2C12 섬유아세포에서 당흡수와 연관되어 있었다. 따라서, 본 발명은 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드가 인슐린에 의해 유도된 IR의 활성 및 생리적 기능인 당 조절에 특이적으로 민감하게 반응한다는 것을 최초로 밝혀낸 것이다.
인슐린(Insulin)은 혈액내에 존재하는 주요 당 조절제로 알려져 있으나, 혈당 수치를 효율적이면서 정확하게 조절하기 위해서는, 인슐린의 기능을 보조하는 보조인자들이 필요하다고 제안되어 왔다. 이러한 보조인자들은 생리적 및 병리적 조건 사이에서 서로 다른 기능적 특징을 가질 수 있다. 정상적인 생리적 조건에서, 인슐린은 주요 당 조절제 역할을 하기 때문에 상기 보조인자들은 당 항상성 조절에서 부수적인 역할을 수행할 수 있다. 그러나, 당뇨병 및 비만과 같은 병리적 조건에서, 인슐린의 기능은 현저하게 감소하기 때문에 상기 보조인자들은 인슐린 작용을 강화시켜 당을 조절하는 매우 중요한 역할을 수행할 수 있다.
인슐린을 STZ-마우스에 투여하여 당 조절을 할 경우, 일부 마우스 및 보조적인 효과가 나타났으나, UCN은 저혈당 효과(hypoglycemic effect)를 보여 주었다. 따라서, UCN은 병리적 조건에서 당을 조절하는데 더욱 강력한 효능을 가질 수 있다. 결론적으로, 본 발명에서는 인슐린과 관련된 당 조절의 신규한 기작 및 UCN의 신규한 기능을 밝혀냈다. 당 항상성 측면에서 볼 때, G-단백질 결합 수용체(GPCR)와 UCN에 의해 조절될 수 있는 IR의 활성이 중추신경계(CNS)와 주변 시스템 사이에서 나타나는 기능과 서로 상반된다는 것은 매우 흥미로운 일이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병 또는 당뇨병 합병증을 예방 또는 치료하기 위한 약제로서 사용될 수 있다. 상기 당뇨병의 예로는 인슐린-의존형 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus) 및 인슐린-비의존형 당뇨병(insulin-independent diabetes mellitus) 등을 포함한다. 특히, 본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병 합병증(예를 들면, 신경병증(neuropathy), 신장병(nephropathy), 망막증(retinopathy), 거대혈관병증(macroangiopathy), 관상동맥질환(coronary artery disease), 골다공증(osteopenia) 등)을 예방 또는 치료하기 위한 약제로서 사용될 수 있으며, 또한 당내성 손상을 치료하기 위한 약제로서 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 약학적 조성물을 인슐린 분비 강화제, 바이구아나이드제(biguanide), 및 α-글루코시다제 억제제 등과 혼합하여 처리하면 보다 우수한 혈당 저해 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 이들 각각의 활성성분의 투여 형태는 타블릿(tablet), 캡슐(연질 캡슐 및 미세 캡슐을 포함), 파우더, 과립, 및 시럽 등과 같은 경구 투여 형태; 및 주사제(예를 들면, 피하 주사제, 정맥 주사제, 근육내 주사제, 및 복강내 주사제 등), 외부 적용제(예를 들면, 코 분무제, 경피 흡수제, 및 연고 등), 좌제(예를 들면, 직장 좌제, 및 질 좌제 등), 펠렛, 및 점적 주입 등과 같은 비경구 투여 형태를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 각 약제에 따라 권고된 투여량을 참조하여 적절하게 결정될 수 있으며, 투여 대상, 투여 대상의 나이 및 체중, 현재의 임상적 상태, 투여 시간, 투여 형태, 투여 방법, 및 약제의 조합 등에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 인슐린 민감화제 및 식욕 억제제의 투여량은 임상적으로 사용되는 투여량에 기초하여 적절하게 선택될 수 있다. 인슐린 민감화제를 성인 당뇨병 환자(체중: 50 kg)에게 투여할 경우, 1일당 0.01 내지 1000 mg, 바람직하게는 0.1 내지 500 mg일 수 있으며, 상기 투여량은 하루에 여러 번 나누어 투여할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
방법 & 물질
물질: 합성 14:0, 18:0, 18:1 리소포스파티딜콜린(LPC), 인슐린 및 스트렙토조토신(STZ)은 시그마(세인트루이스, MO)로부터 구입하였고, 다른 리소포스포리피드들은 아반티 폴러 리피즈(Avanti polar lipids)로부터 구입하였다. 모든 리피드들을 50mM의 고정 농도로 메탄올에 용해시켜 유리 바이알에 1회 분량으로 분주한 다음 -70℃ 질소에 저장하여 한달 내에 사용하였다. Go6976 및 로틀레린은 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 구입하였고, 항체들은 하기 회사로부터 구입하였다: 다클론 항-GLUT4 항체는 바이오제니시스 Ltd(샌다운, NH)로부터 구입하였고, 항-포스포-Ser473 AKT1 항체는 시그마로부터 구입하였으며, 항-포스포-Tyr989 IRS1은 우리 실험실에서 제조하였고, [14C] 2-데옥시-D-글루코스(300mCi/mmol)는 모라베크 바이 오케미칼(Moravek Biochemiacl)로부터 구입하였으며, 트립신은 로슈(만하임, 독일)로부터 구입하였고, 조직 배양 배지 및 우태아 혈청은 GIBCO로부터 구입하였다. 이외 다른 모든 시약들은 분석용 급으로 준비하였다.
세포 배양: 3T3-L1 섬유아세포는 높은 당 농도, 10% 우태아 혈청, 50U/ml의 페니실린과 50ug/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지와 37℃, 5% 이산화탄소가 공급되는 습한 공기 조건에서 유지된 체 증식되었다. 3T3-L1 세포를 지방세포로 분화시키기 위하여, 이전에 기술된 방법을 이용하였다(van den Berghe, N., et al., Mol Cell Biol 14, pp.2372-2377, 1994).
동물: 수컷 ICR 마우스는 효창 과학(ROK)으로부터 구입하였고, C57BLKSJ-db/db 마우스는 SLC(일본)로부터 구입하였다. LPC를 마우스 꼬리정맥내로 투여한 후, 꼬리의 끝 부분을 잘라 휴대용 당 측정기(Gluco-Dr, ROK)를 이용하여 정기적으로 혈당을 측정하였다. 혈청내 인슐린의 농도를 측정하기 위하여, 마우스의 혈액 시료를 인슐린-RIA 키트(LINCO, Missouri)로 분석하였다. 인슐린 결핍 마우스는 구연산나트륨(pH 5.5)에 용해된 STZ(200 mg/kg)을 매일 2번 연속적으로 수컷 ICR 마우스의 복강내로 투여하여 유도하였다. 마지막 STZ를 투여한 다음 3일째 되는 날에, 상기와 같은 방법으로 비히클(vehicle), LPC 또는 인슐린을 마우스 꼬리정맥내로 투여하여 급성 당 저해 효과를 분석하였다.
HPLC 정제: 약 350 ml의 신선한 인간 혈청을 70% (v/v) 아세톤, 1 M 아세트산, 및 20 mM 염산과 혼합하여 20,000g, 30분간 4℃에서 원심분리하였고, 이로부터 얻은 상층액을 수집한 후, 디에틸 에테르로 3번 추출하였다. 추출된 액상부위를 다시 20,000g, 30분간 4℃에서 원심분리하였고, 이로부터 얻은 상층액을 사전세정을 위하여 SepPak C18(물) 카트리지에 적재하였고, 용출하기 위하여 C18 역상 HPLC 컬럼(Vydac 218TP1022, 22 mm x 250 mm)에 직접 적재하였다. 10 ml의 분획물을 수취하였고, 각 분획물의 1% 미만을 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 분석하는데 사용하였다. 활성 분획물은 37℃에서 12시간 동안 트립신으로 처리한 다음, 동일한 양을 C4 역상 HPLC 컬럼(Vydac 214TP5215, 2.1 mm x 150 mm) 및 양이온-교환 HPLC 컬럼(Amersham Pharmacia Min-S HR 5/5, 4.6 mm x 50 mm)에 사용하였다.
질량 분석 및 데이터 분석: 전기분사 이온화 질량분석(Electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS) 및 연속질량분석(tandem mass spectrometry, MS/MS)은 나노-전기분사 이온화(nano-ESI) 기질이 장착된 QSTAR PULSAR I hybrid Q-TOF MS/MS(바이오시스템사에서 공급된 PE SCIEX, 토론토, 온타리오)를 이용하여 수행하였다. 준비된 시료는 프로타나 나노분무 팁(오덴스, 덴마크)을 이용하여 ESI 기질내로 전달된 0.1% 트리플루오로아세트산에 용해되었다. QSTAR에 의해 검출된 모든 시료의 질량은 바이오시스템사에서 공급된 분석용 QS 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. QSTAR는 24시간 동안 유지되는 외부 눈금(external calibration)을 이용하여 10-30ppm의 질량 정밀도와 8,000-10,000의 해상도에서 작동되었다. 상기 분사 팁의 전압을 2300V로 조절하였고, 질량 정보에 의한 통상의 질량을 확인하기 위하여, 결합된 온라인-데이터베이스; Dictionary of Natural Products(Chapman&Hall/CRC)를 이용하였다.
당흡수 측정: 3T3-L1 지방세포에서의 당흡수를 측정하기 위하여, 세포를 혈청이 함유되지 않은 DMEM에서 16시간 동안 증식시킨 다음, 인슐린 또는 리소포스포리피드를 첨가하거나 첨가하지 않고 37℃에서 지시된 시간 동안 배양하였다. 흡수율은 1μCi의 [14C] 2-데옥시-D-글루코스 및 3 mM의 2-데옥시-D-글루코스를 첨가하여 측정하였고, 첨가된 지 10분 후, 차가운 PBS로 2번 빠르게 세척하여 상기 반응을 종결하였다. 세포는 0.5 N NaOH 및 0.1% SDS가 함유된 0.5 ml의 분쇄용액을 이용하여 분쇄하였고, 분쇄된 세포분쇄물을 액체 섬광 계수(liquid scintillation counting)를 측정하는데 이용하였으며, 비특이적인 흡수율은 10 μM 사이토칼라신 B의 존재하에서 분석되었다.
지방세포의 막 분리: 3T3-L1 지방세포로부터 전체 막(total membrane, TM)을 얻기 위하여, 세포를 10 ml의 차가운 HES 용액(250 mM 수크로즈, 1 mM EDTA, 1 mM 페닐메틸슐포닐 플루오라이드[PMSF], 1 μM 펩스타틴, 1 μM 아프로티닌, 1 μM 류펩틴, 및 20 mM HEPES, pH 7.4)내에서 수집한 후, 4℃의 유리 다운스 균질기(glass dounce homogenizer)를 이용하여 30 스트로크(stroke)로 균질화하였다. 분쇄되지 않은 세포를 제거하기 위하여 4℃, 1,000g에서 5분간 원심분리하였고, 이로부터 얻은 상층액을 4℃, 212,000g에서 90분간 원심분리하여 전체 세포의 막을 수득하였다. 3T3-L1 지방세포로부터 원형질막 세포이하의 분획물을 얻기 위하여, 이전에 기술된 바와 같이 차별적인 초원심분리를 이용하였다(Perrini, S., et al., Diabetes 53, pp.41-52, 2004).
PKC 동종체(isoform)의 아데노바이러스 감염: PKCδ 또는 PKCζ 재조합 아데노바이러스를 제조하기 위한 아데노바이러스 발현벡터는 이전에 기술된 바 있다. 배양된 3T3-L1 지방세포를 분화시킨 후, 배양액을 제거하고 PKCδ 또는 PKCζ 재조합 아데노바이러스를 함유한 바이러스 배양액을 24시간 동안 상기 세포에 감염시켰다. 그런 다음, 상기 감염된 세포를 DMEM으로 2번 세척하고 48시간 동안 감염 후 배양하여, 당흡수 또는 면역반응에 사용하였다.
면역반응: 전체 세포분쇄물을 준비하기 위하여, 3T3-L1 지방세포를 칼슘/마그네슘이 첨가되지 않은 PBS로 세척하고 분쇄용액(50 mM HEPES, pH 7.2, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100)내에서 분쇄한 후, 상기 세포분쇄물을 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 단백질을 래믈리(laemmli) 샘플 용액과 혼합하여 95℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 후, SDS-PAGE에서 분리하였다. 호퍼 웨트 트랜스 시스템(Hoefer wet transfer system)을 이용하여 SDS-겔을 니트로셀룰로오스 막으로 전달하였고, 상기 막을 5% 탈지유 파우더를 함유한 TTBS용액(20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)으로 블록킹한 다음, 3시간 동안 항체와 반응시켰다. TTBS를 이용하여 상기 막을 여러 번 세척한 후, HRP(서양고추냉이 과산화수소)-결합된 염소 항-토끼 항체와 1시간 동안 반응시켰고, 다시 TTBS로 세척한 다음 ECL로 발색하였다.
통계 분석: 모든 데이터는 평균±표준오차로 표기하였고, 통계 분석은 Studen's t 테스트로 수행하였다. *P<0.01는 통계적 유의성이 있음을 의미한다.
실시예 1: 인간 혈청내의 3 T3 - L1 지방세포로부터 당흡수 촉진인자인 리소포 스파티딜콜린의 동정
3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진하는 내재적 인자를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 체계적인 평행 컬럼 크로마토그래피, 프로테아제 필터링, 고감도 MS 분석을 기초로 한 새로운 통합 방법을 이용하였다(도 1A). 평행 HPLC의 기본적인 원리는 기존의 연속적인 분리(Baek, M. C., et al., Proteomics 6, pp,1741-1749, 2006) 대신 타겟 분자를 확인하기 위해 검출 분석을 이용한다는 것이다. 다단계의 연속 컬럼에 의한 낮은 수율은 정제하는데 매우 큰 단점이 되는데, 이는 각 컬럼에 의한 수율이 정제 과장에서도 급격히 감소하기 때문이다. 이러한 새로운 방법은 연속적인 HPLC 단계를 최소화하고, 타겟 분자들을 동정하기 위하여 일부 정제된 HPLC 분획물을 이용하며, 연속적인 HPLC에 비해 단지 소량의 출발 물질이 요구된 다.
평행 HPLC와 함께, 본 발명자들은 효율적인 정제를 위하여 프로테아제 필터링 방법을 이용하였다. 즉, 특이적인 프로테아제를 처리한 후 활성 분획물의 활성이 소실되지 않는다면, 본 발명자들은 활성분자를 포함하는 분획물과, 이어 수행되는 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 다양한 비활성 펩타이드로부터 상기 활성 분획물을 확실하게 분리할 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 지질, 아민 및 탄수화물과 같은 비-펩타이드 분자들을 분리하는데 유용하다. 이러한 새로운 통한 방법으로, 본 발명자들은 최초로 C18 역상 HPLC에 의하여 인간 혈청으로부터 아세톤 추출물을 분획하였다. 분획된 HPLC 분획물은 3T3-L1 지방세포에 처리되었고, 당흡수율은 [14C] 2-데옥시-D-글루코스 흡수율의 증가를 통하여 측정되었다(van den Berghe, N., et al., Mol Cell Biol 14, pp.2372-2377, 1994).
도 1B에 나타낸 바와 같이, 최소한 4종류의 활성 분획물이 검출되었고(A-D), 이들의 활성이 트립신 처리에 의하여 감소되는지 조사한 결과, 분획물 D의 활성만이 트립신 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 따라서, 상기 분획물 D를 트립신으로 처리하였고, 평행 상태에 있는 C4 HPLC 및 양이온-교환(SCX) HPLC를 이용하여 추가로 분리하였다. C4 HPLC 및 SCX HPLC의 모든 분획물은 3T3-L1 지방세포로부터 당흡수를 측정하여 스크리닝 되었다(도 1C 및 1D).
각 컬럼(C4로부터는 37분, SCX로부터는 6분)으로부터 얻은 활성 분획물을 ESI-QTOF 질량 분석기로 분석하였고, 표준 질량을 찾기 위하여, 각 질량 스펙트럼 을 비교한 결과, 단일동위원소 질량으로서 495.33의 단 하나의 표준 질량 값이 있었다(도 1E-상단 그림 및 도 1E-중앙 그림). 이러한 질량 정보를 이용하여, 본 발명자들은 결합된 온라인-데이터베이스(Dictionary of Natural Products )로 검색하였고, 팔미토일 리소포스파티딜콜린(LPC)를 동정하였다. 타겟 분자가 LPC인지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 MS/MS 스펙트럼상에서 표준 LPC와 495.33 질량의 각 단편화 양상을 분석하였다(도 1F). 양성-이온 모드에서 표준 LPC 산물-이온 스펙트럼은 m/z 183에서 가장 강한 피크를 포함하는, 포스포콜린 헤드기의 충돌에 의해 유도된 분리로부터 발생된 여러 개의 이온들을 나타내었다(도 1F-하단 패널 및 1G). C4 HPLC 및 SCX HPLC로부터 얻은 495.33 질량의 단편화 양상은 표준 LPC와 정확하게 일치하였다(도 1F-상단 패널 및 1F-중앙 패널). 상기에서 언급한 물리적 특징을 기초로 하여, 본 발명자들은 활성 기질이 LPC라고 결정하였다.
도 1A 내지 1E는 혈청으로부터 신규한 당흡수 촉진제를 동정한 것을 나타낸 것으로, 도 1A는 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진할 수 있는 혈청 인자의 동정 방법을 개략적으로 나타낸 것이며, 도 1B는 혈청의 C18 역상 HPLC(Vydac 218TP1022, 22 mm x 250 mm)의 용출 양상을 나타낸 것이다. 상대적인 2-데옥시-D-글루코스 흡수율은 3T3-L1 지방세포에서 비히클 처리에 대한 각 분획물 처리에 의해 얻어진 증가 비율로서 나타내었다. 활성 분획물 D는 무작위로 선택되었고, 추가적인 정제를 위해 트립신으로 처리되었다. 도 1C는 분획물 D의 C4 역상 HPLC(Amersham Pharmacia Mini-S HR 5/5, 4.6 mm x 50 mm)의 용출 양상을 나타낸 것이고, 도 1E는 ESI-TOF 질량 분석기에 의한 질량 분석을 나타낸 것이다. 도 1C(상단), 도 1D(중앙) 및 표준 팔미토일(16:0) LPC(하단)는 활성 분획물의 질량 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 1F는 도 1E의 각 질량 스펙트럼에서 질량 단편화 및 495.33 질량의 MS/MS 스펙트럼의 양상 분석을 나타낸 것이다.
실시예 2: 3 T3 - L1 지방세포에서 당흡수에 대한 LPC 의 효능
당흡수에 대한 LPC의 효능을 조사하기 위하여, 3T3-L1 지방세포를 다양한 농도의 표준 LPC 존재하에서 시간에 따라 배양하였다. LPC는 3T3-L1 지방세포에서 시간 및 농도에 따라 당흡수의 증가를 촉진하였다. 당흡수에 대한 LPC의 초기의 통계적인 유효량은 1 μM이고, 최적의 유효량은 20 μM로 확인되었다(도 2A). 20 μM의 LPC로 처리할 경우, 10분 후에 당흡수가 최대로 증가되었다(도 2B). 이러한 LPC 농도는 세포독성이 나타나지 않으며, 40 내지 50 μM의 임계미셀농도(critical micellar concentration)보다 낮은 농도이다(Chaudhuri, P., et al., Circ Res 97, 674-681, 2005).
골격근은 당 대사에서 중추적인 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 골격근에서 당 대사의 손상은 종종 당뇨병을 초래한다(Petersen, K. F., et al., Am J Cardiol 90, 11G-18G, 2002; Beck-Nielsen, H., et al., Diabetologia 37, pp217-221, 1994). 비록 이러한 연구보고는 3T3-L1 지방세포에 한정되어 왔으나, 본 발명자들은 또한 LPC가 C2C12 근육세포에서 농도 의존적으로 당흡수율을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 LPC가 지방세포 및 근육세포 모두에서 당을 조절할 수 있음을 의미한다.
LPC의 아실기 길이 변화가 당흡수에 영향을 주는지 알아보기 위하여, 여러 개의 LPC를 대상으로 시험하였다. 흥미롭게도, 미리스토일 LPC 및 팔미토일 LPC는 3T3-L1 세포에서 당흡수를 촉진시켰으나, 스테아로일 LPC는 당흡수를 촉진시키지 않았다(도 2C). 다른 리소포스포리피드들에 대해서도 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진시키는지 조사하기 위하여, 여러 개의 리소포스포리피드들을 3T3-L1 지방세포에 처리하였다. 도 2D에 나타낸 바와 같이, 팔미토일 LPE, 팔미토일 LPG 및 팔미토일 LPI는 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 촉진시키지 않았는데, 이는 LPC의 헤드기가 3T3-L1 지방세포에서 LPC에 의한 당흡수 촉진에 구조적인 선택성을 부여하고 있음을 의미한다.
도 2A 내지 2D는 3T3-L1 지방세포에서 당흡수에 대한 LPC의 효능을 나타낸 것으로, 도 2A는 6-웰 플레이트에서 증식시킨 3T3-L1 지방세포에 당이 없는 Krebs-Ringer 용액으로 1시간 동안 평형화시키고, LPC(0 내지 30 μM) 또는 인슐린(10 nM)을 10분간 처리한 다음, 물질 방법에 기술된 바와 같이 [14C] 2-데옥시-D-글루코스 흡수율을 10분 동안 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 2B는 3T3-L1 지방세포에 LPC(20 μM)를 0 내지 20분 동안 처리 및 배양한 결과를 나타낸 것이다. 도 2C 및 2D는 3T3-L1 지방세포에 등몰 농도의 미리스토일 리소포스파티딜콜린(14:0 LPC), 팔미토일 리소포스파티딜콜린(16:0 LPC), 스테아로일 리소포스파티딜콜린(18:0 LPC), 팔미토일 리소포스타티딜에탄올아민(16:0 LPE), 팔미토일 리소포스파티딜이노시톨(16:0 LPI), 팔미토일 리소포스파티딜글리세롤(16:0 LPG)를 10분 동안 처리 하거나 처리하지 않고(대조군) 배양하여 상대적인 [14C] 2-데옥시-D-글루코스 흡수율의 측정 결과를 나타낸 것이다. 측정값은 3번의 독립적인 실험을 수행하여 얻어진 결과를 평균±표준오차로 나타낸 값이다. * P<0.05 vs. 대조군.
실시예 3: 3 T3 - L1 지방세포에서 GLUT4 전위를 촉진하는 LPC
3T3-L1 지방세포에서 당 수송을 촉진하는 LPC의 기능이 LPC에 의해 유도된상기 세포 표면에 있는 당 수송 단백질양의 변화와 연관되어 있는지 조사하기 위하여, 3T3-L1 지방세포에서 발현되는 주요 당 수송 동종체인, GLUT4 단백질의 수치를 LPC 또는 인슐린을 처리하거나 처리하지 않은 기저 상태의 원형질막(PM) 분획물에서 측정하였다. LPC는 인슐린처럼 GLUT4 단백질의 PM 농도(대조군의 180%)를 현저하게 증가시켰다(도 3A 및 3B). 이러한 결과는 인슐린 및 LPC 모두 GLUT4 전좌(translocation)를 촉진시키며, 당흡수 실험에서 관찰된 것과 일치하고 있음을 알 수 있다.
도 3A 및 3B는 LPC가 3T3-L1 지방세포에서 GLUT4 전좌를 촉진하고 있음을 나타낸 것이다. A) 3T3-L1 지방세포의 원형질막(PM)에서 GLU4 전좌에 대한 인슐린의 효능. LDM, 저농도 마이크로솜. 3T3-L1 지방세포를 100 nM 인슐린 또는 20 μM 리소포스포리피드로 10분간 처리하여 촉진시킨 다음, GLU4의 통합 밀도 값(IDV)의 상대적인 감소 또는 증가를 측정하였다. B) 상대적으로 증가된 값을 정량화하여 표기. 측정값은 3번의 독립적인 실험을 수행하여 얻어진 결과를 평균±표준오차로 나타낸 값이다. * P<0.05.
실시예 4: PKC δ 활성화를 통하여 당흡수를 촉진하는 LPC
지방세포에서 인슐린이 당흡수를 촉진하기 위해서는 IRS1, PI3-키나아제 및 이어 일어나는 AKT의 활성이 필요하다(Burgering, B. M.,　et al., Nature 376, pp.599-602, 1995; Baumann, C. A.,　et al., Nature 407, pp202-207, 2000). 따라서, LPC에 의해 증가된 당흡수가 인슐린 의존형 신호전달경로, IRS1 및 AKT 인산화와 관련되어 있는지 조사하고자 하였다. 예상대로, 3T3-L1 지방세포에 10 nM의 인슐린을 처리할 경우, IRS1 및 AKT 인산화가 촉진되었다. 반면, 지방세포에 LPC를 처리할 경우, IRS1 및 AKT 인산화에 어떠한 영향도 주지 않았는데, 이는 LPC가 다양한 세포에서 기존 및 신규의 PKC를 활성화하기 때문이며(Chaudhuri, P.,　et al.,cell migration. Circ Res 97, 674-681, 2005), LPC에 의해 유도된 당 수송의 증가와 이러한 PKC의 연관성에 대해서는 다음에 조사하였다. 3T3-L1 지방세포에 기존의 PKC 억제제인 2 μM Go6976을 30분 동안 전처리할 경우, LPC는 당흡수를 촉진시키지 않았으나, PKCδ 억제제인 10 μM 로틀레린을 전처리할 경우, LPC에 의해 촉진된 당흡수가 완전히 억제되었다(도 4A).
PKC의 기능을 보다 직접적으로 조사하기 위하여, 본 발명자들은 3T3-L1 지방세포에 특이적인 PKC 동종체(isoform) 및 우성 음성적 PKC 동종체(isoform)를 과발현시키는 아데노바이러스 발현 시스템을 이용하였고, 자연형(wild-type), 우성 음성적 PKCδ 또는 우성 음성적 PKCζ를 과발현하는 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 분석하였다. 자연형 PKCδ 발현은 대조군 3T3-L1 지방세포의 것과 비교했을 때, LPC에 의해 촉진된 당 수송 활성을 미미하게 증가시켰으며, 우성 음성적 PKCδ의 발현은 LPC에 의해 촉진된 당 수송 활성을 현저하게 감소시켰다. 반면, 우성 음성적 PKCζ의 발현은 LPC 및 인슐린에 의해 유도된 당흡수에 어떠한 영향도 주지 않았다(도 4B). 이러한 결과는 PKCδ가 LPC에 의해 유도된 당 수송 활성에 관여하고 있음을 의미한다.
도 4A 및 4B는 LPC가 PKCδ를 활성화시켜 당흡수를 촉진하는 것을 나타낸 것으로, 도 4A는 6-웰 플레이트에서 증식시킨 3T3-L1 지방세포에 당이 없는 Krebs-Ringer 용액으로 1시간 동안 평형화시키고, 2 μM Go6976, 10 μM 로틀레린, 또는 용액 단독을 30분간 처리한 다음, 상기 세포에 비히클(개방 막대기) 또는 20 μM LPC(채워진 막대기)를 10분 동안 처리하여 물질 방법에 기술된 바와 같이 [14C] 2-데옥시-D-글루코스 흡수율을 10분 동안 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 4B는 PKCδ및 PKCζ 단백질의 발현 수치를 나타낸 것이다. 대조군 3T3-L1 지방세포 및 자연형 PKCδ, 우성 음성적 PKCδ 또는 우성 음성적 PKCζ를 발현하는 3T3-L1 지방세포로부터 얻은 세포분쇄물을 각각 항-PKCδ 항체 또는 항-PKCζ 항체와 면역반응시키고(상단), 3T3-L1 지방세포에서 당흡수를 측정하였다(하단). 상기 각 세포에 비히클, 20 μM LPC 또는 10 nM 인슐린을 10분 동안 처리 및 배양하였다. 측정값은 3번의 독립적인 실험을 수행하여 얻어진 결과를 평균±표준오차로 나타낸 값이다. * P<0.05.
실시예 5: 마우스에서 LPC 의 당저해 효능
LPC의 생체내(in vivo) 효능은 수컷 알비노 ICR(암 연구학회) 마우스를 이용하여 조사하였다. 상기 마우스의 꼬리정맥내로 LPC를 투여할 경우, 30분 이내에 혈당 수치가 통계적으로 유의하게 감소되었는데(도 5A), 이러한 효능은 농도에 의존적이나, 혈액내 인슐린 수치의 변화에 의한 것은 아니다(도 5C).
LPC의 종류에 따라 그 활성이 다른지 조사하기 위하여, 다양한 길이의 아실기를 가진 LPC 또는 다른 리소포스포리피드인 리소포스파티딜에탄올아민을 30 μmol/kg의 등몰 농도로 마우스의 꼬리정맥내로 투여하였다. 흥미롭게도, 단지 팔미토일 LPC 만이 혈당을 현저하게 감소시켰다(도 5B). 이어, 본 발명자들은 30 μmol/kg LPC를 스트렙토조토신(STZ)-처리된 인슐린 결핍 마우스에 투여하였고, 그 결과 LPC가 혈당 농도를 현저하게 감소시켰으며, 이러한 효과는 인슐린을 투여한 결과와 유사하였다(도 5D).
다음으로, 본 발명자들은 LPC의 투여가 인슐린-내성의 비만 db/db 마우스의 혈당증(glycemia)에도 영향을 줄 수 있는지 조사하였고, 그 결과 LPC 투여 후 혈당이 거의 정상 수치로 떨어짐을 확인하였다(도 5E). 종합해 보면, 이러한 결과들은 LPC가 정상 마우스뿐만 아니라 타입 I 및 타입 II 당뇨병 마우스 모델에서도 혈당 수치를 조절할 수 있음을 의미한다.
도 5A 내지 5E는 당뇨병 마우스 모델에서 꼬리정맥내로 투여된 LPC의 항-당뇨 효능을 나타낸 것으로, 도 5A 및 5B는 ICR 마우스에서 LPC에 의한 급성 당 저해 효 능을 나타낸 것이다. 8주령된 수컷 마우스에 PBS, 인슐린, LPC, 또는 LPE를 꼬리정맥내로 투여하였고, 혈당은 투여 후 모니터링하였다(0 내지 120 분). 도 5C는 8주령된 수컷 마우스의 꼬리정맥내로 LPC를 단일 투여한 후 혈청내 인슐린 수치를 나타낸 것이고, 도 5D는 스트렙토조토신(STZ)-처리된 인슐린 결핍 ICR 수컷 마우스에서 LPC에 의한 급성 당 저해 효능을 나타낸 것이며, 도 5E는 인슐린-내성의 비만 C57BLKSJ-db/db 마우스에서 LPC에 의한 급성 당 저해 효능을 나타낸 것이다. 모든 동물은 물을 자유롭게 섭취하였고, 국제적인 지침에 따라 보호되었다. 모든 데이터는 평균±표준오차로 나타내었다(n=5-6). * P<0.05.
실시예 6: 당흡수에 대한 LPS 의 효능
6-1: 3 T3 - L1 지방세포에서 당흡수에 대한 LPS 의 효능
LPC와 관련된 실시예와 실질적으로 동일한 방법으로, 3T3-L1 지방세포에서 LPS의 효능을 조사하였고, 그 결과를 도 6A 및 6B에 나타내었다.
6-웰 플레이트에서 증식시킨 3T3-L1 지방세포에 당이 없는 Krebs-Ringer 용액으로 1시간 동안 평형화시키고, 등몰 농도(20 μM)의 리소포스파티딜콜린(LPC), 리소포스파티딜세린(LPS), 리소포스파티딜에탄올아민(LPE), 리소포스파티딜이노시톨(LPI), 리소포스파티딜글리세롤(LPG)을 각각 10분간 처리 및 배양하였다. 도 6A는 LPC 및 LPS가 3T3-L1 지방세포에서 특이적으로 당흡수를 촉진하는 것을 나타낸 것이고, 도 6B는 LPS가 농도 의존적으로 당흡수를 촉진하는 것을 나타낸 것이다(0 내지 30 μM). 측정값은 3번의 독립적인 실험을 수행하여 얻어진 결과를 평균±표 준오차로 나타낸 값이다. * P<0.05 vs. 대조군.
6-2: 당뇨병 마우스 모델에서 LPS 의 당저해 효능
LPC와 관련된 실시예와 실질적으로 동일한 방법으로, 마우스에서 LPS의 효능을 조사하였고, 그 결과를 도 7A 내지 7D에 나타내었다.
도 7A 내지 7B는 당뇨병 마우스 모델에서 꼬리정맥내로 투여된 LPS의 당 저해 효능을 나타낸 것이다. 8주령된 수컷 마우스에 PBS, 인슐린, LPS를 꼬리정맥내로 투여하였고, 혈당은 투여 후 모니터링하였다(0 내지 120 분). 도 7A에 나타낸 바와 같이, LPS는 농도-의존적으로 정상 마우스의 혈당 수치를 감소시켰다. S1P 및 LPE와 같은 다른 리소포스포리피드들은 정상 마우스에서 혈당 수치를 감소시키지 않았다(도 7B). 다음으로, 8주령된 수컷 마우스의 꼬리정맥내로 LPS를 단일 투여한 후 혈청내 인슐린 수치를 측정하였고, 그 결과 혈당 수치가 통계적으로 유의하게 감소되었는데, 이러한 효능은 혈액내 인슐린 수치의 변화에 의한 것이 아니다(도 7C). 이어, 본 발명자들은 LPS를 스트렙토조토신(STZ)-처리된 인슐린 결핍 마우스에 투여하였고, 그 결과 LPS가 혈당 농도를 현저하게 감소시켰으며, 이러한 효과는 인슐린을 투여한 결과와 유사하였다(도 7D). 이러한 결과로부터, LPS는 혈당 수치를 농도-의존적으로 저해시키고, 인슐린 분비에 영향을 주지 않으며, 특히 인슐린이 결핍된 타입 I 당뇨병 마우스 모델에서 당을 조절하는 효능이 있었다. 모든 동물은 물을 자유롭게 섭취하였고, 국제적인 지침에 따라 보호되었다. 모든 데이터는 평균±표준오차로 나타내었다(n=5-6). * P<0.05.
실시예 7: 3 T3 - L1 지방세포에서 당흡수에 대한 LPA 의 효능
7-1: 3 T3 - L1 지방세포에서 당흡수에 대한 LPA 의 효능
LPC와 관련된 실시예와 실질적으로 동일한 방법으로, 3T3-L1 지방세포에서 LPA의 효능을 조사하였고, 그 결과를 도 8A 및 8B에 나타내었다.
당흡수에 대한 LPA의 효능을 조사하기 위하여, 3T3-L1 지방세포를 다양한 농도의 표준 LPA의 존재하에서 시간에 따라 배양하였다. LPA는 3T3-L1 지방세포에서 시간 및 농도에 따라 당흡수의 증가를 촉진시켰다. 당흡수에 대한 LPA의 초기의 통계적인 유효량은 1 μM이고, 최적의 유효량은 20 μM로 확인되었다(도 8A). 20 μM의 LPA로 처리할 경우, 10분 후에 당흡수가 최대로 증가되었다(도 8B). 도 9A는 6-웰 플레이트에서 증식시킨 3T3-L1 지방세포에 당이 없는 Krebs-Ringer 용액으로 1시간 동안 평형화시키고, LPA(0 내지 20 μM) 또는 인슐린(10 nM)을 10분간 처리한 다음, 물질 방법에 기술된 바와 같이 [14C] 2-데옥시-D-글루코스 흡수율을 10분 동안 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 9B는 3T3-L1 지방세포에 LPA(20 μM)를 0 내지 20분 동안 처리 및 배양한 결과를 나타낸 것이다.
7-2: LPA 에 의한 당흡수 촉진의 신호전달기작
LPC와 관련된 실시예와 실질적으로 동일한 방법으로, 3T3-L1 지방세포에서 LPA의 효능을 조사하였고, 그 결과를 도 9A 및 9B, 도 10A 및 10B에 나타내었다.
LPA가 그의 수용체를 통하여 당흡수에 영향을 주는지 조사하기 위하여, 본 발명자들은 LPA 수용체 길항제(antagonist)인 Ki16425를 이용하였다. 도 9A는 LPA에 의해 촉진된 당흡수가 Ki16425 전처리에 의하여 완전하게 억제됨을 나타낸 것이다. 이어, 본 발명자들은 LPA가 Gαi 억제제인 페루투시 독소(pertussi toxin)을 이용하여 Gαi와 결합된 LPA 수용체를 활성화시키는지 조사하였다.
도 9B는 LPA가 Gαi를 활성화시켜 당흡수를 촉진하는 것을 나타낸 것이다.
인슐린이 PI3-키나아제 의존형 신호전달경로를 통하여 당흡수를 촉진한다는 것은 잘 알려져 있으므로, 이러한 신호전달경로를 통하여 LPA가 당흡수를 촉진하는지 조사하기 위하여, 본 발명자들은 PI3-키나아제의 하위 신호인 AKt를 확인하였고, 그 결과 Akt가 LPA에 의해 영향을 받는다는 것을 확인하였다. 도 10A는 LPA가 Akt 인산화를 촉진하고 있음을 나타낸 것이고, 이러한 인산화는 PI3-키나아제 억제제인 LY294002 전처리를 통하여 억제되었다. 이어, LPA가 PI3-키나아제 신호전달경로를 통하여 실질적으로 당흡수를 촉진하는지 조사하기 위하여, 본 발명자들은 3T3-L1 지방세포에 LY294002를 전처리하고, 당흡수를 측정하였다. 도 10B는 LPA에 의해 촉진된 당흡수가 PI3-키나아제 활성에 의존적임을 나타낸 것이다.
7-3: 마우스 모델에서 LPA 의 당 저해 효능
LPC와 관련된 실시예와 실질적으로 동일한 방법으로, 동물 모델에서 LPA의 당-저해 효능을 조사하였고, 그 결과를 도 11A 내지 11D에 나타내었다.
도 11A 내지 11B는 마우스 모델에서 꼬리정맥내로 투여된 LPA의 당 저해 효 능을 나타낸 것이다. 8주령된 수컷 마우스에 PBS, 인슐린, LPA를 꼬리정맥내로 투여하였고, 혈당은 투여 후 모니터링하였다(0 내지 120 분). 도 11A는 8주령된 수컷 마우스의 꼬리정맥내로 LPA를 단일 투여한 후 혈청내 인슐린 수치를 나타낸 것으로, LPA는 정상 마우스에서 농도-의존적으로 혈당 수치를 감소시켰다. S1P 및 LPE와 같은 다른 리소포스포리피드들은 정상 마우스에서 혈당 수치를 감소시키지 않았다(도 11B). 이러한 효능은 혈액내 인슐린 수치의 변화에 의한 것이 아니다(도 11C).
끝으로, 본 발명자들은 LPA에 의한 당 저해 효능이 LPA 수용체의 활성에 의존적인지 조사하고자 하였다. LPA 투여 전, LPA 수용체 억제제인 Ki16425를 투여하였다. 도 11D는 LPA에 의해 촉진된 당흡수가 LPA 수용체 억제제에 의하여 억제됨을 나타낸 것이다. 이러한 결과로부터, LPA는 혈당 수치를 농도-의존적으로 저해시키고, 인슐린 분비에 영향을 주지 않으며, 특히, LPA에 의한 혈당 저해는 LPA 수용체 활성과 관련되어 있었다. 모든 동물은 물을 자유롭게 섭취하였고, 국제적인 지침에 따라 보호되었다. 모든 데이터는 평균±표준오차로 나타내었다(n=5-6). * P<0.05.
실시예 8: hIRcB 세포에서 IR 자가인산화에 대한 UCN 의 효능
물질: Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)은 바이오위태커로부터 구입하였고, 우태아 혈청(FBS) 및 말 혈청(ES)은 하이클론(로간, UT)으로부터 구입하였다. 코르티코트로핀 방출 인자(CRF), 유로코르틴(UCN), 스트레스코르핀 방충 펩 타이드(SRP) 및 스트레스코르핀은 애니젠(광주, 한국)에서 합성하였고, 포스포-인슐린 수용체 항체, IRS 항체, IR 항체 및 AKT 항체는 셀 시그널사(비버리, MA)로부터 구입하였으며, [14C] 2-데옥시-D-글루코스는 모라베크(머큐리, CA)로부터 구입하였다. 이외 다른 모든 시약들은 시그마(세인트루이스, MO)로부터 구입하였다.
면역반응(immunoblot)을 포함한 모든 실험들은 독립적으로 최소한 3번 반복 실시하였고, 본 발명의 면역반응(immunoblot)은 3번 이상의 독립적인 실험 중 대표적인 것을 나타낸 것이다. 정량적인 데이터는 평균±표준오차로 표기하였고, Student's t 테스트를 적절하게 사용하였다. *P<0.05는 통계적 유의성이 있음을 의미한다.
도 12A는 1 mM CRF 류 및/또는 2 nM 인슐린 또는 배지 단독을 1분 동안 처리하여 배양된 세포로부터 수득한 CRF 류 중 인슐린에 대한 민감성을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 인슐린에 대한 UCN의 민감성은 농도(12B, 12C) 및 시간(12D)에 따라 증가되었다. 도 12B는 2 nM 인슐린 및 다양한 농도의 UCN(2 nM 내지 1 mM)을 1분 동안 처리하여 배양된 세포로부터 얻은 결과이고, 도 12c는 100 nM 및 다양한 농도의 인슐린을 1분 동안 처리하여 배양된 세포로부터 얻은 결과이다. IR의 인산화는 항-pTyr 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 도 13D는 100 nM UCN 및/또는 10 nM 인슐린을 0, 2, 10, 30, 및 60분 동안 처리하여 배양된 세포로부터 얻은 결과로서, 이때 IR의 인산화는 항-pIR 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 분석하였다. IR 자가인산화의 정량은 이미지 게이지 소프트웨어(후지필름)를 이용하여 측정하였 다. 측정값은 3번의 독립적인 실험으로부터 얻어진 결과를 평균±표준오차로 나타낸 값이다(n=5-6). * P<0.05.
세포 배양
hIRcB 세포는 10%(v/v) FBS를 포함하는 DMEM과 37℃, 5% 이산화탄소 및 95%의 공기가 공급되는 습한 공기 조건에서 유지된 체 증식되었다.
면역침전( Immunoprecipitation ) 및 면역반응( immunoblot )
지시된 시간 및 농도로 리간드를 처리한 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 프로테아제 억제제(0.5 mM PMSF, 1 mg/ml 류펩틴 및 5 mg/ml 이프로티닌) 및 포스파타제 억제제(30 mM NaF, 1 mM Na3VO4 및 30 mM Na4O7P2)를 포함하는 분쇄용액(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤)내에서 분쇄하였다. 분쇄된 상기 세포분쇄물을 4?에서 1시간 동안 반응시켜 14,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후, 동량의 액상 추출물을 5 mg 항-IR 항체 및 30 ml 레진 부피의 고정 단백질 A와 함께 4시간 동안 반응시켰다. 겔 전기영동을 수행하기 위하여, 상기 침전물을 래믈리(laemmli) 샘플 용액과 혼합하여 SDS-PAGE에서 분리한 다음, 니트로셀룰로오스 막(슐레이처 및 슈엘, BA85)으로 전달하였다. 블록킹은 5% 탈지유 파우더를 함유한 TTBS 용액(10 mM Tris/HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 및 0.05% Tween 20)으로 수행하였고, 상기 막을 3시간 동안 실온에서 1차 항체와 반응시켰다. 이어, 상기 막을 세척하고 서양고추냉이 과산화수소-결합된 2차 항체와 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, TTBS 용액으로 4번 세척하였고, 서양고추냉 이 과산화수소-의존형 화학발광시약(Amersham International, United Kingdom)으로 발색하였다.
본 실시예에서, 유로코르틴(UCN) 및 코르티코트로핀 방출 인자(CRF)는 IR 과발현된 hIRcB 세포에서 다른 류, 즉 스트레스-관련 펩타이드(SRP) 및 스트레스코르핀(SCP)에 비해 인슐린에 의한 IR 인산화에 우세하게 작용하고 있음을 확인하였다(도 12A). UCN 및 CRF 단독은 IR 인산화에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 비록 UCN 및 CRF가 인슐린에 의한 IR 인산화에 우세하게 작용한다 하더라도, UCN은 CRF에 비해 CRF 수용체 1(CRFR1)에 보다 높은 친화성을 가지고 있다. UCN에 의해 유도된 인슐린에 의한 IR 인산화는 농도(도 12B) 및 시간(도 12D)에 따라 촉진되었다. 특히, 도 12C에 나타낸 바와 같이, IR 인산화에 대한 UCN의 효능은 저농도의 인슐린 존재하에서 더욱 강력한데, 이는 UCN이 hIRcB 세포에서 특이적으로 인슐린에 의한 IR 인산화에 민감하게 반응하기 때문이다.
실시예 9: C2C12 섬유아세포에서 당흡수 및 IR 인산화에 대한 UCN 의 효능
UCN은 인슐린에 의해 유도된 당흡수 및 IR 인산화, IRS 및 Akt를 촉진시켰다. 섬유아세포는 2 nM UCN 및/또는 다양한 인슐린 농도(0 내지 20 nM)에서 1분 동안 배양되었고, IRS 및 Akt의 인산화는 항-pIRS 항체 및 항-pAkt 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 당흡수는 하기와 같이 수행하였다.
세포 배양
C2C12 세포는 10%(v/v) FBS를 포함하는 DMEM과 37℃, 5% 이산화탄소 및 95% 의 공기가 공급되는 습한 공기 조건에서 유지된 체 증식되었다. C2C12 세포의 분화를 위하여, 증식용 배지를 2%(v/v) ES를 포함하는 DMEM로 바꾸어 7일간 배양하였다.
당흡수 분석
세포를 분화시킨 후, 세포를 세척하고 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2ㆍ2H2O, 1.3 mM MgSO4ㆍ7H2O, 및 10 mM Na2HPO4ㆍ7H2O, pH 7.4를 포함하는 2 ml Krebs-Ringer phosphate(KRP)로 3시간 동안 배양하였다. 당흡수에 대한 UCN의 효능을 분석하기 위하여, 지시된 조건에서 1 ml KRP로 10분 동안 배양하여 수행하였다. 상기 반응은 [14C] 2-DG(1 mCi/ml) 및 비-방사능 2-DG(최종농도: 20 mM)의 혼합물을 10분 동안 첨가하여 수행하였고, 용매를 제거한 후 차가운 인산완충용액(물 1L에 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.15 g Na2HPO4ㆍ12H2O 및 0.2 g KH2PO4를 포함하는 PBS)으로 빠르게 2번 세척하였다. 세포-연관 방사능은 1 N NaOH에서 세포를 분쇄한 후, 섬광 계수(scintillation counting)로 측정하였으며, 비특이적인 흡수율은 전체 흡수율의 값에서 특이적인 흡수율의 값을 공제하여 측정하였다.
면역침전(Immunoprecipitation) 및 면역반응(immunoblot)은 실시예 8의 방법에 따라 수행하였다.
IR 활성은 근육에서 당흡수에 중추적인 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, UCN은 인슐린에 의한 IR 활성화를 촉진시켜, 당흡수를 조절하는 것으로 여겨지고 있다. 이를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 C2C12 섬유아세포에서 당흡수 및 인슐린에 의한 신호전달을 조사하였다. UCN의 존재하에서, 인슐린에 의한 IR 인산화는 강화되었고, 인슐린에 의한 당흡수 또한 현저하게 증가되었으나(도 13), UCN 단독에서는 이러한 효과가 나타나지 않았다. 이러한 결과는 UCN이 C2C12 섬유아세포에서 인슐린에 의해 촉진된 당흡수에 우세하게 작용하여, 인슐린-매개 신호전달경로에서 인슐린의 민감화제로 작용하여 유도된 것이라고 할 수 있다.
실시예 10: 정상 및 STZ -마우스에서 원형질 당 조절에 대한 UCN 의 효능
UCN은 HPA 축을 촉진시켜 혈당을 강화시키는 강화제로 잘 알려져 있으며, UCN의 생체내(in vivo) 기능은 혈당 수치를 억제한다는 본 발명의 생체내 결과와는 상반된 것이다. 따라서, 이들 사이의 불일치를 구별하기 위하여, 본 발명자들은 마우스에 다양한 농도의 UCN을 투여하고, 혈당 수치의 변화를 조사하였다.
도 14A는 ICR 마우스에서 UCN에 의하여 감소된 혈당을 나타낸 것이고, 삽입된 면역반응 데이터는 골격근에서 UCN에 의한 IR 인산화를 나타낸 것이다. 마우스에 비히클(0.1% BSA를 함유한 식염수) 또는 UCN(0.1-100 pM)을 꼬리정맥내로 투여하였고, 측정값은 4마리의 대조군 및 4마리의 UCN-처리된 마우스로부터 얻어진 결과를 평균±표준오차로 나타낸 값이다. 도 14B는 STZ 마우스에서 UCN에 의하여 감소된 혈당을 나타낸 것이고, 삽입된 면역반응 데이터는 STZ 마우스의 골격근에서 UCN 처리에 의한 IR 인산화를 나타낸 것이다. 마우스에 비히클(0.1% BSA를 함유한 식염수), UCN(0.1 pM) 및/또는 인슐린(1 nM)을 꼬리정맥내로 투여하였고, 당의 원형질 수치를 45분 동안 측정하였다. 측정값은 6마리의 각 군으로부터 얻어진 결과 를 평균±표준오차로 나타낸 값이다. * P<0.05.
10-1: 시험동물 준비
정상 시험동물을 준비하기 위하여, 체중이 20-25g이며 8주령된 수컷 ICR(암 연구학회) 마우스를 효창 과학으로부터 구입하였고, 온도 및 빛이 조절된 방(20-22℃; 12 시간의 조명과 12 시간의 어둠 사이클; 오전 7시에 조명 시작)에 있는 케이지 내에서 4일간 적응시키고, 일반적인 식이 초우와 물을 자유롭게 공급하였다. 동물실험 절차는 실험동물사용 및 관리에 관한 한국정부의 지침에 따라 수행되었다. 생체내(in vivo) 실험에서, 밤새 단식시킨 마우스에 0.1% BSA를 함유한 식염수 또는 UCN을 꼬리정맥내로 투여한 다음, 당 분석기(모델 AGM-2100, 올메티쿠스사, 안양, 한국)를 이용하여 시간에 따른 원형질 당을 측정하였다.
STZ-마우스를 준비하기 위하여, 체중이 20-25g이며 8주령된 수컷 ICR(암 연구학회) 마우스를 효창 과학으로부터 구입하였다. STZ에 의해 유도된 당뇨병 마우스는 1일간 단식시킨 수컷 ICR 마우스에 STZ(시그마사, 세인트루이스, MO)(75 mg/kg)를 꼬리정맥내로 투여하여 준비하였고, 다음 날 STZ를 한번 더 투여하였다. 원형질 농도가 280 mg/dl인 마우스를 타입 I 당뇨병을 가진 마우스로 결정하였다. 모든 시험은 STZ 투여 후 3일간 수행하였다.
10-2: 마우스 골격 조직에서 IR 신호전달 분석
밤새 단식시킨 마우스에 작용제(agonist)를 꼬리정맥내로 투여하여 15분 후에 죽인 다음, 가자미근(soleus muscle)을 빠르게 절개하여 액체 질소에서 동결시 켰다. 세포분쇄물은 프로테아제 억제제(0.5 mM PMSF, 1 mg/ml 류펩틴 및 5 mg/ml 이프로티닌) 및 포스파타제 억제제(30 mM NaF, 1 mM Na3VO4 및 30 mM Na4O7P2)를 포함하는 분쇄용액(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤)내에서 상기 조직을 균질화하여 준비하였다. 찌꺼기는 4?, 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 제거하였고, 면역침전 및 웨스턴 블랏은 이전에 기술된 방법으로 수행하였다.
예상대로, 100 pM 이상의 UCN을 단독 처리하면 혈당 수치를 증가시켰으나, 흥미롭게도 0.1 pM의 UCN을 단독 처리하면 혈당 수치를 감소시켰다. 생체내(in vivo) 시스템과 반대로, 혈액내에는 기저(basal) 인슐린이 존재하기 때문에, 본 발명자들은 UCN이 마우스에서 기저 혈중 인슐린을 가짐으로써 당 저해 효능을 가지며, HPA 축은 피코몰 이하의 농도에서는 활성화되지 않을 것이라고 예상하였다. 또한, UCN이 인슐린 분비를 조절할 수 있고, 인슐린에 독립적으로 혈당 수치를 저해할 수 있다는 몇몇 가능성도 있다. 따라서, 본 발명자들은 인슐린-매개 생리학에서 UCN의 기능을 조사하기 위하여, 인슐린-결핍 모델 시스템인 스트렙토조토신(STZ)-처리된 마우스를 이용하였다.
도 14B에 나타낸 바와 같이, UCN을 단독 처리하면 혈당 수치 변화에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 이는 UCN이 혈당 수치 조절에서 인슐린과 독립적으로 작용하지 않음을 의미한다. 그러나, UCN을 비활성 농도의 인슐린과 함께 STZ-마우스에 투여할 경우, 혈당 수치가 현저하게 감소되었다. 이러한 결과는 마우스 골격근에 서의 IR 인산화와 매우 밀접한 관계가 있고, UCN은 마우스 골격근에서 인슐린에 의해 유도된 IR 인산화에 매우 민감하게 반응하였다. 이러한 결과는 유로코르틴 또한 생체내(in vivo)에서 인슐린에 민감한 효능을 가지고 있음을 의미한다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 바이구아나이드제(biguanide) 및 α-글루코시다제 억제제로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 화합물 및 당흡수 조절제로써 리소포스파티딜세린을 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 치료용 약학적 조성물.
  5. 리소포스파티딘산 및 유로코르틴으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 당흡수 조절제를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 치료용 약학적 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함하는, 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 바이구아나이드제(biguanide), 및 α-글루코시다제 억제제로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 화합물을 더욱 포함하는, 약학적 조성물.
  8. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 당흡수 조절제는 인슐린과 혼합하여 사용되는 것인, 약학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 당뇨병은 인슐린-의존형 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus) 또는 인슐린-비의존형 당뇨병(insulin-independent diabetes mellitus)인, 약학적 조성물.
  11. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 당뇨병 합병증은 비만(obesity), 고지혈증(hyperlipidemia), 동맥경화증(arteriosclerosis), 고혈압(hypertension) 또는 심장병(heart disease)인, 약학적 조성물.
  12. 제5항에 있어서, 상기 유로코르틴은 인슐린과 혼합하여 투여되는 것인, 약학적 조성물.
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