KR100955502B1

KR100955502B1 - 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와 특이적으로 반응하는펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR100955502B1
Application number: KR1020070123380A
Authority: KR
Inventors: 최강석; 이은경; 전우진; 윤은임; 권준헌
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2007-11-30
Publication date: 2010-04-30
Also published as: US20100261206A1; US8114408B2; KR20090056294A

Abstract

본 발명은 조류에서 병원성 뉴캐슬병 바이러스 특이 항원부위의 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩타이드 절편에 관한 것으로, 보다 상세하게는 병원성 뉴캐슬병 바이러스 F 단백질의 분절 부위에 존재하며 숙주에서 체액성 면역반응을 유발하면서 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와만 반응하는 다염기성 아미노산 서열을 포함하며 야외감염개체와 백신접종개체를 감별 진단하는데 유용한 신규 합성 펩타이드 절편에 관한 것이다.

뉴캐슬병 바이러스

Description

병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와 특이적으로 반응하는 펩타이드 및 그의 용도{Peptide fragments specifically reactive with antibodies against highly pathogenic Newcastle disease virus and uses thereof}

뉴캐슬병은 뇌내병원성지수(ICPI, intracerebral pathogenicity index)가 0.7 이상인 뉴캐슬병 바이러스(이하 “병원성 뉴캐슬병 바이러스”라고 함)에 의해 발병하는 바이러스성 전염병으로, 닭과 같은 감수성 조류에 감염시 전염력과 치사율이 매우 높은 악성전염병이다. 뉴캐슬병에 대한 면역이 형성되어 있지 않은 감수 성 닭의 경우 일단 감염이 되면 100%에 육박하는 닭이 발병 후 2주 이내 폐사할 수 있다. 뉴캐슬병에 감염된 닭은 침울, 호흡기 증상, 신경증상 및 심한 설사 등의 임상증상을 보인다.

뉴캐슬병은 아시아, 아프리카 및 유럽 등에서 발생하여 양계산업에 막대한 피해를 입히고 있다. 국내의 경우 1920년대에 뉴캐슬병 발생이 보고된 바 있으며, 뉴캐슬병 바이러스가 최초로 분리된 것은 1949년이다. 뉴캐슬병은 현재까지도 국내에서 근절되지 않고 산재하여 발생되고 있어 양계산업에 막대한 피해를 입히고 있는 실정이다. 아시아(한국 포함)와 아프리카 등 뉴캐슬병 산재 발생지역에서는 뉴캐슬병 발생 피해를 예방하기 위하여 닭에서 뉴캐슬병 백신접종을 의무적으로 실시하고 있는 실정이다. 현재 뉴캐슬병 예방 백신은 뇌내병원성 지수가 0.4 이하인 뉴캐슬병 바이러스(이하 “비병원성바이러스”라고 함)를 이용하여 생산하며, 생바이러스로 제조한 생독백신과 바이러스를 불활성화시킨 후 제조한 사독백신이 있다.

뉴캐슬병 바이러스는 유전계통학적으로 파라믹소비리디(Paramyxoviridae)과에 속하는 알엔에이(RNA) 바이러스로서, 바이러스 입자내 RNA 유전자 게놈은 약 15.2K 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, NP, P, M, F, HN 및 L 등 6개 종류의 구조단백질을 가지고 있다. 특히, 이 중 F 단백질은 HN 단백질과 함께 뉴캐슬병 바이러스의 외피막(envelope)을 구성하는 구조단백질로서 숙주에서 바이러스 중화항체를 유도하며 숙주의 질병방어에 중요한 역할을 한다.

뉴캐슬병 바이러스가 감수성 숙주세포에 감염되는 기전은 다음과 같다. 뉴캐슬병 바이러스 외피막 HN 단백질이 숙주세포막에 부착한 후, 바이러스 외피막과 숙주 세포막간의 융합이 이루어지면서 바이러스 입자내 게놈을 함유하는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)가 숙주 세포내부로 침투하여 들어간다. 그 후 세포내 침투한 바이러스 게놈은 숙주세포의 대사체계를 이용하여 게놈 유전자 복제와 바이러스 구조 단백질을 생산하여 세포내에서 바이러스 입자로 조립되어 감염 세포의 세포질막에서 버딩(budding) 과정을 거쳐 세포외부로 배출됨으로써 감염성 바이러스를 재생산하게 된다. 이 과정에서, 뉴캐슬병 바이러스의 F 단백질은 바이러스 외피막와 세포질막간 융합에 관여하여 바이러스의 세포감염을 촉진시키는 역할을 한다. 구체적으로 기술하자면, F 단백질은 바이러스 입자(virion)에서 비활성 전구체 형태(F0)로 존재하는데, 숙주세포에 바이러스 입자가 부착한 다음 숙주세포의 단백질분해효소(enzyme)에 의해 비활성 F0 전구체가 활성 F1과 F2 서브유니트(subunit)로 절단된다. 이렇게 활성화된 F1과 F2 서브유니트는 바이러스 외피막과 숙주세포막을 서로 융합하게 만든다.

뉴캐슬병 바이러스의 병원성은 감수성 숙주 동물에서 비활성 F0 전구체가 활성 F1 및 F2 서브유니트 단백질로 얼마나 용이하게 절단되는 가에 의해 좌우된다고 알려져 있다. 병원성 뉴캐슬병 바이러스는 F1/F2 분절 부위가 숙주 생체 내 흔하게 존재하는 다양한 단백질분해효소에 의해 용이하게 절단될 수 있는 다염기성 아미노산서열(-Arg/Lys-Arg-Gln-Lys/Arg-Arg-Phe-)을 가지고 있는 데 반해, 비병원성 뉴캐슬병 바이러스는 다염기성 아미노산 배열을 가지고 있지 않아서 호흡기 점막조직 등 숙주의 제한된 부위에 존재하는 트립신유사(trypsin-like) 효소에 의해서만 절단이 가능하다.

뉴캐슬병 진단은 임상증상과 역학사항을 감안하여 잠정적으로 진단할 수 있으나, 최종 확진을 위해서는 반드시 실험실 검사를 수행하여 뉴캐슬병 감염여부가 증명되어져야만 한다. 현재 뉴캐슬병 진단에 사용 중인 실험실 검사법은 크게 항원검사법과 항체검사법이 있다.

항원검사법은 임상증상이 심한 감염 닭이나 감염 후 폐사된 닭 등 숙주 내 바이러스 감염량이 많은 적은 수의 시료를 사용하는 것으로서, 뉴캐슬병을 진단하는데 효과적이다. 현재 사용 중인 항원검사법으로는 바이러스 분리 및 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR) 및 효소결합면역측정법(ELISA) 등이 널리 사용되고 있다.

항체검사법은 백신면역이 형성되지 않은 가금류에서 감염 후 형성된 뉴캐슬병 항체 존재 여부나, 백신면역이 형성된 경우 발병 전후 뉴캐슬병 항체역가의 상승여부를 판단하여 진단하는데 사용할 수 있다. 현재, 항체검사법으로 혈구응집억제반응법(HI), 바이러스 중화시험(VN) 및 효소결합면역반응측정법(ELISA) 등이 사용되고 있다. 항체검사법은 살아있는 닭 개체에서 검사가 가능하고, 항원검사에 비해 단시간에 대량 검사가 용이하기 때문에 대단위 시료를 검사하는데 매우 효과적이다. 그러나, 현재 사용하고 있는 항체검사법은 백신접종 개체와 야외감염개체를 감별할 수 없는 단점이 있다.

뉴캐슬병이 발생하거나 발생위험이 있는 지역이나 국가는 대부분 뉴캐슬병 피해 예방을 위하여 백신접종을 실시하고 있다. 이들 지역에서 면역이 불완전한 백신접종 닭의 일부는 병원성 뉴캐슬병 바이러스에 의해 야외감염이 이루어질 수 있으며, 이러한 닭의 경우 임상증상이나 폐사가 거의 나타나지 않지만 낮은 양의 병 원성 뉴캐슬병 바이러스를 분변이나 호흡기를 통하여 배출하기 때문에 질병 전파의 중요한 요인이 될 수 있다. 수만 수 이상의 대량 사육 닭 농가의 경우 감염되었으나 임상증상을 나타내지 않는 일부의 닭을 육안검사만으로 색출하기가 어렵기 때문이다. 현재의 검사체계에서는 특정병원체부재(SPF) 닭을 감시 닭으로 투입하여 계군내 병원성 뉴캐슬병 바이러스 순환감염여부를 확인하는 것이 가장 확실한 방법이나, 감시 닭의 구입 및 사육관리가 매우 번거로울 뿐만 아니라 감시 닭이 질병전파의 또 다른 요인으로 작용할 수 있기 때문에 현실적으로 적절하지 않은 실정이다. 항원검사법으로 계군내 감염 닭을 검사하여 확인할 수 있으나 감염 닭 내 바이러스 보유량이 낮고 많은 닭을 동시에 검사하기엔 이 또한 적절하지 않다. 많은 수의 닭을 동시에 검사하여 감염 닭을 색출하는 가장 효과적인 방법은 야외감염과 백신접종개체를 감별(DIVA, Differentiating Infected and Vaccinated Animals)할 수 있는 혈청검사법을 사용하는 것이다. 많은 수의 닭을 검사하기 위하여 사용하는 혈청검사법으로 혈구응집억제반응법(HI test)과 효소결합면역측정법(ELISA) 등이 널리 사용되고 있다. 이들 종래 검사방법은 백신접종과 야외감염을 감별하는 것이 불가능하다. 그러므로, 이러한 DIVA 방법을 실현하기 위한 전략은 현실적으로 크게 두 가지가 있다. 첫 번째, 질병 방어와 무관한 특정 바이러스 단백질 부위를 제거한 형태의 마커백신을 접종하고, 마커백신의 결손부위 단백질에 대한 항체를 검사하는 방법이다. 이 방법을 사용하기 위하여 현재의 백신(whole virus) 대신에 마커백신을 의무적으로 사용하여야만 가능하다. 둘째, 병원성 뉴캐슬병 바이러스에만 존재하는 항원부위(일명 에피톱)에 대한 항체를 검출하는 진단법을 사용하는 것이다. 그러나, 현재까지 이러한 진단법이 개발되어 있지 않은 실정이다.

이에, 본 발명자들은 백신접종개체와 야외감염개체를 감별할 수 있는 혈청검사방법을 개발하기 위하여, 병원성 뉴캐슬병 바이러스에만 특이적으로 존재하는 항원부위(에피톱)를 찾아내기 위한 지속적인 연구를 수행한 결과, 비병원성 뉴캐슬병 바이러스와 달리 병원성 뉴캐슬병 바이러스는 F 단백질의 F1/F2 분절 부위에 페닐알라닌을 포함하는 특징적인 다염기성 아미노산 서열을 가진 부위가 면역원성과 항원성이 강한 부위임을 발견하였고, 상기 다염기성 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩타이드 절편이 비병원성뉴캐슬병 바이러스 항체(백신항체)와는 반응하지 않으면서 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와만 특이적으로 반응함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 야외감염개체와 백신접종개체를 감별하고 뉴캐슬병 감염동물의 생체 내에서의 면역수준 평가 등에 활용할 수 있는 뉴캐슬병 바이러스의 특정 항원부위를 포함하는 합성 펩타이드 절편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 합성 펩타이드 절편을 포함하는 각종 뉴캐슬병 진단액 및 진단키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 면역원성과 항원성을 보유하며 병원성 뉴캐슬병 바이러스에 특이적으로 존재하는 뉴캐슬병 바이러스 F 단백질 다 염기성 아미노산 항원부위를 포함하는 서열번호 1 내지 5의 합성 펩타이드 절편 및 이들의 변형된 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 신규 합성 펩타이드 절편 및 이들의 변형된 펩타이드를 포함하는 각종 뉴캐슬병 진단액 및 진단키트를 제공한다.

본 발명에서는 신규 합성 펩타이드를 이용하여 야외감염개체와 백신접종개체를 감별 및 뉴캐슬병 감염동물의 생체 내에서의 면역수준 평가 등에 활용할 수 있는 뉴캐슬병 바이러스의 특정 항원부위를 제공할 수 있었으며, 이를 이용하여 뉴캐슬병 백신접종개체와 야외감염개체의 감별에 유용한 펩타이드 절편 및 이를 포함하는 각종 뉴캐슬병 진단액 및 진단키트 제조하는 데 유익한 정보를 제공할 수 있었다.

또한 종래의 항체검출 진단시약과 달리, 본 발명의 펩타이드 절편은 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체를 특이적으로 검출함으로써 백신접종 개체와 야외감염개체를 감별할 수 있는 다양한 형태의 혈청검사용 진단시약을 제조할 수 있었다. 특히, 본 발명의 펩타이드 절편을 이용한 진단법은 뉴캐슬병 백신접종을 실시하는 지역에서 백신접종 닭과 야외감염 닭을 감별할 수 있으므로 대단위 뉴캐슬병 예찰검사 등 뉴캐슬병 근절 대책을 수립하는데 매우 효과적이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 면역원성과 항원성을 보유하면서 병원성 뉴캐슬병 바이러스에 특이적으로 존재하는 항원부위 및 이를 포함하는 합성 펩타이드 절편에 관한 것이다.

본 발명에 따른 “병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 단백질의 다염기성 아미노산 항원부위”는 0.7 이상의 뇌내병원성 지수를 가지는 병원성 뉴캐슬병 바이러스 F 단백질의 분절부위에 공통적으로 존재하는 다염기성 아미노산 서열을 가지는 항원 모티프를 가지고 있으며, 이들 부위가 숙주 면역반응에 의해 형성되어진 항체와 반응하는 부위를 의미한다. 예를 들어, 최근 국내에서 유행하는 병원성 뉴캐슬병 바이러스들은 모두 다염기성 아미노산 항원 모티프 -Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-를 가지고 있는 반면에, 국내에서 뉴캐슬병 백신으로 널리 사용되는 비병원성 뉴캐슬병 바이러스인 LaSota 주나 B1주의 경우에는 -Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Leu-의 아미노산 모티프를 가지고 있다.

병원성 뉴캐슬병 바이러스에서 존재하는 다염기성 아미노산 서열로서 본 발명에 따른 합성 펩타이드 절편은 하기 표 1에 기재된 서열들을 포함한다.

서열번호	아미노산 서열
1	Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe
2	Lys-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe
3	Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe
4	Gln-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe
5	Arg-Arg-Arg-Lys-Arg-Phe

본 발명의 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편은 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와의 반응능력을 향상시키기 위하여 오바알부민(Ovalbumin)이나 소혈청알부민(Bovine serum albumin)과 같은 캐리어(carrier)와 중합시켜 사용할 수 있으며, 본 발명의 펩타이드 절편의 면역원성을 높이기 위하여 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin)과 같은 캐리어와 중합시켜 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 의한 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편은 상기 오바알부민(Ovalbumin)이나 소혈청알부민(Bovine serum albumin)과 같은 캐리어(carrier)와 중합시켜 사용하기 위하여 펩타이드의 N-말단에 Cys-Ala-Ala를 추가한 후 펩타이드의 형태학적 안정화를 위하여 C-말단에 Ile을 추가한 다음 아미노기(NH₂)를 부착시킨 변형된 펩타이드 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드를 제조하기 위한 합성기술은 특별히 제한되는 것은 아니나, Fmoc 고상법(Solid phase synthesis procedure)을 이용하여 펩타이드를 합성한 후 워터스 C18 칼럼(Waters C18 column)을 이용한 HPLC법으로 정제하는 것이 바람직하다. 이러한 제조기술은 당업계의 기술 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명에 의한 서열번호 1 내지 5의 합성 펩타이드 절편은 백신접종개체와 야외감염개체 감별에 유용한 각종 뉴캐슬병 진단액 조성물 또는 진단키트류 제조에 유용하다. 뉴캐슬병 진단액 조성물 또는 진단키트류 제조를 위하여 본 발명의 펩타이드 절편은 오바알부민(Ovalbumin)이나 소혈청알부민(Bovine serum albumin)과 같은 캐리어(carrier)와 중합시켜 사용하는 것이 바람직하다. 또한 대량의 시료를 검사하기 위하여 진단검사를 위하여 펩타이드 절편을 포함하는 효소결합면역측정법(ELISA)을 제조하여 사용할 수도 있고, 간편하고 용이한 현장 검사를 위하여 신속 면역크로마토그라피법 형태로 진단키트류 제조할 수도 있다. 그러나, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열이 규명된 이상, 당업자는 당업계의 통상적인 기술을 이용하여 뉴캐슬병 진단을 위한 진단액 조성물이나 진단키트를 손쉽게 제조할 수 있는 바, 이 또한 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다.

본 발명에 의한 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편들은 병원성 뉴캐슬병 바이러스의 F 단백질 분절 부위의 다염기성 아미노산 서열의 모티프를 포함하고 있다. 이들 다염기성 아미노산 서열은 비병원성 뉴캐슬병 바이러스에서는 존재하지 않으며, 또한, 이들 다염기성 아미노산 서열의 모티프를 포함한 부위는 항원성을 보유하고 있기 때문에, 뉴캐슬병 백신접종 닭과 병원성 뉴캐슬병 바이러스에 야외감염된 닭의 감별을 용이하게 해준다. 그러므로 본 발명은 현행의 백신접종 정책 하에서도 백신접종축과 야외감염축 감별(DIVA) 전략을 가능하게 함으로써, 현재 뉴캐슬병 백신접종정책을 통한 뉴캐슬병 피해 예방 및 근절을 용이하게 만들 수 있다.

본 발명의 펩타이드 절편은 대량검사 또는 신속검사를 위하여 일반적으로 사용하고 있는 효소결합면역측정법(ELISA)이나 면역크로마토그라피법 등에 적용하였을 때 야외감염항체와 백신면역항체를 감별할 수 있다는 것이 입증되었기 때문에 그 이외의 진단방법을 적용하여도 진단키트를 제작할 수 있음을 보여주고 있다. 특히, 효소면역측정법(ELISA) 형태의 진단키트의 경우 단시간에 대량의 검사 시료를 분석할 수 있다는 장점이 있고, 백신접종 계군을 대상으로 병원성 뉴캐슬병 바이러스 감염여부에 대한 대량 검사가 가능하여 질병 모니터링을 통하여 감염된 닭을 검색하여 제거하거나 뉴캐슬병 백신접종프로그램을 개선하여 개체 면역수준을 향상시킴으로써 뉴캐슬병 전파 경로 및 전파 요인을 조기에 제거할 수 있어 뉴캐슬병 근절사업에 적용하기에 매우 효과적이다.

또한 본 발명의 펩타이드 절편은 병원체 또는 병원체 유래 유전자를 취급하지 않고 아미노산 서열정보만을 이용하여 단백질 합성기기를 이용하여 생산할 수 있기 때문에 항원의 순도가 높을 뿐 아니라 항원 정량이 용이하기 때문에 진단액 제작시 규격화가 가능하고, 진단키트 제작을 위하여 감염성 있는 병원체를 취급할 필요성이 없는 안전성도 확보하고 있다.

본 발명은 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 및 이들의 변형된 펩타이드를 포함하는 뉴캐슬병 진단용 키트 및 이를 이용하여 뉴캐슬병을 진단하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 및 이들의 변형된 펩타이드를 포함하는 뉴캐슬병 진단용 스트립을 제공한다.

상기 뉴캐슬병 진단용 스트립은 검체패드, 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 및 이들의 변형된 펩타이드를 흡착시킨 멤브레인, 골드패드 및 흡습패드를 적층시켜 제조할 수 있으며, 상기 멤브레인은 나이트로 셀룰로오스이고, 검체 패드 및 흡습 패드는 셀룰로오스이다.

또한 본 발명은 상기 뉴캐슬병 진단용 스트립, 검체 적용 홀 및 결과 표시창을 구비하며 상기 스트립을 내부에 삽입하여 검사 결과를 관찰할 수 있도록 제조된 하우징을 사용하는 면역크로마토그라피를 통해 뉴캐슬병을 진단하는 방법에 관한 것이다.

이하, 실시예 및 시험예에 의거 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 합성

기존의 공지된 Fmoc(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) 고상법에 의하여 실시하였으며, 펩타이드 합성을 위한 아미노산 서열은 상기의 서열번호 1 내지 5와 동일하였다.

아미노산 합성 순서는 원하는 합성 절편의 아미노산 서열의 역순, 즉, C-말단 부위쪽 아미노산부터 레진(resin)에 부착하는 방법으로 실시하였다.

(1) N,N-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide, DMF) 2ml에 최종농도 25 μmol의 왕 레진(Wang resin)을 첨가하여 20분간 레진을 미리 팽창(swelling)시켰다.

(2) NMP(N-methyl-2-pyrrolidinone) 2ml로 레진을 2회 세척하였다.

(3) 레진에 Fmoc 제거(deprotection) 용액(20% piperidine in DMF) 1.5ml를 10분간 2회 처리하였다.

(4) NMP(N-methyl-2-pyrrolidone) 2ml로 레진을 2회 세척하였다.

(5) 8당량의 Fmoc 류신(Leucine)을 8당량 디사이클로헥실카보디이미드(Dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 0.6ml, 8당량 N-하이드록시-벤조트리아졸(N-hydroxy-benzotriazole; HoBt) 0.6ml에서 2시간동안 교반하여 레진과 아미노산을 중합 결합시켰다.

(6) 레진을 메탄올(MeOH) 2ml에 30초간 처리하여 2회 세척하였다.

(7) NMP 2ml로 레진을 2회 세척하였다.

(8) 서열번호 1의 아미노산 합성이 순서대로 완료될 때까지 단계 (3)에서 (7)을 반복하였다.

(9) 레진에서 NMP를 완전히 제거한 후 분해(Cleavage) 시약[트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid) 950㎕, 트리이소프로필실란(Tri-isopropyl silane) 25㎕ 및 물 25㎕]을 2시간 처리하여 레진으로부터 합성 펩타이드를 분리(cleavage)하였다.

(10) 합성 펩타이드 산물을 침전용액(ether:hexanes=2:1)을 첨가하여 5분간 원심하여 상층액을 제거하였다.

(11) 침전된 합성 펩타이드를 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 방법으로 정제하고, 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 화합물을 얻었다. 이때 사용된 HPLC 기기는 워터스 2690 모델을 사용하였으며, 사용된 컬럼은 워터스 c18(waters c18; 5 micron)이었으며 파장 220 및 270nm에서 검출하였다. 정성분석(Mass analysis)은 HP 1100 시리즈 LC/MSD 모델을 사용하였다.

[ 실시예 2] 변형된 펩타이드 합성

캐리어(carrier)와 중합시켜 사용하기 위하여 서열번호 1 내지 5의 펩타이드의 아미노산 서열에 N-말단에 Cys-Ala-Ala를 추가한 후 펩타이드의 형태학적 안정화를 위하여 C-말단에 Ile을 추가한 다음 아미노기(NH₂)를 추가로 부착하였다. 펩타이드 절편의 C-말단 아미데이션을 위하여 실시예 1에서 사용한 왕 레진 대신에 동일 농도의 아마이드 레진(Amide resin)을 사용하였다. 합성방법은 실시예 1과 동일하게 진행하였으며, 다만 N-말단에 시스테인을 부착하기 위하여 마지막 합성 아미노산 글리신(Gly)을 레진에 부착 합성한 다음 시스테인을 추가적으로 부착 합성하였다.

[ 실시예 3] 오바알부민이 부착된 펩타이드 합성

상기 실시예 2에서 제조한 합성 펩타이드에 오바알부민을 부착한 것이다. 합성 펩타이드 산물 2mg을 증류수 100㎕에 용해하였다. 그 후 캐리어단백질 2 mg을 PBS, 5mM EDTA 완충액에 녹인 후 펩타이드와 혼합하여 실온에서 2시간동안 반응시켰다.

[ 실시예 4] 소혈청알부민이 부착된 펩타이드 합성

상기 실시예 2에서 제조한 합성 펩타이드에 소혈청알부민을 부착한 것이다. 합성 과정은 실시예 3과 동일한 방법으로 실시하였으며, 합성 펩타이드 산물 2 mg을 증류수 100㎕에 용해하였다. 그 후 캐리어단백질 2mg을 PBS, 5mM EDTA 완충액에 녹인 후 펩타이드와 혼합하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.

[ 실시예 5] 키홀 - 림펫 헤모시아닌이 부착된 펩타이드 합성

상기 실시예 2에서 제조한 합성 펩타이드에 키홀-림펫 헤모시아닌을 부착한 것이다. 합성 과정은 실시예 3과 동일한 방법으로 실시하였으며, 합성 펩타이드 산물 2mg을 증류수 100㎕에 용해하였다. 그 후 캐리어 단백질 2mg을 PBS, 5mM EDTA 완충액에 녹인 후 펩타이드와 혼합하여 실온에서 2시간동안 반응시켰다.

[ 실시예 6] 마우스 항- 펩타이드 면역혈청 제조

상기 실시예 5에서 제조한 합성 펩타이드-키홀림펫헤모시아닌 중합체를 완전 프로인트 어쥬반트(complete Freund's adjuvant)와 동량 혼합한 다음 펩타이드 항원당 5마리씩 마우스 마리당 30㎍씩 피하로 접종하였다. 첫 번째 면역 후 2주가 경과한 다음 동일 항원을 불완전 프로인트 어쥬반트(incomplete Freund's adjuvant)와 동일한 면역 방법으로 2차 면역을 실시하였다. 그리고 2차 면역 후 일주일이 경과한 시점에서 마우스로부터 채혈하여 면역혈청을 제조하였다. 제조한 면역혈청은 표 2와 같이 명명하였으며, 실험에 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다.

면역혈청	면역펩타이드 절편
VCL-1	KLH-Cys-Ala-Ala-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-Ile-NH₂
VCL-2	KLH-Cys-Ala-Ala-Lys-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-Ile-NH₂
VCL-3	KLH-Cys-Ala-Ala-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe-Ile-NH₂
VCL-4	KLH-Cys-Ala-Ala-Gln-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe-Ile-NH₂
VCL-5	KLH-Cys-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg-Phe-Ile-NH₂

[실시예 7] 효소결합면역측정법(ELISA) 플레이트의 제조

상기 소혈청알부민-펩타이드 중합체(실시예 3) 또는 오바알부민-펩타이드 중합체(실시예 4)를 포스페이트 완충용액(0.01 M phosphate buffered saline, pH 7.2)으로 0.5 ㎍/㎖ 되게 희석한 후 엘라이자 플레이트(ELISA Plate)에 웰당 50 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 흡착시켰다(이하, ‘검사웰’이라 함). 대조 검사를 위하여 어떠한 펩타이드가 중합되지 않은 소혈청알부민 또는 오바알부민을 포스페이트 완충용액에서 0.5 ㎍/㎖ 되게 희석한 후 동일 조건하에 흡착하였다(이하, ‘대조웰’이라 함). ELISA 플레이트는 검사혈청 시료당 3 웰을 사용하도록 하였으며, 이중 2 웰은 검사웰을 나머지 1웰은 대조웰이다. 코팅이 완료된 다음 ELISA 플레이트는 세척용 완충용액(0.002 M phosphate buffered saline, pH 7.2, 0.01% Tween 20)으로 3회 세척하였다. 그 후 완전히 건조시킨 다음 플레이트를 완전히 밀봉테잎으로 검사웰을 밀봉시킨 후 실험에 사용할 때까지 4℃에 보관하였다.

[ 실시예 8] 면역크로마토그라피 스트립 제조

실시예 4에서 제조한 소혈청알부민-펩타이드 중합체 2 mg/ml을 나이트로셀룰로오스 멤브레인 검사선 위치에 코팅 용액으로 사용하였다. 즉, 펩타이드 절편은 검사선 위치(병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체를 검출하는 선)에, 그리고 동일 농도의 산양 항-마우스 항체를 대조선 위치에 각각 코팅하였다.

금 콜로이드(gold colloid) ml당 항-닭 IgY 마우스 단클론 항체 20㎍ 농도로 결합시켰다. 즉 염화금을 시트로산 나트륨 용액으로 환원시켜 플레인 골드(plain gold)를 제조한 후 각각의 항체를 첨가하면서 40nm 크기의 항체가 결합된 골드입자를 532nm에서 흡광도가 10+/-1이 되게 제조하였다. 여기에 결합된 항체를 안정화시키기 위하여 PEG 용액으로 처리하였다. 상기의 금 입자와 항체가 결합된 각각의 금 접합체를 각각 8.3㎕/스트립(strip)씩 혼합하고, 폴리에스테르 또는 유리 섬유에 적셔 건조시켜 골드 패드를 제조하였다. 흡습패드 및 검체패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다. 상기 검체 패드와 흡습패드는 셀룰로오스를 사용하였다.

상기에서 제조된 각각의 멤브레인, 패드들을, 오른쪽부터 검체패드, 골드패드, 나이트로셀룰로오스 멤브레인 및 마지막으로 흡습패드를 각각 중첩되게 결합하고 4.45mm/스트립 크기로 절단한 면역크로마토그라피 스트립을 디바이스의 하판에 넣고 상판을 덮어 진단용 키트를 제조하였다.

[시험예 1] 신규한 펩타이드 절편의 면역원성 평가

본 발명의 펩타이드 절편이 동물에서 면역반응을 유도하는지 여부를 조사하기 위하여 상기 표 2에 기재된 마우스 항-펩타이드 면역혈청을 사용하여 효소결합면역측정법(ELISA)법으로 분석하였다(도 1). 구체적으로 기술하자면, 실시예 7의 오바알부민-펩타이드중합체가 흡착되어 있는 ELISA 플레이트에 미리 반응용액(0.01 M 포스페이트 완충용액, pH 7.2, 2% BSA, 0.05% Tween 20)으로 단계 희석한 혈청을 각 혈청당 검사웰 2웰과 대조웰 1웰에 웰당 100 ㎕씩 첨가한 다음 37℃에서 1 시간동안 반응시켰다. 그 후 ELISA 플레이트를 세척용 완충용액으로 3 회 세척하였다. 그 후 반응용액으로 희석한 항-마우스 면역글로불린 G 호스래디쉬 퍼옥시다아제 콘쥬게이트(Peroxidase conjugated anti-mouse IgG, 0.5 ㎍/㎖)를 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 40분 동안 반응시킨 다음, 세척용 완충용액으로 3 회 세척하였다. 여기에 기질 용액(0.04% O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드, 시트레이트-포스페이트 완충액 중 0.01% 과산화수소)을 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 10 분간 반응시켰다. 이후 반응중지용액(0.1N 염산)을 웰당 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시켰다. 그 후 발색정도를 450 ㎚의 흡광도에서 측정하였다. 효소반응의 결과 뉴캐슬병 바이러스 감염 항체가 함유된 시료의 경우 검사한 웰의 최종 반응액은 노란색으로 발색하게 된다. 각 혈청의 검사 결과는 검사웰의 흡광도에서 대조웰(대조군)의 흡광도 수치를 뺀 순수 흡광도(net aboorbance)를 가지고 결과를 분석하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 본 발명의 아미노산 서열번호 1, 2 및 4를 포함하는 합성 펩타이드 절편으로 면역한 마우스의 면역혈청(VCL-1, VCL-2 및 VCL-4)은 동일 서열을 포함하는 소혈청알부민-펩타이드 중합체에 대하여 모두 강한 면역반응이 유도하였다. 본 발명의 서열번호 3 및 5를 포함하는 펩타이드 절편으로 면역한 마우스의 경우(면역혈청 VCL-3 및 VCL-5) 일부 개체에서만 면역반응이 형성되거나 약한 면역반응을 나타내었다.

[ 시험예 2] 제조한 ELISA 플레이트를 이용한 감염개체와 백신접종개체의 감별시험

본 발명의 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 절편을 효소결합면역측정법(ELISA)에 적용하였을 때 백신접종 닭과 야외감염 닭을 감별할 수 있는지를 알아보기 위하여 실시예 7의 소혈청알부민-펩타이드 중합체가 흡착되어 있는 ELISA 플레이트를 사용하였다. 뉴캐슬병 La Sota 백신을 접종하고 3주 후 채취한 닭의 혈청 5점, 뉴캐슬병 음성 닭 혈청 5점, 병원성 뉴캐슬병 바이러스 인공감염 후 생존한 닭(감염 7일후)의 혈청 4점이 사용되었다. 각 혈청은 반응용액[0.01 M 포스페이트 완충용액, pH 7.2, 2% BSA, 0.05% Tween 20]으로 1:500으로 희석한 다음 각 혈청당 검사웰 2웰과 대조웰 1웰에 웰당 100 ㎕씩 첨가한 다음 37℃에서 1 시간동안 반응시켰다. 그 후 ELISA 플레이트를 세척용 완충용액으로 3 회 세척하였다. 그 후 반응용액으로 희석한 항-닭 면역글로불린 G 호스래디쉬 퍼옥시다아제 콘쥬게이트(Peroxidase conjugated anti-chicken IgG, 0.5 ㎍/㎖)를 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 40분 동안 반응시킨 다음, 세척용 완충용액으로 3회 세척하였다. 여기에 기질 용액[0.04% O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드, 시트레이트-포스페이트 완충액 중 0.01% 과산화수소]을 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 10 분간 반응시켰다. 이후 반응중지용액(0.1N 염산)을 웰당 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시켰다. 그 후 발색정도를 450 ㎚의 흡광도에서 측정하였다. 효소반응의 결과 뉴캐슬병 바이러스 감염항체가 함유된 시료의 경우 검사한 웰의 최종 반응액은 노란색으로 발색하게 된다(도 3). 각 혈청의 검사 결과는 검사웰의 흡광도에서 대조웰의 흡광도 수치를 뺀 순수 흡광도(net aboorbance)를 가지고 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 검사결과의 판정은 음성대조혈청의 평균 순수흡광도×2.5 이상의 순수흡광도를 가질 경우 양성반응으로 인정하였다.

본 발명의 펩타이드 절편을 이용한 효소결합면역반응측정법(ELISA) 검사결과

구 분	검사두수	본 발명 ELISA법					HI법
구 분	검사두수	서열1^*	서열2	서열3	서열4	서열5	HI법
백신접종닭	5	0/5(0.11)^**	0/5(0.27)	0/5(0.70)	0/5(0.07)	0/5(0.60)	5/5(8.0)^***
실험감염닭	4	4/4(2.21)	4/4(2.33)	4/4(2.45)	4/4(1.39)	4/4(1.91)	4/4(6.0)
야외음성닭	5	0/5(0.14)	0/5(0.32)	1/5(0.81)	0/5(0.09)	0/5(0.81)	0/5(<2.0)
양성판정기준		0.15^****	0.73	0.95	0.13	1.60

* 해당 서열번호를 포함하는 펩타이드-소혈청알부민 중합체

** 양성수수/검사수수 (검사혈청의 ELISA 흡광도 평균값)

*** 양성수수/검사수수 (검사혈청의 HI log2평균역가)

**** 양성판정기준 흡광도(음성대조혈청의 흡광도x2.5)

표 3의 결과 비교를 위하여, 가장 널리 사용되는 종래의 항체검사법인 혈구응집억제반응법(HI) 검사결과와 비교 분석하였다. 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 절편들은 모두 병원성 뉴캐슬병 바이러스에 감염된 닭의 혈청에서양성반응을 나타내었다. 그러나, 본 발명의 펩타이드 절편들은 백신접종한 실험닭 혈청과 모두 음성반응을 나타내었다. 또한 종래의 방법인 혈구응집억제반응법에서는 백신접종혈청과 야외감염혈청 모두에서 뉴캐슬병 항체양성반응(HI 역가 4배이상)을 보여 백신항체와 감염항체간 감별이 불가능하였다. 따라서, 본 시험 예는 본 발명의 펩타이드 절편들이 백신접종 개체와 야외감염 개체를 감별할 수 있음을 보여주고 있다.

[ 시험예 3] 면역크로마토그라피법을 이용한 감염개체와 백신접종개체의 감별시험

본 발명의 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편을 면역크로마토그라피법에 적용하였을 때 백신접종 닭과 야외감염 닭을 감별할 수 있는 지 알아보기 위하여 이 실시예 8에서 제조한 면역크로마토그라피 진단키트를 사용하였다. 진단키트에 코팅된 항원은 아미노산 서열번호 1을 포함하는 펩타이드-소혈청알부민 중합체였다. 본 실험에 사용된 혈청은 뉴캐슬병 백신접종 혈청, 뉴캐슬병 음성 실험 닭 혈청, 병원성 뉴캐슬병 바이러스 인공감염 닭 혈청, 그리고 야외 NDV 음성 닭 혈청이 사용되었다. 진단키트에 검사혈청 50 ㎕를 적용한 후 10분 후에 그 결과를 판독하였다. 면역크로마토그라피법에 의한 병원성뉴캐슬병 바이러스항체의 검출원리는 도 4에 나타내었다. 이때 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체가 일정량 이상 존재하면 금접합체 패드의 금 입자에 접합되어 있는 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체에 특이적으로 반응하는 펩타이드와 1차적으로 결합하게 되며, 이후 이 결합체는 면역크로마토그라피법 원리에 의해 멤브레인을 따라 이동하게 되면서 항체-항원-항체 복합체를 형성하면서 대조선 밴드와 함께 2개의 보라색 밴드를 나타낸다. 그리고, 검체 중에 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체가 없으면, 금 접합체 패드와 결합되는 항체가 없으며, 금 접합체만 멤브레인을 따라 이동하면서 대조선에 있는 항 마우스 항체와 결합하게 되어 대조선에서만 보라색 밴드를 나타낸다(금 접합체는 마우스 유래 단일클론 항체와 결합되어 있으므로, 대조선의 항 마우스 항체와 직접 결합하게 된다.

면역크로마토그라피법 검사결과는 도 5에 나타내었다. 검사 결과 병원성 뉴캐슬병 바이러스 감염 닭 혈청에서 양성 반응이 나타났으나 백신접종 닭 혈청과 음성 닭 혈청에서는 음성반응을 나타내었다. 이러한 결과를 통하여 본 발명에 의한 펩타이드 절편을 사용하여 개발한 면역크로마토그라피법에서도 백신접종 닭과 야외감염 닭을 충분히 감별할 수 있음을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명에 따른 펩타이드 절편을 이용하여 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체를 검출하기 위한 효소결합면역반응측정법(ELISA)의 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 펩타이드 절편을 면역한 마우스 혈청에서 체액성 면역반응을 효소결합면역반응측정법(ELISA)으로 확인한 결과이다.

도 3은 본 발명에 따른 펩타이드 절편이 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체를 특이적으로 검출하는 것을 효소결합면역반응측정법(ELISA)으로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따른 펩타이드 절편을 이용하여 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체를 특이적으로 검출하기 위한 면역크로마토그라피법의 모식도이다.

도 5는 본 발명에 따른 펩타이드가 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와 특이적으로 반응하는 것을 면역크로마토그라피법으로 확인한 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry of Agriculture and forestry, National Veterinary Research) <120> Peptide fragments specifically reactive with antibodies against highly pathogenic Newcastle disease virus and uses thereof <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 1 Arg Arg Gln Lys Arg Phe 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 2 Lys Arg Gln Lys Arg Phe 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 3 Arg Arg Gln Arg Arg Phe 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 4 Gln Arg Gln Arg Arg Phe 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 5 Arg Arg Arg Lys Arg Phe 1 5

Claims

서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 중 1종 이상을 포함하는 뉴캐슬병 진단용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 중 1종 이상은 N-말단에 Cys-Ala-Ala가 더 부착되고, C-말단에 차례로 Ile 및 아미노기(NH₂)가 더 부착되어 변형된 펩타이드임을 특징으로 하는 진단용 키트.
제 2항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 중 1종 이상은 상기 변형된 펩타이드 N-말단에 오바알부민, 소혈청알부민 및 키홀-림펫 헤모시아닌으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 캐리어가 더 부착된 것임을 특징으로 하는 진단용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 중 1종 이상은 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와 특이적으로 반응하는 것임을 특징으로 하는 진단용 키트.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 진단용 키트를 사용하는 효소결합면역측정법(ELISA)을 거쳐 조류에서 뉴캐슬병을 진단하는 방법.
서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 중 1종 이상을 흡착시킨 멤브레인, 골드패드 및 흡습패드를 적층시켜 제조된 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체 진단용 스트립.
제 6항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 중 1종 이상은 N-말단에 Cys-Ala-Ala가 더 부착되고, C-말단에 차례로 Ile 및 아미노기(NH₂)가 더 부착되어 변형된 펩타이드임을 특징으로 하는 진단용 스트립.
제 7항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 중 1종 이상은 상기 변형된 펩타이드 N-말단에 오바알부민, 소혈청알부민 및 키홀-림펫 헤모시아닌으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 캐리어가 더 부착된 것임을 특징으로 하는 진단용 스트립.
제 6항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 절편 중 1종 이상은 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와 특이적으로 반응하는 것임을 특징으로 하는 진단용 스트립.
제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 진단용 스트립을 사용하는 면역크로마토그라피법을 통하여 조류에서 뉴캐슬병을 진단하는 방법.