KR100916949B1 - 올리고뉴클레오티드 유사체의 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 실질적인 양, 바람직하게는 50% 이상의 하전되지 않은 서브유닛을 갖는 올리고뉴클레오티드 유사체를 분리하고, 정량하고 또는 단리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 분리의 크로마토그래피 또는 전기이동법에 관한다.
수많은 하전된-기반 분리 방법이 핵산 및 대부분의 단백질과 같이 중성 또는 중성에 가까운 pH에서 전하를 갖는 바이오폴리머와의 사용에 이용가능하다. 이들은 예를 들어, 전기이동, 등전 집중화, 및 이온 교환의 다양한 모드를 포함한다. 그러나, 그러한 방법들은 일반적으로 분자들의 먼저의 이온화없이 실질적으로 하전되지 않은 올리고뉴클레오티드 유사체에는 채용될 수 없다. 예를 들어, 하전되지 않은 올리고뉴클레오티드의 이온 교환 분리의 현 방법들은 G와 T 염기가 이온화되는 높은 pH(>11)에서, 또는 C와 A 염기가 이온화되는 낮은 pH(<3) 중의 하나에서 분자의 이온화를 필요로 한다. 예를 들어, 포스포라미데이트- 또는 포스포로디화미데이트-연결된 올리고머와 같은, 일부 하전되지 않은 올리고뉴클레오티드 유사체는 이들 낮은 pH에서 안정하지 않다. 따라서,가벼운 조건하에서 중성 또는 중성에 가까운 pH에서 수행될수 있는 그러한 하전되지 않은 분자들의 분리 방법이 필요하 다.
발명의 개요
본 발명은 한가지 양태에서, 올리고머 검체(analyte) 분자의 집단을 분석하고/또는 분리하는 방법을 포함하는데, 여기서 분자들이 그것의 50% 이상이 중성 또는 중성에 가까운 pH에서 하전되지 않은 연결된 서브유닛으로 구성되고, 핵산 또는 하전된 핵산 유사체인 특정 프로브 분자와 함께 Watson-Crick 염기 쌍을 통해 혼성화될 수 있다. 방법은 전하를 갖는 분리 매질에 프로브의 상보성 또는 상보성에 가까운 지역 및 하나 이상의 검체 분자가 안정적으로 혼성화되도록하는 조건하에서, (i)검체 분자의 집단과 (ii)프로브의 혼합물을 적용하고, 그로써 프로브-검체 이중체, 단일-가닥 검체, 단일 가닥 프로브, 및 그들의 조합으로부터 선택된 종들의 혼합물을 형성하고, (b)매질내에서 종들을 분리하는 단계들을 포함한다.
바람직하게는, 프로브는 다른 검체 분자와 함께 그것의 이중체가 핵산의 혼성화되지 않은 부분의 존재, 길이 또는 위치의 관점에서 다르도록 하는 길이와 서열을 갖는다. 검출 목적을 위해, 프로브는 바람직하게는 형광 라벨, 예를 들어, 플루레신으로 표지화된다. 라벨은 전형적으로는 프로브의 말단, 예를 들어, 5' 말단에 있다.
전형적인 분리에서, 각각의 검체 분자는 선택된 서열, 선택된 서열의 다른 길이 단편들, 선택된 서열의 내부 결손 또는 삽입 변체, 선택된 서열의 돌연변이 변체, 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖 는다. 그러한 결손, 삽입 또는 돌연변이 변형은 일반적으로 선택된 서열의 8개의 뉴클레오티드 당 하나 이하의 그러한 결손 또는 돌연변이 변체를 함유한다. 한가지 구체예에서, 변체는 선택된 서열의 단일 뉴클레오티드 변체이다.
프로브는 선택된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 한가지 구체예에서, 프로브는 선택된 서열과 동일하거나, 또는 불과 25% 더 큰 길이를 갖는다. 프로브는 또한 가장 긴 검체 분자보다 더 짧을 수 있지만, 그것은 분리의 조건하에서 하나 이상의 검체 분자와 함께 안정적인 이중체를 형성하기에 효과적인 길이이다. 실시예는 검체 분자들 사이에서 길이 및/또는 서열의 변형은 주어진 하위영역 내에서, 예를 들면 검체 분자의 말단이나 근처에서 일어나고, 프로브가 분석의 조건하에서 이 하위영역에 안정적으로 혼성화되는인 효과적인 분리이다. 바람직하게는, 프로브는 검체 분자의 대다수 또는 모두를 갖는 안정적인 이중체를 형성하기에 효과적이고, 그러한 이중체는 전하를 갖는 매질안에서 각각으로부터 그리고 단일 가닥 종들로부터 분리된다.
예를 들어, 집단은 선택된 서열의 N-1 결손 변체인 검체 분자들을 함유할 수 있고, 프로브는 결손 부위를 함유하는 검체 분자의 지역에서, 분리의 조건하에서, 적어도 대다수의 그러한 검체 분자들로 안정적으로 혼성화하기 위해 효과적이다.
또다른 구체예에서, 프로브는 선택된 서열의 N-1 결손 변체의 것과 동일한 서열과 길이를 가지고, 분석 조건은 프로브가 오직 N-1 결손 변체로 혼성화하도록 한다.
더 나아간 구체예에서, 길이 및/또는 서열 변화가 일어나는 하위영역은 검체 분자의 말단 또는 그 근처이고, 프로브는 상기 검체 말단으로 혼성화하는 말단에서 표지화 부분을 포함한다. 표지화 부분은 바람직하게는 플루레신과 같은 형광 부분이다.
전하를 갖는 지지물은 이온 교환 매질가 될 수 있고, 여기서 분리의 단계(b) 는 매질 또는 전기이동 매질를 통해 용리제를 통과하는 것을 포함하는데, 여기서 분리의 단계(b)는 매질의 반대 경계들 사이에 전기장을 가하는 것을 포함한다. 전기 이동 매질은 체가름 아닌 매질가 될 수 있다. 매질은 또한 중첩된 pH 구배를 포함하는, 즉, 등전 집중화에 사용하기위한 것이 될 수 있다.
바람직하게는, 검체 분자는 75% 이상이 하전되지 않은 연결된 서브유닛으로 구성된다; 한가지 구체예에서, 모든 서브유닛은 하전되지 않는다. 검체 분자의 예는 펩티드 핵산, 포스포트리에스테르 올리고뉴클레오티드, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드, 모르폴리노 올리고머, 상기 그룹중의 어떤 멤버와 또다른 멤버의 키메라, 또는 상기 그룹중의 어떤 멤버와 DNA, 2'-O-알킬 RNA 또는 2'-O-알릴 RNA의 키메라를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 검체 분자는 바람직하게는 포스포라미데이트 및/또는 포스포로디아미데이트 서브유닛간의 연결을 갖는 모르폴리노 올리고머이다. 프로브는 바람직하게는 DNA, RNA, 2'-O-알킬 RNA, 2'-O-알릴 RNA, 포스포로티오에이트 DNA, 또는 이들중 어떤것의 키메라이고, 가장 바람직한것은 DNA이다. 분리를 수행하는데 있어서, 프로브는 바람직하게는 집단에서 모든 검체 분자로 혼성화하는데 필요한 것보다 더 큰 농도로 혼합물에 존재한다.
한가지 구체예에서, 방법은 집단에서 하나 이상의 표적 검체 분자로 표지화된 프로브의 이중체를 검출하고 정량하는 단계를 더욱 포함한다. 또다른 구체예에서, 방법은 하나 이상의 프로브/검체 이중체를 단리하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 목적 및 특징들은 포함된 도면과 함께 본 발명의 하기 상세한 설명을 읽으면 보다 완전히 명백해질 것이다.
도 1은 모르폴리노 올리고머에 적합한 5-원자(A), 6-원자(B) 및 7-원자(C-E) 연결 기를 갖는 몇가지 바람직한 서브유닛을 나타낸다.
도 2A-A 내지 2E-E는 각각 도 1의 서브유닛 A-E 를 사용하여 구성된, A-A 내지 E-E로 표시된, 예시의 모르폴리노 올리고머의 반복 서브유닛 단편을 나타낸다.
도 3은 전체 길이 검체 올리고머의 길이와 동일한 길이를 갖는, 상보적 하전된 핵산, 예를 들어, DNA로 다른 길이의 하전되지 않은 검체 올리고머를 혼성화하는 것을 보여준다.
도 4A는 검체 분자의 절단된 말단에 안정적으로 혼성화하기에 충분한 길이를 가지고, 선택적인 비혼성화 단편(NNNN으로 표시)을 함유하는, 상보성 하전된 핵산, 예를 들어, DNA로 다른 길이의 하전되지 않은 검체 올리고머를 혼성화하는 것을 보여준다.
도 4B는 결손이 일어나는 검체 분자의 지역으로 안정하게 혼성화하기에 충분한 길이를 갖는, 상보성의 하전된 핵산, 예를 들어, DNA로 결손 변체 하전되지 않은 검체 올리고머를 혼성화하는 것을 보여준다.
도 5A-5B는 13- 내지 20-머 모르폴리노 올리고머를 갖는 DNA의 이중체의 음 이온 교환에 의한 분해를 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.
도 6-9는 20-머 모르폴리노 올리고머의 다양한 N-1 결손 서열을 갖는 DNA의 이중체의 음이온 교환 보유 시간을 나타내는 HPLC 크로마토그램의 오버레이이다(도 6, N-A; 도 7, N-C; 도 8, N-G ; 및 도 9, N-T).
도 10은 피크 영역 대 20-머 PMO 검체 및 15-머 PMO 내부 표준의 농도를 나타내는 눈금보정 곡선이고, 그 구조가 도 11에 나와있고;
도 12는 내부 표준: DNA 이중체 및 초과량 DNA으로부터 DNA와 함께 그것의 이중체의 분해에 의한, 플라즈마 샘플에서 약 10 ng의 표적 PMO의 검출을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.
도 3에서, 하기의 서열이 사용된다: 처음 "하전되지 않은" 서열은 여기서 SEQ ID NO: 1로 나타내는 ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC이다. (이 서열은 Genbank Acc. No. X00196.의 뉴클레오티드 2551-2570 에 해당하는, 인간 c-myc 유전자 서열에 대한 안티센스이다) 도면에서 "하전된" 모든 서열은 SEQ ID NO: 1의 보충물이다. 도 3의 이어지는 "하전되지 않은" 서열은 여기서 SEQ ID NO: 3 (ACG TTG AGG GGC ATC GTC), SEQ ID NO: 4 (ACG TTG AGG GGC ATC G), SEQ ID NO: 5 (ACG TTG AGG GGC AT), SEQ ID NO: 6 (GTT GAG GGG CAT), 및 SEQ ID NO: 7 (TGA GGG GCA TCG TCG C)으로 나타내는, SEQ ID NO: 1의 단편들이다.
도 4A에서, 하기의 서열이 사용된다: 첫번째 "하전되지 않은" 서열은 여기서 SEQ ID NO: 1로 나타내는 ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC이다. 도 4A에서, 이어지는 "하전되지 않은" 서열은 여기서 SEQ ID NO: 3 (ACG TTG AGG GGC ATC GTC) 및 SEQ ID NO: 4 (ACG TTG AGG GGC ATC G)로 나타내는, SEQ ID NO: 1의 단편이다. 이 도면에서 "하전된" 서열의 모두는 SEQ ID NO: 1 더하기 추가적인 서열 NNNN의 보충물의 단편이고, 단 N은 여기서 SEQ ID NO: 8 (NNNN GCG ACG ATG CCC, 5'내지 3'이라 쓰여진)으로 나타내는, 어떠한 뉴클레오티드이다.
도 4B에서, 하기 서열이 사용된다:첫번째 "하전되지 않은" 서열은 여기서 SEQ ID NO: 1으로 나타내는, ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC이다. 도 4B에서 이어지는 "하전되지 않은" 서열은 여기서 SEQ ID NO: 10 (ACG TTG AGG GGC ATC TCG C)으로 나타내는 SEQ ID NO: 1의 결손 변체이다. 도면에서 "하전된" 서열 두가지 모두 여기서 SEQ ID NO : 9 (CGA CGA TGC C, 5' 내지 3'이라 씀)으로 나타내는, SEQ ID NO: 1의 보충물의 단편이다.
본 발명의 상세한 설명
1.정의
하기 용어는 달리 지시되지 않으면 하기의 의미를 갖는다.
여기에서 사용된 바와 같이 "올리고머" 분자는 약 8 내지 100, 바람직하게는 약 10 내지 50, 및 보다 바람직하게는 약 10 내지 30, 뉴클레오티드 서브유닛을 갖는 올리고뉴클레오티드 유사체이다.
올리고뉴클레오티드 또는 그들의 유사체는 2개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 유사체 사이에서 혼성화 또는 이중체 형성이 일어날때 서로에게 "상보적"이라고 말한다. 상보성(하나의 올리고뉴클레오티드 또는 유사체가 다른 것과 상보성인 정도)는 일반적으로 수용되는 염기-쌍 법칙에 따라, 서로 수소 결합을 형 성하도록 예상되는 반대 가닥에서 염기의 비율의 관점에서 정량가능하다. 본 발명의 배경에서, 예를 들어, 하나 이상의 미스매치 또는 결손을 포함하여, 하전된 올리고머 프로브와 하전되지 않은 검체 사이에 형성된 이중체가 이중체 형태에서 분리 매질로부터 용출되기에 충분히 안정적인 한, 하전된 핵산 또는 유사체는 검체 서열에 100% 상보성이 될 수 있거나, 또는 그것은 상보성에 가까울 수 있다. 그러한 경우에, 프로브와 검체는 분석의 조건하에서 "안정적으로 혼성화"되거나 또는 "안정적인 이중체"를 형성한다. 특히, PMO의 N-1 결손 서열은 하기에 나타낸 바와 같이, N-머 하전된 핵산으로 혼성화함으로써 분리가능한 것으로 발견되었다.
이중체에서, DNA의 "혼성화되지 않은" 단편, 또는 또다른 하전된 올리고머는 결손 또는 미스매치 부위에서 내부 "루프"는 물론이고 말단 단일 가닥 부분을 말할 수 있다. (예를 들어, 도 4B)
올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 "서브유닛"은 올리고머의 하나의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 단위를 말한다. 그 용어가 비록, "하전된 서브유닛"을 말할때, 전하는 전형적으로 서브유닛간의 연결내에 존재하지만(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결), 용어는 부착된 서브유닛간의 연결이 있거나 없는 뉴클레오티드 유닛을 말할 수 있다.
여기서 사용된 바와 같이 "하전되지 않은" 서브유닛은 약 5 내지 9의 pH 범위에 해당하는, 중성 또는 중성에 가까운 pH에서 하전되지 않는 것이다. 서브유닛 연결은 또한 이 범위 바깥에 있는 pH에서 하전되지 않은 채로 남아있을 수 있다. 그러나, pH는 C와 A 염기가 이온이 되는 값(약 3)보다 크고 G와 T 염기가 이온화되 는 값(약 11) 보다 작아야 한다. 여기서 개시된 분석은 바람직하게는 상기한 바와같이, 중성 또는 중성에 가까운 pH에서 실행된다. 플루레신 라벨이 사용될 때, 온화하게 염기성인 pH(즉, 7 내지 9)가 바람직하다.
"하전된" 서브유닛은 위에서 정의된 바와 같이 중성 또는 중성에 가까운 pH에서 하전된다. 예는 포스포디에스테르(고유한 DNA) 또는 포스포로티오에이트-연결된 서브유닛이다.
"모르폴리노 올리고머"는 도 1에 나타낸 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성되는 올리고뉴클레오티드 유사체인데, 여기서 (i)구조는 인-함유 연결에 의해 함께 연결되고, 1 내지 3 원자 길이의, 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접한 서브유닛의 5' 외향고리 탄소에 결합시키고, (ii) Pi 및 Pj는 염기-특이성 수소 결합에 의해, 폴리뉴클레오티드에서 염기에 결합하는데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 부분이다. 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 부분은 전형적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 또는 티민이다. 모르폴리노 올리고머의 합성, 구조 및 결합 특성은 미국 특허 Nos. 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, 및 5,506,337에 상세히 기술되고, 그들 모두는 여기에 참고문헌으로 포함된다.
도 1B에 나타낸 서브유닛은 도 2에 B-B에 나타낸 바와 같이, 6-원자 반복-단위 백본에 사용된다. 이들 구조에서, 5' 모르폴리노 탄소를 인 기에 연결하는 원자 Y1 는 황, 질소, 탄소 또는 바람직하게 산소가 될 수 있다. 인으로부터의 X 부분 한쪽은 염기-특이성 수소 결합과 상충하지 않는 어떠한 안정적인 기이다. 바람직한 기는 고리 아민을 포함하여, 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 및 알킬 아미노를 포함하고, 그들 모두는 염기-특이성 결합이 붕괴되지 않는한, 다양하게 치환될 수 있다. 알킬, 알콕시 및 티오알콕시는 바람직하게는 1-6 탄소 원자를 포함한다. 알킬 아미노는 바람직하게는 저급 알킬(C1 내지 C6) 치환을 말하고, 사이클릭 아민은 바람직하게는 산소, 질소 및 황으로부터 선택되는 1-2 추가 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 5- 내지 7-원 질소 헤테로고리이다. Z는 황 또는 산소이고, 바람직하게는 산소이다.
바람직한 모르폴리노 올리고머는 도 2B-B에 나타낸 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성되고, 여기서 구조는 포스포로디아미데이트 연결에 의해 함께 연결되는데 (여기서 X=NH2, NHR, 또는 NR2 (여기서 R 은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸), Y=O, 및 Z=O), 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접 서브유닛의 5' 외향고리 탄소에 연결하고, Pi 및 Pj는 염기-특이성 수소 결합에 의해, 폴리뉴클레오티드에서 염기에 결합하는데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 부분이다. 또한 대신의 포스포로디아미데이트 연결을 갖는 구조가 바람직한데, 도 2B-B에서, 메톡시 또는 에톡시와 같은 X=저급 알콕시, Y=NH 또는 NR, 여기서 R은 저급 알킬이고, Z=O이다.
"펩티드 핵산"에서, 올리고뉴클레오티드 백본의 데옥시리보스 포르포디에스테르 단위는 폴리아미드 연결로 대체된다. 적절한 백본 간격은 메틸렌카르보닐 기 를 통해 각각의 2-아미노 기에 부착된 뉴클레오티드 염기와 함께, 2-아미노에틸 글리신 단위의 사용에 의해 얻어진다.
"2'-O-알킬(또는 알킬) 변형된 올리고뉴클레오티드"는 2' 히드록실이 각각 알릴 또는 알킬 에테르로 변환되는 올리고리보뉴클레오티드이다. 알킬 에테르는 전형적으로 메틸 또는 메톡시에틸 에테르이다.
"알킬"은 탄소와 수소를 함유하는 완전히 포화된 비고리 1가의 라디칼을 말하고, 이는 분지상 또는 스트레이트 사슬이 될 수 있다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, n-부틸, t-부틸, n-헵틸, 및 이소프로필이다. "저급 알킬"은 메틸, 에틸, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 및 t-부틸에 의해 예증되는 바와 같이, 1 내지 6 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 4 탄소 원자의 알킬 라디칼을 말한다.
II. 분리 방법
본 발명은 여기서 검체 분자라고 부르는, 실질적으로 하전되지 않은 올리고머 분자의 집단을 분리하고/또는 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명의 문맥에서, "실질적으로 하전되지 않은" 올리고머 분자는 모든 서브유닛이 하전되지 않거나(중성 또는 중성에 가까운 pH, 즉, 약 5 내지 약 9), 또는 충분한 수가 하전되지 않아서, 하전된 올리고머(예를 들어, DNA)를 갖는 다른 길이 검체 분자의 이중체가 여기서 기술된 분리 방법에 의해 분리가능하도록 하는 분자이다. 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 및 가장 바람직하게는 90% 이상의 서브유닛이 하전되지 않는다. 한가지 구체예에서, 폴리머의 모든 서브유닛은 하전되지 않는다. 검체 분자는 그들이 Watson-Crick 염기 쌍을 통해, 상보성 프로브에서 염기와 혼성 화하는데 효과적인 염기-쌍 부분의 서열을 지지하는 백본을 포함한다는 의미에서, 올리고뉴클레오티드 유사체이다.
동일한 "부모" 서열(N-머)의 다른 길이 단편의 혼합물에서와 같이, 검체 분자는 전체 길이 폴리머의 합성 제조 또는 저하로부터 제조될 수 있기 때문에, 검체 분자는 다른 길이가 될 수 있다. 내부 삽입 변체는 물론이고, 내부 결손 변체 또는 돌연변이 변체 즉, 주어진 뉴클레오티드가 없거나 또는 각각 다른 분자로 치환되는 변체가 또한 존재할 수 있다. (N-1 또는 N+1 단편은 또한 각각 말단 결손 또는 말단 삽입으로 간주될 수 있다는 것을 주목하라). 그러한 변체는 전형적으로 약 8 뉴클레오티드 당 기껏해야 한개의 변체에 의해 "부모" 서열로부터 변한다. 한가지 구체예에서, 변체는 선택된 서열의 단일 뉴클레오티드 변체이다. 오직 다양한 위치에서 하나의 뉴클레오티드의 결손에 의해서만 서열이 다른, 즉, 다른 N-1 종의 선택된 서열인, 동일한 길이 올리고머의 분해가 하기 실시예에서 예증된다. 단일 위치 변체 서열의 분리는 또한 고려된다.
분리는 다양한 하전되지 않은 또는 실질적으로 하전되지 않은 올리고머 분자와 상보성의 하전된 올리고뉴클레오티드 프로브 (그것은 바람직하게는 DNA 분자이다) 사이에서의 이중체의 형성에 기반한다. 하기의 논의에서, 하전된 올리고뉴클레오티드 프로브는 DNA 라고 언급되지만; 그러나, RNA 또는 전하를 갖는 올리고뉴클레오티드 유사체는 또한 프로브로 사용될 수 있다는 것이 이해된다.
방법의 한가지 구체예에서, 검체 혼합물은 동일한 서열의 다른 길이 단편의 혼합물을 함유하고(이것은 전체 길이 서열을 포함할 수 있다), DNA 분자는 집단에 서 가장 긴 검체 분자의 예상된 길이와 동일하거나 다소 더 큰 길이이고, 가장 긴 검체 분자의 전체 길이에 대해 상보성인 (또는 상보성에 가까운) 서열을 가진다. (더 긴 예를 들어, 가장 긴 검체 분자보다 약 25% 더 긴 프로브가 사용될 수 있다) 검체 분자의 길이에 의존하여, 분자: DNA 이중체는 따라서 예를 들어, 완전히 이중 가닥이 되거나 또는 도 3에서 나타난 바와 같이, 일부 길이의 단일 가닥, 혼성화되지 않은 DNA를 포함할 것이다.
예로서, 주어진 서열을 갖는 모르폴리노 올리고머의 다른 길이 단편의 음이온 교환 HLPC 분리에 있어서, 하전되지 않은 단일 가닥 올리고머는, 음이온 교환 칼럼에서 최소로 보유될 것이다. 상보성 DNA는 하전된 포스포디에스테르 백본을 가지고 단일 가닥 형태로 구조적으로 제한되지 않는다. 따라서 그것은 양으로 하전된 정지 상과의 상호작용을 최대화할 수 있기 때문에, 칼럼에서 가장 길게 유지된다. (그러한 제한되지 않은 전하는 도 3에서 볼드체 음 전하로 표시된다.) 올리고머:DNA 이중체는 혼성화되지 않은 DNA와 동일한 전하를 가지만, 일부 또는 모든 DNA 백본은 구조적으로 이중 구조에 의해 강요되고, 그것은 정지된 상과 백본 전하의 최선의 상호작용을 막는다(도 3에서 볼드체가 아닌 음의 전하에 의해 나타낸 바와 같이). 따라서 이중체는 강요되지 않은 단일 가닥 DNA의 양에 의존하는 속도로, 비결합 PMO 와 DNA 사이에서 용출한다.
내부 결손 서열의 경우에, 비혼성화 루프의 DNA는 도 4B에 나타낸 바와 같이, 이중체에서의 다른 위치에서, 결손의 위치에서 일어날 것이다. 분해가 일반적으로 다른 길이 서열에 대해 그 만큼 크지 않지만, 여기서 이중체는 일부 길이의 단일 가닥 DNA를 포함하고, 그러한 결손 서열은 실시예 2에서 나타낸 바와같이, 또한 분해될 수 있다.
분리 공정은 또한 예상되는 가장 긴 검체 분자보다 더 짧은 DNA 분자를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 경우, DNA 분자는 검체 분자의 일부에 혼성화하는 서열을 갖는데, 여기서 일부분은 검체 분자들 사이의 변형이 예상되는 각각의 검체 분자의 영역을 포함하고, 안정적인 이중체를 형성하는데 효과적인 길이이다. 예를 들어, 검체 분자가 주어진 말단에서 절단에 의해 서로 다를 때, 생성되는 이중체는 도 4A에 예증되는 바와 같이, 하전된 DNA의 혼성화되지 않은 일부의 관점에서 다를 것이다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, DNA는 또한 짧은 비혼성화 말단 서열(도면에서 NNNN으로 나타냄)을 포함할 수 있다.
이러한 변형의 잇점은 특히, N-1 머 결손 서열의 분해에서의 예상되는 증가이다. 도 4A-B에서 나타낸 바와 같이, 상호작용을 분간하는데 관련된 "비특이성" 절단의 일부가 감소되기 때문에, 오직 절단 또는 결손을 함유하는 검체 분자의 일부에만 혼성화하는 DNA는 전체 분자에 혼성화하는 DNA보다 더 큰 분해를 제공할 것으로 기대된다. 따라서, 이러한 변형은 단일 말단에서 또는 올리고머의 특정 영역내에서 길이 및/또는 서열의 변형이 크게 일어날 것으로 기대되는 혼합물의 분해에 가장 적합하다.
또한 전체 길이 "부모" 올리고머의 그것으로부터 N-1 결손 변체 종의 이중체의 분리는 (1) 올리고머의 말단이나 그 근처에서(예를 들어, 5' 끝) 결손이 일어나고 (2)이중체를 형성하는데 사용된 프로브는 혼성화하는 말단에서(이 경우, 3' 끝) 예를 들어, 플루레신과 같은 형광 부분인 라벨링 부분을 함유할때, 강화된다는 것을 발견하였다. 유사하게 강화된 분리는 검체 올리고머의 3' 끝에서 또는 근처에서 N-1 결손이 일어날때 관찰되고, 프로브는 5' 끝에서 그렇게 표지화된다.
프로브는 또한 특별히 그 종들의 동일한 길이 및 서열의, 특정 N-1 종을 표적으로 할 수 있고, 분석은 프로브가 안정적으로 오직 N-1 종에만 혼성화하도록, 충분히 엄격한 혼성화 조건하에서 (전형적으로 온도에 관해서) 수행된다. 대안으로서, 프로브가 안정적으로 N-머 및 일부 다른 N-1 종에 혼성화할 수 있도록, 분석은 다소 덜 엄격한 조건하에서 수행될 수 있고, 이중체는 분리 매질를 갖는 전하와의 그들의 다른 상호작용을 기반하여 분리되었다.
분리 또는 분석을 수행하는데 있어서, 적절한 혼성화 조건하에서, 분리되는 분자의 집단과 하전된 프로브 분자의 혼합물, 바람직하게는 표지화된 DNA가 형성되고, 혼합물은 분리 매질, 바람직하게는, 음이온 교환 컬럼을 갖는 전하에 적용된다. DNA 프로브는 상보성 또는 상보성에 가까운 영역을 갖는 모든 검체 분자와 안정적으로 혼성화하는 것이 바람직할때, 프로브는 바람직하게 초과량으로 첨가된다. 이중체는 그후 매질내에서 중성 근처 또는 중성에 가까운 pH에서(약 5와 약 9 사이) 전형적으로 용출에 의해 분리된다.
분석은 일반적으로 그것이 분리동안에 이중 형태로 확실히 남아있도록, 원하는 검체의 이중체의 Tm 아래의 충분히 낮은 온도에서 수행된다. 바람직하게는, 이 온도는 가장 낮은 예상 Tm의 약 20°아래이다. 그러나, 더 높은 온도는 엄격함을 증가시키는데, 예를 들어, 상기한 바와 같이, 프로브가 안정적으로 오직 선택된 종 에 혼성화하는 것이 바람직할때, 사용될 수 있다.
방법은 표지화된 DNA로 혼성화함으로써 낮은 수준의 검체의 검출을 허용한다. 라벨은 바람직하게는 플루레신과 같은 형광 라벨이고, 전형적으로 DNA 프로브의 말단에 부착된다. 검체의 그것의 단편이거나 그것을 포함하지만, 길이는 다른 서열을 갖는 내부 표준이 검체의 정량화에 사용될 수 있다. 실시예 3은 플라즈마 샘플에서 매우 낮은 수준의 (약 10ng) 특정 PMO를 검출하는데 이 방법의 사용을 보여준다.
III. 검체 분자
상기한 바와 같이, 본 발명의 문맥에서 "실질적으로 하전되지 않은" 올리고머 분자는 DNA와 같이, 하전된 올리고머를 갖는 다른 길이 분자의 이중체가 여기에 기술된 분리 방법에 의해 분리되도록, 거의 또는 중성에 가까운 pH에서 (약 pH 5 내지 약 pH 9) 모든 뉴클레오티드 서브유닛이 하전되지 않거나, 또는 상기 pH에서 충분한 수가 하전되지 않은 올리고뉴클레오티드 유사체이다.
잘 공지된 하전되지 않은 올리고뉴클레오티드 유사체의 예는 하전되지 않은 서브유닛간의 연결을 갖는 펩티드 핵산, 포스포트리에스테르 올리고뉴클레오티드, 메틸 포스포네이트 올리고뉴클레오티드 및 모르폴리노 올리고머를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 검체 올리고머는 하전되지 않은 서브유닛간의 연결을 갖는 모르폴리노 올리고머이다. 그러한 연결은 도 2AA-2EE에서 예증된다. 바람직한 구체예에서, 연결은 도 2B-B로 대표되는 바와 같이, 포스포로디아미데이트 연결로부터 선 택되는데 여기서 X=NH2, NHR, 또는 NR2 (여기서 R은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸이다), Y=O및 Z=O이고, 대신하는 포스포로디아미데이트 연결 또한 도 2B-B에 의해 대표되며, 여기서 X=OR, Y=NH 또는 NR, 및 Z=O, 여기서 R은 저급 알킬이다. 이들 연결중의 하나를 갖는 모르폴리노 올리고머는 PMO의 것이라고 언급된다.
검체 분자는 또한 상기 지정된 올리고뉴클레오티드 유사체의 키메라를 포함할 수 있다. 또한 DNA, 2-0-알킬 RNA, 또는 2-0-알킬 RNA와 같은 하전된 올리고머와 함께, 키메라들, 예를 들어 교대의 공중합체가 포함된다. 상기한 바와 같이, 그러한 공중합체의 서브유닛의 50% 이상이 하전되는 것이 바람직하다.
하전된 핵산에 상보적인 영역을 갖는 검체 분자는 어떠한 전하 기반의 분리없이, 혼성화되지 않고 남아있고 하전된 매질를 신속하게 통과할 것으로 기대된다. 따라서 본 방법은 동일한 서열의 다른 단편을 나타내는 검체 분자의 혼합물에 가장 적합하다. 실시예 1에 나타낸 바와같이, 실시예는 합성 반응 혼합물이다. 이 실시예는 오직 하나의 서브유닛에 의해 길이가 다른 몇가지 PMO의 혼합물을 분리하는 방법의 사용을 예증한다. 실시예 2는 N-1 결손 서열의 분해를 설명한다. 생물학적 또는 다른 루트에 의한 올리고머의 백본 분할은 또한 저하 생성물의 분석에 의해 결정될 수 있다.
IV. 하전된 핵산 올리고머
이중체 형성에 사용된 하전된 핵산은 가장 전형적으로는 DNA 이다. 그러나, 어떠한 하전된, 안정적으로 혼성화하는 RNA 또는 DNA 유사체가 또한 사용될 수 있 다. 올리고머가 바람직하게는, 가장 편리하게는, 완전히 하전되지만, 그것은 다른 길이 검체 분자를 갖는 그것의 이중체가 여기에 기술된 분리 방법에 의해 분리가능하도록, 오직 충분한 수의 전하를 갖는 서브유닛를 포함하는 것이 필요하다. 분석의 편리함과 편이성을 위해, 하전된 핵산 또는 유사체의 단일 종(즉, 단일 길이와 서열)이 바람직하게 사용된다.
사용될 수 있는 하전된 핵산 유사체는 2'-O-알킬 RNA 또는 2'-O-알릴 RNA, 및 포스포로티오에이트 DNA와 같은 변형된 DNA, RNA, 변형된 RNA을 포함한다. 이러한 의미에서 "변형된"은 그러한 변경이 혼성화와 또는 하전된:하전되지 않은 이중체의 분해와 상충하지 않는한, 리보스 당 기 또는 염기 쌍을 이루는 부분, 예를 들어, C-2-메틸 또는-프로피닐 치환된 염기로의 변경을 포함한다.
분리 전략에 따라, DNA 또는 하전된 유사체는 다른 검체 분자를 갖는 그것의 이중체가 이중체 형성을 초래하는 혼성화되지 않은 부분(즉, 단일 가닥 또는 내부 루프)의 존재, 길이 및/또는 위치의 관점에서 다르도록 하는, 길이 및 서열을 가진다. 그것은 분리되도록 의도된 가장 긴 검체 분자의 서열의 적어도 일부에 상보성 이거나 또는 상보성에 가깝다. 또한 말단 혼성화되지 않은 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 4A-B 참고).
방법의 한가지 구체예에서, DNA는 분리되도록 의도된 가장 긴 검체 분자의 예상된 길이와 동일하거나 더 큰 길이를 가진다. 그러나, 상기한 바와 같이, 특히 검체 분자들 사이에 예상된 차이(들)가 검체 분자의 예측된 하위 영역안에서 우세할때, 더 짧은 DNA는 사용될 수 있다.
DNA가 가장 긴 검체 분자보다 더 길고/또는 혼성화되지 않은 서열을 포함할 수 있지만, 이중체에서 혼성화되지 않은 DNA의 길이를 증가시키는 것은 더 길어진 보유 시간과 전하를 갖는 매질과의 증가된 비특이성 상호작용을 초래한다. 대부분의 응용을 위해, 따라서, DNA는 가장 긴 검체 분자의 예상된 길이보다 고작 약 25% 더 길다.
검출 목적을 위해, 프로브는 바람직하게는 플루레신과 같은 형광 라벨로 그리고 바람직하게는 프로브의 5' 또는 3' 말단에서 표지화된다.
V. 분리 기술
하전된 바이오폴리머를 분리하는데 유용한 어떠한 전하 기반의 분리 기술은 본 발명에 따라, 실질적으로 하전되지 않은 검체 분자를 혼합시킴으로써 형성된 하전된: 하전되지 않은 이중체를 분리하는데 사용될 수 있다. 그러한 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 과정에 따라, 혼합물은 분리를 위한 전하를 갖는 분리 매질에 적용된다. 분리가 중성 또는 중성 근처의 pH에서 DNA와 검체 분자 사이에 이중체가 분리 목적을 위해 충분히 유지되도록 하는 조건하에서, 수행된다. 바람직한 방법에서, 전하를 갖는 매질은 이온 교환 수지, 특별히 음이온 교환 칼럼이고, 하기의 실시예에서와 같이, 용출은 중성 또는 중성에 가까운 pH 에서 수행된다.
다른 구체예에서, 전하 갖는 분리 매질은 전기이동 매질이다. 그러한 매질은 당업계에서 잘 공지된 방법에 따라, 반대 경계들 사이에 전기장을 인가함으로써 하전된다. 그러한 매질에서 하전된 분자를 분리하는 확립된 방법은 모세관 전기이 동, PAGE와 같은(폴리아크릴아미드 겔 전기이동) 겔 전기이동 및 중첩된 pH 구배를 사용하는 등전 집중화를 포함한다. 본 방법은 체가름이 아닌 즉, 크기에 의해 분자들을 구별하지 않는 매질을 채용할 수 있다. 실시예는 겔이 아닌 모세관 전기이동과 등전 집중화이다.
VI. 응용
대표적인 분석에서, 상기한 바와 같이, 전형적으로 형광 표지화된, 가장 긴 예상되는 검체 분자의 적어도 일부 영역에 상보성 또는 상보성에 가까운, DNA 분자는 검체 분자를 함유하는 샘플과 혼합된다. 샘플은 예를 들어 실시예 3에서 플라즈마에 대해 하기에 기술된 바와 같이, 공지된 분리 프로토콜에 따라 분석을 위해 제조된, 예를 들어 플라즈마, 유린 또는 조직 융해체(lysate) 샘플같은 생물학적 샘플이 될 수 있다. 대안으로서, 그것은 올리고뉴클레오티드 합성으로부터의 생성물 혼합물이 될 수 있다. 자유 DNA는 이중체로부터 충분히 멀리 이동하여 그것을 방해하지 않기때문에, 완전한 이중체의 형성을 확보하기 위해, 크게 초과량의 DNA가 사용될 수 있다. 바람직하게는, DNA는 더나아간 사용을 위해 특히, 반응 혼합물의 예비 분리의 경우에 회복된다.
하기 실시예 1은 이온 교환에 의한 20-머 PMO로부터 13-머 내지 19-머 절단된 종의 분리를 설명한다. 분리는 7 내지 9의 pH 범위를 갖는 용출액을 사용하여 Dionex DNA PacTM 이온 교환 칼럼에서 수행되었다. 도 5A-B에서 나타내 바와같이, 하나의 뉴클레오티드에 의해 길이에서 다른 종들은 깨끗하게 분해되었다.
실시예2는 다양한 19-머 N-1 결손 종의 분리를 보여주는데, 여기서 단일 뉴클레오티드는 부모 2-머로부터 삭제되었다. 다른 19-머의 보유 시간에서의 차이는 도 6-9에 나타낸다.
이들 분석 모두에서, 샘플 매트릭스로부터 매우 작은 백그라운드가 관찰되었고, 매우 낮은 수준의 검체가 검출되고 정량될 수 있었다. 플라즈마 샘플에서 표적 PMO를 검출하는데 있어서 방법의 민감성은 실시예 3에서 설명된다. 눈금보정 커브(도 10)은 도 11에서 나타낸 200μL 플라즈마 샘플 및 증가하는 양의 15-머 표준을 사용하여 제조되었다. 플라즈마 샘플의 분석에 있어서, 15-머 내부 표준은 20-머 검체로부터 깨끗하게 분리되었고, 그것은 10 ng 또는 50 ng/mL의 수준에서 검출되었다(도 12).
하기의 실시예는 예증하지만 발명을 제한하지 않도록 의도된다.
재료 및 방법
DNA는 Hybridon Specialty Products로부터 구매하였다. 검체, ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC (SEQ ID NO: 1) 서열을 갖는 PMO 및 서열 GAG GGG CAT CGT CGC (SEQ ID NO: 2)을 갖는 내부 표준(도 11)으로서 15-머 단편을 표준 방법에 따라 AVI BioPharma에서 제조하였다. (SEQ ID NO: 1은 Genbank Acc. No. X00196.의 뉴클레오티드 2551-2570에 해당하는, 인간 c-myc 유전자 서열에 대한 안티센스이다) 15-머의 동일성은 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 확증되었다(이론치 M+H 5350.6, 실측치 5350.0).
HLPC는 Rainin Al-200 오토샘플러가 구비되고 Varian 9075 형광 검출기에 연결된 Varian 9010 "불활성" 펌프를 사용하여, 수행되었다. 데이타 수집은 Varian Star 크로마토그래피 워크스테이션, 버전 5.3을 사용하여 수행되었다. HLPC 조건은 하기에 기술된 바와 같았다.
실시예 1. 13-머 내지 19-머 절단된 종의 20-머 PMO의 분해
서열 ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC (SEQ ID NO: 1)을 갖는, 13-머 내지 19-머 절단 종과 부모 2-머 PMO의 혼합물을 상보성 20-머 DNA로 복합체 형성함으로써 분해하였다. HLPC 조건은 하기와 같았다.
칼럼 : Dionex DNA PacTM PA-100 (250 x 4 mm, 15μ 입자 크기)
유동 상: A: 0.025 M Tris (pH 9); B: 0.025 M Tris (pH 9)/1 M NaCl
구배: A: B: C 90/10 @ 0 분 내지 55/45 @ 20 분
유속: 1.5 mL/min
파장: 254 nm
온도: 25 ℃
도 5A-B에 나타낸 바와 같이, 모든 종은 분해되었다. 위에서 논의한 바와같이, 보유 시간의 변화는 각각의 PMO:DNA 이중체의 구조적으로 제한되지 않고 구조적으로 억제된 전하의 상대적인 비율에 기인하는 것으로 믿어진다.
실시예 2. N-1 결손 종의 분해
이러한 연구에서, 서열 ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC (SEQ ID NO : 1)을 갖는 20-머 PMO로부터의 N-1 19 머 종을 갖는 DNA 이중체의 보유 시간은 전체 길이 20머:DNA 이중과 비교되었다. 0.1 OD/30.0 μL DNA 용액을 0.1 OD의 N-1 올리고머를 함유하는 각각의 100.0 μL 알리콧의 수성 샘플에 첨가하였고, 용액을 철저하게 혼합하였다. 10.0 μL 알리콧의 각각의 생성되는 용액을 제거하고 오토샘플러를 사용하여 HPLC (이온 교환)에 의해 분석하였다. HPLC 조건은 하기와 같았다:
칼럼 : Dionex DNA PacTM PA-100 (250 x 4 mm, 15μ 입자 크기)
유동 상: A: 물; B: 0. 25M Tris 완충액 (pH 8); C: 1M NaCl
구배: A: B: C 80/10/10 @ 0 분 내지 45/10/45 @ 20 분
유속: 1.5 mL/min
온도: 25 ℃
검출: UV, 254 nm
보유 시간은 하기 표 1에 주어진다. 나타낸 바와 같이, 전체 길이 20머:DNA 이중체 후에 모든 N-1 이중 샘플은 용출되었다. 도 6-9는 각각의 뉴클레오티드에 대해 다양한 N-1 종에 대한 보유 시간을 나타내는 크로마토그램의 오버레이를 나타낸다.
실시예 3. 플라즈마에서 표적 PMO 종의 정량화
HPLC 조건:
칼럼 : Dionex DNA PacTM PA-100 (250 x 4 mm, 15p 입자 크기)
유동 상: A: 0.025 M Tris (pH 9); B: 0.025 M Tris (pH 9)/1 M NaCl
구배: A: B: C 90/10 @ 0 min 내지 55/45 @ 20 min
유속: 1.5 mL/min
파장: 494 nm 여기; 518 검출
온도: 25 ℃
키노몰구스 원숭이에게 검체 PMO와 함께 혈관내 주사하고, 표 2에서 보이는 바와 같이 혈액 샘플을 다양한 시간 간격에서 취했다. 전형적인 분석에서, 200 μL의 플라즈마를 10μL의 0.0025M Tris 완충액, pH 8-9에서 공지된 양(예를 들어, 500 ng)의 내부 표준(도 11)으로 결합시켰다. 메탄올(200.0 μL)을 첨가하고, 샘플 을 소용돌이 믹서를 사용하여 혼합하였다. 고속 원심분리의 도움으로 침전물을 제거하였다. 상청액을 제거하고 펠릿을 100 μL Tris 완충액으로 세척하고; 워시를 상청액에 첨가하였다. 혼합물을 10분동안 70℃에서 가열하였고, 샘플을 한번 다시 고속 원심분리시켰다. 상청액을 이동시키고 동결건조하여 건조시켰다. 건조 재료는 0.025 M Tris (pH 8-9) 중의 100.0 μL 알리콧의 DNA (5'-플루레신 표지화)로 재구성하고 오토샘플러 병으로 이동시키고, 전체 샘플을 HLPC 칼럼위로 주입하고 분석하였다.
250 내지 20,000 ng의 AVI-4126을 함유하는 플라즈마 표준의 분석에 의해 눈금보정을 수행하였다. 데이타를 내부 표준 신호 강도에 대한 검체의 비 대 내부 표준 농도에 대한 검체의 비로서 도시하였다. 그래프는 도 10에 나타나있고, 0.999920의 상관관계 계수를 나타낸다.
내부 표준에 근거한 샘플의 정량화는 표 2에 주어진다. 대표 분석의 크로마토그램은 도 12에 나와있다. 이 분석에서 검출된 수준은 10.0 ng 검체였고, 50 ng/mL에 해당하였다. 이 방법의 민감성은 따라서 UV를 기반으로 한 방법의 검출과 정량을 훨씬 초과한다.
본 발명이 특정 방법과 구체예에 따라 설명되었지만, 본 발명에서 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
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<210> 1
<211> 20
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<220>
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X00196
<400> 1
acgttgaggg gcatcgtcgc 20
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment of SEQ ID NO: 1
<400> 2
gaggggcatc gtcgc 15
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment of SEQ ID NO: 1
<400> 3
acgttgaggg gcatcgtc 18
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment of SEQ ID NO: 1
<400> 5
acgttgaggg gcat 14
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment of SEQ ID NO: 1
<400> 6
gttgaggggc at 12
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment of SEQ ID NO: 1
<400> 7
tgaggggcat cgtcgc 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment of complement to SEQ ID NO: 1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> n = A,T,C or G
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment of complement to SEQ ID NO: 1
<400> 9
cgacgatgcc 10
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> deletion variant of SEQ ID NO: 1
<400> 10
acgttgaggg gcatctcgc 19
Claims (27)
- 상이한 올리고머 검체 분자의 집단중의 하나와 특이성 프로브 분자를 포함하는 이중체 집단을 분리하는 방법으로서,상기 검체 분자는 75% 이상이 하전되지 않은 연결된 서브유닛으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 유사체이고, 상기 특이성 프로브 분자는 전부 하전된 핵산 또는 전부 하전된 핵산의 유사체이고,상기 방법은, (a) 전하를 갖는 분리 매질에, 상기 상이한 올리고머 검체 분자와 상기 특이성 프로브 분자의 혼합물을, 상기 특이성 프로브 분자가 다수의 또는 모든 상기 상이한 검체 분자들과 함께 안정된 이중체를 형성하도록 하는 조건하에서 도포하고, 이로써 프로브 분자의 비혼성화 부분의 존재, 길이 또는 위치에 따라 서로 다른 다수의 상이한 프로브-검체 이중체를 형성하는 단계, 및(b) 매질내에서 이중체의 서로로부터 그리고 단일 가닥의 검체 또는 프로브 분자로부터 상기 상이한 프로브-검체 이중체들을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 각각의 검체 분자의 뉴클레오티드 서열은 선택된 서열, 선택된 서열의 다른 길이 단편, 선택된 서열의 내부 결손 또는 삽입 변체, 선택된 서열의 돌연변이 변체, 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 결손, 삽입 또는 돌연변이 변체는 선택된 서열의 8 뉴클레오티드마다, 많아야 1개의 이러한 결손, 삽입 또는 돌연변이를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 프로브는 선택된 서열에 대해 상보성인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 프로브는 선택된 서열과 동일하거나 또는 단지 25% 더 큰 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 프로브는 선택된 서열의 N-1 결손 변체에 대해 상보성인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 프로브는 선택된 서열의 상기 N-1 결손 변체와 동일한 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 조건은 그러한 프로브가 오직 상기 N-1 결손 변체에 혼성화되도록 하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 검체 분자 사이의 서열 또는 길이에서의 변화는 상기 선택된 서열의 주어진 하위영역 안에서 일어나고, 프로브는 상기 분석의 조건하에서 상기 하위영역으로 안정적으로 혼성화는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 집단은 선택된 서열의 N-1 결손 변체인 검체 분자를 함유하고, 프로브는 결손 부위를 함유하는 검체 분자의 영역에서, 상기 분리의 조건하에서, 각각의 검체 분자에 안정적으로 혼성화하는데 충분한 서열과 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 하위영역은 상기 검체 분자의 말단 또는 이 말단 근처에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 말단은 각각 검체 분자의 5' 또는 3' 말단이고, 프로브는 각각 그것의 3' 또는 5' 말단에서 표지화 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 표지화 부분은 형광 라벨인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 전하를 갖는 분리매질은 이온 교환 매질이고, 단계(b)의 상기 분리는 매질을 통해 용리제를 통과시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 전하를 갖는 분리매질은 전기 이동 매질이고, 단계(b)의 상기 분리는 매질의 반대 경계 사이에 전기장을 인가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 매질은 중첩된 pH 구배를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 검체 분자는 모두가 하전되지 않은 연결된 서브유닛으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 검체 분자가, 펩티드 핵산, 포스포트리에스테르 올리고뉴클레오티드, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드 및 모르폴리노 올리고머로 이루어진 그룹; 상기 그룹 중의 어떤 멤버와 또다른 멤버의 키메라; 및 상기 그룹 중의 어떤 멤버와 DNA, 2'-O-알킬 RNA 또는 2'-O-알릴 RNA의 키메라;로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18항에 있어서, 검체 분자가 모르폴리노 올리모머인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 모르폴리노 올리고머는 포스포라미데이트와 포스포로디아미데이트로 구성되는 군으로부터 선택된 서브유닛간의 연결을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 프로브는 DNA, RNA, 2'-O-알킬 RNA, 2'-O-알릴 RNA, 포스포로티오에이트 DNA, 또는 그들의 키메라로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21항에 있어서, 상기 프로브가 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 프로브가 표지화되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 집단에서 하나 이상의 표적 검체 분자로 표지화된 프로브의 이중체를 검출하고 정량하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 하나 이상의 상기 이중체를 단리(isolating)하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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