KR101270664B1 - Endophytic Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 with antimicrobial activity against plant pathogens and MRSA - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물병을 발생시키는 식물병원세균 및 진균을 방제하는 기능과 약제다제 내성세균 (MRSA)에 대한 억제활성이 있는 바실러스 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) EML-JUN11로, 보다 상세하게는 벼 도열병원균을 포함하는 다양한 식물병원균을 방제하는 기능이 있는 식물내생 균주, 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11를 탄소원, 질소원 또는 이들의 혼합물을 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 생산방법, 항-흰가루병 검정방법, 균주 및 생산된 배양물을 포함하는 방제용 조성물 및 방제방법에 관한 것이다. The present invention is Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11, which has a function of controlling phytopathogenic bacteria and fungi causing plant diseases and inhibitory activity against drug-resistant drug-resistant bacteria (MRSA), in more detail. Is a plant endogenous strain having a function of controlling various phytopathogens including rice blast pathogens, a production method of inoculating the medium containing the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 in a medium containing a carbon source, a nitrogen source or a mixture thereof, An anti-powder powder assay method, a strain, and a control composition comprising the produced culture and a method for controlling the same.

Description

식물병원성 세균 및 진균을 방제하는 기능과 약제 다제내성 세균에 대한 억제활성이 있는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ＥＭＬ－ＪＵＮ１１{Endophytic Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 with antimicrobial activity against plant pathogens and MRSA}Endophytic Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 with antimicrobial activity against plant pathogens and MRSA with the ability to control phytopathogenic bacteria and fungi and inhibitory activity against pharmaceutical multidrug-resistant bacteria

본 발명은 식물병을 발생시키는 식물병원균을 방제하는 기능이 있는 식물내생 세균인 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-JUN11로, 보다 상세하게는 벼 도열병을 포함하는 식물병원균을 방제하는 기능과 약제 다제내성 세균(MRSA)에 대한 억제활성이 있는 균주, 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11를 탄소원, 질소원 또는 이들의 혼합물을 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 생산방법, 항균활성을 증진시키는 영양원 배합 조성, 항-흰가루병 초고속 검정법, 균주 및 생산된 배양물을 포함하는 방제용 조성물 및 방제방법에 관한 것이다. The present invention is a plant endogenous bacteria Bacillus amyloliquefaciens ( Bacillus) having a function of controlling phytopathogens that cause plant diseases amyloliquefaciens ) EML-JUN11, more specifically, a bacterium having a function of controlling phytopathogens including rice blasts and inhibitory activity against drug multidrug-resistant bacteria (MRSA), the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 as a carbon source , A method for inoculating and culturing a medium containing a nitrogen source or a mixture thereof, a nutritional composition for enhancing antimicrobial activity, an anti-powder powder ultrafast assay, a strain and a control composition comprising the produced culture and a method for controlling the same will be.

벼(Oryza sativa L.)는 외떡잎식물인 화본과의 한해살이식물로, 전 세계적으로 열대나 아열대 지방에 주로 분포한다. 벼는 세계 인구의 반 이상에게 중요한 식량 자원이며, 곡물 중에서도 가장 많이 이용된다. 주로 기온과 수온은 벼의 생육에 영향을 미치는데, 벼의 생육초기부터 어린 이삭이 형성되는 시기 (이삭 패기전 약 25일)까지는 기온 보다 수온의 지배를 더 크게 받으나, 어린 이삭이 형성된 이후에는 수온보다 기온에 의해 영향을 받으며, 임실율 및 등숙율은 기온의 영향을 크게 받는다(Park et al., 2006; Gnanamanickam, 2009). 그러나 도열병(Magnaporthe oryzae B Couch sp. nov), 깨씨무늬병(Cochliobolus miyabeanus(S. Ito & Kurib.) Drechsler ex Dastur), 키다리병(Gibberella fujikuroi(Swada) Ito), 흰잎마름병(Xanthomonas oryzae pv. oryzae(Ishiyama) Swings), 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani Kㆌhn)은 벼의 수량과 품질에 직접적인 피해를 미치며 또한 벼의 생육에 지장을 주어 벼가 정상적으로 성장하지 못하게 한다. Rice ( Oryza sativa L.) is a perennial plant of the monocotyledonous plant, which is distributed mainly in the tropics and subtropics. Rice is an important food resource for more than half of the world's population and is the most used crop. Temperatures and water temperatures usually affect the growth of rice. From the beginning of rice growth to the time when young ears are formed (about 25 days before the earing of the ear), the temperature is controlled by water temperature more than the temperature. Are more affected by temperature than by water temperature, and forestry and ripening rates are significantly affected by temperature (Park et al ., 2006; Gnanamanickam, 2009). However, Magnaporthe oryzae B Couch sp. nov), Cochliobolus miyabeanus (S. Ito & Kurib.) Drechsler ex Dastur, Gibberella fujikuroi (Swada) Ito, White leaf blight ( Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ishiyama) Swings), Leaf blight ( Rhizoctonia solani K ㆌ hn) directly affects the yield and quality of rice and impedes the growth of rice, preventing rice from growing normally.

국내 벼에 가장 심각하게 피해를 주는 병해로는 도열병이 차지한다. 도열병은 모도열병, 잎도열병 및 이삭도열병으로 구분되고, 이 중 이삭도열병에 의한 피해가 가장 크다(Ribot et al., 2008). 도열병에 의한 피해는 우리나라뿐만 아니라 벼를 재배하고 있는 세계의 모든 지역에서 발생하는데 수량 감소와 쌀 품질 저하 외에 약제방제에 따른 경영비 증가로 인한 경제적 손실, 잔류독성 등의 환경오염 등을 감안하면 피해는 상당하다(Noh et al., 1998). Blight is the most serious damage to domestic rice. Bleeding fever is divided into febrile fever, leaf fever, and ear fever, among which the most damage is caused by ear fever (Ribot et al ., 2008). The damage from blasting occurs not only in Korea but also in all regions of the world where rice is grown. Significant (Noh et al. , 1998).

하지만 이러한 벼 도열병의 방제는 주로 작물 보호제를 이용한 화학적인 방제 방법에 의해 주로 이루어지고 있다(Kang et al., 2008). 그러나 농약의 과다 사용으로 인한 난분해성 물질의 잔류에 의한 공기, 토양, 지하수의 오염으로 환경과 생태계 파괴, 인축독성 등 많은 문제점들이 야기되었다(Kim et al., 2009). 이러한 화학적 방제법으로 인한 부작용에 효과적으로 대처할 수 있는 방법으로 생태계에서의 미생물 간의 상호관계를 이용한 친환경적인 생물학적 방제법이 모색되었다 (Altindag, 2006). 자연계에서 미생물이 생장과정에서 다른 미생물 생장을 저해하거나 죽이는 2차 대사산물인 항생물질을 생산한다(Cho et al., 2009).However, the control of rice blast is mainly achieved by chemical control method using crop protection agents (Kang et al. al ., 2008). However, the pollution of air, soil and groundwater due to the residual use of hardly decomposable substances due to the overuse of pesticides has caused many problems such as destruction of environment and ecosystem and human toxicity (Kim et al ., 2009). As an effective way to cope with the side effects of these chemical control methods, eco-friendly biological control methods using microbial interactions in ecosystems have been sought (Altindag, 2006). In nature, microorganisms produce antibiotics, secondary metabolites that inhibit or kill other microbial growth during growth (Cho et al ., 2009).

도열병 병원균에 대한 미생물의 항균 기작으로는 siderophore를 분비하여 병원균의 생장을 저해하는 경쟁적 길항작용(Gnanamanickam et al., 1992), cellulase, pectinase를 생산하여 병원균의 세포벽을 분해시키는 용균작용 (Abdel-Fattah et al., 2007; Marco et al., 2003)이 있으며 이 중에서 병원균의 생장을 직접적으로 억제하는 항생물질의 생산에 의한 길항작용이 생물학적 방제법으로 가장 널리 이용되고 있다(Karthikeyan et al., 2008; Cho et al., 2009).The antimicrobial mechanism of microorganisms against blast pathogens is a competitive antagonist that secretes siderophores and inhibits the growth of pathogens (Gnanamanickam et al. al ., 1992), lytic activity of cellulase and pectinase to break down cell walls of pathogens (Abdel-Fattah et. al ., 2007; Marco et al ., 2003), among which antagonism by the production of antibiotics that directly inhibit the growth of pathogens is most widely used as a biological control method (Karthikeyan et al ., 2008; Cho et al ., 2009).

도열병의 방제법에 이용되는 진균으로는 트라이코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 캐토미움 글로보숨(Chaetomium globosum), 마이크로모노스포라 (Micromonospora sp.), 캐토미움 코클리오이데스(Chaetomium cochlioides), 캐토미움 쿠니쿨로룸(Chaetomium cuniculorum), 글리오클라디움 로세움(Gliocladium roseum) 등이 알려져 있으며(Gouramanis, 1994), 길항세균으로는 슈도모나스 플루오르센스(Pseudomonas fluorescens), 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymixa), 바실러스 푸물러스 (Bacillus pumulus), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 엔테로박터 아글로머란스(Enterobacter agglomerans), 방선균은 스트렙토마이세스 (Streptomyces spp.)가 가장 널리 이용되고 있다(Gnanamanickam, 1992; Krishnamurthy, 1998; Zarandi et al., 2009). Fungi used to control blasts include Trichoderma harzianum , Chaetomium globosum , Micromonospora sp., Chaetomium cochlioides and Catto Chaetomium cuniculorum and Gliocladium roseum are known (Gouramanis, 1994), and Pseudomonas fluorescens , Bacillus polymixa , Bacillus pumulus , Bacillus coagulans , Enterobacter agglomerans , Streptomyces spp. Are the most widely used actinomycetes (Gnanamanickam, 1992; Krishnamurthy). , 1998; Zarandi et al ., 2009).

최근에는 바실러스 속(Bacillus spp.) 균이 항균물질과 독성물질을 세포 밖으로 분비하여 병원성 진균에 길항작용을 나타내는 물질들을 생산한다는 연구가 보고되었다(Bacon et al., 2002). 대표적인 균주로는 바실러스 모자벤시스(B. mojavensis), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 바실러스 폴리믹사(B. polymixa), 바실러스 시리우스(B. cereus) 등이 알려져 있다(Kim et al., 2009; Bacon et al., 2002). 또한 바실러스 속은 산업적으로 중요한 종으로서, 일반적으로 생물 산업에서 숙주로 사용되고 있으며 산업적으로 중요한 효소와 항생물질을 다량 분비한다. 산업적 이용면에서 바실러스 균주들이 생산하는 세가지 중요한 산물로서 효소, 항생제 및 살충제를 들 수 있다. 프로티에이즈(Protease), 아밀라아제(amylase), 글루카네이즈(glucanases) 및 셀루라아제(cellulase) 등의 효소가 다양한 바실러스 균주들에 의해 생산되며, 바실러스속내에서 박테리오신은 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 메가테리움(B. megaterium), 바실러스 스테로테르모필러스 (B. stearothermophilus), 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 바실러스 서린지엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 시리우스(B. cereus) 등에서 발견되어 보고되었다(Mah et al., 2001; Bacon et al., 2002). Recently, Bacillus spp. Bacteria have been reported to produce substances that antagonize pathogenic fungi by releasing antibacterial and toxic substances out of cells (Bacon et al ., 2002). Representative strains include B. mojavensis , B. subtilis , B. amyloliquefaciens , B. polymixa , B. sirius ( B. cereus ) And the like are known (Kim et al ., 2009; Bacon et al ., 2002). Also, the genus Bacillus is an industrially important species, generally used as a host in the biological industry, and secretes large amounts of industrially important enzymes and antibiotics. In industrial use, three important products produced by Bacillus strains include enzymes, antibiotics and pesticides. Enzymes such as protease, amylase, glucanases, and cellulase are produced by various Bacillus strains, and bacteriocins in the genus Bacillus subtilis ( B. subtilis), Bacillus MEGATHERIUM (B. megaterium), Bacillus hotel a brush Russ (B. stearothermophilus), Bacillus Kenny Li Po Miss (B. licheniformis), Bacillus Surin whether N-Sys (B. thuringiensis) Stussy as Bacillus Sirius (B cereus ) and others (Mah et al ., 2001; Bacon et al ., 2002).

현재 전 세계적으로 길항미생물을 이용하여 개발된 미생물제제는 약 40종류가 등록되어 있다. 하지만 아직 시장 점유율이 2% 미만으로 낮은 실정이며, 최근 우리나라에서도 미생물 농약은 농산물에 대한 잔류독성의 염려가 없고, 농업생태계를 교란하지 않는다는 장점이 알려지면서 미생물제제를 이용한 생물학적 방제법에 대한 관심이 높아지고 있다(Shen et al., 2002). 특허문헌1에 의하면 바실러스 서브틸리스 EBM-31 KCTC 0985BP)를 함유하는 미생물 농약이 식물 병원성 진균과 동물 병원성 진균에 항진균 활성 스펙트럼을 가지는 미생물이며, 이를 함유하는 병원성 진균 방제용 미생물 농약(biopesticide)에 관한 것이 공개되어 있다. 그러나 우리나라는 식물병 방제에 있어서 외국균주를 직접 들여와 제형화하여 개발하는 사례가 증가하면서 이들 미생물이 우리의 기후 풍토와 토양환경에 적응하는 능력이 결여되어 효과를 충분히 발휘하지 못할 수 있다. Currently, about 40 types of microbial agents developed using antagonistic microorganisms are registered worldwide. However, the market share is still less than 2%. Recently, in Korea, microbial pesticides have no concern about residual toxicity to agricultural products and do not disturb agricultural ecosystems. (Shen et al ., 2002). According to Patent Document 1, the microbial pesticide containing Bacillus subtilis EBM-31 KCTC 0985BP) is a microorganism having an antifungal activity spectrum of plant pathogenic fungi and animal pathogenic fungi, and contains a microbial pesticide for controlling pathogenic fungi containing the same. Is open to the public. However, as the number of cases in which foreign strains are directly imported and formulated and developed in Korea to control plant diseases, these microorganisms lack the ability to adapt to our climate and soil environment may not be effective enough.

본 발명에서는 도열병을 포함한 식물병을 야기하는 병원균에 대해 강한 항균 활성을 나타내는 식물내생 균주를 순수 분리하고 길항균주가 생산하는 항균 물질의 생산조건을 확립하여 식물병원균을 방제할 수 있는 미생물제제의 개발을 위한 기초를 마련하고자 한다.In the present invention, the development of microorganisms capable of controlling phytopathogens by purely separating plant endogenous strains showing strong antimicrobial activity against pathogens causing plant diseases, including blast diseases, and establishing the production conditions of antimicrobial substances produced by antagonistic strains. I want to lay the foundation for it.

한국등록특허공보 10-0431613Korea Patent Publication 10-0431613

본 발명의 목적은 식물병을 발생시키는 식물병원균을 방제하는 기능이 있는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 having a function of controlling phytopathogens causing phytopathogenic diseases.

또한, 본 발명의 목적은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11의 배양물을 이용하여 흰가루병원균의 포자(oidium) 발아 저해율을 평가하는 항-흰가루병 초고속 검정법을 제공한다It is also an object of the present invention to provide an anti-powder disease ultrafast assay for assessing the inhibition of spore (oidium) germination of powdery mildew bacteria using a culture of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11.

또한, 본 발명의 목적은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11를 탄소원, 질소원 또는 이들의 혼합물을 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 생산방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a production method of inoculating Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 in a medium containing a carbon source, a nitrogen source or a mixture thereof.

또한, 본 발명의 목적은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11의 생산방법에 의해 생산된 배양물인 방제용 조성물을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a composition for control, which is a culture produced by the production method of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 and Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11.

또한, 본 발명의 목적은 상기 방제용 조성물을 이용하여 식물병원균 또는 병원성 미생물의 방제방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a method for controlling phytopathogens or pathogenic microorganisms using the composition for controlling the above.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 식물병을 발생시키는 식물병원균을 방제하는 기능이 있는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주, 균주의 생산 방법, 생산방법을 이용한 방제용 조성물 그리고 방제용 조성물을 이용한 방제방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a Bacillus amyloriquafaciens EML-JUN11 strain, a production method of the strain, a composition for control using the production method, and a composition for controlling the phytopathogen causing the plant disease. Provides a control method used.

본 발명은 식물병을 발생시키는 식물병원균을 방제하는 기능이 있는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 제공한다.The present invention provides a Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain having a function of controlling phytopathogens causing plant diseases.

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주(기탁번호:KCTC11972BP)는 우리나라에 기생하는 내생 미생물 균주로서 향나무(Juniperus chinensis L.)의 잎이나 가지로부터 분리되는 신규한 미생물 균주이며 특별히 도열병균을 포함한 식물병원균을 방제하는 기능이 있고 항균 활성을 가지는 것이 특징이다. Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain of the present invention (Accession No .: KCTC11972BP) is an endogenous microbial strain parasitic in Korea and is a novel microbial strain isolated from the leaves or branches of Juniperus chinensis L. It has a function of controlling phytopathogens, including the antibacterial activity.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주(기탁번호:KCTC11972BP)는 향나무의 잎과 가지로부터 분리하였으며, 균주의 형태적 특성, 생화학적 특성 및 16s rDNA 염기서열을 분석한 결과 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)인 것을 확인한 바, 이를 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EML-JUN11으로 명명하고, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에서 2011년 06월 28일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC11972BP를 부여받았다.More specifically, Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain according to the present invention (Accession Number: KCTC11972BP) was isolated from the leaves and branches of juniper, and analyzed the morphological characteristics, biochemical properties and 16s rDNA sequence of the strain The results confirmed that Bacillus amyloliquefaciens ( Bacillus amyloliquefaciens ), which was named Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11, deposited on June 28, 2011 at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Was assigned accession number KCTC11972BP.

본 발명에 따른 식물병을 발생시키는 식물병원균은 벼 도열병균(Pyricularia grisea EML-PGR01), 깨씨무늬병균(Bipolaris sp. EML-ORY15), 키다리병균(Fusarium moniliform EML-ORY56), 고추역병균(Phytophthora capsici EML-PHC01), 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01), 벼문고병균(Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142), 근부병균(Fusarium oxysporum EML-GYP2), 인삼적변균(Pseudomonas panacis), 갈반병원균(Pseudomona tolaasii), 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae KACC 11135), 졸가시나무 흰가루병균 (Erysiphe sp.) 및 벼잎마름병균(Pantoea sp. EML-ORY3)에서 선택된 1종 이상의 균주이고, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주가 특별히 벼 도열병균에 대해 탁월한 방제 기능을 가진다.Phytopathogens that cause plant diseases according to the present invention are rice fever bacteria ( Pyricularia grisea EML-PGR01), sesame seed germ ( Bipolaris sp. EML-ORY15), Fusarium moniliform EML-ORY56, Phytophthora capsici EML-PHC01, Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01, Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142 root pathogens (Fusarium oxysporum EML-GYP2), ginseng ever byeongyun (Pseudomonas panacis), galbanbyeong Won Kyun (Pseudomona tolaasii), huinip blight bacterium (Xanthomonas oryzae KACC 11135), sol thorn powdery mildew fungus (Erysiphe sp.) and byeoip blight fungus ( Pantoea sp. EML-ORY3) is one or more strains selected, Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain according to the present invention has an excellent control function specifically against rice blast bacteria.

구체적인 일예로, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주는 상술한 식물병원균에 항균 활성을 가지고 있으며, 다음과 같은 형태학적 및 생화학적 특징을 가진다. 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주는 그람 양성의 긴 막대모양으로 포자를 형성하였으며 형성된 집락은 원형으로 표면은 매끈한 광택을 나타내는 형태학적 특징을 가진다(도 7 참고). 또한, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 16s rDNA 염기서열을 분석한 결과, 바실러스 속의 종을 포함하는 계통학적 그룹에 속하는 균주로서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 유연관계를 나타낸다(도 8 참조).As a specific example, Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain has an antimicrobial activity against the above-described phytopathogens, and has the following morphological and biochemical characteristics. Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain according to the present invention formed a spore in a gram-positive long rod shape and formed colonies have a morphological characteristic that the surface is smooth and the surface is smooth luster (see Fig. 7). In addition, the 16s rDNA sequences of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain were analyzed and showed a flexible relationship with Bacillus amyloliquefaciens as a strain belonging to the phylogenetic group including the species of the genus Bacillus. (See Figure 8).

일반적으로 항균 활성의 조사는 25℃ 내지 30℃ 에서 7일간 균주를 배양한 후, 감자한천배지 가운데에 병원균주의 배양액 상등액을 올린 후, 수일간 배양하여 생육 저지환을 측정한다. 이에 따라 항균활성 조사에 많은 시간과 비용이 소요되는 한계가 있다. In general, the investigation of the antimicrobial activity incubated strains for 25 days at 25 ℃ to 30 ℃, after raising the culture supernatant of the pathogen strain in potato agar medium, and then cultured for several days to measure the growth inhibition ring. Accordingly, there is a limit that a large amount of time and cost is required to investigate the antimicrobial activity.

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11의 배양물을 이용하여 흰가루병원균의 포자(oidium) 발아 저해율을 평가하는 항-흰가루병 초고속 검정법을 제공한다. 본 발명에 따른 검정법도 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11를 흰가루 병원균 포자와 혼합한 후, 이 혼합액을 슬라이드 글라스에 점적한 후 배양접시에 옮겨 배양한 후 시간에 따른 포자 발아 저해율을 측정하는 특징이 있다.The present invention provides an anti-powder disease ultrafast assay for assessing the inhibition of spores (oidium) germination of powdery mildew bacteria using a culture of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11. The assay according to the present invention is also characterized by mixing Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 with white powdery pathogen spores, dropping the mixture on a slide glass, and then transferring to a culture dish to measure the spore germination inhibition with time. There is this.

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 탄소원, 질소원 또는 이들의 혼합물을 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 생산방법을 제공한다.The present invention provides a production method of inoculating Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strains in a medium containing a carbon source, a nitrogen source or a mixture thereof.

본 발명에 따른 생산 방법에 있어, 상기 배지는 LB배지(Luria-Bertani, DifcoTM, USA), NB 배지 (Nutrient Broth, DifcoTM, USA), 감자한천배지(Potato Dextrose Agar, DifcoTM, USA) 또는 MEB 배지(Malt Extract Broth, DifcoTM, USA)를 사용할 수 있으며, 균주의 생육 촉진 측면에서, 상기 배지는 LB배지인 것이 바람직하다.In the production method according to the invention, the medium is LB medium (Luria-Bertani, Difco ™ , USA), NB medium (Nutrient Broth, Difco ™ , USA), potato agar medium (Potato Dextrose Agar, Difco ™ , USA) Alternatively, MEB medium (Malt Extract Broth, Difco ™ , USA) may be used, and in terms of promoting growth of the strain, the medium is preferably LB medium.

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11균주의 접종 전, 상기 배지는 통상적인 멸균 단계를 거치는 것이 바람직하며, 일 예로 상기 멸균은 100 내지 130 ℃에서 10분 내지 20분간 수행될 수 있다. 멸균된 배지에 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 접종 한 후, 이 배양액의 온도는 20 내지 35℃로 하는 것이 좋고, 배양 pH는 5 내지 8, 배양시간은 10 내지 50시간으로 하는 것이 좋으며, 보다 바람직하게 48시간 이내로 하는 것이 좋다. Before inoculation of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain, the medium is preferably subjected to a conventional sterilization step, for example, the sterilization may be performed for 10 to 20 minutes at 100 to 130 ℃. After inoculating Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain into the sterilized medium, the temperature of the culture medium is preferably 20 to 35 ℃, the culture pH is 5 to 8, the incubation time is 10 to 50 hours. It is good, and it is good to set it as 48 hours more preferably.

특징적으로 상기 배지는 탄소원을 추가로 함유할 수 있으며, 탄소원으로는 수크로오즈(sucrose), 덱스트로오즈(dextrose), 락토오즈(lactose), 만니톨(mannitol), 수용성 전분(soluble starch) 및 솔비톨(sorbitol)로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 상기 배지에 바람직하게 0.05 내지 1.0%(w/v)정도 첨가할 수 있다. 특히 상기 탄소원으로는 솔비톨과 만니톨을 사용하는 것이 균주의 생장 및 항진균 활성을 높이기에 바람직하다.Characteristically, the medium may further contain a carbon source, and the carbon source may include sucrose, dextrose, lactose, mannitol, soluble starch, and sorbitol. At least one selected from the group consisting of (sorbitol) can be added to the medium preferably about 0.05 to 1.0% (w / v). In particular, the use of sorbitol and mannitol as the carbon source is preferable to increase the growth and antifungal activity of the strain.

또한 상기 배지는 질소원을 추가로 함유할 수 있으며, 상기 질소원으로 사용가능한 물질은 배양균에 질소를 공급할 수 있는 모든 물질이 가능하며, 예컨대 질산나트륨(NaNO3), 질산암모늄(NH4NO3), 황산암모늄((NH4)2SO4), 맥아추출물, 펩톤(Peptone) 및 트립톤(Tryptone)으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 상기 배지에 바람직하게 0.05 내지 1.0%(w/v)정도 첨가할 수 있다.In addition, the medium may further contain a nitrogen source, and the material usable as the nitrogen source may be any material capable of supplying nitrogen to the culture, such as sodium nitrate (NaNO 3 ) and ammonium nitrate (NH 4 NO 3 ). , At least one selected from the group consisting of ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ), malt extract, peptone, and tryptone, preferably in the medium, about 0.05 to 1.0% (w / v). Can be added.

또한, 상기 배지는 상기 탄소원 및 질소원을 모두 포함하는 것일 수도 있다. 상기 탄소원을 함유하는 배지 내에, 질소원으로는 맥아 추출물과 트립톤을 첨가하는 것이 바람직하다. 배지 내 바람직한 질소원의 함량은, 0.05 내지 1.0%(w/v)정도 첨가된 탄소원이 포함된 배양액에 0.05 내지 1.0%(w/v) 일 수 있으며 바람직하게는 0.5 내지 1.0% 정도 첨가한다. 배지 내 탄소원 또는 질소원의 함량이 상기 범위보다 많으면 타 영양물질의 결핍이 생길 수 있으며, 상기 범위보다 적으면 탄소원 또는 질소원의 별도 공급으로 인한 상승효과가 미미하게 된다. In addition, the medium may include both the carbon source and the nitrogen source. It is preferable to add malt extract and tryptone as a nitrogen source in the medium containing the said carbon source. The content of the preferred nitrogen source in the medium may be 0.05 to 1.0% (w / v) to the culture solution containing the carbon source added about 0.05 to 1.0% (w / v), preferably about 0.5 to 1.0%. If the content of the carbon source or nitrogen source in the medium is more than the above range may result in deficiency of other nutrients, if less than the above range, the synergy effect from the separate supply of the carbon source or nitrogen source is insignificant.

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주 또는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생산방법에 의해 생산된 배양물인 방제용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for control, which is a culture produced by the production method of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain or the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain.

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주는 병원균의 생장을 저해하는 길항작용을 하며 항균 활성을 가지는 특성을 가지고 있다. 본 균주는 항균제로서 트리시클라졸(tricyclozole)의 화학약제에 대해 강한 저항성을 가진다.The Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain has an antimicrobial activity and antagonism to inhibit the growth of pathogens. The strain has a strong resistance to the chemicals of tricyclozole as an antimicrobial agent.

본 발명에 따른 상기 방제용 조성물은 기본배지에 탄소원, 질소원 또는 이들의 혼합물을 함유하는 배지를 이용하여 생산된 배양물인 것이 바람직하다. The control composition according to the present invention is preferably a culture produced using a medium containing a carbon source, a nitrogen source or a mixture thereof in a basic medium.

상기 방제용 조성물은 생산된 배양물 그 자체를 함유할 수 있으며, 추출용매를 이용하여 상기 배양물에서 통상의 정제방법으로 추출한 추출물을 함유할 수 있다.The control composition may contain the produced culture itself, it may contain an extract extracted by the conventional purification method in the culture using an extraction solvent.

상기 방제용 조성물이 추출물을 함유하는 경우, 상기 추출물은 상기 배양물을 원심분리하여 얻어진 상등액에 클로로포름, 에탄올 및 헥산에서 하나 이상 선택된 추출 용매를 이용하여 추출된 추출액이며, 바람직하게, 상기 상등액에 클로로포름, 에탄올 그리고 헥산으로 분배추출 하였으며, 수용액 층은 다시 동일부피로 클로로포름(CHCl3)으로 분배 추출하였다. 이때, 상기 추출시, 상등액과 동일 부피의 추출 용매를 혼합하는 것이 바람직하다. When the control composition contains an extract, the extract is an extract obtained by extracting at least one selected from chloroform, ethanol and hexane in the supernatant obtained by centrifuging the culture, preferably, chloroform in the supernatant. Partitioned extraction with ethanol and hexane, and the aqueous layer was extracted with chloroform (CHCl 3 ) in the same volume again. At this time, during the extraction, it is preferable to mix the same volume of the extraction solvent with the supernatant.

특징적으로, 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 유효성분으로 함유하는 방제용 조성물; 또는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생산방법에 의해 생산된 배양물을 유효성분으로 함유하는 방제용 조성물은 생체 고분자 물질을 더 함유하는 특징이 있다.Characteristically, the composition for controlling the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain containing as an active ingredient; Alternatively, the composition for controlling the culture produced by the production method of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain and the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain as an active ingredient is characterized by further containing a biological polymer material. have.

상기 생체 고분자 물질은 밀기울, 오트밀, 쌀겨, 대두박, 메주콩 및 옥수수 가루로 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. The biopolymer may be at least one selected from bran, oatmeal, rice bran, soybean meal, soybean meal and corn flour.

또한 상기 생체 고분자 물질은 방제용 조성물의 액상 수화제형 제조시 제형화를 위한 전달매체로 사용되며, 투명하면서도 약흔을 남기지 않고 적절한 점성을 유지할 수 있도록 하는 것으로, 밀기울, 오트밀, 쌀겨, 대두박, 메주콩 및 옥수수 가루로 구성된 군으로 선택된 1종이상의 것일 수 있다. 이 때 바실러스 아밀로리쿼파시엔스EML-JUN11 균주를 접종한 후 배양하여 생산된 방제용 조성물에 함유하는 생체 고분자 물질은 밀기울이 바람직하다.In addition, the biopolymer material is used as a delivery medium for formulation in the preparation of the liquid hydration type of the composition for control, and to maintain a proper viscosity without leaving a scratch, bran, oatmeal, rice bran, soybean meal, soybeans and It may be one or more selected from the group consisting of corn flour. At this time, the biopolymer material contained in the control composition produced by inoculating Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain and then cultured is preferably bran.

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주 또는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11균주의 배양물을 함유하는 방제용 조성물을 이용하여 식물병원균 또는 병원성 미생물을 방제하는 방제방법을 제공한다.The present invention provides a control method for controlling phytopathogenic bacteria or pathogenic microorganisms using a composition for controlling the culture of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain or the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain.

상기 식물병은 벼 도열병(Pyricularia grisea EML-PGR01), 채소 반점세균병균(Xanthomonas campestris), 흰잎마름병(Xanthomonas oryzae), 흰가루병균(Erysiphe sp.)및 벼잎마름병균(Pantoea agglomerans)로부터 선택된 1종 이상의 것이고, 병원성 미생물은 대장균(Escherichia coli) 및 약제다제 내성균인 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphyloccocus aureus)로 부터 선택된 1종 이상의 것으로, 적용 가능한 식물에 특별한 제한이 없으며, 작물에 통상의 방법으로 적용한다.The plant disease is Pyricularia grisea EML-PGR01), vegetable spot bacteria ( Xanthomonas campestris ) , leaf blight ( Xanthomonas) oryzae ) , Erysiphe sp. and Pantoea agglomerans , and one or more pathogenic microorganisms are Escherichia coli and Staphyloccocus aureus , a drug-resistant drug. It is one or more selected from, there is no particular limitation on the applicable plant, it is applied to the crop in the usual way.

본 발명의 방제방법은 상기 방제용 조성물을 토양, 작물의 잎, 줄기, 꽃 또는 열매에 살포하는 것으로, 유기용매 또는 기본배지에 상기 조성물을 희석하여 사용한다.The control method of the present invention is to spray the composition for controlling the soil, crops, leaves, stems, flowers or berries of the control, it is used by diluting the composition in an organic solvent or a basic medium.

본 발명의 구체적인 방제방법은 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 사용하여 적용 대상 작물, 병해충 분포 정도 등을 고려하여 10배 내지 1000배로 희석하여 사용하고 100배 내지 500배로 희석되어 사용하는 것이 바람직하다. Specific control method of the present invention using the Bacillus amyloriquafaciens EML-JUN11 strain in consideration of the crops applied, pest distribution degree, etc. 10 to 1000 times diluted and used to be diluted 100 to 500 times It is preferable.

본 발명의 또 다른 방제방법은, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생산방법으로 생산된 배양물을 함유하는 방제용 조성물을 클로로포름, 에탄올 및 헥산으로 선택된 1종 이상의 것으로 추출하여, 감압 농축한 후 사용한다. Another control method of the present invention, the control composition containing the cultures produced by the production method of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain extracted with one or more selected from chloroform, ethanol and hexane, concentrated under reduced pressure Use it after.

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주는 우리나라에서 자생하는 미생물로서 경제적인 대체효과가 크고, 도열병을 포함한 식물병을 야기하는 병원균에 대해 강한 항균 활성을 가지고 있으며 환경 친화적으로 방제할 수 있다.Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain according to the present invention is a microorganism native to Korea, has a high economical replacement effect, has a strong antimicrobial activity against pathogens causing plant diseases, including blast, and environmentally friendly Can be.

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주 또는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생산방법에 의해 생산된 배양물을 함유하는 방제용 조성물은 도열병을 포함하여 식물병원성 세균 및 진균을 예방 및 방제하는 장점이 있어 농작물 수확량 증대에도 크게 기여할 것이다.The control composition containing the culture produced by the production method of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain or the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain according to the present invention includes phytopathogenic bacteria and fungi The benefits of preventing and controlling them will greatly contribute to increasing crop yields.

도 1은 전남대학교 캠퍼스에 위치한 계절별로 관찰되는 향나무를 보여주는 것이며,
도 2는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11을 접종하여 생산되는 배양물의 분리과정을 나타낸 모식도이며,
도 3은 전라남도 나주시 산포면 산제리에 위치한 벼 포장지를 보여주는 것이며,
도 4는 동정 분리한 5종의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주가 다양한 식물병원균 및 약제 다제내성 세균(MRSA, 메티실린 저항성 포도상구균)에 대한 항균 활성을 보여 주는 것이며,
도 5는 동정 분리한 4종의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주가 온도에 따른 생장곡선을 나나낸 것이며,
도 6은 감자한천배지에 배양된 도열병균(Pyricularia grisea EML-PGR01) 에 항균 활성이 있는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11를 보여주는 것이며,
(A: 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11의 배양액 50㎕, B: LB 배지의 50㎕)
도 7은 LB 배지에서 1일 동안 32℃로 배양한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11(A)와 이를 전자현미경(Scanning electron micrograph)으로 관찰(B)한 것을 보여주는 것이며,
도 8은 16S rRNA 유전자 서열에 기초하여 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11의 바실러스 속 균주(Bacillus spp.)사이에서의 계통분류학적 위치를 보여주는 것이며(계통수는 Pseudomonas oleovorans IAM1508균주를 외집단으로 사용하였으며 scale bar는 뉴클레오타이드 당 0.02 substitutions을 나타냄),
도 9는 LB배지에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생장과 벼 도열병원균(Pyricularia grisea)에 대한 항균 활성을 보여주는 것이며,
도 10은 LB배지에서 시간별로 관찰한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생장과 항균 활성을 보여 주는 것이며,
도 11는 LB배지에서 온도에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생장과 항균 활성을 보여주는 것이며,
도 12는 LB배지에서 pH에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생장과 항균 활성을 보여주는 것이며,
도 13는 탄소원을 함유하는 배지에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 항균 활성을 보여주는 것이며,
도 14는 질소원을 함유하는 배지에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 항균 활성을 보여주는 것이며,
도 15는 생체 고분자가 첨가된 고체배지에 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 접종한 후 20일 동안 배양한 후, 회수한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 배양하여 추출한 조추출물이 도열병균에 대한 항균 활성을 관찰한 것이며,
도 16은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 배양하여 추출한 조추출물이 도열병균(Pyricularia grisea EML-PGR01)의 분생포자(Conidia)발아율에 미치는 영향을 관찰한 결과이며(분생포자를 물(A), 또는 50ppm 의 EML-JUN11 조성물(B), 12.5ppm 의 EML-JUN11 조성물(C)과 혼합, Each scale bar=10㎛),
도 17은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 25배 희석하여 포장에서 도열병 방제효과를 보여주는 것으며
도 18은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11을 처리하지 않는 대조구에는 잎도열병이 발생했으나(A, B), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11을 처리하였을 때는 잎도열병의 증상이 발생하지 않은 것을 보여주는 것이며(C-E),
도 19는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주는 미생물제제인 골드미(Gol)와 탑시드(Top)와 비교하여 병 방제효과 및 벼 생장 결과를 보여주는 것이다. Figure 1 shows the juniper trees observed seasonally located on the campus of Chonnam National University,
Figure 2 is a schematic diagram showing the separation process of the culture produced by inoculating Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11,
3 is a rice wrapping paper located in Sanje-ri, Sanpo-myeon, Naju-si, Jeollanam-do,
4 shows the antibacterial activity of five Bacillus amyloliquefaciens strains isolated against various phytopathogens and drug-drug-resistant bacteria (MRSA, methicillin-resistant staphylococci).
FIG. 5 shows the growth curves of four Bacillus amyloliquefaciens strains isolated according to temperature.
Figure 6 is a culturing bacteria ( Pyricularia) in potato agar medium grisea EML-PGR01) is showing Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 with antibacterial activity,
(A: 50 µl of the culture solution of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11, B: 50 µl of LB medium)
FIG. 7 shows that Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 (A) and this were observed by scanning electron micrograph (B) incubated at 32 ° C. in LB medium for 1 day,
FIG. 8 shows phylogenetic location among Bacillus spp. Of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 based on 16S rRNA gene sequence ( pseudomonas oleovorans IAM1508 strain was used as the out-group and scale bar shows 0.02 substitutions per nucleotide),
Figure 9 shows the growth of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain in LB medium and the antimicrobial activity against Pyricularia grisea ,
Figure 10 shows the growth and antimicrobial activity of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain observed over time in LB medium,
Figure 11 shows the growth and antimicrobial activity of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain with temperature in LB medium,
12 shows the growth and antimicrobial activity of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain according to pH in LB medium,
Figure 13 shows the antimicrobial activity of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain in a medium containing a carbon source,
Figure 14 shows the antimicrobial activity of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain in a medium containing a nitrogen source,
15 is inoculated with Bacillus amyloliquafaciens EML-JUN11 strain in a solid medium to which the biopolymer is added, and then cultured for 20 days, the crude extract extracted by culturing the recovered Bacillus amyloriquafaciens EML-JUN11 strain Observing the antimicrobial activity against this bacterium,
Figure 16 shows the crude extract extracted by culturing Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain Pyricularia grisea The result of observing the effect of EML-PGR01 on the germination rate of Conidia (conidia was water (A) or 50 ppm of EML-JUN11 composition (B), 12.5 ppm of EML-JUN11 composition (C) and Mixed, Each scale bar = 10㎛),
17 is a 25-fold dilution of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain showing the control of blast on the packaging.
FIG. 18 shows that leaf control disease does not occur in the control group that is not treated with Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 (A, B), but the symptoms of leaf disease do not occur when treated with Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11. (CE),
19 shows the disease control effect and rice growth results of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain compared with the microbial preparations Goldmi (Gol) and Topseed (Top).

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. However, the present invention is not limited to the following examples, and it is apparent to those skilled in the art that various changes or modifications can be made within the idea and scope of the present invention.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.At this time, if there is no other definition in the technical and scientific terms used, it has a meaning generally understood by those of ordinary skill in the art. Repeated descriptions of the same technical constitution and operation as those of the conventional art will be omitted.

[실시예 1] 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11의 분리, 동정 및 특징Example 1 Isolation, Identification and Characterization of Bacillus Amyloquifaciens EML-JUN11

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주는 2011년 6월 30일 자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구소 내 미생물자원센터에 기탁되어 있다(기탁번호:KCTC11972BP). 상기 균주를 분리하기 위해 향나무(Juniperus chinensis L.)의 잎과 가지는 2007년 6월(여름)부터 2008년 5월(봄)까지 광주광역시 북구 전남대학교 농생대 지역(북위 35˚10'32", 동경 126˚54'06")에서 매달 수집되었다. 도 1에 보이는 식물을 4℃에 보관 12시간 이내로 사용하여 내생 균주를 분리하였고, 그 방법은 다음과 같다.Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain according to the present invention was deposited on June 30, 2011 in the microbial resource center in the Korea Biotechnology Research Institute of Korea's patent strain deposit institution (Accession Number: KCTC11972BP). Juniperus to isolate the strain chinensis L. leaves and branches every month from June 2007 (Summer) to May 2008 (Spring) in Chonnam National University Agricultural Research Zone (35 ° 10'32 "North, 126˚54'06" North) Collected. Using the plants shown in Figure 1 stored within 4 hours within 12 hours to isolate the endogenous strain, the method is as follows.

향나무의 잎과 가지를 1cm 크기로 절단하고, 자른 부위를 2% 차아염소산나트륨(NaOCl, Yuhan, Korea)에 1분간 살균한 후 멸균수에 3번 세척하였다. 잎 0.5g을 멸균수 500㎕가 들어있는 1.5 ml eppendorf tube에 넣고 마쇄한다. 마쇄된 시료를 10배, 100배로 각각 희석한 후 감자한천배지(PDA;Potato Dextrose Agar, DifcoTM, USA)에 100㎕씩 분주한 후 도말봉을 이용하여 도말하였다. 다른 방법으로 살균된 향나무의 잎과 가지는 마쇄하지 않고 각 3개씩 감자한천배지(PDA)에 치상하였다. 도말한 페트리 플레이트(petri plate)를 23℃, 암조건에 15일 동안 교반 배양기(HT-103-4, Hanbaek, Seoul, Korea)에 배양하였다. 접종한 배지에 세균의 균총이 형성되면 획선 접종 방법을 이용하여 새로운 LB 배지(Luria-Bertani, DifcoTM, USA)에 옮겨 균을 순수 분리하였다. 순수 분리된 균주의 보존을 위해 40% glycerol이 첨가되어 있는 1.5 ml eppendorf tube 3개에 넣어 냉동보관(-80℃)한 후 실험에 사용하였다.The leaves and branches of juniper were cut to 1 cm in size, and the cut portions were sterilized in 2% sodium hypochlorite (NaOCl, Yuhan, Korea) for 1 minute and washed three times in sterile water. 0.5 g of leaves are placed in a 1.5 ml eppendorf tube containing 500 µl of sterile water and ground. The ground samples were diluted 10-fold and 100-fold, respectively, and then 100 μl of potato agar medium (PDA; Potato Dextrose Agar, Difco ™ , USA) was plated using a smear of smear. The leaves and branches of juniper sterilized by the other method were crushed in potato agar medium (PDA), three each without grinding. The petri plate was plated in a stirred incubator (HT-103-4, Hanbaek, Seoul, Korea) for 15 days in 23 ℃, dark conditions. Once the bacterial flora was inoculated on the inoculated medium, it was transferred to a new LB medium (Luria-Bertani, Difco ™ , USA) using the inoculation method to isolate the bacteria. For preservation of the purely isolated strains were placed in three 1.5 ml eppendorf tubes with 40% glycerol added (-80 ℃) was used for the experiment.

실시 예 결과로, 향나무의 잎(표 1, 73)과 가지(표 1, 23)로부터 분리된 균주 중에서 육안관찰, 형태 및 증식양상이 서로 구별되어지는 96가지의 순수 분리된 내생 세균은 표 1과 같았다.As a result of the results, 96 purely isolated endogenous bacteria which distinguished visual observation, morphology and growth patterns among the strains isolated from the leaves (Tables 1 and 73) and the branches (Tables 1 and 23) of the juniper are shown in Table 1 It was like

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또한 도열병을 야기하는 도열병균(Pyricularia grisea )EML-PGR01을 포함한 다양한 식물병원균에 대한 길항균주를 선발하기 위하여 감자한천배지에서 대치배양 하여 25℃에서 배양하여 항균 활성을 가지고 있는 5 균주를 일차적으로 선별한 결과를 표 2와 도 4에서 확인하였다. 상기 선별된 균주의 항균 활성의 조사를 위하여 25℃에서 7일간 도열병균(Pyricularia grisea)을 배양한 후, 멸균한 8 mm borer로 구멍을 뚫어 감자한천배지의 가운데에 올려놓았다. LB 배지에 5 균주를 배양한 배양액은 1,500 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하고 상등액 50㎕를 원형여과지(8 mm paper disc, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Japan)에 침지하여 건조한 후, 감자한천배지에 얹어 25℃에서 7일간 배양하여 생육 저지환을 측정하였다. 그 결과 생장이 양호하고 도열병균(Pyricularia grisea)에 대하여 가장 높은 항균 활성을 가지는 균주를 선별하여 도 6에서 확인하였으며 최종적으로 EML-JUN11이라 명명하였다. 선별된 4 균주의 생장곡선은 35℃ 온도에서 24시간 배양 째 생장이 양호하였으나 24시간을 기점으로 생장은 저조하였고, 온도가 낮은 25℃에서도 생장이 저조한 것을 도 5에서 확인할 수 있었다. Pyricularia also causes schizophrenia In order to select antagonistic strains against various phytopathogens, including EML-PGR01, the results of primary screening of five strains having antimicrobial activity by culturing at 25 ° C. in an agar culture medium in potato agar medium are shown in Table 2 and FIG. 4. Confirmed. In order to investigate the antimicrobial activity of the selected strains incubated with Pyricularia grisea (7 days) at 25 ℃, the hole was sterilized with a sterile 8 mm borer and placed in the middle of potato agar medium. The culture medium incubated with 5 strains in LB medium was centrifuged at 1,500 rpm and 4 ° C. for 15 minutes, and 50 μl of the supernatant was dipped in a circular filter paper (8 mm paper disc, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Japan), and then dried. It was incubated for 7 days at 25 ℃ to measure the growth ring. As a result, strains having good growth and having the highest antimicrobial activity against Pyricularia grisea were selected in FIG. 6 and finally named EML-JUN11. The growth curves of the selected 4 strains were good at 24 hours of culture at 35 ° C., but growth was low starting at 24 hours, and the growth was poor even at 25 ° C. of low temperature.

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선별된 EML-JUN11 균주를 전자현미경으로 관찰한 결과는 도 7에서 보여지는 바와 같이, 그람 양성의 긴 막대모양으로 포자를 형성하였으며 형성된 집락은 원형으로 표면은 매끈한 광택을 나타내었다. As a result of observing the selected EML-JUN11 strain by electron microscopy, as shown in Figure 7, the gram-positive long rod-like spores were formed, and the colonies formed were round and the surface showed smooth luster.

또한 표 3에서 보는 바와 같이, 분리된 EML-JUN11 균주는 100%의 에탄올에 침지할 경우, 다른 5 종류의 Bacillus 속 균주에 비해 8일 까지도 높은 생존율을 나타내는 특징을 보였다.In addition, as shown in Table 3, the isolated EML-JUN11 strain is another five kinds of Bacillus when immersed in 100% ethanol Compared to the genus strains, it showed a high survival rate up to 8 days.

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분리된 균주의 최종 동정은 염기서열 분석을 통하여 수행되었으며, 그 방법은 다음과 같다. EML-JUN11 균주의 DNA를 분리한 후 16S-rRNA의 염기서열 분석을 위하여 27f(5'-AGA GTT TGA TCM GGC TCA G-3') 및 1492r(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')인 2개의 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)법을 실시하였으며, 이 과정은 95 ℃에서 1분간 열변성(denaturation), 53℃에서 40초간 결합(annealing), 72℃에서 1분간 신장(extention)하는 조건에서 효소적인 방법으로 상기 DNA를 증폭시켰다. 증폭된 DNA는 정제 후 염기서열을 결정하였다. 상기 증폭된 DNA는 순수정제한 후 염기서열을 결정하였으며, EzTaxon(Chun et al., 2007)을 이용한 표준균주와의 염기서열 비교 분석결과, 도 8에서 나타낸 바와 같이 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주(Bacillus sp. EML-JUN11)로 명명하였고, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 가까운 근연관계를 가지고 있음을 확인하였다.Final identification of the isolated strain was performed through sequencing, the method is as follows. After separating the DNA of the EML-JUN11 strain, 27f (5'-AGA GTT TGA TCM GGC TCA G-3 ') and 1492r (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3) were used for sequencing 16S-rRNA. Polymerase chain reaction (PCR) was performed using two oligonucleotides (') as primers, which were denatured at 95 ° C for 1 minute, annealing at 53 ° C for 40 seconds, and 72 ° C. The DNA was amplified by the enzymatic method under the condition of extension for 1 minute at. The amplified DNA was purified after nucleotide sequence was determined. The amplified DNA was subjected to pure purification and the nucleotide sequence was determined. As a result of comparison of nucleotide sequences with standard strains using EzTaxon (Chun et al., 2007), as shown in FIG. 8, Bacillus amyloliquefaciens EML- It was named JUN11 strain ( Bacillus sp. EML-JUN11) and confirmed that it has a close relationship with Bacillus amyloliquefaciens ( Bacillus amyloliquefaciens ).

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11는 벼 도열병균(Pyricularia grisea EML-PGR01)외에 깨씨무늬병균(Bipolaris sp. EML-ORY15), 키다리병균( Fusarium moniliform EML-ORY56), 고추역병균(Phytophthora capsici EML-PHC01), 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01), 벼문고병균(Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142), 근부병균(Fusarium oxysporum EML-GYP2), 인삼적변균(Pseudomonas panacis), 갈반병원균(Pseudomona tolaasii), 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae KACC 11135), 흰가루병균 (Erysiphe sp.), 벼잎마름병균(Pantoea sp. EML-ORY3)의 식물병원균을 사용하여 표 4에서 조사한 바와 같이 항균 활성을 비교 관찰하였다.The Bacillus amyl Lowry query Pacific Enschede EML-JUN11 is rice blast fungus (Pyricularia grisea EML-PGR01) in addition to pattern kkaessi germs (Bipolaris sp. EML-ORY15), Fusarium moniliform EML-ORY56, Phytophthora capsici EML-PHC01, Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01, Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142 root pathogens (Fusarium oxysporum EML-GYP2), ginseng ever byeongyun (Pseudomonas panacis), galbanbyeong Won Kyun (Pseudomona tolaasii), huinip blight bacterium (Xanthomonas oryzae KACC 11135), powdery mildew fungus (Erysiphe sp.), byeoip blight fungus (Pantoea sp. The antimicrobial activity of the phytopathogens of EML-ORY3) was compared as observed in Table 4.

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[실시예 1-1][Example 1-1] 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11균 배양물의 항-흰가루병 검정법Anti-powder disease assay of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 bacterial culture

EML-JUN11는 다양한 진균병 방제에 효과를 나타낼 뿐 만 아니라, 표 5에서 보는 바와 같이 졸가시나무 흰가루병균(Erysiphe sp.)에 대해서도 높은 저해효과를 보여 흰가루병 방제제로서 개발될 수 있음을 보여주었다. 증류수 처리구에서 흰가루병원균의 발아율은 46.28ㅁ 5.50 (100% 기준)이었으며 EML-JUN11 균주를 20배 희석한 처리구에서는 25.91%의 발아율을 나타내 대조구(증류수 상에서의 발아율)를 100%로 산정할 경우 4배 정도의 억제효과 (75% 저해율)를 나타내었다. 본 발명에서는 흰가루병원균에 대한 균 배양물의 활성을 슬라이드 배양법으로 측정한바 이는 EML-JUN11균주 배양물을 증류수에 다양한 희석배율로 섞은 후 이 용액에 흰가루병원균의 포자(oidium)를 혼합하여 포자현탁액을 만들어 이를 슬라이드 글라스에 점적하고 포화습도가 유지된 배양접시에 옮겨 시간대별로 흰가루병원균의 포자 발아 저해율을 평가하는 항-흰가루병 검정법으로 사용된바, 다른 항균 검정법보다 시간적 그리고 비용적인 면에서 매우 효과적인 것으로 판단되었다. 이는 졸가시나무 병원균 이외에도 다른 흰가루병원균의 포자를 사용할 경우에도 비슷한 결과를 보여 확대 적용할 수 있었다. 특히, 본 검정법은 배양물의 매우 낮은 농도에서 매우 민감하게 반응하기 때문에 검정하고자 하는 활성물질 또는 배양물의 양이 낮을 때 본 검정 방법이 매우 유용하고 농도 의존적으로 저해 활성을 보여 초고속 검정(HTS)에 이용할 있는 장점이 있다. EML-JUN11 not only shows the effect of controlling various fungal diseases, but also shows high inhibitory effect against Erysiphe sp. As shown in Table 5, showing that it can be developed as a powdery mildew control agent. . The germination rate of powdery mildew fungi was 46.28 ㅁ 5.50 (100%) in the distilled water treatment group, and the germination rate was 25.91% in the 20-dilution of EML-JUN11 strains, and 4 times when the control (germination rate in distilled water) was calculated as 100%. It showed a degree of inhibitory effect (75% inhibition rate). In the present invention, the activity of the bacterial culture against white powdery pathogen was measured by a slide culture method, which was mixed with EML-JUN11 strain culture in distilled water at various dilution ratios to make a spore suspension by mixing spores (oidium) of powdery mildew bacteria in this solution. It was placed on a slide glass and used as an anti-powder disease assay to evaluate the spore germination inhibition of powdery mildew bacteria by time of day, which was found to be more effective in terms of time and cost than other antimicrobial assays. . This result was similarly applied to spores of other white powdery pathogens in addition to the sol-wood pathogens. In particular, this assay reacts very sensitively at very low concentrations of the culture, so the assay is very useful and concentration-dependently inhibited when the amount of active substance or culture to be assayed is low. There is an advantage.

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[실시예 2] 배지에 균주를 접종하여 배양하는 생산방법 Example 2 Production method of inoculating the culture by inoculating the strain

[실시예 2-1] 생산배지에 따른 항균 활성 Example 2-1 Antimicrobial Activity According to Production Medium

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11의 항균 활성을 높이기 위한 생산방법으로 배지를 조사하였다. LB배지(Luria-Bertani, DifcoTM, USA), NB 배지(Nutrient Broth, DifcoTM, USA), 감자한천배지(Potato Dextrose Agar, DifcoTM, USA), MEB 배지(Malt Extract Broth, DifcoTM, USA)를 제조하여 121℃에서 15분간 멸균하였다. 각각의 배지에 전배양된 배양액을 삼각플라스크에 0.2%(V/V)를 접종한 후, 32℃, 120 rpm의 조건으로 진탕배양기(HST-201F, Hanbaek, Seoul, Korea)에 48시간 배양하였다. 배양액은 1,500 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상등액 50㎕를 원형여과지(8 mm paper disc, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Japan)에 침지하여 건조한 후, 25℃에서 7일간 도열병균(Pyricularia grisea)을 배양한 감자한천배지의 가운데에 얹어 생육 저지환을 측정하였다. 그 결과 도 9에서 조사한 바와 같이 LB배지에서 85.5%의 방제가로 가장 양호한 항균 활성을 나타내었으며 다른 배지를 사용한 경우에도 전반적으로 양호한 항균 활성을 나타내었다. 생장의 경우에도 LB배지가 가장 양호한 것으로 나타났으며 MEB배지는 가장 미비하게 나타났으나 항균 활성은 80.5% 방제가로 양호한 항균 활성을 나타냈다. The medium was examined as a production method for enhancing the antibacterial activity of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11. LB medium (Luria-Bertani, Difco ™ , USA), NB medium (Nutrient Broth, Difco ™ , USA), potato agar medium (Potato Dextrose Agar, Difco ™ , USA), MEB medium (Malt Extract Broth, Difco ™ , USA) ) Was sterilized for 15 minutes at 121 ℃. The culture medium preincubated in each medium was inoculated with 0.2% (V / V) in a Erlenmeyer flask, and then incubated in a shaker (HST-201F, Hanbaek, Seoul, Korea) for 48 hours at 32 ° C and 120 rpm. . The culture solution was centrifuged at 1,500 rpm and 4 ° C. for 15 minutes, and 50 μl of the supernatant was immersed in circular filter paper (8 mm paper disc, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Japan) and dried, followed by 7 days of Pyricularia grisea at 25 ° C. Was placed on the center of the cultured potato agar medium and the growth inhibition was measured. As a result, as shown in FIG. 9, the most effective antimicrobial activity was obtained with the control value of 85.5% in the LB medium. In the case of growth, LB medium was the best and MEB medium was the most inferior, but the antimicrobial activity was 80.5% control, showing good antimicrobial activity.

[실시예 2-2] 배양시간에 따른 항균 활성Example 2-2 Antimicrobial Activity According to Incubation Time

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생장 및 항균 활성을 높이기 위한 배양 시간을 조사하기 위해, 앞에서 조사된 기본배지에 전배양된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 접종(1 X 106)한 후, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 84, 96 그리고 108시간동안 120 rpm, 48시간 배양하였다. 배양시간에 따른 항균 활성은 실시예 2-1에서와 동일한 방법으로 조사하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10으로 부터 알 수 있는 바와 같이, 배양 48시간째 79.41% 방제가로 가장 양호한 것으로 나타났으며, 생장은 배양 24시간째 가장 양호한 것으로 나타났다.In order to investigate the incubation time to increase the growth and antimicrobial activity of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain, inoculated Bacillus amyloriquafaciens EML-JUN11 strain pre-cultured to the basic medium investigated above (1 X 10 6 ), followed by incubation at 120 rpm for 48 hours for 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 84, 96 and 108 hours. Antimicrobial activity according to incubation time was investigated in the same manner as in Example 2-1. The results are shown in Fig. As can be seen from FIG. 10, the highest control was 79.41% at 48 hours of culture, and the best growth at 24 hours of culture.

[실시예 2-3] 배양온도 및 pH에 따른 항균 활성Example 2-3 Antimicrobial Activity According to Culture Temperature and pH

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생장 및 항균 활성을 높이기 위한 배양온도를 조사하기 위하여, 앞에서 조사된 기본배지에 전배양된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 접종(1 X 106)한 후, 25, 27, 30, 32, 35 그리고 40℃에서 120 rpm, 48시간 배양하였다. 배양온도에 따른 항균 활성 측정은 배양시간에 따른 항균 활성 측정과 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이 32℃에서 가장 높은 항균 활성을 나타내었으며, 생장 또한 32℃에서 가장 높았다. 또한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생장 및 항균 활성을 높이기 위한 pH 범위를 조사하기 위하여, HCl 및 NaOH를 이용하여 기본배지의 pH를 1.0에서 10.0으로 각각 조정하여 동일한 방법으로 배양하여 조사하였다. 그 결과 도 12에서 알 수 있는 바와 같이 pH 5.0에서 가장 양호한 항균 활성을 나타내었으며, pH 5.0~8.0 범위에서 전반적으로 양호한 항균 활성을 나타내었다. 생장의 경우 역시 pH 5.0에서 가장 양호한 것으로 조사되었으며 pH 1.0~3.0, 그리고 10.0에서는 생육하지 못하였다.In order to investigate the culture temperature to increase the growth and antimicrobial activity of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain, inoculated Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain pre-cultured to the basic medium investigated above (1 X 10 6 ), followed by incubation at 120 rpm for 48 hours at 25, 27, 30, 32, 35 and 40 ° C. The antimicrobial activity was measured according to the culture temperature in the same manner as the antimicrobial activity was measured according to the incubation time. The results are shown in Fig. As can be seen in Figure 11 showed the highest antimicrobial activity at 32 ℃, growth was also the highest at 32 ℃. In addition, in order to investigate the pH range for enhancing the growth and antibacterial activity of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain, the pH of the basal medium was adjusted from 1.0 to 10.0 using HCl and NaOH and cultured in the same manner. It was. As a result, as shown in Figure 12 showed the best antimicrobial activity at pH 5.0, overall showed a good antimicrobial activity in the pH 5.0 ~ 8.0 range. Growth was also best at pH 5.0 and did not grow at pH 1.0-3.0 and 10.0.

[실시예 2-4] 탄소원, 질소원 또는 이들의 혼합물에 따른 항균 활성Example 2-4 Antimicrobial Activity According to Carbon Source, Nitrogen Source or Mixture thereof

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생장 및 항균 활성을 높이기 위해 탄소원의 영향을 조사하기 위하여, 수크로오즈(sucrose, Junsei, 57-50-1), 덱스트로오즈(dextrose, Duksan, 50-99-7), 락토오즈(lactose, DifcoTM, 215620), 만니톨(mannitol, Duksan, 69-65-8), 수용성 전분(soluble starch, DifcoTM, 217820), 솔비톨(sorbitol, Duksan, 50-70-4)를 앞에서 조사한 기본배지에 1.0% 첨가하고 앞에서 상술한 pH5로 조정한 후 사용하였다.In order to investigate the effect of carbon source to increase the growth and antimicrobial activity of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain, sucrose (sucrose, Junsei, 57-50-1), dextrose (dextrose, Duksan, 50-99-7), lactose (lactose, Difco ™ , 215620), mannitol (mannitol, Duksan, 69-65-8), soluble starch (soluble starch, Difco ™ , 217820), sorbitol (Duksan, 50 -70-4) was added to 1.0% of the basic medium irradiated above and used after adjusting to pH5 as described above.

그 결과 도 13에서 알 수 있는 바와 같이 첨가한 6종의 탄소원 중에서 솔비톨(sorbitol, Duksan, 50-70-4)을 첨가하였을 때 가장 양호한 항균 활성을 나타내었으며, 생장의 경우에는 만니톨(mannitol, Duksan, 69-65-8)을 첨가한 경우 가장 양호한 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 13, the best antimicrobial activity was obtained when sorbitol (sorbitol, Duksan, 50-70-4) was added among the six carbon sources added, and in the case of growth, mannitol (Dusan) , 69-65-8) was found to be the best.

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 생장 및 항균 활성을 높이기 위해 질소원의 영향을 조사하기 위하여, 앞서 조사한 기본배지에 탄소원 1.0%를 첨가한 후, 질소산 나트륨(sodium nitrate, Duksan, 7631-99-4), 질산암모늄(ammonium nitrate, Duksan, 6484-52-2), 황산암모늄(ammonium sulfate, Duksan, 7783-20-2), 맥아추출물(malt extract, DifcoTM, 211320), 펩톤(peptone, DifcoTM, 211677), 트립톤(tryptone, DifcoTM, 211705)를 각각 1.0%씩 첨가하고 pH5로 조정하여 동일한 방법으로 조사하였다.In order to investigate the effect of nitrogen source to increase the growth and antibacterial activity of the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain, after the addition of 1.0% carbon source to the basic medium investigated, sodium nitrate (Duksan, 7631 -99-4), ammonium nitrate (Duksan, 6484-52-2), ammonium sulfate (Duksan, 7783-20-2), malt extract (Difco ™ , 211320), peptone ( peptone, Difco ™ , 211677) and tryptone (tryptone, Difco ™ , 211705) were each added by 1.0% and adjusted to pH5 to investigate in the same manner.

그 결과 도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 맥아추출물과 트립톤을 첨가하였을 때 가장 양호한 항균 활성을 나타내었으며 첨가한 질소원에 의하여 전반적으로 항균 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 질산나트륨과 질산암모늄의 경우에는 대조구와 비교할 때 항균 활성이 감소되는 것으로 나타났다. 생장의 경우에는 펩톤을 첨가한 경우에 가장 양호한 것으로 나타났다. 질산암모늄의 경우에 가장 미비한 생장을 하는 것으로 관찰되었으나 항균 활성은 양호한 편으로 나타났다. 이 결과로부터 균의 생장과 항균 활성은 상호관련이 많지 않다는 것을 확인 할 수 있었다.As can be seen in Figure 14, the addition of malt extract and tryptone showed the best antimicrobial activity and the overall antimicrobial activity was increased by the added nitrogen source. However, in the case of sodium nitrate and ammonium nitrate, the antimicrobial activity was reduced compared to the control. Growth was shown to be best with the addition of peptone. In the case of ammonium nitrate, the most inferior growth was observed, but the antibacterial activity was found to be good. From this result, it was confirmed that the growth and antimicrobial activity of the bacteria are not much correlated.

[실시예 2-5] 생체 고분자 물질 첨가에 따른 항균 활성Example 2-5 Antimicrobial Activity According to the Biopolymer Addition

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 이용하여 제제개발을 하기 위해 다음과 같이 조사하였다. 수분 50중량%, 주성분으로 밀기울, 오트밀, 쌀겨, 대두박, 메주콩, 옥수수 가루를 각각 50중량%의 비로 혼합 제조하고 121℃, 1기압의 조건에서 15분간 멸균처리한 후 무균상태에서 1ml의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11(1 X 106 CFU 농도)를 접종하고 32℃ 교반 배양기에서 정치 배양하였다. In order to develop the formulation using the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain was investigated as follows. 50% by weight of moisture, bran, oatmeal, rice bran, soybean meal, soybeans, and cornmeal as 50% by weight of each ingredient are mixed and sterilized for 15 minutes at 121 ° C and 1 atm. Loriquafaciens EML-JUN11 (1 × 10 6 CFU concentration) was inoculated and incubated in a 32 ° C. stirred incubator.

정치 배양 후 생균수를 측정하기 위하여 최종 20일간 배양 후 각각의 고체배지에서 1g씩 취하여 9ml의 멸균증류수에 넣어 105, 106, 107, 108배 까지 희석하여 LB 배지에 도말하고 32℃에서 2일간 배양한 후 형성된 콜로니를 통해 생균수(CFU, colony forming unit)를 디지털 콜로니카운터(KT0074A, Kastech, Korea)를 이용하여 측정하였다.In order to measure viable cell count after stationary culture, 1 g of each medium was incubated in the final medium for 20 days, and then diluted to 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 times in 9 ml of sterile distilled water and plated in LB medium. After incubation for 2 days in the colony formed through the colony (CFU, colony forming unit) was measured using a digital colony counter (KT0074A, Kastech, Korea).

상기 고체배지에서 1g씩 취하고 10ml의 멸균증류수를 넣어 고체배지가 잘 풀리도록 교반하여 1500 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후 상등액 50㎕를 원형여과지(paper disc, 직경 8 mm)에 올려놓고, 25℃에서 7일간 배양한 후 생육저지환을 측정하여 도열병 병원균에 대한 항균 활성을 평가하였다. 그 결과 도 15 에서 보는 바와 같이 밀기울 배지를 주성분으로 배양할 경우 도열병균에 대한 항균활성이 본래의 항균활성 수준보다 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었으며 쌀겨 배지는 보통의 항균활성을 나타냈다. 그러나 대두박을 주성분으로 할 경우 낮은 항균활성을 나타냈다.Take 1g from the solid medium and add 10ml of sterile distilled water, stir to dissolve the solid medium well, centrifuge at 1500 rpm for 15 minutes, and place 50μl of the supernatant on a paper filter (diameter 8 mm). After culturing at 7 ° C. for 7 days, growth-lowering ring was measured to evaluate the antimicrobial activity against blast pathogens. As a result, as shown in FIG. 15, when the bran medium was cultured as the main component, it was found that the antimicrobial activity against the germ bacterium was higher than the original antimicrobial activity level, and the rice bran medium showed the normal antimicrobial activity. However, when soybean meal was the main ingredient, it showed low antibacterial activity.

또한 기본배지 및 첨가제의 조성을 달리하여 균체 생성을 조사한 결과는 도 16 에 나타난 바와 같이, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 경우 밀기울 배지를 주성분으로 배양할 경우 포자생성이 매우 양호한 것으로 나타났다. 하지만 오트밀 배지를 주성분으로 할 경우 낮은 포자생성을 보임을 확인 할 수 있었다.In addition, as a result of investigating the cell production by varying the composition of the basic medium and additives, as shown in Figure 16, the Bacillus amyloriquafaciens EML-JUN11 strain was found to be very good spore production when cultured as a main ingredient. However, if the oatmeal medium as the main component was confirmed to show a low spores production.

[실시예 3] 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11이 생산하는 방제용 조성물Example 3 Composition for Controlling Produced by Bacillus Amyloriquifaciens EML-JUN11

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11이 생산하는 방제용 조성물의 분리는 도 2와 같이 실시하였다. 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11를 실시예 2에서 수행한 배지에 접종(1 X 106)하여 32℃에서 120 rpm으로 48시간 동안 진탕 배양한다. 배양액은 6,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 균체를 제거하고, 회수한 상등액은 동일부피의 클로로포름(CHCl3, OCI, 67-66-3)과 에틸아세테이트 (EtOAc, OCI, 141-78-6)로 각각 2회 분배추출 하였다. 회수한 유기용매층은 농축기(N-100, Tokyo Rikakikai Co., Ltd)로 감압 농축한 후 항균 활성시험을 위한 조추출물로 사용하였다. 이 결과로 얻은 방제용 조성물은 다양한 병원성 미생물을 사용하여 항균력 활성을 조사하였다. 그 결과는 표 6와 같다. 이 결과로부터 클로로포름(CHCl3)층을 회수하여 얻은 방제용 조성물이 식물병원균과 미생물 병원균에 대해 항균 활성이 높을 뿐 아니라 활성범위 또한 넓은 것으로 확인되었다. 상기 식물병원균으로 벼도열병균(Pyricularia grisea EML-PGR01), 채소 반점세균병균(Xanthomonas campestris), 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae) 및 벼잎마름병균 (Pantoea agglomerans)를 사용하였고, 병원성 미생물로는 대장균(Escherichia coli) 및 약제 다제내성의 포도상구균(Staphyloccocus aureus)을 사용하였다. Separation of the composition for controlling the production of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 of the present invention was carried out as shown in FIG. The Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 was inoculated (1 X 10 6 ) in the medium performed in Example 2 and incubated for 48 hours at 120 rpm at 32 ℃. The culture solution was centrifuged at 6,000 rpm for 15 minutes to remove the cells, and the recovered supernatant was washed with the same volume of chloroform (CHCl 3, OCI, 67-66-3) and ethyl acetate (EtOAc, OCI, 141-78-6). Each distribution was extracted twice. The recovered organic solvent layer was concentrated under reduced pressure with a concentrator (N-100, Tokyo Rikakikai Co., Ltd) and used as a crude extract for antimicrobial activity test. The resulting control composition was investigated for antimicrobial activity using a variety of pathogenic microorganisms. The results are shown in Table 6. From the results, it was confirmed that the control composition obtained by recovering the chloroform (CHCl 3 ) layer not only has high antibacterial activity against phytopathogens and microbial pathogens but also has a wide range of activities. As the phytopathogens, Pyricularia grisea EML-PGR01, vegetable antibacterial bacterium ( Xanthomonas campestris ) , white leaf blight ( Xanthomonas oryzae ) and rice leaf blight ( Pantoea agglomerans ) was used as the pathogenic microorganism E. coli (Escherichia coli) and Staphylococcus aureus (Staphyloccocus aureus) of the drug was used as multi-drug resistance.

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[실시예 4] 세포내 실험(Example 4 Intracellular Experiment in vitroin vitro )에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주의 항균 실험 방법Antimicrobial test method of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain

위의 실시예 3으로 수행하여 얻은 방제용 조성물로 방제효과를 실험하였다. 벼 병원균의 균사생장에 미치는 영향을 알아보기 위해 클로로포름층의 조성물을 20% 에탄올로 용해시킨 후 800, 400, 200, 100, 50ppm으로 조절하여 1.5 ml eppendorf tube에 각각 1ml씩 넣어 도열병원균(Pyricularia grisea EML-PGR01), 깨씨무늬병원균(Bipolaris sp. EML-ORY15) 그리고 키다리병원균 (Fusarium moniloform EML-ORY56)을 5분과 10분 침지한 후 감자한천배지의 중앙에 치상하고 25℃ 교반 배양기에서 7일 동안 배양하면서 균사의 생장을 관찰하였다. 그 결과는 표 7 과 같다. 아래 표 7에서 나타난 바와 같이, 10분 침지했을 때 도열병원균은 100 ppm, 깨씨무늬병원균은 400 ppm, 키다리병원균은 800 ppm에서 균사 생장을 완전히 억제하였다. 그리고 5분 침지했을 때 도열병원균은 200 ppm, 깨씨무늬병원균은 800 ppm에서 완전히 균사 생장을 억제 하였음을 확인하였다. 그러나 키다리병원균은 침지 시간에 관계없이 항균 활성이 낮음을 확인하였다.The control effect was tested with the control composition obtained in Example 3 above. In order to examine the effect on the mycelial growth of rice pathogens, the composition of the chloroform layer was dissolved in 20% ethanol, and then adjusted to 800, 400, 200, 100, and 50 ppm, and each 1 ml of 1.5 ml eppendorf tube was added to the Pyricularia grisea. EML-PGR01), Bipolaris sp. EML-ORY15 and Fusarium moniloform EML-ORY56 were soaked for 5 minutes and 10 minutes, and then immersed in the center of potato agar medium for 7 days in a 25 ° C stirred incubator. Mycelial growth was observed during the culture. The results are shown in Table 7. As shown in Table 7 below, when immersed for 10 minutes, the germ growth was completely suppressed at 100 ppm of heat-borne pathogens, 400 ppm of sesame-pattern pathogens and 800 ppm of streptococcus pathogens. After 5 minutes of immersion, it was confirmed that the germ growth was completely inhibited at 200 ppm of the heat-borne pathogen and 800 ppm of the seed germ pathogen. However, it was confirmed that Kidari pathogenic bacteria had low antimicrobial activity regardless of immersion time.

또한, 벼 병원균의 포자발아에 미치는 영향을 알아보기 위해 위에서 조절한 농도 외에 25, 12.5 ppm 까지 낮추어 각각의 병원균 포자를 수확하여 슬라이드 글라스위에 치상하고 조절한 농도의 용액을 20㎕를 점적하였다. 점적한 후 커버 글라스를 덮고 2장의 습지(No.6, Whatman, England)가 깔린 배양접시(Petri dish, 90 X15 mm)에 위에 놓은 후, 25℃의 교반 배양기에 넣고 1일이 지난 후에 각 병원균의 포자 발아 억제율을 확인하였다. 그 결과는 도 16에서 광학현미경(Leica DM E, German)을 통해 관찰되었다. 또한 표 8에서 보는 바와 같이 도열병균을 100 ppm농도의 방제용 조성물이 포자 발아를 100% 억제하고, 12.5 ppm 농도에서는 포자 발아를 65.95% 억제하는 방제효과가 나타났다. In addition, in order to determine the effect on the spore germination of rice pathogens, each of the pathogen spores was harvested by lowering the concentration to 25 and 12.5 ppm in addition to the above adjusted concentrations, and 20 µl of a solution of the adjusted concentration was placed on a slide glass. After dropping, the cover glass was covered and placed on a petri dish (90 x 15 mm) covered with two wetlands (No. 6, Whatman, England), and placed in a stirred incubator at 25 ° C. and after 1 day, each pathogen Spore germination inhibition of was confirmed. The result was observed with an optical microscope (Leica DM E, German) in FIG. In addition, as shown in Table 8, the control composition for the control of the bacterium at 100 ppm concentration showed 100% inhibition of spore germination, and 65.95% inhibition of spore germination at 12.5 ppm concentration.

Figure 112011051896892-pat00007
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[실시예 5] 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 유효성분으로 하는 방제방법Example 5 Control method using Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain as an active ingredient

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주가 벼 잎도열병을 방제하는 효과를 알아보기 위해 다음과 같이 수행하였다. 전라남도 나주시 산포면 산제리에 위치한 벼 포장 (북위 35˚01'27", 동경 126˚49'49")에서 2010년 7월 9일부터 10월 30일까지 1주일 간격으로 살포하였다. 대조구로서 무처리구와 도열병 방제 약제로 등록된 골미드(Gol, 영일케미컬, 한국), 탑시드 (Top, 그린바이오텍, 한국) 또한 1주일 간격으로 살포하여 방제 및 생육 촉진 효과를 비교하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, 모든 처리구의 면접은 3m2씩 난괴법 3반복으로 수행하고, 처리 약제로는 골드미, 탑시드, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주, LB 배지 (대조구)를 사용하였다. 골드미의 처리구는 1,000배, 탑시드의 처리구는 10배, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주 처리구는 25배 그리고 LB 배지는 25배의 농도로 각각 희석하여 살포하였다. 그 결과 도 17에서 보는 바와 같이, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주를 벼 포장에 적용한 결과, 미생물제제인 골드미와 탑시드에 비해 잎도열병 예방 및 방제에 큰 효과를 보였다. 또한 도 18에서는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주가 상기 균주를 처리한 군과 달리 대조구에서는 암녹갈색의 작은 병무늬가 생겨서 장방추형으로 되며 서로 합쳐져서 불규칙한 병무늬가 되는 잎도열병이 발생함을 확인하였다. 상기 실험으로 방제한 후 벼의 생장 결과는 도 19 과 같다. 도 19에서 보는 바와 같이, 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주는 시간이 경과함에 따라 대조구와 비교했을 때 증가함을 확인하였고, 미생물제제인 골드미(Gol)와 탑시드(Top)를 처리했을 때보다도 생장이 좋음을 확인하였다.Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain of the present invention was performed as follows to determine the effect of controlling the rice leaf blast. The rice paddy (35˚01'27 "north latitude, 126˚49'49" longitude) located in Sanje-ri, Naju-si, Jeollanam-do was sprayed every week from July 9 to October 30, 2010. As a control, glumid (Gol, Yeongil Chemical, Korea) and Topseed (Top, Green Biotech, Korea), which were registered as a control agent for febrile disease, were also sprayed at weekly intervals to compare the control and growth promoting effects. As shown in Figure 3, all treatments were interviewed in 3m 2 repeated ingot method 3, and as a treatment drug, gold me, top seed, Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain, LB medium (control) Used. Gold rice treatment was 1,000 times, top seed treatment 10 times, Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain treatment was diluted 25 times and LB medium at 25 times the concentration and sprayed respectively. As a result, as shown in Figure 17, the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain was applied to rice packaging, showed a greater effect on the prevention and control of leaf blast compared to the microbial goldmi and top seed. In addition, in FIG. 18, unlike the group treated with the strain Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11, the control group had a dark greenish brown small lesion pattern, which became a long spindle and combined with each other, resulting in an irregular diseased leaf plaque. Confirmed. After controlling by the above experiments, the results of the growth of rice are shown in FIG. 19. As shown in Figure 19, the Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain was found to increase as compared to the control over time, and treated with microorganisms Goldmi (Gol) and top seed (Top) It confirmed that the growth is better than when.

한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC11972BPKCTC11972BP 2011063020110630

Claims (9)

식물병을 발생시키는 벼 도열병균(Pyricularia grisea EML-PGR01), 깨씨무늬병균(Bipolaris sp. EML-ORY15), 키다리병균(Fusarium moniliform EML-ORY56), 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01), 벼문고병균(Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142) 및 흰가루병균 (Erysiphe sp.) 의 식물병원균을 방제하는 기능이 있는 내생세균, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11(기탁번호:KCTC11972BP).
 Pyricularia grisea EML-PGR01, plant seeds that cause plant diseases ( Bipolaris sp. EML-ORY15), F.rium moniliform EML-ORY56, Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01, rice Bacillus amyloriquafaciens EML-JUN11 (Accession No .: KCTC11972BP), which has the function of controlling phytopathogens of Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142 and Erysiphe sp.
삭제delete 제1항의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11균주(기탁번호:KCTC11972BP)의 배양물을 이용하여 흰가루병원균(Erysiphe sp.)의 포자(oidium) 발아 저해율을 평가하는 항-흰가루병 초고속 검정법.An anti-powder disease ultrafast assay assay for evaluating the rate of spores (oidium) germination of Erysiphe sp. By using the culture of Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain (Accession No .: KCTC11972BP) of claim 1. 제1항의 바실러스 아밀로리퀴페션스 EML-JUN11 균주를 탄소원, 질소원 또는 이들의 혼합물을 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 배양방법. A culture method of inoculating the Bacillus amyloliquifections EML-JUN11 strain of claim 1 in a medium containing a carbon source, a nitrogen source or a mixture thereof. 제 4항에 있어서
상기 탄소원은 수크로오즈(sucrose), 덱스트로즈(dextrose), 락토오즈(lactose), 만니톨(mannitol), 수용성전분(soluble starch) 및 솔비톨(sorbitol)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이며,
상기 질소원은 질산나트륨(NaNO3), 질산암모늄(NH4NO3), 황산암모늄((NH4)2SO4), 맥아추출물, 펩톤(peptone) 및 트립톤(tryptone)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 함유하는 배양방법. The method of claim 4, wherein
The carbon source is at least one selected from the group consisting of sucrose, dextrose, lactose, lactose, mannitol, soluble starch and sorbitol,
The nitrogen source is selected from the group consisting of sodium nitrate (NaNO 3 ), ammonium nitrate (NH 4 NO 3 ), ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ), malt extract, peptone and tryptone A culture method containing more than one species. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EML-JUN11 균주(기탁번호:KCTC11972BP) 또는 제 5항의 배양방법에 의해 생산된 배양물을 함유하는 벼 도열병균(Pyricularia grisea EML-PGR01), 깨씨무늬병균(Bipolaris sp. EML-ORY15), 키다리병균(Fusarium moniliform EML-ORY56), 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01), 벼문고병균(Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142) 및 흰가루병균 (Erysiphe sp.)의 식물병원균을 방제하는 방제용 조성물. Bacillus amyloliquefaciens EML-JUN11 strain (Accession No .: KCTC11972BP) or Pyricularia grisea EML-PGR01 containing the culture produced by the culture method of claim 5, Bipolaris sp. EML -ORY15), phytopathogenic bacteria of Fusarium moniliform EML-ORY56, pepper anthrax ( Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01), Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142, and powdery mildew ( Erysiphe sp.) Composition for controlling. 제 6항에 있어서,
상기 조성물은 오트밀(oat meal), 쌀겨(rice bran), 밀기울(wheat bran), 대두박(soybean meal), 메주콩(soybean) 및 옥수수가루(corn)로 구성된 군으로 부터 선택된 1종 이상의 생체 고분자물질을 더 함유하는 방제용 조성물. The method according to claim 6,
The composition comprises at least one biopolymer selected from the group consisting of oat meal, rice bran, rice bran, soybean meal, soybean meal and corn flour. The composition for control containing further. 제 6항 또는 제 7항의 방제용 조성물을 이용하여 벼 도열병균(Pyricularia grisea EML-PGR01), 깨씨무늬병균(Bipolaris sp. EML-ORY15), 키다리병균(Fusarium moniliform EML-ORY56), 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01), 벼문고병균(Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142) 및 흰가루병균 (Erysiphe sp.)의 식물병원균을 방제하는 방제방법
Using the composition for the control of claim 6 or 7, Pyricularia grisea EML-PGR01, Bipolaris sp. EML-ORY15, Fusarium moniliform EML-ORY56, Capsicum anthrax ( Control method for controlling phytopathogenic bacteria of Colletotrichum gloeosporioides EML-CG01), Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142 and powdery mildew ( Erysiphe sp.)
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