KR100963014B1 - 바실러스 스피시스 нｊ171 균주 유래의 신규한 저온성우라실-ｄｎａ 글리코실라제의 제조방법 및 중합효소연쇄반응에서의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 스피시스 HJ171 균주 유래의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 저온성 세균인 바실러스 스피시스 HJ171 (Bacillus sp. HJ171)로부터 분리된 저온성 우라실-DNA 글리코실라제 (uracil- DNA glycosylase)의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열, Bsp HJ171 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 유전자의 대장균 (Escherichia coli) 내에서 발현 및 정제, 이를 통해서 생산된 UDG의 생화학적 특성 및 중합효소 연쇄반응 (PCR)에의 이용에 관한 것이다.

본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 우라실을 포함하고 있는 DNA 기질 내의 우라실 염기를 저온에서 특이적으로 분해하는 활성이 있고 고온에서 쉽게 변성하는 특징이 있어 dUTP를 이용한 PCR 과정 중에서 발생하는 교차 오염 (carry-over contamination)을 쉽게 제거 할 수 있다. 따라서 본 발명의 신규한 Bsp HJ171 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 PCR를 이용한 임상진단 시에 PCR의 정확도, 가성양성의 제거(elimination of false positives) 즉 순도 및 증폭 효율을 증가시키는데 효과적으로 사용될 수 있다.

바실러스 스피시스 HJ171, 우라실-DNA 글리코실라제(UDG), 중합효소 연쇄반 응(PCR)

Description

바실러스 스피시스 НＪ171 균주 유래의 신규한 저온성 우라실-ＤＮＡ 글리코실라제의 제조방법 및 중합효소 연쇄반응에서의 이용 {Manufacturing process of novel heat-labile uracil-DNA glycosylase from Bacillus sp. HJ171 and PCR application of the enzyme}

본 발명은 바실러스 스피시스 HJ171 균주 유래의 저온성 우라실-DNA 글리코실라제의 특성 및 중합효소 연쇄반응에서의 이용에 관한 것이다.

우라실-DNA 글리코실라제 (uracil-DNA glycosylase; 이하 "UDG" 라고 함)는 손상된 DNA를 회복시키는 효소로써 DNA의 손상부위를 인식하여 DNA 내의 우라실 염기와 데옥시리보오스 당 (deoxyribose sugar) 사이의 N-글리코시드 결합을 가수분해하여 DNA 내에서 손상된 염기를 제거한다. UDG는 대장균에서 분리된 것을 시작으로 바실러스 등의 세균에서도 분리되었고, 분자량은 약 25 ~ 35 kDa에 달하며, DNA 내의 염기 중에서 우라실 염기만을 특이적으로 제거하는 기질에 대한 특이성이 있다. [참고문헌: Lindahl, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3649-3653, 1974; Cone, R. et al., Biochemistry 16, 3194-3201, 1977].

우라실(uracil)은 RNA의 염기로서 때때로 DNA 내에서 발견되기도 하는데, 이 는 사이토신이 자연적으로 탈 아미노화 되어 생긴 우라실이 DNA 내로 삽입되거나 DNA 복제 과정 중 dTTP 대신 dUTP가 DNA 내로 잘못 삽입되어 변이가 발생된 것이다. 따라서 DNA 내에 존재하는 아데닌:티민(A:T)이 아데닌:우라실(A:U)의 염기쌍으로 바뀌어 돌연변이 되거나 손상되는 현상이 발생하게 된다. 그러나 상기의 UDG는 RNA 내의 우라실은 제거하지 않고 DNA 내의 우라실 염기만을 특이적으로 제거하여 염기가 제거된 AP (apyrimidinic site) 부위를 만들게 됨으로써 이 부위에 DNA를 수복하는 여러 가지 효소들, 즉 AP 엔도뉴클레이즈, DNA 폴리머레이즈 및 DNA 리가제 등의 작용을 촉진시켜 손상된 또는 변이된 DNA 복구과정이 진행된다[참고문헌: Chen, R. et al., J Gen Virol. 83, 2339-2345, 2002; Lanes, O. et al., Extremophiles 6, 73-86, 2002].

한편, 핵산 증폭 반응 또는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 내열성 세균 유래의 DNA 합성효소를 이용하여 시험관 내에서 특정 핵산 부위를 대량으로 증폭하여 유용한 유전자를 분리하거나 확인하는 기술이다 [참고문헌: Erlich, H. A., J Clin Immunol 9, 437-447, 1989; Shin, H. J. et al., J Microbiol Biotechnol 15, 1359-136, 2005]. 이러한 PCR은 핵산 검출에 필요한 검출한계를 크게 낮추는데 기여하였고, 현재 바이러스, 병원성 세균의 질환을 확인하고 판단하는데 매우 유용하게 사용되고 있다. 그러나 핵산의 농도가 매우 낮은 경우 검출하기 어려운 문제점이 있으며, 반응 효율이 반응기마다 다르게 나타나는 단점이 있다. 특히 임상 진단 시 시료의 오염으로 PCR 반응 후 잘못된 증폭 생산물들을 가성 양성(false positive)으로 판정 내릴 수 있으며, 시료의 선별, 핵산의 분 리 과정, 시료를 옮기는 과정, 시료의 PCR 과정, 시료 보관 및 전기영동 후 시료의 회수 과정 등에서 교차(carry-over) 오염이 발생하기도 한다. PCR 과정에서의 오염 원인은 시료들 간의 교차 오염, 실험실에서의 DNA 오염 및 증폭 생산물들과 이전 PCR들의 프라이머(primer)에 의한 교차오염(carry-over)이 있는데[참고문헌 : Sobek, H. et al., FEBS Lett 388, 1996], 이러한 교차 오염은 극히 미량 일지라도 목적의 시료와 함께 증폭된다면 기존의 PCR 방법으로는 시료의 오염여부를 구별할 수가 없는 문제점이 발생하게 된다.

따라서, 최근 들어 PCR에서 발생하는 교차 오염을 방지하기 위한 방법으로서, dTTP 대신 dUTP를 넣어서 PCR을 수행하는 방법이 롱고(Longo) 등에 의해 제시된 바 있다[참고문헌 : Longo, M. C. et al., Gene 93, 125-128, 1990]. 또한, PCR 개시 전에 시료 내에 주형 DNA와 함께 극소량으로 오염된 우라실 함유 DNA(우라실-DNA)를 제거시키기 위해 UDG를 처리하고, 가열에 의해 UDG를 불활성화 시킨 후, 다시 dTTP 대신 dUTP를 첨가하여 PCR을 수행하는 방법들이 보고된 바 있다[참고문헌 : Udaykumar., et al., Nucleic Acids Res. 21, 3917-3918, 1993; Taggart et al., J. Virol. Methods 105, 57-65, 2002]. 이로 인하여 최근에는 PCR 과정에서 UDG를 처리하거나, UDG를 포함하는 PCR 제품들이 판매되고 있는 추세이다.

그러나 지금까지 PCR에 사용되고 있는 대장균을 비롯한 중온성 UDG는 60℃ 이상의 고온에서 쉽게 실활되지 않고, 활성을 일부 유지하므로 dUTP를 첨가한 PCR에서 증폭된 우라실 염기를 포함하는 DNA 산물이 절단되어 산물이 줄어드는 문제점이 발생된다. 예를들면, 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 이용한 PCR (RT- PCR)의 첫 단계에서 RNA 2차 구조를 풀기위해 역전사 효소의 반응 한계 온도인 55℃ 내지 60℃ 부근에서 반응을 수행하기 때문에 변성되지 않고, 남아있는 중온성 UDG에 의해 dUTP를 첨가한 반응 산물의 양이 현저하게 줄어들어 반응 효율이 감소한다. 따라서, 오염된 dUTP를 포함한 DNA를 제거하기 위해 UDG 처리 후 반드시 가열하여 UDG를 실활시키는 단계를 거치고, 다시 dUTP를 이용하여 PCR을 수행하여야 하는 번거로움이 있다.

최근 들어 UDG로 인해 PCR의 산물이 절단되거나 또는 반응 산물의 양이 감소되는 단점을 보완하여 UDG 처리 후 가열에 의한 UDG를 실활 시키는 별도의 단계를 거치지 않고, 바로 PCR 및 RT-PCR를 수행 할 수 있도록 열에 불안정한 저온성 UDG의 발굴에 관심이 대두되고 있다. 현재까지 보고된 바에 의하면, 저온성 UDG는 해양성 저온균주인 BMTU 3346으로부터 분리된 UDG 밖에 없다[참고문헌 : Jaeger, S. et al., Extremophiles 4, 115-122, 2000]. 결과적으로 다양한 용도로 유용하게 사용되고 있는 PCR의 정확도 및 효율의 증가를 위해 상기의 BMTU 3346 균주로부터 분리된 UDG 외의 새로운 저온성 UDG의 발굴이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 새로운 UDG를 찾으려 연구를 거듭하던 중, 저온성 세균인 바실러스 스피시스 HJ171(Bacillus sp. HJ171)로부터 신규한 UDG를 분리하였고, 상기 UDG가 저온에서 안정한 효소활성을 가지고 있으며, 50℃에서 쉽게 불활성화 되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 중온성 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 사용으로 인한 문제점을 해결하고, UDG 처리 후 가열에 의해 UDG를 실활 시키는 별도의 단계를 거치지 않고 바로 PCR 또는 RT-PCR를 수행 할 수 있도록 열에 불안정한 저온성 UDG를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 저온성 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 발현하는 벡터를 제조하는 단계; 상기 벡터를 숙주세포로 형질 전환시키는 단계; 상기 형질 전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 UDG를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 저온의 dUTP 존재 하에서 PCR 산물의 교차오염을 제거하는 방법을 보여줌으로써, 진단 등의 목적으로 수행되는 PCR에 이용할 수 있는 우수한 저온성 UDG를 제공한다.

본 발명의 저온성 UDG에 따르면, 우라실을 포함하고 있는 DNA 기질 내의 우라실 염기를 저온에서 특이적으로 분해하는 활성이 있고, 고온에서 쉽게 변성하는 특징이 있어 PCR 과정 중에서 발생하는 교차 오염의 제거가 가능하다. 또한, UDG와 dUTP를 이용함으로써 가성양성 제거로 PCR의 정확도를 높이고, 순도 및 증폭 효율을 증가시키는데 효과적이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 스피시스 HJ171 균주 유 래의 신규한 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 아미노산 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 암호화하는 폴리뉴클리오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환 된 세균을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 포함하는 PCR용 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 우라실 염기를 포함하는 DNA 기질 및 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 이용하여 PCR 산물의 교차오염을 제거하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 UDG 유전자를 탐색하기 위하여 저온성 세균을 이용하였다. 이는 상기 저온성 세균이 생산하는 효소는 보통 중온성 세균들이 생산하는 효소와 동일한 기능을 가지고 있으면서 낮은 온도에서 안정하게 효소반응을 수행한다고 알려져 있기 때문이다. 따라서 본 발명자들은 먼저 종래에 알려진 UDG 유전자들의 공통적으로 보존된 부위에 결합하는 프라이머를 제조하고 저온성 세균 바실러스 스피시 스 HJ171의 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 수행함으로써 약 324 bp에 해당하는 DNA 산물을 얻었다. 이후, 상기 증폭된 DNA의 염기서열을 분석한 결과, 기존에 보고된 다른 종의 UDG 유전자의 염기서열과 높은 상동성을 보임을 확인하였다. 따라서 상기 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 증폭된 DNA를 UDG의 완전한 유전자를 얻기 위하여 인버스(inverse) PCR을 수행하였고, 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리된 UDG의 전체 유전자는 총 738 bp의 염기서열과 총 245개의 아미노산으로 이루어져 있었으며, 단백질 분자량이 약 27,218 Da임을 추정할 수 있었다.

이에 본 발명자들은 상기의 방법으로 획득한 UDG 유전자로부터 발현된 UDG 효소의 특성을 규명하기 위하여 먼저 상기 발현벡터(pTBSU)를 클로닝 한 후, 발현용 세균에 형질전환 하였다. 이후, 상기 형질전환 된 세균에서 발현된 UDG 효소를 IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag, BioLabs) 컬럼(column, CN) 시스템을 이용하여 정제한 다음 우라실이 포함된 DNA 기질을 이용하여 UDG 효소 활성을 측정하였고, 그 결과 상기 UDG 효소가 DNA 기질내의 우라실 염기를 분해하는 것을 확인함으로써 UDG 효소 활성을 가지고 있음을 본 발명의 일실시 예에서 확인하였다.

본 발명은 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리한 UDG를 제공한다. 본 발명의 UDG는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기의 기능적 동등물을 포함한다. 여기서 "기능적 동등물"이란, 같은 종 내에서 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과에 의해 아미노산 서열과 적어도 90%이상, 보다 바 람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서, 본 발명의 UDG 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 또한, "실질적으로 동질의 생리활성"은 DNA 내에서 우라실 염기만을 특이적으로 분해하는 활성을 의미한다.

본 발명은 상기 UDG를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 DNA 및 RNA 일 수 있으며, 자연에서 분리되거나 또는 화학적 합성법에 의해 제조될 수 있다. 그러나 바람직하게는 저온성 세균으로부터 분리될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 바실러스 스피시스 HJ171로부터 분리될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 UDG를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 벡터내로 삽입되어 숙주세포를 형질전환 할 수 있다. 여기서, "발현 벡터"는 UDG 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. “작동 가능하게 연결 (operably linked)”된다는 의미는 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 또한, “발현 조절 서열(expression control sequence)”이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로 모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 플라스미드의 예로는 대장균 유래의 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118, pUC119 및 pET-22b(+)), 바실러스 서브틸러스 유래의 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래의 플라스미드 (YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는데 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘 (CaCl₂) 및 열충격 (heat shock) 방법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스터(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기 천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포로는 세균(bacteria)이 바람직하며, 그 예로는 대장균이 있다.

본 발명은 상기 형질 전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하여 신규의 UDG를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 형질 전환된 숙주 세포내에서 본 발명의 UDG를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 상기 형질 전환된 세포를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 형질 전환된 세포가 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 다음, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 후속하여, 상기 형질 전환된 세포에서 발현이 유도된 본 발명의 UDG 단백질의 분리 및 정제는 당 업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포를 용해 한 후, 용해물을 원심 분리하여, 염석 (황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 UDG 단백질을 생산할 수 있다[참고문헌 : Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)].

본 발명은 신규의 UDG를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 제공한다. 상기 PCR용 조성물은 상기의 UDG를 0.5 내지 10 유닛(units)의 농도로 첨가할 수 있으며, 통상적으로 시험관 내에서 특정 핵산 부위를 대량으로 증폭하는 과정에 사용되는 시약으로는 예를 들면 각 종의 중합효소, 서로 다른 뉴클레오티드 트리포스페이드(dNTP), 특정 핵산 부위와 결합하여 이를 증폭할 수 있는 프라이머 및 적절한 완충액 등을 포함 할 수 있다.

상기 중합효소는 각 종에서 분리된 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 및 역전사 효소일 수 있고, 상기 증폭할 수 있는 프라이머는 적절한 완충액 중의 적절한 조건 및 적당한 온도 하에서 주형 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 또한, 상기 PCR 방법은 당업계에 공지된 모든 PCR의 종류일 수 있으며, 효소와 기질 및 PCR 조성물을 한꺼번에 첨가하여 효소반응을 시킨 후 PCR을 수행하는 직접 PCR (direct PCR) 및 역전사 효소를 사용하는 역전사 효소 PCR(reverse transcriptase-PCR)을 포함할 수 있다.

본 발명은 우라실 염기를 포함하는 DNA 기질 및 상기의 UDG를 포함하는 PCR용 조성물을 25∼50℃에서 0∼5분간 반응하는 단계를 포함하는 PCR 산물의 교차오염을 제거하는 방법을 제공한다. 신규의 UDG는 DNA 기질내의 우라실 염기만을 특이적으로 분해하는 활성이 있어 PCR 과정 중에서 발생하는 교차오염을 제거하는 특징이 있다. 상기 교차오염은 PCR을 위한 시료의 선별, 핵산의 분리 과정, 시료를 옮기는 과정, 시료의 PCR 과정, 시료의 보관 및 전기영동 후 시료의 회수과정 등에서 발생하는 오염을 말하는 것이고, DNA 기질에 외부적으로 첨가된 우라실 염기, 사이토신이 자연적으로 탈 아미노화 되어 DNA 내로 삽입된 우라실 염기 및 상기 우라실 염기가 삽입되어 복제된 DNA 내에 존재하는 우라실 염기일 수 있다.

본 발명에 따른 PCR 산물의 교차오염을 제거하는 방법은 우라실 염기가 포함 된 기질 및 상기의 UDG 단백질을 포함하는 PCR용 조성물을 효소활성을 나타내는 25∼50℃에서 0∼5분간 반응한 다음, 당업계에 공지된 방법으로 PCR을 수행함으로써 PCR 산물내의 교차오염을 제거할 수 있다. 또한, 본 발명의 UDG 단백질은 효소 반응 후, 보통 50℃∼60℃의 온도 범위에서 반응하는 대부분의 PCR 과정에서 활성을 잃기 때문에 PCR 산물을 분해하거나 반응 산물의 양이 줄어드는 일을 방지할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 우라실 염기가 포함된 기질 및 본 발명의 UDG 단백질을 포함하는 PCR용 조성물을 25℃에서 5분간 반응시킨 후 PCR을 수행하였고, 또한 25℃에서 5분간 반응시키지 않고도 바로 PCR을 수행하여도 본 발명의 UDG 단백질이 PCR과정 중에 발생하는 교차오염은 줄이고 PCR에는 아무런 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: UDG 유전자의 클로닝

본 발명자들은 저온에서도 활성을 가지는 신규의 UDG 유전자를 탐색하기 위하여 한국 해양연구원으로부터 후진항 해면에서 분리한 저온성 균주 바실러스 스피시스 HJ171의 게놈 DNA를 분양받았다. 이 균주는 16S rRNA를 이용한 계통분류학상 그람 양성 세균 (Gram-positive bacteria)에 속하며 바실러스 스피시스 AH678 (GenBAnk No. AF290561)의 16S rRNA 염기서열과 98% 상동성을 나타내고 있다.

상기 분양 받은 바실러스 스피시스 HJ171 게놈 DNA를 주형으로 하고 기존에 보고된 대장균 (Escherichia coli; E. coli), 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae; Hin), 슈도모나스 데니트리피칸스 (Pseudomonas denitrificans; Pde), 비브리오 파라해몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus; Vpa ) 및 해양성 저온균주인 BMTU 3346의 UDG 유전자 중에서 잘 보존 된 부위의 아미노산(도 1)을 참조하여 서열번호 3 및 4의 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR의 조건은 95℃에서 3분, 94℃에서 1분, 53℃에서 1분 및 68℃에서 1분간 반응 과정을 5회 반응 후 94℃에서 1분, 57℃에서 1분 및 70℃에서 1분간 반응 과정을 25회 반복 수행하였고, 72℃에서 10분간 연장반응 후 반응 산물을 0.8% 아가로스 겔에 전기 영동하여 약 324 bp의 DNA 단편이 증폭되었음을 확인하였다. 또한, QIAquick Gel Extraction 키트(QIAGEN)를 사용하여 상기 1.5% 아가로스 젤에서 이 PCR의 산물들을 정제하였고, 이를 pGEM-T Easy 벡터 시스템 I(프로메가사, 미국)을 이용하여 상기 제조업체의 실험방법에 따라 벡터에 클로닝한 다음 클로닝된 DNA를 마크로젠사에 의뢰하여 염기서열을 결정하여 기존에 알려진 다른 종의 UDG 염기서열과의 유사성을 비교한 결과 높은 상동성을 보임을 확인하였다. 따라서 클로닝된 324 bp의 DNA 단편이 바실러스 스피시스 HJ171의 UDG 유전자의 일부분임을 확인할 수 있었다.

서열번호 3 프라이머(P1-1) : 5'-GGNCARGAYCCNTAYCAYGG-3'

서열번호 4 프라이머(P1-2) : 5'-TTYTTYTGNGCRTGNGMNCCCCA-3'

(상기에서 N은 G, A, T 또는 C 염기일 수 있고, R은 A 또는 G염기일 수 있 으며, Y는 C 또는 T 염기일 수 있으며, M은 A또는 C의 염기일 수 있다)

실시 예 2: UDG의 전체 유전자의 클로닝

상기 실시예 1에서 확보된 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리한 UDG 유전자의 324 bp의 DNA 염기서열을 이용하여 전체 UDG 유전자 클로닝을 인버스 PCR 방법으로 시도하였다. [참고문헌 : Ogasawara, N., et al., DNA Res, 1, 1-14, 1994] 인버스 PCR은 이미 알려진 염기서열을 이용하여 그곳에 연속되어 있으면서 알지 못한 염기서열을 증폭하여 염기서열을 확인하는 방법이다.

먼저, 바실러스 스피시스 HJ171 균주의 게놈 DNA를 제한 효소 HindIII로 완전히 절단하고 페놀 처리한 다음 정제된 DNA 단편 약 1 ㎍을 T₄ DNA 연결효소(ligase) 및 반응완충액을 첨가하여 전체 부피 20 ㎕로 16℃에서 밤새도록 자가연결(self-ligation)시켰다. 이후 상기 연결된 DNA 산물을 주형으로 인버스 PCR을 수행하기 위하여 상기 실시 예 1의 바실러스 스피시스 HJ171 균주로부터 확인된 약 324 bp에 해당되는 UDG의 보존된 유전자의 염기서열을 기본으로 2개의 인터널 프라이머 (internal primer)를 제작하였다(서열번호 5 및 6). 이 2개의 인터널 프라이머와 상기 연결된 DNA 산물을 주형으로 인버스 PCR을 수행하였다. 상기 PCR의 조건은 95℃에서 5분, 94℃에서 45초, 56℃에서 1분 및 72℃에서 1분 30초간 반응 과정을 30회 반복 수행하였고, 72℃에서 10분간 연장반응 후 반응 산물을 0.8% 아가로스 겔에 전기 영동하여 약 738 bp의 DNA 단편이 증폭되었음을 확인하였다. 상기 PCR 산물은 마크로젠사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. DNASTAR프로그램을 이 용하여 DNA 염기서열을 분석하여 전체 UDG 유전자의 염기서열을 밝혔으며, 또 NCBI 프로그램 (NCBI BLAST program)을 이용하여 사이크로박터 크리오할로렌티스(Psychrobacter cryohalolentis) K5 , 아시네토박터 스피시스(Acinetobacter sp.) ADP1, 아조토박터 비네란디(Azotobacter vinelandii) AvOP , 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 및 대장균 균주의 UDG 유전자의 염기서열과 유사성을 비교하였다.

인터널 프라이머 서열

서열번호 5 프라이머(P2-1): 5'-CCCATTGCCTGCCCTGGTC-3'

서열번호 6 프라이머(P2-2): 5'-GATGTGGTTAATGAACAAACAGAA-3'

그 결과, 상기 바실러스 스피시스 HJ171 균주로부터 분리된 UDG 유전자의 전체 염기서열은 개시코돈(ATG)에서 정지코돈(TAG)을 포함하여 총 738 bp로 이루어져 있었으며(서열번호 1참조), 총 아미노산은 245개로 이루어져 있었다(서열번호 2참조). 상기 아미노산의 서열로 본 발명의 UDG 효소의 분자량이 약 27,218 Da인 것을 추정할 수 있었다.

또한, 도 2에서 보는 바와 같이 바실러스 스피시스 HJ171(Bsp) 균주로부터 분리된 본 발명의 UDG 유전자의 아미노산서열과 다른 균주 유래의 UDG 유전자의 아미노산서열을 비교한 결과, 사이크로박터 크리오할로렌티스 K5 (Pcr)의 UDG와 89.8%, 아시네토박터 스피시스 ADP1 (Asp)의 UDG와 62.4%, 아조토박터 비네란디 AvOP (Avi)의 UDG와 51.4%, 바실러스 서부틸리스 (Bsu)의 UDG와 46.5% 및 대장균 (Eco)의 UDG 는 46.1%의 서열 상동성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 특히 UDG의 활성에 관여하는 중요한 아미노산으로 알려져 있는 D (아스파르트산, Asp), N (아스파라긴, Asn) 및 H (히스티딘, His)의 세 가지 아미노산이 잘 보존되어 있다[참고문헌 : Sartori, A. A. et al., EMBO J 21, 3182-3191, 2002]. 따라서 잘 보존된 D (Asp) 85번째와 H (His) 207번째를 포함한 모티프 A와 모티프 B 영역을 확인 하였다.

실시 예 3: 재조합 UDG의 발현

바실러스 스피시스 HJ171 게놈 DNA를 NdeI과 XhoI이 인위적으로 삽입된 서열번호 7 및 8 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭한 UDG 유전자 산물을 NdeI과 XhoI으로 절단한 후, 1.2% 아가로즈 겔에 전기 영동하여 735 bp 단편 (정지코돈 제외)의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 유전자를 분리하였다. 이렇게 분리한 DNA 단편을 NdeI과 XhoI 제한효소들로 절단하여 정제하였다. 또한, T7 프로모터를 가지는 발현 벡터 pTYB1의 복수 클로닝부위(multiple cloning site; MCS)를 동일한 NdeI과 XhoI으로 절단하여 정제하였다. NdeI과 XhoI으로 절단된 pTYB1 벡터와 NdeI과 XhoI으로 절단된 735 bp의 UDG 유전자를 적당량씩 혼합한 후 T₄ DNA 연결효소를 이용하여 16℃에서 하룻밤 동안 연결반응을 시켜 발현 벡터 pTBSU를 구축하였다(도 3 참조). 참고로 pTYB1 벡터 (뉴잉글랜드 바이오랩스, 미국)는 7,477 bp로 T7 프로모터 다음에 복수 클로닝사이트 (MCS), Sce VMA 인테인(intein) 및 CBD(chhitin binding domain)의 순서로 배열되어 있다. 따라서 pTYB1 벡터에 UDG 유전자가 삽입되어 발현되면 Sce VMA 인테인 및 CBD가 함께 융합된 거대분자로 만들어진다. 상기 반응으 로 구축된 pTBSU가 들어 있는 반응액을 이용하여 대장균 BL21 (DE3)에 Hanahan 방법으로 형질전환 시켰다[참고문헌 : Hanahan, D. et al., Gene 10, 63-67, 1982]. 이후 형질전환된 균주를 100 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 암피실린이 첨가된 LB 플레이트에서 생육한 형질전환체들을 다시 소량 배양하여 플라스미드 pTBSU를 분리하여 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단한 후 1.2% 아가로즈 겔에 전기 영동하여 735 bp 단편의 UDG 유전자를 확인함으로써 정상적인 발현벡터 pTBSU가 구축됨을 확인하였다. 상기와 같이 구축된 pTBSU를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환시킨 균주 (Escherichia coli BL21 (DE3) / pTBSU)를 경기도 수원시 권선구 서둔동 소재의 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터에 2007년 9월 12일자로 기탁번호 KACC95065P로서 기탁하였다.

서열번호 7 프라이머 (P3-1) :

5'-ACATCATATGGAATTATTCGATGAACAAACGC-3'

NdeI

서열번호 8 프라이머 (P3-2) :

5'-TTGACTCGAGTTGCGGTAATTGCCAATCGATAG-3'

XhoI

실시 예 4: UDG 효소의 정제

상기 실시 예 3의 방법에 의해 대장균에 형질 전환시킨 재조합 균주 로부터 상기의 UDG 효소를 융합단백질로 발현시키고 발현된 융합단백질로부터 본 발명의 UDG 만을 절단하여 정제하기 위하여 아래와 같이 실시하였다. 상기 실시 예 3에서 재조합 플라스미드를 가지고 있는 대장균 BL21 (DE3)를 100 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 브로스 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 8 ㎖를 같은 배지 800 ㎖에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도가 0.6정도가 되었을 때, IPTG의 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 첨가한 다음 20℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 6,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 균체를 회수하고 1 mM PMSF가 포함된 25㎖의 초음파처리 완충액 (sonication buffer) (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mM NaCl)에 현탁하여 초음파로 파쇄한 후 18,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 대장균 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 이후 모든 과정은 발현된 재조합 융합단백질로부터 UDG 효소를 절단하고 동시에 UDG 만을 정제하기 위하여 4℃에서 아래와 같이 실시하였다.

침전물을 제거하고 상층만을 취한 세포 파쇄액을 친화성 컬럼(affinity column)인 IMPACT-CN에 로딩 (loading)하여 컬럼에 용합 단백질만을 결합시킨 다음 컬럼 세척 완충액 (column washing buffer) [20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA]로 컬럼의 10 배로 세척하고, 인테인에 의한 융합 단백질의 절단을 위해 분할 완충액 (cleavage buffer) (50 mM DTT가 첨가된 컬럼 세척 완충액)를 컬럼에 채워 하룻밤 동안 방치 시킨다. 후속하여, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA가 첨가된 용리 완충액(elution buffer)으로 세척함으로써 본 발명의 UDG 효소만 분리하고, 본 발명의 UDG 활성을 나타내는 분획물을 모아 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)와 50 mM KCl이 첨가된 완충액으로 투석시켰다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 재조합 플라스미드 pTBSU에서 바실러스 스피시스 HJ171 균주로부터 분리한 UDG를 정제하였다. 도 4의 레인(lane) M은 저분자량 마커 (low-molecular-mass markers), 레인 1은 발현을 유도하지 않은 전체 세포질 분획, 레인 2는 발현을 유도한 전체 세포질 분획, 레인 3은 IMPACT-CN 시스템을 통해 정제한 분획을 나타낸 것이다. 도 4의 레인 2에서 융합단백질의 분자량은 약 86,000 Da으로 발현되었으며, 레인 3에서는 IMPACT-CN 시스템을 거치면서 인테인 절단에 의한 키틴 결합 단백질 (chitin binding protein) 부분이 제거된 약 27,000 Da의 분자량으로 나타났다. 이는 본 발명 UDG의 DNA 서열을 환산한 분자량 27,218 Da과 거의 일치하였고, 정제된 효소의 특이적 활성도(specific activity)는 3,111 U/mg임을 확인하였다.

실시 예 5: UDG의 활성 측정 및 정제수율

본 발명의 UDG의 효소활성 측정은 레인즈(Lanes) 등의 방법[참고문헌 : Secades, P., et al., FEMS Microbiol. Lett. 226, 273-279, 2003]을 이용하여 PCR 기술에 의한 인위적인 [³H]-UMP DNA 기질을 제조하고 이를 이용하여 측정하였다.

<5-1> PCR에 의한 기질 제조

상기 실시 예 4에서 정제된 본 발명의 재조합 UDG 효소의 활성을 측정하기 위하여 약 1.8 kb DNA 단편(Staphylothermus marinus DNA ligase gene)을 주형과 프라이머(서열번호 9, 서열번호 10)를 이용하여[참고문헌 : Seo, M. et al., J. Biotech. 128, 519-530, 2007], PCR 기술에 의한 우라실-DNA 기질을 제조하였다. PCR (100 ㎕) 혼합물 조성은 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 최종농도 0.1 mM씩 각각 첨가하였고, dUTP내에는 약 2.0 μΜ의 데옥시[5-³H] 우리딘 -5- 트리포스페이트([³H]-dUTP) (5-30 Ci/mmol, GE 헬스케어, 코드번호.TRK351)가 포함되었으며, 700 pg 주형 DNA, 20 pmol PCR 프라이머 , 5U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제 (렉스진바이오텍사)와 1X 수퍼 텍 완충액 II를 사용하였다. PCR은 94℃에서 50초, 60℃에서 1분, 72℃에서 3분 30초로 30회 실시하였다. 증폭된 [³H]-dUTP DNA 기질을 NAP-5 컬럼 (아머샴사)을 이용하여 미반응 [³H]-dUTP를 제거하였다. 기질의 특이적 활성도는 약 13,900 cpm/㎕이다.

서열번호 9 프라이머(P4-1)

: 5'-AGGATTACATATGGCTGCACAGCAGAGCGAA-3'

서열번호 10 프라이머(P4-2)

: 5'-ATAACTCGAGTTCAGATAATTTCTTTAGTTGTCTTTT-3'

<5-2> UDG의 활성측정

본 발명에 따른 UDG의 기본적인 활성 측정방법으로 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 100 ㎍/㎖ BSA, 1 mM DTT, [³H]-dUTP DNA 기질 5 ㎕ (69,500 cpm), UDG 효소 1 ㎕를 사용하였고 최종 20 ㎕ 용액으로 하였다. 반응 혼합액을 25℃ 10분간 반응시킨 후, 얼음 속에서 얼음-냉각 단일가닥 송아지-흉선(ice-cold single-stranded calf-thymus) DNA (1 mg/㎖) 20 ㎕와 200 ㎕의 25% (w/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 첨가하였다. 얼음 속에서 15분간 방치한 후 13,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후, 산-용융성(acid-soluble) [³H]-우라실을 함유하는 상층 120 ㎕를 회수하여 Beckman LS 6800 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 측정하였다. UDG의 1 유닛은 25℃에서 1분간 기질로부터 1 pmol [³H]-우라실 유리하는 효소량으로 정하였다.

본 발명에서 800 ㎖의 LB 브로스에서 배양한 재조합균주를 회수하여 균체를 파쇄한 후 친화성 컬럼인 IMPACT-CN을 이용하여 절단, 정제한 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 총 활성은 5,600 U이며 특이적 활성도는 3,111 U/mg 이다.

<5-3> 최적활성 pH의 결정

본 발명의 UDG 효소의 최적 활성 pH를 결정하기 위하여 pH 5.5 내지 9.0의 범위에서 0.5의 간격으로 pH를 달리하면서 상기 <5-2>에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 UDG 효소의 활성을 측정하였다. 이때, pH 5.5 내지 6.5의 범위에서는 50 mM 매스-수산화나트륨 (MES-NaOH) 완충용액을 사용하였으며, pH 6.5 내지 7.5의 범위에서는 50 mM 몹스-수산화나트륨 (Mops-NaOH) 완충용액을 사용하였고, pH 7.5 내지 9.0의 범위에서는 50 mM Tris-HCl 완충용액을 사용하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 UDG 효소의 활성도는 pH 7.5 내지 8.5에서 높게 나타나고 있음을 확인함으로써 상기 pH 7.5 내지 8.5의 범위가 본 발명에 따른 효소의 최적 pH 범위임을 알 수 있었다. 특히, Tris-HCl 완충용액을 사용한 pH 8.0에서 효소의 활성이 가장 높게 나타났다. 반면 pH 7.0 이하에서는 본 발명의 UDG 효소의 활성도가 급격히 감소하는 것으로 나타났다.

<5-4> 최적 온도의 결정

본 발명에 따른 UDG 효소의 최적 온도를 측정하기 위해 10℃ 내지 80℃까지의 온도범위에서 5℃ 내지 10℃간격으로 반응 온도를 다양하게 하면서 상기 <5-2>에서 수행한 UDG 효소의 활성측정 방법과 동일한 방법으로 효소반응의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 UDG 효소의 최적 반응 온도는 25℃인 것으로 나타났으며, 특히, 30℃ 이후부터는 효소의 활성이 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 현재까지 가장 많이 사용되고 있는 대장균의 UDG 효소 및 기존에 알려진 다른 중온성 UDG 효소들이 60℃ 이상의 고온에서도 활성을 가지고 있는 것에 비해서 본 발명의 UDG 효소는 50℃ 이하에서도 쉽게 불활성화 됨을 확인 하였다.

<5-5> 열 안정성 측정

본 발명에 따른 UDG 효소의 열 안전성을 측정하기 위해 상기 <5-2>의 반응 혼합액을 40℃ 및 50℃에서 반응시키면서 각 시간별 (0, 1, 2, 3, 4, 5 및 10분)로 시료를 채취하여 상기 <5-2>에서 수행한 UDG 효소의 효소 활성 측정 방법과 동일한 방법으로 효소반응의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 UDG 효소를 40℃ (●) 및 50℃ (○)에서 5∼10분간 반응시켰을 때 40℃에서 2분에 50% 정도 활성을 유지하는 것을 알 수 있었고, 50℃에서는 효소의 열 안전성이 급격히 감소하여 5분 이 내에 활성이 거의 0에 가깝게 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 UDG 효소는 기존에 알려진 대장균의 UDG 효소가 60℃ 이상에서도 활성을 가지고 있는 것에 비해 50℃ 이하에서도 쉽게 활성을 잃어버린다는 것을 다시 확인 할 수 있었다.

<5-6> 최적 NaCl과 KCl 결정

본 발명에 따른 UDG 효소의 최적 NaCl (●)과 KCl (○)을 측정하기 위해 0 ~ 200 mM 까지의 범위에서 25 mM 간격으로 농도를 다양하게 하면서 상기 <5-2>에서 수행한 UDG 효소의 활성측정 방법과 동일한 방법으로 효소반응의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 UDG 효소의 최적 NaCl과 KCl은 25 mM인 것을 확인할 수 있었다.

실시 예 6: 본 발명의 UDG의 PCR 응용

<6-1> PCR에 의한 0.5 kb 우라실-DNA와 1 kb DNA 기질 제조

본 발명 UDG 효소를 PCR에 응용하기 위해서는 우라실-DNA만 분해시키는 기질의 특이성과 가열에 의해 쉽게 실활 되는 특성을 갖는 것이 필요하다.

우선 PCR를 이용하여 람다 DNA를 주형으로 0.5 kb 우라실-DNA (오염 DNA) 기질 및 1 kb DNA (정상 DNA) 기질 2종류 기질을 제조하였다. 0.5 kb 우라실-DNA 기질과 1 kb DNA 기질의 증폭을 위하여 프라이머 서열번호 11, 12, 13와 14의 프라이머들을 각각 합성하였다. 먼저 0.5 kb 우라실-DNA 기질 합성을 위한 PCR 조건은 다음과 같다. 50 ㎕의 PCR 혼합물로 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 최종농도가 0.2 mM씩 되도록 각각 첨가하였고, 10 pg의 람다 DNA, 서열번호 11와 12로 각각 표시되는 프라이머 각각 10 pmol, 2.5 U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제 및 1X 수퍼 텍 완충액 II를 첨가하였다. PCR은 94℃에서 50초, 58℃ 1분 및 72℃ 1분 30초를 30회 반복 실시하였다. 가능한 DNA의 혼입을 줄이기 위해 이렇게 증폭된 우라실-DNA를 소량 취해서 동일한 방법으로 증폭하였다. 1 kb DNA 기질 합성을 위한 PCR 조건은 서열번호 13과 서열번호 14의 프라이머를 각각 첨가하였고, dUTP를 첨가하는 대신에 dTTP를, 수퍼 텍 DNA 폴리머라제 대신 수퍼 텍 플러스 DNA 폴리머라제를 첨가한다는 조건 외에는 상기의 0.5 kb 우라실-DNA 기질 합성 방법과 동일하다. 후속하여, 2 종류의 기질을 PCR로 제조한 다음 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 순수 분리하여 각각의 기질로 사용하였다.

① 0.5 kb 프라이머

서열번호 11 프라이머 (P5-1)

: 5'-AATAACGTCGGCAACTTTGG-3'

(람다 게놈 서열 NO. 14074-14093)

서열번호 12 프라이머 (P5-2)

: 5'-GTTACGCCACCAGTCATCCT-3'

(람다 게놈 서열 NO. 14556-14575)

② 1 kb 프라이머

서열번호 13 프라이머 (P6-1)

: 5'-CAAAGGCGGTTAAGGTGGTA-3'

(람다 게놈 서열 NO. 20791-20810)

서열번호 14 프라이머 (P6-2)

: 5'-GGCTGTACCGGACAATGAGT-3'

(람다 게놈 서열 NO. 21768-21787)

<6-2> 간접 (Indirect) PCR

정제된 본 발명의 UDG가 인위적으로 오염시킨 0.5 kb 우라실 함유DNA (오염 DNA)와 1 kb DNA (정상 DNA)가 혼합된 혼합기질에서 1kb DNA만을 선택적으로 증폭가능한지 확인하였다. 간접 PCR은 기질을 UDG 와 반응시켜 기질에 오염된 우라실-DNA를 분해시킨 후, PCR을 수행한 것으로, 상기 <6-1>에서 제조한 0.5 kb 우라실-DNA (1 pg/㎕) 기질과 1 kb DNA (10 pg/㎕) 기질을 각각 1:10으로 혼합시킨 혼합기질, 1 U의 본 발명의 UDG와 대장균 UDG 및 1X 수퍼 텍 완충액 II를 먼저 혼합하고, 이들 혼합용액을 25℃에서 5분간 인큐베이션 (incubation)시켜 UDG에 의해 우라실-DNA를 분해시킨 다음, 95℃에서 10분간 열처리하여 UDG를 불활성화 시켰다. 여기에 0.25 mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP, 5 pmol 프라이머 및 1 U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제를 첨가하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR은 94℃에서 50초, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초를 20회 반복 수행하였고, PCR 산물은 0.8% 아가로스 겔에 전기 영동하여 확인하였다.

그 결과, 도 9의 A에 나타낸 바와 같이, 오염된 0.5 kb 우라실-DNA는 분해되어 밴드(band)가 나타나지 않았고, 정상적인 1 kb DNA만 증폭되어 밴드로 확인 할 수 있었다. 이는 저온에서도 UDG가 작용하여 오염된 우라실-DNA를 확실히 제거한다는 것을 알 수 있다.

도 9에서 레인 1은 본 발명의 UDG를 첨가한 것, 레인 2는 대장균 UDG를 첨가한 것이며, 레인 M은 1 kb ladder 마커, 레인 C는 대조군에 UDG를 첨가하지 않은 것이다.

<6-3> 직접 (Direct) PCR

본 발명의 UDG로 별도의 인큐베이션 과정이 없이도 오염된 0.5 kb 우라실-DNA 기질을 분해 할 수 있는지 알아보기 위해 직접 (direct) PCR을 수행하였다. 직접 PCR은 UDG와의 별도의 인큐베이션 과정 없이 바로 PCR을 수행하는 것으로, 상기 <6-2>의 간접 PCR과 기본적으로 동일하게 혼합된 PCR 혼합물을 사용하되, 모든 혼합물들을 PCR 튜브에 함께 넣어서 UDG의 25℃에서의 인큐베이션 과정과 95℃에서의 실활 과정 없이 바로 PCR을 수행하였다. PCR은 상기 <6-2>의 조건과 동일하게 수행하였고, PCR 산물은 0.8% 아가로스 겔에 전기 영동하여 확인하였다.

그 결과, 도 9의 B에 나타낸 바와 같이, 1 kb DNA 밴드만 증폭되어 나타나고 오염된 0.5 kb 우라실함유 DNA는 분해되어 밴드가 전혀 나타나지 않았다. 이는 4℃ 얼음 내에서 PCR의 반응물들을 혼합하는 동안에도 효소가 작용하여 분해한다는 것을 의미한다. 그러나 밴드의 농도가 본 발명의 UDG를 처리한 것에서 더 높게 관찰되는 것으로 보아, 정상적인 1 kb DNA PCR 증폭 효율에서는 본 발명의 Bsp HJ171 UDG가 대장균 UDG보다 훨씬 높다는 것을 알 수 있다. 이러한 현상은 대장균의 UDG가 본 발명의 UDG보다 내열성을 갖기 때문에 dTTP 대신 dUTP를 사용하여 수행한 PCR의 초기 과정에서 우라실 함유 PCR 산물들을 분해하기 때문에 PCR 사이클 수가 증가하면 증가 할수록 PCR 산물의 차이가 나타나는 것으로 고려된다. 따라서, 95℃에서 UDG의 활성을 완전히 실활시킨 간접 PCR에 비해 아무 처리 없이 바로 PCR을 수행한 직접 PCR에서 1 kb DNA의 증폭 효율이 더욱 떨어지는 것을 확인 할 수 있다.

결과적으로 dTTP 대신에 dUTP를 이용한 PCR 과정에서 본 발명의 UDG를 함께 사용한다면 우라실-DNA의 교차오염도 없앨 수 있을 뿐만 아니라, 목적의 DNA (정상 DNA)도 높은 효율로 증폭 가능하여 정확한 결과를 얻을 수 있기 때문에 임상진단에 적합한 효소라고 사료된다.

<6-4> 오염된 기질의 농도별 PCR

본 발명의 UDG가 어느 농도만큼의 오염된 DNA를 제거할 수 있는지 알아보기 위해 상기 <6-2>와 <6-3>의 간접 PCR과 직접 PCR의 방법과 동일한 방법으로 0.5 kb 우라실-DNA(오염 DNA)의 농도만 달리하여 PCR을 수행하였다. 10 pg의 1 kb DNA (목적 DNA)에 0.1 pg에서 10ng까지의 0.5 kb 우라실-DNA를 농도별로 혼합하여 혼합 기질을 제조한 후, 상기 반응과 동일하게 PCR을 수행하여 0.8% 아가로스 겔에 전기 영동하여 확인하였다.

그 결과, 도 10의 A에 나타낸 바와 같이 간접 PCR에서는 0.1 pg에서 10 ng까지의 0.5 kb 우라실-DNA가 포함된 혼합물에서는 0.5 kb 우라실-DNA를 모두 분해하여 밴드가 나타나지 않았고, 1 kb DNA는 UDG를 처리하지 않은 대조군과 동일한 농도로 증폭되어 밴드를 확인할 수 있었다.

또한, 도 10의 B에 나타낸 바와 같이, 직접 PCR에서는 0.1 pg에서 100 pg까지의 0.5 kb 우라실-DNA가 포함된 혼합물에서는 0.5 kb 우라실-DNA가 완전히 분해하여 밴드가 나타나지 않았지만, 1 ng과 10 ng의 0.5 kb 우라실-DNA가 포함된 혼합물에서는 0.5 kb 우라실-DNA가 완전하게 분해되지 않아 약한 밴드를 나타냈다.

도 10의 레인 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 각각 0.1 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng 및 10 ng의 0.5 kb 우라실-DNA가 포함된 주형에 본 발명의 UDG를 첨가한 것이고, 레인 M은 1 kb ladder 마커, 레인 C는 대조군에 UDG를 첨가하지 않은 것이다.

이에 따라 본 발명의 UDG는 간접 PCR에서 10 ng 이상의 오염 DNA를 분해할 수 있어 1 kb DNA의 1000배 이상이 함유된 오염 DNA (0.5 kb 우라실-DNA)를 완벽히 제거하였고, 직접 PCR에서는 100 pg까지만 오염 DNA를 완벽하게 분해하여 1 kb DNA의 10배 이상으로 오염된 오염 DNA (0.5 kb 우라실-DNA)를 완벽하게 제거할 수 있는 것을 알 수 있다. 하지만, 실제로 병원에서 진단 등의 목적으로 PCR이 수행되는 경우, 오염되는 시료의 양이 극소량이고, 얻고자 하는 DNA의 농도에 비해 수십 내지 수백 배 낮은 농도의 양이 오염된다. 따라서 본 발명의 UDG를 함께 사용하여 PCR을 수행한다면, PCR 과정 중에서 오염되는 우라실-DNA를 충분히 제거할 수 있을 것이며 이에 따라 PCR에서 발생하는 교차오염을 확실히 막을 수 있을 것이다.

본 발명은 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리한 저온성 DNA 수복효소인 Bsp HJ171의 UDG를 제조하는 방법을 제공함으로써 우수한 저온성 UDG를 대량 생산하여 원가 절감 효과를 얻을 수 있다. 또한 유전공학 및 분자생물학 실험, 임상 진단, 법의학적 연구 등에 이용되어 질 수 있다. 특히 진단 등의 목적으로 수행할 경우 PCR 및 RT-PCR의 효율 및 정확성을 높일 수 있고, 국내 개발로 인해 일반 PCR 및 RT-PCR 제품의 수입대체 효과 및 신 물질 창출이 가능하다.

도 1은 대장균, 해모필루스 인플루엔자, 슈도모나스 데니트리피칸스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 해양성 저온균주인 BMTU 3346의 아미노산 서열에서 공통적으로 보존된 부분에 해당하는 아미노산 서열이다.

도 2은 본 발명의 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리한 UDG (Bsp)의 전체 유전자의 아미노산 서열과 사이크로박터 크리오할로렌티스 K5(Pcr), 아시네토박터 스피시스 ADP1(Asp), 아조토박터 비네란디 AvOP (Avi), 바실러스 서브틸리스(Bsu) 및 대장균(Eco) 균주의 UDG 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

도 3는 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리한 UDG 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드 pTBSU의 구축 과정이다.

도 4는 대장균에서 발현된 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리한 UDG의 정제단계에 따른 정제상태를 변성 겔 전기영동 (SDS-PAGE)로 확인한 결과이다.

도 5는 정제된 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리한 UDG의 pH에 따른 활성 정도를 도시한 것이다.

도 6은 정제된 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리한 UDG의 온도에 따른 활성의 정도를 도시한 것이다.

도 7은 정제된 바실러스 스피시스 HJ171균주로부터 분리한 UDG 효소를 40℃ (●) 및 50℃ (○)에서 열처리에 따른 영향을 도시한 것이다.

도 8은 정제된 바실러스 스피시스 HJ171 균주로 유래한 UDG의 NaCl (●) 및 KCl (○) 농도에 따른 효소 활성을 도시한 것이다.

도 9의 A는 1 kb DNA와 0.5 kb 우라실-DNA로 인위적으로 오염시킨 주형을 본 발명에 따른 UDG 및 대장균의 UDG를 첨가하여 25℃에서 5분간 반응시키고 95℃에서 10분간 불활성화 시킨 후 PCR하여 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 결과이다.

도 9의 B는 1 kb DNA와 0.5 kb 우라실-DNA로 인위적으로 오염시킨 주형을 본 발명에 따른 UDG 및 대장균의 UDG를 각각 첨가하여 25℃에서 반응시키지 않고 바로 PCR하여 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 결과이다.

도 10의 A는 1 kb DNA에 0.5 kb 우라실-DNA를 0.1 pg에서 10 ng까지 농도별로 인위적으로 오염시킨 주형을 본 발명의 UDG를 첨가하여 25℃에서 5분간 반응시키고 95℃에서 10분간 불활성화 시킨 후 PCR하여 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 결과이다.

도 10의 B는 1 kb DNA에 0.5 kb 우라실-DNA를 0.1 pg에서 10 ng까지 농도별로 인위적으로 오염시킨 주형을 본 발명의 UDG를 첨가하여 25℃에서 반응시키지 않고 바로 PCR하여 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 결과이다.

도 11은 바실러스 스피시스 HJ171 균주의 UDG의 염기서열 및 아미노산서열을 포함한 서열들이다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Manufacturing process of novel heat-labile uracil-DNA glycosylase from Bacillus sp. HJ171 and PCR application of the enzyme <130> IPM-34546 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 735 <212> DNA <213> Uracil-DNA glycosylase from Bacillus sp. HJ171 <400> 1 atggaattat tcgatgaaca aacgccaaaa acgccagcgc aaaaacaagc aattttagac 60 aatgtgcgct tgccagaaga ttggaaaacg gcgttagcag acgagttaac ttctaacaat 120 atggacgact tgcgtgcgtt tttaaaagaa gcctatcaat cagaaaacag tatctatccg 180 ccagcacctt taatatttaa tgcgttaaac ctgacccctt tatcacaaat taaagtcgtg 240 atactagggc aggatccgta tcatggacca gggcaggcaa tgggcttatc gttttcagtg 300 cccaaagtca ttccaaagcc accctcactc aataatttgt taaaagagat ggcaagtgac 360 gttggtatcg caccctcaaa acatggcgac ctgacttact gggcgcagca aggagttttg 420 ctattaaata gctctctgac cgtgcgagaa agtgagccaa atagccatca aaataaaggt 480 tgggagcagt ttaccgatgc ggtgattgat gtggttaatg aacaaacaga acataccgta 540 tttatattgt ggggctctca tgcacaaaaa agcaaatata tcaatactga taagcatctt 600 attctcaccg ctgtacaccc atcaccacta gctgccaatc gtggtggatt ctttggttcc 660 aagccgtttt ctaagaccaa tgattatctg gtacagtatg ggcaaacgcc tatcgattgg 720 caattaccgc aatag 735 <210> 2 <211> 244 <212> PRT <213> Uracil-DNA glycosylase from Bacillus sp. HJ171 <400> 2 Met Glu Leu Phe Asp Glu Gln Thr Pro Lys Thr Pro Ala Gln Lys Gln 1 5 10 15 Ala Ile Leu Asp Asn Val Arg Leu Pro Glu Asp Trp Lys Thr Ala Leu 20 25 30 Ala Asp Glu Leu Thr Ser Asn Asn Met Asp Asp Leu Arg Ala Phe Leu 35 40 45 Lys Glu Ala Tyr Gln Ser Glu Asn Ser Ile Tyr Pro Pro Ala Pro Leu 50 55 60 Ile Phe Asn Ala Leu Asn Leu Thr Pro Leu Ser Gln Ile Lys Val Val 65 70 75 80 Ile Leu Gly Gln Asp Pro Tyr His Gly Pro Gly Gln Ala Met Gly Leu 85 90 95 Ser Phe Ser Val Pro Lys Val Ile Pro Lys Pro Pro Ser Leu Asn Asn 100 105 110 Leu Leu Lys Glu Met Ala Ser Asp Val Gly Ile Ala Pro Ser Lys His 115 120 125 Gly Asp Leu Thr Tyr Trp Ala Gln Gln Gly Val Leu Leu Leu Asn Ser 130 135 140 Ser Leu Thr Val Arg Glu Ser Glu Pro Asn Ser His Gln Asn Lys Gly 145 150 155 160 Trp Glu Gln Phe Thr Asp Ala Val Ile Asp Val Val Asn Glu Gln Thr 165 170 175 Glu His Thr Val Phe Ile Leu Trp Gly Ser His Ala Gln Lys Ser Lys 180 185 190 Tyr Ile Asn Thr Asp Lys His Leu Ile Leu Thr Ala Val His Pro Ser 195 200 205 Pro Leu Ala Ala Asn Arg Gly Gly Phe Phe Gly Ser Lys Pro Phe Ser 210 215 220 Lys Thr Asn Asp Tyr Leu Val Gln Tyr Gly Gln Thr Pro Ile Asp Trp 225 230 235 240 Gln Leu Pro Gln <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer, P1-1 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G, A, T or C <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> A or G <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> C or T <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G, A, T or C <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> C or T <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> C or T <400> 3 ggncargayc cntaycaygg 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer, P1-2 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> C or T <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C or T <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> G, A, T or C <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A or G <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> G, A, T or C <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A or C <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> G, A, T or C <400> 4 ttyttytgng crtgngmncc cca 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal primer: P2-1 <400> 5 cccattgcct gccctggtc 19 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal primer: P2-2 <400> 6 gatgtggtta atgaacaaac agaa 24 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P3-1 <400> 7 acatcatatg gaattattcg atgaacaaac gc 32 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P3-2 <400> 8 ttgactcgag ttgcggtaat tgccaatcga tag 33 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P4-1 <400> 9 aggattacat atggctgcac agcagagcga a 31 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P4-2 <400> 10 ataactcgag ttcagataat ttctttagtt gtctttt 37 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P5-1 <400> 11 aataacgtcg gcaactttgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P5-2 <400> 12 gttacgccac cagtcatcct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P6-1 <400> 13 caaaggcggt taaggtggta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P6-2 <400> 14 ggctgtaccg gacaatgagt 20

Claims (11)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 바실러스 스피시스 HJ171(Bacillus sp. HJ171)의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG).
2. 제1항의 UDG를 암호화하는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
3. 제2항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 UDG 폴리뉴클레오티드.
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바실러스 스피시스 HJ171 로부터 분리된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
5. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 도 3의 재조합 벡터 pTBSU.
6. 제5항의 벡터로 형질 전환된 세균.
7. 제6항의 형질 전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하는 제1항의 UDG를 생산하는 방법.
8. 제1항의 UDG를 포함하는 PCR용 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 UDG의 유닛이 0.5 내지 10의 농도인 것을 특징으로 하는, PCR용 조성물.
10. 우라실 염기를 포함하는 DNA 기질 및 제1항의 UDG를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 10 내지 50℃에서 반응하는 단계를 포함하는 PCR 산물의 교차오염을 제거하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 단계는 10 내지 25℃에서 반응하는 것을 특징으로 하는, PCR 산물의 교차오염을 제거하는 방법.

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