KR100913822B1 - Method for hydrogen production by sequential culture of anaerobes - Google Patents

Method for hydrogen production by sequential culture of anaerobes Download PDF

Info

Publication number
KR100913822B1
KR100913822B1 KR1020080008725A KR20080008725A KR100913822B1 KR 100913822 B1 KR100913822 B1 KR 100913822B1 KR 1020080008725 A KR1020080008725 A KR 1020080008725A KR 20080008725 A KR20080008725 A KR 20080008725A KR 100913822 B1 KR100913822 B1 KR 100913822B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strains
culture
hydrogen production
medium
strain
Prior art date
Application number
KR1020080008725A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20090082779A (en
Inventor
이관영
김의용
김규호
최영진
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020080008725A priority Critical patent/KR100913822B1/en
Publication of KR20090082779A publication Critical patent/KR20090082779A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR100913822B1 publication Critical patent/KR100913822B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B3/00—Hydrogen; Gaseous mixtures containing hydrogen; Separation of hydrogen from mixtures containing it; Purification of hydrogen
    • C01B3/02—Production of hydrogen or of gaseous mixtures containing a substantial proportion of hydrogen

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 혐기성 혼합 균주의 단계적 배양을 이용한 수소가스 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 수소생성능이 있는 혐기성 혼합 균주 중 비우점종을 먼저 배지를 포함하는 반응기에 접종하고, 이와 동시 또는 일정시간 경과 후에 우점종 균주를 접종하여 혼합배양 하는 것을 특징으로 하는 수소가스 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing hydrogen gas using stepwise culturing of anaerobic mixed strains, specifically, inoculating a non-dominant species of anaerobic mixed strains with hydrogen production first into a reactor containing a medium, and at the same time or after a certain period of dominant species It relates to a hydrogen gas production method characterized by inoculating a strain inoculated with the culture.

본 발명에 따르면, 상기 균주들은 단독배양을 통한 수소생산 효율에서 완벽한 혐기적 조건 조성이 어렵기 때문에, 수소 생산에 더 효율적인 클로스트리디움의 높은 성장을 유도하기 위하여 두 균주의 혼합배양을 하였다. 또한 혼합배양에 이용될 수 있는 수소생산용 배지의 최적화 방법을 연구하였으며, 나아가 그람 염색법을 통하여 혼합배양 중의 우점종 균주를 확인하고, 비우점종 균주와 우점종 균주의 담체를 이용한 단계적 접종 및 배양을 통하여 수소생산 효율을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.According to the present invention, since the strains are difficult to form a perfect anaerobic condition in the hydrogen production efficiency through the single culture, the mixed culture of the two strains to induce high growth of Clostridium more efficient for hydrogen production. In addition, the method of optimizing the hydrogen production medium that can be used in the mixed culture was studied. Furthermore, the Gram staining method confirmed the dominant strains in the mixed culture, and the hydrogenation through the stepwise inoculation and culture using the carriers of the non-dominant strains and the dominant strains. It was confirmed that the production efficiency can be improved.

혐기성, 엔테로박터 에어로제네스, 클로스트리디움 부티리쿰, Enterobacter aerogenes, Clostridium butyricum, 수소가스, 단계적 배양 Anaerobic, Enterobacter aerogenes, Clostridium butyricum, Enterobacter aerogenes, Clostridium butyricum, Hydrogen gas, Staged culture

Description

혐기성 혼합 균주의 단계적 배양을 이용한 수소가스 생산방법 {Method for hydrogen production by sequential culture of anaerobes}Hydrogen gas production method using staged culture of anaerobic mixed strains {Method for hydrogen production by sequential culture of anaerobes}

본 발명은 수소생성능이 있는 통성 혐기성 균주와 절대 혐기성 균주를 배지를 포함하는 반응기에서 혼합배양 하는 것을 포함하는 수소가스 생산방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 상기 절대 혐기성 균주를 먼저 배지를 포함하는 반응기에 접종하여 배양하고, 일정시간 경과 후 통성 혐기성 균주를 상기 반응기에 접종하여 배양하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing hydrogen gas comprising mixing and culturing a anaerobic strain and an anaerobic strain having a hydrogen production capability in a reactor including a medium, and more specifically, the absolute anaerobic strain to a reactor including a medium first. Inoculating and culturing, and after a certain time passes through the anaerobic strain through the inoculation to the reactor and the method of culturing.

전 세계적으로 에너지 문제에 대한 관심도가 높아지면서 대체 에너지에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중에 미래 에너지로 크게 각광 받고 있는 수소 에너지는 고효율, 고부가가치, 환경 친화적이라는 장점을 지니고 있다. 본 발명에서는 혐기적 배양조건에서 수소를 생산하는 대표적인 미생물인 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes)와 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)을 대상으로 수소 생산능, 균주의 성장 패턴 및 수소생산을 위한 배지의 최적화 방법을 알아보았다. 이 균주들은 탄소원을 기질로 수소와 유기산을 생성하며 온도, pH, 탄소원, 질소원 등이 영향 인자로 작용한다. 균주의 단독배양을 통한 수소생산 효율은 보통 통성 혐기성인 Enterobacter aerogenes보다 절대 혐기성인 Clostridium butyricum이 높은 것으로 알려져 있다. 하지만 완벽한 혐기적 조건을 만든다는 것이 어렵기 때문에, Clostirium butyricum의 우수한 수소 생산능에도 불구하고 수소생산 수율은 높지 않았다. 본 발명은 Clostirium butyricum의 높은 성장을 유도하고, 상기 두 균주의 상호작용을 이용하기 위하여 두 균주의 혼합배양 방법을 연구하였다. 더불어 그람(Gram) 염색법을 통하여 혼합배양 중의 우점종 균주를 확인하고 이를 활용하여 담체를 이용한 단계적 균주 접종 및 배양을 통한 수소 생산 효율을 알아보았다. 두 과정의 결과를 이용하여 혼합균주의 단계적 배양이 수소 생산의 효율 증대에 영향을 끼치는지 여부에 대한 연구를 수행하였다.With increasing interest in energy issues around the world, research on alternative energy is being actively conducted. Among them, hydrogen energy, which is widely regarded as the future energy, has the advantages of high efficiency, high value added, and environment friendly. In the present invention, hydrogen production capacity, growth pattern and hydrogen production medium for enterobacter aerogenes and Clostridium butyricum , which are representative microorganisms that produce hydrogen in anaerobic culture conditions, Learned how to optimize. These strains produce hydrogen and organic acids as substrates using carbon sources, and temperature, pH, carbon sources, and nitrogen sources act as factors of influence. Hydrogen production efficiency through monoculture of strains is known to be higher in absolute anaerobic Clostridium butyricum than enterobacter aerogenes . However, because it was difficult to create perfect anaerobic conditions, the yield of hydrogen was not high despite the excellent hydrogen production capacity of Clostirium butyricum . The present invention has been studied a method of mixed culture of two strains to induce high growth of Clostirium butyricum and to take advantage of the interaction of the two strains. In addition, the dominant strains in the mixed culture were identified through Gram staining, and the hydrogen production efficiency through the stepwise inoculation and cultivation using the carrier was used. Using the results of the two processes, a study was conducted to determine whether the stepwise cultivation of the mixed strains affects the efficiency of hydrogen production.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 수소생산능이 있는 두 균주를 혼합배양 또는 통성혐기성 균주와 절대혐기성 균주를 순차적으로 혼합배양하는 경우, 수소생산 효율을 향상 시킬 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made a thorough research to overcome the problems of the prior art, as a result of mixing the two strains having hydrogen production capacity or incubated culture of the anaerobic strain and absolute anaerobic strain in order to improve the hydrogen production efficiency After confirming that it can, the present invention was completed.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 수소생산 효율을 향상시키기 위한 수소생산능이 있는 혐기성 균주들의 혼합배양 방법을 제공하는 데 있다.Therefore, the main object of the present invention is to provide a method of mixed culture of anaerobic strains with hydrogen production ability to improve the hydrogen production efficiency.

본 발명의 다른 목적은 상기 혐기성 균주들을 이용한 수소생산용 혼합배지를 제공하는데 있다.Another object of the present invention to provide a mixed medium for hydrogen production using the anaerobic strains.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 수소생성능이 있는 절대 혐기성 균주를 먼저 배지를 포함하는 반응기에 접종하여 배양하고, 일정시간 경과 후 수소생성능이 있는 통성 혐기성 균주를 상기 반응기에 접종하여 혼합배양하는 것을 포함하는 수소가스 생산방법을 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention inoculates an absolute anaerobic strain having a hydrogen production capacity in a reactor containing a medium, and cultures by inoculating a hybrid anaerobic strain having a hydrogen production capacity in a predetermined time and mixed culture It provides a method for producing hydrogen gas comprising the.

본 발명의 수소가스 생산방법에서, 상기 절대 혐기성 균주는 두 균주의 동시배양시 비우점종이고, 통성 혐기성 균주는 두 균주의 동시배양시 우점종인 것이 바람직하다.In the hydrogen gas production method of the present invention, the absolute anaerobic strain is non-dominant species when co-cultivation of two strains, the anaerobic strain is preferably predominant species when co-culture of two strains.

본 발명에서, 상기 우점종은 동시배양시 그람(Gram) 염색법에 의해 확인한 결과 상대적으로 성장률이 더 높게 나타난 균주를 의미하고, 반대로 비우점종은 상대적으로 성장률이 더 낮은 균주를 의미한다. 본 발명의 실시예에서는, 두 균주를 동시배양하여 그람염색하게 되면, 보라색으로 나타나는 그람(+) 균주와 붉은색으로 나타나는 그람(-) 균주가 혼합배양이 진행됨에 따라 붉은색의 그람(-) 균주의 성장 이 우세하여 전체적인 색변화가 붉은색으로 나타남을 확인하고, 붉은색을 우점종, 보라색을 비우점종으로 판단하였다(도 15 참조). In the present invention, the dominant species means a strain with a relatively higher growth rate as confirmed by Gram staining when co-cultured, and on the contrary, a non-dominant species means a strain with a relatively low growth rate. In an embodiment of the present invention, when two strains are co-cultured and gram stained, the gram (-) strains appearing in purple and the grams (-) strains appearing in red are mixed with red grams (-). The growth of the strain was predominantly confirmed that the overall color change appears in red, and red was determined as the dominant species and purple as the non-dominant species (see FIG. 15).

본 발명에서, 상기 “절대 혐기성 균주”는 생장 조건에서 산소가 존재하면 생육이 억제되거나 사멸되는 균주를 말하는 것으로, 산소가 있는 환경에서는 살 수 없는 미생물을 의미한다. 또한 상기 “통성 혐기성 균주”는 생장 조건에서 산소의 유무에 상관없이 생육할 수 있는 균주를 의미한다.In the present invention, the "absolute anaerobic strain" refers to a strain in which growth is inhibited or killed when oxygen is present in growth conditions, and means microorganisms that cannot live in an oxygen environment. In addition, the "passive anaerobic strain" means a strain that can grow in the presence or absence of oxygen in growth conditions.

본 발명에서, 우선 단독 배양을 통하여 각 균주의 수소 생산능을 알아보았다. 일반적으로 절대 혐기성인 Clostridium butyricum이 수소 생산능에서 우수하다는 것은 이미 알려진 사실이다. 하지만 실제 배양 공정에서는 공정이 진행됨에 따라 소량의 산소가 유입될 수 도 있기 때문에, 이러한 혐기적 조건을 전부 만족시키는 것이 어려운 문제여서, Clostridium butyricum을 단독 배양한 경우 수소 생산능은 이론적 값보다 낮아질 수밖에 없다. 또한 혼합 배양을 통한 공정에서도 두 균주의 성장 패턴에서 우점종을 차지하고 있는 한 균주(Enterobacter aerogenes)에 의하여 반응기 내의 반응이 일어났다.In the present invention, first, the hydrogen production capacity of each strain was examined through single culture. It is already known that Clostridium butyricum, which is generally anaerobic, is superior in hydrogen production capacity. However, in the actual culture process, a small amount of oxygen may be introduced as the process proceeds, so it is difficult to satisfy all of these anaerobic conditions. Therefore, when Clostridium butyricum is cultured alone, hydrogen production capacity is lower than the theoretical value. none. In addition, the reaction in the reactor was caused by a strain ( Enterobacter aerogenes ) that occupies the dominant species in the growth pattern of the two strains in the mixed culture process.

본 발명에서는 수소 생산에 효율적이면서도 비우점종인 Clostridium butyricum의 성장을 유도함으로서 좀더 높은 수소 생산 수율을 얻고자 하였다. 이를 위하여 담체를 이용한 Clostridium butyricum의 선 접종 및 배양을 통하여 충분히 균주가 자랄 수 있는 환경을 만들어 주었고, 단계적으로 통성혐기성인 Enterobacter aerogenes를 일정시간 후에 접종, 배양함으로써 반응기 내에 존재 또는 유입 가능성이 있는 소량의 산소를 소모시키게 하여, 결과적으로 Clostridium butyricum은 절대 혐기성 조건, Enterobacter aerogenes는 우점종의 효과를 일으켜, 실제 수소생산 공정에서도 두 균주 간의 상호작용을 유도할 수 있으며, 좀 더 높은 수소 생산 수율을 얻을 수 있음을 확인하였다.In the present invention, by inducing the growth of Clostridium butyricum , which is an efficient and non-dominant species for hydrogen production, it was intended to obtain a higher yield of hydrogen production. For this purpose, the pre-inoculation and cultivation of Clostridium butyricum using a carrier has created an environment in which the strains can grow sufficiently, and the inoculation and incubation of the anaerobic Enterobacter aerogenes after a certain period of time is carried out in a small amount of potential or inflow into the reactor. As a result, Clostridium butyricum is an absolute anaerobic condition, Enterobacter aerogenes has the effect of dominant species, which can induce interactions between the two strains in the actual hydrogen production process, resulting in higher hydrogen production yield. It was confirmed.

본 발명에서, 일반적으로는 통성혐기성 균주를 우선배양한 후 절대혐기성 균주를 배양하게 되면 통성혐기성 균주의 배양에 의해 혐기성 조건이 유지될 수 있어 절대 혐기성 균주의 생육에 기여할 것으로 예측되나, 본 발명자들은 상기 두 균주간의 관계가 우점관계가 분명하기 때문에 통성혐기성인 Enterobacter aerogenes를 선배양한 후 절대혐기성인 Clostridium butyricum를 배양하게 되면, 오히려 비우점종인 Clostridium butyricum의 성장이 제한될 수 있다는 점을 밝혀냈다. 따라서 본 발명에서는 두 혼합균주의 우점관계를 그람 염색법을 통하여 먼저 우점균주를 선별한 후, 비우점종(Clostridium butyricum)을 먼저 접종하고 비우점종이 충분히 자랄 수 있는 시간이 지난 후에 우점종을 접종함으로써 두 균주의 상호작용을 유도할 수 있었다.In the present invention, in general, if the culture of the absolute anaerobic strain after the first culture of the anaerobic strain can be maintained anaerobic conditions by culturing the anaerobic strain is expected to contribute to the growth of the absolute anaerobic strain, the present inventors Since the relationship between the two strains is dominant, it was found that the pre -culturing of anaerobic Enterobacter aerogenes and culturing absolute anaerobic Clostridium butyricum may limit the growth of non-dominant Clostridium butyricum . Therefore, in the present invention, the predominant relationship between the two mixed strains is first selected by Gram staining, followed by inoculation with the non-dominant species ( Clostridium butyricum ) and inoculation of the predominant species after the time when the non-dominant species have sufficiently grown. Could induce an interaction.

본 발명의 수소가스 생산방법에서, 상기 배지를 포함하는 반응기는 균주들의 고정화를 위한 담체를 포함하는 것이 바람직하다.In the hydrogen gas production method of the present invention, the reactor containing the medium preferably includes a carrier for immobilization of the strains.

본 발명에 있어서, 상기 담체의 재질은 수소생산에 이용되는 균주들을 고정화하기 위한 것으로 나무재질, 금속재질, 화학합성재질 등 균체가 부착하여 성장할 수 있다면 그 재질은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)이며, 균체의 성장 특성을 고려하여 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다.In the present invention, the material of the carrier is for immobilizing the strains used for hydrogen production, and the material is not particularly limited, as long as the cells, such as wood, metal, chemical synthetic materials, can be grown and attached. Vinyl alcohol (polyvinyl alcohol), in consideration of the growth characteristics of the cells can be selected and used appropriate.

본 발명의 수소가스 생산방법에서, 상기 절대 혐기성 균주는 수소생산능이 있는 클로스트리디움 종(Clostridium sp.), 통성혐기성 균주는 엔테로박터 에어로제네스(Enterobactoer aerogenes), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 시트로박터 종(Citrobacter sp.), 클라미도모나스 라인하르티(Chlamydomonas reinhardtii)을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 절대 혐기성 균주는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)이고, 통성 혐기성 균주는 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes)가 적당하다. 본 발명의 방법을 이용하여 상기 균주들 이외에도 수소생산능이 있는 절대 혐기성 균주와 통성 혐기성 균주를 혼합 배양함으로써 그 시너지 효과를 기대할 수 있으며, 이 때 두 균주의 우점관계를 밝힌 후 비우점종을 먼저 배양한다면 더 높은 시너지 효과를 기대할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 수소생산능이 있는 것으로 알려져 있는 대표적인 두 균주를 이용하여 본 발명에서는 혼합배양을 통하여 수소생산 효율을 증대할 수 있는 방법을 모색하고자 하였다. 본 발명의 실시예에서는 상기 균주들의 혼합배양, 특히 단계적 혼합배양을 통하여 수소생산 효율을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.In the hydrogen gas production method of the present invention, the absolute anaerobic strain is Clostridium sp . (Hydrogen-producing ability) Clostridium sp ., The anaerobic strain is Enterobactoer aerogenes , Enterobacter cloacae ( Enterobacter cloacae ) Citrobacter sp ., Chlamydomonas reinhardtii , but preferably the absolute anaerobic strain is Clostridium butyricum , and the permeable anaerobic strain is Enterobacter aero Genes ( Enterobacter aerogenes ) is suitable. In addition to the above strains by using the method of the present invention can be expected the synergistic effect by mixing and culturing the anaerobic strain and anaerobic anaerobic strains, if the cultivated first non-dominant species after revealing the predominant relationship between the two strains Higher synergies can be expected. In the present invention, by using two representative strains known to have the hydrogen production capacity in the present invention was to find a method that can increase the hydrogen production efficiency through the mixed culture. In the embodiment of the present invention it was confirmed that the hydrogen production efficiency can be improved through the mixed culture, in particular stepwise mixed culture of the strains.

본 발명에 있어서, 상기 클로스트리디움 부티리쿰에 대한 엔테로박터 에어로제네스의 균수 접종비율은 0.1 내지 10인 것이 바람직하다. 본 발명에서는, 상기 두 균주가 각각 절대 혐기성과 통성 혐기성의 특성을 가지므로, 절대 혐기성 균주를 충분히 배양시킨 후 통성 혐기성 균주를 배양시키면, 비우점종인 절대 혐기성 균주가 충분히 자란 후에 우점종인 통성 혐기성 균주가 생육함에 따라 반응기 내로 유입되는 소량의 산소를 소모시켜 혐기성 조건을 유지시키는데 도움이 되고, 이에 두 균주의 성장 및 수소생산 효율이 증가하게 됨을 확인하였다. 따라서 두 균주는 접종량은 상기 접종비율이라면 단독배양보다 시너지 효과를 기대할 수 있으며, 더 높은 수소생성량 증대를 위해서는 수소 생성능이 더 우수한 클로스트리디움 브티리쿰의 접종량을 많게 하는 것이 좋으므로 두 균주의 접종비율을 0.1 내지 1로 하는 것이 더욱 바람직하다.In the present invention, the bacterium inoculation ratio of Enterobacter aerogenes to Clostridium butyricum is preferably 0.1 to 10. In the present invention, since the two strains each have an absolute anaerobic and aerobic anaerobic characteristics, if the cultured anaerobic strains after fully cultured absolute anaerobic strains, the non-dominant absolute anaerobic strains are fully grown anaerobic strains that are predominant species As it grows, it helps to maintain the anaerobic conditions by consuming a small amount of oxygen introduced into the reactor, thereby increasing the growth and hydrogen production efficiency of the two strains. Therefore, the two strains can be expected to have a synergistic effect than the single culture if the inoculation ratio is the inoculation ratio, in order to increase the amount of hydrogen production, it is better to increase the inoculation ratio of Clostridium vitrikum, which has better hydrogen generation ability, so that the inoculation ratio of the two strains is higher. It is more preferable to set it as 0.1-1.

본 발명의 수소가스 생산방법에서, 상기 배지는 탄소원 20-40 g/L, 질소원 1-10 g/L, K2HPO4 10-20 g/L, KH2PO4 1-10 g/L, Na3C6H5O7·2H2O 0.1-2.0 g/L, (NH4)2SO4 0.5-3.0 g/L 및 미량원소(trace element)를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 용어 “배지”는 특별한 언급이 없는 한, 두 균주를 혼합하여 배양하기 위한 수소생산용 배지를 말하는 것으로, 본 명세서에서는 “혼합배지”와 혼용하여 사용하였다.In the hydrogen gas production method of the present invention, the medium is 20-40 g / L carbon source, 1-10 g / L nitrogen source, 10-20 g / L K 2 HPO 4 , 1-10 g / L KH 2 PO 4 , Na 3 C 6 H 5 O 7 .2H 2 O 0.1-2.0 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 0.5-3.0 g / L and trace elements are preferred. The term "medium" refers to a medium for hydrogen production for mixing and culturing two strains, unless otherwise specified. In this specification, the term "medium" is used interchangeably with "mixed medium".

본 발명에서, 상기 미량원소(trace element)는 미생물이 정상적으로 생장하는 데는 종류에 따라 차이가 있으나 반드시 필수불가결한 원소를 말하는 것으로, 본 발명에서는 NaCl 0.1 g, MgCl2·6H2O 0.1g, MnSO4·6H2O 0.015g, FeSO4·7H2O 0.025g, CuSO4·5H2O 0.005g, CoCl2·5H2O 1.25× 10-4 g를 포함하는 trace element solution을 사용하였다.In the present invention, the trace element (trace element) refers to an element that is essential but indispensable for the microorganism to grow normally, but in the present invention, NaCl 0.1 g, MgCl 2 · 6H 2 O 0.1g, MnSO A trace element solution containing 0.015 g of 4 · 6H 2 O, 0.025 g of FeSO 4 · 7H 2 O, 0.005 g of CuSO 4 · 5H 2 O, and 1.25 × 10 −4 g of CoCl 2 · 5H 2 O was used.

본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 글루코오스(glucose) 또는 수크로오스(sucrose), 질소원은 요소(urea), 맥아추출물(malt extract), 효모추출물(yeast extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상인 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 상기 질소원의 영향에서 peptone, tryptone에서 효율이 좋았으며, 질소원을 사용하지 않은 배지(no add)에서는 수소 생산이 거의 없는 것으로 나타나, 질소원이 균주의 성장에 중요한 영향을 미치는 것을 알 수 있었다(도 6참조).In the present invention, the carbon source is glucose (glucose) or sucrose (sucrose), the nitrogen source is urea (urea), malt extract (malt extract), yeast extract (yeast extract), peptone (peptone), tryptone (tryptone) It is preferably at least one selected from the group consisting of. In the embodiment of the present invention, the efficiency of the peptone, tryptone under the influence of the nitrogen source was good, and in the medium (no add) that does not use the nitrogen source, it was shown that there is little hydrogen production, the nitrogen source has an important effect on the growth of the strain It was found (see Fig. 6).

본 발명의 수소가스 생산방법에서, 상기 단계적 배양에서의 일정시간은 먼저 접종한 비우점종인 절대혐기성 균주가 충분히 성장할 수 있는 어떤 시간도 가능하나, 바람직하게는 12-36시간, 더욱 바람직하게는 20-28시간인 것을 특징으로 한다.In the hydrogen gas production method of the present invention, a predetermined time in the staged culture may be any time that the absolute anaerobic strain, which is a non-dominant species inoculated first, can grow sufficiently, preferably 12-36 hours, more preferably 20 Characterized by -28 hours.

본 발명의 수소가스 생산방법에서, 상기 혼합균주의 배양은 pH 5-7, 온도 35-40℃, 및 100-200 rpm으로 수행하는 것이 바람직하다. 상기 배양조건은 본 발명의 실시예에서와 같이, 각 균주의 단독배양 시 사용되는 배양조건을 토대로 설정한 것이며, 일반적인 혐기성 균주의 배양조건인 인큐베이터(37 ℃, 160 rpm)에서 혐기, 암반응 조건에서의 배양을 포함한다.In the hydrogen gas production method of the present invention, the culture of the mixed strain is preferably carried out at pH 5-7, temperature 35-40 ℃, and 100-200 rpm. The culture conditions are set based on the culture conditions used in the individual culture of each strain, as in the embodiment of the present invention, in the anaerobic, cancer reaction conditions in the incubator (37 ℃, 160 rpm) that is the culture conditions of common anaerobic strains Cultivation.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 탄소원 20-40 g/L, 질소원 1-10 g/L, K2HPO4 10-20 g/L, KH2PO4 1-10 g/L, Na3C6H5O7·2H2O 0.1-2.0 g/L, (NH4)2SO4 0.5-3.0 g/L 및 미량원소(trace element)를 포함하는 클로스트리디움 부티리쿰과 엔테로박터 에어로제네스의 혼합배양을 이용한 수소생산용 배지조성물을 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention provides a carbon source of 20-40 g / L, a nitrogen source of 1-10 g / L, K 2 HPO 4 10-20 g / L, KH 2 PO 4 1-10 g / L, Na 3 C 6 H 5 O 7 2H 2 O Clostridium Butyricum and Enterobacter Aero containing 0.1-2.0 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 0.5-3.0 g / L and trace elements It provides a medium composition for hydrogen production using a mixed culture of Genes.

본 발명의 수소생산용 배지조성물에서, 탄소원은 글루코오스(glucose) 또는 수크로오스(sucrose), 질소원은 요소(urea), 맥아추출물(malt extract), 효모추출 물(yeast extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상인 것이 바람직하다.In the medium composition for hydrogen production of the present invention, the carbon source is glucose (glucose) or sucrose (sucrose), the nitrogen source is urea, malt extract, yeast extract, peptone, trip It is preferably at least one selected from the group consisting of tryptones.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예 1. 혼합 균주 및 배양배지의 준비Example 1 Preparation of Mixed Strains and Culture Medium

본 발명에 사용된 균주는 탄소원을 주영양분으로 하여 혐기성 조건에서 암발효를 통해 수소와 부산물인 유기산(Organic Acid), CO2를 생산하는 미생물이다. 통성 혐기성인 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes) KCCM 40146과 절대 혐기성인 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) KCCM 35433이며, 한국미생물보존센터에서 균주 분양하여 제공받았다. 균주의 보관은 활성배양체(agar-plate) 상태로 4 ℃에서 냉장보관 하였다.The strain used in the present invention is a microorganism that produces hydrogen and by-products of organic acid and CO 2 through dark fermentation under anaerobic conditions using a carbon source as a main nutrient. The enteric anaerobic Enterobacter aerogenes KCCM 40146 and the absolute anaerobic Clostridium butyricum KCCM 35433 were provided by strain preservation at the Korea Microbiological Conservation Center. The strain was stored refrigerated at 4 ℃ in an agar-plate state.

본 발명에는 Medium No.2, Medium No.71, 혼합배지를 사용하였다. Medium No.2 배지는 Enterobacter aerogenes 종균배양 배지이며 조성은 다음과 같다: beef extract 3g, peptone 5g, D.W 1ℓ, pH 7.0, Temp. 37℃. Medium No.71 배지는 Clostridium butyricum 종균배양 배지이며 조성은 다음과 같다 : yeast extract 3g, beef extract 10g, peptone 10g, soluble starch 10g, glucose 5g, cysteine hydrochloride 0.5g, NaCl 5g, sodium acetate 3g, D.W 1ℓ, pH 6.80, Temp. 37 ℃. 혼합배지의 조성은 다음과 같다 : glucose 30g, peptone 5g, K2HPO4 14g, KH2PO4 6 g, Na3C6H5O7·2H2O 1g, (NH4)2SO4 2g, trace element solution (NaCl 0.1 g, MgCl2·6H2O 0.1g, MnSO4·6H2O 0.015g, FeSO4·7H2O 0.025g, CuSO4·5H2O 0.005g, CoCl2·5H2O 1.25× 10-4 g), D.W 1ℓ, pH 6.7, Temp. 37 ℃.Medium No. 2, Medium No. 71, and mixed medium were used in the present invention. Medium No. 2 medium is Enterobacter aerogenes spawn culture medium with the following composition: beef extract 3g, peptone 5g, DW 1L, pH 7.0, Temp. 37 ° C. Medium No.71 medium is Clostridium butyricum spawn culture medium with the following composition: yeast extract 3g, beef extract 10g, peptone 10g, soluble starch 10g, glucose 5g, cysteine hydrochloride 0.5g, NaCl 5g, sodium acetate 3g, DW 1ℓ , pH 6.80, Temp. 37 ° C. The composition of the mixed medium is as follows: glucose 30g, peptone 5g, K 2 HPO 4 14g, KH 2 PO 4 6 g, Na 3 C 6 H 5 O 7 2H 2 O 1g, (NH 4 ) 2 SO 4 2g, trace element solution (NaCl 0.1 g, MgCl 2 · 6H 2 O 0.1g, MnSO 4 · 6H 2 O 0.015g, FeSO 4 · 7H 2 O 0.025g, CuSO 4 · 5H 2 O 0.005g, CoCl 2 · 5H 2 O 1.25 × 10 -4 g), DW 1L, pH 6.7, Temp. 37 ° C.

배지의 초기 pH를 설정하기 위하여 potassium phosphate buffer를 사용하였다. D.W 대신 혼합배지에 사용되는 KH2PO4와 K2HPO4을 각 0.3M, 0.5M, 1.0M의 용액으로 만들어 혼합하여 초기 pH를 설정한 buffer 용액 1ℓ를 사용하였다. 완충 역할로서 초기의 안정된 pH를 유지하였다.Potassium phosphate buffer was used to set the initial pH of the medium. Instead of DW, KH 2 PO 4 and K 2 HPO 4 used in the mixing medium were mixed into 0.3M, 0.5M, and 1.0M solutions, and 1 L of buffer solution was used to set the initial pH. An initial stable pH was maintained as a buffer.

실시예 2. 수소생산 배지의 최적화를 위한 혼합배양 방법Example 2 Mixed Culture Method for Optimization of Hydrogen Production Medium

활성배양체(agar-plate) 상태의 균주는 loop를 이용하여 먼저 Medium No.2, Medium No.71 배지 100 ㎖에 소량(colony) 접종하고 인큐베이터(JISICO shaking incubator, 37 ℃, 160 rpm)에서 2일간 배양한다. 균주의 상태를 최적화하기 위하여 3~4회 반복 배양하였으며, 사전 적응(pre-conditioning)이 된 상태에서 혼합배지에 접종하였다. 혼합배지에 접종할 때에는 glove box(N2 gas) 내에서 실행하였으며, 종균배양 배지에서 충분히 영양분을 섭취한 균주를 syringe를 이용하여 1㎖ (1% v/v)을 혼합배지에 접종한다. 혼합배양의 경우 En. aerogenes : Cl. butyricum = 1 : 4의 비율로 배지에 접종하였다(Mix). 총 배지의 양은 100 ㎖이고 initial head space는 60 ㎖이다. head space는 분석에서 sampling으로 인한 serum bottle 내의 head space의 변화를 감안한 것으로 변화된 부피에 대한 총 발생 gas량과 gas중의 H2의 비율에 있어 매우 중요하다.Strains in the agar-plate state were first inoculated in a small amount (colony) in 100 ml of Medium No. 2, Medium No. 71 medium using a loop, and then incubated for 2 days in a JISU shaking shaking incubator (37 ℃, 160 rpm). Incubate. In order to optimize the state of the strain was repeated 3 to 4 times culture, inoculated in mixed medium in a pre-conditioning (pre-conditioning) state. When inoculated into the mixed medium was carried out in a glove box (N 2 gas), 1ml (1% v / v) was inoculated into the mixed medium using a syringe for strains sufficiently ingested in the spawn culture medium. For mixed cultures En. aerogenes : Cl. butyricum = 1: 4 was inoculated in the medium (Mix). The amount of total medium is 100 ml and the initial head space is 60 ml. The head space takes into account the change in head space in the serum bottle due to sampling in the analysis, which is very important for the total amount of gas produced and the ratio of H 2 in the gas to the changed volume.

접종 직 후, bottle 내에 증가된 배지의 양으로 인한 압력을 제거하기 위하여 syringe를 이용하여 serum bottle 내를 대기압 상태로 만들어주었다. 배양은 인큐베이터(37 ℃, 160 rpm)에서 혐기, 암반응 조건에서 배양하였다.Immediately after inoculation, the serum bottle was brought to atmospheric pressure using a syringe to remove pressure due to the increased amount of medium in the bottle. The culture was incubated under anaerobic and cancer reaction conditions in an incubator (37 ℃, 160 rpm).

실시예 3. 혼합배지의 최적화Example 3 Optimization of Mixed Medium

수소생산 배지의 최적화를 위하여 몇 가지 인자를 변화하여 실험을 수행하였다. 먼저 미생물의 성장에 있어서 가장 큰 영향을 미치는 요소인 pH의 비교를 위하여 potassium phosphate buffer를 이용한 초기 배지의 pH를 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0으로 설정하고, 대조군으로 buffer를 사용하지 않은 배지와 비교 실험하였다(도 1). 또한 buffer의 농도를 0.3M, 0.5M, 1.0M으로 하여 효율적인 buffer의 사용을 실험하였다(도 2). 탄소원의 비교를 위하여 글루코오스(glucose)와 수크로오스(sucrose)를 사용하였고, lag time을 비교하였다(도 3, 4). 탄소원의 잔여량에 따른 비교를 위하여 탄소원의 양을 20g, 25g, 30g으로 비교 실험하였다(도 5). 질소원의 비교를 위하여 urea, malt extract, yeast extract, peptone, tryptone을 각각 5g 씩 넣어 여러 가지 질소원 조건에서 비교하였다(도 6). 환원제로 L-cysteine 사용하여 영향을 알아보고 유기산의 생성 및 소비 패턴을 분석하였다(도 7).In order to optimize the hydrogen production medium, several experiments were carried out with varying factors. First, the pH of the initial medium using potassium phosphate buffer was set to 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 for comparison of pH, the most influential factor in the growth of microorganisms. Comparative experiment (FIG. 1). In addition, the concentration of the buffer was 0.3M, 0.5M, 1.0M to test the use of efficient buffer (Fig. 2). Glucose (glucose) and sucrose (sucrose) were used to compare the carbon source, and lag time was compared (Figs. 3 and 4). The amount of carbon source was compared to 20g, 25g, and 30g for comparison according to the remaining amount of carbon source (FIG. 5). For comparison of the nitrogen source urea, malt extract, yeast extract, peptone, tryptone 5g each was compared under various nitrogen source conditions (Fig. 6). The effect of using L-cysteine as a reducing agent was analyzed and the production and consumption patterns of organic acids were analyzed (FIG. 7).

도 1과 2는, Buffer를 사용한 초기 pH 설정 배지와 buffer의 농도에 따른 배지에서 Enterobacter aerogenes의 비성장속도(μ)와 수소의 비생산속도(qp)를 나타낸 그래프이다. 도면에서 볼 수 있듯이, Initial pH 6.5, buffer conc. 0.5 M 배지에서 효율이 가장 높았으며, Buffer를 사용하지 않은 배지에서는 pH가 급감하면서 초기 균주의 성장이 높았다가 급감하였다. 1.0M의 buffer 농도에서는 pH가 적정 범위에 들어서지 못한 채 균주의 성장이 이루어지지 않았다. Buffer의 농도가 다를 때 비성장속도는 비슷한 값(3.85 ~ 4.47)은 비슷하지만 수소의 비생산속도 값(10.80 ~ 17.80)은 차이를 보였다. 균주의 성장이 높다고 해서 수소의 생산 또한 증가하는 것은 아니다. 즉, 수소생산 배지 환경이 최적화일 때 균주 성장 및 수소 생산이 극대화 된다.1 and 2 are graphs showing the specific growth rate (μ) of Enterobacter aerogenes and the specific production rate of hydrogen (qp) in the initial pH setting medium using the buffer and the medium according to the concentration of the buffer. As can be seen in the figure, Initial pH 6.5, buffer conc. In 0.5 M medium, the efficiency was the highest, and in medium without Buffer, the initial strain growth was high and then sharply decreased as pH decreased. At the buffer concentration of 1.0M, the strain was not grown without the pH being in the proper range. When the buffer concentrations were different, the specific growth rate was similar (3.85 ~ 4.47) but the specific production rate of hydrogen (10.80 ~ 17.80) was different. High strain growth does not increase hydrogen production. That is, strain growth and hydrogen production are maximized when the hydrogen production medium environment is optimized.

도 3과 4에서와 같이, Lag time과 최대 수소 생산속도는 glucose의 경우 20h, 215.3 ㎖/ℓ/h이며, sucrose의 경우 36h, 98.3 ㎖/ℓ/h로 나타냈으며, 총 수소 생산량에서는 glucose의 경우 431 ㎖, sucrose의 경우 427 ㎖이었다. 도 5에서, 탄소원의 양에서는 20, 25 g/L 에서 잔여 탄소원의 양으로 보아 거의 소비를 하였으며 30g 이상의 경우에는 균주가 그 이상의 탄소원을 소비하지 못하였다.As shown in Figures 3 and 4, the Lag time and the maximum hydrogen production rate was 20h, 215.3 ㎖ / ℓ / h for glucose, 36h, 98.3 ㎖ / ℓ / h for sucrose, and the total hydrogen production of glucose 431 mL for case and 427 mL for sucrose. In FIG. 5, the amount of carbon source was almost consumed in terms of the amount of remaining carbon source at 20, 25 g / L, and the strain did not consume more carbon source than 30g.

도 6에서, 질소원의 영향에서 peptone, tryptone에서 효율이 좋았으며, 질소원을 사용하지 않은 배지(no add)에서는 수소 생산이 거의 없는 것으로 보아 질소 원이 균주의 성장에 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 또한 환원제를 사용하였을 경우에는 첨가량에 비례하여 균주의 성장이 저조하였고(도 7), 유기산의 생성·소비 패턴에서는 초기 pH 6.5 설정 배지에서 아세트산(acetic acid)의 양이 많았으며(도 8), 이는 배지의 산성화와 연관되어 수소 생산능을 저하시킨다(도 9).In Figure 6, the effect of the nitrogen source was good in peptone, tryptone, the medium (no add) that does not use the nitrogen source, it can be seen that the nitrogen source affects the growth of the strain because there is little hydrogen production. In addition, when the reducing agent was used, the growth of the strain was low in proportion to the amount of addition (Fig. 7), and the amount of acetic acid in the initial pH 6.5 setting medium was high in the production and consumption pattern of the organic acid (Fig. 8). This lowers the hydrogen production capacity in association with acidification of the medium (FIG. 9).

따라서, Enterobacter aerogenes, Clostridium butyricum, 혼합균주(Mix)의 최적 배지 조건은 initial pH 6.5, potassium phosphate buffer conc. 0.5M, glucose 30g/ℓ, peptone 5g/ℓ이다. 단위 glucose당 수소생산 ㏖수는 Enterobacter aerogenes 1.058, Clostridium butyricum 1.061, 혼합균주(Mix) 1.194이며, 배지에 다량의 영양분을 첨가하거나 반응기의 크기를 크게 하여 압력에 대한 저항을 적게 하면 그 수치(H2 ㏖/㏖ glucose)를 더 높일 수 있다.Therefore, the optimum media conditions for Enterobacter aerogenes , Clostridium butyricum , and Mix strain were initial pH 6.5, potassium phosphate buffer conc. 0.5 M, glucose 30 g / l, peptone 5 g / l. The number of mols of hydrogen produced per unit of glucose was 1.058 for Enterobacter aerogenes , 1.061 for Clostridium butyricum, and 1.194 for mixed strain (Mix), and the value was obtained by adding a large amount of nutrients to the medium or increasing the size of the reactor to decrease the pressure resistance (H 2). Mol / mol glucose) can be further increased.

실시예 4. 최적화 배지에서 혼합배양에 의한 수소생산량 변화Example 4 Changes in Hydrogen Production by Mixed Culture in Optimized Medium

상기 최적화 배지에서 혼합배양 접종 후 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 및 168시간 경과된 시점에서 syringe를 이용하여 gas(1 ㎖), liquid(1 ㎖) sampling하였다. 총 gas 생산량은 syringe를 serum bottle에 꽂아서 head space의 증가량을 기록하였다. 수소생산량(H2)은 GC(Gas Chromatography, Young-Lin M600D, SUPELCO Carboxen 1000 column, TCD detector)로 분석하였다. 생산된 gas 중에 정확한 H2 생산량 분석을 위하여, 표준 gas(H2 조성 비율 5%, 10%, 20%, 44%)를 사용하여 교정(calibration)하였다. 균체량(cell mass)은 UV(Ultraviolet Spectroscopy, Varian cary 50UV-vis, 10 ㎜ Quartz cell)로 원시료의 10배 희석하여 660㎚에서 측정하고 건조중량법을 이용하여 그 양을 산출하였다. 잔여 당량분석은 UV로 glucose의 경우 DNS법에 의하여 546 ㎚ 에서 측정하였고, sucrose의 경우 페놀-황산법에 의하여 490 ㎚에서 측정하였다.3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours after the mixed culture inoculation in the optimized medium using a syringe (gas (1 ml), liquid ( 1 ml) was sampled. Total gas production was recorded by increasing the head space by inserting a syringe into the serum bottle. Hydrogen production (H 2 ) was analyzed by GC (Gas Chromatography, Young-Lin M600D, SUPELCO Carboxen 1000 column, TCD detector). For accurate H 2 production analysis in the produced gas, calibration was performed using standard gas (5%, 10%, 20%, 44% H 2 composition ratio). Cell mass was measured at 660 nm by diluting 10 times the raw material with UV (Ultraviolet Spectroscopy, Varian cary 50UV-vis, 10 mm Quartz cell) and calculating the amount by dry weight method. Residual equivalence was measured by UV at 546 nm for glucose and sucrose at 490 nm for phenol-sulfuric acid.

도 10, 11, 12는 potassium phosphate buffer 0.5M, initial pH 6.5, glucose 30g/ℓ, peptone 5g/ℓ 배지에서 Enterobacter aerogenes, Clostridium butyricum, 혼합 균주(Mix)를 배양하여 얻은 결과이다. pH가 5.0 ~ 5.5 범위에서 균주의 성장과 수소 생산이 동시에 이루어진다. 단독 배양일 때보다 혼합균주의 배양 때에 수소 생산능과 최대 수소 생산 속도가 높았다. 이는 두 균주 간의 상호작용으로 인한 결과로 판단된다.10, 11, and 12 are results obtained by culturing Enterobacter aerogenes , Clostridium butyricum , and mixed strain (Mix) in potassium phosphate buffer 0.5M, initial pH 6.5, glucose 30g / L, peptone 5g / L medium. Strain growth and hydrogen production occur simultaneously in the pH range of 5.0 to 5.5. The hydrogen production capacity and the maximum hydrogen production rate were higher in the culture of the mixed strain than in the single culture. This is believed to be a result of the interaction between the two strains.

실시예 5. 수소생산 효율 증대를 위한 단계적 혼합배양Example 5 Stepwise Culture for Increasing Hydrogen Production Efficiency

단계적 혼합배양에는 상기 실시예 1에서 준비된 두 균주, 혼합배지 및 배양조건을 이용하였다.In step mixed culture, the two strains prepared in Example 1, mixed medium and culture conditions were used.

1) 분석방법1) Analysis method

반응기 내 head space에 생산된 gas의 부피는 syringe를 이용하여 측정하였다. 생산된 gas중 수소의 조성은 GC(Gas Chromatography, Young-Lin M600D, SUPELCO Carboxen 1000 column, TCD detector)를 이용하여 분석하였다. Cell mass는 UV(Ultraviolet Spectroscopy, Varian cary 50 UV-vis, 10 ㎜ Quartz cell)로 원 시료의 10배 희석하여 660 ㎚에서 측정하였으며 건조중량법을 이용하여 균주의 농도를 산출하였다. Glucose는 DNS법에 의하여 분석하였다. The volume of gas produced in the head space of the reactor was measured using a syringe. The composition of hydrogen in the produced gas was analyzed using GC (Gas Chromatography, Young-Lin M600D, SUPELCO Carboxen 1000 column, TCD detector). Cell mass was measured at 660 nm by diluting 10 times the original sample with UV (Ultraviolet Spectroscopy, Varian cary 50 UV-vis, 10 mm quartz cell) and using a dry weight method to determine the concentration of the strain. Glucose was analyzed by DNS method.

2) 동시 접종 혼합배양2) Simultaneous inoculation mixed culture

수소 생산 배지에 두 균주를 농도비 1:1의 비율로 동시 접종하였다. 접종 후 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 및 168시간 경과된 시점에서 syringe를 이용하여 head space 중의 gas 1 ㎖과 배양액 1 ㎖을 시료 채취하였다. 분석기기를 이용하여 누적 수소 생산량, pH, cell mass, glucose의 변화량을 분석하였다.Two strains were simultaneously inoculated in a hydrogen production medium at a ratio of 1: 1. At 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours after inoculation, 1 ml of gas and 1 ml of culture medium were sampled using a syringe. . Cumulative hydrogen production, pH, cell mass, glucose changes were analyzed using the analyzer.

두 균주를 농도비 1:1의 비율로 동시 접종하여 얻은 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서, 누적 수소 생산량은 486 ㎖ 이었으며 pH 5.0 ~ 6.0 범위에서 cell mass가 급증한다. 이에 따라 glucose의 양은 감소하며 최종적으로 glucose가 거의 소비되었음을 알 수 있다. 최종 cell mass는 0.7 g/L이며 수소 생산 수율은 1.42 mole H2/mole glucose이다.13 shows the results obtained by simultaneously inoculating two strains at a ratio of 1: 1. In FIG. 13, the cumulative hydrogen production amount was 486 ml and the cell mass increased rapidly in the pH range of 5.0 to 6.0. As a result, the amount of glucose decreases, and the final amount of glucose was almost consumed. The final cell mass is 0.7 g / L and the hydrogen production yield is 1.42 mole H 2 / mole glucose.

3) 단계적 혼합배양을 위한 우점종 균주의 선별3) Selection of dominant strains for staged mixed culture

수소생산 배지에 두 균주를 혼합배양(1:1) 하였을 경우, 한 균주가 다른 균주에 비하여 크게 성장하는 우점종으로 나타났다. 일반적으로 박테리아는 Gram 염색법에 의하여 양성균(+)과 음성균(-)으로 구분할 수 있다. Gram 염색법에 필요한 시약을 표 1에 나타내었다.When two strains were mixed cultured (1: 1) in the hydrogen production medium, one strain was found to grow predominantly compared to the other strains. In general, bacteria can be classified into positive bacteria (+) and negative bacteria (-) by Gram staining. The reagents required for Gram staining are shown in Table 1.

[표 1]. 시약 제조TABLE 1 Reagent manufacturing

Figure 112008007133657-pat00001
Figure 112008007133657-pat00001

*distilled water* distilled water

최종 염색된 표본을 증류수로 세척하였을 때에 crystal violet의 보라색이 나타나는 균주는 Gram 양성균(+)이며, safranine의 붉은 색이 나타나는 균주는 Gram 음성균(-)이다. Gram 염색법에서 색깔의 변화를 도 14에 나타내었다. 본 발명에 사용한 균주 가운데 Enterobacter aerogenes는 Gram 음성균(-)이고 Clostridium butyricum은 Gram 양성균(+)으로 알려져 있다. 상기 실시예의 혼합배양 과정에서 접종 후 6, 12, 18, 24 시간 경과된 시점의 시료를 일정량 채취하여 Gram 염색법을 통한 두 균주의 성장 패턴을 관찰하였다.When the final stained sample was washed with distilled water, the purple violet strain of crystal violet was Gram positive bacteria (+), and the red strain of safranine was Gram negative bacteria (-). The color change in the Gram staining method is shown in FIG. 14. Among the strains used in the present invention, Enterobacter aerogenes is known as Gram negative bacteria (-) and Clostridium butyricum is Gram positive bacteria (+). In the mixed culture process of the above example, 6, 12, 18, and 24 hours after inoculation, a certain amount of samples were taken and observed growth patterns of the two strains by Gram staining.

그 결과, 혼합 균주의 배양에서 접종 후 6, 12, 18, 24 시간 경과 된 시점에서의 균주 성장 패턴을 도 15에 나타내었다. 초기에는 두 균주가 비슷하게 성장하다가 점점 한 균주의 성장이 두드러지면서 24시간 경과 된 시점에서는 우점종을 확 인할 수 있었다. Gram 염색법을 통한 결과에서 우점종은 Enterobacter aerogenes이다. 이는 단독 배양에서 수소 생산 효율이 높았던 Clostridium butyricum이 제대로 성장하지 못하여 결과적으로 수소 생산 효율이 떨어졌음을 알 수 있었다.As a result, the strain growth pattern at 6, 12, 18, 24 hours after inoculation in the culture of the mixed strain is shown in Figure 15. Initially, the two strains grew similarly, and as the growth of one strain became more prominent, the dominant species could be identified at 24 hours. Dominant species in the results of Gram staining are Enterobacter aerogenes . It was found that Clostridium butyricum, which had high hydrogen production efficiency in single culture, did not grow properly, resulting in a decrease in hydrogen production efficiency.

4) 담체를 이용한 단계적 배양을 통한 균주의 성장 패턴4) Growth pattern of the strain through the stepwise culture using the carrier

실시예 5의 3)에 따라, 담체를 이용하여 비우점종 균주를 우선적으로 접종 및 배양시켰다. 담체의 재질은 PVA(polyvinyl alcohol)이며 총 배지양의 5% (w/V)로 반응기에 넣어서 사용하였다. 160 ㎖ serum bottle에 배지 50 ㎖와 비우점종을 접종하고 접종 후 24 시간 경과된 시점에서 새로운 배지 50 ㎖와 우점종을 접종하였다. 배양을 통하여 단계적 접종 및 배양에 의한 수소 생산 효율의 증대를 알아보았다.According to 3) of Example 5, non-dominant species strains were preferentially inoculated and cultured using a carrier. The material of the carrier was polyvinyl alcohol (PVA) and was used in a reactor at 5% (w / V) of the total medium volume. 50 ml of medium and non-dominant species were inoculated into 160 ml serum bottles, and 50 ml of fresh medium and dominant species were inoculated 24 hours after inoculation. The increase in hydrogen production efficiency by the step inoculation and culture through the culture was examined.

단계적 혼합배양의 결과, Clostridium butyricum은 단독 배양에서 상대적으로 수소 생산 효율이 높지만 혼합 배양에서는 비우점종으로 나타났다. 따라서 Clostridium butyricum의 성장을 유도하기 위하여, 담체에 우선적으로 단독 배양하고 24시간 경과 된 시점에서 Enterobacter aerogenes를 단계적으로 접종하여 얻은 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서, 단계적으로 균주를 접종 하였을 경우에서 누적 수소 생산량은 506.8 ㎖ 이었으며 cell mass는 0.98 g/L로 두 균주를 동시 접종하였을 때 보다 높은 값을 나타내었다. 수소 생산 수율은 1.49 mole H2/mole glucose였다.As a result of the staged mixed culture, Clostridium butyricum showed relatively high hydrogen production efficiency in single culture but non-dominant species in mixed culture. Therefore, in order to induce the growth of Clostridium butyricum , the result obtained by inoculating Enterobacter aerogenes stepwise at 24 hours after being incubated preferentially in the carrier is shown in Figure 16. In FIG. 16, the cumulative hydrogen production was 506.8 ml when the strains were inoculated step by step, and the cell mass was 0.98 g / L, indicating higher values when two strains were simultaneously inoculated. Hydrogen production yield was 1.49 mole H 2 / mole glucose.

이상의 결과를 정리하면, 본 발명에서는 수소 생산능이 높은 Clostridium butyricum의 성장을 유도함으로서 좀더 높은 수소 생산 수율을 얻고자 하였다. 이를 위하여 담체를 이용한 Clostridium butyricum의 선 접종 및 배양을 통하여 충분히 균주가 자랄 수 있는 환경을 만들어 주었고, 단계적으로 Enterobacter aerogenes를 접종함으로서 두 균주 간의 상호작용을 유도할 수 있었으며, 좀 더 높은 수소생산 수율을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 두 균주를 농도비 1:1의 비율로 동시 접종하여 실험하였을 경우에서, 누적수소 생산량은 486 ㎖, 수소 생산 수율은 1.42 mole H2/mole glucose이었으며, 담체를 이용하여 두 균주를 단계적으로 접종하여 실험하였을 경우에는 누적 수소 생산량은 506.8 ㎖, 수소생산 수율은 1.49 mole H2/mole glucose로써, 결과적으로 단독배양보다는 동시 혼합배양, 동시 혼합배양보다는 단계적 혼합배양이 수소생산량 및 수소생산 수율이 높게 나타났다.In summary, in the present invention, by inducing the growth of Clostridium butyricum with high hydrogen production ability, it was intended to obtain a higher yield of hydrogen production. For this purpose, the pre-inoculation and incubation of Clostridium butyricum using carriers made the environment sufficiently to grow the strain, and by inoculating Enterobacter aerogenes step by step, it was possible to induce the interaction between the two strains, and higher yield of hydrogen production. It can be seen that. When the two strains were inoculated simultaneously at a ratio of 1: 1, the cumulative hydrogen production yield was 486 ml, and the hydrogen production yield was 1.42 mole H 2 / mole glucose. In this case, the cumulative hydrogen production was 506.8 ml, and the hydrogen production yield was 1.49 mole H 2 / mole glucose. As a result, the hydrogen production yield and the hydrogen production yield were higher in the co-culture and the step-mix culture than in the simultaneous culture.

이상 설명한 바와 같이, 수소 생산능이 높은 Clostridium butyricum의 효율적인 성장을 유도하여 좀더 높은 수소 생산 수율을 얻고자 하였다. 이를 위해 담체를 이용한 Clostridium butyricum의 선 접종 및 배양을 통하여 충분히 균주가 자랄 수 있는 환경을 만들어 주었고, 일정시간 후 단계적으로 Enterobacter aerogenes를 접종함으로서 두 균주 간의 상호작용을 유도하였으며, 이러한 상호작용은 좀 더 높은 수소생산 수율을 나타낸다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 방법을 이용하면 수소생산 공정에서 생산효율성 향상을 이룰 수 있으며, 나아가 해당 산업의 발전에 기여할 것으로 판단된다.As described above, inducing efficient growth of Clostridium butyricum with high hydrogen production capacity was intended to obtain higher hydrogen production yield. To this end, the pre-inoculation and incubation of Clostridium butyricum with a carrier was used to create an environment in which the strains could grow sufficiently, and after a certain period of time, the inoculation of Enterobacter aerogenes induced the interaction between the two strains. It was confirmed that a high yield of hydrogen production was shown. Therefore, by using the method of the present invention it is possible to achieve the production efficiency improvement in the hydrogen production process, and furthermore, it is believed to contribute to the development of the industry.

도 1과 2는 buffer를 사용한 초기 pH 설정 배지와 buffer의 농도에 따른 배지에서 Enterobacter aerogenes의 비성장속도(μ)와 수소의 비생산속도(qp)를 나타낸 그래프이다.1 and 2 are graphs showing the specific growth rate (μ) and specific hydrogen production rate (qp) of Enterobacter aerogenes in the initial pH setting medium using the buffer and the medium according to the concentration of the buffer.

도 3은 글루코오스와 수크로오스 배지에서 Enterobacter aerogenes의 수소생산 속도를 나타낸다.Figure 3 shows the hydrogen production rate of Enterobacter aerogenes in glucose and sucrose medium.

도 4는 글루코오스 배지에서 Enterobacter aerogenes의 누적 수소생산량을 나타낸다.Figure 4 shows the cumulative hydrogen production of Enterobacter aerogenes in glucose medium.

도 5는 글루코오스 배지에서 Enterobacter aerogenes의 잔여 탄소원 양을 나타낸다.5 shows the residual carbon source amount of Enterobacter aerogenes in glucose medium.

도 6은 다양한 질소원에서 Enterobacter aerogenes의 누적 수소생산량을 나타낸다.6 shows the cumulative hydrogen production of Enterobacter aerogenes from various nitrogen sources.

도 7은 배양과정에서 환원제(L-cystein)의 효과를 나타낸다.Figure 7 shows the effect of the reducing agent (L-cystein) in the culture process.

도 8과 9는 수소생산 공정에서 생산된 유기산의 생성·소비 패턴 및 전체 생산된 유기산을 나타낸다.8 and 9 show the production and consumption patterns of organic acids produced in the hydrogen production process and the total organic acids produced.

도 10은 배지에서 각 균주들의 단독배양 및 혼합배양에 의한 누적 수소생산량을 나타낸다.Figure 10 shows the cumulative hydrogen production by the single culture and mixed culture of each strain in the medium.

도 11은 배지에서 각 균주들의 단독배양 및 혼합배양에 의한 수소생산 속도를 나타낸다.Figure 11 shows the hydrogen production rate by monoculture and mixed culture of each strain in the medium.

도 12는 배지에서 각 균주들의 단독배양 및 혼합배양에 의한 pH 변화를 나타 낸다.Figure 12 shows the pH change by the single culture and mixed culture of each strain in the medium.

도 13은 수소생산 배지에 두 균주를 농도비 1:1의 비율로 동시 접종한 결과이다.FIG. 13 shows the result of simultaneous inoculation of two strains in a hydrogen production medium at a ratio of 1: 1.

도 14는 그람 염색법을 설명하는 개념도이다.It is a conceptual diagram explaining the Gram staining method.

도 15는 혼합 균주의 배양에서 접종 후 6, 12, 18, 24 시간 경과 된 시점에서의 균주 성장 패턴을 나타낸다.Figure 15 shows strain growth patterns at 6, 12, 18 and 24 hours after inoculation in culture of mixed strains.

도 16은 수소생산 배지에 Clostridium butyricum과 Enterobacter aerogenes를 단계적으로 접종하여 혼합배양 한 결과를 나타낸다.Figure 16 shows the results of the mixed culture by inoculating Clostridium butyricum and Enterobacter aerogenes step by step in the hydrogen production medium.

Claims (12)

수소생성능이 있는 절대 혐기성 균주를 먼저 배지를 포함하는 반응기에 접종하여 배양하고, 12-36시간 경과 후 수소생성능이 있는 통성 혐기성 균주를 상기 반응기에 접종하여 혼합배양하는 것을 특징으로 수소가스 생산방법.Hydrogen gas production method characterized in that by inoculating the absolute anaerobic strain with hydrogen-producing first in the reactor containing the medium, and incubating mixed culture by inoculating the anaerobic strain with hydrogen production in the reactor after 12-36 hours. 제 1항에 있어서, 상기 절대 혐기성 균주는 두 균주의 동시배양시 비우점종이고, 통성 혐기성 균주는 두 균주의 동시배양시 우점종인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the absolute anaerobic strain is non-dominant species when co-culturing two strains, and the anaerobic strain is predominant species when co-culturing two strains. 제 1항에 있어서, 상기 배지를 포함하는 반응기는 균주들의 고정화를 위한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the reactor comprising the medium comprises a carrier for immobilization of strains. 제 3항에 있어서, 상기 담체의 재질은 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 3, wherein the carrier is made of polyvinyl alcohol. 제 1항에 있어서, 상기 절대 혐기성 균주는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)이고, 통성 혐기성 균주는 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes)인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the absolute anaerobic strain is Clostridium butyricum , and the anaerobic strain is Enterobacter aerogenes . 제 5항에 있어서, 상기 클로스트리디움 부티리쿰에 대한 엔테로박터 에어로제네스의 균수 접종비율은 0.1 내지 10인 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 5, wherein the bacterial inoculation ratio of Enterobacter aerogenes to Clostridium butyricum is 0.1 to 10. 제 1항에 있어서, 상기 배지는 탄소원 20-40 g/L, 질소원 1-10 g/L, K2HPO4 10-20 g/L, KH2PO4 1-10 g/L, Na3C6H5O7·2H2O 0.1-2.0 g/L, (NH4)2SO4 0.5-3.0 g/L 및 미량원소(trace element)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.According to claim 1, wherein the medium is 20-40 g / L carbon source, 1-10 g / L nitrogen source, K 2 HPO 4 10-20 g / L, KH 2 PO 4 1-10 g / L, Na 3 C 6 H 5 O 7 .2H 2 O 0.1-2.0 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 0.5-3.0 g / L and a trace element. 제 7항에 있어서, 상기 탄소원은 글루코오스(glucose) 또는 수크로오스(sucrose), 질소원은 요소(urea), 맥아추출물(malt extract), 효모추출물(yeast extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 7, wherein the carbon source is glucose (glucose) or sucrose (sucrose), the nitrogen source is urea (urea), malt extract (malt extract), yeast extract (yeast extract), peptone (tryptone) At least one selected from the group consisting of. 삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 혼합균주의 배양은 pH 5-7, 온도 35-40℃, 및 100-200 rpm으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the culture of the mixed strain is carried out at pH 5-7, temperature 35-40 ℃, and 100-200 rpm. 삭제delete 삭제delete
KR1020080008725A 2008-01-28 2008-01-28 Method for hydrogen production by sequential culture of anaerobes KR100913822B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080008725A KR100913822B1 (en) 2008-01-28 2008-01-28 Method for hydrogen production by sequential culture of anaerobes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080008725A KR100913822B1 (en) 2008-01-28 2008-01-28 Method for hydrogen production by sequential culture of anaerobes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090082779A KR20090082779A (en) 2009-07-31
KR100913822B1 true KR100913822B1 (en) 2009-08-26

Family

ID=41294027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080008725A KR100913822B1 (en) 2008-01-28 2008-01-28 Method for hydrogen production by sequential culture of anaerobes

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100913822B1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101173468B1 (en) 2010-08-17 2012-08-13 동의대학교 산학협력단 Enterobacter sp?ES392 KACC 91568P and method of producing hydrogen by using the same

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101824437A (en) * 2010-03-02 2010-09-08 东南大学 Method for producing hydrogen by utilizing facultative anaerobe fermentation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Yokoi,H., et al., H2 Production from starch by a mixed cultrue of Clostridium butyricum and Enterobacter aeroenes, Biotechnol. Lett., 20, 143-147, 1998

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101173468B1 (en) 2010-08-17 2012-08-13 동의대학교 산학협력단 Enterobacter sp?ES392 KACC 91568P and method of producing hydrogen by using the same

Also Published As

Publication number Publication date
KR20090082779A (en) 2009-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Bioethanol production from sweet potato by co-immobilization of saccharolytic molds and Saccharomyces cerevisiae
Mountfort et al. Effect of inorganic sulfide on the growth and metabolism of Methanosarcina barkeri strain DM
CN109913523B (en) Culture medium for screening nitrogen source suitable for proliferation of bifidobacteria
JP6329176B2 (en) Rhodococcus aetherivorans VKMac-2610D strain producing nitrile hydratase, its culture method and method for producing acrylamide
Harun et al. Hydrogen production performance by Enterobacter cloacae KBH3 isolated from termite guts
Xin et al. Methanol production from CO2 by resting cells of the methanotrophic bacterium Methylosinus trichosporium IMV 3011
Xu et al. Effect of co-cultivation of Chlamydomonas reinhardtii with Azotobacter chroococcum on hydrogen production
CN106554931B (en) Carboxylic acid bacterium bailii and application thereof
CN114276948B (en) Lysine bacillus for producing caproic acid and application thereof
CN112852678B (en) Enterobacter gondii for producing nicotinamide mononucleotide and application thereof
Berndt et al. Identification and physiological characterization of the nitrogen fixing bacterium Corynebacterium autotrophicum GZ 29
CN104630166A (en) Method for producing low-temperature glucose oxidase by virtue of microbial fermentation
CN101988075B (en) Method for preparing hydrogen by fermentation through using special anaerobic clostridium pasteurianum
KR100913822B1 (en) Method for hydrogen production by sequential culture of anaerobes
CN103937691A (en) Aspergillus oryzae strain capable of producing beta-fructofuranosidase, as well as culture method and application thereof
CN110747149B (en) Salt-tolerant methanogenic archaea and application thereof
Zhao et al. Hydrogen production characteristics from dark fermentation of maltose by an isolated strain FP 01
Lu et al. Synergistic effect of Candida maltosa HY-35 and Enterobacter aerogenes W-23 on hydrogen production
CN114196546A (en) Application of DCMU (dendritic cell activator-responsive unit) in stabilizing microalgae polyculture growth pH (potential of hydrogen) or improving microalgae polyculture growth speed
CN109811013B (en) Application of Rhodococcus pyridinivorans in methane production through anaerobic fermentation
CN109251869B (en) Klebsiella for efficiently producing 1, 3-propylene glycol by using crude glycerol
CN102676483A (en) Method for producing protease through one-bacterium multi-enzyme strain
CN105018410A (en) Method for inducing Blakeslea trispora aging strain to rapidly produce a large number of spores
CN105296407A (en) Method for culturing avibacterium paragallinarum bacterial solution
Nanninga et al. Major differences between glutamate-fermenting species isolated from chemostat enrichments at different dilution rates

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120615

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130621

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee