KR100914377B1 - 스트랩토코쿠스 표면 항원 Ⅰ/Ⅱ와 특이적으로 결합하는ｄｉａｂｏｄｙ 및 이의 이용 방법 - Google Patents

Abstract

치주염(periodontitis) 및 충치와 같은 대부분의 구강질환은 수동 면역조치에 의해서 효과적으로 예방될 수 있다. 본 발명의 인간 단일사슬 Fv(Single Chain Variable Fragment: scFv)와 diabody 항체 절편은 뮤린 단일클론항체 Guy's 13의 결합 성질에 기초하고 있다. 모항체처럼, 이러한 유도체는 스트랩토코쿠스(Streptococcus)의 표면 부착 단백질, SAI/Π와 특이적으로 결합하고, 인간 diabody 스트랩토코쿠스 세포를 응집시킬 수 있으므로 구강질환의 수동면역에 대한 유용한 후보 치료제일 수 있다.

Description

스트랩토코쿠스 표면 항원 Ⅰ/Ⅱ와 특이적으로 결합하는 ｄｉａｂｏｄｙ 및 이의 이용 방법{A DIABODY WHICH SPECIFICALLY BINDS STREPTOCOCCUS SURFACE ANTIGEN I/II AND METHODS OF USE THEREOF}

충치는 사람의 질환 중 가장 보편적인 질환이다. 주요 원인 병원체는 뮤탄스 스트랩토코키(mutans streptococci)라고 기술되는 스트랩토코쿠스(streptococcal) 종이다(Balakrishnan, et al . Aust . Dent. J. 2000, 45:235-45). 스트랩토코쿠스 뮤탄스는 질환의 주요 병인 병원균으로 동정되어왔다. 많은 다른 질환들과는 달리, 충치는 개발도상국에서와 같이 서방국가에서도 널리 유행하기 때문에 의약회사뿐만 아니라 치의학 공사에서 중요한 관심을 가지고 있다. 감염 초기의 첫 번째 단계는 세균이 적당한 수용체에 부착이며 예방의 이상적인 시기이다. 뮤탄스 스트랩토코쿠스에서 유래한 두 그룹의 단백질은 인간 충치 백신의 우선적인 후보로 대표된다: 글루코실트랜스퍼라제(glucosyltransferase)효소 및; 글리칸(glycan)을 합성하고 미생물을 축적시키는 하나는 침샘 박막으로의 부착을 매개하는 세포 표면 원섬유성 단백질(Hajishengallis and Michalek, Oral Microbiol. Immunol . 1999, 14: 1-20). 세균의 부착단백질(adhensin) SAI/II(Russell, et al . Arch. Oral Biol. 1978, 23:7-15)는 190 kDa 분자량의 표 면 발현 단백질로 뮤탄스 스트랩토코쿠스가 치아 표면에 초기 부착하는데 중요한 역할을 한다.

스트랩토코쿠스 뮤탄스 및 스트랩토코쿠스 소브리누스(streptococcus sobrinus)의 SAI/II 단백질을 특이적으로 인식하는 뮤린(murine) 단일클론항체 Guy'13(Smith and Lehner. Oral Microbiol . Immunol. 1989, 4: 153-8)은 스트랩토코쿠스 뮤탄스의 군체 형성과 충치로의 발전을 예방하는데 성공적으로 이용된다(Lehner, et al. Infect . Immun. 1985, 50: 796-9). 또한 항체는 인간의 임상 실험에서도 세균 군체 형성을 예방하였다(Ma, et al . Infect . Immun. 1990, 58: 3407-14; Ma, et al . Clin . Exp . Immunol. 1989, 77: 331-7). 그러나 다른 뮤린 항체같이 임상 적용에서 주요 한계점은 제거(clearance)의 비율과 초기 및 알러지 반응을 증가시키는 인체 항-바우스 항체 반응(human anti-mouse antibody response, HAMA)일 것이다(Saleh, et al . Cancer Immunol . Immunother. 1990, 32: 185-90). 뮤린 항체와 관련 된 문제점은, 예를 들면, 키메라화(chimerization)(Mountain and Adair. Biotechnol . Genet . Eng . Rev. 1992, 10: 1-142), CDR 그래프팅(grafting: Kettleborough, et al . Protein Eng. 1991, 4: 773-83) 및 파지 디스플레이 기술을 이용한 유도 선별을 통해 뮤린 서열을 그들의 인간 대응물로 대체함으로써 극복될 수 있다(Beiboer, et al. J. Mol . Biol. 2000, 296: 833-49). 그에 더하여, 항체 전체 대신 항체 절편의 이용은 불변구역의 일부를 제거함으로 유발할 수 있다.

항-SAI/Ⅱ 항체와 이의 절편은 미국 특허 제 5,518,721; 5,612,031; 5,854,402 및 WO 제 88/06455호에 공개되어있다. 상기 공개는 칫솔, 양치질 물약, 껌, 정제 또는 젤의 형태에서 항-SAI/Ⅱ 항체 혼합물을 이용함으로써 충치에 대항하고 있음을 알려준다.

그러나, 항-SAI/Ⅱ 항체를 이용해 충치와 대항하는 잠재적인 치료법이 있어왔음에도 불구하고 인간 diabody의 존재와 생산이 전통적인 항체와 연관된 문제를 극복하고, 충치 치료에 효과적으로 이용될 수 있을지는 밝혀진바 없다.

발명의 요약

본 발명은 스트랩토코쿠스 표면 항원 I/Π(SAI/Π)와 특이적으로 결합하는 인간 중연쇄 가변 영역과 인간 경쇄 가변 영역으로 구성된 분리된 diabody를 제공한다. 본 발명의 실시예에서 중연쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7 이다. 다른 실시예에서, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8 이다. 구체적인 실시예에서, diabody는 중연쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 사이의 짧은 링커 서열을 포함하며, 상기서열은 서열번호 9로 기재된다.

본 발명의 실시예는 스트랩토코쿠스 SAI/Π에 특이적으로 결합하는 diabody를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하며 동일하게 발현할 수 있는 숙주세포이다.

본 발명의 다른 실시예는 스트랩토코쿠스와 연관된 구강질환의 예방과 치료 방법이다. 본 방법은 스트랩토코쿠스 SAI/Π에 특이적으로 결합하는 diabody의 양 을 효과적으로 조절함으로써 구강질환의 적어도 한 종류의 징후나 증세를 막거나 치료하는데 관여한다.

또한 스트랩토코쿠스 SAI/Π와 특이적으로 결합하는 diabody를 포함하는 조성물 및 키트가 제공된다.

도 1은 단일클론항체 Guy 13에 의한 SAI/II와 chimscFv (mGuy13VH/huVL; A1, A6, A9, B4, C6 및 G4) 결합의 저해를 나타낸다.

도 2는 인간 scFv 항체 절편의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3은 SAI/II와 스트랩토코쿠스 뮤탄스에 대한 인간 scFv(B10, D12 및 H6)의 결합을 나타낸 그래프이다.

도 4는 SAI/II와 스트랩토코쿠스 뮤탄스에 대한 인간 diabody(B10, D12 및 H6)의 결합을 나타낸다.

구강 병원체인 스트랩토코쿠스 뮤탄스를 인식하는 항체는 충치의 제어와 예방을 위한 새로운 접근을 제공한다. 스트랩토코쿠스 뮤탄스의 SAI/Ⅱ 항체 표면 부착단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 분리되었고(Saleh, et al . supra. 1990) 식물체에서 분비 IgA(a secretory IgA, sIgA)로 발현되었다(Ma, et al. (1998) Nat . Med. 4:601-6). 임상 2기에 상기 재조합 항체는 초기 세균 소거 이후에 스트랩토코쿠스 뮤탄스에 의한 구강 내의 재군집화를 예방함을 보여주었다. sIgA은 침에서 자연적으로 발견된 항체의 우세한 형태이기 때문에 스트랩토코쿠스 뮤탄스에 의한 치아 표면의 군집화를 저해하는 항체의 국소 적용에 적합한 형태이다. 그러나 각각의 sIgA는 4개의 다른 형태의 10개의 폴리펩티드(polypeptide) 사슬로 구성되어 있어, 이는 전통적인 생산 시스템상에서의 대량 생산을 어렵게 한다.

그 대안으로서 뮤린 Guy's 13 항체의 인간 항체 절편 유도체는 인간 항체 가변 유전자 파지-발현 라이브러리(phage-display libraries)에 기초한 사슬 셔플링(shuffling) 접근을 사용해서 생산되고 있다. 인간 항체 절편은 세균에서 scFv 및 항체절편 유도체로서 발현되었고 생체외 실험(in vitro)에서 스트랩토코쿠스 뮤탄스를 응집시키는데 이용되었다. 항체절편은 세균을 응집시키는 것이 가능하므로 충치의 치료 또는 예방을 위한 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 diabody 유도체는 많은 양으로 쉽게 발현하며, 조직을 쉽게 침투할 수 있고, 종종 원치 않거나 필요없는 여분의 작동 기능을 증진시키는 불변 영역이 결여되어 있기 때문에 당업계에 알려진 다른 항체 및 항체 절편을 넘어서서 유리하게 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 diabody는 뮤린에서 기원된 것이 아니기 때문에 인간 숙주에서 면역 반응을 유발하지 않다. 장기간 치료시 빠른 제거(clearance)와 낮은 효율을 유도한 충치는 급성보다 만성인 경향이 있으므로, 장기간 동안 환자에게 작은 장점이다. scFv들에서 SAI/Ⅱ가 생성되는 동안(Ma, et al. supra . 1990)에는 이상적인 sIgA 형태와 비교해서 scFv들은 1이며 불안정하다는 두 개의 결점이 생긴다. scFv들은 중연쇄 및 경쇄가 유동적인 펩티드 링커(linker)에 의해 조합되어 있는데 이것은 두 개의 도메인이 서로 접히고 상호 작용하는 것을 가능하게 만들기 때문에 1가(monovalent)이다. diabody를 이용하면 연결 펩티드는 중연쇄와 경쇄 가변 영역이 이합체(dimer)로 상호작용하므로 그것에 의해 짧아지고, scFv들을 이용함으로써 생기는 단점은 극복될 수 있다. 또한 상기 상호작용의 결과로 diabody는 모체 면역 글로블린 항체처럼 2가(bivalent)이고 이로 인해 결합력이 증가된다.

기술한 방법에 의해, 뮤린 항체 Guy's 13에 기초한 인간 scFv 항체 절편은 가변 영역 셔플링(shuffling)과 파지-라이브러리(phage-library) 선별의 두 일괄적인 연속된 과정을 이용하여 구축된다. 첫번째로, 키메라 scFv는 뮤린 Guy's 13 중연쇄 가변 영역을 증폭해서 제조되었고 이에 인간 경쇄 가변 영역의 파지 발현 라이브러리를 삽입하였다. 제조된 파지 발현 라이브러리는 5× 10⁵의 복잡도(complexity)를 가졌다. 적합한 결합력을 가진 단일 사슬 Fv 항체 절편은 정제되어 선별되었고, 고정된 SAI/Ⅱ 항원이다. 선별 3회는 특이한 후보 항체는 ELISA로 동정되었다. 이후 서열분석은 5개의 항체 절편을 산출했다(chimscFvA1, chimscFvA6, chimscFvA9, chimscFvB4 및 chimscFvG4). 인간 가변 유전자 서열 분석은 chimscFvA6 및 chimscFvB4 두 개의 클론을 보여주는데 HK137와 유사한 chimscFvA6는 VΚ1에 속해 있고 chimscFvB4는 L12 생식계열에 속해 있다. chimscFvA9는 VΚ4 DPk24에 속해 있다. chimscFvA1 및 chimscFvG4는 Vλ3 DPL16에 속해 있다. ELISA의 저해는 6개의 모든 chimscFv가 SAI/Ⅱ와의 결합이 Guy's 13 뮤린 단일클론항체에 의해 억제될 수 있음을 보여준다. chimscFv A6, A9, B4 및 C6의 결합은 약 80% 정도 저해될 수 있으며 이는 에피토프의 인식이 유지되고 있음을 나타낸다(도 1). chimscFv A1 및 G4의 결합은 오직 약 30% 정도로 억제되었고 이는 항체가 다른 에피토프를 인지함을 나타낸다.

선별된 인간 V_L 유전자는 인간 V_H 라이브러리(복잡도 8× 10⁸)로 도입되고 조합된 라이브러리는 1× 10⁶의 복잡도를 확립하였다. 선별 3회는 상자성 비드(paramagnetic bead)로 한 쌍이 된 SAI/Ⅱ 항원이 이용된 용액에서 수행하였다. 7개의 인간 scFv는 ELISA로 동정되었다. 이후 서열분석으로 3개의 인간 scFv인, huscFv B10, huscFv D12 및 huscFv H6를 동정했다. 도 2는 인간 scFv 항체 절편의 아미노산 서열을 보여준다. chimscFv A6(Vk1 HK137)상의 인간 V_L 영역은 인간 scFv B10 및 H6 각각에서 생산된 두개의 다른 인간 가변 중연쇄의 조합에서 선별되었다. 인간 scFv B10(서열번호3)의 V_H영역은 V_H1 DP10과 상동하고, 인간 scFv H6(서열번호 7)의 V_H 영역은 V_H3 DP35와 상동하다. chimscFv B4(Vk1 L12)(서열번호 6)상의 인간 V_L 영역은 하나의 인간 가변 중연쇄가 주어진 인간 scFv D12의 조합에서 선별되었다. 인간 scFv D12(서열번호 5) V_H 영역은 VH5 DP73과 상동하다. 도 3은 3개의 인간 scFv가 SAI/Ⅱ 항원 및 병원체 세균 스트랩토코쿠스 뮤탄스와의 결합을 보여준다. ELISA의 저해는 모든 3개의 인간 scFv와 SAI/Ⅱ와의 결합이 Guy's 13에 의하여 억제되고, 이는 에피토프의 인식이 유지됨을 나타낸다.

재조합 항체 절편은 높은 결합력과 특이성을 가진 안정적인 다중결합의 올리고머(oligomer)의 조합으로 제조된다(Kortt, et al. Biomol . Eng. 2001, 18:95-108). 3 ~ 12 잔기의 링커에 의해 조합된 scFv 분자는 기능적 Fv 영역으로 접혀지지 않으며 대신에 2가 이합체의 형태인 두 번째 scFv 분자와 결합한다(diabody 약 60k Da). 세포 표면 항원의 교차결합(cross-linking)을 위해 적어도 두개의 결합 부분이 필요하다. diabody는 이러한 필요를 충족시키는 가장 작은 2가 항체 분자이다. 인간 diabody는 인간의 scFv B10, D12 및 H6 또는 뮤린 Guy'13으로부터 온 가변 중연쇄와 경쇄유전자의 PCR 증폭(표 2)하고 10개의 아미노산 잔기 링커를 포함하는 벡터 pHenIXdia로 두 번의 연속적인 엠플리콘(amplicon) 삽입하여 구축된다. 클론의 보존은 서열분석으로 확인하였고, SAI/Ⅱ 항원과 스트랩토코쿠스 뮤탄스 세포를 이용한 ELISA에 의해 확인했다(도 4). 1가 Fab 절편이 아닌 F(ab')2 유도체는 충치에 대항하여 보호하므로, 뮤린 Guy'13의 2가 결합은 보호를 위해 필요하다(Ma, et al . supra . 1990). 스트랩토코쿠스 뮤탄스는 마우스 diabody Guy'13 및 인간 diabody D12가 존재할 때 의존적(dose-dependent) 방법으로 응집되는데 유사한 농도에서는 Guy's 13에서보다 인간 diabody가 능가한다. 그러므로 스트랩토코쿠스의 SAI/Ⅱ와 결합하는 인간 diabody의 세대에서는 결합 친화력의 유의적 손실을 보이지는 않았다.

따라서 본 발명은 단일클론항체 Guy's 13의 인간 가변 영역을 포함하는 diabody를 제공에 관한 것으로, 상기 diabody는 스트랩토코쿠스의 SAI/Ⅱ와 특이적으로 결합하고 스트랩토코쿠스 세포의 응집을 촉진한다. 스트랩토코쿠스의 SAI/Ⅱ와 결합하는 diabody는 상세하게는 스트랩토코쿠스 뮤탄스와 스트랩토코쿠스 소브리누스에서 유래한 SAI/Ⅱ와 물리적으로 상호작용하게 공정된 항체로써 SAI/Ⅱ의 접합단백질 기능을 차단함으로써 숙주에서 스트랩토코쿠스의 군집화를 예방한다. 본 발명의 diabody는 Guy's 13 가변 영역에서 유래되었으므로 상기 diabody는 스트랩토코쿠스 뮤탄스와 스트랩토코쿠스 소브리누스의 군집화를 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다.

본 명세서에서 diabody는 결합 항체의 결합 도메인(중연쇄 및 경쇄 모두)에서 분리하여 제조하는 공정된 항체 구성체로서 정의되며, 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 중연쇄와 경쇄가 결합되거나 또는 연결가능한 연결 모이어티(moiety)를 제공하며 이를 통하여 Holliger등(1993), Proc . Natl . Acad. Sci . USA. 90: 6444 및 Poljak(1994), Structure . 2: 1121-1123에 기재된 결합 기능을 유지한다. 본질적으로, 근본적으로 생략된 형태는 오직 항원 결합에 필요한 가변 영역만을 가지고 있다. 같은 사슬 내의 두개의 영역 사이를 쌍으로 만들기에는 너무 짧기 때문에 링커를 사용함으로써 영역들은 다른 사슬의 상보성 영역으로 쌍을 이루어서 두 개의 항원 결합 자리가 생성된다. 상기 이합체 항체 절편 또는 diabody는 2가이고 이특이적(bispecific)이다. diabody를 생산하는 방법은 Holliger 등 supra . 1993; Poljak supra . 1994; Zhu 등 Biotechnology . 1996, 14: 192-196 또는 미국 특허 제 6,492,123호 중의 어느 방법을 참조하여 이용할 수 있다. 제조 후 결합 특이성은 예를 들면, 평형(enzyme-linked immunoabsorbent assay(ELISA), radioimmunoassay(RIA) 등)방법 또는 역학(예; BIACORETM 분석)으로 측정될 수 있다. 추가적으로 diabody의 치료제로서의 약학적 활성과 잠재적인 효과의 측정을 위하여 세포 응집 또는 군집화 분석과 같은 다른 생물학적 활성 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석은 본 발명의 실시예에서도 기술하였으며 당해업계에서 잘 알려져 있다.

인간 가변 영역을 포함한 diabody 생산는 본 명세서의 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 diabody는 미국 특허 제 5,518,721호; 5,612,031호; 및 5,854,402호 및 WO 제 88/06455호에 기재된 항 SAI/Ⅱ 항체와 같은 다른 항 SAI/Ⅱ 항체의 가변 영역으로 구성된 단일클론항체 Guy's 13과 같은 에피토프를 인식하는데 제한되지 않는다.

당해업계에서 알려진 기술로서 본 발명의 diabody는 SAI/Ⅱ와 특이적으로 결합하므로, diabody는 다른 특이성의 2개의 scFv 역시 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 diabody는 SAI/Ⅱ와 결합하는 동시에 점착성이 있는 글리칸(glycan) 또는 다른 분자를 목표로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 본 발명의 SAI/Ⅱ와 결합하는 diabody는 서열번호 5인 인간 중연쇄 가변 영역 및 서열번호 6의 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 D12를 나타낸다(도 2). 다른 실시예에서는 SAI/Ⅱ와 결합하는 diabody는 서열번호 3인 인간 중연쇄 가변 영역 및 서열번호 4의 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 B10으로 나타낸다. 또 다른 실시예에서는 SAI/Ⅱ와 결합하는 diabody는 서열번호 7인 인간 중연쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 인간 경쇄 가변 영역을 포함하고 있는 H6로 나타낸다.

상세한 실시예에서는 본 발명의 diabody의 중연쇄 및 경쇄 가변 영역은 링커 서열에 의해 조합되거나 연결이 가능하다. 링커는 사슬의 V_L 영역이 V_H 영역과 조합할 수 있는 몇몇의 아미노산보다 짧은 펩티드이다. 상기 펩티드는 10개의 아미노산보다 적을 수 있으며, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 가능하다. 적합한 경우, 9, 8, 7 또는 6개의 아미노산인 것이 적당하다. 어떠한 경우, V_H 영역과 V_L 영역을 함께 직접 연결하여 하나의 아미노산이 없어져 “-1” 일수도 있다. 적합한 경우, 하나 또는 두개의 영역 모두에서 하나 이상의 아미노산의 생략도 가능하다. 본 발명의 diabody에 사용하기에 적합한 링커 서열은 이에 한정된 것은 아니나, Thr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Ala-Leu(서열번호 9); Ser-Val-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-His(서열번호 10); Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 11); 및 미국 특허 제 6,492,123호에 기재되어 있는 링커이다.

본 발명은 본 발명의 diabody를 인코딩하는 아미노산 포함하는 벡터와 숙주세포를 포함한다.

diabody의 재조합 생산을 위하여, diabody를 인코딩하는 핵산(nucleic acid) 서열은 분리하고 이후 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터를 삽입하였다. 본 발명의 diabody를 인코딩하는 핵산 서열은 기존 방법을 이용하여 쉽게 분리되었고 서열결정 되었다(예, SAI/Ⅱ diabody의 중연쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 본 명세서에 기재된 올리고뉴클리오티드 프루브). 많은 벡터들이 사용가능하다. 벡터 구성 요소는 이에 한정되지는 않지만 하기 중 어느 하나 이상을 통상적으로 포함한다: 신호 서열, 복제기원(origin of replication), 하나 또는 그 이상의 마커(marker) 유전자, 인핸서(enhancer) 요소, 프로모터(promoter) 및 전사 종결 서열.

본 발명의 diabody는 직접적인 재조합뿐만 아니라 이종 폴리펩티드와 융합된 폴리펩티드로 생산될 수 있으며, 상기 이종 폴리펩티드는 신호 서열 또는 성숙 단백질이나 폴리펩티드의 N-말단의 특이한 절단 자리를 가진다. 선별된 이종 신호 서열은 일반적으로 숙주세포에서 의해서 인지되고 처리된다(예; 신호 펩티다아제에 의한 절단). 원핵의 숙주세포를 위한 신호 서열은 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 페니실리나제(penicillinase), lpp 또는 내열성 독소 Ⅱ 리더(heat-stable enterotoxin II leaders)등을 포함할 수 있다. 효모 분비를 위해서 효모 자당효소(invertase), 알파 펙터(alpha-facter: 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 쿨리버미세스(Kluyveromyces) 알파-펙터 리더) 또는 산 포스파타제(acid phosphatase), 칸디다 알비칸스(C. albicans)의 글루코아밀라제(glucoamylas)의 리더 또는 WO 제 90/13646호에 기재된 신호의 리더 서열을 포함할 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는, 단순포진(herpes simplex) gD 신호로 알려진 바이러스 분비 리더 같은 포유동물 신호서열이 이용가능하다. 이러한 선도 아미노산 서열을 위한 핵산 서열은 diabody를 인코딩하는 핵산 서열의 리딩 프레임(reading frame)에 삽입된다.

발현 벡터 및 클로닝 벡터 모두는 하나 또는 그 이상의 선별된 숙주세포에서 벡터를 복제할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주세포의 염색체 DNA와 관계없이 벡터의 복제를 가능하게 하고 복제기원 또는 자율적인 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 세균, 효모 및 바이러스에서 다양하게 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR3222로부터 유래된 복제기원은 대부분의 그람음성 세균에 적합하고, 효모에는 2 u 플라스미드 기원이 적합하고, 다양한 바이러스 기원[SV40, 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스(denoviruse), VSV 또는 BPV]은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터로 유용하다. 복제 기원 구성요소는 포유동물의 발현 벡터에 필요하지 않다(SV40 기원은 단지 초기 프로모터를 포함하고 있기 때문에 전형적으로 이용된다).

발현 벡터와 클로닝 벡터는 또한 선별 유전자와 선별적 마커가 포함될 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 저항성을 부여하는 항체 또는 다른 독성, 예를 들면 암피실린(ampicillin), 네오마이신(neomycin), 메토트렉사트(methotrexate) 또는 테트라싸이클린(tetracyclin); 보체 영양요구성 결핍; 바실러스를 위한 D-알라닌(D-alanine); 라세마아제(racemase)를 인코딩하는 유전자와 같이 복합 배지로부터 공급이 불가능한 중요한 영양분을 제공해주는 단백질을 인코딩한다.

선별 전략의 한 예는 숙주세포의 성장을 저해하는 약으로 이용된다. 이종 유전자가 성공적으로 형질도입된 상기 세포는 약의 저항성을 제공하는 단백질을 생산해서 선별처방에서 생존한다. 상기 우선 선별의 예에서는 네오마이신(neomycin), 마이코페놀릭산(mycophenolic acid) 및 하이드로마이신(hygromycin) 등을 이용한다.

포유동물의 적당한 선별 마커로서 다른 예는 diabody 핵산 서열, DHFR, 티미딘 키나제(thymidine kinase), 메탈로티오네인-I 및 II(metallothionein-I 및 II), 아데노신 데아미나아제(adenosine deaminase), 오르니틴 카르복실 효소(ornithine decarboxylase) 등을 받아들인 세포 적격의 동정이다.

예를 들어, DHFR 선별 유전자가 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉사트(methotrexate: Mtx)를 함유한 배양배지에 모든 형질전환체를 배양함으로써 처음 동정된다. 야생형(wild-type) DHFR을 이용하는경우 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주이다.

추가적으로, diabody, 야생형 DHFR 단백질 및 아미노글리코사이드 3-포스포트랜스퍼라제(aminoglycoside 3'-phosphotransferase: APH)와 같은 다른 선별 마커를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환 또는 동시-형질전환된(co-transformed) 숙주세포(특히 내생적 DHFR을 가진 야생형의 숙주)는 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin) 또는 G418와 같은 아미노글리코사이드계 항생물질과 같은 선별적 마커를 위한 선별제를 포함한 배지에서 배양함으로써 선별될 수 있다. 미국 특허 제 4,965,199호를 참조하라.

효모에 이용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb, et al . Nature . 282: 39, 1979). trp1 유전자는 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones Genetics . 85: 12, 1977) 등과 같이 트립토판(tryptophan)에서 성장 능력이 부족한 효모 변종 균주의 선별 마커를 제공한다. 효모 숙주 세포 게놈에 trp1 부분이 존재하면 트립토판의 부재시 성장에 의해 형질전환체를 선별하는데 좋은 조건이 된다. 유사하게 Lue-2결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 ATCC 38,626)에서는 Lue2 유전자를 함유한 알려진 플라스미드로 보완된다.

그에 더하여, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1으로부터 유래된 벡터는 쿨리버미세스(Kluyveromyces) 효모 형질전환에 유용하게 이용될 수 있다. K. lactis를 위한 송아지 키모신(chymosin) 재조합의 대량 생산하는 발현 시스템은 보고되었다(Van den Berg Bio / Technology . 8: 135, 1990). 또한 상업적 균주 쿨리버미세스(Kluyveromyces)에 의한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정적 다-카피(multi-copy) 발현 벡터도 발표되었다(Fleer. et al . Bio / Technology . 9: 968-975, 1991 참조).

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 기관에 의해 인지되는 프로모터를 함유하며, diabody 핵산 서열에 자동적으로 연결된다. 원핵 숙주에 이용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제(beta-lactamase) 및 락토오스(lactose) 프로모터 시스템, 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 택(tac) 프로모터와 같은 이종(hybrid) 프로모터이다. 그러나 다른 알려진 세균 프로모터도 적합하다. 또한 세균 시스템에 이용하는 프로모터는 diabody DNA에 연결이 가능한 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함한다.

진핵세포의 프로모터 서열은 잘 알려져 있다. 효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리서레이트 키아제(phosphoglycerate kinase) 또는 에놀라아제(enolase), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게네이즈(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 헥소키나제(hexokinase), 피부르산 탈탄산효소(pyruvate decarboxylase), 포스포프럭토키나아제(phospho-fructokinase), 글루코오스-6-포스페이트 아이소모라아제(glucose-6-phosphate isomerase), 3-포스포글리서레이트 뮤타아제(3-phosphoglycerate mutase), 피부르산 키나제(pyruvate kinase), 트리오세포스페이트 아이소모라아제(triosephosphate isomerase), 포스포글루코오스 아이소오라아제(hosphoglucose isomerase) 및 글루코기나아제(glucokinase)와 같은 해당과정(glycolytic) 효소를 위한 프로모터를 포함한다.

성장조건에 의한 전사 제어의 추가적인 이익을 가지는 유발성 프로모터를 가지는 다른 효모 프로모터는 알코올탈수소효소 2(alcohol dehydrogenase 2), 아이소사이토크롬 C(isocytochrome C), 포스파타아제 산(acid phosphatase)을 위한 프로모터 부분이 있으며, 질소대사와 관련있는 degradative 효소, 메탈로타이아닌(metallothionein), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로제네이즈(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 및 말토오스(maltose)와 갈락토오스(galactose) 이용에 관여하는 효소를 위한 프로모터 부분이 있다. 효모 발현에 이용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 제73,657호에 기재되어있다. 또한 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 이용된다.

포유동물 숙주 세포에 있는 벡터로부터의 항체 전사는 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 계두 바이러스(fowlpox virus), 아데노바이러스2(adenovirus 2), 우형 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus), 조류 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 레트로바이러스(retrovirus), B형 간염바이러스(hepatitis-B virus), 가장 바람직하게는 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40: SV40)의 게놈으로부터 얻은 프로모터에 의해 제어되고, 이종의 포유동물 프로모터(액틴(actin)프로모터, 면역글로블린(immunoglobulin) 프로모터 등)과 열 충격(heat-shock) 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해서도 제어되며, 이러한 프로모터는 숙주 세포 체계와의 양립을 제공한다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제기원을 포함한 SV40 제한 절편으로 편리하게 수득될 수 있다. 인간 싸이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 직접 초기 프로모터 부분은 HindIII 제한 절편으로 편리하게 수득될 수 있다. 포유동물 숙주에서 벡터로서 우형 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus)를 이용한 DNA 발현 시스템은 미국 특허 제 4,419,446호에 기재되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 제 4,601,978호에 기재되어 있다. 그에 더하여 로우스 육종 바이러스(rous sarcoma virus) 긴 말단 반복은 프로모터로 이용될 수 있다.

고등 진핵생물에 의한 본 발명의 diabody를 인코딩하는 DNA의 전사는 종종 벡터상의 인핸서 부분을 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자[글로빈(globin), 엘라스타아제(elastase), 알부민, 알파-태아성 단백(alpha-fetoprotein) 및 인슐린]로부터 유래하여 알려져 있다. 그러나 전형적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용한다. 예를 들자면, 복제기원 말단부분(bp 120-270)의 SV40 인핸서, 싸이토메갈로바이러스의 초기 인핸서, 복제기원 말단 부분의 폴리오마(polyoma) 인핸서 및 아데노 바이러스 인핸서가 있다. 또한 진핵세포 프로모터의 활성을 위한 인해서 요소에 대하여 Yaniv. Nature . 297: 17-1, 1982를 참조하라. 인핸서는 diabody의 인코딩 서열을 위해서 벡터의 5' 또는 3'의 자리에 접합시킬 수 있으나 일반적으로 프로모터로부터 5' 자리에 위치한다.

또한 진핵 숙주세포(효모, 균류, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 기관의 핵이 있는 세포)에 이용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정을 위해서 필요한 서열을 포함한다. 이러한 서열은 보통 5'으로부터 이용될 수 있고, 진핵이나 바이러스 DNA 또는 cDNA의 번역되지 않은 부분은 때때로 3'으로부터 이용될 수 있다. 이러한 부분은 항체를 인코딩하는 mRNA의 번역되지 않은 부분에서 폴리아데닐레이트(poly A) 절편으로 번역된 뉴클레오티드를 포함한다. 유용한 전사종결요소는 소의 성장 호르몬 폴리아데닌화(polyadenylation) 영역이다. 상기의 발현 벡터는 WO 제 94/11026호에 기재되어 있다.

본 발명의 disbody는 식물로부터 발현되고 분리될 수 있을 것이다. 식물세포에서 발현 시스템은 종종 재조합 Ti 및 Ri 플라스미드 벡터 시스템에서 유도된다. 운반 벡터의 상호 삽입 클래스(class)에서는 관심있는 유전자는 유전적 재조합에 의해서 비종양성 Ti 플라스미드에 삽입된다. 비종양성 Ti 플라스미드는 식물의 형질전환에 필요한 cis-acting 및 trans-acting 요소를 모두 포함하고 있다. 대표적인 벡터는 pMLJ1 운반 벡터(DeBlock, et al . EMBO J. 3: 1681-1689, 1984) 및 비종양성 Ti 플라스미드 pGV2850(Zambryski, et al . EMBO J. 2: 2143-2150, 1983)를 포함한다. 이원 시스템에서는 관심 있는 유전자를 식물 형질전환을 위해 필요한 cis-acting을 포함하는 운반 벡터에 삽입된다. 다른 필요한 기능은 비종양성 Ti 플라스미드에 의해 트랜스(trans)가 제공된다. 대표적인 벡터는 pBIN19 운반 벡터(Bevan Nucl . Acids Res . 12: 8711-8721, 1984) 및 비종양성 Ti 플라스미드 pAL4404(Hoekema, et al . Nature . 303: 179-180, 1983)를 포함한다.

식물 발현 시스템에서 이용되는 프로모터는 전형적으로 식물세포의 게놈(열 충격 프로모터, 루비스코(RUBISCO)의 작은 서브유닛을 위한 프로모터 또는 엽록소 a/b 결합 단백질을 위한 프로모터 등) 또는 식물 바이러스 게놈[꽃 양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus:　CaMV)]의 35S RNA 프로모터, 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus: TMV)의 피막 단백질 프로모터]에서 유래된다.

본 명세서의 벡터의 diabody 핵산 서열의 클로닝 또는 발현을 위한 적당한 숙주세포는 상기에 기술한 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 상기 목적을 위한 적합한 원핵세포는 그람 음성 또는 그람 양성유기체와 같은 유박테리아(eubacteria)를 포함한다. 예를 들면, 에스처리치아(Escherichi; 예, E. coli)같은 엔테로박테리아씨애(Enterobacteriaceae), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라[Salmonella; 예, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)], 세르티아[Serratia; 예, 세르티아 마르센세스(Serratia marcescans)] 쉬겔라(Shigella), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스(예, B. licheniformis; DD 266,710호 41p에 기재), 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)이다. 대표적인 대장균(E. coli) 클로닝 숙주는 E. coli B, E. coli X1776(ATCC 31,537) 및 E. coli W3110(ATCC 27,325)와 같은 다른 균주도 적당하지만 대장균(E. coli) 294(ATCC 31,446)가 바람직하다. 이 예시는 제한적이라기보다는 실례가 된다.

그에 대하여 원핵생물 외에, 곰팡이 또는 효모와 같은 진핵세포 미생물은 diabody 인코딩 벡터를 위한 클로닝 또는 발현 숙주로 적합하다. 하등 진핵세포 숙주 미생물로 가장 널리 사용된 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 빵효모이다. 그러나 다른 종, 속 및 균주도 본 명세서에서는 유용하게 일반적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 분열효모(Schizosaccharomyces pombe); 클루버마이세스(Kluyveromyces) 숙주와 같은 케이. 라틱스(K. lactis), 케이. 프라질리스(K. fragilis: ATCC 12,424), 케이. 불가리스(K. bulgaricus: ATCC 16,045), 케이. 위커아미(K. wickeramii: ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii: ATCC 56,500), 케이. 드로소필라럼(K. drosophilarum: ATCC 36,906), 케이. 썰모톨러란스(K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로이아(yarrowia: EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris: EP 183,070); 캔디다(Candida ); 트리코마 리시아(Trichoderma reesia: EP 244,234); 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa), 스크와니미세스 오씨덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 스크와니노미세스; 및 네우로스포라(Neurospora), 페니실리엄(Penicillium), 톨리포클라디엄(Tolypocladium)과 같은 곰팡이 및 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니제르(A. niger)와 같은 아스퍼질러스(Aspergillus ) 숙주를 사용할 수 있다.

다세포 유기체에서 diabody의 발현을 위해 적합한 숙주세포는 식물과 곤충 세포와 같은 무척추동물 세포를 포함한다. 수많은 곤충바이러스 균주, 변종 및 유사하게 복제를 허용하는 곤충 숙주 세포는 동정되어 왔으며, 상기 숙주세포로는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda : 모충), 아에데스 이집티(Aedes aegypti: 모기), 아에데스 알보픽터스(Aedes albopictus: 모기), 도르소필리아 멜라노가스터(Drosophila melanogaster: 과일파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)가 있다. 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica)의 NPV L-1 변형체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주 등, 형질전환을 위한 다양한 바이러스 균주가 널리 이용되고 있다.

면, 옥수수, 감자, 콩, 페튜니아, 토마토 및 바나나, 담배의 식물 및 식물 세포 배양체는 숙주로서 이용될 수 있다.

그러나 척추동물 세포에서 효율은 최대가 되고 배양(조직배양)에서의 척추동물 세포의 증식은 일반적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장세포주(293 세포주 또는 현탁배양 성장을 위해 클로닝 된 293 세포주, Graham, et al . J. Gen Virol. 36: 59, 1977); BHK 세포(baby hamster kidney cells, ATCC CCL 10); CHO 세포/-DHFR (Chinese hamster ovary cells/-DHFR, Urlaub, et al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 77: 4216, 1980); 마우스 써톨리 세포(mouth sertoli, TM4, Mather. Biol . Reprod. 23: 243-251, 1980); 원숭이 신장 세포(monkey kidney cells, CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(African green monkey kidney cells, VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 자궁경부 암종 세포(human cervical carcinoma cells, HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(canine kidney cells MDCK, ATCC CCL 34); BRL 세포(buffalo rat liver cells, 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(human lung cells, W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포(human liver cells, Hep G2, HB 8065); MMT 세포(mouse mammary tumor, MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather, et al. Annals NY Acad . Sci. 383: 44-68, 1982); MRC 5 세포, FS4 세포 및 인간 간종양 세포주(human hepatoma line, Hep G2)이다.

숙주 세포는 diabody 생산을 위해 상기의 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되며 프로모터의 함유, 형질전환체의 선별 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하기위해 적합하게 변형된 통상의 영양배지에서 배양된다.

본 발명의 항체 변이체를 생산하기 위해 사용된 숙주세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma, St. Louis, MO), MEM(Minimal Essential Medium: Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 Dulbecco's DMEM(Modified Eagle's Medium, Sigma)과 같이 상업적으로 이용 가능한 배지는 숙주세포를 배양하기에 적당하다. 또한 Ham, et al . (1979) Meth . Enz . 58: 44, Barnes, et al. Anal . Biochem. 102: 255, 1980; 미국 특허 제 4,767,704호; 4,657,866호; 4,927,762호; 4,560,655호 또는 5,122,469호; WO 제 90/03430호; WO 제87/00195호 또는 미국 특허 RE 30,985호에 기재되어 있는 배지도 숙주세포 배양을 위한 배지로 이용될 수 있다. 이러한 배지에 호르몬 및/또는 다른 성장 인자[인슐린, 트랜스페린(transferrin) 또는 표피성장인자 등], 염(염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(HEPES 등), 뉴클레오티드(아데노신 및 티미딘), 항생제(젠타마이신 등), 미량원소(보통 최종 농도에서 마이크로몰 농도로 존재하는 무기물로 정의됨) 및 글루코오스 또는 당량의 에너지원을 첨가할 수 있다. 다른 필요 요소도 당해업계에서 널리 알려진 적합한 농도로 첨가될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양조건은 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이용되어야 하며, 이것은 통상적으로 널리 알려져 있다.

재조합 기술을 사용할 때, diabody는 세포내 세포질 주변에서 생산될 수 있고 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. diabody가 세포질내에서 생산된다면 첫번째 단계로, 미립자 파편인 숙주세포 또는 용해된 세포 절편은 원심분리 또는 한외여과(ultrafiltration) 등을 이용해서 제거된다. Carter 등 (1992) Bio / Technology 10: 163-167에는 E. coli.의 세포질 주변에 분비된 항체를 분리하는 절차는 기술되어 있다. 간략하게는, 아세트산 나트륨(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플로라이드(phenylmethylsulfonylfluoride: PMSF)가 있는 상태에서 약 30분 이상 세포 페이스트(paste)를 용해시켰다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 배지에 diabody가 분비되면, 발현 체계로부터의 상등액은 통상 상업적으로 이용 가능한 아미콘(Amicon) 또는 밀리포아 펠리콘 한외여과기(Millipore Pellicon ultrafiltration unit) 등의 단백질 응집 필터를 이용하여 농축된다. PMSF와 같은 단백질 분해효소(protease) 저해제는 단백질 분해를 막기 위해서 상기의 어떤 단계에서도 첨가될 수 있고 항생제는 우발적인 오염의 성장을 막기 위해서 포함될 수 있다.

세포로부터 준비된 diabody 조성물은 수산화인회석(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 리간드가 부착되기에 가장 적합한 매트릭스는 아가로오스(agarose)이나 다른 매트릭스도 이용가능하다. 다공성 유리구슬(controlled pore glass) 또는 폴리(스티레네디비닐: styrenedivinyl)벤젠 등과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로오스로 수행하는 것보다 유량도 빠르고 수행시간도 짧다. 이온교환 컬럼, 에탄올 침전, 역상 고성능액체크로마토그래피(Reverse Phase HPLC), 실리카 크로마토그피, 음이온 헤파린 세파로오스(heparin SEPHAROSE) 크로마토그래피 또는 양이온 교환수지(폴리아스파르트산 등), 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술 또한 유용하다.

본 발명에서 기술된 인간 diabody 유도체는 스트랩토코쿠스 뮤탄스를 응집시킬 수 있으므로 구강질환의 수동 면역을 위한 유용한 치료제이다. 그러므로 본 발명의 실시예는 diabody의 치료용 조성물 또는 제형을 제공할 수 있다. 본 발명의 diabody는 어떠한 편리한 방법으로도 포유동물 구강의 치아에 적용될 수 있다. 다양한 방법은 다양한 목적을 위한 다양한 재료로 치아의 치료에 유용하다. 치료가 치과의사에 의해 수행된다면 diabody는 치아 표면에 편리하게 응용될 수 있다. diabody가 개인에 의해 적용된다면 치약, 양치질 물약, 껌, 정제 또는 젤 및 정규적인 양치질을 하는 동안에 적용될 수 있고, 또는 diabody는 단독 치료로서 제형화되고 포장될 수 있으며 정규적인 양치질 전, 후 및/또는 하는 동안 단독으로 이용될 수 있다. 치약 등으로의 개별 적용은 매일 반복함으로써 결과가 나타날 수 있고, 정제의 이용은 diabody의 빈번한 적용으로써 결과가 나타날 수 있다. 껌과 젤이 이러한 목적으로 적용된다면 한 시간 반 정도 또는 그 이상으로 diabody의 방출이 지속되는 양을 제공해야 한다. diabody 방출의 유지가 요구된다면, 구강의 온도 또는 침의 상태에 따라서 diabody를 구강으로 천천히 방출하는 적합한 제형이 이용될 수 있다. 확실한 경우에는 치아 표면에 diabody의 좀 더 표면적인 장기 접촉을 제공하는 것이 바람직하며, 상기와 같은 경우 적합한 치과용 트레이 또는 점착성 스트랩이 diabody 조성물로 치아를 덮거나 치료하는 동안 침 등에 의해 제거되는 diabody를 막기 위해 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 diabody의 치료적 투여를 위한 제형은 원하는 등급의 순도를 가린 disbody를 확립된 방법에 따라 생리적으로 허용가능한 담체, 첨가제 또는 안정제를 추가여 혼합함으로써 제조될 수 있다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20th ed. Lippingcott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000). 허용되는 담체, 첨가제 또는 안정제는 복용량 및 허용된 농도를 수용하기 위해서 무독성이어야 하며 인산염, 구연산염 및 다른 유기산 같은 완충액; 항산화제; 방부제; 저분자 무게(10개의 잔기 이하)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로블린과 같은 단백질; 친수성 폴리머; 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코오스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA과 같은 킬레이트 시약; 당류; 염-형성 대응 이온; 금속 복합체(예, 아연-단백질 복합체); 및/또는 트윈, 플루로닉스(PLURONICS) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 계면활성제를 포함한다.

diabody 조성물은 치료를 위해 특별한 적용을 위해 필요한 경우, 특별히 특별히 서로 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 보이며 자동적으로 연결되지 않는 하나 이상의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들면 항생제는 바람직하게 조합되거나 본 발명의 diabody 조성물 일부로서 제공될 수 있다. 상기 분자는 목적을 위해 유효량으로 적합하게 존재한다.

본 발명의 다른 실시예에서, 본 명세서의 기재된 diabody는 예로서, 글루코오스 산화효소(glucose oxidase) 또는 디펜신(defensin)(Maisetta, et al . Antimicrob. Agents Chemother. 47: 3349-3351, 2003 참조)과 같은 치료제에 실시 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에서 이용시 실시 가능하게 조합되거나 또는 연결된다는 것은 diabody 및 치료제가 조합되거나 서로 접합된다는 의미이다. diabody 및 치료용 단백질의 경우, 같은 인접된 mRNA 서열을 번역함으로써 실시 가능하게 연결될 수 있다. 그에 더하여, diabody와 치료제는 본 명세서에서 기재한 바와 같이 링커를 통해서 공유결합으로 부착될 수 있다. 더 나아가, 항생제와 같은 치료제는 아미드 결합을 통해서 본 발명의 diabody 의 아미노 그룹의 리신(Lysine) 곁사슬에 부착될 수 있다.

또한 본 발명의 실시예는 스트랩토코쿠스 뮤탄스 및 스트랩토코쿠스 소브리누스와 같은 스트랩토코쿠스와 관련된 구강질환을 예방 및 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 적어도 하나의 징후 또는 증상(세균의 군집화) 또는 당해업계에서 정의된 질환의 다른 지표를 개선 또는 제거하여 구강질환을 저해 또는 예방에 의한 개선을 성취하기 위해 본 발명의 diabody의 유효량의 투여와 관련이 있다. diabody 또는 diabody 조성물은 환자 개개인의 임상적 상황, 투여 방법 및 위치, 투여 일정, 환자의 나이. 성별, 체중을 고려하고 개업의에게 잘 알려진 다른 요소에 따라 최상의 의학적 실행에 따라 투여되고 복용된다.

diabody의 국소 투여는 가장 실제적인 투여이다. diabody가 치아의 표면과 접촉하게 하고 치아의 표면에 부드럽게 맞물리도록 이상적으로 적용되어지는 것이 중요하다.

일반적으로, 적용되는 diabody의 정량은 나타나지 않는데 상기 형태의 방법에서 diabody의 반복된 적용은 어렵지 않다. 실제로, 특별히 치과의사에 의한 초기 치료 후에 유지 또는 충전 치료는 사용자가 바라는 만큼 얼마든지 수행될 수 있다. 모범적인 방법에 의하면, 각각의 경우에 따라서 10 내지 500 mg의 diabody를 각각의 치아에 적용될 수 있으며, 적용된 diabody의 양은 손실을 일으키지 않으면 목적을 위해서 상기 범위를 벗어날 수 있다. diabody의 부족한 양의 이용은 얻을 수 있는 예방 정도가 대단하지 않음을 의미하는 반면 diabody의 과도한 이용은 예방을 향상시키지는 못하고 단순히 불필요한 diabody만을 증가시킴을 의미한다.

diabody를 위한 추출물 제형은 중요하지 않으며 전반적으로 사용자의 편리함과 가능한 적용 방법에 의존한다. 모든 경우에, 적당한 pH와 단백질 분해를 일으킬 수 있는 다른 유독한 물질이 없는 환경은 diabody 형성에 중요하다. 또한 대상의 구강에서 유해한 환경을 유발할 수 있는 미생물 불순물도 없어야 한다. 예를 들자면, 치과수술에서의 이용을 위하여, diabody는 100 ㎕당 0.1 내지 10 mg의 diabody를 함유한 단순 수용액 살포제로 제형화될 수 있고 상기 농도의 용액은 치아에 치아 분포마다 약 1 내지 10 ㎕의 비율로 적용될 수 있다. 자기투여를 위한 diabody의 농도는 상기의 지침을 참고로 하여 선별되어질 수 있다. 각각의 자기투여의 경우 보통 취해지는 제형의 양 및 초과한 diabody의 투여는 유해하지 않다.

또한 diabody는 충치에서 SAI/II를 발현하는 스트랩토코쿠스 세포의 존재를 탐색하는 진단 분석에 유용하다.

진단의 적용을 위하여, 전형적으로 diabody는 검출 표지자와 함께 표지된다. 하기와 같은 종류의 수많은 표지자가 유용하다: 방사성동위원소, 형광 표지자 또는 다양한 효소-기질 표지자가 있다. 방사성동위원소로는 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I이 있다.

diabody는 current protocols in Immunology, Volumes1 및 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs, 1991에 기재된 예제 및 신틸레이션(scintillation) 카운팅으로 측정될 수 있는 방사능의 성질을 이용하여 방사성동위원소는 표지자로 이용될 수 있다.

드문 토양 킬레이트(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실(dansyl), 리사마인(Lissamine), 피코에리트린(phycoerythrin) 및 텍사스 레드(Texas Red)와 같은 형광 표지자가 이용가능하다. 예로서 형광 표지자는 상기 기재되어 있는(current protocols Immunology) 기술을 이용해서 diabody와 접합될 수 있다.

다양한 효소-기질 표지자가 이용가능하며 미국 특허 제 4,275,149호는 이들의 몇몇 자료를 제공한다. 일반적으로 효소는 다양한 기술로 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들면, 효소는 기질의 색의 변화를 촉매시키며 이는 분광 광도계로 측정될 수 있다. 그에 더하여, 효소는 기질의 형광 발광 또는 화학 발광을 변경한다. 형광 발광 변화의 정량을 위한 기술은 하기에 기재되어 있다. 화학 발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기(excited)된 이후 방사된 빛이 측정되거나(예, 화학 발광 분석기 이용) 형광성 수용체에게 에너지를 제공한다. 효소 표지자는 루시퍼라아제[예; 파이어플라이(firefly) 루시퍼라아제 및 세균 루시퍼라아제; 미국 특허 제 4,737,456호], 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라지네디온(2,3-dihydrophthalazinediones), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase), 우레아제, 양고추냉이 페록시다아제(HRPO)와 같은 페록시다아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 산화효소(예; 글루코오스 산화효소, 갈락토오스 산화효소, 및 글루코오스-6-인산 탈수소효소), 이종고리식(heterocyclic) 산화효소(우리카아제 및 크산틴산화효소 등), 락토페록시다아제, 마이크로페록시다아제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay와 Methods in Enzymology (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166, 1981에 기재되어 있다.

때때로 표지자는 diabody와 간접적으로 접합된다. 당업자는 이것을 달성하는데는 다양한 기술이 있음을 안다. 예를 들어 diabody는 비오틴(biotin)과 접합될 수 있고 상기에서 언급된 3가지의 표지자 방법 중 어느 한 가지의 방법으로 아비딘(avidin) 또는 역으로 접합될 수 있다. 비오틴은 선별적으로 아비딘과 결합함으로써 표지자는 diabody에 간접적인 방법으로 접합될 수 있다. 그에 더하여, diabody와 표지자의 간접적인 결합을 위해서, diabody는 작은 합텐(예, 디곡신)과 접합될 수 있고 상기에 언급된 3가지 방법 중 하나로 항-합텐 항체 변이체와 접합될 수 있다(예, 항-디곡신 항체). 그러므로 diabody와 표지자의 간접적인 접합은 달성될 수 있다. 또한 diabody는 예로서 재조합 단백질로서 알칼리 포스파타아제에 직접적으로 융합될 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 diabody에 표지가 필요하지 않으며, 그의 존재를 diabody와 결합할 수 있는 표지된 항체를 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 diabody에는 경쟁성 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침강 법과 같이 알려진 어떤 분석 방법을 적용해도 된다. 졸라（Zola）단일클론항체:　A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

편리를 위하여, 본 발명의 diabody는 진단 분석을 수행하기 위한 사용 설명서와 함께 미리 결정된 양의 시약이 포장된 기수인 키트(kit)로 제공될 수 있다. 효소로 표지되어 있는 diabody가 있는 경우, 키트는 효소에 의해 요구되는[예, 검출가능한 발색단(chromophore) 또는 형광물질(fluorophor)을 제공하는 기질 전구체(precursor)] 기질과 공동인자를 포함하게 될 것이다. 그에 더하여, 다른 첨가제는 안정제, 완충액(예, 저해 완충액 또는 세포 용해 완충액)등이 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 분석의 민감성을 실질적으로 적정화하기에 적합한 시양의 용액 농도를 제공하기 위해 매우 다양하다. 특별히, 일반적으로 동결 건조된 건조 분말로 제공될 수 있고, 용해에 의해 적당한 농도를 가진 시약 용액을 제공할 수 있는 첨가제가 포함된다.

본 발명은 하기의 한정되지 않는 실시예에 의해 상세히 설명된다.

실시예 1: 스트랩토코쿠스 뮤탄스( streptococcus mutans )의 증식

스트랩토코쿠스 뮤탄스(streptococcus mutans) 20523 혈청학적 그룹 (serological group) C는 DSMZ(Braunschweig, Germany)에서 구입했고 사용하기 전에 S₂ 함유 배양기에서 효모 추출 배지(30 g/L trypticase soy broth, 3 g/L yeast extract, pH 7.0-7.2)에서 37℃로 2 일간 배양했다.

실시예 2: spa P 유전자의 클로닝

spaP 유전자의 SAI/II 항원을 인코딩하는 뉴클레오티드 214에서 3048부분을(Bleiweis, et al. Arch . Oral Biol. 35 Suppl: 15S-23S, 1990) SfiI/NotI 절편인 pUC18에서 절단해서 같은 효소로 절단되는 세균 발현 벡터 pCantab5E(Pharmacia, Freiburg, Germany) 및 pSin1(Amersdorfer and Marks. Methods Mol . Biol. 145:219-40, 2000)에 삽입하였다. pCantab5E 벡터는 단일클론항체 5E(Pharmacia)를 이용함으로써 발현 단백질의 탐지를 용이하게 하는 E-태그(tag) 서열을 추가적으로 포함한다. 이와 비슷하게 pSin1 벡터는 뮤린 단일클론항체 9E10(ATCC CRL 1729)로 탐지를 용이하게 하는 MYC-태그 및 IMAC(immobilized metal-chelate affinity chromatograp)을 이용함으로써 발현 단백질의 정제를 용이하게 하고 뮤린 펜타-HIS 항체(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용해서 탐지를 용이하게 하는 His-태그를 인코딩하는 서열을 포함한다. pSin1을 이용하며 발현된 SAI/II는 파지-발현 라이브러리로부터 항체를 선별하는데 이용된다. pCantab5E에서 발현된 SAI/II는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 이용된다.

실시예 3: 상자성 비드(pharamagnetic bead)로 SAI / II 를 코팅하기

파지-발현 항체를 선별하기 위해서 PBS로 세척된 디나비드(Dynabead: Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany) 250 ㎕를 0.1 M의 인산염 용액(pH 7.4) 500 ㎕에서 첨가하고 2분간 부드럽게 혼합했다. 비드는 자석으로 수득하고 상층액은 버리고 수득한 비드는 다시 같은 완충액 250 ㎖에 첨가한 후, SAI/II 항원 500 ㎕를 첨가했다. 37℃에서 16 시간 동안 교반시키면서 배양한 후, 비드를 자석으로 수득하고 상층액은 버렸다. 코팅된 비드는 4회 세척하였고, 0.13 M NaCl, 1% 우유 분말이 포함된 0.1 M 인산염 용액(pH 7.4)으로 37℃에서 5분간 2회 세척하였고, 37℃에서 4 시간 동안 0.2 M Tris-HCl(pH 8.5) 용액으로 1회 세척하였고 다시 같은 완충액으로 4℃에서 5분간 세척했다.

실시예 4: pSin1 에서 scFv Guy's 13의 클로닝

뮤린 단일클론항체 Guy's 13의 가변 영역 유전자는 올리고뉴클레타이드 프라이머 LMB3(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3' : 서열번호 12) 및 fdSeq 1(5'-GAA TTT TCT GTA TG/AG GG-3' : 서열번호 13)을 이용하여 증폭된 후, SfiI 및 NotI으로 절단했다. 생성물은 같은 효소로 처리한 파지미드(phagemid) 벡터 pSin1에 삽입했고 이 재조합 벡터는 E. coli 균주 TG1에 도입되었다.

실시예 5: 인간 SAI / II -특이적 scFv 항체

뮤린 항체 Guy's 13의 가변 중연쇄 항체 영역은 인간 말초혈액 림프구(8 × 10⁸)에서 유래한 경쇄 항체 파지-발현 라이브러리를 포함하는 세균 발현 벡터인 pHenIX상에서 SfiI/SalI 절편으로 클로닝되었다. 상기 벡터는 필라멘트형(filamentous) 박테리오파지 M13의 소수 외피 단백질(minor coat protein)과 N-말단 융합으로 항체 절편이 발현하는 파지미드 벡터 pHenI(Hoogenboom, et al. Nucl. Acids Res. 19: 4133-7, 1991)에 기초하고 있다. 두개의 융합된 상대 사이에 앰버 정지 코돈(amber stop codon)은 가용성 항체 절편 및 재조합 항체를 발현하는 파지 입자의 발현을 허용한다. 재조합 벡터는 E. coli 균주 TG1에 도입되었다. 3회 선별은 확립된 방법(Marks, et al . J. Mol . Biol. 222: 581-97, 1991)으로 고정시킨 SAI/II 항원을 이용해서 수행하였다. 용리(elution)는 같은 에피토프(epitope)를 인지하는 결합제(binder)를 선별하기 위해서 단일클론항체 Guy's 13을 이용해서 수행하였다. 가용성 scFv 발현은 정의된 방법으로 수행되었다(Marks, et al. supra , 1991). 또한 SAI/II 항원을 위한 특이적 scFv는 SAI/II 항원을 이용한 ELISA로 동정되었다. 옮겨진 인간 경쇄의 선별된 가변 항체 영역 유전자는 인간 가변 중연쇄 라이브러리를 포함하는(8 × 10⁸) pHenIX의 ApaLI 및 NotI 절편을 E. coli TG1에 도입시킴으로써 클로닝되었다. 이는 프라이머 VΚ4 ApaLI(5'-TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC-3' : 서열번호 14), VΚ1 ApaLI(5'-TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC-3' : 서열번호 15) 및 JΚ1 NotI(5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT C/TTC CAC/G CTT GGT CCC-3' : 서열번호 16)를 이용한 인간 경쇄 유전자의 PCR 증폭에 의해 달성되었다. 3회의 선별은 디나비드 상에 고정시킨 SAI/II 항원을 이용해서 수행되었다. 간략하게는, SAI/II로 코팅된 비드 150 ㎍을 2% 우유 분말 2 ㎖에 1시간 동안 차단하였다. 비드는 자석으로 수득하였으며 PBS로 세척한 후, 항체-파지 발현 라이브러리와 함께 1 시간 동안 교반기에서 배양시켰다. 비드는 PBS/0.05% TWEEN 20으로 15회 세척하였으며, 결합되지 않은 파지를 제거하기 위해서 PBS로 15회 세척하였다. 결합된 파지는 교반기에서 10분간 100 mM 트리에탄올아민 100 ㎖에 용출하여 분리한 후, 200 ㎕의 1 M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화시켰다. 용출된 파지는 지수적으로 자라는 E. coli TG1을 감염시키는데 이용되었고 30℃에서 하룻밤동안 100 ug mL-1 암피실린과 1% 글루코오스를 함유한 TYE 배지에 배양시킨다. 가용성 scFv 발현의 선별, 파지 증식 및 도입은 정의된 방법으로 수행되었다(Marks, et al. supra , 1991). 항원-특이적 인간 scFv 절편은 SAI/II 항체를 이용한 ELISA를 통해서 동정되었다.

실시예 6: 파지 발현 항체 라이브러리의 증식

2 × TY(100 ug mL-1 ampicillin과 1% 글루코오스 첨가) 1 L에 파지 항체 라이브러리의 글리세롤 스탁(stock) 일부를 배양시켰다. 파지의 증식 및 도입은 확립된 방법에 따라서 수행되었다(Marks, et al. supra , 1991). 파지미드 증식은 파지 항체 라이브러리를 증식하기 위하여 헬퍼(helper) 파지 VCSM13(Pharmacia) 1010 unit를 첨가함으로써 수행되었다. 배양 배지는 100 ug/㎖ 암피실린 및 25 ug/㎖ 카나마이신이 포함된 2 × TY로 교체되었고 30℃에서 하룻밤 동안 회전 진탕기에서 250 rpm으로 배양시켰다. 파지는 PEG(20% PEG, 2.5 M NaCl) 침전으로 2회 정제시킨 후, PBS 2 ㎖ 최종 부피로 용해시켰다. 파지는 다음 이용을 위해 4℃에 보관하였다.

실시예 7: DNA 서열 분석

복제된 클론의 수는 프라이머 LMB3(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3' : 서열번호 12) 및 fdSeq 1(5'-GAA TTT TCT GTA TG/AG G-3' : 서열번호 13)을 이용하여 재조합 항체 삽입의 PCR 증폭에 의해 결정되었고 BstNI(New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소에 의해 절단되었다. 각각의 절단된 두개의 클론으로부터 유래된 가변 항체 유전자는 제조사의 지침(LI-COR, Lincoln, NE)에 따라 적외선 표지된 프라이머를 이용하여 PCR 서열분석으로 분석되었다. 서열 분석 반응은 LI-COR 자동 DNA 서열분석기(4000L)로 수행되었고 서열은 씨퀀서 3.1(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI)을 이용함으로써 분석되었다. VH 및 VL 유전자의 서열은 V-BASE database( http://www.mrccpe.cam.ac.uk / vbase - ok . php ? menu =901; Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)에서 생식계열 서열과 비교되었다.

실시예 8: Diabody 의 구축

Diabody(Holliger, et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA90:6444-8)는 인간 scFv 클론의 중연쇄 및 경쇄의 항체의 가변 영역의 PCR 증폭과 이를 pHenIXdia 벡터에서 서브클로닝 시켜 수행되었다. Diabody 구조는 10 개의 아미노산 링커(Thr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Ala-Leu; : 서열번호 9)로 연결된 중연쇄 및 경쇄의 항체 가변 영역으로 구성되었고 용액에서 두 개의 항원 결합 자리를 만들기 위해서 발현된 영역이 상보적 사슬에 부착되게 한다. Diabody 항체 형성의 구성을 위하여 이용된 프라이머는 다음 표 1과 같다.

Diabody 항체 형성의 구성을 위한 프라이머

주형	VL 증폭
pHenIX 인간 scFv B10	Vк1 ApaLⅠ	Jк1 NotⅠ
pHenIX 인간 scFv H6	Vк1 ApaLⅠ	Jк1 NotⅠ
pHenIX 인간 scFv D12	Vк1 ApaLⅠ	Jк1 NotⅠ
pHenIX scFv mGuy13	mGuy13 ApaLⅠ	mGuy13 NotⅠ
	VH 증폭
pHenIX 인간 scFv B10	VH4 sfiI/NcoⅠ	JH3 for SalⅠ
pHenIX 인간 scFv H6	VH6 sfiI/NcoⅠ	JH3 for SalⅠ
pHenIX 인간 scFv D12	VH4 sfiI/NcoⅠ	JH3 for SalⅠ
pHenIX scFv mGuy13	VH4 sfiI/NcoⅠ	mGuy13 SalⅠ

Vк1 ApaLI: 5'-TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC-3' (서열번호 15);

Vк4 ApaLI: 5'- TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC-3' (서열번호 14);

Jк1 NotI: 5'-GAG TCAT TCT CGA CTT GCG GCC GCA CGT TTG ATC/T TCC AC/GC TTG GTC CC-3' (서열번호 16);

V_H4 SfiI/NcoI: 5'-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG CA/GG AGT CGG G-3' (서열번호 17);

V_H6 SfiI/NcoI: 5'-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTACAG CTG CA/GC AGT CAG G-3' (서열번호 18);

J_H3 SalI: 5'-GAG TCA TTC TCG TGT CGA CAC GGT GAC CAT TGT CCC-3' (서열번호 19);

J_H2 SalI: 5'-GAG TCA TTC TCG TGT CGA CAC AGT GAC CAG GGT GCC-3' (서열번호 20);

mGuy13 ApaLI: 5'-TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CC-3' (서열번호 21);

mGuy13 NotI: 5'-TTT TCC TTT TGC GGC CGC CCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT-3' (서열번호 22); 및

mGuy13 SalI: 5'-GAG TCA TTC TCG TGT CGA CAC GGT GAC CGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GTC AAA GTA GGT-3' (서열번호 23).

실시예 9: 대용량의 단백질 생산

재조합 단백질은 30℃에서 3 내지 4 시간 동안 IPTG(O.5 mM)과 함께 도입시킨 후(Breitling, et al . Gene 104: 147-153, 1991) 세균 원형질막 공간에서 회수하였다. 원심분리(4000 × g, 4℃, 30 분) 후에 펠렛(pellet)은 20% 수크로오스와 1 mM EDTA가 첨가된 10 ㎖의 30 mM Tris-HCl(pH 8.2)에 용해시키고 15분간 얼음에 방치한 후 다시 상기와 같이 원심분리를 하였다. 펠렛은 1 mM EDTA가 첨가된 10 mL의 5 mM MgSO₄에 용해시키고 상기와 같이 마지막으로 원심분리를 하기 전에 얼음에 15분간 방치하였다. 상기 두개의 상등액은 모아서, PBS로 투석하여 4℃에 보관하였다. 재조합 단백질은 융화성의 용질이 존재하는 삼투압 스트레스하에서 원형질막내에서도 발현되었다(Barth, et al. Appl . Environ . Microbiol. 66: 1572-9, 2000). 간략하게는, 세균은 26℃에서 100 ug/㎖ 암피실린 및 0.5 mM ZnCl₂를 첨가한 TB(Terrific Broth: TB, 12 g/L 박토-트립톤, 24 g/L 박토-효모-추출물, 4 mL/L 글리세롤)에서 하룻밤 동안 동안 배양하였다. 배양은 같은 배지의 200 mL을 30배 희석하였다. OD₆₀₀ nm에서 배양액의 농도가 2.0이 될 때, 배양액에 0.5 M 소르비톨, 4% NaCl, 40 mM 글리신 베타인을 보충했고 26℃에서 추가적으로 30 ~ 60 분간 배양하였다. 발현은 최종 농도 1 mM인 IPTG 및 26℃에서 6시간 동안 성장시킴으로써 유도되었다. 세포는 30,000 × g에서 10분 동안 원심분리에 의해서 수득되었다. 재조합 항체 절편은 상기에서 기술한 바와 같이 원형질막 공간으로부터 분리되었다. 원형질막 및 삼투압 충격 분획을 모았고 PBS로 투석하였다. 페닐메틸수포닐플로라이드(PMSF)는 1 mM의 최종농도로 첨가되었다.

실시예 10: 재조합 단백질의 정제

인간 scFv 및 diabody 항체 절편은 잘 알려진 방법(Griffiths, et al. EMBO J. 13:3245-3260, 1994)에 따라서 His6 태그를 이용하는 IMAC에 의해서 정제되었다. 간략하게는, 10 mL 컬럼(BIO-RAD Polyprep chromatography columns)은 500 ㎕ Ni-NTA 레진(resin, Qiagen)으로 충진되었고, 재조합 단백질을 로딩하기 전에 컬럼의 5배 부피의 PBS로 세척하였다. 칼럼은 10 mM 이미다졸을 함유하고 있는 컬럼의 10배 부피의 PBS로 세척하였다. 결합된 단백질은 250 mM 이미다졸로 용출되었고 1 mL 분획으로 수득되었다. 단백질 농도는 재조합 단백질과 함께 0.7 mg/mL의 scFv 또는 diabody와 일치하는 A 280 nm = 1에서 분광광도법으로 측정하였다. 겔 여과는 더 나은 정제를 위해서 이용되었다. 세파덱스(SEPHADEX) 200 칼럼(Pharmacia)은 PBS로 평형을 유지시켰다. ScFv 또는 diabody 항체 절편은 로딩되었고 분당 1 mL 씩 진행하였다. 아프로티닌(Aprotinin, 6500 Da), 시토크롬 C(cytochrome C, 12,400 Da), 탄산탈수 효소(carbonic anhydrase, 29,000 Da), BSA(66,000 Da) 및 덱스트란 블루(Dextran Blue, 2,000,000 Da)는 분자량 표준으로 이용되었다(Fluka, Buchs, Switzerland).

실시예 11: ELISA( Enzyme - Linked Immunosorbent Assay )

스트랩토코쿠스 뮤탄스, SAI/II 항원 또는 우혈청알부민(BSA)은 PBS에서 4℃에서 하룻밤 동안 웰 당 1 ~ 10 ug의 농도로 ELISA 플레이트(Nalge Nunc International, Rochester, NY)에 코팅되었다. 플레이트는 PBS로 3회 세척되었고 2시간 동안 상온에서 2% 우유 분말을 함유한 PBS로 차단하였다. scFv는 하룻밤 동안 유도된 배양의 웰 당 1 ug 또는 웰 당 100 ㎕의 농도로 시험하였다. MYC 태그를 함유한 재조합 항체는 뮤린 9E10 단일클론항체(ATCC CRL1729)로 검출되었다. His6 태그를 함유한 항체는 뮤린 항-핀타-히스 항체(murine anti-penta-HIS antibody, Qiagen)를 이용함으로써 검출되었다. 뮤린 항체는 염소-항-마우스(Fc-특이적) 페록시다아제로 표지된 항체로 검출되었다. 분석은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, Sigma, St. Louis, MO)으로 전개되었다. 반응은 20분 후에 H₂SO₄의 첨가로 중단시키고 OD₄₅₀nm에서 측정하였다. 모든 배양 단계마다, 플레이트는 PBS/0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였고 PBS로 3회 세척하였다.

실시예 12: 스트랩토코쿠스 뮤탄스의 응집

배양된 스트랩토코쿠스 뮤탄스는 20 ㎕로 분주되었고 세균으로 발현된 재조합 항체를 순차적으로 희석하여 랩-테크 II 챔버 슬라이드(Lab-Tek II chamber slides, Nalge Nunc International)에서 4℃에서 2일 동안 또는 37℃에서 1 시간 동안 배양되었다. 과도한 배지는 버렸고 세포는 공기 중에서 건조시켰다. 세균은 그람 용액(Diagnostica Merck, Darmstadt, Germany)으로 대조염색하였다. 슬라이드는 이뮤노플루오르 배지(Immunofluor medium, ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA)로 고정시켰고 제이스 악시오스콥(Zeiss Axioskob) 면역형광검사법 현미경으로 촬영하였다.

<110> Fraunhofer-Gesellschaft zur Forderung der angewandten Forschung E.V. <120> A DIABODY WHICH SPECIFICALLY BINDS STREPTOCOCCUS SURFACE ANTIGEN I/II AND METHODS OF USE THEREOF <130> 6FPI-10-001 <140> PCT/EP2005/004284 <141> 2005-04-21 <150> US 60/564,396 <151> 2004-04-22 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser Arg Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Thr Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Leu Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Thr Ser Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln 100 105 110 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 <210> 3 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic diabody heavy chain variable domain <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ala Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Tyr Asp Tyr Val Trp Gly Ser Tyr Arg Pro Asn Glu Tyr 100 105 110 Gly Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic diabody light chain variable domain <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Leu Ile Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 5 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic diabody heavy chain variable domain <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Leu Gln Asp Asp Tyr Val Trp Gly Ser Pro Asn Trp 100 105 110 Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 6 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic diabody light chain varialbe domain <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Phe Thr Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic diabody light chain variable domain <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Ala Gly Thr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 8 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic diabody light chain variable domain <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Leu Ile Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic linker <400> 9 Thr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Leu 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic linker <400> 10 Ser Val Asp Gly Gly Gly Gly Ser Val His 1 5 10 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic linker <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 caggaaacag ctatgac 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 gaattttctg tatrggg 17 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 tgagcacaca gtgcactcga catcgtgatg acccagtctc c 41 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 tgagcacaca gtgcactcga catccagatg acccagtctc c 41 <210> 16 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatytccasc ttggtcc 47 <210> 17 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctgcrgag tcggg 55 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtac agctgcrcag tcagg 55 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 gagtcattct cgtgtcgaca cggtgaccat tgtccc 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 gagtcattct cgtgtcgaca cagtgaccag ggtgcc 36 <210> 21 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 tgagcacaca gtgcactcga catcgagctc actcagtctc c 41 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 ttttcctttt gcggccgccc gttttatttc caactttgt 39 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 gagtcattct cgtgtcgaca cggtgaccgt ggtgccttgg ccccagtagt caaagtaggt 60 60

Claims (12)

1. 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 인간 중쇄 사슬 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 인간 경쇄 사슬 가변 영역을 포함하며, 특이적으로 스트랩토코쿠스(streptococcus) 표면 항원 I/II와 결합하는 분리된 다이아바디(diabody).
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 중쇄 사슬 가변 영역과 경쇄 사슬 가변 영역 사이에 위치한 짧은 링커 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 다이아바디.
5. 제 4항에 있어서, 링커는 서열번호 9의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 다이아바디.
6. 제 1항에 있어서, 상기 다이아바디에 작동 가능하게 연결된 치료제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 다이아바디.
7. 제 1항의 다이아바디를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
8. 제 7항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
9. 삭제
10. 제 1항의 다이아바디를 포함하는 조성물.
11. 구강질환의 적어도 하나의 징후 또는 증세를 예방 또는 치료하기 위하여, 제 1항의 다이아바디의 유효량을 포함하는, 스트랩토코쿠스와 관련된, 치주염 또는 치아우식증인 구강질환의 예방제 또는 치료제.
12. 제 1항의 다이아바디를 포함하는 충치 진단용 키트.

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