KR102011772B1 - 신규한 형광체-테트라진 화합물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 형광체-테트라진 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, tert-부틸(3-(7-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)-3-옥소-9-페닐-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)카바메이트라는 신규한 중심 구조(core skeleton)를 갖는 화합물을 이용하여 다양한 파장 영역에서 높은 형광증폭 효율을 갖는 신규한 화합물을 제공한다.
Description
본 발명은 신규한 형광체-테트라진 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, tert-부틸(3-(7-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)-3-옥소-9-페닐-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)카바메이트라는 신규한 중심 구조(core skeleton)를 갖는 화합물을 이용하여 다양한 파장 영역에서 높은 형광증폭 효율을 갖는 신규한 화합물을 제공한다.
형광 프로브(fluorogenic probe)는 높은 민감성과 취급의 용이성으로 인하여 생물 과학, 임상진단 및 신약 개발 등에서 연구의 도구로서 광범위하게 사용되어 왔다.
생명현상을 연구할 때 바이오 이미징, 특히 살아있는 세포에서의 이미징은 중요한 역할을 한다. 이러한 바이오 이미징의 성패는 좋은 형광 프로브의 개발 여부에 달려있다고 볼 수 있다. 따라서, 살아있는 세포에서 원하는 표적물질과 작용하여 형광을 내는 형광 생물직교 프로브(fluorogenic bioorthogonal probe)는 바이오 이미징의 핵심적인 요소가 된다.
특히, 테트라진(tetrazine)과 결합된 형광 프로브는 신속한 반응성과 높은 형광증폭 효율을 가지고 있어 활발히 연구되고 있다. 하지만, 기존의 테트라진 기반 형광 프로브는 생체 내 광투과율이 우수하고 생체 고분자와의 신호 겹침이 적다고 알려진 장파장 영역(>600nm)에서 형광증폭 효율이 현저하게 감소하는 한계점을 갖는다. 이것은 바이오 이미징에서 다양한 정보를 얻기 위한 다원동시 이미징(multiplex imaging)을 어렵게 하는 제한 요소였다.
기존의 테트라진 기반 형광 프로브들은 형광 분자의 들뜬 에너지를 소광제(quencher)인 테트라진 분자 쪽으로 넘기는 에너지 전달(energy transfer) 방식을 통해서 프로브의 소광을 유도하였다. 테트라진은 단파장의 형광 프로브와 잘 맞는 소광제이지만, 장파장의 형광 프로브는 테트라진과 잘 맞지 않아서 에너지 전달이 원활하지 않고, 그 결과 장파장에서는 형광증폭 효율이 현저하게 떨어지는 한계점을 갖고 있다. 따라서 본 발명자는 파장영역에 관계없이 높은 형광증폭 효율을 갖는 형광 생물직교 프로브(fluorogenic bioorthogonal probe)를 개발하고자 하였다.
기존에 개발된 형광 생물직교 프로브는 형광분자와 테트라진을 전자적으로 분리시킨 후, 형광분자의 들뜬 에너지를 소광제인 테트라진 분자 쪽으로 넘기는 에너지 전달방식을 통해 프로브의 소광을 유도하였다. 상기의 프로브는 장파장 영역에서 형광증폭 효율이 크게 감소한다는 단점을 갖고 있으나, 합성적으로 용이하여 많은 연구자들이 사용하는 방법이다.
따라서, 본 발명은 장파장 영역에서도 우수한 형광증폭 효율을 갖는 형광 프로브 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C6 알콕시, 하이드록시 또는 NR4R5 (여기에서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-C6 알킬기 또는 C3-C8 시클로알킬기) 이고,
R2는 수소, C1-C6 알킬, C6-C20 아릴 또는 C4-C20 헤테로아릴기이며,
R3은 수소, 하이드록시, 트리이소프로필실릴(TIPS)로 보호된 알코올, C3-C8 헤테로시클릭 또는 아민기이고,
상기 헤테로시클릭 또는 아민기는 C1-C6 알킬; 카르복실C1-C6알킬 또는 tert-부틸옥시카르보닐기(Boc기)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
또한 본 발명은
R1이 수소, C1-C6 알콕시, 또는 NR4R5 (여기에서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬기) 이고,
R2가 수소 또는 C1-C6 알킬이며,
R3가 수소, C3-C8 헤테로시클릭 또는 아민기이고,
상기 헤테로시클릭 또는 아민기는 C1-C6 알킬; 카르복실C1-C6알킬 또는 tert-부틸옥시카르보닐기(Boc기)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 R2이 C1-C6 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2 내지 7의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물을 제공한다:
[화학식 2]
[여기서, Boc는 tert-부틸옥시카르보닐기임]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
및
[화학식 7]
또한, 본 발명은 UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 측정한 흡수 스펙트럼에서 500-550 nm의 흡수봉우리를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
본 발명은 기존의 형광체-테트라진을 구획화하여 연결하는 방식에서 벗어나 형광체와 테트라진 소광제를 분자단일화 방식으로 처리함으로써, 파장에 상관없이 형광체의 들뜬 에너지를 소광시킬 수 있어, 전 파장 영역에서 매우 높은 효율로 형광 신호가 증폭될 수 있는 새로운 형광 생물직교 프로브를 제공한다.
도 1은 실시예 1 내지 4의 화합물과 TCO의 반응 전후의 흡광도의 변화를 나타낸다.
도 2는 비교예 1 내지 4의 화합물과 TCO의 반응 전후의 흡광도의 변화를 나타낸다.
도 3은 실시예 1 내지 4의 화합물과 TCO의 반응 전후의 형광 강도를 나타낸다.
도 4는 비교예 1 내지 4의 화합물과 TCO의 반응 전후의 형광 강도의 변화를 나타낸다.
도 2는 비교예 1 내지 4의 화합물과 TCO의 반응 전후의 흡광도의 변화를 나타낸다.
도 3은 실시예 1 내지 4의 화합물과 TCO의 반응 전후의 형광 강도를 나타낸다.
도 4는 비교예 1 내지 4의 화합물과 TCO의 반응 전후의 형광 강도의 변화를 나타낸다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 화합물은 상기 화학식 1에서 "9-페닐-2-프로필-7-(1,2,4,5-테트라진-3-일)-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-3(2H)-온"의 중심 구조(core skeleton)를 갖는 화합물 및 이의 유도체로서, 치환기의 변화를 통해 특별한 광물리적 특성 및 광화학적 특성을 갖는다.
구체적으로 본 발명의 화합물은 치환기 변화를 통해 형광파장의 조율과 예측이 가능하고, 이를 통해 다양한 파장에서 활용될 수 있는 새로운 형광 생물직교 프로브를 제공한다. 특히 형광 발현양이 적어 관찰이 어려웠던 생체 내 표적들을 선택적으로 추적할 수 있는 유용한 형광 화합물로 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물은 형광염료 또는 형광 프로브로서 유기발광소자, 바이오 이미징 및 바이오 응용분야에서 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 면역세포화학 분야에서 관심 단백질을 특이적으로 라벨링(labeling) 할 수 있는 형광 프로브로 사용 가능하다.
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C6 알콕시, 하이드록시 또는 NR4R5 (여기에서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-C6 알킬기 또는 C3-C8 시클로알킬기) 이고,
R2는 수소, C1-C6 알킬, C6-C20 아릴 또는 C4-C20 헤테로아릴기이며,
R3은 수소, 하이드록시, 트리이소프로필실릴(TIPS)로 보호된 알코올, C3-C8 헤테로시클릭 또는 아민기이고,
상기 헤테로시클릭 또는 아민기는 C1-C6 알킬; 카르복실C1-C6알킬 또는 tert-부틸옥시카르보닐기(Boc기)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
또한 본 발명은
R1이 수소, C1-C6 알콕시, 또는 NR4R5 (여기에서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬기) 이고,
R2가 수소 또는 C1-C6 알킬이며,
R3가 수소, C3-C8 헤테로시클릭 또는 아민기이고,
상기 헤테로시클릭 또는 아민기는 C1-C6 알킬; 카르복실C1-C6알킬 또는 tert-부틸옥시카르보닐기(Boc기)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 R2이 C1-C6 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2 내지 7의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물을 제공한다:
[화학식 2]
[여기서, Boc는 tert-부틸옥시카르보닐기임]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
및
[화학식 7]
또한, 본 발명은 UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 측정한 흡수 스펙트럼에서 500-550 nm의 흡수봉우리를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
“헤테로시클릭”은 하나 이상의 고리 탄소가 각각 B, N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자로 대체되는 3 내지 30개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릭이다.
“헤테로아릴”은 하나 이상의 고리 탄소가 각각 B, N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자로 대체되는 3 내지 30개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴이다.
"테트라진(tetrazine)"은 네 개의 질소 원자를 포함하는 방향족 육각고리 화합물로서, 표적 물질과 신속한 생물직교 반응을 일으킬 수 있는 화학 반응성을 지니고 있으며, 형광분자에 연결할 경우 형광 신호를 감소시키는 형광 소광제의 역할을 할 수 있다. 또한, 테트라진이 표적물질과 신속하게 화학반응을 일으켜 화학구조가 변형되면, 형광신호가 증폭되게 된다.
"생물직교 반응(bioorthogonal reaction)"은 생리학적 환경에서 일어나는 화학 반응으로, 생체 내 고유 분자들과는 반응을 일으키지 않으면서 외부에서 투입된 물질과 선택적으로 발생하는 화학 반응을 의미한다.
"형광 소광제(fluorescence quencher)"는 형광체와 연결되어 형광 신호를 감소시키는 물질로, 형광체로부터 흡수한 들뜬 에너지를 빛의 형태가 아닌 열 방출과 같은 과정을 거쳐 소진하는 화학 물질을 말한다.
종래의 형광체-테트라진 구획화 방식(bichromophore type)은 형광체와 소광제 사이의 π-전자 공유를 끊어 놓은 구조적 형태를 지니고 있으며, 형광 분자의 에너지가 다이폴-다이폴 교환 혹은 전자 상호교환 방식을 통해 테트라진으로 전달되는 방식이었다. 따라서, 생체 내 광투과율이 우수하다고 알려진 장파장 영역(>600nm)에서 형광증폭 효율이 감소하는 것을 막지 못했다.
반면, 본 발명의 형광체-테트라진 분자단일화 방식(monochromophore type)은 형광체와 소광제를 인접한 한 평면으로 연결시켜 두 분자의 π-전자를 단일분자 형태로 공유할 수 있도록 고안된 화합물을 이용하여, 구획화 방식과 달리 에너지 주개-받개의 구분이 없으며 소광제의 비전자기복사 전이를 통해 들뜬 에너지를 방출함으로써 빛이 아닌 형태로 흡수된 에너지를 소진한다. 이러한 특성으로 인해 분자단일화방식은 장파장 영역에서도 높은 형광증폭 효율을 얻을 수 있다.
본 발명의 화합물은 형광프로브로 사용될 수 있으며, 특히 다원동시 이미징(multiplex imaging) 형광프로브로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물이 생체 내에서 생물직교 반응(bioorthogonal reaction)을 통해 형광 프로브로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
화학식 2(tert-부틸(3-(7-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)-3-옥소-9-페닐-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)카바메이트)의 제조
[화학식 2]
tert-부틸(3-(7-시아노-3-옥소-9-페닐-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)카바메이트(64.5 mg, 150 μmol), 아세토니트릴(391 μL, 7.49 mmol), 아연 트리플루오로메탄설포네이트(27.2 mg, 74.9 μmol) 및 하이드라진 모노하이드레이트(728 μL, 15.0 mmol) 의 혼합 용액 10ml를 마이크로파 반응 바이알(vial)에 넣고, 80 ℃(100 W)의 마이크로웨이브 하에 30분 동안 자기교반 하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 1 mL의 물에 아질산나트륨을 첨가 한 후, 1N HCl을 pH가 3에 도달할 때까지 천천히 첨가하였다. 이어서, 생성된 잔류물을 포화 NaHCO3 수용액으로 세척한 후 CH2Cl2로 추출하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조 후 농축시켰다. 농축 후 조생성물은 유속 5 ml/분으로 CH2Cl2 중 메탄올(1-4 %)의 선형구배를 사용하여 HPLC로 정제하여 16.7 mg의 화학식 2를 적색 고체로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.16 (s, 1H), 8.69 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.50 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 5.39 (br s, 1H, NH), 4.53 (s, 2H), 3.70 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.20 (m, 2H), 3.10 (s, 3H), 1.86 (quin, J = 6.3 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) 167.0, 163.2, 162.0, 156.2, 135.6, 135.2, 133.6, 129.4, 127.6, 127.0, 125.6, 124.2, 122.8, 119.8, 113.8, 109.2, 79.2, 46.8, 40.2, 37.4, 28.9, 28.6, 21.3; HRMS (ESI) m/z calcd for C27H29N7NaO3 [M+Na]+ : 522.2224, found: 522.2225.
[실시예 2]
화학식 3 (tert-부틸(3-(9-(4-메톡시페닐)-7-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)카바메이트)의 제조
[화학식 3]
tert-부틸(3-(7-시아노-9-(4-메톡시페닐)-3-옥소-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)카바메이트 (33.4 mg, 72.5 μmol), 아세토니트릴(190 μL, 3.63 mmol), 아연 트리플루오로메탄설포네이트(13.2 mg, 36.3 μmol) 및 히드라진 모노하이드레이트(352 μL, 7.25 mmol)를 마이크로파 반응 바이알(10ml)에 넣고, 0.5 시간 동안 자기교반 하면서 80 ℃ (100W)의 마이크로파 하에 조사하였다. 이를 실온으로 냉각시킨 후, 1 ml의 물에 아질산나트륨(250mg, 3.63mmol)을 첨가하고 pH가 3에 도달할 때까지 1N HCl을 천천히 첨가하였다. 이어서, 생성된 잔류물을 염수로 세척하고, CH2Cl2로 추출한 후, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 감압 하에 농축한 후, 조생성물을 5 ml/분의 유속으로 CH2Cl2 중 메탄올 (1 내지 10 %)의 구배를 사용하여 normal-phase preparative HPLC로 정제하여 화학식 3을 적색 고체로 수득하였다(7.0 mg, 18 % 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.12 (s, 1H), 8.69 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.86 (dd, J = 7.2, 1.2 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.39 (br s, 1 H, NH), 4.51 (s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.70 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.19 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 3.09 (s, 3H), 1.85 (quin, J = 6.3 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) 166.8, 163.1, 162.0, 158.6, 156.1, 135.3, 134.6, 128.7, 125.9, 125.4, 123.6, 122.5, 119.8, 114.8, 113.6, 108.9, 79.1, 55.4, 46.6, 40.1, 37.2, 28.7, 28.4, 21.2; HRMS (ESI) m/z calcd for C28H31N7NaO4 [M+Na]+ : 552.2330, found: 552.2330.
[실시예 3]
화학식 4 (tert-부틸(3-(9-(4-아미노페닐)-7-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)카바메이트)의 제조
[화학식 4]
tert-부틸(3-(7-시아노-9-(4-니트로페닐)-3-옥소-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)카바메이트(40 mg, 84μmol), 아세토니트릴(220 μL, 4.21 mmol), 아연 트리플루오로메탄설포네이트(15.3mg, 42.1μmol) 및 히드라진 모노하이드레이트(409 μL, 8.41 mmol)를 마이크로파 반응 바이알(10ml)에 넣고, 1.5 시간 동안 자기교반 하면서 80 ℃ (100W)의 마이크로파 하에 조사하였다. 이 후, 실온으로 냉각시킨 후 물 0.5 ml에 아질산나트륨(290mg, 4.21mmol)을 첨가하고, 1N HCl을 pH가 3에 도달할 때까지 천천히 첨가하였다. 이어서, 생성된 잔류물을 포화 NaHCO3 수용액으로 세척하고, CH2Cl2로 추출한 후, 무수 Na2SO4 상에서 건조 및 농축시켰다. 이 후 생성된 조생성물을 5 ml/분의 유속으로 CH2Cl2 중 메탄올 (0.1-10 %)의 선형 구배를 사용하여 normal-phase preparative HPLC로 정제하여 화학식 4를 붉은 갈색 고체로 수득하였다(2 mg, 5 % 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.13 (s, 1H), 8.67 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 7.4, 1.6 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.39 (br s, 1H, NH), 4.50 (s, 2H), 3.81 (br s, 2H, NH2), 3.70 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.19 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 3.09 (s, 3H), 1.84 (quin, J = 6.2 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) 166.7, 163.2, 162.0, 156.1, 145.5, 135.2, 134.4, 128.7, 125.4, 123.6, 123.3, 122.4, 120.1, 115.8, 114.2, 108.8, 79.1, 46.6, 40.1, 37.3, 28.7, 28.4, 21.2; HRMS (ESI) m/z calcd for C27H30N8NaO3 [M+Na]+ : 537.2333, found: 537.2335;
[실시예 4]
화학식 5 (tert-부틸(3-(9-(4-(디에틸아미노)페닐)-7-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)카바메이트)의 제조
[화학식 5]
tert-부틸(3-(7-시아노-9-(4-디에틸아미노)페닐)-3-옥소-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)카바메이트(60.2 mg, 120μmol), 아세토니트릴(313 μL, 6.00 mmol), 아연 트리플루오로메탄설포네이트(21.8mg, 60.0μmol) 및 히드라진 모노하이드레이트(583 μL, 12.0 mmol)를 마이크로파 반응 바이알(10ml)에 넣고, 1.5 시간 동안 자기교반 하면서 100 ℃ (40W)의 마이크로파 하에 조사하였다. 이 후, 실온으로 냉각시킨 후 아질산나트륨을 가하고, 1N HCl을 pH가 3에 도달할 때까지 천천히 첨가하였다. 이어서, 생성된 잔류물을 포화 NaHCO3 수용액으로 세척하고, CH2Cl2로 추출하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조 및 농축시켰다. 이 후 생성된 조생성물을 실리카겔 플래시 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 : EtOAc = 8 : 1)로 정제하여 화학식 5를 적갈색 고체로 수득하였다(11.8 mg, 17.2 % 수율).
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2) 9.15 (s, 1H), 8.65 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 5.46 (br s, 1H, NH), 4.51 (s, 2H), 3.67 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.43 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 3.14 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 3.05 (s, 3H), 1.81 (quin, J = 6.3 Hz, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.21 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) 166.6, 163.2, 162.1, 156.1, 146.7, 135.0, 134.1, 128.6, 125.3, 122.9, 122.4, 120.4, 120.1, 114.6, 112.2, 108.6, 79.0, 46.7, 44.5, 40.0, 37.2, 28.7, 28.4, 21.2, 12.7; HRMS (ESI) m/z calcd for C31H38N8NaO3 [M+Na]+ : 593.2959, found: 593.2960.
[실시예 5]
화학식 6 (3-(4-(3-(7-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)-3-옥소-9-페닐-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)피페라진-1-일)프로파노산)의 제조
[화학식 6]
tert-부틸4-(3-(7-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)-3-옥소-9-페닐-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)피페라진-1-카복실레이트, 3-브로모프로판 산(4.8 mg, 32 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (28 μL, 160 μmol)을 DMF (160 μL)에 용해시킨 현탁액을 50 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 조생성물을 1 % TFA가 함유된 물 중에서 아세토나이트릴 (5-100 %)의 선형 구배를 사용하여 reverse-phase preparative HPLC로 직접 정제하여 화합물 6의 TFA 염을 수득하였다(5.7 mg, 47 % 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3:MeOD-d 4 = 10:1, v/v) 9.15 (s, 1H), 8.67 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.52 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.60 (s, 2H), 3.72 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.31 (br s, 8 H), 3.20-3.11 (m, 4H), 3.07 (s, 3H), 2.70 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.18-2.11 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3:MeOD-d 4 = 10:1, v/v) 172.8, 167.5, 163.4, 162.5, 136.2, 136.0, 133.8, 129.6, 127.9, 127.2, 125.9, 124.9, 122.5, 119.9, 114.0, 109.6, 54.9, 52.9, 50.5, 49.8, 47.2, 40.5, 30.1, 24.1, 21.3; HRMS (ESI) m/z calcd for C29H33N8O3 [M+H]+ : 541.2670, found: 541.2674.
[실시예 6]
화학식 7 (9-(4-(디에틸아미노)페닐)-7-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)-2-(3-(4-메틸피페라진-1-일)프로필)-1,2-디하이드로-3H-피롤로[3,4-b]인돌리진-3-온)의 제조
[화학식 7]
마이크로파 반응 바이알(10 ml)에 9-(4-(디에틸아미노)페닐)-2-(3-(4-메틸피페라진-1-일)프로필)-3-옥소-2,3-디히드로-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-7-카보니트릴(15.2 mg, 31.3 μmol), 아세토니트릴(82 μL, 1.6 mmol), 아연 트리플루오로 메탄설포네이트(5.7 mg, 16 μmol) 및 히드라진 일 수화물 (152 μL, 3.13 mmol)을 첨가하고, 1.5 시간 동안 자기교반 하면서 100 ℃ (40W)의 마이크로파를 조사하였다. 이 후, 실온으로 냉각시킨 후, 1 mL의 물에 아질산나트륨(43.3 mg, 627 μmol)을 첨가한 후 1N HCl을 pH가 3에 도달할 때까지 천천히 첨가하였다. 이어서, 생성된 잔류물을 포화 NaHCO3 수용액으로 세척하고, CH2Cl2로 추출하고, 무수 Na2SO4로 건조 및 농축하였다. 조생성물을 1 % TFA 수용액 하에서 아세토나이트릴 (5-100 %)의 선형구배를 사용하여 reverse-phase preparative HPLC로 정제하여 화학식 7의 TFA 염을 수득 하였다(6.5 mg, 31 % 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.17 (s, 1H), 8.66 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.67 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.43 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 3.07 (s, 3H), 2.47 (m, 10H), 2.28 (s, 3H), 1.90 (quin, J = 7.1 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) 166.5, 163.2, 161.6, 146.7, 134.9, 134.1, 128.6, 125.3, 122.9, 122.7, 120.4, 120.2, 114.5, 112.3, 108.5, 55.8, 55.1, 53.2, 46.8, 46.0, 44.5, 41.4, 26.3, 21.1, 12.7; HRMS (ESI) m/z calcd for C31H40N9O [M+H]+ : 554.3350, found: 554.3351.
[비교예 1]
화학식 8 (tert-부틸(3-(7-아세틸-9-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)페닐)-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)카바메이트)의 제조
[화학식 8]
tert-부틸(3-(7-아세틸-3-옥소-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)카바메이트 (93.0 mg, 250 μmol), 3-(4-아이오도페닐)-6-메틸-1,2,4,5-테트라진 (224 mg, 751 μmol), 팔라듐 아세테이트(11.2 mg, 50.0 μmol) 및 은 아세테이트(125 mg, 751 μmol)를 N,N-디메틸포름아마이드(DMF) 2.5 mL에 용해시킨 용액을 80 °C 에서 밤새도록 저어주었다. 이 후, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 감압 조건에서 농축시켰다. 조생성물을 실리카겔 플래쉬 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 7.7mg의 화학식 8을 주황색 고체로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.72 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.62 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.32 (br s, 1H, NH), 4.60 (s, 2H), 3.72 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.20 (m, 2H), 3.13 (s, 3H), 2.66 (s, 3H), 1.88 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) 195.4, 167.2, 163.8, 161.7, 156.1, 137.9, 135.3, 135.0, 130.0, 129.9, 128.8, 127.9, 125.0, 123.2, 120.9, 112.9, 110.1, 79.2, 46.8, 40.2, 37.3, 28.8, 28.4, 26.2, 21.2; HRMS (ESI) m/z calcd for C29H31N7NaO4 [M+Na]+: 564.2330, found: 564.2331.
[비교예 2]
화학식 9 (tert-부틸(3-(7-아세틸-9-(4-((4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)카바모일)페닐)-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)카바메이트)의 제조
[화학식 9]
메틸4-(7-아세틸-2-(3-((tert-부톡시카보닐)아미노)프로필)-3-옥소-2,3-디히드로-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-9-일)벤조에이트(43.3 mg, 85.7 μmol) 및 리튬 히드록사이드 모노하이드레이트(10.8 mg, 257 μmol)를 테트라하이드로퓨란 0.6 mL, 메탄올 0.3 mL 및 물 0.3 mL에 첨가하고 실온에서 3시간 동안 저어주었다. 이 후 NH4Cl 포화수용액으로 세척하고, CH2Cl2로 추출한 후, 무수Na2SO4 상에서 건조 및 농축시켰다. 결과물인 N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로-[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드(HATU, 65.1 mg, 171 μmol)과 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA, 74.6 μL, 428 μmol)을 DMF 1.2 mL에 용해시켰다. 이 후, 용액을 실온에서 0.5 시간 동안 교반한 후, (4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)페닐)메탄아미늄(40.5 mg, 128 μmol)을 용액에 첨가하고 실온에서 추가로 2 시간 동안 교반하였다. 조생성물을 실리카겔 플래쉬 칼럼 크로마토그래피로 정제 한 후, EtOAc로 수회 세척하고 진공건조하여 21 mg의 화학식 9를 적색 고체로 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CD2Cl2) 8.59-8.57 (m, 3H), 8.44 (s, 1H), 7.98 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.32 (dd, J = 7.3, 1.5 Hz, 1H), 6.75 (t, J = 5.8 Hz, 1H, NH), 5.36 (br s, 1H, NH), 4.80 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.54 (s, 2H), 3.67 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.10 (m, 2H), 3.07 (s, 3H), 2.60 (s, 3H), 1.81 (quin, J = 6.3 Hz, 2H), 1.41 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3:MeOD-d 4 = 10:1, v/v) 196.1, 167.6, 167.3, 163.9, 161.9, 156.6, 143.5, 137.0, 135.4, 135.1, 132.2, 130.8, 129.7, 128.5, 128.34, 128.26, 127.4, 124.9, 122.9, 120.9, 113.1, 110.2, 79.4, 46.8, 43.7, 40.4, 37.5, 28.7, 28.4, 26.3, 21.1; HRMS (ESI) m/z calcd for C37H38N8NaO5 [M+Na]+ : 697.2857, found: 697.2860.
[비교예 3]
화학식 10 (tert-부틸(3-(7-((4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)카바모일)-3-옥소-9-페닐-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)카바메이트)의 제조
[화학식 10]
메틸2-(3-((tert-부톡시카보닐)아미노)프로필)-3-옥소-9-페닐-2,3-디히드로-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-7-카복실레이트(39.2 mg, 84.6 μmol), 리튬 히드록사이드 모노하이드레이트(10.6 mg, 254 μmol), 테트라하이드로퓨란 0.6 mL, 메탄올0.3 mL 및 물0.3 mL을 혼합하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 수용액으로 세척하고, EtOAc로 추출한 후, 무수 Na2SO4로 건조 및 농축시켰다. 상기 결과물을 (4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)페닐)메탄아미늄(40.0 mg, 127 μmol), (1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디니움 3-옥시드헥사플루오로포스페이트 (Hexafluorophosphate Azabenzotriazole Tetramethyl Uronium; 이하 HATU로 기재함) (64.3 mg, 169 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(73.7 μL, 423 μmol)와 함께 DMF 0.9 mL에 용해시키고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거한 후, 조생성물을 실리카겔 플래쉬 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 37.6 mg의 화학식 10을 분홍색 고체로 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CD2Cl2) 8.57 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.54 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 8.34 (s, 1H), 7.60-7.56 (m, 4H), 7.48 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.31 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.12 (dd, J = 7.1, 1.7 Hz, 1H), 6.79 (t, J = 5.9 Hz, 1H, NH), 5.41 (br s, 1H, NH), 4.76 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.49 (s, 2H), 3.64 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.13-3.10 (m, 2H), 3.06 (s, 3H), 1.79 (quin, J = 6.4 Hz, 2H), 1.40 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3:MeOD-d 4 = 10:1, v/v) 167.3, 166.4, 163.9, 162.4, 156.6, 143.6, 135.34, 135.29, 133.5, 130.8, 129.2, 128.5, 128.2, 127.5, 126.8, 126.3, 124.7, 121.5, 119.4, 112.7, 109.7, 79.4, 46.8, 43.8, 40.4, 37.5, 28.7, 28.4, 21.1; HRMS (ESI) m/z calcd for C35H36N8NaO4 [M+Na]+ : 655.2752, found: 655.2755.
[비교예 4]
화학식 11 (N
1
-(3-(7-아세틸-3-옥소-9-페닐-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)-N
4
-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)숙신이미드)의 제조
[화학식 11]
tert-부틸(3-(7-아세틸-3-옥소-9-페닐-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)카바메이트(42 mg, 94 μmol) 및 12N HCl(100 μL, 1.2 mmol) 혼합물을 CH2Cl2 1 mL에 넣고 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 조고체(crude solid), 숙신산 무수물(14.1 mg, 141 μmol) 및 트리에틸아민(65.4 μL, 469 μmol)을 CH2Cl2 1 ml에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 조 혼합물을 실리카겔 플래쉬 칼럼 크로마토그래피로 직접 정제하여 중간 생성물인 4-((3-(7-아세틸-3-옥소-9-페닐-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)아미노)-4-옥소부타닉산 36 mg을 황색 고체로 수득 하였다.
이 후, 상기 중간 생성물 4-((3-(7-아세틸-3-옥소-9-페닐-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)아미노)-4-옥소부타닉산 (33 mg, 74 μmol), (4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)페닐)메탄아미늄(35 mg, 110 μmol), HATU (56 mg, 150 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(64 μL, 370 μmol)를 DMF 1 mL에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 조반응 혼합물을 실리카겔 플래시 칼럼 크로마토그래피로 직접 정제하여 23 mg의 화학식 11을 주황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, pyridine-d 5 ) 9.41 (t, J = 5.9 Hz, 1H, NH), 8.66 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.60 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 8.57 (s, 1H), 7.77 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.60-7.57 (m, 2H), 7.44-7.40 (m, 2H), 4.78 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H), 3.79 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.63-3.60 (m, 2H), 3.05-3.03 (m, 2H), 2.99-2.95 (m, 5H), 2.61 (s, 3H), 2.06 (quin, J = 6.8 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3:MeOD-d 4 = 10:1, v/v) 196.3, 173.1, 173.0, 167.2, 163.9, 162.2, 143.5, 135.2, 134.9, 133.3, 130.6, 129.43, 129.38, 128.3, 128.1, 127.6, 127.1, 124.7, 122.5, 121.5, 114.4, 109.8, 46.8, 43.1, 40.5, 36.4, 31.73, 31.66, 28.3, 26.1, 21.1; HRMS (ESI) m/z calcd for C35H34N8NaO4 [M+Na]+ : 653.2595, found: 653.2599.
[비교예 5]
화학식 12 (tert-부틸(3-(9-(4-(디에틸아미노)페닐)-7-((4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)카바모일)-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)카바메이트)의 제조
[화학식 12]
메틸2-(3-((tert-부톡시카보닐)아미노)프로필)-9-(4-(디에틸아미노)페닐)-3-옥소-2,3-디히드로-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-7-카복실레이트 (26.7mg, 49.9 μmol), 수산화리튬 일수화물(6.3 mg, 150 μmol), 테트라하이드로퓨란(THF, 300 μL), 메탄올(150 μL) 및 물(150 μL)의 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 포화 NH4Cl 수용액으로 세척하고, EtOAc로 추출한 후, 무수 Na2SO4로 건조 및 농축시켰다. 상기 결과물을 (4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)페닐)메탄아미늄(23.6 mg, 74.9 μmol), HATU (38.0 mg, 100 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (43.5 μL, 250 μmol)과 함께 DMF (0.5 mL)에 용해시켰다. 용매를 감압 하에 제거한 후, 조생성물을 실리카겔 플래시 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 : 메탄올 = 20 : 1)로 정제하여 갈색 고체의 화학식 12를 수득하였다(32.9 mg, 93.6 % 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.48 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.56 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.80-6.74 (m, 3H), 5.39 (br s., 1H, NH), 4.77 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.44 (s, 2H), 3.65 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 3.15 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.08 (s, 3H), 1.80 (quin, J = 6.3 Hz, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.19 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3:MeOD-d 4 = 10:1, v/v) 167.3, 166.7, 164.0, 162.6, 156.7, 146.7, 143.7, 134.8, 134.6, 130.7, 128.6, 128.5, 128.2, 125.2, 124.5, 121.1, 120.3, 119.9, 113.5, 112.5, 109.3, 79.4, 46.9, 44.5, 43.8, 40.4, 37.5, 28.7, 28.4, 21.1, 12.6; HRMS (ESI) m/z calcd for C39H46N9O4 [M+H]+ : 704.3667, found: 704.3669.
[비교예 6]
화학식 13 (N
1
-(3-(7-아세틸-9-(4-(디에틸아미노)페닐)-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2-일)프로필)-N
4
-(4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질)숙신이미드)의 제조
[화학식 13]
CH2Cl2 0.9 mL에 tert-부틸(3-(7-아세틸-9-(4-(디에틸아미노)페닐)-3-옥소-1H-피롤로[3,4-b]인돌리진-2(3H)-일)프로필)카바메이트(45 mg, 87 μmol) 및 TFA (200 μL, 2.61 mmol)를 넣은 현탁액을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 이어서, 생성된 잔류물을 포화 NaHCO3 수용액으로 세척하고, CH2Cl2로 추출한 후, 무수 Na2SO4상에서 건조 및 농축하였다. 생성된 고체인 숙신산 무수물(13.0 mg, 130 μmol) 및 트리에틸아민(60.5 μL, 433 μmol)을 CH2Cl2(900 μL)에 용해시켰다. 이 후 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 조반응 혼합물을 실리카겔 플래쉬 칼럼 크로마토 그래피 (CH2Cl2 : 메탄올 = 1 : 1 아세트산 함유 10 : 1)로 직접 정제하여 백색 고체인 중간생성물을 수득하였다(35.3 mg, 78.5 % 수율).
중간생성물(26 mg, 50 μmol), (4-(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)페닐)메탄아미늄(23.7 mg, 75.2 μmol), HATU (38.1 mg, 100 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(43.7 μL, 251 μmol)를 DMF (500 μL)에 용해시킨 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 용매를 감압 하에 제거하고 조생성물을 실리카겔 플래시 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 : 메탄올 = 20 : 1)로 정제하여 화학식 13을 적색 고체로 수득하였다(26 mg, 74 % 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.45-8.37 (m, 2H), 8.37 (s, 1H), 7.45 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.03-6.99 (m, 2H), 6.79 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.55 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.44 (s, 2H), 3.64 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.43 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 3.29 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 3.04 (s, 3H), 2.67 (m, 4H), 2.61 (s, 3H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) 195.5, 172.4, 172.3, 167.1, 163.7, 162.2, 146.7, 143.4, 134.1, 133.9, 130.6, 128.54, 128.46, 128.2, 127.9, 124.3, 122.04, 121.99, 119.8, 115.0, 112.2, 109.2, 46.7, 44.4, 43.2, 39.9, 35.8, 32.0, 28.3, 26.0, 21.1, 12.7; HRMS (ESI) m/z calcd for C39H43N9NaO4 [M+Na]+ : 724.3330, found: 724.3333.
[시험예 1]
화합물과 TCO의 반응에 따른 흡수 특성의 변화
본 시험에서 흡수 스펙트럼은 UV-VIS 분광 광도계 UV-1650PC (Shimadzu)로 측정하였고, 방출 스펙트럼 및 운동 데이터는 Cary Eclipse Fluorescence 분광 광도계 (Varian Associates)를 사용하여 측정하였으며, 절대 양자 수율은 QE-2000 (Otsuka Electronics)으로 측정하였다.
각 화합물의 화학식 구조에 따라 인돌리진 및 테트라진의 전기적 직교성에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여, (E)-시클로옥트-4-엔올 ((E)-cyclooct-4-enol, “TCO”)와 생물직교 반응 전후의 각 화학물의 흡수 스펙트럼을 확인하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
전기적 직교성은 TCO와의 반응 후 흡수 봉우리의 변화를 분석함으로써 확인할 수 있다. 만약, 인돌리진과 테트라진이 두 개의 독립적이고 전자적으로 디커플된 상태(de-coupled state)라면, 화합물과 TCO의 고리화 반응 후에는 테트라진의 흡수에 따른 500-550 nm 부근의 흡수 봉우리가 사라지고 나머지 흡수 봉우리는 그대로 유지될 것이다.
반면, 인돌리진과 테트라진이 강하게 결합되어 단일 발색단으로 작용한다면 TCO와의 고리화 반응은 π-컨쥬게이션 길이의 감소로 인해 흡수 스펙트럼이 전반적으로 단파장 쪽으로 이동하게 된다.
도 1에 나타낸 바와 같이, TCO 처리 전, 실시예 1 내지 4의 화합물은 약 400-420 nm의 흡수 봉우리를 가지나, 약 500-550 nm의 흡수 봉우리는 관찰할 수 없었다. 테트라진 유도체가 일반적으로 500-550 nm 부근에서 뚜렷한 흡수 봉우리가 나타내므로, 실시예 1 내지 4의 화합물에서 인돌리진과 테트라진 간의 결합 상태가 강함을 알 수 있다.
또한, TCO 처리 후, 실시예 1 내지 4의 화합물에서 흡수 봉우리가 415nm에서 386 nm로 전체적으로 단파장 쪽으로 이동한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 실시예 1내지 4의 화합물에서 인돌리진과 테트라진이 강력한 전자적 결합 상태를 갖는 것을 알 수 있다.
반면, 도 2에 나타낸 바와 같이, TCO 처리 전, 비교예 1 내지 4의 화합물은 약 400-420 nm 및 500-550 nm 에서 두 개의 다른 흡수 봉우리를 갖는 것을 확인하였다.
TCO 처리 후, 비교예 1 내지 4의 화합물에서 테트라진의 흡수에 기인한 500-550 nm 부근의 흡수 봉우리가 사라지고, 나머지 봉우리는 그대로 유지되었다. 따라서, 비교예 1내지 4의 화합물은 인돌리진과 테트라진이 강력한 전자적 결합 상태를 갖지 않는 것을 알 수 있다.
[시험예 2]
화합물과 TCO의 반응에 따른 방출 특성의 변화
화합물과 TCO의 반응 전후 최대 형광 강도에 도달했을 때의 방출 스펙트럼을 비교하여, 실시예 1 내지 4, 및 비교예 1 내지 4의 화합물의 형광 변화를 관찰하여, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 구분 | Φoff | K2 (m -1 s -1 ) |
λex (nm) |
λem (nm) |
Φon | 형광증폭률 (on/off) |
| 실시예 1 | 0.002 | 24 | 375 | 484 | 0.683 | > 1,000 |
| 실시예 2 | 0.001 | 23 | 383 | 505 | 0.485 | > 1,000 |
| 실시예 3 | 0.002 | 22 | 390 | 562 | 0.064 | > 600 |
| 실시예 4 | 0.001 | 22 | 401 | 581 | 0.045 | > 600 |
| 비교예 1 | 0.011 | 21 | 416 | 532 | 0.168 | 20 |
| 비교예 2 | 0.042 | 15 | 401 | 522 | 0.583 | 14 |
| 비교예 3 | 0.012 | 15 | 375 | 493 | 0.616 | 67 |
| 비교예 4 | 0.017 | 8.5 | 401 | 530 | 0.325 | 24 |
- Φoff 및 Φon : 각각 TCO와 반응 전후의 절대 양자수율
- K2 : 20 ° C에서 측정한 2차 속도상수 값
- λex : 주어진 최대 방출 파장에서의 가장 큰 여기 최대값(largest excitation maxima),
- λem: 최대 방출 파장
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 화합물은 TCO와 반응 전, 완전 소광의 형광 특성(양자수율: 0.1 ~ 0.2%)을 나타내었고, 비교예 1 내지 4의 화합물은 TCO와 반응 전, 잔류 형광 특성(양자수율: 최대 4 %)을 나타내었다.
또한, 비교예 1 내지 4의 화합물은 반응 전후 형광신호가 약 10 내지 70 배 정도 증폭되는 것을 확인하였고, 실시예 1 및 2의 화합물은 형광신호가 1,000 배 이상 증폭되고, 실시예 3 및 4의 화합물은 형광신호가 600배 이상 증폭되는 것을 확인하였다.
결과적으로, 강한 전자 결합을 갖는 실시예 1 내지 4의 화합물은 TCO와 반응하기 전에는 완전한 소광 상태를 갖지만, TCO와 반응 후에는 형광신호가 600 내지 1000배 이상 증폭되는 것을 알 수 있다.
[시험예 3]
치환기에 따른 형광증폭 시험
하기 화학식 1의 화합물에서, R1위치에 전자공여 그룹의 치환이 형광증폭에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 비교예 3 및 4의 R1 위치에 전자공여기인 디에틸아미노기를 도입하여 비교예 5 및 6을 제조하였다.
[화학식 1]
화합물과 TCO의 반응 전후 최대 형광 강도에 도달했을 때의 방출 스펙트럼을 비교하여, 실시예 1 및 4, 및 비교예 3 내지 6의 화합물의 형광 변화를 관찰하여, 그 결과를 하기 표 2, 도 3 및 4에 나타내었다.
| 구분 | Φoff | K2 (m -1 s -1 ) |
λex (nm) |
λem (nm) |
Φon | 형광증폭률 (on/off) |
| 실시예 1 | 0.002 | 24 | 375 | 484 | 0.683 | > 1,000 |
| 실시예 4 | 0.001 | 22 | 401 | 581 | 0.045 | > 600 |
| 비교예 3 | 0.012 | 15 | 375 | 493 | 0.616 | 67 |
| 비교예 4 | 0.017 | 8.5 | 401 | 530 | 0.325 | 24 |
| 비교예 5 | 0.005 | 15 | 418 | 608 | 0.016 | 30 |
| 비교예 6 | 0.013 | 1.2 | 438 | 625 | 0.028 | 3 |
- Φoff 및 Φon : 각각 TCO와 반응 전후의 절대 양자수율
- K2 : 20 ° C에서 측정한 2차 속도상수 값
- λex : 주어진 최대 방출 파장에서의 가장 큰 여기 최대값(largest excitation maxima),
- λem: 최대 방출 파장
상기 표 2에서 보는 바와 같이, TCO와의 반응 후 비교예 5 및 6의 화합물은 비교예 4 및 5와 비교하여 형광신호 증폭 효율이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 형광체-소광제 분자단일화 방식의 구조를 갖는 실시예 1 및 4의 화합물은 장파장 영역에서도 우수한 형광신호 증폭효율을 가지며, 이는 R1 위치의 전자공여기와 무관한 것을 알 수 있다.
[시험예 4]
화합물의 바이오 응용 가능성 확인 실험 (미세소관)
본 발명의 화합물은 장파장 영역에서도 높은 형광증폭 효율을 갖기 때문에, 다양한 색깔을 동시에 확인할 수 있는 다원동시 이미징(multiplex imaging) 프로브로 유용성을 갖는지 여부를 하기의 방법으로 확인하였다.
형광 이미징 시험은 GE Healthcare의 DeltaVision Elite 이미징 시스템을 사용하여 수행하였고, Olympus IX-71 현미경을 사용하였다.
생체 내 사용을 위해, 하기 화학식 1의 R3 위치에 피페라진 및 카르복실기와 같은 수용성 치환기를 도입하여, 실시예 5 및 실시예 6의 화합물을 제조하였다.
[화학식 1]
미세 소관의 형광 바이오 이미징을 위해 docetaxel-TCO 접합체 (Dox-TCO)를 사용하였다. HeLa 인간 자궁경부암 세포를 고정시키고 Dox-TCO와 함께 1 시간 동안 배양한 후, PBS로 세척하였다.
상기 세포에 실시예 5 또는 실시예 6의 화합물을 첨가한 즉시 밝은 형광 신호가 생성되었고, 세포 내 형광 이미지는 미세 소관의 전형적인 스핀들(spindle) 구조와 유사한 것으로 관찰되었다.
반면에, 실시예 5 또는 6의 화합물을 처리하지 않은 군에서는 세포 내 무시할 수 있을 정도의 배경 신호가 존재하고 세포 외부의 배경 신호는 존재하지 않는 것을 확인하였다.
또한, α-tubulin 항체를 이용한 추가적인 면역 형광 검사를 실시한 결과가 실시예 5 또는 실시예 6의 형광신호의 위치와 일치하는 것을 관찰하여 미세소관 특이적인 염색임을 확인하였다.
[시험예 5]
화합물의 바이오 응용 가능성 확인 실험 (미토콘드리아)
살아있는 세포에서 미토콘드리아의 형광 이미징을 확인하기 위하여, 하기의 방법으로 시험하였다.
트리페닐포스포늄(TPP)-TCO의 존재 또는 부재하에, 1 시간 인큐베이션 한 후, HeLa 세포를 세척하고 실시예 5 또는 실시예 6의 화합물로 처리하였다.
TPP-TCO를 처리하지 않은 경우, 미토콘드리아의 특정 염색 또는 배경 신호가 관찰되지 않았다.
반면, TPP-TCO 및 실시예 5 또는 TPP-TCO 및 실시예 6의 화합물을 처리한 경우 선명한 형광 미토콘드리아 이미지를 관찰하였으며, 세포 외 영역에서는 형광발현 강도가 0으로 관찰되었다.
또한, 미토콘드리아에 대한 TPP-TCO 및 실시예 5, 및 TPP-TCO 및 실시예 6의 선택성을 확인하기 위해, HeLa 세포를 미토콘드리아 착색 염료인 MitoTracker Deep Red와 함께 처리하였다. 그 결과 MitoTracker Deep Red와 실시예 5 또는 실시예 6의 형광신호의 위치가 일치하는 것을 관찰할 수 있었다.
결국, 본 발명의 화합물을 통해 형광 프로브를 제거하기 위한 세척 단계 및 세포 고정 단계 없이 세포 내부 및 외부의 형광신호를 선명히 수득할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 통해 다양한 형광파장 영역에서 우수한 형광 이미지를 확보할 수 있으며, 다원동시 이미징(multiplex imaging)으로 활용 가능하다는 점을 알 수 있다.
Claims (8)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C6 알콕시, 하이드록시 또는 NR4R5 (여기에서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-C6 알킬기 또는 C3-C8 시클로알킬기) 이고,
R2는 수소, C1-C6 알킬, C6-C20 아릴 또는 C4-C20 헤테로아릴기이며,
R3은 수소, 하이드록시, 트리이소프로필실릴(TIPS)로 보호된 알코올, C3-C8 헤테로시클릭 또는 아민기이고,
상기 헤테로시클릭 또는 아민기는 C1-C6 알킬; 카르복실C1-C6알킬 또는 tert-부틸옥시카르보닐기(Boc기)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있음.
- 제1항에 있어서,
R1은 수소, C1-C6 알콕시, 또는 NR4R5 (여기에서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬기) 이고,
R2는 수소 또는 C1-C6 알킬이며,
R3은 수소, C3-C8 헤테로시클릭 또는 아민기이고,
상기 헤테로시클릭 또는 아민기는 C1-C6 알킬; 카르복실C1-C6알킬 또는 tert-부틸옥시카르보닐기(Boc기)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제2항에 있어서, R2는 C1-C6 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항에 있어서, 하기 화학식 2 내지 7의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물:
[화학식 2]
[여기서, Boc는 tert-부틸옥시카르보닐기임]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
및
[화학식 7]
- 제1항에 있어서, UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 측정한 흡수 스펙트럼에서 500-550 nm의 흡수 봉우리를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 화합물이 형광 프로브로 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제6항에 있어서, 상기 화합물이 생체 내에서 생물직교 반응(bioorthogonal reaction)을 통해 형광 프로브로 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제7항에 있어서, 상기 화합물이 다원동시 이미징(multiplex imaging) 형광프로브로 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
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