KR100954561B1 - 방사성 형광 화합물, 그 제조방법 및 그의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 방사성 형광 화합물, 그 제조방법 및 그의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1,2-디하이드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온이라는 새로운 코어 스켈레톤(core skeleton)을 이용한 풀 컬러 조정가능한 방사성 형광 화합물, 그 제조방법 및 그 이용에 관한 것이다.

형광 화합물, 1,2-디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온, 형광체, 바이오 프로브

Description

방사성 형광 화합물, 그 제조방법 및 그의 이용{Emissive fluorescent compounds, synthetic method and uses thereof}

본 발명은 신규한 방사성 형광 화합물, 그 제조방법 및 그의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1,2-디하이드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온이라는 새로운 코어 스켈레톤(core skeleton)을 이용한 풀 컬러 조정가능한 방사성 형광 화합물, 그 제조방법 및 그 이용에 관한 것이다.

형광 프로브는 높은 민감성과 취급의 용이성으로 인하여 생물과학, 임상진단 및 약물 발견 분야에서 연구 도구로서 광범위하게 사용되어 왔다.

형광 물질은 생물의학연구에서의 응용 외에 유기 발광 염료(OLEDs)로서의 산업적 응용 때문에 점점 더 주목받는 물질이 되었다.

그러나 형광체에 대한 높은 수요에도 불구하고, 방출파장이 조절가능하고, 합성 전략에서 유연성을 갖는 형광 코어 스켈레톤(fluorescent core skeleton)은 아주 제한된 수만이 존재한다. 이는 형광 프로브의 발견에 대한 많은 전략이 한 번에 하나씩 경험적으로만 수행되어 왔기 때문이다.

또한, 기본적인 광물리적 현상이 지니고 있는 복잡성 때문에, 특정한 방출 파장 및 높은 양자 수득률을 갖는 형광 프로브의 합리적인 디자인(rational design)은 매우 어렵다.

최근 들어, 이러한 제한점을 극복하기 위한 해결책으로 형광물질의 합성에 있어서, 조합적 접근방법(combinatorial approach)이 신규한 형광 프로브 및 형광체의 발견에 대한 강력한 도구로서 주목을 받고 있다.

이에 본 발명자들은 조합적 접근방법을 이용하여, 풀-컬러-조정가능한 방사적 특성(full-color-tunable emissive property)을 갖는 신규한 형광 코어 스켈레톤의 새로운 디자인 및 발견을 보고하고자 한다.

본 발명의 목적은 단일 분자 구조에서 풀 컬러 조정가능한 방출 특성을 갖는 새로운 형광 화합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형광 화합물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형광 화합물의 용도를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물에 관한 것이다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁ 및 R₂ 는 각각 독립적으로 수소; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; C2-C8의 알케닐기; C2-C8의 알키닐기; C3-C8의 시클로알킬기; 하이드록시기; C1-C6의 알콕시기; 폴리에틸렌글라이콜기; 니트릴기; 니트로기; 카르복실기; 설포닐기; 아자이드기; 메탄설포닐기; 말레이미드기; 터셔리-부틸디메틸실릴기(TBS)로 보호된 알콜; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고,

R₃는 수소; 니트릴기; 할로겐; 니트로기; C1-C6의 알콕시기; C6-C20의 아릴기; C5-C20의 시클로헤테로고리기; 보론기; 아자이드기; NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴, C1-C6의 알콕시, 할로겐, 보론기, 하이드록시기 또는 CH₂NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)로 치환된 C6-C20의 아릴기; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; C2-C8의 알케닐기; C2-C8의 알키닐기; C3-C8의 시클로알킬기; 또는 C4-C20의 헤테로아릴기이고,

R₄, R₅, R₆ 및 R₇은 각각 독립적으로 수소; 할로겐; 니트릴기; 보론기; 하이드록시기; COY(여기에서 Y는 수소, C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C2-C8의 알케닐기, C2-C8의 알키닐기, C3-C8의 시클로알킬기, 또는 NR₈R₉[여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임]); C1-C6의 알콕시기; C6-C20의 아릴기; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴 또는 할로겐으로 치환된 C6-C20의 아릴기이며,

이 때 서로 인접한 R₅ 및 R₆는 탄소, 질소, 산소 또는 황원소를 매개체로 한 부가적인 아릴 고리를 형성할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 R₁은 하이드록시기; 폴리에틸렌글라이콜기; 아자이드기; 메탄설포닐기; 말레이미드기; 터셔리-부틸디메틸실릴기(TBS)로 보호된 알콜; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고, R₂는 C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이다.

다른 구현예에 따르면, 상기 R₄, R₆ 및 R₇는 각각 독립적으로 수소; 할로겐; 니트릴기; 또는 보론기이고, R₅는 수소; 니트릴기; COY(여기에서 Y는 수소, C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C2-C8의 알케닐기, C2-C8의 알키닐기, C3-C8의 시클로알킬기, 또는 NR₈R₉[여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임]); C1-C6의 알콕시기; 또는 C6-C20의 아릴기이다.

또 다른 구현예에 따르면, R₃는 C6-C20의 아릴기; NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴, C1-C6의 알콕시, 할로겐, 보론기, 하이드록시기 또는 CH₂NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)로 치환된 C6-C20의 아릴기; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; 또는 C4-C20의 헤테로아릴기이다.

또 다른 구현예에 따르면, R₁은 수소; C1-C6의 알콕시기; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고,

R₂는 C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이고,

R₃는 수소; 니트릴기; 할로겐; 니트로기; C1-C6의 알콕시기; C6-C20의 아릴기; C5-C20의 시클로헤테로고리기; 보론기; 아자이드기; NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴, C1-C6의 알콕시, 할로겐, 보론기, 하이드록시기 또는 CH₂NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)로 치환된 C6-C20의 아릴기; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; C2-C8의 알케닐기; C2-C8의 알키닐기; C3-C8의 시클로알킬기; 또는 C4-C20의 헤테로아릴기이고,

R₄, R₆ 및 R₇는 각각 독립적으로 수소; 할로겐; 니트릴기; 또는 보론기이고,

R₅는 COY(여기에서 Y는 수소, C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C2-C8의 알케닐기, C2-C8의 알키닐기, C3-C8의 시클로알킬기, 또는 NR₈R₉[여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임])이다.

또 다른 구현예에 따르면, R₁은 하이드록시기, 아자이드기, 메탄설포닐기, 말레이미드기, 터셔리-부틸디메틸실릴기(TBS)로 보호된 알콜, 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고, R₂는 메틸이고, R₃는 메틸기, 페닐기, 메톡시페닐기, 사이오페닐기 또는 디메틸아미노페닐기이고, R₄, R₆ 및 R₇은 각각 수소이고, 또한 R₅는 수소, 니트릴기, 메톡시기, 페닐기 또는 아세틸기이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 다음 단계를 포함하는 상기 형광 화합물의 제조방법에 관한 것이다:

a) R₁ 및 R₂ 치환기를 갖는 아미노에틸 그룹을 포함하는 화합물을, R₃ 치환기를 갖는 α,β-불포화 알데히드와 반응시켜 환원성 아미노화에 의해 이차 아민 화합물을 제조하는 단계;

b) 상기 이차 아민 화합물을 아실할라이드를 이용하여 아실화하는 단계; 및

c) 상기 아실화된 화합물을 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘으로 처리한 후, 그로부터 얻어진 조 생성물을 고리화하고, 산화성 방향족화 시키는 단계.

일 구현예에 따르면, 상기 α,β-불포화 알데히드는 C1-C20의 불포화 지방족 알데히드 또는 C5-C30의 방향족 알데히드를 사용할 수 있다.

다른 구현예에 따르면, 상기 아실할라이드는 친전자성 모이어티(electrophilic moiety)를 갖는 것을 사용할 수 있다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 c) 단계에서, 고리화는 강염기를 처리하거나 또는 강염기와 루이스산을 동시에 처리하여 수행하고, 산화성 방향족화는 산화제를 이용하여 수행할 수 있다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 a) 단계에서 R₁ 및 R₂ 치환기를 갖는 아미노에틸 그룹을 포함하는 화합물은 보호화한 후 이용할 수 있고, 상기 c) 단계 후에 탈보호화 반응을 추가로 수행할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양상은 상기 형광 화합물의 용도에 관한 것이다.

일 구현예에 따르면, 상기 형광 화합물은 바이오 프로브 또는 형광체로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 형광 화합물은 치환기 변화를 통해 단일 분자 구조 내에서 풀 컬러 조정가능한 방출 특성(형광 특성), 넓은 범위의 양자수득률(absolute quantum yields (Φ_F), 광표백에 대한 내성, pH-독립적 형광성, 큰 스토크 편이(Storke shifts), 및 막투과성에 대한 약물-유사 지질친화성 등 뛰어난 광물리적 특성 및 광화학적 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 형광 화합물은 형광체(형광염료) 또는 형광 프로브로서 유기발광소자, 바이오 이미징 및 바이오 응용분야 에서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 형광 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁ 및 R₂ 는 각각 독립적으로 수소; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; C2-C8의 알케닐기; C2-C8의 알키닐기; C3-C8의 시클로알킬기; 하이드록시기; C1-C6의 알콕시기; 폴리에틸렌글라이콜기; 니트릴기; 니트로기; 카르복실기; 설포닐기; 아자이드기; 메탄설포닐기; 말레이미드기; 터셔리-부틸디메틸실릴기(TBS)로 보호된 알콜; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고,

R₃는 수소; 니트릴기; 할로겐; 니트로기; C1-C6의 알콕시기; C6-C20의 아릴 기; C5-C20의 시클로헤테로고리기; 보론기; 아자이드기; NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴, C1-C6의 알콕시, 할로겐, 보론기, 하이드록시기 또는 CH₂NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)로 치환된 C6-C20의 아릴기; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; C2-C8의 알케닐기; C2-C8의 알키닐기; C3-C8의 시클로알킬기; 또는 C4-C20의 헤테로아릴기이고,

R₄, R₅, R₆ 및 R₇은 각각 독립적으로 수소; 할로겐; 니트릴기; 보론기; 하이드록시기; COY(여기에서 Y는 수소, C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C2-C8의 알케닐기, C2-C8의 알키닐기, C3-C8의 시클로알킬기, 또는 NR₈R₉[여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임]); C1-C6의 알콕시기; C6-C20의 아릴기; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴 또는 할로겐으로 치환된 C6-C20의 아릴기이며,

이 때 서로 인접한 R₅ 및 R₆는 탄소, 질소, 산소 또는 황원소를 매개체로 한 부가적인 아릴 고리를 형성할 수 있다.

본 발명의 형광 화합물은 1,2-디하이드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온이라는 새로운 코어 스켈레톤을 이용한 것으로서, 치환기의 변화를 통해 뛰어난 광 물리적 특성 및 광화학적 특성을 갖는다.

구체적으로 본 발명의 형광 화합물은 치환기 변화를 통해 방출파장의 적색편이를 일으킬 수 있어, 단일 분자 구조 내에서 풀 컬러 조정가능한 방출 특성(형광 특성)을 가지며, 넓은 범위의 양자수득률(absolute quantum yields (Φ_F))을 나타낸다. 또한, 공지의 형광 물질인 플루오르신에 비해 광표백에 대한 내성이 더 강할 뿐만 아니라 pH에 독립적인 형광성을 나타내고, 그 외에 큰 스토크 편이(Storke shifts), 막투과성에 대한 약물-유사 지질친화성, 세포 무독성 등의 특성을 갖는다.

따라서, 본 발명의 형광 화합물은 형광체, 형광염료 또는 형광 프로브로서 유기발광소자, 바이오 이미징 및 바이오 응용분야에서 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 면역세포화학 분야에서 관심 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 형광 프로브로 사용 가능하다.

상기 화학식 1에서, 바람직하게는, R₁은 하이드록시기; 폴리에틸렌글라이콜기; 아자이드기; 메탄설포닐기; 말레이미드기; 터셔리-부틸디메틸실릴기(TBS)로 보호된 알콜; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고, R₂는 C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이다.

또한, 바람직하게는, R₄, R₆ 및 R₇는 각각 독립적으로 수소; 할로겐; 니트릴기; 또는 보론기이고, R₅는 수소; 니트릴기; COY(여기에서 Y는 수소, C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C2-C8의 알케닐기, C2-C8의 알키닐기, C3-C8의 시클로알킬기, 또는 NR₈R₉[여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임]); C1-C6의 알콕시기; 또는 C6-C20의 아릴기이다.

또한, 바람직하게는, R₃는 C6-C20의 아릴기; NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴, C1-C6의 알콕시, 할로겐, 보론기, 하이드록시기 또는 CH₂NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)로 치환된 C6-C20의 아릴기; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; 또는 C4-C20의 헤테로 아릴기이다.

이 때 본 발명에서,‘할로겐’은 특별히 제한되지는 않으나, 예를 들면 F, Cl, Br, I 등이며, ‘헤테로아릴기’ 또는 ‘시클로헤테로고리기’란 아릴고리 또는 시클로 고리를 이루는 탄소 원자 중 1개 이상의 원자가 산소, 질소, 황 또는 세슘 등의 이종원자로 치환되어 있는 것을 의미한다.

또한 상기 화학식 1에서, R₁은 수소; C1-C6의 알콕시기; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또 는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고, R₂는 C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이고, R₃는 수소; 니트릴기; 할로겐; 니트로기; C1-C6의 알콕시기; C6-C20의 아릴기; C5-C20의 시클로헤테로고리기; 보론기; 아자이드기; NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴, C1-C6의 알콕시, 할로겐, 보론기, 하이드록시기 또는 CH₂NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)로 치환된 C6-C20의 아릴기; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; C2-C8의 알케닐기; C2-C8의 알키닐기; C3-C8의 시클로알킬기; 또는 C4-C20의 헤테로아릴기이고, R₄, R₆ 및 R₇는 각각 독립적으로 수소; 할로겐; 니트릴기; 또는 보론기이며, R₅는 COY(여기에서 Y는 수소, C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C2-C8의 알케닐기, C2-C8의 알키닐기, C3-C8의 시클로알킬기, 또는 NR₈R₉[여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임])일 수 있다.

구체적으로 예를 들면, R₁은 하이드록시기, 아자이드기, 메탄설포닐기, 말레이미드기, 터셔리-부틸디메틸실릴기(TBS)로 보호된 알콜, 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고, R₂는 메틸이고, R₃는 메틸기, 페닐기, 메톡시페닐기, 사이오 페닐기 또는 디메틸아미노페닐기이고, R₄, R₆ 및 R₇은 각각 수소이며, R₅는 수소, 니트릴기, 메톡시기, 페닐기 또는 아세틸기이다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물의 일 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 형광 화합물의 제조방법은, 용액상 평행합성법에 의한 것으로서,

a) R₁ 및 R₂ 치환기를 갖는 아미노에틸 그룹을 포함하는 화합물을, R₃ 치환기를 갖는 α,β-불포화 알데히드와 반응시켜 환원성 아미노화에 의해 이차 아민 화합물을 제조하는 단계;

b) 상기 이차 아민 화합물을 아실할라이드를 이용하여 아실화하는 단계; 및

c) 상기 아실화된 화합물을 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘으로 처리한 후, 그로부터 얻어진 조 생성물을 고리화하고, 산화성 방향족화 시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 형광 화합물의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

a) 단계: α, β-불포화 알데히드의 환원성 아미노화에 의한 이차 아민 화합 물의 제조

먼저 R₁ 및 R₂ 치환기를 갖는 아미노에틸 그룹을 포함하는 화합물(여기에서, R₁ 및 R₂는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같음)을, R₃ 치환기를 갖는 α,β-불포화 알데히드(여기에서, R₃는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같음)와 반응시켜 환원성 아미노화에 의해 이차 아민 화합물을 제조한다.

상기 R₁ 및 R₂ 치환기를 갖는 아미노에틸 그룹을 포함하는 화합물은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 C1과 C2 위치에 각각 R₂ 및 R₁ 치환기를 갖는 아미노에탄(aminoethane)을 사용할 수 있다.

상기 α,β-불포화 알데히드로는 R₃ 치환기를 갖는 불포화 알데히드이면 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 R₃ 치환기를 갖는 C1-C20의 불포화 지방족 알데히드 또는 C5-C30의 방향족 알데히드를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 R3 치환기를 갖는 시남알데히드류를 사용한다.

상기의 반응은, 통상의 유기용매 내에서 R₁ 및 R₂ 치환기를 갖는 아미노에틸 그룹을 포함하는 화합물과 R₃ 치환기를 갖는 α,β-불포화 알데히드의 반응 혼합물을 산성화하고, 적정 온도, 예를 들면 0~50℃에서 2~24시간 동안 교반하여 이민(imine)을 얻어낸 후, 통상의 여과, 냉각 및 정제 등의 과정을 거쳐 수행될 수 있다.

경우에 따라서는, 상기 R₁ 및 R₂ 치환기를 갖는 아미노에틸 그룹을 포함하는 화합물을 미리 보호화한 후 반응에 이용할 수 있다. 이 때 상기의 보호화 방법은 당업계에서 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물의 R1 치환기가 하이드록시기인 경우, 상기 화합물은 -78 내지 0℃의 통상의 유기용매 내에서 Si(silane)를 함유하는 화합물, 예컨대 TBSCl을 이용하여 상기 하이드록시기를 보호한 후 반응에 사용할 수 있다.

이와 같이, 보호화 반응이 수행되는 경우에는, 후술하는 c) 단계 후에 상기 보호기를 탈보호화하는 반응을 추가로 수행한다. 이 때, 상기 탈보호화 반응은 보호기의 종류에 따라 당업계에서 알려진 통상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

b) 단계: 이차 아민 화합물의 아실화

이어서, 상기 a) 단계에서 얻어진 이차 아민 화합물을 아실할라이드를 이용하여 아실화한다.

상기의 아실화는 당업계에서 알려진 통상의 방법을 이용하여 제한 없이 수행될 수 있는데, 바람직하게는 상기 아실할라이드로서 브로모아세틸 브로마이드, 클로로아세틸 클로라이드, 아이오도아세틸 아이오다이드, 하이드록시아세틸 브로마이드, 하이드록시아세틸 클로라이드, 하이드록시아세틸아이오다이드 등과 같은 친전자성 모이어티(electrophilic moiety)를 함유하는 것을 사용한다. 보다 바람직하게는 상기 아실할라이드로 브로모아세틸 브로마이드(bromoacetyl bromide), 클로로 아세틸클로라이드(chloroacetyl Chloride) 등을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 브로모아세틸 브로마이드를 사용한다.

구체적으로, 본 단계에서는, 아실할라이드의 유기용액에, 상기 a) 단계에서 제조된 이차 아민 화합물과 염기(바람직하게는 트리에틸아민(Triethylamine))와의 유기혼합물 용액을, 적정 온도(예: -90 내지 -50℃)의 아르곤 분위기 하에서 떨어뜨려 아실화한 다음, 통상의 추출, 건조, 여과, 농축 및 정제과정 등을 거친다.

이 때, 상기 유기용액을 제조하는데 사용되는 유기용매는 통상의 유기용매를 사용할 수 있으며, 아실할라이드 및 이차 아민 화합물의 구체적인 종류에 따라 당업자가 적절히 결정할 수 있다.

c) 단계: 1,3- 디폴라 고리화 및 고리화된 생성물의 산화성 방향족화

마지막으로, 상기 b) 단계에서 얻어진 아실화된 화합물을 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘(여기에서, R₄, R₅, R₆ 및 R₇은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같음)으로 처리한 후, 그로부터 얻어진 조 생성물을 고리화하고, 이어서 산화성 방향족화시킨다.

구체적으로, 상기 b) 단계에서 얻어진 아실화된 화합물을 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘과 반응시킴으로써 피리딘 염 화합물을 산출한다. 이 때, 상기 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘 유도체는 예를 들면 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.

[화학식 2]

(상기 화학식 2에서, R₄, R₅, R₆ 및 R₇은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)

이어서 상기 피리딘 염 화합물(조 생성물)을 유기용매로 희석시킨 후 고리화를 위한 적절한 시약, 바람직하게는 강염기를 처리하거나, 또는 강염기와 루이스산을 동시에 처리하여 고리화한다. 상기 강염기 또는 루이스산으로는 공지의 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 1,8-디아자비시클로-[5.4.0]운덱-7-엔(DBU)를 단독 처리하거나, 또는 DBU와 코발트(Ⅱ) 클로라이드 헥사하이드레이트를 동시에 처리할 수 있다. 이 때, 얻고자 하는 형광 화합물의 종류에 따라 필요한 경우에는 통상의 방법으로 극초단파 조사(microwave irradiation) 등을 수행할 수도 있다. 그 결과 얻어지는 생성물은 방향족화 되지 않은 생성물과 방향족화된 생성물의 혼합물이다.

이어서 일용기에서 상기 혼합물에 산화성 방향족화를 위한 적절한 시약, 바람직하게는 산화제, 보다 바람직하게는 퀴논계열 산화제를 첨가하여 방향족화 되지 않은 생성물을 방향족화한다. 이 때, 상기 퀴논계열 산화제로는 제한이 없으나, 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ)을 예로 들 수 있다.

마지막으로, 방향족화된 화합물을 통상의 추출, 건조, 여과, 농축 및 정제하여 본 발명의 형광 화합물을 얻는다.

한편, 본 발명의 형광 화합물은 R₁ 및/또는 R₂ 치환기, 바람직하게는 R₁ 치환기의 변형을 통하여 바이오 프로브로서의 응용 가능성을 높일 수 있다. 즉, 본 발명의 형광 화합물은 R₁ 및/또는 R₂ 치환기에 의해서 라벨링하고자 하는 관심 단백질의 모이어티에 보다 선택적으로 결합될 수 있다.

이 때, 예를 들어, R₁ 치환기로서 메탄설포닐기, 아자이드기, NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임) 또는 말레이미드기 등을 갖는 형광 화합물을 얻고자 하는 경우, 상술한 바와 같이 처음부터 그러한 R₁ 치환기를 갖는 출발물질을 이용하여 목적을 달성할 수 있다.

그러나 상기 방법 외에, 먼저 R₁ 치환기로서 하이드록시기를 갖는 형광 화합물을 얻은 다음, 상기 하이드록시기를 순차적인 화학적 형질전환을 통해 메탄설포닐기, 아자이드기, NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임) 또는 말레이미드기 등으로 변형시키는 방법을 사용할 수 있다. 이하, 이에 대해 보다 상세히 설명한다.

ⅰ) 단계: 하이드록시기의 메탄설포닐기로의 전환

먼저, 상술한 제조방법에 의해 R₁ 치환기로서 하이드록시기를 갖는 형광 화 합물을 얻은 다음, 상기 화합물을 유기용매에 용해시키고, 메탄설포닐기(Ms)를 함유하는 화합물을 첨가하여 반응시킨다.

이 때, 상기 유기용매로는 통상의 유기용매를 제한 없이 사용할 수 있으며, 상기 메탄설포닐기를 함유하는 화합물로는 특별한 제한이 없으나, 바람직하게는 메탄설포닐기를 함유하는 할로겐화물, 보다 바람직하게는 MsCl(methanesulfonyl chloride) 등을 사용할 수 있다.

상기 반응이 완료된 후에는 증류수를 첨가하고, 통상의 추출, 여과, 정제 등의 과정을 거칠 수 있다.

ⅱ) 단계: 메탄설포닐기의 아자이드(N ₃ )기로의 전환

이어서, 상기 ⅰ) 단계에서 얻어진 화합물(R₁ = 메탄설포닐기)을 N₃를 함유하는 화합물과 함께 유기용매에 용해시켜 반응시킨다.

이 때, 상기 N₃를 함유하는 화합물로는 특별한 제한이 없으나, 바람직하게는 NaN₃, TsN₃, TMSN₃등을 사용할 수 있으며, 상기 유기용매 또한 통상의 유기용매를 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 DMF를 사용한다.

상기 반응은 30~100℃, 바람직하게는 40~80℃의 아르곤 기체 하에서 수행될 수 있다. 또한 상기 반응이 완료된 후에는 증류수를 첨가하여 반응을 켄치(quench)시킨 다음, 통상의 추출, 여과, 정제 등의 과정을 거칠 수 있다.

ⅲ) 아자이드기의 NH ₂ 기로의 전환

이어서, 상기 ⅱ) 단계에서 얻어진 화합물(R₁ = 아자이드기)을 유기용매에 용해시킨 후 환원제를 첨가하여 반응시킨다.

이 때, 상기 환원제로는 트리페닐포스핀(PPh₃), LiAlH, NaBH₄, Pd-C 등의 환원제를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매로는 통상의 용매를 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 반응이 완료된 후에는 통상의 추출, 여과, 정제 등의 과정을 거칠 수 있다.

ⅳ) NH ₂ 기의 말레이미드기로의 전환

이어서, 상기 ⅲ) 단계에서 얻어진 화합물(R₁ = NH₂)을 말레이미드기를 함유하는 화합물과 함께 유기용매에 용해시켜 반응시킴으로써, R1 치환기가 말레이미드기인 형광 화합물을 얻는다.

이 때, 상기 말레이미드기를 함유하는 화합물로는 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 3-말레이미도프로피온산 N-히드록시 숙신이미드 에스테르, 4-말레이미도부티린산 N-숙신이미딜 에스테르(4-Maleimidobutyric Acid N-Succinimidyl Ester), 4-말레이미도부티린산(4-Maleimidobutyric Acid) 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 유기용매는 통상의 유기용매를 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 DCM을 사용한다.

상기 반응은 바람직하게는 -10 내지 10℃의 아르곤 기체 하에서 수행될 수 있고, 반응 혼합물을 주위 온도까지 데운 후 12시간 내지 36시간 정도 주위 온도에서 교반하는 것이 바람직하다. 상기 반응이 완료된 후에는 통상의 정제과정을 거칠 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

재료준비 및 일반내용

1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker DRX-300(Bruker Biospin, Germany) 및 Varian Inova-500(Varian Assoc., Palo Alto, USA)를 사용하여 기록되었으며, 화학적 이동(chemical shift)은 내부 테트라메틸실란 표준의 ppm의 낮은 장(downfield) 범위를 측정하였다.

다중도(multiplicity)는 다음과 같이 표시하였다: s(singlet); d(doublet); t(triplet); q(quartet); m(multiplet); dd(doublet of doublet); ddd(doublet of doublet of doublet); dt(doublet of triplet); td(triplet of doublet); brs(broad singlet).

커플링 상수는 Hz로 기록하였다. 질량 분석(routine mass analyses)은 역상컬럼(C-18, 50× 2.1mm, 5㎛)이 구비된 LC/MS 시스템과 전자 분무 이온화(ESI) 또 는 대기압 화학 이온화(APCI)를 이용한 광다이오드 분석 탐지기 상에서 수행되었다.

소망하는 형광 화합물의 동정은 고분해능 질량분석기(HRMS; high-resolution mass spectrometry)에 의해 확인하였다. HRMS 분석은 서울대학교의 질량분석 실험실에서 전자 충격(EI) 또는 화학적 이온화(CI)를 이용한 JEOL JMS 600W 스펙트로미터, 및 FAB(fast atom bombardment) 방법을 이용한 JEOL JMS AX505WA 스펙트로미터를 이용하여 수행하였다.

최종 형광 화합물의 UV 흡수는 UV-VISIBLE 스펙트로포토미터 (UV-1650PC, SHIMADZU, Japan)에 의해 측정하였다. 여기 최대량과 방출 최대량은 Cary Eclipse 형광 스펙트로포토미터 (Varian Assoc., Palo Alto, USA)에 의해 측정하였다. 양자 수득률(absolute quantum yield)은 Absolute PL 양자 수득률 측정 시스템(C9920-20, Hamamatsu, Japan)에 의해 측정하였다.

알라니놀, 크로톤알데히드(crotonaldehyde), 및 트리에틸아민(TEA)은 TCI(Japan)으로부터 구입하였다. 시남알데히드(cinnamaldehyde), 디이소부틸알루미늄 하이드라이드(diisobutylaluminium hydride), 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운덱-7-엔(DBU), t-부틸디메틸실릴 클로라이드(TBSCl), 이미다졸, 소듐 보로하이드라이드, 2-메톡시시남알데히드, 4-디메틸아미노시남알데히드, 브로모아세틸 브로마이드, 소듐 하이드라이드, 피리딘 유사체, 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ), 아세트산, 무수 디메틸 포름아미드(DMF)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Micro BCATM 단백질 분석 키트는 PIERCE (Rockford, Ⅰ1. USA)에서 구입하였다. Microcon®은 Millipore (Bedford, MA, USA)에서 구입하였다. 마우스 γ-글로불린은 Jackson Immuno Research Laboratory(West Grove, PA, USA)에서 구입하였다. Cetuximab(Erbitux®)는 Merck KGaA에서 구입하였다.

반응의 진행은 TLC(실리카 겔 60 F254 0.25mm)를 이용하여 모니터하였으며, 구성성분은 UV 광(254nm, 365nm) 하에서 관찰함으로써 또는 TLC 플레이트를 아니스알데히드(anisaldehyde), KMNO4, 및 포스포몰리브딘산으로 처리한 후 가열함으로써 시각화하였다. 특별한 언급이 없으면, 모든 반응은 건조한 아르곤 대기 하 오븐-건조한 글래스웨어(glassware)에서 수행하였다.

톨루엔과 THF는 사용 전에 즉시 소듐벤조페논으로부터 증류에 의해 건조하였다. DCM(CH₂Cl₂)는 CaH₂로부터 증류하였으며, TEA는 KOH로부터 증류시켰다. 다른 용매 및 유기 시약은 시중에서 구입하였고, 다른 언급이 없으면 추가의 정제없이 사용하였다. 증류수는 이온 교환 및 여과에 의해 마무리하였다. 극초단파(microwave) 반응은 CEM Discover® Benchmate를 이용하여 수행되었으며, 그 반응 조건은 실험 과정에서 기재하였다.

(E)-3-( 사이오펜 -2-일)아크릴알데히드의 제조

대부분의 α,β-불포화 알데히드는 시중에서 구입하여 추가의 정제없이 사용하였다. 그러나,하기 화학식 3의 (E)-3-(사이오펜-2-일)아크릴알데히드는 다음의 과정을 이용하여 합성하였다:

(1)(E)-3-(사이오펜-2-일)프로프-2-엔-1-올((E)-3-(thiophen-2-yl) prop-2-en-1-ol)의 제조

: 2-사이오펜아크릴산(300 mg, 1.95 mmol)이 DCM(20 mL)에 용해되어 있는 용액을 15분간 -20℃까지 냉각시켰다. 그 후 DIBAL(1.0 M solution in THF, 5.84 mL)을 방울방울 첨가하였다. 반응이 완료된 후 포화 포타슘 소듐 타르트레이트 용액(saturated potassium sodium tartrate solution)을 상기 용액에 첨가하고, 유기물질을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 결합된 유기층을 브린으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 다음, 여과 후 진공 상(in vacuo)에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 252 mg의 (E)-3-(사이오펜-2-일)프로프-2-엔-1-올을 수득하였다(92.3%).

(2) (E)-3-(사이오펜-2-일)아크릴알데히드의 제조

: Dess-Martin periodinate(563 mg, 1.328 mmol)을 (E)-3-(사이오펜-2-일)프로프-2-엔-1-올(124 mg, 0.886 mmol)의 DCM(3 mL) 용액에 첨가하였다. TLC에 의해 반응 완료를 모니터한 후, 포화 Na₂S₂O₃ 용액을 첨가하여 반응을 켄치시켰다. 그 후 포화된 NaHCO₃를 상기 용액에 첨가하고, 유기 물질을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 결합된 유기층을 브린으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 다음, 여과 후 진공 상(in vacuo)에서 농축시켰다. 잔류물을 실리칼 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 120 mg의 (E)-3-(사이오펜-2-일)아크릴알데히드를 수득하였다(98%).

[화학식 3]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.61 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 3.5, 5.0 Hz, 1H), 6.50 (dd, J = 8.0, 15.5 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 193.1, 144.6, 139.4, 132.2, 130.5, 128.7, 127.4; LRMS (EI) m/z calcd for C7H6OS [M+H]+ 138.01; found: 138.02.

[ 실시예 1: 본 발명의 형광 화합물의 제조]

[반응식 1]

상기 반응식 1에서,

a는 TBSCl, 이미다졸, DCM, 0℃이고,

b는 ① R₃ 치환기를 갖는 α,β-불포화 알데히드, 아세트산, Na₂SO₄, DCM, 상온, ② NaBH₄, DCM, MeOH, 0℃이고,

c는 브로모아세틸 브로마이드, TEA, DCM, -78℃이고,

d는 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘이고(이 때, R₄, R₆ 및 R₇는 수소임),

e는 ① DBU in 톨루엔, ② DDQ이고,

f는 HF:피리딘:THF (v:v:v = 5:5:90), TMSOMe이다.

1단계: α,β-불포화 알데히드의 환원성 아미노화에 의한 이차 아민 화합물의 제조

1. 1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2- 아민(반응식 1의 2번 화합물)의 제조

0℃에서 교반된 이미다졸(10.9 g, 159.77 mmol) 및 알라니놀(반응식 1의 1번 화합물(5.0 g, 66.5 mmol))의 DCM(150 mL) 용액에 TBSC1(12.0 g, 79.9 mmol)의 DCM(50 mL) 용액을 방울방울 첨가하였다. 그 후 반응 혼합물을 상온에서 4시간 동안 교반하였다. TLC에 의해 상기 반응의 완료를 모니터한 후, 포화된 NaHCO₃ 용액을 첨가하고, 유기물질을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 여과하고 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 12.6 g의 2번 화합물을 정량적인 수율로 수득하였다.

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ3.52-3.49 (m, 1H), 3.28-3.24 (m, 1H), 3.00-3.24 (m, 1H), 0.99 (d, J = 3.5 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ70.0, 48.6, 25.9, 19.4, 18.4, -5.3; LRMS (EI) m/z calcd for C9H23NOSi [M+ACN+H]+ 231.18; found : 231.15.

2. 환원성 아미노화에 의한 이차 아민 화합물(반응식 1의 3번 화합물)의 제 조

일반적인 절차

상기 2번 화합물 1당량 및 R₃ 치환기를 갖는 α,β-불포화 알데히드 2당량을 무수 Na₂SO₄의 존재 하에 무수 DCM(0.3M)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 10mol%의 아세트산으로 산성화하였다. 그 결과 얻어진 반응 혼합물을 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 여과를 통해 Na₂SO₄를 제거하고, MeOH를 여과물에 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시켰다. 그러고 나서 NaBH₄(2 당량)를 첨가하고 반응 혼합물을 상온에서 교반하였다. TLC에 의해 반응의 완료를 모니터한 후, 포화된 NaHCO₃ 용액을 상기 용액에 첨가하고, 유기물질을 DCM으로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 여과 후 진공 중에서 농축하였다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하여 3번 화합물을 수득하였다.

(1)(E)-N-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일) 부트 -2-엔-1-아민(3A)

R₃ 치환기로서 메틸기(A)를 갖는 불포화 알데히드(크로톤알데히드)를 이용하여 하기 화학식 4의 3A 화합물을 수득하였다.

[화학식 4]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.59-5.54 (m, 2H), 3.51 and 3.41 (ABX, JAB = 9.8 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX= 7.5 Hz, 2H), 3.23 and 3.10 (ABX, JAB = 13.1 Hz, JAX = 5.7 Hz, JBX = 6.0 Hz, 2H), 2.77-2.74 (m, 1H), 2.67 (dd, J = 1.0, 6.0 Hz, 3H), 0.99 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.04 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 129.9, 127.0, 67.3, 54.1, 49.2, 26.0, 18.4, 18.0, 17.0, -5.2; LRMS (EI) m/z calcd for C13H29NOSi [M+H]+ 244.20; found : 244.16.

(2) (E)-N-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-3- 페닐프로프 -2-엔-1-아민 (3B)

R₃ 치환기로서 페닐기(B)를 갖는 불포화 알데히드(시남알데히드)를 이용하여 하기 화학식 5의 3B 화합물을 수득하였다.

[화학식 5]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.37 (d, J = 8.5Hz, 2H), 7.30 (t, J = 7.5, 12.0 Hz, 2H), 7.21 (tt, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.31 (td, J = 6.0, 16 Hz, 1H), 3.57 and 3.46 (ABX, JAB = 9.9 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX = 7.3 Hz, 2H), 3.51-3.47 (m, 1H), 3.40-3.35 (m, 1H), 2.86-2.83 (m, 1H), 1.03 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.07 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 137.5, 131.1, 129.2, 128.7, 127.4, 126.5, 67.5, 54.2, 49.5, 26.2, 18.5, 17.2, -5.1; LRMS (EI) m/z calcd for C18H31NOSi [M+H]+ 306.22; found : 306.21.

(3) (E)-N-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-3-(2- 메톡시페닐 ) 프 로프-2-엔-1-아민 (3C)

R₃ 치환기로서 2-메톡시페닐기(C)를 갖는 불포화 알데히드(2-메톡시시남알데히드)를 이용하여 하기 화학식 6의 3C 화합물을 수득하였다.

[화학식 6]

1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.42 (dd, J = 1.3, 7.5 Hz, 1H), 7.20 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.94-6.82 (m, 3H), 6.31 (td, J = 6.4, 16.0 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.59-3.36 (m, 4H), 2.85-2.82 (m, 1H), 1.03 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.90 (s, 9H), 0.06 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 156.6, 129.6, 128.4, 126.9, 128.4, 126.9, 126.4, 125.8, 120.7, 110.9, 67.4, 55.5, 54.1, 49.9, 26.0, 18.4, 17.0, -5.2; LRMS(EI) m/z calcd for C19H33NO2Si [M+H]+ 336.23; found : 336.27.

(4) (E)-N-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-3-( 사이오펜 -2-일)프로프-2-엔-1-아민 (3D)

R₃ 치환기로서 2-사이오페닐기(D)를 갖는 불포화 알데히드(상기 화학식 2의 (E)-3-(사이오펜-2-일)아크릴알데히드)를 이용하여 하기 화학식 7의 3D 화합물을 수득하였다.

[화학식 7]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ7.11 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.95-6.93 (m, 1H), 6.90 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.14 (td, J = 6.5, 16.0 Hz, 1H), 3.56 and 3.44 (ABX, JAB = 9.6 Hz, JAX = 4.2 HZ, JBX = 7.0 Hz, 2H), 3.47-3.43 (m, 1H), 3.53-3.31 (m, 1H), 2.86-2.80 (m, 1H), 1.01 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 142.5, 128.9, 127.3, 125.0, 124.0, 123.8, 67.3, 54.0, 49.0, 26.1, 18.4, 17.0, -5.3; LRMS (EI) m/z calcd for C16H29NOSSi [M+H]+ 312.17; found : 312.18.

(5) (E)-4-(3-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2- 일라미노 ) 프로프 -1-에닐)-N,N- 디메틸벤젠아민 (3E)

R₃ 치환기로서 4-(디메틸아민)페닐기(E)를 갖는 불포화 알데히드(4-디메틸아미노시남알데히드)를 이용하여 하기 화학식 8의 3E 화합물을 수득하였다.

[화학식 8]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.27 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 6.11 (td, J = 6.5, 15.5 Hz, 1H), 3.55 and 3.45 (ABX, JAB = 9.9 Hz, JAX = 4.7 Hz, JBX = 7.0 Hz, 2H), 3.48-3.45 (m, 1H), 3.34-3.30 (m, 1H), 2.96 (s, 6H), 2.85-2.82 (m, 1H), 1.03 (d, J = 6.0Hz, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.07 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ150.2, 131.2, 127.4, 126.1, 124.7, 112.7, 67.5, 54.2, 49.8, 40.8, 26.2, 18.6, 17.2, -5.1; LRMS (EI) m/z calcd for C20H36NO2Si [M+H]+ 349.26; found : 349.22.

2단계: 이차 아민 화합물의 브로모아실화

브로모아세틸 브로마이드 1.5 당량을 아르곤 분위기 하 -78℃에서 무수 디클로로메탄(0.1M)에 첨가하였다. 그 후 상기 3번 화합물 1 당량과 트리에틸아민 2당량이 디클로로메탄(0.1 M)에 용해되어 있는 용액을 2시간에 걸쳐 방울방울 떨어뜨렸다. 반응이 완료된 후, 포화된 NaHCO₃ 용액을 첨가하고, 유기물질을 DCM으로 추 출하였다. 결합된 유기층을 Na₂SO₄를 이용하여 건조한 후, 여과하고, 진공 중에서 농축하였다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하여 상기 반응식 1의 4번 화합물(4A 내지 4E)을 얻었다.

3단계: 1,3- 디폴라 고리화 및 고리화된 생성물의 산화성 방향족화

조건 Ⅰ

반응식 1의 4번 화합물 1 당량과 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘 유도체(이 때, R₄, R₆ 및 R₇는 수소임, 5당량)를 무수 DCM에 용해시킨 후, 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 피리딘 유도체가 액체 형태인 경우, 피리딘 유도체는 그 자체가 용매로서 사용되었다. 4번 화합물의 완전한 소비를 TLC에 의해 모니터한 후, 반응 혼합물을 톨루엔으로 희석시키고, DBU 1.5 당량을 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 그 결과 얻어진 방향족화되지 않은 생성물과 충분히 방향족화된 생성물의 혼합물에 2,3-디클로로-5,6-디시아노히드로퀴논(DDQ)을 첨가하여 상기 방향족화되지 않은 생성물의 산화성 방향족화를 유도하였다. 반응 혼합물을 다시 30분 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 실리카 겔의 쇼트 베드(short bed)를 통해 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 반응식 1의 7번 화합물을 수득하였다. 이러한 조건 Ⅰ은 T-A3, T-A5 및 T-E2를 제외한 대부분의 형광 화합물을 합성하는데 사용되었다.

조건 Ⅱ

반응식 1의 4번 화합물 1 당량과 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘 유도체(이 때, R₄, R₆ 및 R₇는 수소임, 5당량)를 무수 DCM에 용해시킨 후, 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 피리딘 유도체가 액체 형태인 경우, 피리딘 유도체는 그 자체가 용매로서 사용되었다. 4번 화합물의 완전한 소비를 TLC에 의해 모니터한 후, 반응 혼합물을 톨루엔으로 희석시켰다. 이어서, 0.1 당량의 코발트(Ⅱ) 클로라이드 헥사하이드레이트 및 1.5 당량의 DBU를 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 그 결과 얻어진 방향족화되지 않은 생성물과 충분히 방향족화된 생성물의 혼합물에 2,3-디클로로-5,6-디시아노히드로퀴논(DDQ)을 첨가하여 상기 방향족화되지 않은 생성물의 산화성 방향족화를 유도하였다. 반응 혼합물을 다시 30분 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 실리카 겔의 쇼트 베드(short bed)를 통해 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 반응식 1의 7번 화합물을 수득하였다. 이러한 조건 Ⅱ는 T-A3 및 T-A5 형광 화합물을 합성하는데 사용되었다.

조건 Ⅲ

반응식 1의 4번 화합물 1 당량과 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘 유 도체(이 때, R₄, R₆ 및 R₇는 수소임, 5당량)를 무수 DCM에 용해시킨 후, 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 피리딘 유도체가 액체 형태인 경우, 피리딘 유도체는 그 자체가 용매로서 사용되었다. 4번 화합물의 완전한 소비를 TLC에 의해 모니터한 후, 반응 혼합물을 톨루엔으로 희석시키고, 1.5 당량의 DBU를 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 캡을 씌운 마이크로웨이브 용기 내에서 극초단파 조사(microwave irradiation)(300W, 110℃) 하 2시간 동안 가열하였다. 극초단파 조사 후, 반응 혼합물을 둥근 바닥 플라스크로 옮겨 담았다. 그 결과 얻어진 방향족화되지 않은 생성물과 충분히 방향족화된 생성물의 혼합물에 2,3-디클로로-5,6-디시아노히드로퀴논(DDQ)을 첨가하여 상기 방향족화되지 않은 생성물의 산화성 방향족화를 유도하였다. 반응 혼합물을 다시 30분 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 실리카 겔의 쇼트 베드(short bed)를 통해 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 반응식 1의 7번 화합물을 수득하였다. 이러한 조건 Ⅲ는 T-E2 형광 화합물을 합성하는데 사용되었다.

(1) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9- 메틸 -1,2- 디히드로피 롤로[ 3,4-b]인돌리진 -3-온 (T-A1)

4A 화합물과 R₅ 치환기로서 수소(1)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 9의 T-A1 화합물을 수득하였다.

[화학식 9]

1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 8.49 (td, J = 1.0, 6.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.82 (ddd, J = 1.0, 6.5, 9.0 Hz, 1H), 6.59 (dt, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 4.46-4.42 (m, 1H), 4.34 (AB q, JAB = 17.5 Hz, 2H), 3.77 and 3.74 (ABX, JAB = 10.3 Hz, JAX = 4.8 Hz, JBX = 5.2 Hz, 2H), 2.30 (s, 3H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.04 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ162.2, 137.3, 136.1, 125,2 119.6, 118.8, 117.4, 110.7, 102.2, 66.2, 48.7 43.0, 26.0, 18.3, 15.4, 9.1, -5.3; HRMS (EI) m/z calcd for C20H30N2O2Si [M]+: 358.2077; found : 358.2080

(2) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9- 메틸 -7- 페닐 -1,2- 디히 드로피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 (T-A3)

4A 화합물과 R₅ 치환기로서 페닐기(3)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 10의 T-A3 화합물을 수득하였다.

[화학식 10]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.53 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 7.65 (dd, J = 1.0, 8.5 Hz,2H), 7.57 (s, 1H), 7.45 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.37-7.33 (m, 1H), 6.92 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.49-4.45 (m, 1H), 4.35 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 3.79 and 3.76 (ABX, JAB = 10.1 Hz, JAX = 5.0 Hz, JBX = 5.2 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 1.33 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.04 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ162.0, 139.6, 137.7, 136.7, 131.6, 129.0, 127.6, 126.6, 125.1, 119.5, 114.4, 110.5, 103.1, 66.2, 48.8, 43.0, 26.0, 18.3, 15.4, 9.3, -5.3; LRMS (EI) m/z calcd for C26H34N2O2Si [M+H]+ 435.24; found : 435.35

(3) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9- 메틸 -3-옥소-2,3- 디히 드로-1H- 피롤로[3,4-β]인돌리진 -7- 카르보니트릴 (T-A4)

4A 화합물과 R₅ 치환기로서 니트릴기(4)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 11의 T-A4 화합물을 수득하였다.

[화학식 11]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.49 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H), 6.69 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 4.48-4.44 (m, 1H), 4.39 (AB q, JAB= 17.0 Hz, 2H), 3.79 and 3.74 (ABX, JAB= 10.5 Hz, JAX = 4.2 Hz, JBX = 5.2 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H), 1.33 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.05 (s, 3H) 0.02 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ 161.1, 136.6, 134.9, 125.0, 124.6, 123.2, 118.8, 110.1, 107.5, 100.7, 65.9, 49.0, 43.0, 25.8, 18.2, 15.2, 9.2, -5.5; LRMS (APCI) m/z calcd for C21H29N3O2Si [M+H]+: 384.20; found : 384.32.

(4) 7-아세틸-2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9- 메틸 -1,2- 디 히드로피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 (T-A5)

4A 화합물과 R₅ 치환기로서 아세틸기(5)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 12의 T-A5 화합물을 수득하였다.

[화학식 12]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.45 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.17 (dd, J = 2.0, 7.5 Hz, 1H), 4.48-4.45 (m, 1H), 4.37 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 3.78 and 3.74 (ABX, JAB = 10.3 Hz, JAX = 4.7 Hz, JBX = 5.2 Hz, 2H), 2.61 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.86 (s, 9H), 0.04 (s, 3H), 0.02 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.8, 161.6, 136.3, 135.9, 127.2, 124.3, 120.4, 108.6, 108.2, 66.1, 49.0, 43.1, 31.1, 26.2, 25.9, 18.3, 15.4, 9.5, -5.4; LRMS (APCI) m/z calcd for C22H32N2O3Si [M]+: 401.22; found : 401.33.

(5) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9- 페닐 -1,2- 디히드로피 롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 (T-B1)

4B 화합물과 R₅ 치환기로서 수소(1)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 13의 T-B1 화합물을 수득하였다.

[화학식 13]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.61 (td, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 7.82 (td, J = 1.0, 9.0 Hz, 1H), 7.55(dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 2H), 7.46 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.297.26 (m, 1H), 6.97 (ddd, J = 1.5, 6.5, 9.5 Hz, 1H), 6.87 (dt, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.57 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 4.544.48 (m, 2H), 3.81 and 3.77 (ABX, JAB = 10.4 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX = 5.3 Hz, 2H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.04 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.9, 136.1, 135.2, 134.9, 129.1, 127.1, 125.9, 125.6, 121.2, 121.0, 118.4, 111.7, 108.8, 66.2, 48.8, 44.1, 25.9, 18.3, 15.5, -5.4; LRMS (APCI) m/z calcd for C25H32N2O2Si [M+H]+: 421.22; found : 421.36.

(6) 2-(1-( 텨서리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-7- 메톡시 -9- 페닐 -1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T-B2)

4B 화합물과 R₅ 치환기로서 메톡시기(2)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 14의 T-B2 화합물을 수득하였다.

[화학식 14]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.46 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.28-7.22 (m, 1H), 7.05 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.47 (dd, J = 2.0, 7.5 Hz, 1H), 4.52 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 4.47-4.44 (m, 1H), 3.85(s, 3H), 3.81-3.74 (m, 2H), 1.33 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.04 (s, 3H); HRMS (EI) m/z calcd for C30H36N2O3Si [M]+: 500.2495; found : 500.2495.

(7) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-7,9- 디페닐 -1,2- 디히드 로피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 (T-B3)

4B 화합물과 R₅ 치환기로서 페닐기(3)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 15의 T-B3 화합물을 수득하였다.

[화학식 15]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.66 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.65 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 2H), 7.59 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 2H), 7.50-7.45 (m, 4H), 7.37 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 7.34 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.03 (dd, J = 2.0, 7.5 Hz, 1H), 4.59 (AB q, JAB = 16.8 Hz, 2H), 4.53-4.50 (m, 1H), 3.83 and 3.79 (ABX, JAB= 10.1 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX = 4.7 Hz, 2H), 1.36 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.90 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.06 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.8, 139.4, 136.5, 135.9, 134.9, 129.2, 129.1, 128.0, 127.3, 126.7, 126.0, 125.6, 120.9, 115.4, 109.6, 66.2, 48.8, 44.1, 26.0, 18.3, 15.5, -5.4; LRMS (APCI) m/z calcd for C31H36N2O2Si [M+H]+: 497.25; found : 497.33.

(8) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-3-옥소-9- 페닐 -2,3- 디히드로 -1H- 피롤로[3,4-β]인돌리진 -7- 카르보니트릴 (T-B4)

4B 화합물과 R₅ 치환기로서 니트릴기(4)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 16의 T-B4 화합물을 수득하였다.

[화학식 16]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.61 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 8.16 (t, J = 1.0 Hz, 1H), 7.51 (m, 4H), 7.38-7.35 (m, 1H), 6.79 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 4.60 (AB q, JAB = 17.3 Hz, 2H), 4.55-4.49 (m, 1H), 3.82 and 3.76 (ABX, JAB = 10.5 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX = 5.0 Hz, 2H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz CDCl3) δ 161.0, 135.7, 133.5, 133.1, 129.5, 127.6, 127.3, 125.8, 125.5, 124.2, 118.6, 113.6, 111.1, 103.0, 66.0, 49.1, 44.1, 25.9, 18.2, 15.4, -5.4; LRMS (APCI) m/z calcd for C26H31N3O2Si [M+H]+: 446.22; found : 446.36.

(9) 7-아세틸-2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9- 페닐 -1,2- 디 히드로피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 (T-B5)

4B 화합물과 R₅ 치환기로서 아세틸기(5)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 17의 T-B5 화합물을 수득하였다.

[화학식 17]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.58 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.56 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H), 7.51 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.59 (AB q, JAB = 17.3 Hz, 2H), 4.52- 4.49 (m, 1H), 3.82 and 3.77 (ABX, JAB = 10.4 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX = 4.8 Hz, 2H), 2.61 (s, 3H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.04 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ195.7, 161.4, 135.5, 134.5, 133.9, 129.4, 129.2, 127.6, 126.9, 124.8, 123.6, 121.4, 114.1, 109.5, 66.1, 49.1, 44.1, 26.2, 25.9, 18.3, 15.4, -5.3; LRMS (APCI) m/z calcd for C27H34N2O3Si [M+H]+: 463.23; found : 463.31.

(10) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-(2- 메톡시페닐 )-1,2-디히드로피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- C1 )

4C 화합물과 R₅ 치환기로서 수소(1)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 18의 T-C1 화합물을 수득하였다.

[화학식 18]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.60 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.18 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.07-7.01 (m, 2H), 6.90 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.69 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.51-4.44 (m, 1H), 4.39 (AB q, JAB = 17.5 Hz, 2H), 3.88(s, 3H), 3.78-3.77 (m, 2H), 1.31 (d, J = 7.0 Hz, 3), 0.88 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.04 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.0, 156.7, 136.9, 136.8, 130.4, 127.9, 125.3, 123.1, 120.9, 120.7, 120.6, 118.8, 111.4, 111.2, 104.9, 66.2, 55.5, 48.8, 44.6, 26.0, 18.3, 15.4, -5.3; LRMS (APCI) m/z calcd for C26H34N2O3Si [M+H]+: 450.23; found : 451.34.

(11) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-7- 메톡시 -9-(2- 메톡시페닐 )-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- C2 )

4C 화합물과 R₅ 치환기로서 메톡시기(2)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 19의 T-C2 화합물을 수득하였다.

[화학식 19]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.45 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.48 (dd, J = 2.0, 7.5 Hz, 1H), 7.31 (dt, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.08-7.03 (m, 2H), 6.83 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.43 (dd, J = 2.5, 7.5 Hz, 1H), 4.46-4.42 (m, 1H), 4.36 (AB q, JAB = 17.3 Hz, 2H), 3.88(s, 3H), 3.79(s, 3H), 3.77(d, J = 5.0 Hz, 2H), 1.30 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.05 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.0, 156.6, 154.8, 138.3, 138.1, 130.0, 127.6, 126.5, 123.5, 121.0, 119.4, 111.3, 106.5, 103.2, 95.6, 66.2, 55.5, 55.4, 48.7, 44.6, 26.0, 18.3, 15.5, -5.4; LRMS (APCI) m/z calcd for C27H36N2O4Si [M+H]+: 481.24; found : 481.32.

(12) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-(2- 메톡시페닐 )-7- 페 닐-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- C3 )

4C 화합물과 R₅ 치환기로서 페닐기(3)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 20의 T-C3 화합물을 수득하였다.

[화학식 20]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.66 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.62 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.54 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.44 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.10-7.05 (m, 2H), 7.02(dd, J = 2.0, 7.0 Hz, 1H), 4.54-4.50 (m, 1H), 4.42 (AB q, JAB = 17.2 Hz, 2H), 3.90(s, 3H), 3.81-3.80 (m, 2H), 1.33 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.90 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.07 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.0, 156.8, 139.5, 137.5, 137.3, 133.4, 130.5, 129.0, 128.0, 127.8, 126.7, 125.3, 123.1, 121.0, 120.6, 115.8, 111.3, 105.8, 66.2, 55.6, 48.9, 44.7, 26.0, 18.4, 15.4, -5.3; LRMS (APCI) m/z calcd for C32H38N2O3Si [M+H]+: 527.27; found : 527.36.

(13) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-(2- 메톡시페닐 )-3-옥소-2,3- 디히드로 -1H- 피롤로[3,4-β]인돌리진 -7- 카르보니트릴 (T- C4 )

4C 화합물과 R₅ 치환기로서 니트릴기(4)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 21의 T-C4 화합물을 수득하였다.

[화학식 21]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.60 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.40 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 7.09 (dt, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 4.44 (AB q, JAB = 17.5 Hz, 2H), 4.53-4.47 (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.83-3.76 (m, 2H), 1.31 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.04 (s, 3H); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ 161.2, 156.8, 137.3, 134.4, 130.6, 129.2, 126.4, 125.3, 123.9, 121.3, 121.2, 118.8, 111.5, 110.9, 110.0, 102.4, 66.0, 55.6, 49.1, 44.7, 25.9, 18.3, 15.3, -5.3; LRMS (EI) m/z calcd for C27H33N3O3Si [M+H]+: 476.23; found : 476.30.

(14) 7-아세틸-2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-(2- 메톡시 페닐)-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- C5 )

4C 화합물과 R₅ 치환기로서 아세틸기(5)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 22의 T-C5 화합물을 수득하였다.

[화학식 22]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.58 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.48 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.40 (dt, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.11 (dt, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.50-4.47 (m, 1H), 4.43 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.80 and 3.77 (ABX, JAB = 10.4 Hz, JAX = 5.0 Hz, JBX = 5.3 Hz, 2H), 2.57 (s, 3H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.04 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 195.7, 161.4, 156.7, 137.0, 135.2, 130.6, 128.8, 128.6, 124.5, 123.2, 122.1, 122.0, 121.1, 111.4, 110.3, 109.1, 66.0, 55.5, 49.0, 44.6, 29.8, 26.0, 18.3, 15.3, -5.4; (APCI) m/z calcd for C28H36N2O4Si [M+H]+ : 493.24, found : 493.30.

(15) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-( 사이오펜 -2-일)-1,2-디 히드로피롤로[3,4-β]인돌 리진-3-온 (T- D1 )

4D 화합물과 R₅ 치환기로서 수소(1)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 23의 T-D1 화합물을 수득하였다.

[화학식 23]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.59 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.24 (td, J = 1.5, 4.5 Hz, 1H), 7.12-7.09 (m, 2H), 7.01 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.72 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.55 (AB q, JAB= 17.5 Hz, 2H), 4.50-4.46 (m, 1H), 3.83-3.75 (m, 2H), 1.36 (d, J = 5.0 Hz, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.05 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.7, 137.2, 135.7, 134.8, 127.7, 125.5, 122.3, 122.0, 121.5, 120.9, 118.6, 111.8, 102.8, 66.2, 48.8, 44.1, 25.9, 18.3, 15.4, -5.4; LRMS (APCI) m/z calcd for C23H30N2O2SSi [M+H]+: 427.18; found : 427.27.

(16) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-7- 메톡시 -9-( 사이오펜 -2-일)-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- D2 )

4D 화합물(100mg, 0.231mmol)과 R₅ 치환기로서 메톡시기(2)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 24의 T-D2 화합물을 수득하였다.

[화학식 24]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.43 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 4.5, 5.0 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 6.47 (dd, J = 2.5, 7.5 Hz, 1H), 4.51 (AB q, JAB = 17.5 Hz, 2H), 4.48-4.43 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.80 and 3.76 (ABX, JAB = 10.3 Hz, JAX = 4.8 Hz, JBX = 4.8 Hz, 2H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.03 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.7, 155.6, 137.8, 137.1, 136.3, 127.7, 126.7, 121.7, 121.3, 119.7, 106.7, 101.3, 95.7, 66.3, 55.5, 48.8, 44.1, 26.0, 18.3, 15.5, -5.3; LRMS (APCI) m/z calcd for C24H32N2O3SSi [M+H]+: 457.19; found : 457.28.

(17) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-7- 페닐 -9-( 사이오펜 -2-일)-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- D3 )

4D 화합물과 R₅ 치환기로서 페닐기(3)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학 식 25의 T-D3 화합물을 수득하였다.

[화학식 25]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.63 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.68 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.49 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 1.5, 5.0 Hz, 1H), 7.167.14 (m, 2H), 7.04 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.58 (AB q, JAB = 17.5 Hz, 2H), 4.52-4.49 (m, 1H), 3.83 and 3.79 (ABX, JAB = 10.4 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX = 4.8 Hz, 2H) 1.36 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.05 (s, 3H); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ 161.7, 139.2, 137.2, 136.1, 135.5, 134.4, 129.2, 128.1, 127.8, 126.8, 125.6, 122.5, 122.2, 120.9, 115.7, 111.6, 103.6, 66.2, 48.9, 44.2, 26.0, 18.3, 15.5, -5.4; LRMS (APCI) m/z calcd for C29H34N2O2SSi [M+H]+: 503.21; found : 503.28.

(18) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-3-옥소-9-( 사이오펜 -2-일)-2,3- 디히드로 -1H- 피롤로[3,4-β]인돌리진 -7- 카르보니트릴 (T- D4 )

4D 화합물과 R₅ 치환기로서 니트릴기(4)를 갖는 피리딘을 이용하여 기 화학식 26의 T-D4 화합물을 수득하였다.

[화학식 26]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.57 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.34 (dd, J = 2.5, 3.5 Hz, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.78 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.60 (AB q, JAB = 17.5 Hz, 2H), 4.51-4.48 (m, 1H), 3.83 and 3.76 (ABX, JAB = 10.4 Hz, JAX = 4.2 Hz, JBX = 5.0 Hz, 2H), 1.35 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 160.8, 135.3, 135.1, 133.1, 128.1, 125.8, 125.5, 124.4, 123.8, 118.5, 111.3, 107.4, 103.2, 66.0, 49.2, 44.2, 25.9, 18.3, 15.4, -5.3; LRMS (EI) m/z calcd for C24H29N3O2SSi [M+H]+: 452.18; found : 452.28.

(19) 7-아세틸-2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-( 사이오펜 -2-일)-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- D5 )

4D 화합물과 R₅ 치환기로서 아세틸기(5)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 27의 T-D5 화합물을 수득하였다.

[화학식 27]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.56 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.34 (dd, J = 1.0, 5.0 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.21 (dd, J = 1.0, 3.5 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 3.5, 5.0 Hz, 1H), 4.60 (AB q, JAB= 17.0 Hz, 2H), 4.52-4.48 (m, 1H), 3.83 and 3.77 (ABX, JAB = 10.5 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX = 5.0 Hz, 2H), 2.65 (s, 3H), 1.36 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 195.4, 161.1, 135.9, 135.0, 134.0, 129.2, 128.0, 124.7, 123.8, 123.5, 123.4, 121.4, 109.5, 107.7, 66.0, 49.0, 44.2, 26.1, 18.3, 15.4, -5.3; LRMS (EI) m/z calcd for C25H32N2O3SSi [M+H]+: 469.19; found : 469.26.

(20) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-(4-(디메틸아미노) 페닐 )-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- E1 )

4E 화합물과 R₅ 치환기로서 수소(1)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 28의 T-E1 화합물을 수득하였다.

[화학식 28]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.57 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.91-6.87 (m, 1H), 6.66 (t, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 4.54 (AB q, JAB = 16.8 Hz, 2H), 4.53-4.48 (m, 1H), 3.84-3.77 (m, 2H), 3.00 (s, 6H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.90 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.05 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 162.0, 149.0, 135.7, 134.7, 128.1, 128.0, 125.4, 120.5, 120.3, 118.6, 113.2, 109.1, 66.2, 48.7, 43.9, 40.8, 26.0, 18.3, 15.4, -5.4; LRMS (APCI) m/z calcd for C27H37N3O2Si [M+H]+: 464.27; found : 464.35.

(21) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-(4-(디메틸아미노) 페 닐)-7- 메톡시 -1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- E2 )

4E 화합물과 R₅ 치환기로서 메톡시기(2)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 29의 T-E2 화합물을 수득하였다.

[화학식 29]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.41 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.99 (s, 1H), 6.86 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.41 (dd, J = 2.5, 7.5 Hz, 1H), 4.48 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 4.47-4.43 (m, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.78 and 3.76 (ABX, JAB = 10.0 Hz, JAX = 5.0 Hz, JBX = 5.0 Hz, 2H), 3.01 (bs, 6H), 1.31 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.04 (s, 3H); LRMS (APCI) m/z calcd for C28H39N3O3Si [M+H]+: 494.28; found : 494.28.

(22) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-(4-(디메틸아미노) 페 닐)-7- 페닐 -1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- E3 )

4E 화합물과 R₅ 치환기로서 페닐기(3)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 30의 T-E3 화합물을 수득하였다.

[화학식 30]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.62 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.96 (bs, 1H), 7.65 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.50-7.44 (m, 4H), 7.36 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.55 (AB q, J = 17.5 Hz, 2H), 4.52-4.47 (m, 1H), 3.81 and 3.78 (ABX, JAB= 10.1 Hz, JAX = 5.0 Hz, JBX = 5.0 Hz, 2H), 3.02 (bs, 6H), 1.35 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.05 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.8, 139.4, 136.0, 135.2, 133.0, 129.0, 128.1, 127.6, 126.5, 125.3, 115.6, 113.3, 111.1, 109.9, 77.3, 66.1, 48.8, 43.9, 40.7, 25.9, 18.2, 15.4, -5.4; LRMS (APCI) m/z calcd for C33H41N3O2Si [M+H]+: 540.30; found : 540.39.

(23) 2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-(4-(디메틸아미노) 페닐 )-3-옥소-2,3- 디히드로 -1H- 피롤로[3,4-β]인돌리진 -7- 카르보니트릴 (T- E4 )

4E 화합물과 R₅ 치환기로서 니트릴기(4)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 31의 T-E4 화합물을 수득하였다.

[화학식 31]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.55 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.38 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.72 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.57 (AB q, JAB = 17.3 Hz, 2H), 4.50-4.46 (m, 1H), 3.83-3.74 (m, 2H), 3.03 (s, 6H), 1.33 (d, J = 7.5 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H); LRMS (EI) m/z calcd for C28H39N3O3Si [M+H]+: 489.261; found : 489.549.

(24) 7-아세틸-2-(1-( 터셔리 - 부틸디메틸실릴옥시 )프로판-2-일)-9-(4-(디메틸아미노) 페닐 )-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (T- E5 )

4E 화합물과 R₅ 치환기로서 아세틸기(5)를 갖는 피리딘을 이용하여 하기 화학식 32의 T-E5 화합물을 수득하였다.

[화학식 32]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.53 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.44 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.56 (AB q, JAB = 16.7 Hz, 2H), 4.51-4.47 (m, 1H), 3.81 and 3.76 (ABX, JAB = 10.3 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX = 5.0 Hz, 2H), 3.03 (s, 6H), 2.59 (s, 3H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.88 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.04 (s, 3H); HRMS (EI) m/z calcd for C29H39N3O3Si [M]+: 505.2754; found : 505.2760.

4단계: 탈보호화( deprotection )

일반적인 절차

7번 화합물의 THF 용액에 과량의 HF:피리딘:THF(5:5:90, v:v:v) 혼합용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 완료 후, 상기 반응을 메톡시트리메틸실란(TMSOMe)으로 켄치시켰으며, 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하여 상기 반응식 1의 8번 화합물을 수득하였다.

(1) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-9- 메틸 -1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (A1)

T-A1 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 33의 A1 화합물을 수득하였다.

[화학식 33]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.39 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 6.80 (dd, J = 6.5, 9.0 Hz, 1H), 6.57 (dd, J = 6.5, 7.0 Hz, 1H), 4.37-4.31 (m, 1H), 4.27 (AB q, JAB = 16.5 Hz, 2H), 3.85-3.71 (m, 2H), 2.21 (s, 3H), 1.29 (d, J = 7.5 Hz, 3H); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ 163.2, 137.7, 136.0, 125.2, 119.2, 119.1, 117.4, 110.9, 102.4, 65.9, 50.9, 43.0, 15.4, 9.2; HRMS (FAB) m/z calcd for C14H16N2O2 [M+H]+ : 245.1290; found : 245.1288.

(2) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-9- 메틸 -7- 페닐 -1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (A3)

T-A3 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 34의 A3 화합물을 수득하였다.

[화학식 34]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.34 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.46-7.42 (m, 2H), 7.39-7.35 (m, 2H), 6.84 (dd, J = 2.0, 7.5 Hz, 1H), 4.41-4.37 (m, 1H), 4.29 (AB q, JAB = 16.5 Hz, 2H), 3.86 and 3.76 (ABX, JAB = 11.7 Hz, JAX = 4.2 Hz, JBX = 8.3 Hz, 2H), 2.19 (s, 3H), 1.28 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.9, 139.4, 137.8, 136.6, 131.7, 129.0, 127.7, 126.5, 125.0, 118.9, 114.1, 110.4, 103.2, 65.6, 50.7, 42.7, 15.4, 9.2; HRMS (FAB) m/z calcd for C20H20N2O2 [M+H]+ : 321.1603; found : 321.1599.

(3) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-9- 메틸 -3-옥소-2,3- 디히드로 -1H- 피롤로[3,4-β]인돌리진 -7- 카르보니트릴 (A4)

T-A4 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 35의 A4 화합물을 수득하였다.

[화학식 35]

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.40 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 4.84 (t, J = 0.5 Hz, 1H), 4.38 (s, 2H), 4.27-4.22 (m, 1H), 3.55 and 3.51 (ABX, JAB= 10.6 Hz, JAX = 6.0 Hz, JBX = 5.2 Hz, 2H), 2.33 (s, 3H), 1.18 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 160.2, 136.5, 134.4, 125.5, 124.3, 122.6, 118.8, 110.2, 107.8, 99.4, 63.2, 49.0, 41.6, 15.2, 8.7; HRMS (FAB) m/z calcd for C15H15N3O2 [M+H]+ : 270.1243; found : 270.1237.

(4) 7-아세틸-2-(1-히드록시프로판-2-일)-9- 메틸 -1,2- 디히드로피롤로[3,4- β]인돌리진 -3-온 (A5)

T-A5 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 36의 A5 화합물을 수득하였다.

[화학식 36]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.34 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.12 (dd, J = 1.5, 7.5Hz, 1H), 4.41-4.38 (m, 1H), 4.34 (AB q, JAB= 16.8 Hz, 2H), 3.86 and 3.75 (ABX, JAB= 11.5 Hz, JAX = 3.5 Hz, JBX= 8.0 Hz, 2H), 2.60 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ 195.7, 162.5, 136.1, 136.0, 127.4, 124.3, 120.2, 108.6, 108.3, 65.7, 50.9, 43.0, 26.2, 15.3, 9.4; HRMS (FAB) m/z calcd for C16H18N2O3 [M+H]+ : 287.1396; found : 287.1393.

(5) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-9- 페닐 -1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (B1)

T-B1 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 37의 B1 화합물을 수득하였다.

[화학식 37]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.44 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.48-7.41 (m, 4H), 7.27-7.24 (m, 1H), 6.86 (ddd, J = 1.0, 6.5, 9.5 Hz, 1H), 6.58 (dt, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 4.49 (AB q, JAB = 16.5 Hz, 2H), 4.43-4.40 (m, 1H), 3.85 and 3.76 (ABX, JAB = 11.8 Hz, JAX = 4.0 Hz, JBX = 8.0 Hz, 2H), 1.29 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.7, 136.2, 135.0, 134.6, 129.1, 127.1, 125.9, 125.4, 121.4, 120.4, 118.1, 111.7, 108.8, 65.6, 50.5, 43.6, 15.4; HRMS (FAB) m/z calcd for C19H18N2O2 [M+H]+ : 307.1447; found : 307.1453.

(6) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-7- 메톡시 -9- 페닐 -1,2- 디히드로피롤로[3,4- β] 인돌리진 -3-온 (B2)

T-B2 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 38의 B2 화합물을 수득하였다.

[화학식 38]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.46 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 2H), 7.45 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.47 (dd, J = 2.0, 7.5 Hz, 1H), 4.40 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 4.47-4.31 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.81-3.74 (m, 2H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H); HRMS (FAB) m/ zcalcd for C20H20N2O3 [M+H]+ : 337.1552; found : 337.1550.

(7) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-7,9- 디페닐 -1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 (B3)

T-B3 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 39의 B3 화합물을 수득하였다.

[화학식 39]

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.57 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.78 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.49 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 7.39 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.28 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.84 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.61 (AB q, JAB = 17.5 Hz, 2H), 4.29-4.25 (m, 1H), 3.61-3.51 (m, 2H), 1.21 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 160.6, 138.1, 135.7, 135.2, 134.1, 133.0, 129.2, 129.1, 128.0, 126.9, 126.4, 125.8, 124.8, 120.5, 114.6, 111.4, 108.9, 63.4, 48.9, 42.5, 15.3; HRMS (FAB) m/z calcd for C25H22N2O2[M+H]+: 383.1760; found: 383.1769.

(8) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-3-옥소-9- 페닐 -2,3- 디히드로 -1H- 피롤로[3,4-β]인돌리진 -7- 카르보니트릴 (B4)

T-B4 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 40의 B4 화합물을 수득하였다.

[화학식 40]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.47 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 8.01 (t, J = 1.0 Hz, 1H), 7.49 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.48-7.43 (m, 2H), 7.38-7.35 (m, 1H), 6.67 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.55 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 4.48-4.44(m, 1H), 3.89-3.74 (m, 2H), 3.21 (bs, 1H), 1.33 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ 161.8, 135.5, 133.6, 132.8, 129.6, 127.6, 127.5, 125.5, 125.4, 123.8, 118.3, 113.7, 111.2, 103.2, 65.4, 50.7, 43.6, 15.3; HRMS (FAB) m/z calcd for C20H17N3O2 [M+H]+ : 332.1399; found : 332.1409.

(9) 7-아세틸-2-(1-히드록시프로판-2-일)-9- 페닐 -1,2- 디히드로피롤로[3,4- β] 인돌리진 -3-온 (B5)

T-B5 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 41의 B5 화합물을 수득하였다.

[화학식 41]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.41 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.50-7.49 (m, 4H), 7.36-7.34 (m, 1H), 7.13 (dd, J = 2.0, 7.5 Hz, 1H), 4.54 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 4.48-4.42 (m, 1H), 3.89 and 3.78 (ABX, JAB = 11.5 Hz, JAX = 4.0 Hz, JBX = 8.0 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 1.33 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.6, 162.2, 135.2, 134.5, 133.6, 129.5, 129.2, 127.5, 127.0, 124.7, 123.0, 121.1, 114.0, 109.5, 65.5, 50.8, 43.7, 26.2, 15.4; HRMS (FAB) m/z calcd for C21H20N2O3 [M+H]+: 349.1552; found: 349.1559.

(10) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-9-(2- 메톡시페닐 )-1,2- 디히드로피롤로[3,4- β] 인돌리진 -3-온 ( C1 )

T-C1 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 42의 C1 화합물을 수득하였다.

[화학식 42]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.52 (td, J = 1.5, 6.5 Hz, 1H), 7.55 (td, J = 1.5, 9.0 Hz, 1H), 7.45 (dd, J = 2.0, 7.5 Hz, 1H), 7.33-7.29 (m, 1H), 7.077.01 (m, 2H), 6.88 (ddd, J = 1.0, 7.0, 9.0 Hz, 1H), 6.64 (dt, J = 1.0, 6.5 Hz, 1H), 4.37-4.33 (m, 1H), 4.36 (AB q, JAB = 17.3 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.83 and 3.74 (ABX, JAB = 11.4 Hz, JAX = 4.5 Hz, JBX = 7.7 Hz, 2H), 1.31 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ 163.0, 156.6, 137.2, 136.7, 130.3, 128.0, 125.3, 122.8, 120.9, 120.2, 118.7, 111.6, 111.2, 105.1, 65.8, 55.5, 50.9, 44.8, 15.3; HRMS (FAB) m/z calcd for C20H20N2O3 [M+H]+ : 337.1552; found : 337.1548.

(11) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-7- 메톡시 -9-(2- 메톡시페닐 )-1,2- 디히드로피 롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 ( C2 )

T-C2 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 43의 C2 화합물을 수득하였다.

[화학식 43]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.41 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.48 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.32(t, J= 7.5 Hz, 1H), 7.08-7.03 (m, 2H), 6.83(d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.45 (dd, J = 2.5, 7.5 Hz, 1H), 4.33 (AB q, JAB = 16.8 Hz, 2H), 4.30-4.26 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.88-3.72 (m, 3H), 3.80 (s, 3H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 3H); HRMS (FAB) m/z calcd for C21H22N2O4 [M+H]+ : 366.1580; found : 366.1583.

(12) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-9-(2- 메톡시페닐 )-7- 페닐 -1,2- 디히드로피롤 로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 ( C3 )

T-C3 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 44의 C3 화합물을 수득하였다.

[화학식 44]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.51 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.53-7.52 (m, 2H), 7.46 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.41-7.38 (m, 2H), 7.35-7.32 (m, 2H), 7.06-7.02 (m, 2H), 6.91 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.42-4.37 (m, 1H), 4.39 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.87 and 3.78 (ABX, JAB = 11.4 Hz, JAX = 3.7 Hz, JBX = 8.0 Hz, 2H), 1.33 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 163.0, 156.7, 139.3, 137.5, 137.4, 133.6, 130.4, 129.0, 128.1, 127.8, 126.6, 125.2, 122.9, 121.0, 120.0, 115.5, 111.4, 111.3, 105.9, 65.9, 55.6, 51.1, 44.9, 15.4; HRMS (FAB) m/z calcd for C26H24N2O3 [M+H]+ : 412.1787; found : 412.1796.

(13) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-9-(2- 메톡시페닐 )-3-옥소-2,3- 디히드로 -1H-피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -7- 카르보니트릴 ( C4 )

T-C4 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 45의 C4 화합물을 수득하였다.

[화학식 45]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.50 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.39 (dt, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.08-7.04 (m, 2H), 6.69 (dd, J= 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.43-4.39 (m, 1H), 4.42 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.87-3.73 (m, 2H), 3.13 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 1.33 (d, J= 6.5 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.1, 156.7, 137.2, 134.5, 130.5, 129.4, 126.1, 125.2, 123.5, 121.2, 121.1, 118.6, 111.5, 111.0, 110.1, 102.5, 65.7, 55.6, 50.9, 44.7, 15.3; HRMS (FAB) m/z calcd for C21H19N3O3 [M+H]+ : 362.1505; found : 362.1501.

(14) 7-아세틸-2-(1-히드록시프로판-2-일)-9-(2- 메톡시페닐 )-1,2- 디히드로피 롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 ( C5 )

T-C5 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 46의 C5 화합물을 수득하였다.

[화학식 46]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.35 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 8.11-8.10 (m, 1H), 7.42 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.40-7.36 (m, 1H), 7.10-7.04 (m, 3H), 4.42-4.40 (m, 1H), 4.40 (AB q, JAB = 16.8 Hz, 2H), 3.90 (s, 1H), 3.86-3.75 (m, 3H), 2.51 (s, 3H), 1.30 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.8, 162.2, 156.7, 136.9, 135.2, 130.4, 128.8, 128.6, 124.3, 122.8, 121.9, 121.8, 121.1, 111.4, 110.4, 108.9, 65.4, 55.5, 50.7, 44.4, 26.0, 15.3; HRMS (FAB) m/ zcalcd for C22H22N2O4 [M+H]+ : 379.1658; found : 379.1648.

(15) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-9-( 사이오펜 -2-일)-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 ( D1 )

T-D1 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 47의 D1 화합물을 수득하였다.

[화학식 47]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.34 (td, J = 1.0, 6.5 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 1.0, 9.0 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 7.10-7.08 (m, 1H), 7.03 (dd, J = 1.0, 8.5 Hz, 1H), 6.88 (ddd, J = 1.0, 6.5, 9.0 Hz, 1H), 6.57 (dt, J= 1.0, 6.5 Hz, 1H), 4.45 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 4.44-4.38 (m, 1H), 3.87 and 3.77 (ABX, JAB = 11.6 Hz, JAX = 3.7 Hz, JBX = 8.0 Hz, 2H), 1.30 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.6, 137.0, 135.8, 134.6, 127.7, 125.4, 122.3, 122.1, 121.8, 120.3, 118.4, 111.9, 102.9, 65.6, 50.7, 43.7, 15.4; HRMS (FAB) m/z calcd for C17H16N2O2S[M]+ : 312.0932; found : 312.0931.

(16) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-7- 메톡시 -9-( 사이오펜 -2-일)-1,2- 디히드로 피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 ( D2 )

T-D2 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 48의 D2 화합물을 수득하였다.

[화학식 48]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.28 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 1.0, 5.0 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 4.0, 5.0 Hz, 1H), 6.98-6.95 (m, 2H), 6.37 (dd, J= 2.5, 7.5 Hz, 1H), 4.42 (AB q, JAB= 17.0 Hz, 2H), 4.41-4.33 (m, 1H), 3.86 and 3.76 (ABX, JAB = 11.5 Hz, JAX = 4.0 Hz, JBX = 8.0 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 1.31 (d, J= 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.7, 155.7, 137.4, 137.3, 136.1, 127.7, 126.6, 121.7, 121.4, 119.1, 106.7, 101.3, 95.6, 65.8, 55.4, 50.9, 43.9, 15.4; HRMS (FAB) m/z calcd for C18H18N2O3S [M]+ : 342.1038; found : 342.1042.

(17) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-7- 페닐 -9-( 사이오펜 -2-일)-1,2- 디히드로피 롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 ( D3 )

T-D3 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 49의 D3 화합물을 수득하였다.

[화학식 49]

1H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 8.59 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 8.14-8.13 (m, 1H), 7.84-7.82 (m, 2H), 7.54-7.51 (m, 3H), 7.45-7.41 (m, 1H), 7.40 (dd, J = 1.0, 3.5 Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 3.5, 5.0 Hz, 1H), 4.85 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.59 (s, 2H), 3.62-3.54 (m, 2H), 1.23 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 160.4, 137.9, 135.9, 135.0, 134.7, 133.3, 129.2, 128.2, 128.1, 126.4, 125.0, 123.1, 122.9, 120.4, 114.6, 111.5, 103.2, 63.3, 49.0, 42.5, 15.3; HRMS (FAB) m/z calcd for C23H20N2O2S [M]+ : 388.1245; found : 388.1241.

(18) 2-(1-히드록시프로판-2-일)-3-옥소-9-( 사이오펜 -2-일)-2,3- 디히드로 -1H-피 롤로[3,4-β]인돌리 진-7- 카르보니트릴 ( D4 )

T-D4 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 50의 D4 화합물을 수득하였다.

[화학식 50]

1H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 8.50 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 8.44 (t, J = 1.0 Hz, 1H), 7.58 (dd, J= 1.0, 5.0 Hz, 1H), 7.45 (dd, J = 1.0, 4.0 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 3.5, 5.0 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 4.86 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.57 (s, 2H), 4.284.25 (m, 1H), 3.58 and 3.55 (ABX, JAB = 8.6 Hz, JAX = 0.5 Hz, JBX = 5.2 Hz, 2H), 1.22 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR(125 MHz, DMSO-d6) δ 159.8, 134.7, 134.3, 131.8, 128.3, 125.6, 125.0, 124.6, 124.2, 123.6, 118.3, 111.6, 106.6, 102.3, 63.2, 49.2, 42.6, 15.2; HRMS (FAB) m/z calcd for C18H15N3O2S [M+H]+ : 338.0963; found : 338.0956.

(19) 7-아세틸-2-(1-히드록시프로판-2-일)-9-( 사이오펜 -2-일)-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 ( D5 )

T-D5 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 51의 D5 화합물을 수득하였다.

[화학식 51]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.24 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.29 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.13-7.12 (m, 1H), 7.05-7.04 (m, 1H), 6.98 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.49-4.42 (m, 1H), 4.45 (AB q, JAB = 16.8 Hz, 2H), 3.96-3.77 (m, 3H), 2.48 (s, 3H), 1.31 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.3, 161.8, 135.6, 134.5, 133.8, 129.1, 128.1, 124.5, 123.7, 123.4, 122.8, 120.9, 109.4, 107.7, 65.3, 50.8, 43.6, 26.0, 15.4; HRMS (FAB) m/z calcd for C19H18N2O3S [M+H]+ : 355.1116; found : 355.1110.

(20) 9-(4-(디메틸아미노) 페닐 )-2-(1-히드록시프로판-2-일)-1,2- 디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진 -3-온 ( E1 )

T-E1 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 52의 E1 화합물을 수득하였다.

[화학식 52]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.48 (bs, 1H), 7.68 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 6.98-6.76 (m, 3H), 6.65-6.58 (m, 1H), 4.60-4.34 (m, 3H), 3.86 and 3.76 (ABX, JAB = 11.4 Hz, JAX = 4.0 Hz, JBX = 7.8 Hz, 2H), 3.46 (bs, 1H), 3.01 (bs, 6H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ 162.8, 148.9, 135.8, 134.5, 128.0, 125.2, 120.4, 118.3, 113.2, 111.3, 109.2, 65.5, 50.5, 43.6, 40.7, 15.3; HRMS (FAB) m/z calcd for C21H23N3O2 [M]+ : 349.1790; found : 349.1789.

(21) 9-(4-(디메틸아미노) 페닐 )-2-(1-히드록시프로판-2-일)-7- 메톡시 -1,2- 디 히드로피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 ( E2 )

T-E2 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 53의 E2 화합물을 수득하였다.

[화학식 53]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.31 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 6.91 (bs, 1H), 6.84 (bs, 2H), 6.36 (dd, J = 2.5, 7.5 Hz, 1H), 4.42 (AB q, JAB = 17.5 Hz, 2H), 4.354.30 (m, 1H), 3.863.70 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.60 (bs, 1H), 3.00 (bs, 6H), 1.30 (d, J =7.0 Hz, 3H); HRMS (FAB) m/ zcalcd for C22H25N3O3 [M]+ : 379.1896; found : 379.1887.

(22) 9-(4-(디메틸아미노) 페닐 )-2-(1-히드록시프로판-2-일)-7- 페닐 -1,2- 디히 드로피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 ( E3 )

T-E3 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 54의 E3 화합물을 수득하였다.

[화학식 54]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.52 (bs, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.57 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.477.38 (m, 4H), 7.35 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.84 (bs, 2H), 4.60-4.36 (m, 3H), 3.92-3.74 (m, 2H), 3.42 (bs, 1H), 3.00 (bs, 6H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 3H); HRMS (FAB) m/z calcd for C27H27N3O2 [M]+ : 425.2103; found : 425.2103.

(23) 9-(4-(디메틸아미노) 페닐 )-2-(1-히드록시프로판-3-일)-3-옥소-2,3- 디히드로 -1H- 피롤로[3,4-β]인돌리진 -7- 카르보니트릴 ( E4 )

T-E4 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 55의 E4 화합물을 수득하였다.

[화학식 55]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.44 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 8.03 (t, J= 1.0 Hz, 1H), 7.33-7.31 (m, 2H), 6.80-6.78 (m, 2H), 6.65 (dd, J = 2.0, 7.0 Hz, 1H), 4.49 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 4.39-4.36 (m, 1H), 3.85-3.70 (m, 2H), 2.99 (s, 6H), 1.30 (d, J = 7.0 Hz, 3H); HRMS (FAB) m/z calcd for C22H22N4O2 [M]+: 374.1743; found : 374.1744.

(24) 7-아세틸-9-(4-(디메틸아미노)페닐)-2-(1-히드록시프로판-2-일)-1,2-디히드로피롤로[ 3,4-β]인돌리진 -3-온 ( E5 )

T-E5 화합물로부터 TBS기를 탈보호화하여 하기 화학식 56의 E5 화합물을 수득하였다.

[화학식 56]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.46 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.42(d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.19 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 2.0, 7.0 Hz, 2H), 4.52 (AB q, JAB = 16.5 Hz, 2H), 4.41 (m, 1H), 3.92-3.75 (m, 2H), 3.03 (s, 6H), 2.57 (s, 3H), 1.35 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.7, 162.4, 134.5, 134.1, 128.4, 124.5, 122.9, 121.8, 121.5, 114.8, 113.3, 113.2, 109.2, 70.7, 65.6, 50.9, 43.8, 40.7, 26.2, 15.5; HRMS (FAB) m/z calcd for C23H25N3O3 [M]+ : 391.1896; found : 391.1893.

상기에서 수득한 A1 내지 E5 화합물들의 광물리적 데이터를 하기 표 1에 나타내었고, 대표적인 화합물들의 형광 방출 스펙트럼(normalized fluorescence emission spectra)을 도 1에 나타내었다.

상기 표 1의 결과로부터, 본 발명의 형광 화합물에서 간단한 치환기 변화를 통해, 단일 분자 구조 내에서 형광 특성의 극적인 변화를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

전자 공여의 가능성은 R₅ 치환기가 아세틸기인 경우, R₃이 메틸(A5), 페닐(B5), 2-메톡시페닐(C5), 사이오페닐(D5) 및 p-디메틸아미노페닐(E5)인 순서대로 증가함을 알 수 있는데, 상기의 A5, B5, C5, D5 및 E5에 상응하는 방출 파장은 표 1에서 볼 수 있듯이 각각 471nm, 507nm, 508nm, 540nm, 613 nm로서, 장파장쪽으로 적색편이를 일으킴을 알 수 있다. 따라서, 본 형광 화합물들의 라이브러리는 모든 색상의 방출 파장을 커버할 수 있는 풀-컬러 조정가능성을 갖는다.

또한, 표 1에서 보면 HOMO와 LUMO 사이의 에너지 갭의 감소가 방출 파장의 증가 및 흡수 최대치와 잘 일치함을 확인할 수 있고, 본 발명의 형광 화합물들이 풀-컬러 조정가능성 외에 넓은 범위의 양자 수득률을 가짐을 확인할 수 있다.

[ 실시예 2: 본 발명의 형광 화합물의 물리화학적 특성 확인]

(1) 상기 표 1의 화합물들 중 B5를 선택하여, 잘 알려진 형광물질인 플루오르신(Φ_F: 0.76, λ_abs: 494nm, λ_em: 521nm)과 물리화학적 특성을 비교하였다. 그 결과 본 발명의 B5 화합물은 플루오르신과 비슷한 양자 수득률(Φ_F: 0.74) 및 훨씬 큰 스토크스 편이(λ_abs: 403nm, λ_em: 507nm)를 가짐으로써 더 많은 형광 신호를 이끌어낼 수 있을 것으로 기대되었다.

(2) 또한, 상기 두 화합물의 광표백에 대한 내성 정도를 다음과 같이 조사하였다: 6.0 μM의 플루오르신과 26μM의 B5 화합물의 PBS 용액을 757 mW/cm²의 광세기를 갖는 W-할로겐 램프(200W, KANDOlite@) 하에서 광에 노출시켰다. 형광 방출 스펙트럼을 광노출 후 각각 0분, 5분, 30분, 90분, 120분, 180분, 240분, 300분이 되었을 때 Cary Eclipse (Varian, USA)로 측정하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 결과로부터 본 발명의 B5 화합물이 통상의 염료인 플루오르신에 비해 광표백에 대한 내성이 더 강함을 확인할 수 있었다.

(3) 한편 플루오르신은 다수의 이온화 평형을 갖는 것으로 잘 알려져 있는데, 상기의 이온화 평형은 5 내지 9의 범위에 걸쳐 pH 의존적인 흡수 및 방출을 유도한다. 그러나 본 발명의 B5 화합물은 도 3에 나타낸 바와 같이, 그 형광 세기 및 최대 방출 파장이 수용액 내 pH 4 내지 9의 범위(생체 내 시스템의 생리 범위)에서 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 이러한 pH-독립적인 형광성은 바이오 이미징 및 바이오 응용 분야에서 중요한 요소이다.

(4) 또한, B5 화합물은 그 지질친화성(lipophilicity)이 세포막 투과성에 이상적이었으며(표 1에서 cLogP 값이 2.50), A549 폐암 세포주에서 테스트된 높은 농도에서도(100μM) 세포독성을 나타내지 않았다(결과 미도시).

이상의 결과로부터, 본 발명의 신규한 형광 화합물이 뛰어난 광물리적 특성 및 물리화학적 특성을 가짐으로써 바이오 이미징 및 바이오 응용 분야에서 큰 가능성이 있음을 알 수 있었다.

[ 실시예 3: 본 발명의 형광 화합물의 바이오응용 가능성 확인]

본 발명의 형광 화합물의 바이오응용 가능성을 확인하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1에서 수득한 화합물들 중 A1, B5 및 E5 화합물에 대해 OH기 대신 다른 치환기를 가지도록 아래와 같이 변형을 가하였다.

1. A1 화합물

(1) 2-(9-메틸-3-옥소-1H-피롤로[3,4-β]인돌리진-2(3H)-일)프로필 메탄술포네이트 (A1-Ms)

A1 화합물(136mg, 0.557mmol) 및 TEA(165μL, 1.182mmol)의 DCM(3mL) 용액을 0℃에서 교반한 후, 메탄설포닐 클로라이드(MsCl, 95μL, 1.18mmol)를 방울방울 첨가하였다. 상기 반응이 완료된 후 dd H₂O를 첨가하고 유기물질을 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 브린으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 다음, 여과 후 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 하기 화학식 57의 A1-Ms 화합물을 수득하였다(156mg, 82%).

[화학식 57]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.45 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 1.5, 9.0 Hz, 1H), 6.83 (m, 1H), 6.63 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.70-4.64 (m, 1H), 4.43-4.35 (m, 2H), 3.00 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 1.41 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ157.1, 132.9, 131.0, 120.1, 114.4, 113.6, 112.5, 106.1, 97.6, 66.3, 41.6, 37.6, 32.8, 10.5, 4.2.

(2) 2-(1-아지도프로판-2-일)-9-메틸-1,2-디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온 (A1-N₃)

A1-Ms 화합물(156mg, 0.484mmol) 및 NaN3(314mg, 4.84mmol)의 DMF(5mL) 용액을 아르곤 분위기 하 60℃에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 dd H₂O를 첨가하여 켄치시키고, 유기 물질을 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 브린으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 다음 여과 후 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 하기 화학식 58의 A1-N₃ 화합물을 수득하였다(97mg, 74%).

[화학식 58]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.48 (td, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 7.37 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 6.85 (ddd, J = 1.0, 6.5, 9.0 Hz, 1H), 6.62 (dt, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 4.57-4.53 (m, 1H), 4.29 (AB q, JAB = 16.5 Hz, 2H), 3.55 and 3.52 (ABX, JAB = 12.7 Hz, JAX = 7.0 Hz, JBX = 6.0 Hz, 2H), 2.30 (s, 3H), 1.37 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.1, 137.7, 135.8, 125.2, 119.3, 119.0, 117.4, 110.9, 102.4, 55.2, 47.0, 42.3, 16.5, 9.2; LRMS (EI) m/z calcd for C14H15N5O [M+H]+: 270.13; found : 270.10.

(3) 2-(1-아미노프로판-2-일)-9-메틸-1,2-디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온 (A1-NH₂)

A1-N₃ 화합물(20mg, 0.074mmol) 및 PPh3(58mg, 0.22mmol)의 THF(2mL) 용액을 90분간 상온에서 교반한 다음, dd H₂O를 다섯 방울 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 포화된 NaHCO₃ 용액을 첨가하고, 유기 물질을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 하기 화학식 59의 A1-NH₂ 화합물을 수득하였다(13mg, 73%).

[화학식 59]

1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.47 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9Hz, 1H), 6.97 (ddd, J = 1.0, 6.5, 9.0 Hz, 1H), 6.75 (dt, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 4.56-4.52 (m, 1H), 4.43-4.37 (m, 2H), 3.30 and 3.18 (ABX, JAB = 11.4 Hz, JAX = 6.5 Hz, JBX = 3.8 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.42 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125MHz, MeOD) δ 164.6, 139.7, 138.3, 125.8, 121.0, 119.0, 118.6, 112.5, 104.0, 47.8, 44.0, 42.7, 16.6, 8.7; LRMS (EI) m/z calcd for C14H17N3O [M+H]+: 244.14; found : 244.11.

2. B5 화합물

(1) 2-(7-아세틸-3-옥소-9-페닐-1H-피롤로[3,4-β]인돌리진-2(3H)-일)프로필메탄술포네이트 (B5-Ms)

B5 화합물(360mg, 1.03mmol) 및 TEA(288μl, 2.07mmol)의 DCM(20mL) 용액을 0℃에서 15분간 교반하였다. 이어서 MsCl(166μl, 2.07mmol)을 방울방울 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 상온까지 데웠다. 반응이 완료된 후, 상기 반응 혼합물을 dd H₂O를 첨가하여 켄치시키고, 유기물질을 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 브린으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 다음, 여과 후 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 하기 화학식 60의 B5-Ms 화합물을 수득하였다(412mg, 94%).

[화학식 60]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.56 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 8.40 (s, 1H), 7.56-7.51 (m, 4H), 7.37 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 4.74-4.71 (m, 1H), 4.56 (AB q, JAB = 16.5 Hz, 2H), 4.44 and 4.40 (ABX, JAB = 10.5 Hz, JAX = 7.0 Hz, JBX = 4.5 Hz, 2H), 3.03 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 1.44 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.6, 161.5, 135.3, 134.9, 133.5, 129.6, 129.5, 127.8, 127.2, 124.9, 122.7, 121.3, 114.3, 109.8, 70.9, 47.1, 43.6, 37.8, 26.2, 15.3.

(2) 7-아세틸-2-(1-아지도프로판-2-일)-9-페닐-1,2-디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온 (B5-N₃)

B5-Ms 화합물(412mg, 0.966mmol) 및 NaN3(628mg, 9.66mmol)의 DMF(10mL) 용액을 아르곤 분위기 하 80℃에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, dd H₂O를 첨가하고, 유기물질을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 브린으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 다음, 여과 후 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 하기 화학식 61의 B5-N₃ 화합물을 수득하였다(364mg, 100%).

[화학식 61]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.57 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 8.40 (s, 1H), 7.57 (dd, J = 1.5, 8.0 Hz, 2H), 7.52 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.37 (tt, J = 1.5, 7.3 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 4.62-4.58 (m, 1H), 4.54 (AB q, JAB = 17.0 Hz, 2H), 3.62-3.55 (m, 2H), 2.61 (s, 3H), 1.41 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.5, 161.3, 135.2, 134.7, 133.6, 129.4, 127.6, 127.0, 124.8, 122.9, 121.2, 114.1, 109.6, 55.0, 47.2, 43.3, 26.2, 16.4; LRMS (EI) m/z calcd for C21H19N5O2 [M+H]+: 374.15; found : 374.15.

(3) 7-아세틸-2-(1-아미노프로판-2-일)-9-페닐-1,2-디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온 (B5-NH₂)

PPh₃(100mg, 0.382mmol) 및 B5-N₃ 화합물(130mg, 0.348mmol)의 THF(2mL) 용액을 상온에서 90분간 교반하고, dd H₂O 4방울을 첨가하였다. 반응이 완료된 후, 상기 반응을 포화된 NaHCO₃ 용액의 첨가에 의해 켄치시키고, 유기물질을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 하기 화학식 62의 B5-NH₂ 화합물을 수득하였다(90mg, 74%).

[화학식 62]

1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.42 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 8.30 (s, 1H), 7.59 (dd, J = 1.0, 8.5 Hz, 2H), 7.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 1.0, 7.0 Hz, 1H), 4.63-4.59 (m, 3H), 3.37 and 3.22 (dd, JAB = 12.9 Hz, JAX= 10.3 Hz, JBX = 4.0 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 1.47 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, MeOD) 197.8, 163.7, 137.3, 136.0, 134.5, 130.5, 130.4, 128.6, 128.1, 125.6, 123.4, 122.3, 115.5, 110.5, 48.1, 44.1, 43.8, 26.1, 16.8; LRMS (EI) m/z calcd for C21H21N3O2 [M+H]+: 348.16; found : 348.12.

(4) N-2-(7-아세틸-3-옥소-9-페닐-1H-피롤로[3,4-β]인돌리진-2(3H)-일)프로필)-3-(2,5-디옥소-2H-피롤-1(5H)-일)프로판아미드 (B5-말레이미드)

B5-NH₂ 화합물(10mg, 0.029mmol) 및 3-말레이미도프로피온산 N-히드록시 숙신이미드 에스테르(8mg, 0.029mmol)의 DCM(0.5mL) 용액을 아르곤 하 0℃에서 교반하고, TEA(6μL, 0.043 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 그 후 반응 혼합물을 주위 온도(ambient temperature)까지 데운 후 주위 온도에서 하룻밤 동안 교반하였다. 조 생성물을 prep HPLC에 의해 정제하여 하기 화학식 63의 B5-말레이미드 화합물을 수득하였다.

[화학식 63]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.54 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.58 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.53 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.38 (t, J= 7.3 Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 1H), 6.49 (s, 2H), 4.53 (m, 1H),4.50 (AB q, JAB= 17.0 Hz, 2H), 3.71 (m, 3H), 3.28 (dt, J = 4.0, 14.0 Hz, 1H), 2.62 (s, 3H), 2.44 (dt, J = 3.8, 10.5 Hz, 2H), 1.35 (d, J = 7.0 Hz, 3H).

3. E5 화합물

(1) 2-(7-아세틸-9-(4-(디메틸아미노)페닐)-3-옥소-1H-피롤로[3,4-β]인돌리진-2(3H)-일)프로필 메탄술포네이트 (E5-Ms)

E5 화합물(300mg, 0.7664mmol) 및 TEA(160μL, 1.15mmol)의 DCM(10mL) 용액을 0℃에서 교반한 후, MsCl(92μL, 1.15mmol)을 방울방울 첨가하였다. 반응이 완료된 후, dd H₂O를 첨가하고, 유기물질을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 브린으로 세척하고, Na₂SO₄로 건조한 다음, 여과 후 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 하기 화학식 64의 E5-Ms 화합물을 수득하였다(250mg, 70%).

[화학식 64]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.49 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.43 (m, 2H), 7.24 (dd, J = 2.0, 7.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.73-4.69 (m, 1H), 4.53 (AB q, JAB = 16.2 Hz, 2H), 4.43 and 4.40 (ABX, JAB = 10.4 Hz, JAX = 6.8 Hz, JBX = 4.5 Hz, 2H), 3.03 (s, 6H), 3.02 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 1.45 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.6, 161.6, 149.7, 134.6, 134.5, 128.8, 128.6, 124.7, 122.4, 121.9, 121.3, 115.0, 113.2, 109.4, 70.9, 47.0, 43.6, 40.6, 37.8, 26.1, 15.3.

(2) 7-아세틸-2-(1-아지도프로판-2-일)-9-(4-(디메틸아미노)페닐)-1,2-디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온 (E5-N₃)

E5-Ms 화합물(217mg, 0.462mmol) 및 NaN3(300mg, 4.62mmol)의 DMF(5mL) 용액을 아르곤 분위기 하 80℃에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, dd H₂O를 첨가하고, 유기 물질을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 브린으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 다음, 여과 후 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 하기 화학식 65의 E5-N₃ 화합물을 수득하였다(170mg, 88%).

[화학식 65]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.52 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.46-7.43 (m, 2H), 7.24 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 6.89-6.86 (m, 2H), 4.61-4.57 (m, 1H), 4.51 (AB q, JAB = 16.5 Hz, 2H), 3.58 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.04 (s, 6H), 2.60 (s, 3H), 1.40 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.6, 161.5, 149.6, 134.5, 134.3, 128.6, 128.5, 124.6, 122.6, 121.9, 121.3, 114.9, 113.1, 109.2, 55.0, 47.1, 43.2, 40.6, 26.1, 16.4; LRMS (EI) m/z calcd for C23H24N6O2 [M+H]+: 417.20; found : 417.17.

(3) 7-아세틸-2-(1-아미노프로판-2-일)-9-(4-(디메틸아미노)페닐)-1,2-디히드로피롤로[3,4-β]인돌리진-3-온 (E5-NH₂)

E5-N₃ 화합물(20mg, 0.048MMOL) 및 PPh3(14mg, 0.053mmol)의 THF(0.5mL) 용액을 상온에서 90분간 교반한 후, H₂O 한방울을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 포화된 NaHCO₃ 용액을 첨가하고, 유기 물질을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과 후 진공 중에서 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 하기 화학식 66의 E5-NH₂ 화합물을 수득하였다(18mg, 96%).

[화학식 66]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.50 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.45-7.42 (m, 2H), 7.21 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 6.88-6.85 (m, 2H), 4.49-4.40 (m, 3H), 3.03 (s, 6H), 2.942.87 (m, 2H), 2.58 (s, 3H), 1.30 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 195.6, 162.1, 149.7, 134.3, 134.2, 128.6, 124.6, 123.1, 121.9, 121.5, 115.0, 113.2, 109.2, 50.4, 46.5, 42.1, 40.7, 26.1, 14.3; LRMS (EI) m/z calcd for C23H26N4O2 [M+H]+: 391.21; found : 391.19.

(4) N-(2-(7-아세틸-9-(4-(디메틸아미노)페닐-3-옥소-1H-피롤로[3,4-β]인돌리진-2(3H)-일)프로필)-3-(2,5-디옥소-2H-피롤-1(5H)-일)프로판아미드 (E5-말레이미드)

E5-NH₂ 화합물(5mg, 0.013mmol) 및 3-말레이미도프로피온산 N-히드록시 숙신이미드 에스테르(3mg, 0.013mmol)의 DCM(0.2mL) 용액을 아르곤 하 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 그 후 반응 혼합물을 주위 온도까지 데우고, 주위 온도에서 하룻밤 동안 교반하였다. 조 생성물을 prep HPLC로 정제하여 하기 화학식 67의 E5-말레이미드 화합물을 수득하였다.

[화학식 67]

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.46 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.45-7.43 (m, 2H), 7.23 (dd, J = 1.5, 7.0 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.47 (s, 2H), 4.54-4.51 (m, 1H), 4.45 (AB q, JAB = 16.5 Hz, 2H), 3.78-3.62 (m, 3H), 3.32 (dt, J = 4.0, 9.0 Hz, 1H), 3.04 (s, 6H), 2.59 (s, 3H), 2.45 (dt, J = 1.0, 7.0 Hz, 2H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 3H).

면역형광실험

상기에서 수득된 화합물들 중 B5-말레이미드 화합물을 선택하여, 아래와 같은 실험에 의해 상기 화합물의 면역조직화학법에서의 바이오 응용성을 확인하였다. 말레이미드 모이어티는 바이오폴리머 상의 사이올 모이어티(thiol moiety)에 대해 특이적인 변형을 일으킬 수 있는 것이다. 이 때, 모델 시스템으로는 cetuximab, 즉 HeLa 세포의 EGFR을 표적으로 하는 키메릭 모노클로날 항체를 선택하였으며, 상기 항체는 사이올 모이어티를 도입하기 위해 트라우트 시약(traut's reagent)으로 변형시켰다(도 4 참조).

(1) 세포 배양

HeLa 세포주(HeLa Human cervical carcinoma cells)는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. HeLa 세포는 열불활성화된 10%(v/v) 우혈청(FBS, GIBCO, Grand Island, NY, USA) 및 1%(v/v) 항생-항진균제(GIBCO)가 함유된 RPMI 1640(United Search Partners, Austin, TX, USA)에서 배양하였다. 상기 Hela 세포주는 37℃ 하, 5%의 CO₂ 및 95%의 공기로 이루어진 습윤한 대기에서 유지하였고, T75 플라스크(Nalge Nunc International, Naperville, IN, USA)에서 배양하였다.

(2) 형광 화합물 B5-말레이미드를 이용한 항체의 라벨링

이미노사이올란(iminothiolane)이 10 mM EDTA를 함유한 1× PBS에 용해되어 있는 용액에 항체 용액을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 배양하였다. 항체의 원하는 단편(fraction)을 Sephadex G-25를 이용한 크기 배제 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 10mM EDTA를 함유한 PBS로 용출시켰다. 항체의 순도를 Micro BCA™ 단백질 분석 키트 및 브래드포드 분석법으로 확인하였다. 적절한 항체 단편을 B5-말레이미드의 DMSO 용액에 혼합하였다. 그 반응 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 부드럽게 흔들었다(tumbling). 형광표지된 항체를 Microcon®에 의해 10mM EDTA를 함유한 PBS로 3회 세척하였다.

(3) 항체 표지의 확인을 위한 SDS-PAGE

상기 단백질 샘플을 로딩 버퍼에 걸어 SDS-PAGE(10% 비스아크릴아마이드 겔, 200 mV, 40A Hofer 전기영동 장치)를 수행하였다. 그 결과를 도 5에 도시하였다. 도 5에서, a)는 가시광선 하에서 겔을 본 결과이고, b)는 UV광 하에서 겔을 본 결과이며, c)는 겔을 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining)에 의해 시각화한 것이다.

(4) 면역형광

HeLa 세포를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 Lab-TeK 글래스 챔버 슬라이드에 시딩(seeding)하고 배양하였다. 형광 방출을 관찰하기 위하여, 상기 세포를 1× PBS 내에서 3.7% 파라포름알데히드로 15분간 고정하고, 얼음같이 찬 PBS로 2회 세척하였다. 글래스 챔버 슬라이드에 고정된 세포에, 0.25% Triton X-100의 PBS 용액(PBST)을 첨가하였다. 상기 세포를 4℃에서 15분간 배양한 다음, 차가운 PBS로 3회 세척하고, PBST에서 30분간 1% BSA와 함께 배양하였다. BSA 용액을 글래스 챔버 슬라이드로부터 제거하였다. 고정된 세포를 1% BSA를 함유하는 PBST에 항체 용액과 함께 도입한 후, 하룻밤 동안 어둠 속에서 4℃ 배양하였다. 항체 용액을 제거한 후 PBS로 3회 세척하였다. 마지막으로, 고정된 세포를 핵 염색(nucleus staining)을 위하여 Hoechst로 처리하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 Hela 세포의 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 이미지를 보여준다. 도 6에서, Hela 세포의 EGFR이 본 발명의 형광 화합물(B5-말레이미드)에 의해 라벨링된 cetuximab로 염색된 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 본 발명의 형광 화합물이 바이오 프로브로서 면역세포화학 분야에서 성공적으로 이용될 수 있음을 시사한다.

도 1은 실시예에서 수득한 대표적인 형광 화합물들의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 도면,

도 2는 본 발명의 형광 화합물 B5와 플루오르신의 광표백에 대한 내성을 비교측정한 그래프,

도 3은 본 발명의 형광 화합물 B5의 pH에 따른 형광 세기 및 최대 방출 파장을 나타낸 그래프,

도 4는 본 발명의 형광 화합물 B5-말레이미드(B5-maleimide)가 사이올 모이어티가 도입된 cetuximab 항체에 라벨링되는 모습을 도식적으로 나타낸 그림,

도 5는 변형된 cetuximab에 대한 본 발명의 형광 화합물 B5-말레이미드의 특이적 라벨링을 SDS-PAGE로 확인한 결과,

도 6은 본 발명의 형광 화합물 B5-말레이미드로 라벨링된 cetuximab로 처리한 Hela 세포의 공초점 레이저 주사 현미경 사진이다.

Claims (14)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 형광 화합물:

   [화학식 1]

   

   상기 화학식 1에서,

   R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; C2-C8의 알케닐기; C2-C8의 알키닐기; C3-C8의 시클로알킬기; 하이드록시기; C1-C6의 알콕시기; 폴리에틸렌글라이콜기; 니트릴기; 니트로기; 카르복실기; 설포닐기; 아자이드기; 메탄설포닐기; 말레이미드기; 터셔리-부틸디메틸실릴기(TBS)로 보호된 알콜; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고,

   R₃는 수소; 니트릴기; 할로겐; 니트로기; C1-C6의 알콕시기; C6-C20의 아릴기; C5-C20의 시클로헤테로고리기; 보론기; 아자이드기; NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아 릴기임), 니트릴, C1-C6의 알콕시, 할로겐, 보론기, 하이드록시기 또는 CH₂NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)로 치환된 C6-C20의 아릴기; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; C2-C8의 알케닐기; C2-C8의 알키닐기; C3-C8의 시클로알킬기; 또는 C4-C20의 헤테로아릴기이고,

   R₄, R₅, R₆ 및 R₇은 각각 독립적으로 수소; 할로겐; 니트릴기; 보론기; 하이드록시기; COY(여기에서 Y는 수소, C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C2-C8의 알케닐기, C2-C8의 알키닐기, C3-C8의 시클로알킬기, 또는 NR₈R₉[여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임]); C1-C6의 알콕시기; C6-C20의 아릴기; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴 또는 할로겐으로 치환된 C6-C20의 아릴기이며,

   이 때 서로 인접한 R₅ 및 R₆는 탄소, 질소, 산소 또는 황원소를 매개체로 한 부가적인 아릴 고리를 형성할 수 있다.
2. 청구항 1에 있어서,

   R₁은 하이드록시기; 폴리에틸렌글라이콜기; 아자이드기; 메탄설포닐기; 말레 이미드기; 터셔리-부틸디메틸실릴기(TBS)로 보호된 알콜; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고,

   R₂는 C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기인 것을 특징으로 하는 형광 화합물.
3. 청구항 1에 있어서,

   R₄, R₆ 및 R₇는 각각 독립적으로 수소; 할로겐; 니트릴기; 또는 보론기이고,

   R₅는 수소; 니트릴기; COY(여기에서 Y는 수소, C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C2-C8의 알케닐기, C2-C8의 알키닐기, C3-C8의 시클로알킬기, 또는 NR₈R₉[여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임]); C1-C6의 알콕시기; 또는 C6-C20의 아릴기인 것을 특징으로 하는 형광 화합물.
4. 청구항 1에 있어서,

   R₃는 C6-C20의 아릴기; NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴, C1-C6 의 알콕시, 할로겐, 보론기, 하이드록시기 또는 CH₂NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)로 치환된 C6-C20의 아릴기; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; 또는 C4-C20의 헤테로 아릴기인 것을 특징으로 하는 형광 화합물.
5. 청구항 1에 있어서,

   R₁은 수소; C1-C6의 알콕시기; 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고,

   R₂는 C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이고,

   R₃는 수소; 니트릴기; 할로겐; 니트로기; C1-C6의 알콕시기; C6-C20의 아릴기; C5-C20의 시클로헤테로고리기; 보론기; 아자이드기; NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임), 니트릴, C1-C6의 알콕시, 할로겐, 보론기, 하이드록시기 또는 CH₂NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)로 치환된 C6-C20의 아릴기; C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기; C2-C8의 알케닐기; C2-C8의 알키닐기; C3-C8의 시클로알킬기; 또는 C4-C20의 헤테로아릴기이고,

   R₄, R₆ 및 R₇는 각각 독립적으로 수소; 할로겐; 니트릴기; 또는 보론기이고,

   R₅는 COY(여기에서 Y는 수소, C1-C8의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C2-C8의 알케닐기, C2-C8의 알키닐기, C3-C8의 시클로알킬기, 또는 NR₈R₉[여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임])인 것을 특징으로 하는 형광 화합물.
6. 청구항 1에 있어서,

   R₁은 하이드록시기, 아자이드기, 메탄설포닐기, 말레이미드기, 터셔리-부틸디메틸실릴기(TBS)로 보호된 알콜, 또는 NR₈R₉(여기에서, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 수소, C1-C10의 알킬기, C6-C20의 아릴기 또는 C4-C20의 헤테로아릴기임)이고,

   R₂는 메틸이고,

   R₃는 메틸기, 페닐기, 메톡시페닐기, 사이오페닐기 또는 디메틸아미노페닐기이고,

   R₄, R₆ 및 R₇은 각각 수소이고,

   R₅는 수소, 니트릴기, 메톡시기, 페닐기 또는 아세틸기인 것을 특징으로 하 는 형광 화합물.
7. a) R₁ 및 R₂ 치환기를 갖는 아미노에틸 그룹을 포함하는 화합물을, R₃ 치환기를 갖는 α,β-불포화 알데히드와 반응시켜 환원성 아미노화에 의해 이차 아민 화합물을 제조하는 단계;

   b) 상기 이차 아민 화합물을 아실할라이드를 이용하여 아실화하는 단계; 및

   c) 상기 아실화된 화합물을 R₄, R₅, R₆ 및 R₇ 치환기를 갖는 피리딘으로 처리한 후, 그로부터 얻어진 조 생성물을 고리화하고, 산화성 방향족화 시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 청구항 1 기재의 형광 화합물의 제조방법.
8. 청구항 7에 있어서,

   상기 α,β-불포화 알데히드는 C1-C20의 불포화 지방족 알데히드 또는 C5-C30의 방향족 알데히드를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 청구항 7에 있어서,

   상기 아실할라이드는 친전자성 모이어티(electrophilic moiety)를 갖는 것을 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
10. 청구항 7에 있어서,

    상기 c) 단계에서, 고리화는 강염기를 처리하거나 또는 강염기와 루이스산을 동시에 처리하여 수행하고, 산화성 방향족화는 산화제를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
11. 청구항 7에 있어서,

    상기 a) 단계에서, 상기 R₁ 및 R₂ 치환기를 갖는 아미노에틸 그룹을 포함하는 화합물은 보호화한 후 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
12. 청구항 11에 있어서,

    상기 c) 단계 후에 탈보호화 반응을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
13. 청구항 1의 형광 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 바이오 프로브.
14. 청구항 1의 형광 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 형광체.

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