KR100945717B1 - Use and a method of modified capsicum pectin fermented from red pepper extract - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고춧가루를 용매를 이용하여 펙틴을 추출하고, 상기 추출된 펙틴을 검정곰팡이(Aspergillus niger)로 발효시켜 생성되는 변형고추펙틴(MCP, Modified Capsicum Pectin)과, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 고춧가루로부터 펙틴을 함유한 추출물을 검정곰팡이(Aspergillus niger)로 발효시켜서, 고추 세포벽을 구성하고 있는 펙틴(pectin)화합물이 검정곰팡이(Aspergillus niger)로부터 분비되는 엔도폴리갈락투로나아제(endopolygalacturonase) 및 펙틴 메틸에스테라제(pectin methylesterase)에 의해 분해가 되도록 하여, 변형고추펙틴을 제조하는 방법을 제시한다. The present invention relates to a modified capsicum pectin (MCP, Modified Capsicum Pectin) produced by fermenting red pepper powder using a solvent and fermenting the extracted pectin with a black mold (Aspergillus niger), and a method and a use thereof. . That is, the present invention fermented an extract containing pectin from red pepper powder to black mold (Aspergillus niger), so that the pectin compound constituting the pepper cell wall is secreted from black mold (Aspergillus niger). The present invention provides a method for preparing a modified pepper pectin by being degraded by endopolygalacturonase and pectin methylesterase.
또한, 본 발명은 상기 제조된 변형고추펙틴(MCP)이 중금속(heavy metal)과 복합체 반응(Chelation)을 일으키는 것을 실험으로써 확인하여 장내 중금속 제거하는 효과가 있음을 밝혀내고, 시토킨(Cytokine) 유도 기능을 확인하여 인체면역성 증대 효과가 있음을 밝혀내고, 항산화 활성기능을 확인하여 항암 및 노화방지 효과가 있음을 밝혀낸다. 이를 통해, 상기 변형고추펙틴(MCP)을 유효한 성분으로 하는 식품(또는 조성물)은 장내 중금속 제거와, 인체면역성 증대, 항암 및 노화방지 효과를 가지는 기능성 식품으로서 활용이 가능함을 제시한다.In addition, the present invention confirms by the experiment that the modified high-peptide pectin (MCP) prepared by the heavy metal (heavy metal) and the effect of removing the intestinal heavy metals, cytokine (Cytokine) induction It confirms the function to increase the body's immunity effect, and confirms the antioxidant activity function to reveal the anti-cancer and anti-aging effect. Through this, the food (or composition) containing the modified high-peptide pectin (MCP) as an effective ingredient suggests that it can be used as a functional food having an intestinal heavy metal removal, human body immunity enhancement, anti-cancer and anti-aging effect.
고추, 펙틴, 변형고추펙틴, 중금속, 엔도폴리갈락투로나아제, 시토킨, 산화스트레스, 펙틴메틸에스테라아제, 발효, 기능성식품, red pepper, pectin, modified capsicum pectin, MCP, heavy metals, endopolygalacturonase, cytokines, oxidative stress, pectin methylesterase, fermentation, functional food Red pepper, pectin, modified pepper pectin, heavy metal, endopolygalacturonase, cytokine, oxidative stress, pectin methyl esterase, fermentation, functional food, red pepper, pectin, modified capsicum pectin, MCP, heavy metals, endopolygalacturonase, cytokines , oxidative stress, pectin methylesterase, fermentation, functional food
Description
본 발명은 고춧가루를 용매를 이용하여 펙틴을 추출하고, 상기 추출된 펙틴을 검정곰팡이(Aspergillus niger)로 발효시켜 생성되는 변형고추펙틴(MCP, Modified Capsicum Pectin)과, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a modified capsicum pectin (MCP, Modified Capsicum Pectin) produced by fermenting red pepper powder using a solvent and fermenting the extracted pectin with a black mold (Aspergillus niger), and a method and a use thereof. .
즉, 본 발명은 고춧가루로부터 펙틴을 함유한 추출물을 검정곰팡이(Aspergillus niger)로 발효시켜서, 고추 세포벽을 구성하고 있는 펙틴(pectin)화합물이 검정곰팡이(Aspergillus niger)로부터 분비되는 엔도폴리갈락투로나아제(endopolygalacturonase) 및 펙틴 메틸에스테라제(pectin methylesterase)에 의해 분해가 되도록 하여, 변형고추펙틴을 제조하는 방법을 제시한다.That is, the present invention fermented an extract containing pectin from red pepper powder to black mold (Aspergillus niger), so that the pectin compound constituting the pepper cell wall is secreted from black mold (Aspergillus niger). The present invention provides a method for preparing a modified pepper pectin by being degraded by endopolygalacturonase and pectin methylesterase.
또한, 본 발명은 상기 제조된 변형고추펙틴(MCP)이 중금속(heavy metal)과 복합체 반응(Chelation)을 일으키는 것을 실험으로써 확인하여 장내 중금속 제거하는 효과가 있음을 밝혀내고, 시토킨(Cytokine) 유도 기능을 확인하여 인체면역성 증대 효과가 있음을 밝혀내고, 항산화 활성기능을 확인하여 항암 및 노화방지 효과가 있음을 밝혀낸다. 이를 통해, 상기 변형고추펙틴(MCP)을 유효한 성분으로 하는 식품(또는 조성물)은 장내 중금속 제거와, 인체면역성 증대, 항암 및 노화방지 효과를 가지는 기능성 식품으로서 활용이 가능함을 제시한다.In addition, the present invention confirms by the experiment that the modified high-peptide pectin (MCP) prepared by the heavy metal (heavy metal) and the effect of removing the intestinal heavy metals, cytokine (Cytokine) induction It confirms the function to increase the body's immunity effect, and confirms the antioxidant activity function to reveal the anti-cancer and anti-aging effect. Through this, the food (or composition) containing the modified high-peptide pectin (MCP) as an effective ingredient suggests that it can be used as a functional food having an intestinal heavy metal removal, human body immunity enhancement, anti-cancer and anti-aging effect.
펙틴(Pectin)은 식물의 비전분다당류(Non-starch polysaccharide) 중의 대표적인 물질로서 지금까지 식품공업에서 젬(Jams) 또는 젤리(Jelly) 등을 만들 때 겔화제(gelling agent), 응고제(Coagulating agent), 증점제(Thickening agent), 안정제(Stabilizing agent), 고화방지제(Anti-solidification agent), 유화제(Emulsifying agent) 등으로 알려져 왔다.Pectin is a representative substance in non-starch polysaccharides of plants. So far, gelling agents and coagulating agents have been used to make gems or jelly in the food industry. , Thickening agents, stabilizing agents, anti-solidification agents, emulsifying agents and the like have been known.
그러나 최근에 효소에 의한 펙틴의 분해 과정에서 생성된 변형펙틴(Modified pectin)은 중금속 독성 제거(Detoxification of heavy metals), 콜레스테롤 조절작용(Cholesterol regulation), 선생물적 효과(Prebiotic effect) 및 항암작용(Anti-cancer action) 등 새로운 생물활성 작용(Bioactive action)이 있는 것으로 판명되었다[문헌 1, 문헌 2]. 이로써, 펙틴에 관련되는 새로운 연구가 활발히 진행되고 있다.Recently, however, modified pectin produced during the enzymatic degradation of pectin is detoxification of heavy metals, cholesterol regulation, prebiotic effect and anticancer activity. It has been found that there are new bioactive actions such as -cancer action. As a result, new research related to pectin is being actively conducted.
또한, 프랑스 및 이탈리아 등 유럽 여러 나라에서는 포도주 양조과정에서 발생되는 펙틴의 부유물을 소거하거나 중금속을 제거하기 위하여, 검정곰팡이(Aspergillus niger) 등으로부터 분비되는 펙틴 분해 효소인 엔도폴리갈락투로나아제(endopolygalacturonase) 및 펙틴메틸에스테라제(Pectin methylesterase)에 의해 기능성이 높은 람노갈락투로난(rhamnogalacturonan)을 생성하고, 이를 가공한 다음 유해한 중금속을 체외 배설하는 기능에 관련된 연구들이 많이 수행되고 있다[문헌3, 문헌4].In addition, in many European countries, such as France and Italy, endopolygalacturase, a pectin degrading enzyme secreted from black fungus (Aspergillus niger), is used to eliminate pectin suspended solids or remove heavy metals from winemaking. Many studies have been conducted on the ability to produce highly functional rhamnogalacturonan by endopolygalacturonase and Pectin methylesterase, process it, and then excrete harmful heavy metals in vitro. 3, 4].
이와 같이 특정효소에 의하여 분해되어 구조적으로 변형된 펙틴을 변형펙틴(modified pectin)이라 한다. 최근에 와서 귤껍질로부터 만든 변형 감귤류 펙틴(modified citrus pectin, MCP)은 전립선암의 전이반응 억제 또는 백혈구 활성화 작용 및 콜레스테롤(cholesterol) 강하작용 등 중요한 생리활성 기능이 판명되었다. 또한, 사과로부터 펙틴에스테라제(pectinesterase)의 정제와 성질에 관한 연구가 나왔고문헌 5], 토마토 과실이 익을 때 펙틴 다당류의 변화과정에서 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase) 활성도에 관한 연구가 있다[문헌 6]. 이 외에 지금까지 보고된 펙틴에 관련된 연구 기술로는 사탕무, 레몬 기타 과실 등으로부터 다당류 펙틴을 추출하고 정제하는 방법에 관한 것이 제시되고 있다. As such, the pectin that is degraded by the specific enzyme and structurally modified is called modified pectin. Recently, modified citrus pectin (MCP) made from tangerine peel has been found to have important bioactive functions such as inhibiting metastatic reaction of prostate cancer or activating leukocytes and lowering cholesterol. In addition, a study on the purification and properties of pectinesterase from apples has been published. [5], there is a study on the polygalacturonase activity during the change of pectin polysaccharide when tomato fruit is ripe. [Document 6]. In addition, as a research technique related to pectin reported so far, there is proposed a method for extracting and purifying polysaccharide pectin from beets, lemons and other fruits.
이 방법은, 세척된 사탕무, 사과, 오렌지, 레몬 등의 껍질에 90~95℃의 열수, 염산 및 인산을 투입하여 펙틴을 추출하고, 추출된 펙틴을 분리기에서 분리한 후 멤브레인여과기(membrane filtrate)를 통과시켜 정제하고, 농축하여 건조하고, 건조된 펙틴분말에 NaOH 수용액을 처리하고 알코올과 염산용액을 처리하여 침전물을 분리하고 95% 무수 알코올을 사용하여 수분을 제거하여 정제하는 방법을 제시하고 있다.In this method, pectin is extracted by adding hot water, hydrochloric acid and phosphoric acid at 90-95 ° C. to the washed beets, apples, oranges, lemons, and the like, and the extracted pectin is separated from the separator, followed by a membrane filter. Purification by passing through, concentrated to dryness, and dried pectin powder treated with NaOH aqueous solution, and treated with alcohol and hydrochloric acid solution to separate the precipitate and using a 95% anhydrous alcohol to remove and purify the method. .
[문헌 1] B.R. Sharma, Naresh L., N.C. Dhuldhoya, S.U. Merchant and U.C. Merchant; An Overview on Pectins. Times Food Processing Journal. June- July Issue, P. 44-51(2006)
[문헌 2] Kari Tvete Inngjerdingen., et al; Bioactive pectic polysaccharides from Glinus opposotofolius(L.) Aug. DC., a Malian medicinal plant, isolation and partial characterization. J. of Ethnopharmacology. Vol. 101, P. 204-214(2005) 2 Kari Tvete Inngjerdingen., Et al; Bioactive pectic polysaccharides from Glinus opposotofolius (L.) Aug. DC., A Malian medicinal plant, isolation and partial characterization. J. of Ethnopharmacology. Vol. 101, P. 204-214 (2005)
[문헌 3] P. Pellerin and M.A. O'Neill; The interaction of the pectic polysaccharide Rhamnogalacturonan Ⅱ with heavy metals and lanthanides in wines and fruit juices. ANALUSIS MAGAZINE, Vol.26, No.6, P.32-36(1998).[Reference 3] P. Pellerin and M.A. O'Neill; The interaction of the pectic polysaccharide Rhamnogalacturonan Ⅱ with heavy metals and lanthanides in wines and fruit juices. ANALUSIS MAGAZINE, Vol. 26, No. 6, P. 32-36 (1998).
[문헌 4] Patrice Pellerin et al.; Structural characterization of red wine rhamnogalacturonan Ⅱ. Carbohydrate Research. Vol. 290, P. 183-197(1996) Patrice Pellerin et al .; Structural characterization of red wine rhamnogalacturonan Ⅱ. Carbohydrate Research. Vol. 290, P. 183-197 (1996)
[문헌 5] Helen M. Macdonald and Roger Evens; Purification and Properties of Apple Pectinesterase., J. Sci. Food Agric. Vol. 70, P. 321-326(1996)
[문헌 6] Taeko INARI et al.; Changes in Pectic Polysaccharide during the Ripening of Cherry Tomato Fruits., Food Sci Technol. Res. Vol. 8, P. 55-58(2002)[6] Taeko INARI et al .; Changes in Pectic Polysaccharide during the Ripening of Cherry Tomato Fruits., Food Sci Technol. Res. Vol. 8, P. 55-58 (2002)
상기와 같은 펙틴의 활용성이 아직 고추에는 적용된 바가 없기 때문에, 본 발명의 목적은 고춧가루로부터 펙틴을 추출하고, 상기 추출된 펙틴을 발효공법을 적용시켜 생성되는 변형고추펙틴(MCP, Modified Capsicum Pectin) 물질 자체와, 그 제조방법 및 용도를 제공하는 것이다.Since the utility of the pectin as described above has not been applied to pepper yet, an object of the present invention is to extract the pectin from the red pepper powder, modified pectin pectin (MCP, Modified Capsicum Pectin) produced by applying the fermentation method It is to provide the substance itself and its manufacturing method and use.
또한, 고춧가루로부터 펙틴을 추출하는 방법을 용매별로 제시하고 그 성능차이를 비교하여 보다 효과적인 추출방법을 제공하는 것이다.In addition, by presenting a method for extracting the pectin from the red pepper powder by solvent and to compare the performance difference to provide a more effective extraction method.
또한, 상기 발효공법을 적용함에 있어서도, 보다 효과적인 변형방법을 제시하고, 다른 변형방법과 비교하여 본 발명의 방법이 보다 우수함을 증명하고, 상기 변형고추펙틴(MCP)의 화학적 기능을 해명하여 그 용도를 밝혀내고, 기능성 식품으로서 활용될 때의 효과들을 제공하는 것이다.In addition, in the application of the fermentation method, a more effective modification method is presented, and the method of the present invention is proved to be superior to other modification methods, and the chemical function of the modified Gopectin pectin (MCP) is elucidated for its use. It is to provide the effects when used as a functional food.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 고춧가루를 용매를 이용하여 펙틴을 추출하는 단계와, 상기 추출된 펙틴을 검정곰팡이(Aspergillus niger)와 함께 발효시켜 변형고추펙틴을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형고추펙틴과, 그 제조방법 및 용도이다. 특히, 펙틴을 추출하는 방법은 고춧가루로부터 물, 옥살산암모늄, 염산으로 연속 추출하고, 변형고추펙틴을 생성하는 방법은 검정곰팡이(Aspergillus niger)로 발효시킴으로써, 검정곰팡이가 분비하는 엔도폴리갈락투로나아제(endopolygalacturonase) 및 펙틴 메틸에스테라제(pectin methylesterase)에 의해 분해되는 방법을 적용한다.The present invention for achieving the above object comprises the step of extracting the pectin using a red pepper powder and the fermentation of the extracted pectin with a black mold (Aspergillus niger) characterized in that it comprises a step of producing a modified pepper pectin Modified pepper pectin, and a preparation method and use thereof. In particular, the method of extracting pectin is extracted continuously from red pepper powder with water, ammonium oxalate, hydrochloric acid, and the method of producing modified pepper pectin is fermented with black mold (Aspergillus niger), which is produced by endopolygalacturona The method of degradation by endopolygalacturonase and pectin methylesterase is applied.
또한, 본 발명은 상기 변형고추펙틴의 화학적 기능인 메탈 복합제 반응과, 시토킨(Cytokine) 유도 기능, 항산화 활성기능을 실험으로서 규명하고, 이와 더불어, 변형고추펙틴을 첨가한 식품을 실험동물에 급식하는 실험을 통해, 장내 중금속 제거와, 인체면역성 증대, 항암 및 노화 방지에 유용한 용도가 있음을 실증한다.In addition, the present invention as a test to identify the metal complex reaction, the cytokine (Cytokine) induction function, and the antioxidant activity function of the chemical function of the modified Gopectin, and, in addition, to feed the experimental animal foods added with modified Gopectin Experiments demonstrate that it is useful for the removal of heavy metals in the intestine, increased human immunity, anticancer and anti-aging.
본 발명은 인체에 유용한 펙틴을 고추에 적용하여, 고춧가루로부터 펙틴을 추출하고, 상기 추출된 펙틴을 발효공법을 적용시켜 생성되는 변형고추펙틴(Modified Capsicum Pectin ; MCP) 물질 자체와, 그 제조방법 및 용도를 제시하고 있다.The present invention is a modified Capsicum Pectin (MCP) material itself produced by applying a pectin useful to the human body to red pepper, extracting the pectin from red pepper powder, and applying the extracted pectin fermentation method, and a method for producing the same Its use is suggested.
또한, 고춧가루로부터 펙틴을 추출하는 방법을 물, 옥살산암모늄, 염산으로 용매별로 추출하는 방법을 제시하고 그 성능차이를 비교하여 보다 효과적인 추출방법을 제시하고 있다.In addition, a method of extracting pectin from red pepper powder is proposed as a method of extracting each solvent with water, ammonium oxalate, and hydrochloric acid, and a more effective extraction method is proposed by comparing the performance difference.
또한, 본 발명의 발효공법에 의해 변형한 변형고추펙틴이 산 또는 알칼리 가수분해에 의하여 만든 변형고추펙틴보다 여러 가지 측면에서 우수함을 증명하였다.In addition, it was proved that the modified high-peptide modified by the fermentation method of the present invention is superior in many respects to the modified high-peptide made by acid or alkali hydrolysis.
또한, 상기 변형고추펙틴(MCP)은 Cu(Ⅱ), Pb(Ⅱ), Cd(Ⅱ) 등 중금속 이온과 킬레이트화 경향을 가지고 있어 중금속 제거 기능의 용도가 있음을 밝히고 있고, 변형고추펙틴의 항산화 활성 및 면역 증강 기능을 실험으로 검증하여 항암 및 노화 방지효과의 용도도 제시하고 있다.In addition, the modified pepper pectin (MCP) has a tendency to chelate with heavy metal ions, such as Cu (II), Pb (II), Cd (II), reveals the use of heavy metal removal function, antioxidant of modified pepper pectin It has also demonstrated the use of anti-cancer and anti-aging effects by experimentally verifying its activity and immune enhancing function.
변형고추펙틴을 첨가한 식품을 실험동물에 급식하는 실험을 통해, 장내 중금속 제거와, 인체면역성 증대, 노화 방지에 유용한 용도가 있음을 실증했다.Through experiments to feed foods with modified pepper pectin to experimental animals, it proved to be useful for removing intestinal heavy metals, enhancing human immunity, and preventing aging.
본 발명은 고춧가루를 용매를 이용하여 펙틴을 추출하는 단계와, 상기 추출된 펙틴을 검정곰팡이(Aspergillus niger)와 함께 발효시켜 변형고추펙틴을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형고추펙틴, 그 제조방법 및 용도이다.The present invention is a modified pepper pectin, characterized in that it comprises the step of extracting the pectin using a solvent of red pepper powder, and fermenting the extracted pectin with a black mold (Aspergillus niger) to produce a modified pepper pectin, It is a manufacturing method and a use.
본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.The above and other objects and novel features of the present invention will become more apparent from the description and the accompanying drawings.
이하 본 발명의 도면에 따라 설명한다.It will be described below according to the drawings of the present invention.
본 발명인 변형고추펙틴의 제조방법은 (a) 고춧가루를 용매를 이용하여 펙틴을 추출하는 단계와, (b) 상기 추출된 펙틴을 검정곰팡이(Aspergillus niger)로 발효시켜 변형고추펙틴을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.Method for producing modified pepper pectin of the present invention comprises the steps of (a) extracting the pectin using a red pepper powder and (b) fermenting the extracted pectin with black mold (Aspergillus niger) to produce a modified pepper pectin It is characterized by including.
상기 (a) 단계에서 펙틴을 추출하기 위해 사용한 용매는 물(또는 탈이온수)과, 옥살산암모늄(ammonium Oxalate), 염산(HCl)을 이용하였다. 즉, 고춧가루를 80% 에탄올(ethanol)로 1차 추출하여 지용성 물질(capsaicin 등)을 회수하고 남은 알콜불용물(AIS)로부터 1차적으로 펙틴(pectin)을 물로 추출하고, 남은 박으로부터 2차적으로 옥살산암모늄(ammonium oxalate)을 용매로 하여 펙틴(pectin)을 추출한 후 남은 박으로부터 3차적으로 희박한 염산으로 펙틴(pectin)을 추출한다. 물로 추출한 펙틴을 수용성펙틴(WSP, Water Soluble Pectin)이라 하고, 옥살산암모늄(ammonium Oxalate)로 추출한 펙틴을 수산염용해성펙틴(OSP, Oxalate Soluble Pectin)이라 하고, 염산(HCl)으로 추출한 펙틴(pectin)을 산성펙틴(ASP, Acid Soluble Pectin)이라 한다.The solvent used to extract the pectin in step (a) was water (or deionized water), ammonium oxalate, and hydrochloric acid (HCl). That is, red pepper powder is first extracted with 80% ethanol to recover fat-soluble substances (capsaicin, etc.), and pectin is extracted with water from the remaining alcohol insolubles (AIS). Pectin is extracted using ammonium oxalate as a solvent, and then pectin is extracted from the remaining gourd with dilute hydrochloric acid. Pectin extracted with water is called water soluble pectin (WSP), pectin extracted with ammonium oxalate (ammonium oxalate) is called oxalate soluble pectin (OSP), and pectin extracted with hydrochloric acid (HCl) It is called Acid Pectin (ASP).
이와 관련하여, 상기 3가지 용매에 대하여 펙틴의 추출에 대한 수월성을 비교하기 위하여, 용매별 추출되는 펙틴에 대한 수율 및 성분분석을 실험하였다. 그 결과, 고추펙틴을 물, 옥살산암모늄(ammonium Oxalate) 및 희염산(HCl)으로 추출한 총합적인 수율은 18.2%로서 고추원료에 함유되어 있는 전체 섬유소 함량 약 20%에 대한 회수율은 약 91%로서 대체적으로 만족스러운 값이라 평가된다. 용매별 추출물에서 수율은 물 추출물이 높은 것에 반하여 갈락투론산 함량은 옥살산암모늄 추출물이 가장 높았고 다음은 염산 추출물이 높았다. 그러나 옥살산암모늄에 의한 추출은 화공약품을 구입하는 데 필요한 비용과 건강기능식품을 제조하는 차원에서는 위생문제와 경제적인 사정이 산업화에 걸림돌이 된다는 단점이 있기 때문에, 산업화를 위해서는 물 추출법이 경제성이 높은 것으로 판단된다.In this regard, in order to compare the ease of extraction of pectin with respect to the three solvents, the yield and component analysis for the extracted pectin for each solvent was tested. As a result, the total yield of pepper pectin extracted with water, ammonium oxalate and dilute hydrochloric acid (HCl) was 18.2%, and the recovery rate for the total fiber content of about 20% contained in red pepper was about 91%. It is evaluated as a satisfactory value. The yield of solvent extracts was high in water extract, whereas the content of galacturonic acid in ammonium oxalate was the highest, followed by hydrochloric acid. However, the extraction by ammonium oxalate has the disadvantage that the hygiene problem and the economic situation are obstacles to the industrialization in terms of the cost of purchasing chemicals and the manufacture of health functional foods. It seems to be.
따라서 상기 (a) 단계에 대한 또 다른 실시예는 다음과 같다.Therefore, another embodiment of the step (a) is as follows.
상기 (a)단계는 (a5) 상기 고춧가루를 80% 에탄올로 추출하여 지용성물질을 회수하고 남은 침전물을 알콜불용물(AIS)로 추출하는 단계와, (a6) 상기 알콜불용물(AIS)을 물에 넣어, 잔여물을 제외한 상등액을 에탄올 침전법으로 수용성펙틴(WSP)을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.The step (a) is (a5) extracting the red pepper powder with 80% ethanol to recover the fat-soluble material and extracting the remaining precipitate with alcohol insolubles (AIS), (a6) the alcohol insolubles (AIS) water In the supernatant except the residue, characterized in that it comprises the step of preparing a water-soluble pectin (WSP) by ethanol precipitation.
상기 물 추출법은 경제성이 높은 실시예로서, 산업화에 적합한 실시예라 하겠다.The water extraction method is a high economical embodiment, it will be said to be an embodiment suitable for industrialization.
상기 (b)단계는 (b1) PDA배지에 검정곰팡이(Aspergillus niger)를 접종하여 3일간 25℃에서 배양한 다음 검정곰팡이 종균을 만드는 단계와, (b2) PDA배지에 고 추 펙틴을 적정 농도로 가하고 여기에 검정곰팡이 종균을 접균한 배양액을 조제하여 25℃에서 진탕법으로 4일간 배양하여 변형펙틴 분말을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.The step (b) is (b1) inoculating black mold (Aspergillus niger) in PDA medium and incubated at 25 ℃ for 3 days to make a black mold spawn, and (b2) PDA pectin to the appropriate concentration of pepper pectin It is characterized in that it comprises the step of preparing a culture medium in which the black mold spawn inoculated and incubated for 4 days by shaking method at 25 ℃ to obtain a modified pectin powder.
즉, 추출된 펙틴을 변형하여 변형고추펙틴(MCP)을 제조하기 위하여, 먼저 검정곰팡이 종균을 배양하고, 배양된 종균을 이용하여 상기 펙틴을 변형하는 본 배양을 한다. 구체적으로, 검정곰팡이(Aspergillus niger)KCTC 3278 앰플로부터 균을 액체배지에 녹여 25℃에서 2일간 배양하여 균을 재생시키고, PDP 배지에 상기 재생시킨 검정곰팡이를 25℃에서 3일간 진탕배양하고, PDA배지에 본 배양을 시킨다. In other words, in order to produce modified Pectin (MCP) by modifying the extracted pectin, first, the black mold spawn is cultured, and the main culture is modified using the cultured spawn. Specifically, the fungus (Aspergillus niger) KCTC 3278 ampoules were dissolved in a liquid medium and incubated for 2 days at 25 ° C. to regenerate the bacteria, and the cultured black mold was shaken at 25 ° C. for 3 days, and PDA Main culture is carried out in the medium.
펙틴(Pectin)은 고등식물의 세포벽 성분으로 또는 세포간극에 존재하는 음이온 다당체(anionic poly-saccharide)의 일종으로 갈락투론산(GA)의 α-1,4 결합으로 긴 사슬을 하고 있으며 여러 가지 단당류로 된 곁사슬(side chain)이 붙어있는 복잡한 화합물로 되어있다. 상기 펙틴을 탄소원으로 하여 검정곰팡이(Aspergillus niger)를 발효시키면, 검정곰팡이는 펙틴을 분해하기 위하여 엔도폴리갈락투로나아제(endopolygalacturonase)와 펙틴메틸에스테라제(pectin methylesterase)를 분비한다. 엔도폴리갈락투로나아제는 펙틴의 α-1,4-글리코시드(glycoside) 결합을 분해하여 저분자 펙틴을 만들고, 펙틴메틸에스테라제는 펙틴의 메틸에스테르(methylester) 결합을 분해하여 펙틴산(pectic acid) 구조를 만든다. 즉, 펙틴은 구조적으로 복잡한 성분으로 구성되어 있으며 분자량이 약 25만 이상의 거대분자이다. 이러한 거대분자인 펙틴을 절단하여 저분자펙틴으로 분해과정, 또한 펙틴의 주 성분인 갈락투론산의 카르복실 그룹에 결합되어 있는 메틸에스터를 가수분해하여 탈메틸화하는 과정을 펙틴변형이라 한다.Pectin is a cell wall component of higher plants or is an anionic poly-saccharide present in the cell gap and has long chains with α-1,4 bonds of galacturonic acid (GA). It is a complex compound with a side chain attached to it. Fermentation of the black mold (Aspergillus niger) using the pectin as a carbon source, the black mold secretes endopolygalacturonase and pectin methylesterase to degrade the pectin. Endopolygalacturonasase decomposes α-1,4-glycoside bonds of pectin to make low molecular pectin, and pectin methyl esterase decomposes the methylester bond of pectin pectic acid) structure. In other words, pectin is composed of structurally complex components and molecular weight of about 250,000 or more. The process of cleaving such macromolecule pectin and decomposing it into low molecular pectin, and hydrolyzing and demethylating methyl ester bound to the carboxyl group of galacturonic acid, the main component of pectin, is called pectin modification.
검정곰팡이를 배양하여 배양시간에 따라 펙틴이 변형되는 정도를 알아내기 위하여, 배양액의 총산(Total acid)에 대한 변화와, 변형시킨 반응용액 중의 메탄올 함량변화, 분자량 250kDa 범위의 펙틴을 30～50kDa의 저분자 펙틴으로 변형시키는 폴리갈락투로나아제의 활성도 변화를 실험하였다(실험 3-1).In order to determine the degree of pectin transformation according to the culture time by culturing the black mold, the change in the total acid of the culture medium, the methanol content in the modified reaction solution, the pectin in the molecular weight range of 250 kDa and 30 to 50 kDa The change in activity of polygalacturonase transformed into low molecular pectin was tested (Experiment 3-1).
총산은 시간이 경과되면서 점차적으로 함량이 증가되는데, 이는 펙틴을 포함한 배지중의 탄수화물 및 단백질 등이 산화 분해되어 유기산을 생산하기 때문이라 해석된다. 즉, 총산은 탈메틸화 과정에서 아세틸(acetyl)기 결합에서 떨어져 나오는 아세트산(acetic acid) 함량변화(발효과정에서 아미노산, 당류 등의 발효 생성물이 있음을 고려하여 측정하여야 한다)를 관찰함으로써, 검정곰팡이를 배양하여 배양시간에 따라 펙틴이 변형되는 정도를 알 수 있다.The total acid content gradually increases over time because the carbohydrates and proteins in the medium containing pectin are oxidatively decomposed to produce organic acids. In other words, the total acid must be determined by observing changes in the amount of acetic acid released from the acetyl group bond during demethylation (measured by considering the presence of fermentation products such as amino acids and sugars in the fermentation tablets). By culturing it can be seen the degree of modification of the pectin according to the incubation time.
메탄올은 펙틴의 메틸에스테르(methylester) 결합이 분해되면서 발생되는 것으로서, 검정곰팡이 배양과정 중 4일에서 반응초기에 비해 약 5배 정도 높았으며, 산 및 알칼리로 처리한 경우보다 효소 처리구가 높았다. 폴리갈락투로나아제의 할성도를 측정한 결과, 배양 72시간 및 96시간 구에서는 활성도가 떨어져 배양시간이 장시간일수록 효소활성도가 소멸되는 것을 확인할 수 있었다.Methanol is generated by decomposing the methyl ester bond of pectin, which was about 5 times higher than the initial reaction in 4 days of the black mold cultivation process, and higher than the acid and alkali treatment. As a result of measuring the activity of polygalacturonase, it was confirmed that the activity was decreased in 72 hours and 96 hours of culture, and the enzyme activity disappeared as the culture time was longer.
저분자로 가수분해하여 변형펙틴을 만드는 목적은 기능성식품을 개발했을 때 먹어서 흡수(또는 체내 중금속 제거)되게 하기 위함이다. 탈메틸은 중금속과 킬레이트 반응(chelate)이 용이하게 일어나도록 한다. 또한, 이와 같은 변형펙틴이 면 역 증강 작용 또는 항산화 작용을 갖는다면 우수한 기능성 식품이 된다.The purpose of making modified pectin by hydrolysis with low molecules is to eat and absorb (or remove heavy metals from the body) when functional foods are developed. Demethylation facilitates chelates with heavy metals. In addition, such modified pectin is an excellent functional food if it has an immune enhancing or antioxidant action.
또한, 상기 검정곰팡이(Aspergillus niger)로 발효시켜 변형고추펙틴을 제조하는 방법을 산과 알칼리에 의한 펙틴의 변형방법과 비교하는 실험을 하였다(실험 3-2). 펙틴을 변형시키는 방법은 효소에 의하는 방법이외에도 알칼리나 산을 이용한 가수분해를 통해 펙틴을 분해하는 방법이 있다. 즉, 고추펙틴 시료를 0.1M 염산에 녹여 가수분해를 시키고 원심분리 하여 상등 액을 취하여 수산화나트륨(NaOH)으로 중화하고 에탄올 침전법으로 변형고추펙틴을 얻었다. 이를 산에 의한 변형고추펙틴(AMCP, Acidic Modified Capsicum Pectin)이라 명명하였다. 그리고 고추펙틴을 0.1M 수산화나트륨(NaOH)에 녹여 탈메틸화(Demethylation)를 시키고 염산으로 산성도(pH 5.2)를 조절하여 에탄올침전법으로 변형고추펙틴을 얻었다. 이를 알칼리에 의한 변형고추펙틴(ALMCP, Alkaline Modified Capsicum pectin)이라 명명하였다.In addition, the experiment to compare the method of producing a modified pepper pectin by fermentation with the black mold (Aspergillus niger) and the method of modifying the pectin by acid and alkali (Experiment 3-2). In addition to the enzyme-based method of modifying pectin, there is a method of decomposing pectin through hydrolysis using alkali or acid. That is, red pepper pectin sample was dissolved in 0.1 M hydrochloric acid, hydrolyzed and centrifuged to obtain a supernatant, neutralized with sodium hydroxide (NaOH), and a modified pepper pectin was obtained by ethanol precipitation. This is called acid-modified cappectin (AMCP, Acidic Modified Capsicum Pectin). And pepper pectin was dissolved in 0.1M sodium hydroxide (NaOH) to demethylation (Demethylation) and acidic acid (pH 5.2) with hydrochloric acid to obtain modified pepper pectin by ethanol precipitation. This is called Alkaline Modified Capsicum pectin (ALMCP).
그 결과를 비교하면 다음 표 1과 같다.Comparing the results are shown in Table 1 below.
< 표 1 > 효소, 산, 알칼리에 의한 변형고추펙틴의 수율 및 갈락투론산 함량 비교<Table 1> Yield and galacturonic acid content of modified pepper pectin by enzyme, acid and alkali
위의 표에서 보는 바와 같이 효소변형 펙틴의 수율은 18.64%로서 산 변형펙틴 0.75% 및 알칼리 변형펙틴 0.87%에 비해 높은 수율을 얻을 수 있다. 변형펙틴 분말 중의 갈락투론산 함량은 효소 변형펙틴의 65% 에탄올 침전물에서 59.25%, 85% 에탄올 침전물에서 27.27%로서 합계 86.52%의 높은 함량을 나타내었다. 그러나 산 변형펙틴에서는 수율이 낮았으며 불용성 및 수용성 펙틴의 합계가 1%에 미치지 못하였으며, 갈락투론산 함량도 불용성펙틴에서 21,6%, 수용성 펙틴에서 9.81%로서 합계 30.2%에 불과하였다. 알칼리 변형펙틴에서도 수율의 총합은 0.87%에 불과하며 갈락투론산의 함량 역시 35.02%로서 효소변형펙틴에 비해 수율과 갈락투론산 함량이 모두 낮았다.As shown in the above table, the yield of enzyme modified pectin is 18.64%, which is higher than that of acid modified pectin 0.75% and alkaline modified pectin 0.87%. The galacturonic acid content in the modified pectin powder was 59.25% in the 65% ethanol precipitate of the enzyme modified pectin and 27.27% in the 85% ethanol precipitate, indicating a high content of 86.52%. However, the yield of acid-modified pectin was low, and the total amount of insoluble and water-soluble pectin was less than 1%, and the content of galacturonic acid was 21,6% in insoluble pectin and 9.81% in water-soluble pectin, totaling 30.2%. In alkaline modified pectin, the total yield was only 0.87%, and the content of galacturonic acid was 35.02%, which was lower in both yield and galacturonic acid than enzyme modified pectin.
또한, 용매별 추출된 펙틴의 분자량 분포와, 변형고추펙틴의 분자량 분포, 산과 알칼리에 의한 가수분해로 변형된 변형펙틴의 분자량 분포를 구하는 실험을 실시하였다.(실험3-3) 본 발명에서 조제한 고추 펙틴을 1% 범위로 증류수에 용해시켜 투석한 후 바이바플로우50 막(Vivaflow50 membrane)으로 펙틴의 분자량별로 분획하여 다음과 같은 결과를 얻었다.In addition, an experiment was performed to determine the molecular weight distribution of the extracted pectin, the molecular weight distribution of the modified pepper pectin, and the molecular weight distribution of the modified pectin modified by hydrolysis with acid and alkali. (Experiment 3-3) Pepper pectin was dissolved in distilled water in 1% range and dialyzed, and fractionated by molecular weight of pectin by Vivaflow50 membrane to obtain the following results.
< 표 2 >고추펙틴 및 변형고추펙틴의 분자량별 함량 분포 비율<Table 2> Content distribution ratio of molecular weight of pepper pectin and modified pepper pectin
그 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 용매별 추출 펙틴은 100kDa을 넘는 분자량이 물 추출에서 얻은 펙틴이 89%에 이르고 변형고추펙틴에서 산 변형고추펙틴(AMCP)과 알칼리변형고추펙틴(ALMCP)의 분자량 분포는 100kDa을 넘는 분자량이 77% 범위인데 반하여 효소로 처리한 효소변형고추펙틴(EMCP)에서는 100kDa을 넘는 분자량은 65% 에탄올 침전물이 24.6%이었고, 85% 에탄올 침전물은 36.7%로서 도합 61.3%로서 물 추출펙틴에 비해 약 28% 분량이 가수분해 된 것으로 간주된다. As a result, as shown in Table 2, the solvent-extracted pectin has a molecular weight of more than 100 kDa, reaching 89% of the pectin obtained from water extraction, and the molecular weight of acid-modified high-peptide (AMCP) and alkali-modified high-peptide (ALMCP) The distribution ranged from 77% of the molecular weight over 100 kDa, whereas the enzyme-modified Gopectin (EMCP) treated with enzyme showed 65% ethanol precipitates of 24.6%, 85% ethanol precipitates of 36.7%, total 61.3%. About 28% of the water is considered hydrolyzed relative to the pectin extracted.
산 변형고추펙틴의 분자량은 100kDa 이상이 77.0%, 그리고 알칼리 변형고추펙틴의 100kDa이상 분자량 분포인 76.5%에 비하면 효소변형고추펙틴은 평균 16% 분량의 펙틴이 가수분해 되어 저분자를 생성한 것으로 나타났다. 따라서 효소로 변형시킨 것은 산 및 알칼리변형펙틴에 비해 매우 효과적인 제조방법이라는 것을 확인 할 수 있다. The molecular weight of the acid modified Gopectin was 77.0% over 100kDa and 76.5% of the molecular weight distribution over 100kDa of Alkali modified Gopectin. Therefore, it can be confirmed that the modification with enzyme is a very effective production method compared to acid and alkali modified pectin.
다음으로는, 앞서 살펴본 제조방법에 의하여 생성되는 변형고추펙틴의 용도를 밝혀내기 위한 실험을 수행하였다.Next, an experiment was performed to find out the use of the modified pepper pectin produced by the above-described manufacturing method.
먼저, 변형고추펙틴(MCP)과 중금속(Heavy Metal)과의 킬레이트화(Chelation) 반응에 대한 실험을 실시하여, 고추펙틴이 체내 중금속 제거능력에 대한 활성 가능성을 확인하는 기초 자료를 얻었다. 킬레이트화 반응 실험은 표준펙틴과 산과 알칼리, 효소에 의한 3개 종류 변형고추펙틴을 시료로 하였고, 구리이온(Cu ion)과의 킬레이트화 경향과 저분자 변형고추펙틴과 구리이온과의 킬레이트화 경향을 실험하였다.First, experiments were conducted on the chelation reaction between modified pepper pectin (MCP) and heavy metal to obtain basic data confirming the possibility of pepper pectin activity in the body's heavy metal removal ability. In the chelation reaction experiment, three kinds of modified pectin pectin by standard pectin, acid, alkali and enzyme were sampled, and the tendency of chelation between Cu ions and low molecular weight modified pectin pectin and copper ion was tested. Experiment.
그 결과, 변형고추펙틴(MCP)이 대조구(또는 표준펙틴구)보다 킬레이트화 경향이 더 높았으며, 특히 알칼리 변형고추펙틴(AMCP)에서는 100%에 가까운 결합을 형성하였다. 변형고추펙틴(MCP)을 몇 가지 범위의 분자량으로 분획한 저분자 변형고추펙틴(Low molecular MCP)과 0.001M 구리 이온(Cu ion)과의 반응에서는 분자량 100kDa에서는 97%범위이었고 50-100kDa 범위에서는 94%, 30-50kDa 범위에서는 89%, 10-30kDa 범위에서는 86%, 10kDa 이하에서는 86% 범위로서 분자량이 낮을수록 흡착율이 다소 감소하였다. 그러나 변형고추펙틴의 분자량이 낮은 조건에서 생체 내에 흡수가 가능하다면 기능성은 매우 탁월한 것으로 평가할 수 있다.As a result, modified Gopectin (MCP) had a higher tendency to chelate than the control (or standard Pectin), especially in the case of alkali modified Gopectin (AMCP), formed a binding close to 100%. In the reaction of low molecular weight modified MCP with low molecular weight MCP with 0.001M Cu ion, it was 97% in molecular weight 100kDa and 94 in 50-100kDa. %, 89% in the 30-50kDa range, 86% in the 10-30kDa range, 86% in the 10kDa or less range, the lower the molecular weight, the adsorption rate slightly decreased. However, it can be evaluated that the functionality is very excellent if it can be absorbed in vivo under low molecular weight of modified Gopectin.
또한, 고추 펙틴을 주성분으로 하는 5가지 추출물을 조제하여 면역증진 기능을 확인하는 2가지의 실험을 하였다. In addition, two experiments were performed in which five extracts containing pepper pectin as a main component were prepared to confirm the immune enhancing function.
하나는 시토킨(Cytokine) 유도기능을 지표로 하는 면역 증진기능을 확인하기 위해 고추 추출물 5종을 섭식한 Balb/c 실험쥐(mouse)에 LPS를 투입하여 추출물의 항염증 억제 효과 및 과산화지질 발생 억제를 확인하는 실험이고(실험 5-1), 인터페론(Interferon), IL-2, IL-12 분비촉진 기능을 탐색하기 위하여, Raw264.7 Cell을 이용하여 6종의 시료 추출 제조물을 첨가한 후 LPS를 처리했을 때 NO, TNF-α, Interferon-γ 생성량을 측정하는 실험을 하였다(실험 5-2).One was to inject LPS into Balb / c mice fed five pepper extracts to identify immune-promoting function as an indicator of cytokine-induced function. In order to investigate the inhibition (Experiment 5-1), and to explore the interferon, IL-2, IL-12 secretion promoting function, after the addition of six sample preparations using Raw264.7 Cell When LPS was treated, experiments were conducted to measure NO, TNF-α, and Interferon-γ production (Experiment 5-2).
상기 동물실험에 사용된 시료는 다음 표와 같다.Samples used in the animal experiment are shown in the following table.
< 표 3 >동물 실험에 사용된 고추추출물시료<Table 3> Red Pepper Extract Samples Used in Animal Experiments
5주령의 SD 수컷 rat를 구입하여 1주간 적응 시킨 후 군당 6마리로 배치우 4주간 2.0% 농도로 실험1에서 우수한 효과를 나타낸 추출물(5)을 4주간 투여하였다. 투여 후 혈청 및 간장에서 과산화지질량을 형광법으로 측정하였다. Five-week-old male SD rats were purchased for 1 week, and 6 rats per group were administered with extract (5), which showed excellent effect in
간장에서의 과산화지질 농도는 LⅣ 및 LⅤ 시료에서 현저하게 낮았다. 이러한 결과는 간장중 SOD 효소활성과 어느 정도에서 일치하는 결과를 보이고 있다. 따라서 고추가공물이 순수한 고추펙틴이거나 저분자 고추펙틴인 경우에 항산화효과가 높은 것으로 평가된다.Lipid peroxide concentrations in the liver were significantly lower in the LIV and LV samples. These results are in agreement with the SOD enzyme activity in the liver to some extent. Therefore, it is evaluated that the antioxidant effect is high when the red pepper product is pure red pepper pectin or low molecular red pepper pectin.
이상과 같이, 고추 시료로부터 추출하여 제조한 펙틴(pectin)을 효소, 산 및 알칼리 처리하여 가공한 변형고추펙틴(MCP)에 대한 변형 방법 및 이화학적 특성과 중금속 제거를 위한 변형고추펙-중금속(MCP-Heavy metal) 복합체 결합 활성도 등을 검정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.As described above, the modified method for modified Gopectin (MCP) processed by processing pectin prepared by extracting pepper samples from enzymes, acids and alkalis, and the modified high-peptide-heavy metals for removing physicochemical properties and heavy metals ( MCP-Heavy metal) complex binding activity was assayed and the following conclusions were obtained.
고추 펙틴(pectin)물질의 추출은 물을 용매로 사용했을 때 수율 면에서 가장 좋았고, 효소, 산 및 알칼리로 변형(modified) 시켰을 때 구리 이온(Cu ion)과의 킬레이트(chelation)효과는 3가지 방법이 대등하게 높았으며 그 중 알칼리 처리구가 특이하게 높은 편이었다. 이와 같은 결과는 펙틴(pectin)에 결합되어 있는 메틸에스테르(methyl ester) 가수분해 경향이 알칼리 처리가 수월하기 때문이라 사료된다.The extraction of pepper pectin was the best in terms of yield when water was used as a solvent, and the chelation effect with Cu ions when modified with enzymes, acids and alkalis The method was comparably high, of which the alkali treatments were unusually high. This result is considered to be because the tendency of methyl ester hydrolysis to pectin is easy to alkali treatment.
또한, 효소로 변형시킨 고추변형펙틴은 산 및 알칼리변형펙틴에 비해 매우 효과적인 제조방법이라는 것을 확인하였다.In addition, it was confirmed that the pepper modified pectin modified with enzyme is a very effective method of preparation compared to acid and alkali modified pectin.
또한, 구리 이온(Cu ion)과의 반응에서는 분자량이 낮을수록 흡착율이 다소 감소하였으나 변형고추펙틴의 분자량이 낮은 조건에서 생체 내에 흡수가 가능하다면 그 기능성은 매우 탁월한 것으로 평가할 수 있고, 고추가공물이 순수한 고추펙틴이거나 저분자 고추펙틴인 경우에 항산화효과가 높은 것으로 나타나, 효소에 의한 변형고추펙틴은 항산화효과에서도 높은 효과가 있는 것으로 평가된다.In addition, in the reaction with Cu ions, the lower the molecular weight, the adsorption rate slightly decreased, but if the modified gochuectin was able to be absorbed in vivo under the low molecular weight condition, its functionality could be evaluated as being very excellent. When pepper pectin or low-molecular pepper pectin appears to have a high antioxidant effect, enzyme-modified high-peptide pectin is evaluated to have a high effect in the antioxidant effect.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 본 발명은 이하 실시예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is a matter of course that the present invention is not limited to the following examples and can be variously modified without departing from the gist thereof.
< 실시예 1 > 공통시료의 추출조제Example 1 Extraction Preparation of Common Sample
공통시료는 본 발명의 제조방법에 의해 만들어진 고추펙틴 또는 변형고추펙틴의 성분 및 성능에 대한 중금속 결합력, 면역증강 작용 그리고 항산화 활성 등의 비교 실험에 사용하기 위해 5가지 시료를 조제하였다. 그 중 시료 4 및 시료 5는 고추 펙틴이 중금속과의 착화합물 형성반응에 사용하였고, 시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 4 및 시료 5는 동물을 이용한 생리실험에 사용하였으며, 항산화 실험을 위해 시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 5를 사용함으로서 몇 가지 기능성에 대한 공통성을 찾는데 목적이 있다. 다만 고추 펙틴 추출단계에서 3가지 용매를 사용한 목적은 22% 범위로 존재하는 고추 섬유소 가운데 펙틴의 용매별 용해성과 용매별 최대 수율을 알아보기 위해 연속적으로 추출 최적 용매를 찾는데 의미를 둔다. 여기에서 온도, 시간, 펙틴 분리 용매 및 방법, 용매의 농도 등을 밝힐 필요가 있다. Common samples prepared five samples for use in comparative experiments, such as heavy metal binding capacity, immuno-enhancing action and antioxidant activity on the components and performance of pepper pectin or modified pepper pectin produced by the production method of the present invention.
즉, 상기 공통시료는 고추 펙틴의 총 수율 및 추출의 수월성 고찰, 즉 수율이 높고 경제적인 용매를 찾는데 있으며, 3가지 용매 중 물 추출물에서 얻어지는 참 수율을 알아보는데도 이용된다.That is, the common sample is used to find the total yield of the pepper pectin and the easiness of extraction, that is, to find a high yield and economic solvent, and also to find out the true yield obtained from the water extract of the three solvents.
도 1은 고춧가루로부터 캅사이신(Capsaicin)분리 및 알코올불용물(AIS)로부터 5종의 펙틴(Pectin)시료 추출 공정도이다. 도 1에서 보는 바와 같이, 고춧가루를 80% 에탄올(EtOH)에 넣어 5시간 느린 휘젓기(Slowly stirring)로 95～100℃에서 가열 추출하고 여과시켜, 잔여물을 제외한 상등 액을 증류와 원심분리 하여 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 분획하고 이 추출물을 증류하고 감압하여 동결건조(Lyophilize)시켜 캅사이신(Capsaicin)을 분리한다. 상기 추출된 캅사이신을 [시료-1] 로 한다.1 is a process diagram of capsaicin separation from red pepper powder and five pectin sample extraction from alcohol insolubles (AIS). As shown in FIG. 1, red pepper powder was added to 80% ethanol (EtOH) and extracted by heating and stirring at 95-100 ° C. with slow stirring for 5 hours, and the supernatant except the residue was distilled and centrifuged. After fractionation with ethyl acetate, the extract was distilled and lyophilized under reduced pressure to separate capsaicin. The extracted capsaicin is referred to as [sample-1].
상기 잔여물이 곧 에탄올에 용해되지 않는 알코올불용물(AIS, Alcohol Insoluble Solid)이며, 상기 알코올불용물(AIS)로부터 단계적으로 추출한 추출물을 원심분리 하여 상등 액으로부터 에탄올 침전법으로 펙틴-단백질 혼합물(pectin-protein complex), 고추단백질(protein), 조펙틴(crude pectin)을 산출한다. 단, 고추단백질은 펙틴나아제를 처리한 후, 조펙틴은 프로테아제로 처리한 후, 원심분리 한 상등 액으로 부터 에탄올 침전법으로 산출한다. 이들이 각각 [시료-2]와, [시료-3], [시료-4]가 된다. 알코올불용물(AIS)로부터 추출한 추출액을 원심분리 및 농축 단계를 거친 후 검정곰팡이를 접종하여 48시간 발효시킨 다음 발효액을 원심분리 하여 상등 액을 에탄올 침전법으로 분리, 원심분리, 동결건조 한 변형펙틴 분말(Modifieid pectin powder)을 산출하여 [시료-5]를 얻는다. 상기와 같이 [시료-1]을 제외한 [시료-2], [시료-3], [시료-4], [시료-5]의 4가지 시료는 고추 알코올 불용물(Alcohol Insoluble Solid, AIS)로부터 단계적으로 조제한 공통 시료가 된다. 이들 시료는 본 발명의 펙틴-중금속 착물 형성에, 동물을 이용한 시토킨 확인 실험에, 그리고 항산화성 확인 실험에 공통시료로 사용한다. The residue is an alcohol insoluble solid (AIS) which is not dissolved in ethanol, and the pectin-protein mixture is extracted from the supernatant by ethanol precipitation by centrifuging the extract extracted stepwise from the alcohol insoluble (AIS). pectin-protein complex, pepper protein (protein), crop pectin (crude pectin) is calculated. However, red pepper protein is treated with pectinase, and zepectin is treated with protease, and then ethanol precipitation is calculated from centrifuged supernatant. These are [sample-2], [sample-3], and [sample-4], respectively. The extract extracted from alcohol insolubles (AIS) was subjected to centrifugation and concentration step, inoculated with black mold and fermented for 48 hours, then the fermentation broth was centrifuged to separate the supernatant by ethanol precipitation, centrifugation, and lyophilization A powder (Modifieid pectin powder) is calculated to obtain [Sample-5]. As described above, four samples of [Sample-2], [Sample-3], [Sample-4], and [Sample-5], except for [Sample-1], were prepared from alcohol insoluble solid (AIS). It becomes the common sample prepared in steps. These samples are used as common samples for the formation of pectin-heavy metal complexes of the present invention, for cytokine identification experiments using animals, and for antioxidant identification experiments.
상기 에탄올 침전법은 추출물(Extract, 이하 Ex)을 원심분리 등의 과정을 거친 다음 추출물에 주정을 가하여 65% 에탄올(ethanol) 농도로 조정하여 침전시킨 침전물과 그 상등 액을 다시 85% 에탄올(ethanol)용액으로 조정하여 침전시켜 얻은 침전물을 모두 동결건조 시켜 얻는 것으로서, 이 방법에 의한 수율은 상기 2개의 침전물들을 합산하여 수율로 계산한다.In the ethanol precipitation method, the extract (Extract hereinafter) is subjected to centrifugation and the like, and then, the ethanol is added to the extract to adjust the concentration to 65% ethanol. It is obtained by lyophilizing all the precipitates obtained by adjusting with a solution, and the yield by this method is calculated by adding the two precipitates together.
상기 5가지 공통시료의 수율, 환원당, 갈락투론산(GA) 및 단백질 함량을 표 4에 나타내었다Yields, reducing sugars, galacturonic acid (GA) and protein contents of the five common samples are shown in Table 4.
< 표 4 >공통시료의 환원당, 갈락투론산(GA) 및 단백질 함량 <Table 4> Reducing sugar, galacturonic acid (GA) and protein content in common samples
표 4에 나타낸 바와 같이 에탄올(ethanol) 침전법에 의해 분리한 고추펙틴(pectin)분말 시료에 대한 수율은 평균 15.5%로서 고추에 함유되어 있는 섬유소 함량(약 22%)에서 약 70%의 펙틴물질을 획득하였다. 이것은 섬유소 추출액에 95% 에탄올(ethanol)로 침전시켰을 때 얻어지는 8-9%에 비해 약 2배 정도의 수율을 높일 수 있다는 것을 알 수 있었다. 4가지 펙틴(pectin)시료 중 미생물 발효공법에 의해 제조한 시료가 17.4%로서 가장 많았다. 시료-1의 캅사이신(capsaicin)은 80% 에탄올(ethanol)로 추출한 결과 약 10%의 수율을 얻었다.As shown in Table 4, the average yield of pepper pectin powder samples isolated by ethanol precipitation method was 15.5%, which is about 70% of the pectin substance in the fiber content (about 22%) of red pepper. Obtained. This was found to be about twice as high yield as 8-9% obtained when precipitated with 95% ethanol (ethanol) in the fiber extract. Of the four pectin samples, 17.4% of the samples were prepared by the microbial fermentation method. Capsaicin of Sample-1 was extracted with 80% ethanol to obtain a yield of about 10%.
침전물로부터 조제한 조펙틴(crude pectin)의 주성분을 이루고 있는 갈락투론산(GA) 함량은 평균 29,5%였고 4가지 시료 중에서 발효공법에 준하여 얻어진 펙틴(pectin)의 갈락투론산(GA)함량이 33,1%로서 가장 높았다.The content of galacturonic acid (GA), which is a major component of crude pectin prepared from the sediment, was 29,5% on average, and the content of pectin galacturonic acid (GA) obtained by fermentation method among four samples. The highest was 33,1%.
조펙틴(Crude pectin)중의 환원당 함량은 평균 27.6%로서 갈락투론산(galacturonic acid, GA) 함량과 비슷하지만 펙틴(pectin) 분말을 투석 등 정제과정에서 환원당은 대부분 제거가 가능하다는 것을 알 수 있었다.Reducing sugar content in Crude pectin was 27.6%, which is similar to galacturonic acid (GA) content, but it was found that most of reducing sugar can be removed during pectin powder purification process such as dialysis.
조펙틴(Crude pectin)중의 단백질 함량은 대체적으로 2% 범위로 함유되어 있었다. 시료-4와 같은 고추 펙틴의 경우 프로테아제(protease)처리 후에도 단백질이 함유되어있다는 것은 단백질이 펙틴(pectin)과 강하게 결합되어 있기 때문이라 추측되어진다.Protein content in Crude pectin was generally in the 2% range. In the case of pepper pectin, such as sample-4, it is presumed that the protein is contained even after protease treatment because the protein is strongly bound to pectin.
< 실시예 2 > 용매별 고추펙틴(Pectin) 추출과 그 수월성 검정Example 2 Pectin Extraction by Solvent and Its Excellence Assay
고춧가루에서 용매별 고추펙틴을 추출하는 단계는 (a1) 상기 고춧가루를 80% 에탄올의 에탄올 침전법에 의해 침전물인 알콜불용물(AIS)을 추출하는 단계와, (a2) 도 2와 같이 상기 알콜불용물(AIS)을 200g 당 100㎖ 탈이온수에 넣어 25℃에서 1시간 휘젓기(stir)와 5000rpm으로 15분간 원심분리를 하여, 잔여물을 제외한 상등 액을 분말로 만들어 수용성펙틴(WSP) 분말을 제조하는 단계, (a3) 상기 (a2)단계에서 생성되는 상기 잔여물을 0.1M 옥살산암모늄(ammonium Oxalate)에 넣어 25℃에서 1시간 휘젓기(stir)와 5000rpm으로 20분간 원심분리를 하여, 잔여물을 제외한 상등 액을 분말로 만들어 옥살레이트 용해성 펙틴(OSP) 분말을 제조하는 단계, (a4) 상기 (a3)단계에서 생성되는 잔여물을 0.2N 염산(HCl)에 넣어 80℃로 30분간 가열하고 5000rpm으로 20분간 원심분리를 하여, 잔여물을 제외한 상등 액을 분말로 만들어 산성용해성펙틴(ASP) 분말을 제조하는 단계로 세분화되는 단계들을 포함한 다. 그리고 상기 (a2)단계와 (a4)단계에서 잔여물을 제외한 상기 상등 액을 분말로 제조하는 방법은, 95% 에탄올(이하 주정)을 가하여 65% 에탄올 농도가 되도록 조절한 후 4℃에서 24시간 침전시켜 얻은 침전물을 원심분리하고, 그 상등 액에 주정을 가하여 85% 농도가 되도록 조절한 후 얻은 침전물을 동결건조 한 다음 분말로 제조하는 것으로 한다.Extracting the pepper pectin for each solvent from the red pepper powder (a1) extracting the alcohol insoluble matter (AIS) precipitated by the ethanol precipitation method of 80% ethanol, and (a2) the alcohol insoluble as shown in FIG. Water (AIS) was added to 100ml deionized water per 200g and stirred for 1 hour at 25 ° C and centrifuged at 5000rpm for 15 minutes to prepare supernatant liquid except residue to produce water-soluble pectin (WSP) powder. Step (a3) The residue produced in step (a2) was added to 0.1M ammonium oxalate (ammonium oxalate) and stirred at 25 ° C. for 1 hour and centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes. Preparing an oxalate soluble pectin (OSP) powder by making the supernatant except the powder, (a4) adding the residue produced in step (a3) to 0.2N hydrochloric acid (HCl) for 30 minutes and heating at 80 ° C. for 5000 rpm Centrifuge for 20 minutes Creating a fluid such as a powder, including the steps that are broken down to prepare the acid-soluble pectin (ASP) powder. And the method of preparing the supernatant except the residue in the step (a2) and (a4) as a powder, adjusted to 65% ethanol concentration by adding 95% ethanol (hereinafter referred to as alcohol) for 24 hours at 4 ℃ The precipitate obtained by precipitation is centrifuged, and the supernatant is poured into alcohol to adjust the concentration to 85%, and the precipitate obtained is lyophilized and then prepared into powder.
다음은 용매별로 추출한 고추 펙틴(Pectin) 추출물의 수율, 환원당, 갈락투론산(GA), 단백질 및 무기질 함량을 분석한 결과이다.The following is the result of analyzing the yield, reducing sugar, galacturonic acid (GA), protein and mineral content of pepper pectin extract extracted by solvent.
< 결과 2-1 > 용매별로 추출한 고추펙틴(Pectin) 추출물의 수율 비교<Result 2-1> Yield Comparison of Pectin Extract Extracted by Solvent
도 3은 본 발명의 3가지 용매인 물, 옥살산암모늄(ammonium oxalate), 염산(HCl)으로 추출했을때 얻어지는 펙틴(Pectin)의 수율 그래프이다.Figure 3 is a graph of the yield of pectin (Pectin) obtained when extracted with three solvents of the present invention, water, ammonium oxalate, hydrochloric acid (HCl).
도 3에서 보는 바와 같이 물로 추출하여 얻은 Ex를 정제한 후 추출액에 에탄올(ethanol)을 가하여 65% 용액으로 침전시킨 펙틴(pectin)분말의 수율이 6.38%인 것에 비해 85% 에탄올(ethanol)로 침전시켜 얻은 펙틴(pectin)의 수율은 절반인 3.07%이였고, 도합 9.46%의 펙틴 물질을 얻었다. 알코올불용물(AIS)을 옥살산암모늄(ammonium oxalate)로 3차 추출한 Ex를 물 추출과 같은 방법으로 수행하여 얻은 펙틴(pectin)수율은 65% 에탄올(ethanol)에서 5.30%, 85% 에탄올(ethanol)에서 1.26%로서 물 추출에 비해 각각 1% 정도 낮은 수치를 보였고, 도합 6.56%의 펙틴 물질을 얻었다. 최종적으로 알코올불용물(AIS)을 희염산으로 추출하여 얻은 Ex에 에탄올을 가하여 침전시킨 펙틴(pectin)의 수율은 65% 에탄올에서 1.24%이었고, 85% 에탄올에서는 0.98%로서 수율이 낮았고, 도합 2.20%의 펙틴 물질을 얻었다.As shown in FIG. 3, after purification of the Ex obtained by extraction with water, the yield of the pectin powder precipitated as a 65% solution by adding ethanol to the extract was precipitated with 85% ethanol, compared to 6.38%. The yield of pectin was 3.07%, which is half, and a total of 9.46% pectin material was obtained. The yield of pectin obtained by tertiary extraction of alcohol insolubles (AIS) with ammonium oxalate in the same manner as water extraction was 5.30% in 65% ethanol and 85% ethanol. Was 1.26% at 1% lower than water extraction, and a total of 6.56% pectin material was obtained. Finally, the yield of pectin precipitated by adding ethanol to Ex obtained by diluting an alcohol insoluble substance (AIS) with dilute hydrochloric acid was 1.24% in 65% ethanol, 0.98% in 85% ethanol, and the yield was 2.20% in total. Pectin material was obtained.
따라서 고추펙틴을 물, 옥살산암모늄 및 희염산으로 단계적으로 추출한 고추 펙틴 추출물의 전체 수율은 18.2%로서 고추 원료에 함유되어 있는 섬유소 함량 22%에 대한 회수율(recovery)은 약 82.7%로서 대체적으로 만족스러운 값으로 간주된다.Therefore, the overall yield of the pepper pectin extract obtained by the stepwise extraction of pepper pectin with water, ammonium oxalate and dilute hydrochloric acid is 18.2%, and the recovery of the fiber content of 22% of red pepper material is about 82.7%, which is generally satisfactory. Is considered.
< 결과 2-2 > 용매별로 추출한 고추펙틴 침전물 중 GA 함량분석<Result 2-2> Analysis of GA Content in Chillipectin Precipitate Extracted by Solvent
도 4는 본 발명에 따른 물, 옥살산암모늄, 염산(HCl)으로 추출하여 얻은 펙틴(pectin)분말 중에 함유되어 있는 갈락투론산(GA) 함량을 비교한 그래프이다. 전체적으로 65% 에탄올로 침전시킨 펙틴 분말 중의 갈락투론산(GA)함량은 85% 에탄올로 침전시킨 펙틴에 비해 약 6배 정도 많은 값으로 분석되었다. 물 추출물에서는 65% 에탄올 침전물 중의 갈락투론산 함량은 27.8%로서 85% 에탄올 침전물 중의 9.38%에 비하여 약 3배 정도 높은 값을 나타내었다. 옥살산암모늄 추출물의 65%에탄올 침전물 중에는 47.3%로서 85% 에탄올 침전물 중의 7.94%에 비하여 약 6배 정도의 갈락투론산 함량이 높은 것으로 나타났다. 염산 추출물의 65% 에탄올 침전물 중 갈락투론산 함량은 41.0%로서 85% 에탄올 침전물의 7.2%에 비하여 약 6배 정도 높은 값을 나타내었다.Figure 4 is a graph comparing the galacturonic acid (GA) content contained in the pectin (pectin) powder obtained by extraction with water, ammonium oxalate, hydrochloric acid (HCl) according to the present invention. Overall, galacturonic acid (GA) content in pectin powder precipitated with 65% ethanol was about 6 times higher than that of pectin precipitated with 85% ethanol. In the water extract, the galacturonic acid content in the 65% ethanol precipitate was 27.8%, which was about three times higher than the 9.38% in the 85% ethanol precipitate. Among 65% ethanol precipitates of ammonium oxalate extract, 47.3% showed about 6 times higher galacturonic acid content than 7.94% in 85% ethanol precipitates. The content of galacturonic acid in 65% ethanol precipitate of hydrochloric acid extract was 41.0%, which was about 6 times higher than 7.2% of 85% ethanol precipitate.
따라서 3가지 용매 추출물에서 수율은 물 추출물이 높은 것에 반하여 갈락투론산 함량은 옥살산암모늄 추출물이 가장 높았고 다음은 염산 추출물이 높았다. 그러나 옥살산암모늄에 의한 추출은 화공약품을 구입하는 데 필요한 비용과 건강기능 식품을 제조하는 차원에서는 위생문제와 경제적인 사정이 산업화에 걸림돌이 된다는 단점이 있기 때문에, 산업화를 위해서는 물 추출법이 경제성이 높은 것으로 판단된다.Therefore, the yield of the three solvent extracts was high in the water extract, whereas the content of galacturonic acid was the highest in the ammonium oxalate extract, followed by the high hydrochloric acid extract. However, the extraction by ammonium oxalate has the disadvantage that the hygiene problem and the economic situation are obstacles to the industrialization in terms of the cost of purchasing chemicals and the manufacture of health functional foods. It seems to be.
< 결과 2-3 > 용매별로 추출한 고추펙틴 침전물 중 환원당 함량분석<Result 2-3> Reducing Sugar Content of Red Pepper Pectin Precipitate Extracted by Solvent
도 5는 본 발명에 따른 물, 옥살산암모늄, 염산으로 추출하여 얻어진 고추펙틴 분말 중의 환원당 함량 비교 그래프이다. 65% 에탄올로 침전시켜 얻은 펙틴(pectin) 중의 환원당 함량을 측정한 값으로서 평균 32%로 대등하였으며 85% 에탄올(ethanol)로 침전시킨 펙틴(pectin) 중의 환원당은 물 추출물에서 33.9%로서 다소 높았으나 수산염(oxalate)추출물에서는 26.7%, 염산 추출물에서는 21.2%로서 점차적으로 낮은 값을 보였다.Figure 5 is a graph of reducing sugar content in red pepper pectin powder obtained by extraction with water, ammonium oxalate, hydrochloric acid according to the present invention. Reducing sugar content in pectin obtained by precipitation with 65% ethanol was comparable to 32% on average.Reducing sugar in pectin precipitated with 85% ethanol was 33.9% in water extract. The oxalate extract showed 26.7% and the hydrochloric acid extract showed 21.2%.
이와 같은 결과는 환원당이 물과 산 용액에서 녹는 용해도의 차이에 의한 것이라 생각되어지며 펙틴(pectin) 생산 산업에는 큰 영향이 없는 것으로 보인다.This result is thought to be due to the difference in solubility of reducing sugars in water and acid solutions and does not appear to have a significant effect on the pectin production industry.
< 결과 2-4 > 용매별로 추출한 고추펙틴 침전물 중의 단백질 함량분석<Result 2-4> Analysis of Protein Content in Red Pepper Pectin Precipitate Extracted by Solvent
이외 용매별로 추출하여 제조한 펙틴(pectin) 분말 중의 단백질 함량은 물 추출물에서 1.13%로서 가장 많았고, 옥살산암모늄(ammonium oxalate)로 추출하여 얻은 펙틴(pectin)분말 중의 단백질이 0.26%로서 가장 낮았다. 희염산 추출물에서는 0.83%로서 중간 값으로 분석되었다.The protein content of pectin powder extracted by solvent was the highest as 1.13% in water extract, and the lowest in pectin powder obtained by extraction with ammonium oxalate was 0.26%. Dilute hydrochloric acid extract was analyzed as median value of 0.83%.
< 실시예 3 > 고추펙틴의 효소에 의한 변형Example 3 Modification of Red Pepper Pectin by Enzyme
고추 펙틴의 효소에 의한 변형은 검정곰팡이(Aspergillus niger) 발효과정 중 생성되는 폴리갈락투로나아제 및 펙틴메틸에스테라아제에 의한 펙틴 사슬의 분해 또는 메틸기 탈리반응으로 펙틴의 구조적인 변화를 유도하여 변형시켰다. Enzymatic modification of red pepper pectin was induced by modification of pectin chain by polygalacturonase and pectin methyl esterase produced by black fungus (Aspergillus niger) fermentation, or by methylation desorption. .
우선 한국생명공학원에서 분양한 검정곰팡이(Aspergillus niger)KCTC 3278앰플을 맥아추출물, 글루코오스, 펩톤 혼합배지에 용해시킨 후 포테이토-덱스트로오스 배지에 접종하여 재생시켰다. 이것을 포테이토-덱스트로오스-아가(PDA; Becton, Dickinson and Company) 2.4g를 100㎖에 녹인 다음 1분간 열처리 하여 PDA를 완전히 용해시킨 후 5개의 시험관에 5㎖식 분주한 후 오토클레이브에 넣고 121℃에서 15분간 멸균한 다음 냉각시켜 앞에서 재생시킨 검정곰팡이(Aspergillus niger)KCTC 3278를 접종하여 24℃에서 3일간 진탕배양 하면서 종균을 만들었다(황색 원형 균사체를 얻음).First, the black fungus (Aspergillus niger) KCTC 3278 ampoule, which was prepared by the Korea Institute of Biotechnology, was dissolved in malt extract, glucose, and peptone mixed medium, and then inoculated in potato-dextrose medium to be regenerated. This was dissolved 2.4 g of Potato-Dextrose-Agar (PDA; Becton, Dickinson and Company) in 100 ml, followed by heat treatment for 1 minute to completely dissolve the PDA. After dispensing 5 ml in 5 test tubes, they were placed in an autoclave and 121 Sterilized for 15 minutes at ℃ and then inoculated with the inoculated black fungus (Aspergillus niger) KCTC 3278 was made to spawn while shaking culture for 24 days at 24 ℃ (yellow circular mycelium obtained).
상세하게 설명하면 다음과 같다.It will be described in detail as follows.
균 재생을 위한 배양을 액체배지와 평판배지에 각각 실시하였다. 액체배지는 맥아추출물(malt extract) 5g, 글루코오스(glucose) 5g, 펩톤(peptone) 0.25g를 증류수 250㎖에 녹이고 이 가운데 50㎖를 시험관 10개에 각각 5㎖식 분주하여 액체배지를 만든다. 나머지 200㎖와 한천(agar) 4g를 삼각 플라스크에 넣고 충분히 혼합한다. 위의 시험관과 삼각 플라스크를 121℃에서 15분간 멸균하고 냉각 후 시험관에 균을 용해시키고, 삼각플라스크 배지를 페트리접시에 담아 평판배지를 만든다. 실온으로 냉각시킨 다음 앰플 로부터 균을 액체배지에 녹이고, 이 액을 페트리 접시에 백금이로 3점 접종하여 25℃에서 2일간 배양하여 균을 재생시켰다.Cultures for bacterial regeneration were carried out in liquid and plate media, respectively. The liquid medium is prepared by dissolving 5 g malt extract, 5 g glucose, and 0.25 g peptone in 250 ml of distilled water, 50 ml of which are dispensed in 5 ml aliquots into 10 test tubes, respectively. Add the remaining 200ml and 4g of agar to the Erlenmeyer flask and mix well. Sterilize the test tube and Erlenmeyer flask at 121 ° C. for 15 minutes, dissolve the bacteria in the test tube after cooling, and place the Erlenmeyer flask medium in a Petri dish to make a plate medium. After cooling to room temperature, the bacteria were dissolved in the liquid medium from the ampoules, and the solution was inoculated three times with platinum in a petri dish and incubated at 25 ° C for 2 days to regenerate the bacteria.
종균배양을 목적으로 Potato Dextrose Broth(PDP; Beaton, Dickinson and Company) 배지 2.4g를 100㎖에 녹인 다음 1분간 열처리하여 완전히 용해시킨 후 시험관 5개에 5㎖식 분주한다. 이것을 멸균기에 넣고 121℃에서 15분간 멸균한 다음 냉각시켜 (b1)에서 재생시킨 검정곰팡이(Aspergillus niger)KCTC 3278를 접종하여 25℃에서 3일간 진탕 배양 하는 단계, 배양한 종균을 고추 펙틴 변형을 목적으로 본 배양을 실시하였다. 즉 기본배지인 Potato Dextrose Agar(PDA: Potato starch 4.0g, Dextrose 20.0g, Agar 4.0g) 24g를 1000㎖에 녹인 다음 그 중 200㎖ 분주하여 기본배지로 하고, 두 번째 기본배지 200㎖에 표준펙틴(citrus pectin; Sigma제품)을 1%가 되도록 첨가하여 대조 배지를 만들고, 세 번째 기본배지 200㎖를 3개의 삼각 플라스크에 담고 여기에 고추펙틴을 각각 1%, 2%, 3%가 되도록 반응용액을 만든 다음 pH를 측정한 결과 4.52에서 5.26범위 이었다. 위와 같이 만든 5개의 삼각플라스크에 (b2)에서 만든 종균을 2.0%를 접종하여 진탕배양하면서 24시간 마다 시료를 채취하여 펙틴의 분해 정도를 검정한 단계로 실시한 것을 특징으로 한다.For the purpose of spawn culture, 2.4g of Potato Dextrose Broth (PDP; Beaton, Dickinson and Company) medium is dissolved in 100 ml, and then completely dissolved by heat treatment for 1 minute, followed by 5 ml aliquots in 5 test tubes. This was put into a sterilizer and sterilized for 15 minutes at 121 ℃ and then cooled and inoculated with the black mold (Aspergillus niger) KCTC 3278, which was regenerated in (b1), shaking culture at 25 ℃ for 3 days, the culture of the spawn pectin modified This culture was carried out. In other words, 24g of Potato Dextrose Agar (PDA: Potato starch 4.0g, Dextrose 20.0g, Agar 4.0g) was dissolved in 1000ml, and then 200ml aliquots were used as the standard medium. (citrus pectin; product made by Sigma) was added to 1% to make a control medium, and 200 ml of the third base medium was placed in three Erlenmeyer flasks, and 1%, 2%, and 3% of red pepper pectin was added thereto. The pH was measured and then ranged from 4.52 to 5.26. Five triangular flasks made as described above were inoculated with 2.0% of the spawn made in (b2) and incubated with shaking to collect a sample every 24 hours.
앞에서 배양한 검정곰팡이을 종균으로서 본 배양에 접종하는 양은 배양액의 2%(용량)를 본 배양액에 접종하여 고추 펙틴 변형을 진행한다. 통상 1～1.5%범위이나 본 발명에서는 상기와 같이 2%로 하였다. 2%로 하는 이유는 기질 농도 탐색에 목적이 있기 때문이다.The inoculation of this fungus into the culture as a seed was inoculated with 2% (volume) of the culture solution in the culture solution to proceed with pepper pectin modification. Usually in the range of 1 to 1.5%, the present invention is 2% as described above. The reason for setting it to 2% is because it is intended for the substrate concentration search.
본 배양단계에서의 검정곰팡이의 펙틴 분해(효소활성도) 정도를 4일로 기준하였는데, 이것은 반응용액에 주입한 펙틴의 회수율이 배양시간 4일에서 0%가 되기 때문이다. 따라서 본 배양은 4일을 하는 것이 효과적임을 알아냈다.The degree of pectin degradation (enzyme activity) of the black mold in this culture step was based on 4 days because the recovery rate of pectin injected into the reaction solution was 0% at 4 days of incubation time. Therefore, this culture was found to be effective for 4 days.
＜실험 3-1＞ 고추펙틴 용액 제조과정 및 검정곰팡이 본 배양<Experiment 3-1> Preparation of Red Pepper Pectin Solution and Culture of Black Mold
고춧가루로부터 변형고추펙틴(시료-5)은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 건고춧가루 16㎏을 추출기에 넣고 80% 에탄올 용액 56ℓ를 가한 다음 70～80℃에서 5시간 가열 추출하여 압착여과로 상등액과 잔사를 분리한다. 상등액은 농축하여 캅사이신을 함유하는 시료-1을 조제하고 잔사는 실온에서 건조하여 알코올 불용물(AIS)을 얻는다. Modified pepper pectin (Sample-5) from the red pepper powder was carried out in the following manner. Put 16kg dried red pepper powder into the extractor, add 56ℓ of 80% ethanol solution, heat-extract at 70 ~ 80 ℃ for 5 hours, and separate the supernatant and residue by compression filtration. The supernatant is concentrated to prepare Sample-1 containing capsaicin and the residue is dried at room temperature to obtain an alcohol insoluble (AIS).
알코올 불용물(AIS) 11.4㎏을 증류수 90ℓ를 가하여 추출기에서 실온으로 12시간 교반추출하고 압착여과 하여 여액 69ℓ(Brix. 5)를 얻었다. 이 여액을 53ℓ(Brix. 7)로 농축하여 시료-2, 시료-3, 시료-4, 시료-5를 조제하는데 적절히 나누어 사용하였다. 90 L of distilled water was added to 11.4 kg of alcohol insoluble substance (AIS), and the mixture was stirred and extracted at room temperature for 12 hours, followed by compression filtration to obtain 69 L (Brix. 5) of the filtrate. The filtrate was concentrated to 53 L (Brix. 7) and used appropriately to prepare Sample-2, Sample-3, Sample-4, and Sample-5.
효소에 의한 변형고추펙틴(EMCP) 제조과정에서는 농축액(Brix. 7) 5ℓ를 앞에서 배양한 종균(13페이지)을 2% 비율로 접종하여 25℃에서 48시간 진탕 배양한다. 배양액을 10.000rpm으로 20분간 원심분리 하여 상등액을 Brix. 9로 농축한 후 95% 에탄올(이하 주정)을 가하여 반응액의 농도를 65%가 되도록 조절하여 4℃에서 펙틴을 서서히 침전 시켰다. 침전물은 다시 10.000rpm으로 20분간 원심분리 하여 펙틴을 분리하고 동결건조 시켜 변형고추펙틴 분말 113g를 얻었다. 원심분리 한 상 등 액에 다시 95% 에탄올을 가하여 85% 반응농도로 조절하여 2차적으로 변형고추펙틴 침전물을 만들고 이것을 원심분리 하여 얻은 침전물을 동결건조 시켜 148g의 변형고추펙틴을 얻었다. In the manufacturing process of modified CP by enzyme (EMCP), 5 liters of concentrate (Brix. 7) were inoculated at 2% inoculation at the rate of 2% of the spawned seeds (page 13) and incubated at 25 ° C for 48 hours. The culture was centrifuged at 10.000 rpm for 20 minutes to remove supernatant from Brix. After concentration to 9 was added to 95% ethanol (hereinafter alcohol) to adjust the concentration of the reaction solution to 65% to slowly precipitate the pectin at 4 ℃. The precipitate was further centrifuged at 10.000 rpm for 20 minutes to separate pectin and freeze-dried to obtain 113 g of modified pepper pectin powder. 95% ethanol was added to the supernatant, which was then centrifuged, and the reaction concentration was adjusted to 85% to make a modified Gopectin precipitate. The precipitate obtained by centrifugation was lyophilized to obtain 148g of modified Gopectin.
< 실험 3-2 > 검정곰팡이 배양액으로부터 효소추출 및 활성도 측정<Experiment 3-2> Enzyme Extraction and Activity from Black Mold Culture
검정곰팡이 균 앰플 로부터 재생시키고 PD 배지에서 배양한 종균을 포테이토-덱스토로오스-아가(PDA) 배지에 배양한다. 효소PDA 제조는 Czapek's 등의 액상배지(pH 5.0)에서 표면배양법(surface culture)으로 실시하였으며 여기에 탄소원으로 pectin 이용여부를 확인하기위해 본 실험에서 가공한 고추 펙틴과 표준 펙틴(citrus pectin, Sigma제품) 분말을 1%(w/v), 2%, 3% 가하여 대조하였다. 즉 PDA 4.8g를 200㎖ 증류수에 용해시키고 이것을 250㎖ 여기에 고추펙틴을 1%, 2%, 3% 용량씩 가한 다음 250㎖ 삼각플라스크(Erlenmeyer flask)에 50㎖식 나누어 넣고 25℃에서 4일간 배양하였다. Regeneration from the S. aureus ampoules and incubation in PD medium is incubated in potato-dextrose-agar (PDA) medium. The enzyme PDA was prepared by surface culture in liquid medium such as Czapek's (pH 5.0), and the pepper pectin and standard pectin (citrus pectin, Sigma products) processed in this experiment to check whether pectin was used as a carbon source. ) Powder was added by adding 1% (w / v), 2%, 3%. In other words, 4.8 g of PDA was dissolved in 200 ml of distilled water, and 250 ml of 1%, 2%, and 3% of red pepper pectin was added thereto, then 50 ml of 250 ml Erlenmeyer flask was added thereto for 4 days at 25 ° C. Incubated.
배양플라스크(Cultures flasks)를 모아 부흐너깔때기(Buchner funnel)로 여과하여 균체를 제거하고 다시 10,000rpm 으로 20분간 원심분리 하여 상등 액을 얻은 다음 농축하여 Brix 5로 조절하고 4℃에서 증류수로 투석(dialysis)하여 청정액을 얻은 것을 효소 용액으로 하였으며 효소 용액에 대한 단백질 정량은 로리(Lorry)법으로 실시하였다.Cultures flasks were collected and filtered through a Buchner funnel to remove the cells, and centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes to obtain a supernatant, and then concentrated to
검정곰팡이(Aspergillus niger)KCTC 3278배양액으로부터 엔도폴리갈락트우로나아제(PGA)활성도는 W. Klaffeke 및 G.E. Anthon 등의 방법에 준하여 실시하였다. 활성도 측정에 필요한 교정곡선(Calibration Curve)은 갈락투론산(GA)를 기질로 하여 작성하였으며, 검정곰팡이(Aspergillus niger) 배양액으로부터 채취한 반응액에 대한 효소 활성도는 폴리갈락투로네이즈(Polygalacturonase) 활성도 변화로 계산하였다.Endopolygalacturonase (PGA) activity from Aspergillus niger KCTC 3278 culture was measured by W. Klaffeke and G.E. It was carried out according to the method of Anthon et al. The calibration curve required for the activity measurement was prepared using galacturonic acid (GA) as a substrate, and the enzyme activity for the reaction solution obtained from the Aspergillus niger culture was polygalacturonase activity. Calculated as change.
배양액 중의 메탄올(methanol)정량은 P. J. Wood & I. R. Siddigui 등의 방법에 준하였다. 즉 시약 A,B,C를 조제하여 실온에서 시료와 혼합하여 1시간 반응시킨 다음 분광광도계(spectrophotometer)로 412㎚에서 흡광도를 측정하여 교정곡선(calibration curve)으로부터 메탄올(methanol)함량을 구하였다. 메탄올(methanol)정량은 시약 A(2%,w/v) 과망간산칼륨(Potassium permanganate ; Baker analyzed reagent), 시약 B(012N, 황산에 0.5M 나트륨 알세나이트를 녹인 액（0.5M sodium arsenite in 0.12N H2SO4） ; Fisher "certified reagent) 및 시약 C(0.02M pentane -2.4-dione dissolved in a solution containing 2.0M Ammonium acetate and 0.05M Acetic acid)를 조제하여 실시하였다. The amount of methanol in the culture was determined according to the method of P. J. Wood & I. R. Siddigui. That is, reagents A, B, and C were prepared, mixed with the sample at room temperature, and reacted for 1 hour. Then, the absorbance was measured at 412 nm with a spectrophotometer to obtain methanol content from a calibration curve. Methanol was determined by reagent A (2%, w / v) potassium permanganate (baker analyzed reagent), reagent B (012N, 0.5M sodium arsenite dissolved in sulfuric acid (0.5M sodium arsenite in 0.12N). H2SO4); Fisher "certified reagent) and Reagent C (0.02M pentane -2.4-dione dissolved in a solution containing 2.0M Ammonium acetate and 0.05M Acetic acid) were prepared.
< 결과 3-2-1 > 검정곰팡이배양 과정에서 배양액 중 총산의 변화<Result 3-2-1> Changes of Total Acid in Culture Media during Black Mold Culture
도 6은 검정곰팡이로 배양하는 동안 시간별로 측정한 총산(total acid)의 함량 비교 그래프이다. Figure 6 is a graph comparing the content of total acid (time total) measured during incubation with black mold.
도 6에서 보는 바와 같이 펙틴(pectin)을 변형(modification)시키는 과정에서 미생물이 생산하는 총산(Total Acid)은 시간이 경과되면서 점차적으로 함량이 증가되는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 펙틴(pectin)을 포함한 배지 중의 탄 수화물 및 단백질 등이 분해되어 유기산을 생산하기 때문이라 해석된다.As shown in FIG. 6, the total acid produced by the microorganism in the process of modifying pectin was gradually increased in content. This result is interpreted because carbohydrates and proteins in the medium containing pectin are decomposed to produce organic acids.
< 결과 3-2-2 > 변형(Modification)시킨 반응용액 중의 메탄올(Methanol) 정량<Result 3-2-2> Determination of Methanol in Modified Reaction Solution
도 7은 검정곰팡이 배양과정 중 메탄올의 시간별 측정치 비교 그래프이다.Figure 7 is a graph comparing the measurement of the hourly methanol during the black mold culture process.
도 7에서 보는 바와 같이 검정곰팡이(Aspergillus niger)배양과정 중 펙틴(pectin)으로부터 유리되는 메탄올(methanol의)함량은 96시간에서 0.057㎍/㎖로서 반응초기의 0.012㎍/㎖에 비해 약 5배 정도 높았다.As shown in FIG. 7, methanol content of methanol released from pectin during Aspergillus niger culture was about 0.057 µg / ml at 96 hours, which was about 5 times higher than 0.012 µg / ml at the beginning of the reaction. High.
< 결과 3-2-3 > 검정곰팡이 배양액 중 폴리갈락투로나제 활성도<Result 3-2-3> Polygalacturonase Activity in Black Fungal Cultures
도 8은 검정곰팡이 배양액 중 폴리갈락투로나제 활성도를 측정한 결과 그래프이다. 도 8에서 보는 바와 같이, 검정곰팡이(Aspergillus niger)를 반응시간 별로 폴리갈락투로네이즈(polygalacturonase)활성을 측정한 결과 반응 초기인 10분에서 대조구(control)인 pectinex는 116U/㎖에 비하여, 균주발효 12시간 구에서 32U/㎖, 24시간 발효 구에서 24.5U/㎖, 배양48시간 구에서는 19U/㎖로서 시간이 경과할수록 활성도가 감소하였다.8 is a graph showing the results of measuring polygalacturonase activity in the black mold culture. As shown in FIG. 8, as a result of measuring the polygalacturonase activity of the black fungus (Aspergillus niger) according to the reaction time, the control (pectinex) as a control at 10 minutes of the initial reaction was compared with 116 U / ml. The activity decreased with time as 32U / mL in 12 hours fermentation, 24.5U / mL in 24 hours fermentation and 19U / mL in 48 hours culture.
< 실험 3-3 > 산과 알칼리 가수분해에 의한 펙틴변형Experiment 3-3 Pectin Modification by Acid and Alkaline Hydrolysis
고추Pectin을 산으로 가수분해하여 변형고추펙틴(AMCP)을 제조하였다. 즉 고추펙틴(capsicum pectin)시료 3g 을 0.1M HCl용액 100㎖에 녹인 다음 80℃에서 24 시간 가수분해 시켰다. 이 액을 7000rpm으로 10분간 원심분리 하여 상등액을 취한 다음 0.1M NaOH로 pH 6.5로 중화하였다. 다시 원심분리한 액에 95% 에탄올을 가하여 65% 및 85%농도에서 펙틴(pectin)을 침전시킨 후 10000rpm으로 10분간 원심분리 한 후 침전물을 동결건조 시켜 변형고추펙틴(modified capsicum pectin)분말을 얻었다. 변형고추펙틴(modified capsicum pectin)분말을 투석시킨 후 갈락투론산(galacturonic acid, 이하'GA'라 함)정량 및 분자량 분획 등을 실시하였다. 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)은 MCP에 포함되는 것으로 간주 한다Hydrolyzed pepper Pectin with acid to prepare modified pepper pectin (AMCP). That is, 3 g of capsicum pectin sample was dissolved in 100 ml of 0.1 M HCl solution, and then hydrolyzed at 80 ° C. for 24 hours. The solution was centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant, which was then neutralized to pH 6.5 with 0.1 M NaOH. 95% ethanol was added to the centrifuged solution to precipitate pectin at 65% and 85% concentrations, followed by centrifugation at 10000 rpm for 10 minutes, and the precipitate was lyophilized to obtain a modified capsicum pectin powder. . After dialysis of the modified capsicum pectin powder, galacturonic acid (hereinafter referred to as 'GA') quantification and molecular weight fractions were performed. Rhamnogalacturonan is considered to be included in the MCP
펙틴(Pectin)의 탈메틸화(Demethylation)를 목적으로 하는 변형(Modification)을 실시하여, 알칼리에 의한 변형고추펙틴(ALMCP)시료를 조제하였다. 즉 고추 펙틴(pectin)을 3% 수용액으로 만든 다음 삼각플라스크(Erlenmayer flask)에 담고, 여기에 0.1M NaOH 냉 용액으로 pH12로 조절하였다. 48시간 반응시키면서 pH 12로 유지시키면서 4℃에서 휘젓는다(stirring). 48시간 반응시킨 후 0.1M HCl용액을 가하면서 pH 5.2로 조절하였다. 반응용액 중의 탈메틸화 된 펙틴(Demethylated pectin)은 65% 및 85% 에탄올 용액으로 침전시킨 다음 원심분리 하여 얻은 침전물을 동결건조 하여 ALMCP 시료를 조제하였다. 분말은 사용 직전에 95% 에탄올로 세척하고 투석(dialysis)시킨 다음 분자량 분획을 실시하였다.Modification aimed at demethylation of pectin was carried out to prepare a modified high-peptide pectin (ALMCP) sample with alkali. That is, red pepper pectin (pectin) was made into a 3% aqueous solution and placed in an Erlenmayer flask, which was adjusted to
< 결과 3-3-1 > 산으로 가수 분해한 변형고추펙틴(MCP)의 수율 비교<Result 3-3-1> Yield Comparison of Modified Gopectin (MCP) Hydrolyzed with Acid
도 9는 본 발명에 따른 산 가수분해에서 생성되는 용해성 펙틴(Pectin) 및 비용해성 펙틴(Pectin)의 수율비교 그래프이다.Figure 9 is a graph of yield comparison of soluble pectin (Pectin) and insoluble pectin (Pectin) produced in the acid hydrolysis according to the present invention.
도 9에서 보는 바와 같이 시간별로 산 가수분해 후 에탄올로 침전시켜 얻은 펙틴(pectin) 분해물 중 불용성펙틴과 수용성펙틴의 수율은 시간에 대한 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 여기에서 수용성펙틴은 수율에 있어서 불용성펙틴에 비해 절반 값으로 나타났다.As shown in FIG. 9, the yields of insoluble pectin and water-soluble pectin in pectin digests obtained by precipitation with ethanol after acid hydrolysis by time were not affected by time. Here, the water-soluble pectin was found to be half the value of the insoluble pectin in yield.
< 결과 3-3-2 > 알칼리 가수분해에 의한 변형펙틴의 수율 비교<Result 3-3-2> Yield Comparison of Modified Pectin by Alkali Hydrolysis
도 10은 본 발명에 따른 알칼리(Alkali)로 가수분해하여 재가공한 변형펙틴 (Modified Pectin)의 수율비교 그래프이다.Figure 10 is a graph of yield comparison of modified pectin (Modified Pectin) hydrolyzed with alkali (Alkali) according to the present invention.
도 10에서 보는 바와 같이 알칼리로 가수분해 시킨 고추 펙틴(pectin)의 가수분해 후 잔류물 중 펙틴(pectin)의 수율은 에탄올 65% 반응용액으로 얻은 변형고추펙틴 물질이 85% 에탄올 반응용액에 비해 약 7배 정도 높은 값으로 나타났다. 시간이 경과됨에 따라 65% 반응용액으로부터 얻어지는 수율은 감소하는 경향을 나타내었으며 85% 반응용액에서는 미미한 증가율을 나타내었다.As shown in FIG. 10, the yield of pectin in the residue after hydrolysis of pepper pectin hydrolyzed with alkali was about 50% compared with 85% ethanol reaction solution. It was 7 times higher. As time passed, the yield obtained from the 65% reaction solution showed a tendency to decrease, and a slight increase in the 85% reaction solution.
< 결과 3-3-3 > 산과 알칼리로 가수 분해한 변형고추펙틴 중의 갈락투론산(GA)의 함량<Result 3-3-3> Content of Galacturonic Acid (GA) in Modified Pepperpeptin Hydrolyzed with Acid and Alkali
도 11은 본 발명에 따른 시간별로 산가수분해하여 가공한 고추변형펙틴(MCP) 중의 갈락투론산(GA) 함량 비교 그래프이다.11 is a graph comparing galacturonic acid (GA) content in red pepper modified pectin (MCP) processed by acid hydrolysis according to time according to the present invention.
도 11에서 보는 바와 같이, 산 가수분해 후 침전물 중의 갈락투론산(GA)함량은 시간이 경과될수록 고추시료 펙틴(pectin)에서 유래된 불용성 펙틴(pectin)은 감소하는 경향을 나타내었고, 가용성 펙틴(pectin)의 갈락투론산 함량은 48시간에서 증가하는 경향을 나타내었다. 따라서 산 가수분해 반응시간을 시간을 연장시킬 때 가용성 섬유소의 함량을 높일 수 있다는 근거를 찾은 결과라 할 수 있다.As shown in FIG. 11, the content of galacturonic acid (GA) in the precipitate after acid hydrolysis showed a tendency to decrease insoluble pectin derived from pepper sample pectin over time, and soluble pectin ( The galacturonic acid content of pectin) tended to increase at 48 hours. Therefore, it can be said that the results of finding the evidence that the content of soluble fiber can be increased when the acid hydrolysis reaction time is extended.
도 12는 본 발명에 따른 시간별로 알칼리(alkali) 가수분해하여 에탄올 농도별로 가공한 변형고추펙틴(MCP) 중의 갈락투론산(GA) 함량비교 그래프이다.FIG. 12 is a graph comparing galacturonic acid (GA) content in modified Gopectin (MCP) hydrolyzed by alkali according to the present invention and processed by ethanol concentration.
도 12에서 보는 바와 같이, 알칼리 가수분해한 펙틴(pectin) 중의 갈락투론산(GA) 함량은 시간이 경과할수록 에탄올 65% 침전물에서는 변형고추펙틴(MCP) 수율이 증가하는 경향을 나타내었고 반대로 85% 에탄올 침전물에서는 미미한 감소현상을 나타내었다.As shown in FIG. 12, the content of galacturonic acid (GA) in alkaline hydrolyzed pectin tended to increase the yield of modified Pectin pectin (MCP) in
< 실험 3-4 > 고추 펙틴변형 실시 여부에 의한 분자량 분포 비교확인<Experiment 3-4> Comparison of molecular weight distribution by red pepper pectin modification
고추 섬유소로부터 분리한 조펙틴(crude pectin)분말을 5% 농도로 용해하여 투석한 후 Vivaflow 50 멤브레인(membrane)으로 분획하고, 분획물을 농축 및 여과, 갈락투론산(GA) 함량 분석 등의 조작을 거쳐 펙틴(pectin)의 변형(modification)정도를 검정확인 하였다.Crude pectin powder isolated from red pepper fiber was dissolved at 5% concentration, dialyzed and fractionated with a Vivaflow 50 membrane, and the fractions were concentrated and filtered and analyzed for galacturonic acid (GA) content analysis. Afterwards, the degree of modification of pectin was verified.
도 13은 Vivaflow 50 멤브레인 여과기의 단일모듈을 도시한 것이다.FIG. 13 shows a single module of a Vivaflow 50 membrane filter.
변형고추펙틴의 분자량을 분획하기 위한 Vivaflow50 멤브레인 운전 조건은 펌프 유속(pump flow)을 200 ~ 400㎖/min으로 하고, 최대압력은 3bar(45psi), 온도는 실온에서 실시하였다.The Vivaflow50 membrane operating conditions for fractionating the molecular weight of modified high-peptide were set at a pump flow rate of 200 to 400 ml / min, a maximum pressure of 3 bar (45 psi), and a temperature at room temperature.
본 발명의 고추 펙틴(Pectin)을 정제한 후 분자량별 분획은 Vivaflow50 멤 브레인(membrane)을 사용하였다. 샘플(Sample)병의 용량은 500㎖가 이상적이며 경우에 따라 1ℓ도 가능하다. 멤브레인(membrane)을 통과하지 않은 회수물의 유속은 200-400㎖/min의 속도로 조절하였으며 압력은 2.5bar로 하였다. 수기에 모아지는 분획된 여과액(filtrate)은 멤브레인(membrane)의 규격에 따라 시간이 다르지만 100-200㎖로 회수하였다. 수기에 모은 분획한 여과액(filtrate)은 갈락투론산(GA), 단백질(protein) 환원당을 정량하고 그대로 동결하여 수율을 계산하였다.After purification of the pepper pectin (Pectin) of the present invention was fractionated by molecular weight was used Vivaflow50 membrane (membrane). Sample volume is ideal for 500ml and in some cases 1l. The flow rate of the recovered product that did not pass through the membrane was controlled at a rate of 200-400 ml / min and the pressure was 2.5 bar. The fractionated filtrate collected in the water was recovered in 100-200 ml although the time varies depending on the size of the membrane. The filtrate collected in the hand was quantified galacturonic acid (GA), protein (protein) reducing sugar and frozen as it was to calculate the yield.
본 실험에서 고추 펙틴(pectin)에 대한 분자량 분획은 발효시킨 MCP와 발효시키지 않은 조펙틴(crude pectin)중의 갈락투론산(GA)을 정량하여 펙틴(pectin)의 변형(modified)정도를 비교하였다.In this experiment, the molecular weight fraction of pepper pectin was compared with the modified degree of pectin by quantifying galacturonic acid (GA) in fermented MCP and unfermented crude pectin.
< 결과 3-4-1 > 용매별 및 물 추출 후 분획한 펙틴(pectin)의 분자량 분포<Result 3-4-1> Molecular weight distribution of pectin fraction by solvent and after water extraction
표 5는 몇 가지 펙틴(Pectin) 제품을 분자량별로 분획하여 조펙틴의 분자량과 변형고추펙틴의 분자량을 비교함으로서 검정곰팡이 효소로 분해시킨 변형고추펙틴(MCP)의 분자량이 실지로 감소되었는지를 갈락투론산 함량을 정량하여 펙틴 분포도를 나타낸 표이다.Table 5 shows how galacturonic acid actually reduced the molecular weight of modified Gopectin (MCP) digested with black mold enzyme by fractionating several pectin products by molecular weight and comparing the molecular weight of zepectin with that of modified Gopectin. Table showing the pectin distribution by quantifying the content.
< 표 5 >분자량별로 분획한 몇 가지 펙틴(Pectin)의 분자량별 MCP 함량 분포<Table 5> Distribution of MCP Content by Molecular Weight of Several Pectins Fractionated by Molecular Weight
표 5에서 보는 바와 같이, 물, 옥살산암모늄, 산의 3가지 용매별로 추출하여 가공한 고추펙틴(pectin)의 분자량 분포도를 보면 약 80-90% 이상이 분자량 100,000이상의 분획 물에 치우쳐 있음을 알 수 있다.As shown in Table 5, the molecular weight distribution of pepper pectin extracted and processed by three solvents of water, ammonium oxalate, and acid shows that about 80-90% or more are inclined to fractions of 100,000 or more molecular weight. have.
효소(폴리갈락투로나아제)로 제작한 공통시료-5의 펙틴으로부터 분자량별로 변형고추펙틴(EMCP)을 분획한 후 펙틴 분말 중의 분자량 분포를 비효소 처리 펙틴과 비교한 결과 용매별 추출 펙틴의 분자량 100kDa 이상이 평균 85.1%이었고, 조펙틴(crude pectin)에서 79.6% 및 70.3% 인 것에 비해 30시간 효소 가수분해구의 65% 에탄올 침전물에서는 24.6%, 그리고 85% 에탄올 침전물에서는 36.7%로 감소됨으로서 효소에 의하여 약 1/3 정도 저분자 펙틴으로 분해반응이 일어난 결과로 간주 할 수 있다. 이와 같은 효소조작을 보다 간편한 방법으로 수행하기 위해 고추의 알코올 불용물로부터 추출한 엑스(Ex)에 직접 검정곰팡이(Aspergillus niger)KCTC 3278를 접균하여 60시간 발효시켰을 때 100kDa 이상의 펙틴물질의 분자량은 65% 에탄올 침전물에서 52.1%, 85% 에탄올 침전물에서 50.0%로서 펙틴 분말을 발효시킨 구에 비해 펙틴 변형의 정도가 낮은 것으로 나타났다. 따라서 고추펙틴의 효소에 의한 변형은 알코올 불용물로부터 추출한 엑스(Ex)로부터 펙틴을 에탄올로 침전시킨 후 동결건조 하여 펙틴의 1～2% 농도에서 검정곰팡이로 30시간 이상 발효시키는 것이 변형고추펙틴 제조에 효율성이 높은 것으로 평가된다. 이에 관련된 내용을 그림으로 나타내면 도 14, 도 15 및 도 16과 같다.The modified gopectin (EMCP) was fractionated by the molecular weight from the pectin of the common sample-5 prepared by the enzyme (polygalacturonase), and the molecular weight distribution in the pectin powder was compared with the non-enzyme-treated pectin. Molecular weight of 100 kDa or more averaged 85.1% and decreased to 24.6% in 65% ethanol precipitates and 36.7% in 85% ethanol precipitates compared to 79.6% and 70.3% in crude pectin. It can be regarded as a result of decomposition reaction with low molecular pectin by about one third. In order to carry out this enzymatic operation in a simpler way, the black mold (Aspergillus niger) KCTC 3278 was directly fermented for 60 hours by extracting it from the alcohol insoluble substance of red pepper, and the molecular weight of the
< 결과 3-4-2 > 효소에 의하여 변형(Modified)시킨 변형고추펙틴(MCP) 시료중의 분자량 분포 비교Results 3-4-2 Comparison of molecular weight distribution in modified Gopectin (MCP) samples modified by enzymes
도 13은 변형고추펙틴(MCP) 시료를 Vivaflow50 막(membrane)으로 펙틴(pectin)분자량별로 분획하여 얻은 저분자 변형고추펙틴(Low molecular MCP) 분말 중의 갈락투론산(GA) 함량을 정량한 결과로서, 효소가수분해하여 가공한 고추펙틴(pectin)의 몇 가지 분자량별로 분획한 저분자 변형고추펙틴(MCP)의 분포도이다.FIG. 13 is a result of quantifying galacturonic acid (GA) content in a low molecular weight modified high molecular weight (CP) powder obtained by dividing modified high molecular weight Pectin (MCP) sample by Pectin molecular weight with a Vivaflow50 membrane. It is the distribution of low molecular weight modified pepper pectin (MCP) fractionated by several molecular weights of pepper pectin processed by enzymatic hydrolysis.
도 13에서 보는 바와 같이, 그림 A는 분획한 후 용액 중의 펙틴(pectin)을 65% 에탄올 농도로 침전시킨 펙틴(pectin)을 동결건조 하여 갈락투론산(GA)을 정량한 결과이며, 그림 B는 85% 에탄올 농도로 펙틴을 침전시켜 갈락투론산(GA)을 분석한 결과이다.As shown in Figure 13, Figure A shows the result of quantifying galacturonic acid (GA) by lyophilizing pectin (pectin) precipitated pectin (65% ethanol concentration) in solution after fractionation, Figure B Pectin was precipitated at 85% ethanol concentration to analyze galacturonic acid (GA).
이 두 개의 그림에 나타낸 갈락투론산(GA) 값은 분자량 10,000Da에서 100,000Da까지 분획된 저분자펙틴(Low molecular pectin)은 평균 갈락투론산(GA)값이 20% 범위로서 도 13에 나타낸 갈락투론산(GA) 값에 비하여 약 2배의 값으로 증 가되었음 알 수 있다. 따라서 검정곰팡이(Aspergillus niger)로 배양하여 펙틴(pectin)을 변형(modified)시킨 결과는 산, 알칼리 가수분해 방법에 의한 변형에 비해 좋은 결과를 얻었다고 판정된다.The galacturonic acid (GA) values shown in these two figures are low molecular pectin fractionated from 10,000 Da to 100,000 Da molecular weight, and the average galacturonic acid (GA) value is in the range of 20%. It can be seen that it is increased to about twice the value of the lon acid (GA) value. Therefore, the result of modifying pectin by culturing with black fungus (Aspergillus niger) is judged to be good compared with the modification by acid and alkali hydrolysis methods.
< 결과 3-4-3 > 산(Acid), 알칼리(Alkali)로 가수분해한 MCP의 분자량 분획물 중의 갈락투론산(GA) 함량<Result 3-4-3> Galacturonic acid (GA) content in the molecular weight fraction of MCP hydrolyzed with Acid and Alkali
< 표 6 >산 및 알칼리(Alkali)로 가수분해하여 가공한 변형펙틴(modified pectin)의 분자량별 수율, 갈락투론산(GA), 총당(total Carbohydrate) 함량.TABLE 6 Yield, molecular weight, galacturonic acid (GA), total carbohydrate content of modified pectin hydrolyzed with acid and alkali (Alkali).
표 6에서 보는 바와 같이 염산과 알칼리로 변형(modified)시킨 펙틴(pectin) 시료 2g를 증류수에 녹여 투석 시킨 다음 분자량별로 분획하여 에탄올로 침전시킨 펙틴(pectin) 분말 중의 갈락투론산(GA) 함량과 총당의 함량을 측정한 결과 대부분이 분자량 100.000Da이상 획분에 함유되어 있는 것으로 나타났으며, 수율에서도 같은 획분에 치우처 있는 것으로 보아 산과 알칼리 처리에서는 펙틴(pectin)사슬의 메탄올 탈리 반응 등의 변형에 기여하고 펙틴 사슬 절단 반응에는 작용이 미미한 것으로 해석된다. 이와 같은 결과는 산, 알칼리 처리 후 펙틴(pectin)의 회수율에서 얻어진 값과 같은 양상으로 평가된다.As shown in Table 6, 2 g of pectin sample modified with hydrochloric acid and alkali was dissolved in distilled water and dialyzed, and then fractionated by molecular weight, and the galacturonic acid (GA) content in the pectin powder precipitated with ethanol. As a result of the measurement of the total sugar content, it was found that most of the fraction was contained in the fraction of 100.000 Da or more, and the yield was inclined to the same fraction, so that the acid and alkali treatments were used to modify the methanol desorption reaction of the pectin chain. It is interpreted that the action is negligible for the pectin chain cleavage reaction. This result is evaluated in the same manner as the value obtained from the recovery of pectin after acid and alkali treatment.
< 실시예 4 > 변형고추펙틴(MCP)의 중금속 제거 효과<Example 4> heavy metal removal effect of modified pepper pectin (MCP)
변형고추펙틴(MCP)과 중금속(Heavy Metal)과의 킬레이트화(Chelation) 반응을 실시함으로써, 고추펙틴이 체내 중금속 제거능력에 대한 활성 가능성을 타진하기 위한 기초 자료를 작성하는데 목적이 있다. P. Pollen과 M.A. O'Nell 등은 비에스테르화(nonesterified)되어 있는 갈락투로난(galacturonan) 사슬 2개가 입체적으로 배좌(conformation)를 형성하여 마치 "계란케이스(egg-box)" 모델을 하여 중금속 원소를 포집하여 킬레이트 착화합물(chelate complex)을 만든다고 주장하였다. The purpose of this study is to prepare basic data to determine the possibility of pepper pectin's activity on the removal of heavy metals from the body by conducting the chelation reaction between modified pepper pectin (MCP) and heavy metal. P. Pollen and M.A. In O'Nell et al., Two nonesterified galacturonan chains form conformation three-dimensionally, forming a "egg-box" model to capture heavy metal elements. He claimed to make chelate complexes.
변형고추펙틴(MCP)과 중금속의 킬레이트화(chelation)실험은 University of Liege에서 개발한 원자흡광분광법(AAS, Atomic absorption spectroscopy), 유도결합플라즈마(ICP, Inductively Coupled Plasma)법에 준하여 검정하였다. 시료는 앞에서 기술한 (1) 효소 변형(Enzymic modification), (2) 산성변형(Acidic modification), (3) 알칼리성변형(Alkaline modification)의 3종 시료와 (4) 대조구(control) 시료를 사용하였다. 대조구는 65% 에탄올(ethanol)로 침전시킨 1개 표준펙틴(Standard Pectin)을 시료로 하였다.Chelating experiments of modified high-peptide pectin (MCP) and heavy metals were assayed according to Atomic absorption spectroscopy (AAS) and Inductively Coupled Plasma (ICP) methods developed by the University of Liege. The sample used was three samples of (1) Enzymic modification, (2) Acidic modification, (3) Alkaline modification and (4) Control sample. . The control group was sampled with one standard pectin precipitated with 65% ethanol.
우선적으로 4가지 시료 중에 함유되어 있는 천연 킬레이트 금속(Natural chelating metals)의 값을 분석하여 반응시키고자 하는 중금속 이온과의 킬레이트 화(chelation)반응에 대한 활성도 분석에 참고하였다.First of all, the value of natural chelating metals contained in four samples was analyzed to refer to the activity analysis for chelation reaction with heavy metal ions to be reacted.
첫 번째 실험은 변형고추펙틴(MCP)의 정제 및 Cu(NO3)2ㆍ2.5H2O 킬레이트(Chelate)실험으로서, 다음과 같은 단계로 진행하였다.The first experiment was the purification of modified pepper pectin (MCP) and Cu (NO3) 2.2.5H2O chelate experiment, which proceeded to the following steps.
(1) 〔Cu(NO3)2〕ㆍ2.5H2O 0.005M/L - 0.5M/L 범위의 용액을 조제한 다음 그 중 20㎖를 5개의 반응플라스크(원심관-centrifuge tube) 50㎖에 취한다.(1) [Cu (NO3) 2] .2.5H2O Prepare a solution in the range of 0.005 M / L-0.5 M / L, and 20 ml of this is taken in 50 ml of five reaction flasks (centrifuge tubes).
(2) 수용성 변형고추펙틴(Water soluble MCP) 0.2g를 금속 용액 10㎖를 (1)의 결과물과 혼합하여 혼합액을 만든다. (2) 0.2 g of a water soluble MCP is mixed with 10 ml of a metal solution with the resultant of (1) to form a mixed solution.
(3). 혼합액 30㎖를 25℃에서 진동(shaking)하면서 24시간 반응시킨다. 24시간 반응시킨 다음 원심분리(15.000rpm/15min) 한 후 침전물은 동결건조 한다. 상등액은 농축하여 2㎖로 시료조제 후 구리 이온(Cu ion)을 유도결합플라즈마 분광계(ICP-Spectrometer)로 분석한다. (3). 30 ml of the mixed solution is reacted for 24 hours while shaking at 25 ° C. After reacting for 24 hours, centrifugation (15.000 rpm / 15 min) and the precipitate are lyophilized. The supernatant is concentrated to prepare a sample in 2ml and copper ions (Cu ions) are analyzed by an inductively coupled plasma spectrometer (ICP-Spectrometer).
두 번째는 변형고추펙틴(MCP)의 분자량별 분획물과 구리 이온(Cu ion)과의 킬레이트(Chelate)에 대한 실험으로서, 변형고추펙틴(MCP)을 Vivaflow50 멤브레인으로 분획한 시료를 Cu(NO3)2ㆍ2,5H2O와 반응시켜 킬레이트(chelate)를 만든 다음 구리 이온(Cu ion)을 분석한다.The second is an experiment on the chelate between the molecular weight fraction of modified pepper pectin (MCP) and copper ion (Cu ion). React with 2,5H2O to chelate and analyze the Cu ions.
< 실험 4-1 > 변형고추펙틴 시료에 함유되어 있는 기존 중금속 함량분석<Experiment 4-1> Analysis of Existing Heavy Metals in Modified High-peptide Pectin Samples
< 표 7 > 변형고추펙틴 시료에 함유되어 있는 기존 중금속의 함량(㎎/0.2g)<Table 7> Content of Existing Heavy Metals Contained in Modified High-peptide Pectin Samples (mg / 0.2g)
표 7에서 보는 바와 같이 구리(Cu) 함량은 6개 시료 평균치가 0.002㎎/0.2g 범위이며 납(Pb), 카드뮴(Cd), 및 수은(Hg)은 없는 것으로 분석되었다. 반면에 칼슘(Ca) 및 칼륨(K)의 함량이 다른 무기질 보다 많이 함유되어 있는 것으로 분석되었다.As shown in Table 7, the copper (Cu) content was analyzed to be the average of six samples in the range 0.002 mg / 0.2g, free of lead (Pb), cadmium (Cd), and mercury (Hg). On the other hand, the content of calcium (Ca) and potassium (K) was analyzed to contain more than other minerals.
< 실험 4-2 > 변형고추펙틴(MCP)과 중금속과의 킬레이트 상호작용(Chelate Interaction)실험Experiment 4-2 Chelate Interaction of Modified High-Perfect Pectin (MCP) and Heavy Metals
도 17은 본 발명의 변형고추펙틴-구리 이온 착물(MCP-Copper Complex)반응 후 침전물과 상등액 중의 구리 이온(Cu ion)함량을 비교한 그래프이다.Figure 17 is a graph comparing the copper ion content of the precipitate and the supernatant after the MCP-Copper Complex reaction of the present invention.
본 실험에서는 Cu(NO3)2ㆍ2,5H2O를 0.001M 용액과 효소, 산, 알칼리로 분해하여 얻은 변형고추펙틴(MCP) 0.2% 용액을 반응 시켰을 때 도 14와 같이 시료인 변형고추펙틴(MCP)은 대조구(control)에 비해 복합체 형성 비율이 높았으며 특히 알칼리 처리 변형고추펙틴(MCP)에서는 100%에 가까운 착화합물을 형성하였다.In the present experiment, when a Cu (NO3) 2,2,5H2O was decomposed with a 0.001M solution and 0.2% modified Gopectin (MCP) solution obtained by decomposition with enzymes, acids, and alkalis, the modified Gopectin (MCP) sample, as shown in FIG. ) Had a higher complex formation rate than the control, and in particular, alkaline-modified high-peptide pectin (MCP) formed close to 100% complexes.
< 실험 4-3 > 변형고추펙틴(MCP)의 분자량 분획물인 저분자 변형고추펙틴(Low molecular MCP)과 구리 이온(Cu ion)과의 킬레이트화(Chelation) 경향<Experiment 4-3> Chelation of low molecular weight MCP and Cu ion, which is the molecular weight fraction of modified gopectin (MCP)
도 18은 효소, 산 및 알칼리로 변형시킨 저분자 변형고추펙틴과 0.01M 구리 이온 용액을 반응시킨 후 침전물과 용액 중의 구리 이온을 ICP 스펙트로포토메터로 분석한 그래프이다. 도 18에서 보는바와 같이 본 발명의 변형고추펙틴과 구리 이온을 착화합물(MCP-Copper Complexes) 반응을 시켰을 때 0.001M 농도와 같이 알칼리 변형고추펙틴은 100%에 가까운 흡착이 이루어진다는 것을 알 수 있다. FIG. 18 is a graph of ICP spectrophotometer analyzing precipitates and copper ions in a solution after reacting a low molecular weight modified high-peptectin modified with an enzyme, an acid and an alkali with a 0.01 M copper ion solution. As shown in FIG. 18, when the modified gopectin and copper ions of the present invention were reacted with a complex compound (MCP-Copper Complexes), the alkaline modified gopectin was found to have an adsorption close to 100% as in a concentration of 0.001 M.
도 19에서 보는 바와 같이 변형고추펙틴(MCP)을 몇 가지 범위의 분자량으로 분획한 저분자 변형고추펙틴(Low molecular MCP)과 0.001M 구리 이온(Cu ion)과의 반응에서는 분자량 100kDa에서는 97%범위이었고 50-100kDa 범위에서는 94%, 30-50kDa 범위에서는 89%, 10-30kDa 범위에서는 86%, 10kDa 이하에서는 86% 범위로서 분자량이 낮을수록 흡착율이 다소 감소하였다. 그러나 변형고추펙틴의 분자량이 낮은 조건에서 생체 내에 흡수가 가능하다면 기능성은 매우 탁월한 것으로 평가할 수 있다.As shown in FIG. 19, the low molecular weight modified high peak pectin (MCP), which was fractionated into several ranges of molecular weight, was reacted with low molecular weight MCP and 0.001M Cu ion, which was in the range of 97% at a molecular weight of 100 kDa. In the 50-100kDa range, 94%, 30-
< 실시예 5 > 변형고추펙틴(MCP)의 면역성 증진 효과Example 5 Immune Enhancement Effect of Modified High-Perfect Pectin (MCP)
< 실험 5-1 > 실험쥐를 이용한 항염증효과 확인<Experiment 5-1> Confirmation of anti-inflammatory effect using mice
Balb/c 실험쥐 5주령을 구입하여 2주간 환경에 적응시킨 후 3주간 2.0% 수준으로 고추추출물을 첨가한 사료를 자유 급식하였다. 실험 종료 6시간 전 LPS 용액을 복강투여 후 마취하여 복대정맥으로부터 채혈하여 TNF-α 시료로 하였다. 별도 로 간장을 분리하여 SOD, catalase 활성 및 glutathione 및 간장과산화지질함량을 측정하기 위한 시료로 하였다.Balb / c rats were purchased at 5 weeks of age and were acclimated to the environment for 2 weeks and fed freely with red pepper extract at 2.0% level for 3 weeks. Six hours before the end of the experiment, the LPS solution was intraperitoneally administered, anesthetized, and collected from the abdominal vein to obtain a TNF-α sample. Separately, the liver was separated and used as a sample for measuring SOD, catalase activity, glutathione and hepatic peroxide content.
도 20은 LPS를 처리한 실험쥐에서 고추 추출물의 TNF-α 발현 억제효과를 , 도 21은 LPS를 처리한 실험쥐의 간장에서 고 Superoxide dismutase 활성유도효과, 도 22는 LPS를 처리한 실험쥐의 간장에서 고추가공물의 과산화지질 생성억제효과 를 도시한 것이Figure 20 shows the inhibitory effect of pepper extract TNF-α expression in LPS-treated mice, Figure 21 is a high superoxide dismutase activity induction effect in the liver of the rats treated with LPS, Figure 22 is LPS-treated mice Inhibitory effect on the production of lipid peroxide from red pepper in soy sauce
도 20에서 보는 바와 같이, 실험쥐에서 고추 가공물에 의한 TNF-α의 생성억제 정도는 고추 가공물에 의해 분명하지 않았다. 도 21에서 보는 바와 같이, 채혈량의 부족으로 간장조직에서 SOD활성을 측정한 결과 Type Ⅲ-Ⅱ, Type L Ⅳ, Type L Ⅴ 시료에서 높은 활성을 보였다.As shown in FIG. 20, the degree of inhibition of TNF-α production by red pepper work in the rat was not obvious by the red pepper work. As shown in FIG. 21, as a result of measuring the SOD activity in the liver tissues due to the lack of blood collection, high activity was observed in Type III-II, Type L IV, and Type L V samples.
한편 간장에서의 과산화지질농도는 LⅣ 및 LⅤ 시료에서 현저하게 낮았다. 이러한 결과는 간장 중 SOD 효소활성과 어느 정도에서 일치하는 결과를 보이는 것이다. 따라서 고추가공물 LⅣ 및 LⅤ 는 항산화효과가 높은 것으로 판단되었다.Lipid peroxide levels in liver were significantly lower in LIV and LV samples. These results are in some agreement with the SOD enzyme activity in the liver. Therefore, red pepper products LIV and LV were considered to have high antioxidant effects.
< 실험 5-2 > Raw264.7 세포(cell)를 이용한 시토킨 생성억제효과 확인<Experiment 5-2> Confirmation of cytokine production inhibitory effect using Raw264.7 cells
강원대부설 혈관연구소로부터 분양받은 Raw264.7 세포를 DMEM 배지에서 배양 후, MTT실험으로 투여 추출물의 유효농도를 결정한 후, 24 well plate에 세포를 분주 후 세포가 90% confluent 할 때, 고추추출물을 최종농도로 0.01% 로 하여 처리 1시간 뒤, LPS(1㎍/ml medium)를 첨가 24시간 후 배지를 모아 nitric oxide 활성측정을 하였다. 표 6에서 보는 바와 같이, Type 6-8 시료는 NO 생성량이 현저하게 낮 았다. 이러한 결과는 마우스에서 분명하게 나타나지 않은 TNF-α 생성량을 보완하는 의미가 있으며, Type 8은 Type 5와 동일한 가공물로 의미 있는 시료로 판단된다.After culturing Raw264.7 cells from Kangwon University vascular incubator in DMEM medium, the effective concentration of the extract was determined by MTT experiment. After dispensing the cells in 24 well plates, the red pepper extract was finalized when the cells were 90% confluent. After 1 hour of treatment with 0.01% of the concentration, LPS (1 µg / ml medium) was added 24 hours after the addition of the medium, and nitric oxide activity was measured. As shown in Table 6, the Type 6-8 samples showed significantly lower NO production. These results have the meaning of complementing the amount of TNF-α that is not clearly seen in the mouse,
< 표 8 >Raw264.7 세포에서 고추가공물에 의한 Nitric oxide 생성억제정도<Table 8> Inhibition of Nitric Oxide Formation by Red Pepper Processing in Raw264.7 Cells
표 8에서 보는바와 같이 Nitric oxide의 생성억제 정도는 시료 Type 6, Type 7 및 Type 8에서 평균 83% 억제성이 나타났으며 이것은 control에 비해 약 17%의 억제 효과가 있음을 알 수 있다.As shown in Table 8, the inhibition of nitric oxide production was 83% in the average of Type 6, Type 7 and
도 22에서 보는바와 같이 간장에서의 과산화지질 농도는 LⅣ 및 LⅤ 시료에서 현저하게 낮았다. 이러한 결과는 간장중 SOD 효소활성과 어느 정도에서 일치하는 결과를 보이고 있다. 따라서 고추가공물 LⅣ 및 LⅤ는 항산화효과가 높은 것으로 평가된다.As shown in Figure 22, the lipid peroxide concentration in the liver was significantly lower in the LIV and LV samples. These results are in agreement with the SOD enzyme activity in the liver to some extent. Therefore, red pepper products LIV and LV have high antioxidant effects.
표 9에서 보는 바와 같이 간장이나 비장에서 추출물의 과산화지질가 저하효과는 관찰되지 않았으나, 혈청 중 과산화 지질 량은 크게 감소하였다.As shown in Table 9, the lipid peroxide lowering effect of the extract was not observed in the liver or spleen, but the amount of lipid peroxide in the serum was greatly reduced.
< 표 9 > 흰쥐에 있어서 간장, 비장, 혈청 중의 과산화지질가<Table 9> Lipid Peroxide Values in Liver, Spleen and Serum of Rats
이상 본 발명자에 의해서 이루어진 상기 실시예에 따라 구체적으로 설명하였지만 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경가능한 것은 물론이다.Although the present invention has been described in detail according to the above embodiments made by the present inventors, the present invention is not limited to the above embodiments and can be modified in various ways without departing from the gist of the present invention.
도 1은 고춧가루로부터 캅사이신(Capsaicin)분리 및 알코올불용물(AIS)로부터 5종의 펙틴(Pectin)시료를 추출하는 공정도를 도시한 것이다.Figure 1 shows a process for extracting capsaicin (Capsaicin) separation from the red pepper powder and five pectin (Pectin) samples from alcohol insolubles (AIS).
도 2는 본 발명의 고춧가루 알코올불용물을 시료로 하여 3가지 용매로 펙틴물질을 추출하는 공정도이다.2 is a process chart of extracting a pectin substance with three solvents using red pepper powder insoluble matter of the present invention as a sample.
도 3은 본 발명에 따른 물, 옥살산암모늄(ammonium oxalate), 염산(HCl)으로 추출했을 때 얻어진 펙틴(Pectin)의 수율 그래프이다.Figure 3 is a graph of the yield of pectin (Pectin) obtained when extracted with water, ammonium oxalate (ammonium oxalate), hydrochloric acid (HCl) according to the present invention.
도 4는 본 발명의 3가지 용매인 물, 옥살산암모늄(ammonium oxalate), 염산(HCl)으로 추출하여 얻어진 펙틴(pectin) 분말 중의 갈락투론산(GA) 함량 비교 그래프이다. 4 is a graph comparing galacturonic acid (GA) content in pectin powder obtained by extraction with three solvents of the present invention, water, ammonium oxalate and hydrochloric acid (HCl).
도 5는 본 발명의 3가지 용매인 물, 옥살산암모늄, 염산으로 추출하여 얻어진 펙틴 분말 중의 총 탄수화물의 함량을 비교한 그래프이다. 5 is a graph comparing the total carbohydrate content in the pectin powder obtained by extraction with three solvents of the present invention, water, ammonium oxalate and hydrochloric acid.
도 6은 검정곰팡이로 배양하는 동안 시간별로 측정한 총산(total acid)의 함량 비교 그래프이다.Figure 6 is a graph comparing the content of total acid (time total) measured during incubation with black mold.
도 7은 검정곰팡이 배양과정 중 메탄올의 시간별 측정치 비교 그래프이다.Figure 7 is a graph comparing the measurement of the hourly methanol during the black mold culture process.
도 8은 검정곰팡이 배양액 중 폴리갈락투로나제 활성도를 측정한 결과 그래프이다.8 is a graph showing the results of measuring polygalacturonase activity in the black mold culture.
도 9는 본 발명에 따른 산 가수분해에서 생성되는 용해성 펙틴(Pectin) 및 비용해성 펙틴(Pectin)의 수율비교 그래프이다.Figure 9 is a graph of yield comparison of soluble pectin (Pectin) and insoluble pectin (Pectin) produced in the acid hydrolysis according to the present invention.
도 10은 본 발명에 따른 알칼리(Alkali)로 가수분해하여 재가공한 변형펙틴 (Modified Pectin)의 수율비교 그래프이다.Figure 10 is a graph of yield comparison of modified pectin (Modified Pectin) hydrolyzed with alkali (Alkali) according to the present invention.
도 11은 본 발명에 따른 시간별로 산가수분해하여 가공한 고추변형펙틴(MCP) 중의 갈락투론산(GA) 함량 비교 그래프이다.11 is a graph comparing galacturonic acid (GA) content in red pepper modified pectin (MCP) processed by acid hydrolysis according to time according to the present invention.
도 12는 본 발명에 따른 시간별로 알칼리(alkali) 가수분해하여 에탄올 농도별로 가공한 변형고추펙틴(MCP) 중의 갈락투론산(GA) 함량비교 그래프이다.FIG. 12 is a graph comparing galacturonic acid (GA) content in modified Gopectin (MCP) hydrolyzed by alkali according to the present invention and processed by ethanol concentration.
도 13은 Vivaflow 50 멤브레인 여과기의 단일모듈을 도시한 그래프이다.FIG. 13 is a graph showing a single module of a Vivaflow 50 membrane filter.
도 14는 물 추출물로부터 65%에탄올, 85%에탄올로 침전시킨 고추펙틴의 분자량 분포를 나타낸 그래프이다.14 is a graph showing the molecular weight distribution of pepper pectin precipitated with 65% ethanol, 85% ethanol from the water extract.
도 15는 본 발명의 용매별로 추출하여 얻은 고추펙틴의 분자량 분포를 비교한 그래프이다.15 is a graph comparing the molecular weight distribution of pepper pectin obtained by extraction for each solvent of the present invention.
도 16a는 효소로 변형시킨 저분자 변형고추펙틴(Low molecular MCP) 분말을 65% 에탄올로 분리하여 분자량별로 갈락투론산(GA) 함량 분포를 나타낸 그래프이다. Figure 16a is a graph showing the distribution of galacturonic acid (GA) content by molecular weight by separating the low molecular weight modified high peak pectin (Low molecular MCP) powder modified by enzyme with 65% ethanol.
도 16b는 효소로 변형시킨 저분자 변형고추펙틴(Low molecular MCP) 분말을 85% 에탄올로 분리하여 분자량별로 갈락투론산(GA) 함량 분포를 나타낸 그래프이다.Figure 16b is a graph showing the distribution of galacturonic acid (GA) content by molecular weight by separating the low molecular weight modified high peak pectin (Low molecular MCP) powder modified by enzyme with 85% ethanol.
도 17은 본 발명의 변형고추펙틴-구리 이온 착물(MCP-Copper Complex)반응 후 침전물과 상등액 중의 구리 이온(Cu ion)함량을 비교한 그래프이다.Figure 17 is a graph comparing the copper ion content of the precipitate and the supernatant after the MCP-Copper Complex reaction of the present invention.
도 18은 본 발명의 효소, 산 및 알칼리로 변형시킨 저분자 변형고추펙틴과 0.01M 구리 이온 용액을 반응시킨 후 침전물과 용액 중의 구리 이온을 ICP 스펙트 로포토메터로 분석한 그래프이다.FIG. 18 is a graph of an ICP spectrophotometer analyzing the precipitates and copper ions in the solution after reacting a low molecular weight modified high-peptectin modified with an enzyme, acid and alkali of the present invention with a 0.01 M copper ion solution.
도 19는 본 발명의 분자량별로 분획한 변형고추펙틴과 구리 이온의 착화합물(MCP-Cadmium Complexes) 반응 후 침전물과 상등액 중의 구리이온 함량을 비교한 그래프이다.19 is a graph comparing the copper ions content in the precipitate and the supernatant after the reaction of the modified gopectin fractionated by the molecular weight of the present invention and the copper ion complex (MCP-Cadmium Complexes).
도 20은 LPS를 처리한 실험쥐에서 고추 추출물의 TNF-α 발현 억제효과를 도시한 것이다.Figure 20 shows the inhibitory effect of TNF-α expression of pepper extract in mice treated with LPS.
도 21은 LPS를 처리한 실험쥐의 간장에서 고 Superoxide dismutase 활성유도효과를 도시한 것이다.Figure 21 shows the effect of inducing high Superoxide dismutase activity in the liver of mice treated with LPS.
도 22는 LPS를 처리한 실험쥐의 간장에서 고추가공물의 과산화지질 생성억제효과를 도시한 것이다.Figure 22 shows the inhibitory effect of lipid peroxide production of the red pepper in the liver of rats treated with LPS.
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