KR100914234B1 - Bacillus subtilis sm022m strain and method of controlling plant pathogens using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 식물병원균에 대하여 방제효과를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 균주, 이를 포함하는 식물병원균 방제용 조성물, 및 이를 이용한 식물병원균 방제 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Bacillus subtilis strain having a control effect against phytopathogens, a composition for controlling phytopathogens comprising the same, and a method for controlling phytopathogens using the same.
식물의 병해충 방제에는 친환경적인 기술이 보급되도록 추진되고 있는데, 생물농약은 그 동안 경제성과 제제의 제조방법 및 사용 방법상의 문제 등으로 인해 대규모로 생산되지는 못하였다. 최근 식물병의 생물학적 방제 연구가 활기를 띠어 미생물 제제의 실용화 가능성으로 외국에서는 길항 진균과 세균을 이용한 미생물 농약에 대하여 많은 개발이 이루어지고 있다(Cook and Baker, 1983; Kim 등, 1990; Dandurand 등, 2000; Jack and Robert, 1998; Jack and Robert, 2001). 예컨대, 균핵병의 생물학적 방제 인자로서 Coniothyrium minitans (Whipps and Gerlagh, 1992), Serratia plymuthica (Merav 등, 2003), Ulocladium atrum(Li 등, 2003), Pseudomonas fluorescens(Pedras 등, 2003), Bacillus megaterium N4 (이재필 등, 2002), Nostoc strain ATCC 53789(Biondi 등, 2004) 등이 보고된 바 있다.Environmentally friendly technologies are being promoted to control pests of plants. Biopesticides have not been produced on a large scale due to economic problems and problems in the preparation and use of preparations. Recently, research on biological control of plant diseases has been encouraging, and as a result, the development of microbial pesticides using antagonistic fungi and bacteria has been developed in foreign countries (Cook and Baker, 1983; Kim et al., 1990; Dandurand et al. 2000; Jack and Robert, 1998; Jack and Robert, 2001). For example, Coniothyrium minitans (Whipps and Gerlagh, 1992), Serratia plymuthica (Merav et al., 2003), Ulocladium atrum (Li et al., 2003), Pseudomonas fluorescens (Pedras et al., 2003), Bacillus megaterium N4 (Refill) Et al., 2002), and Nostoc strain ATCC 53789 (Biondi et al., 2004).
현재 전세계 생물농약시장은 7000 억원 정도로 소규모이지만 매년 12%정도의 고속성장을 지속하고 있으며, 특히 미생물농약 분야는 년간 15 내지 20%의 고속성장을 지속할 것이라고 예측하고 있다(농경과원예사, 2001; Steve, L, 1999; Knight 등, 1997).At present, the global biopesticide market is small at about 700 billion won, but it continues to grow at a rapid rate of 12% annually, especially in the microbial pesticide sector. Steve, L, 1999; Knight et al., 1997).
따라서, 친환경적이고 인축에게 무해하면서 보다 다양한 식물병원균에 대하여 방제 활성을 갖는 생물학적 방제제의 개발이 요구된다.Therefore, there is a need for the development of biological control agents that are environmentally friendly, harmless to humans, and have a control activity against various phytopathogens.
이에, 본 발명의 일례는 식물병원균에 대하여 방제효과를 갖는 신규 바실러스 서브틸리스 균주를 제공한다.Thus, one example of the present invention provides a novel Bacillus subtilis strain having a control effect against phytopathogens.
다른 예에 있어서, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 균주를 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제제를 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a phytopathogen control agent comprising the Bacillus subtilis strain as an active ingredient.
또 다른 예에 있어서, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 균주를 식물에 적용하는 단계를 포함하는 식물병원균 방제 방법을 제공한다.In another example, the present invention provides a method for controlling phytopathogenic bacteria comprising applying the Bacillus subtilis strain to a plant.
본 발명은 식물병원균에 대하여 방제효과를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 균주, 이를 포함하는 식물병원균 방제용 조성물, 및 이를 이용한 식물병원균 방제 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Bacillus subtilis strain having a control effect against phytopathogens, a composition for controlling phytopathogens comprising the same, and a method for controlling phytopathogens using the same.
본 발명자들은 식물병원균에 대하여 우수한 항균활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 균주 (수탁번호: KCTC11440BP)를 분리 및 동정하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors have successfully isolated and identified Bacillus subtilis SM022M strain (Accession No .: KCTC11440BP) having excellent antimicrobial activity against phytopathogens and completed the present invention.
따라서, 본 발명의 일례는 식물병원균에 대하여 항균활성을 갖는 수탁번호 KCTC11440BP 의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 균주를 제공한다.Thus, one example of the present invention provides a Bacillus subtilis SM022M strain of Accession No. KCTC11440BP having antibacterial activity against phytopathogens.
다른 예에서, 본 발명은 수탁번호 KCTC11440BP 의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 균주의 균체, 상기 균주의 현탁액, 상기 균주의 배양 물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병원균 방제용 조성물을 제공한다.In another example, the invention provides a bacterium of Bacillus subtilis SM022M strain of Accession No. KCTC11440BP, a suspension of the strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, and a dried product of the culture. It provides a composition for controlling phytopathogenic bacteria containing at least one selected as an active ingredient.
또 다른 예에서, 본 발명은 수탁번호 KCTC11440BP 의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 식물에 적용하는 단계를 포함하는 식물병원균 방제 방법을 제공한다.In another embodiment, the present invention is one or more selected from the group consisting of Bacillus subtilis SM022M strain of Accession No. KCTC11440BP, the culture of the strain, the concentrate of the culture, and the dried product of the culture. It provides a phytopathogen control method comprising the step of applying to the plant.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 균주는 세균류 및 진균류를 포함하는 다양한 식물병원균에 대하여 방제 효과를 가지며, 하기의 실시예에서 확인되는 바와 같이 점무늬병균 (Alternaria panax), 겹무늬병균 (Alternaria solani), 잎점무늬병균 (Bipolaris sorokiniana), 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cinerea), 탄저병균 (Colletotrichum acutatum, Colletotrichum lagenarium), 궤양병균 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 무름병균 (Erwinia carotovora subsp. carotovora), 붉은곰팡이병균 (Fusarium graminearum), 역병균 (Phytophthora nicotianae), 도열병균 (Pyricularia grisea, Magnaporthe grisea), 모잘록병균 (Rhizoctonia solani), 이삭마름병균 (Septoria nodorum), 균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum), 반쪽시들음병균 (Verticillium dahliae), 줄기속썩음병균 (Pseudomonas corrugata), 세균성점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상에 대하여 방제 효과를 갖는다. 이 중에서도 특히 탄저병균 (Colletotrichum acutatum, Colletotrichum lagenarium), 역병균 (Phytophthora nicotianae), 세균 성점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), 반쪽시들음병균 (Verticillium dahliae), 및 줄기속썩음병균 (Pseudomonas corrugata)에 대한 방제 활성은 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 균주와 상동성이 높은 것으로 나타난 바실러스 서브틸리스 종류 균에서는 알려진 바 없는 활성이다. Bacillus subtilis SM022M strain according to the present invention has a control effect against various phytopathogens, including bacteria and fungi, and as shown in the examples below, spotnade bacteria ( Alternaria panax ), layered fungi ( Alternaria solani), leaf jeommunuibyeong bacteria (Bipolaris sorokiniana), gray mold pathogen (Botrytis cinerea), anthracnose fungus (Colletotrichum acutatum, Colletotrichum lagenarium), ulcer bacteria (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), soft rot bacterium (Erwinia carotovora subsp. carotovora), Fusarium graminearum , Phytophthora nicotianae , Pyricularia grisea, Magnaporthe grisea , Rhizoctonia solani , Septoria nodorum , Mycobacterium tuberculosis , Sclerotinia sclerotinia ( Verticillium dahliae ), Pseudomonas corrugata , Bacterial spot pattern bacteria ( Xan thomonas campestris pv.vesicatoria ) and the like. Among them, particularly the anthrax (Colletotrichum acutatum, Colletotrichum lagenarium), reverse pathogens (Phytophthora nicotianae), bacterial sex jeommunuibyeong bacterium (Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria), half-wilt fungus (Verticillium dahliae), and a stem in rot bacterium (Pseudomonas corrugata) The control activity against the Bacillus subtilis SM022M strain according to the present invention is not known in the Bacillus subtilis strains that have shown high homology.
상기 균체는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 균주의 균체는 균 자체의 몸체 및 포자를 모두 포함하는 의미이며, 상기 현탁액은 상기 균체가 증류수, 생리식염수, 완충액 등에 현탁된 상태를 의미하고, 상기 배양물은 균체 포함 및 균체 비포함 배양물을 모두 포함하며, 상기 농축물 및 건조물은 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라서 농축 또는 건조된 것을 의미한다.The cell is a bacterium of Bacillus subtilis SM022M strain means both the body and spores of the bacteria itself, the suspension means a state in which the cells are suspended in distilled water, saline, buffer, etc. The culture includes both cell-containing and cell-free cultures, and the concentrates and dried products are concentrated or dried according to methods commonly used in the art to which the present invention belongs.
본 발명에 따른 식물병원균 방제용 조성물 및/또는 식물병원균 방제 방법이 적용 가능한 식물은 특별한 제한이 없으며, 예컨대 고추, 파프리카, 토마토, 딸기, 참외, 메론, 오이, 감자, 벼, 인삼 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 식물에 적용 가능하지만, 이에 제한되지는 않는다. 적용 농도는 방제 효과의 최대화와 부작용의 최소화 및 경제적 측면에서 1X106 CFU/ml 내지 1X109 CFU/ml의 양으로 적용하는 것이 바람직하지만 이에 제한되는 것은 아니다.The plant to which the composition for controlling phytopathogens and / or the method for controlling phytopathogens according to the present invention is applicable is not particularly limited, for example, a group consisting of pepper, paprika, tomato, strawberry, melon, melon, cucumber, potato, rice, ginseng and the like. Applicable to, but is not limited to, one or more plants selected from. The applied concentration is preferably applied in an amount of 1 × 10 6 CFU / ml to 1 × 10 9 CFU / ml, but not limited to maximizing control effects, minimizing side effects, and economics.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 균주를 식물병원균 방제에 사용함으로써, 친환경적이고 인축에게 무해하면서 보다 다양한 식물병원균에 대한 방제가 가능하다.By using the Bacillus subtilis SM022M strain according to the present invention to control phytopathogens, it is possible to control various phytopathogens while being environmentally friendly and harmless to human beings.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1: 균주의 분리Example 1 Isolation of Strains
퇴비시료 20g 을 멸균증류수 100 ㎖이 들어있는 삼각플라스크에 첨가한 후 30 분간 교반하여 시료용액을 만들었다. 시료용액을 105~106으로 희석한 후 각 희석액을 200 ㎕씩 취하여 트립틱 소이 한천배지(Tryptic soy agar)에 도말하여 30℃에서 배양한 후 세균콜로니가 나타나면 영양한천배지(Nutrient agar)에서 계대배양하여 단일콜로니를 분리하였다. 분리된 단일콜로니를 감자 한천배지(Potato Dextrose Agar)에 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)과 함께 배양하여 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis에 대한 억제활성이 있는 콜로니를 선발하여 SM022M 로 명명하였다. 상기 균주 SM022M 를 2008 년 12 월 5 일자로 대전에 소재하는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하 여 기탁번호 KCTC11440BP 를 부여받았다.20 g of compost sample was added to a Erlenmeyer flask containing 100 ml of sterile distilled water and stirred for 30 minutes to prepare a sample solution. After diluting the sample solution to 10 5 ~ 10 6 , take 200 ㎕ of each dilution and spread it on Tryptic soy agar and incubate at 30 ° C. When bacterial colonies appear, nutrient agar (Nutrient agar) Passage was used to isolate single colonies. Ulcerative the separated single colonies on potato dextrose agar (Potato Dextrose Agar) bacteria (Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis) and incubated with Clavibacter michiganensis subsp. Colonies with inhibitory activity against michiganensis were selected and named SM022M. The strain SM022M was deposited on December 5, 2008 at the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center (KCTC), Daejeon, and received the accession number KCTC11440BP.
실시예 2: 식물병원균과 SM022M 균주의 대치배양을 통한 항균활성 검정Example 2: Antimicrobial Activity Assay Through Substitution of Phytopathogen and SM022M Strains
상기 실시예 1 에서 분리된 SM022M 균주의 항균 활성을 확인하기 위하여, 상기 균주를 감자 한천배지(Potato Dextrose Agar)를 이용하여 28℃에서 3 일간 배양하여 사용하였으며, 잿빛곰팡이병균, 탄저병균, 역병균, 도열병균, 모잘록병균, 세균성점무늬병균, 점무늬병균 등의 식물 병균에 대하여 paper disc를 이용한 대치 배양 또는 병원균 포자 도말을 통해 분리 균주의 병원균 생장 억제 여부를 조사하였다. 미리 배양된 병원균의 균사 선단에서 직경 5mm의 균사 조각을 떼어내어 PDA 배지 (세균성점무늬병균(Xanthomonas campestris pv . vesicatoria)의 경우는 영양한천배지)에 접종하고, 반대편 또는 중앙에 지름 6mm 의 paper disc를 올려놓고 상기 분리 균주 배양액을 10ul 씩 점적하였다. 각 병원균의 배양 온도에서 7 일간 배양(세균성점무늬병균은 3 일간 배양)한 후, 분리 균주에 의한 저지원(Inhibition zone) 지름을 측정하여 상기 분리 균주의 항균 활성을 조사하였다.In order to confirm the antimicrobial activity of the SM022M strain isolated in Example 1, the strain was incubated for 3 days at 28 ℃ using a potato agar medium (Potato Dextrose Agar), gray mold, anthrax, bacillus Inhibition of pathogenic growth of isolated strains was carried out by confrontation with paper disc or spore smearing of pathogens against plant pathogens such as blast, bacillus, bacterial spot pattern, and spot pattern. Remove 5 mm diameter mycelia from the incubated mycelium tip and inoculate them on PDA medium ( Xanthomonas campestris pv . Vesicatoria for nutrient agar medium) and paper discs with 6 mm diameter on the other side or in the center. On top of this, the isolated strain culture solution was instilled by 10ul. After culturing for 7 days at the incubation temperature of each pathogen (bacterial striated pathogen for 3 days), the antimicrobial activity of the isolated strain was examined by measuring the inhibition zone diameter by the isolated strain.
상기에서 얻어진 결과를 아래의 표 1 에 나타내었다.The results obtained above are shown in Table 1 below.
[표 1] SM022M 균주의 식물병원균에 대한 항균 활성 조사 [Table 1] Antibacterial activity of phytopathogenic bacteria of SM022M strain
+++: 저지원 지름 20 mm 이상.+++: Low support 20 mm or more in diameter.
++: 저지원 지름 10 mm 이상 20 mm 미만.++: Low support 10 mm or more in diameter and less than 20 mm.
+: 저지원 지름 10 mm 미만.+: Low support diameter less than 10 mm.
도 1 내지 도 3 은 SM022M 균주와 여러 식물 병균을 대치배양할 때 SM022M 균주에 의해 식물병원균의 증식이 억제되는 것을 보여주는 현미경 사진이다. 도 1 은 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cinerea)에 대한 SM022M 균주의 항균활성을 보여주는 것으로 SM022M 이 생산하는 활성물질에 의해 잿빛곰팡이 병균 균사의 성장이 저해됨을 확인할 수 있다 (붉은 색 원 참조). 도 2 는 탄저병균 (Colletotrichum acutatum)에 대한 SM022M 균주의 항균활성을 보여주는 것으로 SM022M 이 생산하는 활성물질에 의해 탄저병균 균사의 성장이 저해됨을 확인할 수 있다 (붉은 색 원 참조). 도 3 은 도열병균 (Magnaporthe grisea)에 대한 SM022M 균주의 항균활성을 보여주는 것으로 SM022M 이 생산하는 활성물질에 의해 벼 도열병균 균사의 성장이 저해됨을 확인할 수 있다.1 to 3 are micrographs showing that the growth of phytopathogens is inhibited by the SM022M strain when replacing the SM022M strain with various plant pathogens. Figure 1 shows the antimicrobial activity of the SM022M strain against Botrytis cinerea can be confirmed that the growth of gray fungus mycelia by the active material produced by SM022M (see red circle). Figure 2 shows the antimicrobial activity of the SM022M strain against anthrax (colletotrichum acutatum ) can be confirmed that the growth of anthrax mycelia is inhibited by the active material produced by SM022M (see red circle). Figure 3 shows the antimicrobial activity of the SM022M strain against Magnaporthe grisea can be confirmed that the growth of rice blast mycelia by the active material produced by SM022M.
실시예 3: 분리 균주의 동정Example 3: Identification of Isolated Strains
상기 분리 균주 SM022M 의 형태적 배양적 특성을 조사하기 위하여, 옥수수-당밀 한천 배지(Maize molasses agar), 미트 펩톤 한천배지(Meat peptone agar) 등 고체 영양배지 (Nutrient Media)를 이용하여 SM022M 균주를 28±2℃에서 3 내지 5 일간 배양한 뒤 현미경 하에서 균을 관찰하였고, 16S rDNA 염기서열 분석을 수행하였다.In order to investigate the morphological culture characteristics of the isolated strain SM022M, SM022M strains were prepared using solid medium such as maize molasses agar and meat peptone agar. After incubation for 3 to 5 days at ± 2 ℃ bacteria were observed under the microscope, 16S rDNA sequence analysis was performed.
16S rDNA 염기서열 분석에 필요한 단편을 증폭하기 위해 SM022M 균주의 genomic DNA 와 27F primer (5'- AGAGTTTGATYMTGGCTCAG -3' (Y = C or T, M = A or C), SEQ ID NO: 2), 1492R primer (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACT -3' (Y = C or T), SEQ ID NO: 3)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 GeneAmpTM PCR System 9700(Applied Biosystem)을 이용하여, 94℃에서 3 분간 1 cycle 수행하고, 94℃에서 30 초, 50℃에서 30 초, 72℃에서 5 분 과정을 총 30 cycle 수행한 뒤, 72℃에서 10 분간 1 cycle 수행하였다. PCR 결과는 1% agarose gel 에 전기영동하여 확인한 뒤 16S rDNA 단편을 회수하였다. 회수된 단편은 ABI PRISMTM BigdyeTM terminator cycle sequencing Ready reaction kit V.3.1 (Applied Biosystem)을 이용하여 염기서열 분석 반응을 수행한 뒤, Montage dye remove kit(Millipore)을 이 용하여 형광 라벨된 단편을 회수하였다. 회수된 단편은 ABI 3730XL capillary DNA sequencer(Applied Biosystem)를 이용하여 전개하였고 얻어진 결과로부터 염기서열을 결정하였다.To amplify fragments required for 16S rDNA sequencing, genomic DNA of the SM022M strain and 27F primer (5'- AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3 '(Y = C or T, M = A or C), SEQ ID NO: 2), 1492R PCR reactions were performed using primers (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACT-3 '(Y = C or T), SEQ ID NO: 3). PCR reaction was performed using GeneAmp ™ PCR System 9700 (Applied Biosystem), 1 cycle at 94 ° C for 3 minutes, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 50 ° C, and 5 minutes at 72 ° C for a total of 30 cycles. Then, 1 cycle was performed for 10 minutes at 72 ℃. PCR results were confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel and 16S rDNA fragments were recovered. The recovered fragment was recovered ABI PRISM TM Bigdye TM terminator cycle sequencing Ready reaction kit V.3.1 (Applied Biosystem) then used to perform a sequencing reaction to, Montage remove dye kit (Millipore) to a fluorescent label by using the fragment It was. The recovered fragment was developed using an ABI 3730XL capillary DNA sequencer (Applied Biosystem), and the base sequence was determined from the obtained result.
형태적 배양적 특성 조사 결과, SM022M 균주는 막대 형태(rod shape)이며 크기는 0.8~0.9 ㎛×2.5~3.5 ㎛이고, 그람 양성균이며, 타원형의 포자를 세포 내에 하나만 형성하며, 이동성이 있고, 편모(flagella)는 주모(peritrichous flagella)인 것으로 관찰되었다. 모든 고체 영양배지에서, 1 일 후 작은 콜로니를 확인할 수 있으며, 미트 펩톤 한천배지와 옥수수-당밀 한천배지에서 2-3 일 배양하면 콜로니 가장자리가 부정형으로 자라며 콜로니 가운데에는 주름과 희미한 광택이 관찰되나 가장자리에는 광택이 없는 것으로 관찰되었다. 카탈라제(catalase) 활성 및 산화효소(oxidase) 활성을 가지며, 전분(Starch)과 카제인(casein)을 가수분해하며, 혐기성 조건에서는 자라지 않았다. 성장 온도는 최대 45 내지 55℃, 최저 5 내지 10℃이고, 포도당(glucose), 수크로스(sucrose), 전분(starch)을 영양분으로 이용하고, 포도당(glucose), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 마니톨(mannitol)을 이용할 때 산을 생성하며, 질산염(nitrate)을 아질산염(nitrite)으로 환원시키는 것으로 관찰되었다.As a result of morphological culture characterization, the SM022M strain is rod shape, the size is 0.8-0.9 μm × 2.5-3.5 μm, is Gram-positive bacteria, forms only one elliptical spore in the cell, is mobile, flagella (flagella) was observed to be peritrichous flagella. In all solid nutrient media, small colonies can be identified after 1 day, and after 2-3 days of incubation in meat peptone agar and corn-molasses agar, the edges of the colonies grow irregularly, and wrinkles and faint gloss are observed in the center of the colonies. Gloss was observed. It has catalase activity and oxidase activity, and hydrolyzes starch and casein, but did not grow under anaerobic conditions. Growth temperature is 45 to 55 ℃ maximum, 5 to 10 ℃ minimum, using glucose (glucose), sucrose (sucrose), starch (starch) as a nutrient, glucose (arabinose), xylose (xylose) and mannitol have been observed to produce acids and reduce nitrate to nitrite.
16S rDNA 염기서열 분석 결과 얻어진 SM022M 균주의 16S rDNA 서열을 도 4 및 SEQ ID NO: 1 에 나타내었다.The 16S rDNA sequence of the SM022M strain obtained as a result of 16S rDNA sequencing was shown in FIG. 4 and SEQ ID NO: 1.
상기 얻어진 SM022M 균주의 16S rDNA 의 염기서열은 NCBI GenBank 에 등록된 미생물과 비교하여 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 99.9%의 상동성을 나타내어 가장 가까움을 확인하여, 분리된 균주를 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 으로 명명하였다.The nucleotide sequence of 16S rDNA of the obtained SM022M strain showed 99.9% homology with Bacillus subtilis compared to the microorganism registered in NCBI GenBank, and confirmed the closest, and isolated strain Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ) was named SM022M.
실시예 4: 바실러스 서브틸리스 SM022M의 식물병에 대한 방제효과 시험Example 4: Control effect test of plant disease of Bacillus subtilis SM022M
바실러스 서브틸리스 SM022M 균주를 작물에 살포하기 위해서 살아있는 미생물 균체 및 그 배양액, 계면활성제, 아세틸렌 카본(acetylene carbon), 이스트 추출물(yeast extract) 등을 혼합한 뒤, 농축, 건조하여 분말 형태로 제조하였다. 이 때, 미생물의 농도를 1010 CFU/g 이상 포함하도록 제조하였다.In order to spread the Bacillus subtilis SM022M strain on the crops, living microbial cells and its culture, surfactant, acetylene carbon, yeast extract, etc. were mixed, concentrated and dried to prepare a powder form. . At this time, the concentration of the microorganism was prepared to include 10 10 CFU / g or more.
4.1. 바실러스 서브틸리스 SM022M의 세균성점무늬병에 대한 방제 효과4.1. Control Effect of Bacillus Subtilis SM022M on Bacterial Spot Pattern Disease
세균성점무늬병의 병원균인 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 는 28℃의 영양한천(Nutrient Agar) 배지에서 배양한 뒤 하나의 콜로니를 영양(Nutrient Broth) 배지에 접종하여 동일한 조건에서 2 일간 배양한 후 수확하여 접종원으로 사용하였다. 바실러스 서브틸리스 SM022M은 병원균을 접종하기 1 주일 전에 토양에 관주처리하였다. 수확한 병원균은 분광광도계를 사용하여 병원균 현탁액의 흡광도를 0.76 으로 조절한 후 병원균의 침입을 돕기 위하여 병원균의 현탁액에 0.1%의 실루엣을 첨가하였다. 병원균을 접종하기 위해 온실에서 재배한 6 엽기의 고추(품종: 녹광)에 5ml 씩 분무하였다. 병원균을 접종한 고추는 80% 이상의 습도를 유지하는 비닐 상자(온도; 30℃, 광조건; 광 12hr/암 12hr)에 넣어 보관하며 발병을 유도하였다. 병의 진전 상황을 보면서 고추에서의 발병도를 조사하여 방제가를 산출 하였다. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria was incubated in Nutrient Agar medium at 28 ° C., and one colony was inoculated in Nutrient Broth medium, incubated for 2 days under the same conditions, and then harvested and used as an inoculum. Bacillus subtilis SM022M was irrigated with soil one week before inoculation of pathogens. The harvested pathogens were adjusted with a spectrophotometer to adjust the absorbance of the pathogen suspension to 0.76, and then 0.1% of the silhouette was added to the pathogen suspension to aid invasion of the pathogen. To inoculate pathogens, 5 ml of peppers (cultivar: green mine) grown in greenhouses were sprayed at 5 ml each. Pepper inoculated with the pathogen was stored in a plastic box (temperature; 30 ° C., light condition; light 12 hr / dark 12 hr) maintaining a humidity of 80% or higher to induce the onset. By looking at the progress of the disease, the incidence of pepper was investigated to calculate the control price.
발병도(%)=[ ∑ (발병수 × 계수) ÷ 4N ] X 100(%)Incidence (%) = [∑ (Number of Incidents × Coefficient) ÷ 4N] X 100 (%)
계수 기준 Counting criteria
0 : 발병무(0%), 1 : 발병 정도 5% 미만 0: No onset (0%), 1: Less than 5% of onset
2 : 발병 정도 5~20% 3 : 발병 정도 20~50% 2: onset 5 ~ 20% 3: onset 20 ~ 50%
4 : 발병 정도 50% 이상 N : 조사주수 4: 50% or more of the onset of N
방제가(%)=(1-처리구의 발병도/무처리구의 발병도)×100Control value (%) = (degree of incidence / treatment-free of 1-treatment tool) * 100
상기와 같이 얻어진 발병도와 방제가를 아래의 표 2 에 나타내었다.The incidence and control value obtained as described above are shown in Table 2 below.
[표 2]TABLE 2
상기 표 2 에서 보는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 SM022M 균주는 세균성점무늬병에 대해 우수한 방제 효과가 있는 것으로 확인되었다.As shown in Table 2, Bacillus subtilis SM022M strain was confirmed to have an excellent control effect against bacterial spot pattern disease.
4.2. 바실러스 서브틸리스 SM022M의 모잘록병에 대한 방제효과4.2. Control Effects of Bacillus subtilis SM022M against Mozallock Disease
모잘록병의 병원균인 Rhizoctonia solani 밀기울, 왕겨 배지에 접종하여 25℃에서 10 간 배양하고, 병원균을 배양한 밀기울과 왕겨는 수확하여 완전히 풍건한 후 접종원으로 사용하였다. 병원균이 배양된 접종원은 사용하는 상토 양의 0.1%가 되도록 넣어 고르게 혼합하고 고추 종자를 파종하는데 사용하였다. 실험에 사용한 미생물제와 대조 살균제 (가지란, 동부하이텍)는 종자를 파종한 폿트에 5 ml 씩 토양에 관주하여 처리하였다. 고추를 파종한 폿트는 온실에서 재배하였으며, 파종하고 7 일 후에 발병율을 조사하여 방제가를 산출하였다Inoculated in Rhizoctonia solani wheat bran, chaff pathogen, and cultured for 10 hours at 25 ℃, bran and chaff cultured pathogens were harvested and completely dried and used as inoculum. The inoculum in which the pathogens were cultured was added to 0.1% of the amount of top soil to be used, mixed evenly, and used for sowing pepper seeds. The microorganisms and control fungicides used in the experiments (eg, eggplant, Dongbu HiTek) were treated by irrigation in the soil by 5 ml in the seeded pot. Pots seeded with red pepper were grown in a greenhouse, and after 7 days of sowing, the incidence was investigated to calculate the control value.
발병율(%)= (발병주수 ÷ 조사주수) X 100(%)Incidence rate (%) = (number of cases ÷ number of investigations) X 100 (%)
방제가(%)=(1-처리구의 발병율/무처리구의 발병율)×100Control value (%) = (incidence rate of 1-treated group / incidence rate of untreated group) * 100
상기와 같이 얻어진 발병율과 방제가를 아래의 표 3 에 나타내었다.The incidence and control value obtained as described above are shown in Table 3 below.
[표 3]TABLE 3
상기 표에서 보는 바와 같이 바실러스 서브틸리스 SM022M 균주는 모잘록병에 대해 우수한 방제 효과가 있는 것으로 확인되었다. 도 5 는 바실러스 서브틸리스 SM022M 균주의 모잘록병에 대한 방제활성을 나타낸 것으로서 무처리구(A)에서는 모잘록병이 많이 발생한 반면, 균주를 처리한 실험군(B)에서는 발병이 많이 줄어든 것을 확인할 수 있다.As shown in the table, the Bacillus subtilis SM022M strain was confirmed to have an excellent control effect against Mozallock disease. Figure 5 shows the control activity against Mozzarlock disease of the Bacillus subtilis SM022M strain, while in the untreated group (A) a lot of Mozalok disease was generated, it can be seen that the incidence is reduced in the experimental group (B) treated with the strain.
4.3 바실러스 서브틸리스 SM022M 균주의 탄저병에 대한 방제 효과4.3 Control Effect of Bacillus Subtilis SM022M Strain on Anthrax
바실러스 서브틸리스 SM022M 의 탄저병에 대한 방제활성은 고추 열매에 탄저병균(Colletotrichum acutatum)을 감염시킨 후 방제효과를 조사하였다. 고추 열매 를 이용한 방제 효과를 조사하기 위하여, 고추 재배지에서 탄저병균에 감염된 고추를 채집하여 탄저병균(Colletotrichum acutatum)을 순수 분리한 후, 감자한천(PDA) 배지에 이식하여 25℃의 암 상태에서 10 일간 배양한 후, 20 ㎖의 증류수를 부어 배지 표면에 형성된 분생포자를 수확하였다. 분생포자의 현탁액은 4 겹의 가제에 걸러서 균사와 배지의 찌꺼기를 제거하고, 현탁액 중의 분생포자 수를 1×106 개/㎖로 조절하였다. 실험에 사용한 바실러스 서브틸리스 SM022M 을 고추열매(품종: 녹광)에 분무처리하고 상온에서 1 일간 풍건하였다. 준비한 탄저병균의 포자현탁액을 고추의 표면에 분무접종하고 30℃의 암 상태에서 5 일간 습실처리한 후, 습실을 제거하고 다시 5 일간 동일한 온도에서 보관하며 발병을 유도하였다. 접종 10 일 후에 각 열매의 발병도를 조사하여 방제가를 산출하였다.The control activity of Bacillus subtilis SM022M against anthrax was investigated after the infection of the pepper anthracnose ( Colletotrichum acutatum ). In order to investigate the control effect using red pepper fruits, red peppers infected with anthrax germ were collected from the red pepper plantation, Colletotrichum acutatum was isolated purely, transplanted into potato agar (PDA) medium, After incubation for 20 days, 20 ml of distilled water was poured to harvest conidia formed on the surface of the medium. The suspension of conidia was filtered through four layers of gauze to remove the mycelia and debris, and the number of conidia in the suspension was adjusted to 1 × 10 6 / ml. Bacillus subtilis SM022M used in the experiment was sprayed on red pepper fruit (variety: green mine) and air-dried at room temperature for 1 day. The spore suspension of the anthrax was prepared by spraying the surface of red pepper, and wet-treated in the dark at 30 ° C. for 5 days, and then removed from the wet chamber and stored at the same temperature for 5 days to induce the onset. After 10 days of inoculation, the incidence of each fruit was examined to calculate the control value.
발병도(%)= [ ∑(발병수 X 계수) ÷ 5N ] X 100(%)Incidence (%) = [∑ (Number of Incidents X Coefficient) ÷ 5N] X 100 (%)
계수 기준 Counting criteria
0 : 발병무(0%), 1 : 발병 정도 1% 미만 0: No onset (0%), 1: Less than 1% of onset
2 : 발병 정도 1~10% 3 : 발병 정도 10~25% 2: onset 1 ~ 10% 3: onset 10 ~ 25%
4 : 발병 정도 25~50% 5 : 발병 정도 50% 이상 4: onset 25 ~ 50% 5: onset 50% or more
N : 조사주수 N: Survey Number
방제가(%)=(1-처리구의 발병도/무처리구의 발병도)×100Control value (%) = (degree of incidence / treatment-free of 1-treatment tool) * 100
상기와 같이 얻어진 방제가를 아래의 표 4 에 나타내었다.The control value obtained as described above is shown in Table 4 below.
[표 4]TABLE 4
상기 표 4 에서 보는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 SM022M 균주는 탄저병에 대하여 우수한 방제 효과가 있는 것으로 확인되었다.As shown in Table 4, the Bacillus subtilis SM022M strain was confirmed to have an excellent control effect against anthrax.
이상과 같이 바실러스 서브틸리스 SM022M 균주는 세균성점무늬병, 모잘록병, 탄저병에 대해 우수한 방제효과를 나타내었고, 잿빛곰팡이병균, 도열병균, 균핵병균, 점무늬병균, 역병균 등 곰팡이병 뿐 아니라 무름병, 궤양병 등 세균병에 대한 길항작용을 나타내므로 이를 식물병 방제에 유용하게 이용할 수 있다.As described above, the Bacillus subtilis SM022M strain exhibited excellent control against bacterial spot pattern disease, mozalococcal disease, anthrax disease, and bacteria such as fungus diseases such as gray mold, germ, bacillus, spot pattern bacteria and late blight, as well as fungal diseases such as ulcer disease and ulcer disease. Since the antagonism of the disease is shown, it can be usefully used for controlling plant diseases.
도 1 은 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cinerea)에 대한 SM022M 균주의 항균활성을 보여주는 사진이다.Figure 1 is a photograph showing the antimicrobial activity of the SM022M strain against the gray mold ( Botrytis cinerea ).
도 2 는 탄저병균 (Colletotrichum acutatum)에 대한 SM022M 균주의 항균활성을 보여주는 사진이다.Figure 2 is a photograph showing the antimicrobial activity of SM022M strain against anthrax (colletotrichum acutatum ).
도 3 은 벼 도열병균 (Magnaporthe grisea)에 대한 SM022M 균주의 항균활성을 보여주는 사진이다.Figure 3 is a photograph showing the antimicrobial activity of SM022M strain against rice blast bacteria ( Magnaporthe grisea ).
도 4 은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) SM022M 균주의 16S rDNA 염기서열을 보여주는 것이다.Figure 4 shows the 16S rDNA sequence of the Bacillus subtilis SM022M strain.
도 5 는 바실러스 서브틸리스 SM022M 균주의 고추 모잘록병에 대한 방제활성을 보여주는 사진이다.Figure 5 is a photograph showing the control activity against pepper mozzarlock disease of Bacillus subtilis SM022M strain.
<110> SESIL Corporation <120> Bacillus subtilis SM022M strain and method of controlling plant pathogens using the same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 16S rDNA of SM022M strain <400> 1 tgcctataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga 60 cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg 120 ctaataccgg atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc 180 acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga 240 cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300 tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 360 ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc 420 cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 480 cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc 540 tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600 gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg 660 cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg 720 aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780 atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac 840 tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900 agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960 cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg 1020 gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080 atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140 aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200 atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc 1260 agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1320 cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380 gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg aa 1432 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat ymtggctcag 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac t 21 <110> SESIL Corporation <120> Bacillus subtilis SM022M strain and method of controlling plant pathogens using the same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 16S rDNA of SM022M strain <400> 1 tgcctataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga 60 cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg 120 ctaataccgg atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc 180 acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga 240 cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300 tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 360 ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc 420 cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 480 cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc 540 tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600 gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg 660 cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg 720 aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780 atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac 840 tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900 agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960 cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg 1020 gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080 atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140 aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200 atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc 1260 agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1320 cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380 gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg aa 1432 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat ymtggctcag 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac t 21
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