KR100950246B1 - 야누스 그린 ｂ를 포함하는 가시화 제제 및 이를 이용한가시화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 야누스 그린 B(Janus Green B, JGB)를 포함하는 가시화 제제, 및 이를 이용한 가시화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 림프 조직에 JGB를 주입하여 염색하고, 현미경으로 관찰하는 단계를 포함하는 림프관 내부에 유리된 혈관내 실 구조체(봉한관)를 가시화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포 해부학 및 생리학 분야에 획기적인 발견을 제공한다. 상기 구조체의 조직학적 특징 및 생리학적 기능에 대한 더 많은 연구는 생물학 및 의학 분야에 중요한 새 개념의 가능성을 제시할 수 있다.

Description

야누스 그린 Ｂ를 포함하는 가시화 제제 및 이를 이용한 가시화 방법{VISUALIZING AGENT COMPRISING A JANUS GREEN B AND VISUALIZING METHOD BY USING THE SAME}

본 발명은 야누스 그린 B(Janus Green B, JGB)를 포함하는 가시화 제제, 및 이를 이용한 가시화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 림프 조직에 JGB를 주입하여 염색하고, 현미경으로 관찰하는 단계를 포함하는 림프관 내부에 유리된 혈관내 실 구조체를 가시화하는 방법에 관한 것이다.

1960년대 초, 김봉한(Bonghan Kim)은 혈관계 또는 신경계와는 완전히 다른 새로운 순환계의 큰 네트워크의 일부로서 림프관 내부에 있는 혈관내 실 구조체(intravascular threadlike structure)를 발견하였다고 보고하였으나, 실험 결과의 재현성 문제로 인하여 그 방법이 공개되지 않았다(참고문헌 1). 따라서, 그의 연구는 오랫동안 방치되어 왔다. 한국의 생리학자인 김봉한은 그의 발견이 3번째 순환계를 형성한다고 가정하여 "봉한관(Bonghan duct)"이라고 불리는 물리학 기초의 침 경락지에 보고하였다. 손상된 조직내 세포를 재생시키는 특이적인 과립구를 포함하는 액체는 이러한 봉한관의 네트웍을 통하여 이동한다. 그의 연구는 1962~1965년까지 한국의학지(한국)에 5편이 발표되었다. 본 발명의 참조로서 포함된 9번째 참고문헌은 그의 초기 연구의 일부를 요약한 영어 논문이다.

이와 달리, 일본의 해부학자인 후지와라(Fujiwara)는 김의 실험 결과(참고문헌 4)를 부분적으로 인정하였으나, 보다 많은 관심을 받기에는 매력적이지 못하다고 주장하였다. 더욱 최근에는, 몇몇 연구자들은 랫트 및 토끼에서 혈액을 천천히 관류시키는 방법(참고문헌 6)을 이용하여 토끼 및 렛트의 내장 표면에 있는 실 구조체(참고문헌 14, 15, 20)뿐 아니라 혈관내 실 구조체를 재발견하였다. 비록 김(Kim)은 림프관 내부에 실 구조체가 있음을 주장하였으나, 이에 대한 어떠한 증거 시진도 제시하지 못했다. 또한, 김의 방법은 공개되지 않았기 때문에, 후지와라를 포함한 어떠한 사람도 그의 주장을 확인할 수 없었다.

완전하게는 아니더라도 림프관이 발견된 후 초기에는, 림프관의 해부학적 구조 및 생리학적 기능 대부분이 밝혀진 것으로 알려졌다(참고문헌 5, 16). 또한, 림프관의 관강 내에 림프구를 포함하는 유동액이 존재한다는 사실이 명백하게 밝혀지게 되었고, 이외 림프관 내에 다른 구조체는 알려지지 않았다.

이러한 림프관 내에 존재하는 새로운 구조체는 현미경으로는 검출하기가 매우 어렵기 때문에 종래에는 알려지지 않았다. 서양 해부학에서도, 림프관 내부에 유리된 혈관내 실 구조체에 대하여 어떠한 언급도 하지 않았다(참고문헌 5, 16). 이러한 구조체가 중간규모(대략 20 ㎛ 정도의 두께를 가진)로 존재하고 있고 많은 외과수술에서도 관찰되지 않았다는 사실은 매우 놀라운 일이다. 분명하게, 이러한 구조체의 광학적 투명도는 이들을 검출하는데 매우 어려움을 주게 된다.

도 1은 실시예 1에 따른 토끼의 대정맥 하부 근처에 있는 림프관의 입체상을 나타낸 것이고;

도 2는 실시예 1에 따른 아크리딘 오렌지로 염색한 시료를 공초점 레이저주사현미경(CLSM)으로 측정한 실 구조체의 광학적 절편화된 연속상을 나타낸 것이고;

도3(A)는 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 림프관 내부에 있는 실 구조체(화살표 부위)의 교차단면상을 1,000(x) 배율 및 200(x) 배율로 측정한 사진이고, 도 3(B)는 실시예 1에 따른 실 구조체(화살표 부위)의 사선단면상을 400(x) 배율 및 200(x) 배율로 측정한 사진이고;

도 4(A)는 특징적인 외막을 가진 또 다른 하부구조를 포함하는 붕괴된 림프관(점선으로 그려진 테두리 부위, 현미경상에서 관찰되지 않음)을 나타내는 동결-절편화된 시료이고, 도 4(B)는 실시예 1에 따른 (A)의 직사각형 부위를 확대한 사진이고;

도 5는 실시예 2에 따른 광학현미경(Axiophot, Carl Zeiss, 독일)하에서 측정된 실 구조체(화살표 부위)를 가진 림프관을 나타내는, 헤마톡실린과 에오신으로 염색된 시료의 교차단면상을 나타낸 것이고; 및

도 6은 실시예 2에 따른 동결주사전자현미경(JSM-5410LV, JEOL, 일본)하에서 측정된 림프관 내부에 있는 새로운 실 구조체(점선으로 그려진 테두리 부위)의 교차단면상을 나타낸 것이다.

<발명의 요약>

림프관 내부에서 유리된 혈관내 실 구조체는 육안으로 확인하기 어렵기 때문에, 이를 위해 본 발명자들은 직접적인 표시가 가능하도록 이 부위를 다량으로 염색할 수 있는 새로운 구조체인 야누스 그린 B(Janus Green B, JGB)를 이용한 새로운 방법을 개발하였다. 아크리딘 오렌지(acridine orange)로 염색하여 얻어진 시료는 공초점 레이저주사현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM)으로, 헤마톡실린으로 염색하여 얻어진 시료는 광학현미경(light microscopy)으로, 및 동결된 시료는 동결주사전자현미경(cryo scanning electron microscopy, Cryo-SEM)으로 각각 측정하였다. 따라서, 혈관벽에 부착하지 않은 림프관 내부에 유리된 실 구조체를 발견했다는 것은 매우 놀라운 일이다. 즉, 전세계에 걸쳐 지금까지 림프관에 관한 많은 외과수술 및 연구에도 불구하고 약 10 ㎛의 직경을 가진 실 구조체를 발견하지 못했다는 사실은 도저히 믿어질 수 없는 일이라 여겨졌다.

따라서, 본 발명의 목적은 입체현미경하에서 림프관 내부에 있는 림프판을 통하여 실 구조체의 통로를 명확하게 나타낼 수 있는 야누스 그린 B(JGB)를 포함하는 가시화 제제를 제공하는 것이다. 상기의 새로운 실 모양의 조직 및 그의 조직학적 구조를 특이적으로 염색하는 염료의 개발은 세포 해부학에 대한 이해의 폭을 넓히는데 매우 중요하다.

본 발명의 또 다른 목적은 JGB를 포함하는 가시화 제제를 이용한 가시화 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 수반되는 도면은 본 발명의 더 많은 이해를 돕기 위하여 본 명세서의 일부로서 구성 및 첨부되었고, 본 발명의 원리를 설명하기 위하여 도면의 설명 및 발명의 실시예를 들어 구체적으로 설명하였다.

JGB를 포함하는 림프관 내부 봉한관의 염색용 가시화 제제. 상기 제제는 인 시추(in situ) 또는 생체 내(in vivo)에 있는 혈관내 실 구조체를 가시화하는데 사용된다. 상기 제제는 다른 림프 조직에 비하여 혈관내 실 구조체를 다량으로 염색하여 가시화한다.

상기 가시화 제제는 0.01 내지 10 (w/v)%의 JGB 용액을, 바람직하게는 0.1 내지 5 (w/v)%의 JGB 용액을 포함하는 것일 수 있다. 상기 JGB 용액을 준비하는데 사용되는 용매로는 특별히 한정되어 있는 것은 아니나, 바람직하게는 에탄올, 및 식염수를 포함하는 것일 수 있다. 보다 바람직한 용매로는 에탄올일 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 가시화 제제를 이용하여 림프관 내부에 유리된 혈관내 실 구조체를 가시화하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 림프 조직에 JGB를 주입하여 염색하고, 및 현미경으로 관찰하는 단계를 포함하는, 림프관 내부에 유리된 혈관내 실 구조체를 가시화하는 방법에 관한 것이다. 상기 가시화 방법은 인 시추(in situ) 또는 생체 내(in vivo)에 있는 림프관 내부에 유리된 혈관내 실 구조체를 가시화하는데, 이는 혈관내 실 구조체를 연구하는데 매우 중요한 방법이다. 염료인 상기 JGB는 새로운 혈관내 실 모양의 조직을 강하게 염색할 수 있으며, 투명한 림프관 내부의 생체 내 및 인 시추상에 있는 새로운 실 구조체를 관찰하는데 이용가능하다.

JGB는 미토콘드리아 및 신경을 염색한다고 알려져 왔다(참고문헌 3, 21). 본 발명에 있어서, 상기 JGB를 이용한 염색 방법은 인 시추 및 생체 내에서 토끼의 림프관 내부에 있는 거의 투명한 실 구조체를 노출시킨다. JGB는 상기 실 구조체를 분명하게 가시화시킬 수 있는 반면, 몇몇 다른 염료들은 이러한 가시화 능력을 나타내지 않았다.

일반적인 구조체에서 발견되는 것처럼, 염색 방법은 혈관 벽에 부착 없이 토끼의 림프관 내부에 유리된 실 모양의 조직을 인 시추 및 생체 내에서 관찰하기 위하여 개발되어 왔다. 이러한 새로운 구조체는 종래에는 알려지지 않았는데, 이는 현미경을 이용하여 림프관을 관찰할 경우 상기 구조체를 탐지하기 어렵기 때문이다. 이에, 본 발명자들은 직접적인 표시가 가능하도록 새로운 구조체를 다량으로 염색할 수 있는 야누스 그린 B(Janus Green B)를 이용하는 방법을 발견하였다. 상기 조직은 공초점 레이저주사현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM), 광학현미경(light microscopy), 및 동결주사전자현미경(cryo scanning electron microscopy, Cryo-SEM)을 이용하여 측정할 수 있다. 새로운 조직을 아크리딘 오렌지(acridine orange)로 염색하여 얻어진 CLSM 상에서는 상기 조직의 특징적인 핵 분포, 즉 부서진 선과 줄무늬가 있는 형태로 정렬된 10-20 ㎛의 막대 모양의 핵이 관찰되었다. 헤마톡실린과 에오신 염색에서는 림프관(lymphatic vessel) 및 림프판(lymphatic valve)과는 조직학적으로 다른 림프판(lymphatic valve)을 통과하는 실 구조체가 관찰되었다. Cryo-SEM상에서는 붕괴된 림프관에 의해 갇힌 실 구조체가 관찰되었다. 급속 동결된 시료의 누관(sinus) 내부에는 구형의 구조체가 관찰되었는데, 이는 상기 실 구조체에 있는 세로로 된 관을 통하여 흐르는 액체일 수 있다. 이러한 JGB를 이용한 특이적인 염색 방법은 림프관 내부에 있는 실 구조체가 이를 포함하는 세포 및/또는 신경과 유사한 특징을 가진 세포 내에 고밀도의 미토콘드리아를 가지고 있음을 나타낼 수 있고, 이들 세포 중 어느 하나는 상기 실 구조체의 생리적인 기능에 중요한 단서를 제공해 줄 수 있다. JGB는 메틸렌 블루(methylen blue), 메틸 그린(methyl green), 및 톨루이딘 블루(toluidine blue)와 같은 다른 염료보다 더욱 효과적으로 상기 실 구조체를 가시화할 수 있다. 이는, 상기 염료들의 양을 염색 시 줄이거나 혹은 제거하더라도, 상기 실 구조체만큼 다량으로 림프관을 염색하기 때문이다.

이하에서는, 림프관 내부에서 유출된 혈관내 실 구조체를 "봉한관(Bonhan duct)"이라고 명명하였는데, 이는 혈관계 또는 신경계와는 완전히 다른 새로운 순환계의 큰 네트워크 중 일부로서 김봉한에 의해 보고되었다. 김봉한의 설명에 의하면, 상기 실 구조체는 유사부교감신경계(parasymphatomimetic)인(참고문헌 9) 위장관과는 전혀 다른 독특한 이동 양상을 가지고 있다고 주장하였다. 이는 상기 봉한관은 특이적인 연동 운동, 및/또는 부교감신경의 특징을 갖도록 많은 수의 미토콘드리아를 포함하고 있기 때문에 JGB에 의해 염색될 수 있음을 의미한다. 이러한 특징으로 인해, 상기 봉한관은 더욱 더 생리학적으로 적용될 수 있으며, 이를 위해 더욱 평가되어야 한다. 본 발명에서는 실 구조체 내부에 고밀도의 미토콘드리아가 있음을 최초로 보고하였다. 이는, 나노입자 기술을 이용한 가시화 방법에도 많은 장점을 부여할 수 있다.

림프관 내부에 유출된 상기 염색된 혈관내 실 구조체는 현미경으로 관찰할 수 있다. 현미경은 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 상기 현미경은 통상적인 방법으로 JGB로 염색된 구조체를 확인할 수 있는 현미경을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 현미경 관찰은 바람직하게는 입체현미경, 광학현미경, 공초점 레이저주사현미경(CLSM), 및 동결주사전자현미경(Cryo-SEM)으로 수행할 수 있다. 이때, 상기 입체현미경 관찰은 JGB를 림프 조직에 주입한 후 수행할 수 있다.

공초점 레이저주사현미경(CLSM) 관찰은 JGB를 림프 조직에 주입한 후 아크리딘 오렌지로 염색한 후 CLSM을 이용하여 수행할 수 있다. 림프관 내부에 있는 JGB로 염색된 실 구조체가 착시(optical illusion) 또는 실제 조직과 다른 눈에 보이는 인공물이 아닌지를 증명하기 위하여, 상기 실 모양의 시료 중 일부를 채취하여 핵 및 이의 분포를 확인할 수 있는 제제인 0/1% (w/v)의 아크리딘 오렌지로 염색한 후 CLSM을 이용하여 관찰하였다.

조직학적 분석은, JGB를 림프 조직에 주입한 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 광학현미경을 이용하여 관찰할 수 있다. 더욱이, 림프관 내부에 새로운 구조체가 있는지를 직접적으로 증명하기 위하여, 상기 실 구조체를 가진 림프관을 조직학적 방법 및 동결주사전자현미경을 이용하는 방법으로 조사하였다. 상기 조직의 교차 및 사선 단면상에서는 특이한 구조가 관찰되었고, 동결건조주사현미경상에서는 상기 시료의 급속 동결에 의해 유지된 액체가 내부에서 자세하게 관찰되었다.

본 발명에서는 새로운 구조체가 명백하게 존재하고 있음을 설득력 있게 증명하였다. 혈관내 구조체의 초기 연구에서는, 새롭게 관찰된 구조체의 존재 및 신규함을 증명하기 위하여 특이적인 관류 방법, 아크리딘 오렌지를 이용한 형광 기술 방법, 및 헤마톡실린과 에오신을 이용한 염색 방법과 같은 복잡한 방법을 이용하였다(참고문헌 13). 그러므로, JGB를 이용한 염색 기술 및 이를 통한 림프관 내 새로운 구조체의 인 시추(in situ) 및 생체 내(in vivo) 증명 방법을 개발하는 것은, 상기 신규한 구조체의 존재를 입증하는데 매우 중요하다.

상기 헤마톡실린과 에오신으로 염색된 단면상, 및 동결주사전자현미경으로부터 얻어진 동결-절편화된 시료의 상은 림프관 내부에 유리된 어떤 실 구조체가 존재하고 있음을 강하게 보여주고 있다. 상기 실 구조체의 두께는 대상 시료에 따라 다양하며, 특히 실 구조체의 기능적인 상태 및/또는 대상 시료 동물의 생리적인 상태에 따라 다르다. 다양한 림프관에 있는 혈관내 실 구조체의 핵의 직경 및 다발 구조, 및 그 크기 및 배열은 토끼 및 렛트의 동맥 및 정맥에서 발견된 것과 유사하다(참고문헌 13). 상기 실 구조체의 다발 구조는 그 크기가 약 5 ㎛인 관들로 이루어져 있는데, 이는 CLSM 및 조직학적 상에 의한 것이다. 더욱이, 상기 동결주사전자현미경상에서 관찰되는 특이적인 구형의 구조체 및 분리 구역은 상기 관의 누관 내부에 점성이 있는 액체가 있음을 의미한다. 이러한 새로운 실 구조체는 렛트에서도 유사한 결과를 보여 주었고, 이러한 렛트의 결과는 본 발명의 실시예에 기재하였다.

상기 결과로부터, 이러한 실 구조체의 생리적인 기능에 대한 김(Kim)의 이론을 좀 더 신중하게 고려해볼 수 있다. 그의 이론은 침의 경선(acupuncture meridian) 및 경혈(acupoint)에 대한 물리학의 기초를 세우는데 그 목적이 있다. 최근에는 경혈의 초음파 사진을 통하여 그의 주장과 일치하는 구조체가 밝혀지게 되었다(참고문헌 7). 그러나, 그의 이론 및 최근 널리 사용되고 있는 신경생리학 모델(참고문헌 2)과 관련된 그의 이론 모두 더 많은 연구가 필요하다. 김에 의하면, DNA를 포함하는 과립구(참고문헌 10)를 가진 몇 종류의 액체들은 미세세포와 유사하고, 세포치료(참고문헌 17)와 밀접하게 연관된 관(duct)을 통하여 흐른다고 하였다. 게다가, 상기 실 모양의 관은 발생 과정, 특히 상기 림프 혈관내 실 구조체는 조혈모 기능(참고문헌 17)과 밀접하게 관련되어 있다고 보았다. 따라서, 림프관 내부에서 새로운 구조체의 발견은 단순한 호기심이 아닌 세포 해부학 및 세포 생리학이 획기적인 발전에 중요한 초석이 될 수 있다. 또한, 상기 구조체의 조직학적 특징 및 생리적 기능을 보다 더 분석할 경우 생물학 및 의학 분야에 중요한 새로운 개념의 가능성을 제시할 수 있다.

이하, 본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 이때, 본 발명의 바람직한 실시예는 다음과 같다.

< 실시예 1> 토끼의 림프관 내부에 있는 실 구조체

뉴질랜드 흰 토끼 (암컷, 12 주령)는 한국중앙실험동물사로부터 구입하였고, 현재 통용되는 국제법 및 조약에 따른 동물 보호 및 실험 절차에 의해 상기 동물을 순응시켰다(실험동물 보호 및 사용 지침서, 국제대학출판, 1996). 1.5 g/kg의 우레탄을 토끼의 복강내로 주입하여 마취하였고, 모든 수술적인 절차는 통상적인 미취하에서 실시되었다.

상기 토끼의 복부는 절개되었고, 대정맥 하부 근처에 있는 많은 림프관들은 노출되었다. 림프관 내부에 유리된 실 구조체를 염색하기 위하여, 40℃에서 미리 열처리한 약 0.3ml의 JGB(100ml의 99.9% 순도 에탄올에 1g의 65% 야누스 그린 B(Janus Green B, Aldrich, 미국)를 첨가한 시료 함량)를 30 1/2 치수의 주사기에 적재하여 대정맥 하부 근처에 있는 림프절 또는 림프관으로 천천히 주입하였다. 주사 바늘을 제거한 후, 림프관 내에서 유동하는 푸른색의 JGB를 관찰하였다. 이어, 상기 시료로부터 역류하는 JGB를 세척하고, 상기 시료의 온도 유지, 및 생명력을 유지하기 위하여 40 ℃에서 미리 열처리한 PBS를 상기 림프관 및 림프절에 주입하였다. 시료를 관찰하기 위해서 입체현미경을 이용하였다. 림프관에서 잘 염색된 실 구조체의 위치는 대상 토끼의 림프관 상태 및 염색 정도에 따라 다양하다. 잘 염색된 부위가 발견되었을 때, 그 림프관 주위에 있는 연결 조직을 조심스럽게 제거하였는데, 이는 보다 명확한 관찰 및 본 발명에서 목표로 하는 시료를 용이하게 검출하기 위함이다.

공초점 레이저주사현미경(CLSM) 관찰을 위하여, 상기 시료를 수취한 후 즉시 10% 중성 완충포르말린용액에 고정시켰고, 이 중 일부를 0/1% (w/v)의 아크리딘 오렌지(acridine orange, Sigma-Aldrich, 미국)가 첨가된 PBS로 염색하였다.

조직학적 분석을 위하여, 우선 파라핀 포매를 위한 전처리 과정으로 실 구조체를 가진 상기 림프관을 10% 중성 완충포르말린용액에 고정시켜 준비하였다. 마이크로톰을 이용하여 상기 시료를 5㎛ 두께의 단편으로 절단하였고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 상기 절편은 광학현미경 (Axiophot, Carl Zeiss, 독일)하에서 관찰 및 인화하였다.

동결주사전자현미경(Cryo-SEM) 관찰을 위하여, 상기 방법으로 고정된 시료를 슬롯금속스텁(slotted metal stub)상에서 마운틴된 리벳으로 묶은 후, 동결-고정을 위하여 20초 동안 액체 질소에 담갔다. 동결 시료는 -170℃의 동결-전달 시스템(CT1500, Oxford Instruments, Oxon, UK)상에 있는 동결 챔버에 위치시킨 후, 주사전자현미경 (JSM-5410LV, JEOL, Tokyo, 일본)의 시료 위치대로 옮겨졌다. 이어, 동결 챔버 안에 있는 상기 리벳 표면을 차가운 나이프로 절단하여 JGB로 염색된 실 구조체를 포함하는 동결 림프관의 내부 구조체를 노출하기 위하여 동결-절편화하였다. 표면상의 동결된 물을 승화하기 위하여 열처리하였고, -60℃에서 10분간 상기 시료 위치대를 차갑게 유지하였으며, 5 kV의 가속 볼트상에서 전자현미경으로 상기 과정을 모니터링 하였다. 상기 시료를 동결-챔버 안에서 금 (두께가 약 30 nm 정도)으로 피막 처리한 후, 20 kV의 가속 볼트상에서 전자현미경으로 관찰하였다.

도 1은 토끼의 대정맥 하부 근처에 있는 림프관의 입체상을 나타낸 것이다. 이때, (A)는 염색 없이 일반적으로 관찰되는 부위이고, (B, C)는 JGB를 림프관에 주입한 후 염색하여 나타낸 부위이다. (A)에 있어서, 림프관 벽 근처에 있는 림프관 및 모세혈관의 내부에서 림프판 (화살촉 부위)이 관찰되었다. JGB를 주입한 후, (B)의 실 구조체 (화살표 부위)가 약하게 염색된 림프관 벽 내부에서 뚜렷하게 염색된 림프판 (화살촉 부위)이 관찰되었다. (C)의 실 구조체 (화살표 부위)는 관찰된 부위 중 가장 큰 것이며, 그 크기는 직경이 약 600 ㎛이다. (C)에 삽입된 도면에서, 3개의 염색된 림프판 (화살촉 부위)은 상기 림프관의 크기 및 잘 염색된 새로운 구조체가 그 판에 위치하거나 혹은 그 판을 통해서 관찰될 수 있음을 의미한다. 스케일 바는 1nm이다.

도1A는 대정맥 하부 근처에 있는 림프관의 입체현미경상을 나타낸 것으로, 이때 그 직경은 약 600 ㎛이다. 림프관 벽에 있는 모세혈관은 명확하게 관찰되었고, 림프관 벽 하부 아래쪽에 있더라도 관찰될 수 있다. 또한, 명확하지는 않지만 림프판 역시 관찰될 수 있다. 반면, 이외에는 림프관 내부에서 어떠한 다른 구조체도 관찰되지 않았다. 이는, 통상적인 현미경 관찰로는 새로운 조직을 검출하는데 어려움이 있음을 의미한다. 그러나, 염색 시료인 JGB를 림프관 또는 림프절에 주입한 후 림프관 내부에 새로운 구조체가 발견됨을 알 수 있었다. 도 1B 및 1C는 JGB를 림프관 또는 림프절에 주입한 후 나타낸 입체상이다. 도 1B에서 나타낸 바와 같이, JGB로 염색된 실 구조체가 염색된 림프판 및 약하게 염색된 림프관 벽과 함께 명확하게 관찰되었다. 또한, 도 1C에서 나타낸 바와 같이, 또 하나의 매우 두꺼운 실 구조체가 2개의 림프판 사이에서 원통 형태로 관찰되었다. 도 1B 및 1C에서 보여지듯이, 이러한 실 구조체의 두께는 대상 시료에 따라 매우 다양하다. 도 1C에 삽입된 도면은 약하게 염색된 림프관 벽 내에 있는 3개의 염색된 림프판을 통해 유리된 JGB로 염색된 실 구조체를 나타낸 것이다.

도 1B 및 도 1C는 표 1 및 2에 기재된 14번의 실험을 통해 얻어진 대표적인 도면이다. 본 발명자들은 대정맥 하부 및 장골정맥 옆에 있는 요추결절, 및 장 근처에 있는 복막내 림프관과 연결된 복부 림프관을 조사하였다. 14번의 실험을 통해, 본 발명자들은 2번의 실패를 제외하고는 모든 대상 토끼에서 림프관의 혈관 내 구조체를 관찰하였다. 따라서, JGB로 염색된 실 구조체는 특정 대상 시료에서 관찰되는 비정상적인 부위가 아님을 알 수 있다. 상기 림프관의 직경은 130~2000 ㎛ 범위이고, 실 모양 구조체의 직경은 26~500 ㎛ 범위이며, 평균적으로는 129 ㎛이다. 도 1B 및 1C에서 나타낸 바와 같이, 실 구조체의 두께는 대상 시료에 따라 다양하다.

표 1은 14마리의 뉴질랜드 흰 토끼로부터 얻어진 19개의 실 구조체의 크기를 나타낸 결과이다. 하기 표의 데이터의 값은 (평균±표준편차)로 기재하였고, 더욱 자세한 정보는 표 2에 기재하였다.

대상 시료의 림프관 위치	실 구조체의 수	림프관의 직경 (㎛)	실 구조체의 직경 (㎛)
대정맥 하부 근처	15	785.6±537.9	153.5±142.6
대장	1	180.0	13.0
장골정맥	3	510.0±340.7	43.3±7.0
전체	19	719.7±506.0	129.4±134.6

대상시료			주입 부위	대상 시료의 림프관 위치	림프관의 직경 (㎛)	실 구조체의 직경 (㎛)	실 구조체의 길이 (㎛)
일자 (2004)	성	몸무게 (kg)
10.18	암컷	2.2	대정맥 끝 림프관	대정맥 끝 근처	M: 1500 m: 600	100	4000
10.25	암컷	2.2	요추결절	대정맥 끝 근처	2000	50	3000
11.01	암컷	2.2	요추결절	대정맥 끝 근처	1060	80	12000
11.10	암컷	2.2	요추결절	대정맥 끝 근처	100	16	220
					880	DM: 510 Dm: 190	4000
11.11	암컷	2.2	대정맥 끝 림프관	대정맥 끝 근처	M: 400 m: 180	30	5000
					M: 880 m: 320	60	3200
11.15	암컷	2.2	요추결절	대정맥 끝 근처	540	80	940
11.16	암컷	2.2	요추결절	대정맥 끝 근처	X	X	X
11.18	암컷	2.2	요추결절	대정맥 끝 근처	X	X	X
11.24	암컷	2.2	요추결절	대정맥 끝 근처	180	50	1600
					600	230	2700
11.25	암컷	2.2	요추결절	대정맥 끝 근처	1500	500	5000
					1300	DM: 400 Dm: 170	1700
					960	170	6600
11.29	암컷	2.2	대장 림프관	대장 상부	360	26	1180
12.01	암컷	2.2	요추결절	대정맥 끝 근처	130	40	2700
					540	260	4540
12.06	암컷	2.2	림프절 끝	장골정맥 끝	270	44	2700
					360	50	2180
							B: 1800
12.07	암컷	2.2	림프절 끝	장골정맥 끝	900	36	1640

표 2는 상기 표 1에서 언급한 14마리 토끼에 대한 보다 자세한 정보를 포함 B=branch, X=시료 채취 불가, DM=duct maximum, Dm=duct minimum, JGB=Janus Green B.

도 2는 아크리딘 오렌지로 염색한 후 공초점 레이저주사현미경(CLSM)으로 관찰한 실 구조체의 광학적 절편화된 연속상을 나타낸 것이다. 핵은 막대기 모양이며, 길이가 10~20 ㎛이다. 이들은 부서진-선 형태로 분포되어 있고, 선의 수도 A~D까지 다양하며, 그 초점 깊이도 실 구조체의 바닥에서 1 ㎛까지 증가되었다. 스케일 바는 10 ㎛이다.

실 구조체의 핵 분포는 CLSM 관찰을 통하여 수행되었다. 상기 실 구조체의 한 부분을 400배로 확대하였고, 1 ㎛ 크기로 광학적 절단을 수행하였다. 이렇게 절편화된 상을 통하여, 상기 실 구조체는 약 10~20 ㎛의 특징적인 막대기-형태이며, 부서진-선 모양의 가늘고 긴 형태로 분포하고 있음을 알 수 있었다. 가늘고 긴 부선진 선의 수는 도 2A~2D에서와 같이 다양하며, 그 초점은 바닥에서부터 차례대로 1 ㎛씩 이동하였다. 이러한 특징은 상기 실 구조체가 약 5 ㎛의 직경을 가진 작은 관으로 이루어진 "다발(bundle)" 구조로 이루어질 수 있음을 의미한다. 또한, 이러한 구조는 기존에 알려진 토끼 및 랫트의 혈관 내부(참고문헌 1, 13) 및 장-표면에 있는 유사한 구조와 서로 연관되어 있다(참고문헌 14, 15, 20).

도 3의 (A)는 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 림프관 내부에 있는 실 구조체의 교차단명상 (화살표 부위)을 1,000(x) 배율 및 200(x) 배율로 측정하여 나타낸 것이다. (B)는 실 구조체의 사선단면상을 400(x) 배율 및 200(x) 배율로 측정하여 나타낸 것이다. (A)에 삽입된 도면에서 보여지듯이, 새로운 조직은 림프관 벽 및 림프판 (화살촉)에 부착하지 않았다. 헤마톡실린으로 다량 염색된 핵 (점선으로 된 화살표 부위)에 의해 부분적으로 둘러싸인 몇 개의 크고 작은 누관 (별표 부위)이 관찰되었고, 이들이 실 구조체를 따라 동일한 부위에서 지속적으로 나타남을 알 수 있었다. 스케일 바는 20 ㎛이고, 삽입된 도면의 스케일 바는 50 ㎛이다.

림프관 내부에 있는 새로운 구조체의 위치 및 이를 포함하는 세포 및 누관에 대한 정보를 얻기 위하여, 본 발명에서는 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 후 단면상을 분석하였다. 도 3A에 삽입된 교차단면상은 림프관 벽에 부착되지 않은 특징적인 조직 인자가 있음을 분명하게 보여주고 있다 (도 3A). 도 3A에서, 새로운 조직은 외막을 가지며, 림프관 내부에 있는 혈관내피세포와 달리 특이적으로 다량으로 염색된 핵을 포함하고 있음을 보여주고 있다. 이러한 새로운 조직 내부에 있는 세포외 기질은 몇 개의 크고 작은 누관을 가지고 있으며, 이러한 누관은 몇 개의 다른 슬라이드의 동일한 위치에서도 연속적으로 분포하고 있었다. 이처럼, 각 슬라이드에 연속적으로 누관이 나타난다는 것은 새로운 조직의 생리적 기능을 평가하는데 있어서 상기 누관에 대하여 더 많은 노력과 연구가 필요하다는 것을 의미한다. 도 3B의 사선단면상은 림프판에 의해 대부분이 둘러싸인 실 구조체의 특징적인 도면을 나타낸 것이다. 이 도면 및 삽입된 도면은 상기 판을 통과하는 실 구조체의 통로를 나타내고 있다. 이는, 상기 실 구조체가 실제로 존재함을 명백하게 증명하고 있다.

이러한 새로운 조직은 세포외 기질 내에 누관과 유사한 구조를 많이 가지고 있을 뿐 아니라 핵 내에 기능적인 특징을 가지고 있다. CLSM과 같은 형태학적 분석 방법 또는 헤마톡실린과 에오신에 의한 조직학적 분석 방법 이외에, 동결주사전자현미경(Cryo-SEM) 분석 방법은 세포 구조뿐 아니라 시료에 본래 가지고 있던 액체를 검출하는데 이용 가능하다(참고문헌 18). 유동성 물질, 세포 소기관, 및 거대분자는 동결 시 분리 구역에서 유지된다. 또한, 이러한 방법은 림프관 내부에 있는 실 구조체의 형태를 보다 세밀하게 관찰할 수 있도록 해준다.

도 4(A)는 특징적인 외막을 가진 또 하나의 하부 구조를 포함하는 붕괴된 림프관 (점선으로 표시된 테두리 부위, 현미경에서 관찰되지 않음)을 나타내는 동결-절편화된 시료의 도면이다. 도 (B)는 (A)에 있는 직사각형 부위를 보다 확대한 도면이다. 새로운 구조체는 분리 구역 및 구형의 구조체를 가진 누관을 가지고 있다. 상기 누관에 있는 유동 물질은 구형의 구조체로 유입된다 (화살표 부위). 스케일 바는 도 (A)에서는 200 ㎛ 이고, 도 (B)에서는 20 ㎛이다.

동결-절편화된 시료에서, 연결조직으로 둘러싸인 상기 림프관은 동결 후 승화시킴으로써 물결모양의 외막계를 가지는 것으로 확인되었으나, 새로운 조직은 림프관의 붕괴된 관강 내부에 존재하는 것으로 드러났다 (도 4A). 이러한 새로운 조직은 붕괴되지 않는 특징적인 외막을 가지며, 이러한 시료의 크기는 도 1C의 입체상에서 발견된 것과 유사하다. 도 4A의 직사각형 및 이를 확대한 도 4B에서 나타낸 바와 같이, 새로운 조직의 누관은 주변에 있는 세포질보다 더 넓은 공간의 분리 구역을 가지고 있음을 알 수 있다 (도 4B). 상기 누관이 분리 구역 및 구형의 구조를 가지고 있다 하더라도, 상기 누관은 그 내부에 구형의 물체 및 다른 구성성분을 포함하는 액체임을(액체를 가지고 있음을) 의미한다.

< 실시예 2> 랫트의 림프관 내부에 있는 실 구조체

렛트의 림프관 내부에 있는 실 구조체를 형태학적 및 조직학적으로 분석하기 위하여, 상기 실시에 1의 토끼를 이용한 실험 방법과 동일하게 실시하였다.

상기 실험을 위하여, 본 실시예에서는 중앙실험동물사로부터 마리 당 약 170g의 몸무게를 갖는 6 마리의 위스타 랫트(수컷, 암컷 모두 3마리씩)를 구입하였다. 상기 동물들을 12시간 light/dark cycle하에서 60% 상대습도를 가지며 일정한 온도로 조절된 환경(23℃)에서 순응시켰다. 또한, 모든 상기 동물들은 제한 없이 사료와 물을 공급받았다. 실험 동물과 관련된 실험 절차 및 동물의 보호는 현재 통용되는 국제법 및 조약에 준수하여 수행되었다(실험동물 보호 및 사용 지침서, 국제대학출판, 1996).

상기 렛트는 1.5 g/kg의 우레탄을 복강내로 주입하여 마취하였고, 모든 수술적인 절차는 통상적인 마취하에서 수행되었다. 상기 렛트의 복부면이 완전히 마취된 상태에서 절개하였고, 대정맥 하부 근처에 있는 복막 및 지방을 제거하여 요추결절 (lumbar node)을 노출시켰다.

0.05ml의 에탄올에 1%의 야누스 그린 B(JGB)가 함유된 용액을 30 1/2 치수의 주사기에 적재하여 천천히 주입하였다. 본 발명의 실시예에 기재된 토끼 실험에서, JGB는 림프절뿐 아니라 림프관에도 주입하였으나, 랫트 실험에서는 JGB를 3종류의 림프절, 즉 림프절 하부, 장 림프절, 및 요추 림프절에만 주입하였다. 토끼의 림프관과 비교했을 때, 랫트의 림프관은 매우 작아 주입하는데 어려움이 있었다.

시료를 수취한 후, 헤마톡실린과 에오신 염색 (도 5), 및 동결주사전자현미경 관찰(도 6)을 실시하였다. 그 결과를 도 5, 도 6, 및 표 3에 나타내었다.

렛트과 토끼의 결과는 매우 유사하였다. 렛트에서 관찰된 실 구조체의 평균 직경은 토끼의 것보다 작은 70±57 ㎛이며, 이들은 얇은 외막으로 둘러싸여 있고, 다량으로 염색된 핵과 세포외 기질을 포함하고 있었다 (도 5). 따라서, 본 발명자들은 이러한 렛트 및 토끼에서 실시된 방법과 유사한 방법을 이용할 경우, 다른 포유동물의 림프관 내부에 있는 새로운 실 구조체의 유무를 확인하는데 적용시킬 수 있음을 기대하였고, 이를 위해서는 더 많은 연구가 필요할 것이라 판단하였다.

도 5는 광학현미경 (Axiophot, Carl Zeiss, 독일)하에서 측정한 실 구조체 (화살표 부위)를 가진 림프관을 나타내는, 헤마톡실린과 에오신으로 염색된 시료의 교차단면상을 나타낸 것이다. 상기 시료는 약 5 ㎛의 두께로 파라핀-절개를 통하여 준비되었다. 이로부터 얻은 새로운 구조체는 얇은 외막 (2중선으로 표시된 화살표 부위)을 가지며, 다량으로 염색된 핵 (점선으로 표시된 화살표 부위) 및 세포외 기질을 포함하고 있다. 또한, 핵에 의해 부분적으로 둘러싸인 몇 개의 누관 (별표 부위)을 가지고 있다. 상기 실 구조체와 림프관 사이의 직경 비율은 대상 시료에 따라 다양하다. (A) 및 (B)는 각각 상대적으로 두껍고, 얇은 실 구조체를 나타내는 것이다. 이들은 동일한 랫트에서 유래된 것이나, 서로 다른 림프관이다. 2개의 도면에서 서로 다른 색깔을 보이는 것은 광학 필터에 의한 것이다. 즉, 본 발명자들은 상기 누관의 명확한 사진을 얻기 위하여 푸른색 필터 (A)를 사용하였다. 스케일 바는 20 ㎛이다.

도 6은 동결주사전자현미경 (JSM-5410LV, JEOL, 일본)하에서 림프관 내 부에 있는 새로운 실 구조체 (점선으로 표시된 부위)의 교차단면상을 나타낸 것이다. 동결-절편화된 시료에서, 상기 붕괴된 림프관은 특징적인 외막을 가진 또 다른 하부 구조를 포함하고 있음을 보여주고 있다. 토끼의 경우와 마찬가지로, 상기 림프관은 붕괴되었으나, 새로운 구조체는 붕괴되지 않았다. 스케일 바는 50 ㎛이다. 도 6B는 도 6A의 직사각형 부위를 더욱 확대한 도면이다. 이를 통해, 본 발명자들은 상기 실 구조체가 림프관 벽과 특징적으로 분리되어 있음을 관찰할 수 있었다. 이는, 상기 새로운 실 구조체가 림프관의 림프 내에서 유리되어 있음을 의미한다. 스케일 바는 10 ㎛이다. 6마리의 랫트로부터 유래된 6개의 실 구조체의 크기는 하기 표 3에 기재하였다.

대상 시료			림프절 주입	대상 시료의 림프절 위치	림프절의 직경 (㎛)	실 구조체의 직경 (㎛)		실 구조체의 길이 (㎛)
일자	성	몸무게 (g)
2004. 11.18	수컷	180	림프절 끝	방광 근처	340	60		920
					B: 90	B: 20		B: 680
2004. 11.18	암컷	160	림프절 끝	요추결절 하부	M: 530 m: 210	70		5100
2004. 11.20	수컷	150	장 림프절	간 근처	550	DM: 280		3000
						Dm: 80
2004. 11.22	암컷	180	림프절 끝	방광 근처	M: 260	50		2500
					m: 100
2005. 1.10	수컷	170	요추결절	요추결절 상부	M: 670	50		4000
					m: 290
2005. 1.19	암컷	170	요추결절	요추결절 하부	130	10		645

상기에서 사용된 약어는 다음과 같다: M=maximum, m=minimum, B=branch, X=시료 채취 불가, DM=duct maximum, Dm=duct minimum, JGB=Janus Green.

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Claims (13)

1. 야누스 그린 B(JGB)를 포함하며, 다른 림프 조직에 비하여 봉한관을 특이적으로 염색하여 가시화하는, 림프관 내부 봉한관(Bonghan duct)의 염색용 가시화 제제.
2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 인 시추(in situ) 또는 생체 내(in vivo) 봉한관을 가시화하는 것인, 가시화 제제.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 제제는 JGB를 포함하는 용액인 것인, 가시화 제제.
5. 제4항에 있어서, 상기 용액은 에탄올 또는 식염수 내에 0.01 내지 10 (w/v)%의 JGB를 함유하는 것인, 가시화 제제.
6. 림프 조직에 야누스 그린 B(JGB)를 포함하는 용액을 주입하여 염색하고,

   현미경으로 관찰하는 단계를 포함하는,

   림프관 내부의 봉한관을 가시화하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 용액은 0.01 내지 10 (w/v)%의 JGB를 함유하는 것인, 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 JGB는 인 시추(in situ) 또는 생체 내(in vivo) 봉한관을 염색하는 것인, 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 현미경 관찰은 입체현미경(stereomicroscope), 광학현미경(light microscope), 공초점 레이저주사현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM), 또는 동결주사전사현미경(cryo scanning electron microscope, Cryo-SEM)으로 측정하는 것인, 방법.
10. 제6항에 있어서, 상기 방법은 JGB를 상기 림프 조직에 주입한 후 봉한관을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 현미경 관찰은 광학현미경으로 측정하는 것인, 방법.
12. 제6항에 있어서, 상기 방법은 JGB를 상기 림프 조직에 주입한 후 봉한관을 아크리딘 오렌지(acridine orange)로 염색하는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 현미경 관찰은 공초점 레이저주사현미경으로 측정하는 것인, 방법.

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