KR100905035B1 - 목초액 추출물로부터 분리한 페놀성 화합물을 유효성분으로함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 목초액(wood vineger) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 목초액 추출물 또는 이로부터 분리한 페놀성 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 가지며 피부에 적용한 경우 뛰어난 피부 미백 효능을 발휘한다.

목초액, 추출물, 페놀성 화합물, 멜라닌, 피부미백

Description

목초액 추출물로부터 분리한 페놀성 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물{Cosmetic Composition for Skin Whitening Comprising Phenolic Compounds isolated from Wood Veneger Extract as Active Ingredient}

도 1은 멜라노좀(melanosome)에서의 멜라닌(melanin)의 합성과정을 보여주는 모식도이다.

도 2는 목초액으로부터 화합물 1-4의 추출 및 분리 과정을 보여주는 도면이다.

도 3a는 화합물 1의 Negative LC MS 스펙트럼, 도 3b는 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼, 도 3c는 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 4a는 화합물 2의 Negative LC MS 스펙트럼, 도 4b는 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼, 도 4c는 화합물 2의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 5a는 화합물 3의 Negative LC MS 스펙트럼, 도 5b는 화합물 3의 ¹H-NMR 스펙트럼, 도 5c는 화합물 3의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 6a는 화합물 4의 Negative LC MS 스펙트럼, 도 6b는 화합물 4의 ¹H-NMR 스펙트럼, 도 6c는 화합물 4의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 7은 버섯 티로시나아제 활성에 대한 목초액, 에테르 추출물, H₂O 층의 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 8은 버섯 티로시나아제 활성에 대한 화합물 1-4의 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 9는 B16F10 멜라노마 세포의 생존력에 대한 화합물 1-4의 효과를 보여주는 그래프이다. 세포의 생존력은 MTT 분석법에 의해 측정하였다. 결과들은 대조군 흡광도에 대한 ％로서 표현하였고 데이터는 적어도 3번의 실험에 대한 평균± 표준편차로 나타내었다.

도 10은 B16F10 멜라노마 세포에서 티로시나아제 활성에 대한 화합물 1-4의 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 티로시나아제 활성은 405nm에서 측정하였다. 결과들은 대조군 흡광도에 대한 ％로서 표현하였다.

도 11은 B16F10 멜라노마 세포에서 멜라닌 합성에 대한 화합물 1-4의 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 멜라닌 함량은 405nm에서 측정하였다. 결과들은 대조군 흡광도에 대한 ％로서 표현하였다.

도 12는 B16F10 멜라노마 세포에서 100nM α-MSH의 존재하에서 티로시나아제 활성에 대한 화합물 1-4의 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 티로시나아제 활성은 405nm에서 측정하였다. 결과들은 대조군 흡광도에 대한 ％로서 표현하였다.

도 13는 B16F10 멜라노마 세포에서 100nM α-MSH의 존재하에서 멜라닌 합성에 대한 화합물 1-4의 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 멜라닌 함량은 405nm에서 측정하였다. 결과들은 대조군 흡광도에 대한 ％로서 표현하였다.

본 발명은 목초액(wood vineger) 추출물 또는 목초액 추출물로부터 분리한 페놀성 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

목초액(wood vineger)은 초산을 주성분으로 하는 pH 3 정도의 산성액체로 식초와 성분과 색조도 비슷하나 만들어지는 과정은 전혀 다르다. 식초는 탄수화물을 효소분해하여 만들지만 목초액은 원목의 성분을 숯가마와 같이 공기가 차단된 상태에서 열을 가하여 생산된다. 목초액의 원료가 되는 원목의 주성분은 탄수화물인 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스와 탄화수소인 리그닌이며 숯가마에 불을 붙여 가마의 온도가 올라가기 시작하면 이들 성분의 열분해가 시작되어 약 200-300℃에서 셀룰로오스, 약 300-400℃에서 리그닌이 차례로 탄화된다(1).

이 과정을 연기의 상태로 보면, 처음에는 수증기가 많은 촉촉한 연기가 피어오르고, 온도가 상승하여 헤미셀룰로오스 성분이 탄화되면 탄내가 나면서 코를 자 극하는 연기로 변하게 되는데, 이 연기를 황벽연(黃蘗煙)이라 한다. 이 황벽연은 가마 안의 탄재가 탄화를 시작했다는 신호이며, 이 단계에서 작은 통기구만을 남기고 가마 입구를 폐쇄하면 온도는 더욱 상승하여 리그닌의 열분해가 시작된다. 목초액은 이와 같이 숯 연기가 자연적으로 냉각되어 액상으로 된 것을 회수하는 것이므로 채취할 때의 연기 종류에 따라 그 성분과 성상에 큰 차이가 있으며, 목초액은 황벽연으로부터 채취한 것이 제일 유용하고 독성 물질이 적은 것으로 알려져 있다. 황벽연의 온도는 약 80-150℃인데, 일본목초액협회에서도 표준목초액의 규격을 채취온도 80-150℃로 하고 있다(1, 2).

구미지역에서는 오래전부터 목초액을 항균, 살균, 보존성 향상, 가공식품의 향취개선 등의 목적으로 사용하여 왔으며(3-5), 일본에서는 농업 및 환경정화 분야에서 목초액의 활용성에 관한 연구가 수행되어 현재까지 토양살균, 축산분뇨의 탈취, 작물의 해충기피, 퇴비 발효촉진, 색물생장 및 뿌리 생육 촉진효과를 지니고 있음이 밝혀졌다(6-8).

목초액의 성분에 관한 연구로는 1972년 일본삼림총합연구소 생물활성물질 연구실(6)에서는 흑탄가마 목초액에서 유기산으로 포름 산, 부티르 산, 발레르 산, 크로톤 산 등을, 페놀성분으로 페놀, 크레졸, 피로갈롤, 2,4-크실레놀, 3-디메틸 에테르 등을, 카르보닐 성분으로 포름알데히드, 아세트알데히드, 이소발레르알데히드 등을, 알코올 성분으로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 알릴알코올 등을, 중성 성분으로 레보글루코산(levoglucosan), 3,4-벤즈피렌, 아세톨 등을, 염기성 성분으로 암모니아, 메틸아민, 피리딘 등을 분리 보고하였고, 2001년 김(9) 등이 국내에서 농업용으로 시판되고 있는 목초액의 산성분획에서 아세트산, 프로피온산, n-부티르산 등을, 페놀성 분획에서 guaiacol(2-methoxyphenol), 4-methylguiacol, 페놀, ρ-크레졸, m-크레졸 등을, 중성분획으로부터 2-푸르푸랄, 3-메틸-2-시클로펜텐-1-온 등을 분리하였고, 2002년 문(10) 등은 졸참나무 Quercus serrata, 맹종죽 Phyllostachys pubescens, 소나무 Pinus densiflora로부터 제조한 미정제 초액에서 휘발성 성분으로 아세트산, 2-부타논, 페놀 등을 분리하였다. 2005년 정(11) 등은 목초액으로부터 3-메틸-2-시클로펜텐-1-온, 1-(2,4,6-트리히드록시)-2-펜타논, 2(5H)-푸란논, 2,6-디메톡시페놀(시린졸), 피로카테콜 등을 분리 보고하였다.

목초액의 생리 활성에 관한 연구로서는 1978년 Kishimoto(12) 는 목초액의 살균효과에 대해 보고하였고, 1975년 Tamura(13)는 사염화탄소를 주입하여 간염을 유발한 쥐에게 목초액을 투여한 결과 간기능이 정상으로 돌아왔으며 사망 확률이 현저하게 떨어지는 것을 보고하였고, 1977년 Nasata(14)는 간실질성 황달을 보이는 환자들에게 목초액을 투여한 결과 빌리루빈과 GOT, GPT 등의 수치가 적절하게 떨어졌음을 보고하였다. 2000년 서(15) 등은 참나무 목초액의 항균효과에 대하여 보고하였으며, 2004년 박(16) 등은 목초액의 항균 및 DPPH 라디칼 소거 활성에 대하여 보고하였다.

한편, 미백활성 실험에서 타겟이 되는 멜라닌은 동물, 식물, 미생물에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 물질로 이것의 생성은 피부에 기미, 주근깨, 검버섯을 형성하며 피부노화도 촉진 시키는 것으로 알려져 있다. 멜라닌은 표피 기저층의 멜 라노사이트 세포내 멜라노좀에서 티로시나아제(tyrosinase) 효소의 연속적 산화반응으로 합성되어 진다. 티로시나아제는 구리를 함유한 멜라닌 생합성 과정의 주요 효소이며 멜라닌 합성의 출발 물질은 아미노산의 일종인 티로신이다. 티로신이 티로시나아제에 의해 L-3,4-dihydroxyl-L-phenyl alanine(L-DOPA)으로, 이것이 다시 DOPAquinone으로 산화되고 다시 DOPAquinone이 DOPAchrome, 5,6-dihydroxyindole, indole 5,6-quinone이 되어 중합에 의해 최종적으로 멜라닌이 합성된다(17 , 18)(도 1 참조). 이렇게 티로시나아제는 티로신을 산화시켜 DOPA를 만드는 티로신 히드록실라아제(tyrosine hydroxylase)로, DOPA를 산화시켜 DOPAquinone을 만드는 DOPA 옥시다아제로 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요 효소로 작용한다(19). 따라서 티로시나아제 활성억제 실험은 유용한 평가법으로 인정되고 있는데 이 티로시나아제 활성억제 실험은 티로신 히드록실라아제 억제실험법과 DOPA 옥시다아제 억제 실험법, 종합적인 멜라닌 합성 억제 실험법으로 구별되며, 티로신 히드록실라아제 억제 실험법과 멜라닌 합성억제 실험법은 방사성 동위원소를 사용하기에 실제로는 DOPA를 기질로하여 생성되는 DOPAchrome의 양을 측정하는 DOPA 옥시다아제 억제실험법이 많이 사용된다(20). 지금까지 알려진 티로시나아제 억제제로는 히드록시퀴논(hydroquinone), 레조르시놀(resorcinol), 4-히드록시아니솔(4-hydroxyanisole), 아스코르브산(ascorbic acid)와 그 유도체, 코직산(kojic acid, 누룩곰팡이의 2차대사물질)와 그 유도체, azelaic acid, arbutin(우바우르시잎), 글루코사민(glucosamin), oxyresveratrol(상백피), α-viniferin, ferulic acid 등이 있으나 피부 안전성, 제형안정성 등의 문제로 인해 arbutin과 코직산이 미백제 의 첨가제로 제한된 양만 사용되고 있다(21, 22). 또한, 천연 미백제 개발을 위해 최근까지 다양한 식물들이 연구되어 왔는데 그 중 티로시나아제 저해 활성이 있는 것으로 알려진 것으로는 상백피(23), 오배자(24), 감초(25), 녹차(26), 석이(27), 치자 열매(28) 등이 보고 되고 있으며 일부는 제품에 사용되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 여러 가지 천연물 중에서 보다 개선된 피부 미백작용을 갖는 유효성분을 추출하고자 연구 노력한 결과 목초액(wood vineger)추출물, 특히 목초액 추출물로부터 분리한 페놀성 화합물이 매우 우수한 피부 미백활성을 갖는다는 것을 실험적으로 확인 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 목초액 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 목초액 추출물로부터 분리한 페놀성 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 목초액(wood vineger) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 여러 가지 천연물로부터 보다 개선된 피부 미백작용을 갖는 유효성분을 추출하고자 연구 노력한 결과 목초액 추출물이 매우 우수한 피부 미백활성을 갖는다는 것을 실험적으로 확인 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 명세서에서 “목초액”이란 나무로 숯을 만드는 과정에서 나오는 연기를 액화시켜 채취한 뒤, 이를 숙성시켜 독성과 유해물질을 제거한 것을 의미한다. 즉, 원목의 성분을 숯가마와 같이 공기가 차단된 상태에서 열을 가하여 얻은 액체성분을 말한다. 목초액의 원료가 되는 원목의 주성분은 탄수화물인 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스와 탄화수소인 리그닌이다. 숯가마에 불을 붙여 가마의 온도가 올라가기 시작하면 이들 성분의 열분해가 시작되어 약 200-300℃에서 셀룰로오스, 약 300-400℃에서 리그닌이 차례로 탄화된다. 이 과정을 연기의 상태로 보면, 처음에는 수증기가 많은 촉촉한 연기가 피어오르고, 온도가 상승하여 헤미셀룰로오스 성분이 탄화되면 탄내가 나면서 코를 자극하는 연기로 변하게 되는데, 이 연기를 황벽연(黃蘗煙)이라 한다. 이 황벽연은 가마 안의 탄재가 탄화를 시작했다는 신호 이며, 이 단계에서 작은 통기구만을 남기고 가마 입구를 폐쇄하면 온도는 더욱 상승하여 리그닌의 열분해가 시작된다. 목초액은 이와 같이 숯 연기가 자연적으로 냉각되어 액상으로 된 것을 회수하는 것이므로 채취할 때의 연기 종류에 따라 그 성분과 성상에 큰 차이가 있으며, 목초액은 황벽연으로부터 채취한 것이 제일 유용하고 독성 물질이 적은 것으로 알려져 있다. 황벽연의 온도는 약 80-150℃인데, 일본목초액협회에서도 표준목초액의 규격을 채취온도 80-150℃로 하고 있다.

본 발명의 명세서에서 “목초액 추출물”이란 상기 목초액으로부터 적합한 용매를 사용하여 추출하여 얻는 물질을 의미한다.

본 발명의 조성물에서의 유효성분인 목초액 추출물을 분리하는 방법은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 존건하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.

본 발명의 조성물에서의 목초액을 추출하기 위한 추출 용매로는 화장료에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 에테르이며, 가장 바람직하게는 디에틸에테르이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 상기 목초액 추출물은 목초액의 에테르 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 상기 목초액 추출물로부터 미백활성 물질을 규명하기 위해 활성 가이드 분리법(activity guided isolation)을 실시하여 목초액 추출물 중에서 특정 페놀성 화합물이 미백효능이 있음을 밝혀내었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 목초액 추출물로부터 분리한 페놀성 화합물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 명세서에서 상기 목초액 추출물로부터 분리한 “페놀성 화합물”은 목초액 추출물중에 포함된 페놀성 화합물 및 이의 유도체를 의미한다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 상기 페놀성 화합물은 상술한 목초액의 추출물을 통상적인 정제 과정을 수행하여 분리한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 분리한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 페놀성 화합물이 히드로퀴논(hydroquinone, 화합물 1), 프탈산(phthalic acid, 화합물 2), 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol, 화합물 3) 및 2-메톡시히드로퀴논(2-methoxyhydroquinone, 화합물 4)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서의 화합물 1은 히드로퀴논(hydroquinone)으로서 다음의 화학식으로 표시된다.

(화합물 1)

본 발명의 조성물에서의 화합물 2는 프탈산(phthalic acid)으로서 다음의 화학식으로 표시된다.

(화합물 2)

본 발명의 조성물에서의 화합물 3은 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol)으로서 다음의 화학식으로 표시된다.

(화합물 3)

본 발명의 조성물에서의 화합물 4은 2-메톡시히드로퀴논(2-methoxyhydroquinone)으로서 다음의 화학식으로 표시된다.

(화합물 4)

본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 목초 추출물 또는 상기 페놀성 화합물 이외에 다른 미백 성분을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 화장료 조성물은 목초 추출물 또는 상기 페놀성 화합물만으로 구성된 유효 성분만으로도 매우 우수한 미백 효과를 나타낸다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수 (스킨), 영양 화장수 (밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

Ⅰ. 추출물질의 분리

1. 실험재료

본 실험에서 사용한 목초액 (wood vineger)은 2005년 6월 경기도 가평군‘유명산 참숯고을’에서 생산, 판매하고 있는 것을 제공받아 사용하였다.

2. 기기 및 시약

¹H-NMR spectrometer: Varian Gemini 2000, 300MHz (Palo Alto, CA, USA) Internal standard: TMS,

¹³C-NMR spectrometer: Varian Gemini 2000, 75MHz (Palo Alto, CA, USA), Internal standard : TMS,

TLC Adsorbent: Kieselgel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Germany)

TLC Solvent(v/v): CHCl3 : MeOH = 10 : 1

CHCl3 : MeOH = 100 : 1

TLC Detection: Ethanolic-FeCl₃ solution,

10％-H₂SO₄ in ethanol (heating),

UV-lamp (254㎚)

Gels: Sephadex LH-20 (25-100㎛, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)

MCI gel CHP20P (75-150μ. Mitsubishi, Tokyo, Japan)

Silica gel 60 (0.040-0.063 mm, Merck, Darmstadt, Germany)

High pressure liquid chromatography: Waters 600 (Milford, Massachusetts, USA)

3. 추출 및 성분 분리

목초액 20L를 디에틸에테르로 separatory funnel을 이용하여 실온에서 추출하였다. 그 추출액을 감압 농축한 후 H₂O에 현탁하여 여과한 후 MCI-gel CHP 20P 컬럼크로마토그래피를 이용하여 용매는 물에서부터 메탄올을 10％씩 올려 100％까지 농도를 높였으며 TLC 방법으로 확인하여 총 5개의 분획 (Fr. 1, Fr. 2, Fr. 3, Fr. 4, Fr. 5)으로 나누었다. Fr. 1에 대해서는 Sephadex LH-20(H₂O→100% MeOH, gradient system)과 MCI-gel CHP 20P 컬럼 크로마토그래피(H₂O→10% MeOH, gradient system)를 실시하여 화합물 1(compound 1, 73 mg)과 화합물 2(compound 2, 150mg)를 얻었다. Fr. 3에 대해서는 Sephadex LH-20(20→60% MeOH, gradient system)와 High pressure liquid chromatography (20% MeOH)를 실시하여 화합물 4(compound 4, 45 mg)를 얻었다. Fr. 4에 대해서는 실리카겔 컬럼 크로마토그래프 (CHCl₃ : MeOH = 100 : 1)를 실시하여 화합물 3(compound 3, 5.25g)을 얻었다(도 2 참조).

분리한 화합물 1-4에 대한 분석자료는 다음과 같다.

(1) 화합물 1

백색 무정형 분말

Negative LC MS : m/z 107.8 [M+H]+

1H-NMR (300MHz, MeOH-d4+D2O) : δ 6.64 (4H, s, H-2, 3, 5, 6)

13C-NMR (75MHz, MeOH-d4) : δ 116.4 (C-2, 3, 5, 6), 150.9 (C-1, 4)

(2) 화합물 2

갈색 무정형 분말

Negative LC MS : m/z 164.8 [M-H]-

1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) : δ 6.56-6.60 (2H in total, m, H-3, 4), 6.71-6.75 (2H in total, m, H-2, 5)

13C-NMR (75MHz, DMSO-d6) : δ 127.6 (C-3, 4), 129.3 (C-2, 5), 133.2 (C-1, 6), 167.5(-2COOH)

(3) 화합물 3

노란색 무정형 분말

EI MS : m/z 154 [M]+

1H-NMR (300MHz, Me2CO-d6+D2O) : δ 3.80 (6H, s, 2CH3-), 6.62 (2H, d, J=7.2 Hz, H-3, 5), 6.74(1H, d, J=7.2 Hz, H-4)

13C-NMR (75MHz, Me2CO-d6) : δ 56.6 (-2OCH3), 106.7 (C-3, 5), 119.4 (C-4), 137.3(C-1), 149.2(C-2, 6)

(4) 화합물 4

흑색 무정형 분말

Negative LC MS : m/z 134.1 [M+H]+

1H-NMR (300MHz, MeOH-d4) : δ 3.80 (3H, s, CH3-), 6.43 (1H, d, J=1.5Hz, H-3), 6.46 (1H, dd, J=8.1, 1.5Hz, H-5), 6.59-6.61 (1H, d, J=8.1Hz, H-6)

13C-NMR (75MHz, MeOH-d4) : δ 56.5(-OCH3), 104.6(C-3), 110.1(C-5), 120.1(C-6), 135.4(C-1), 146.9(C-2), 150.0(C-4)

Ⅱ. 생리활성 실험

1. 시약 및 기기

본 발명의 생리활성 실험에 사용한 시약 및 기기는 다음과 같다.

DMSO (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.), FBS (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.), MTT (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.), Penicillin-Streptomycin (Gibco BRL, Grand island, NY, U.S.A.), MEM (Gibco BRL, Grand island, NY, U.S.A.), Trypsin-EDTA (Gibco BRL, Grand island, NY, U.S.A.), Tyrosinase (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.), L-DOPA (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.), α-MSH (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.), Melanin (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.), Arbutin (Merck, Darmstadt, Germany), Centrifuge (Hanil SME Co,Siheung, Korea), CO2 incubator (Sanyo, Moriguchi, Osaka, Japan), Microscope (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan), ELISA reader (Tecan, Untersbergstrasse, Austria), Water Bath (Sunil Eyela Co., Sungnam, Korea)

이외 실험 중 사용한 버퍼 및 시약들은 시판되는 1급 또는 특급 시약으로 직접 조제하였다.

2. 티로시나아제 억제 분석

티로시나아제 저해활성 측정은 L-DOPA 옥시다아제의 방법(29)을 변형시켜 시행하였다. L-DOPA 옥시다아제의 활성측정은 L-DOPA를 기질로 하여 티로시나아제에 의하여 생성되는 반응산물인 붉은 색의 DOPAchrome이 흡광을 나타내는 점을 이용한 다. 즉 일정한 반응조건에서 생성된 dopachrome의 양을 흡광도 492 nm로 정량하여 티로시나아제의 활성을 측정하며 시료의 첨가에 의한 활성도의 변화를 관찰하여 효소저해 정도를 평가하였다. 96 웰 플레이트를 사용하여 반응군은 1/15M 소디엄 포스페이트 버퍼 (pH 6.8) 50μL, 2mg/mL L-DOPA 25μL, 200unit 티로시나아제 25μL와 각 화합물를 농도별(2.5, 5, 10, 20μG/mL)로 50μL를 혼합하고 대조군에는 화합물 대신 용매를 50μL 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 얼음 용기 내에서 효소의 반응을 정지시키고 ELISA 리더를 이용하여 492 nm에서 대조군, 반응군, 블랭크(blank)의 흡광도를 측정하여 다음 식으로 저해율을 구하였다.

3. B16 멜라노마 세포( melanoma cell ) 배양

B16F10 멜라노마 세포의 배지는 10％ FBS (fetal bovine serum), 페니실린G(100IU/ml), 스트렙토마이신(100 ug/ml)을 포함한 MEM 배지를 사용하였으며, 온도 37℃, 5％의 CO₂를 유지하면서 인큐베이터에서 배양하였다.

4. MTT 분석

본 실험에서 B16F10 멜라노마 세포에 대한 화합물들의 처리농도를 결정하기 위해 MTT 분석을 사용하였는데, 이 정량법은 Mosmann의 방법(30)을 변형하여 실시하였다. 이 분석법은 노란색의 수용성 기질인 MTT (3-(4,5-di methylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)를 진청색의 비수용성인 포르마잔 물질로 변화시키는 살아있는 세포의 미토콘드리아 디히드로게나아제의 능력을 이용한 방법이다. 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포 수에 비례한다.

5. B16F10 멜라노마 세포내의 티로시나아제 활성도 및 멜라닌 생성량 측정(31)

(1) 티로시나아제 활성도 측정

세포를 배양하여 96 웰 플레이트에 각 웰 당 세포를 1×10⁵ 개씩 넣고 각각의 화합물을 처리한 후 48시간 배양하였다. 48시간 배양한 후 각 웰의 세포를 10 mM PBS로 세척하였으며, Triton X-100 1%를 함유한 10mM PBS 100μL에 현탁시켰다. 현탁된 이 액을 볼텍싱(vortexing)한 후 원심분리하여 상징액을 효소액으로 사용하였다.

96 웰 플레이트에 이 효소액을 40μL 넣고 기질인 L-DOPA (2mG/mL) 100μL를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응을 진행시킨 뒤, ELISA 리더를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나아제의 활성도는 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다.

(2) 멜라닌 생성량 측정

세포를 배양하여 96 웰 플레이트에 각 웰 당 세포를 1× 10⁵ 개씩 넣고 각각의 화합물들을 처리한 후 48시간 배양하였다. 48시간 배양한 후 각 웰의 세포를 PBS로 세척한 후 0.2M NaOH 용액 100μL를 첨가하고 60℃에서 1시간 동안 용해하였으며, ELISA 리더를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌을 사용하여 작성된 표준 직선에서 구하고, 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌양에 대한 백분율로 계산하였다.

6. α- MSH 에 의한 티로시나아제 활성 및 과생성 멜라닌에 미치는 영향

외부자극에 따른 B16F10 멜라노마 세포내 티로시나아제의 활성 및 과생성멜라닌에 각 화합물들이 어떤 영향을 미치는지를 알아보기 위해 외부자극제로 α-MSH를 사용하였다. 약물농도는 100nM로 정하고 티로시나아제 활성도와 과생성멜라닌의 생성량 측정은 상기 항목 5.의 방법을 그대로 이용하였으며, 농도별로 조제한 각 화합물과 외부자극제를 세포에 처리한 후 티로시나아제 활성도 및 과생성 멜라닌량을 측정함으로써 외부자극에 따른 멜라닌화에 대한 화합물들의 영향을 알아보았다.

실험결과

Ⅰ. 화합물 1-4의 구조 동정

1. 화합물 1

화합물 1은 흰색 무정형 분말이며 TLC상에서 UV 램프 254nm 파장에서 소광에 의한 스폿을 나타내었고, FeCl₃ 분무에 의해서 양성으로, 10% H₂SO₄을 분무하고 가열했을때 주황색으로 발색한다. Negative LC-MS 스펙트럼에서 m/z 107.8의 [M-H]- 의 피크를 관찰할 수 있었다(도 3a 참조).

¹H-NMR 스펙트럼에서는 δ6.64 (4H, s)에서 A4 타입의 aromatic proton signal이 나타났다(도 3b 참조).

¹³C-NMR 스펙트럼에서도 δ116.4에서 나타난 A4 타입의 aromatic carbon signal과 δ150.9 피크로 보아 1은 1,4-benzenediol (hydroquinone)으로 추정되었다(도 3c 참조).

이상의 기기분석 결과를 문헌과 비교, 일치함을 확인하여 화합물 1을 히드로퀴논(hydroquinone)으로 최종 확인, 동정하였다(32).

2. 화합물 2

화합물 2는 갈색 무정형 분말이며 TLC상에서 UV 램프 254nm 파장에서 소광에 의한 스폿을 나타내었고, FeCl₃ 분무에 의해서 양성으로, 10% H₂SO₄을 분무하고 가열했을때 옅은 청색으로 발색한다. Negative LC-MS 스펙트럼에서 m/z 164.8의 [M-H]-의 피크를 관찰할 수 있었다(도 4a 참조).

₁H-NMR 스펙트럼의 δ 6.56-6.60 (2H in total, m)와 δ 6.71-6.75 (2H in total, m)에서 A2B2 type의 aromatic proton signal이 나타났다(도 4b 참조).

₁₃C-NMR 스펙트럼에서도 δ 127.6, δ 129.3 로부터 A2B2 type의 aromatic carbon signal과 δ 133.2 의 aromatic carbon signal과 δ 167.5에서 -COOH의 피크를 통 해 2를 1,2-benzenedicarboxylic acid(phthalic acid)로 추정하였다(도 4c 참조).

이상의 기기분석 결과를 문헌과 비교, 일치함을 확인하여 화합물 2을 프탈산(phthalic acid)으로 최종 확인, 동정하였다(33).

3. 화합물 3

화합물 3은 노란색 무정형 분말이며 TLC상에서 UV 램프 254nm 파장에서 소광에 의한 스폿을 나타내었고, FeCl₃ 분무에 의해서 양성으로, 10% H₂SO₄을 분무하고 가열했을때 연한 갈색으로 발색한다. EI-MS 스펙트럼에서 m/z 154 [M]+ 피크를 관찰할 수 있었다(도 5a 참조).

₁H-NMR 스펙트럼에서 δ 3.80에서 6H에 해당하는 2개의 O-CH3기에 의한 signal이 singlet으로 나타났으며 δ 6.62(2H, d, J=7.2Hz), 6.74(1H, d, J= 7.2 Hz)로 보아 이들은 aromatic proton으로 파악되었다(도 5b 참조).

₁₃C-NMR 스펙트럼에서는 δ 56.6에서 methoxyl기의 존재를 확인하였고, 그 외 δ 106.7, 119.4, 137.3, 149.2의 피크는 문헌과의 비교를 통해 2,6-di- methoxyphenol과 각각의 signal이 일치함을 확인하였다(도 5c 참조).

이상의 기기분석 결과로부터 화합물 3을 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol)로 최종 확인, 동정하였다(34).

4. 화합물 4

화합물 4는 검은색 무정형 분말로 TLC상에서 UV 램프 254nm 파장에서 소광에 의한 스폿을 나타내었고, FeCl₃ 분무에 의해서 양성으로, 10% H₂SO₄을 분무하고 가열했을때 연한 황색으로 발색한다. Negative LC-MS 스펙트럼에서 m/z 140의 [M-H]-의 피크를 관찰할 수 있었다(도 6a 참조).

¹H-NMR 스펙트럼에서 δ 3.80에서 3H에 해당하는 1개의 O-CH3기에 의한 signal이 singlet으로 나타났으며, δ 6.43-6.46 (2H in total, m), δ 6.59-6.61 (1H, d, J=8.1Hz)을 통해 H-5와 H-6의 meta coupling과 H-5와 H-3의 ortho coupling하고 있는 ABX type의 구조를 확인하였다(도 6b 참조).

¹³C-NMR 스펙트럼에서는 δ 56.5에서 methoxyl기를 확인하였고, 그 외δ 104.6, 110.1, 120.1, 135.4, 146.9, 150.0의 피크는 문헌과의 비교를 통해 2-methoxyhydroquinone과 일치함을 확인하였다(도 6c 참조).

이상의 기기분석 결과로부터 화합물 4를 2-메톡시히드로퀴논(2-methoxyhydroquinone)으로 최종 확인, 동정하였다(35).

Ⅱ. 생리활성 실험

1. 티로시나아제 억제 분석

티로시나아제에 대한 에테르 분획의 직접적인 영향을 알아보기 위해 목초액과 에테르 분획, 물층, 코직산(kojic acid)의 농도를 2.5, 5, 10, 20㎍/mL로 조제한 후 기질인 L-DOPA와 같이 처리하여 티로시나아제 활성 억제율을 알아보았다. 도 7에서와 같이 에테르 분획은 목초액보다는 못하지만 티로시나아제 효소에 대해서는 어느 정도 저해효과를 보였다.

또, 티로시나아제에 대한 화합물들의 직접적인 영향을 알아보기 위해 각 화합물들의 농도를 2.5, 5, 10, 20 ㎍/mL로 조제한 후 기질인 L-DOPA와 같이 처리하여 티로시나아제 활성 억제율을 알아보았다. 도 8에서와 같이 각 화합물들은 티로시나아제 효소에 대해서는 직접적인 저해효과를 보이지 않았다.

2. MTT 분석

각 화합물들이 B16F10 멜라노마 세포의 증식에 어떤 영향을 미치는가를 알아보기 위하여 각 화합물들을 2.5 ㎍/mL에서 20 ㎍/mL까지의 농도별로 처리하고, 48시간 후에 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다. 도 9 에서 보는 바와 같이 각 화합물들에 의한 세포의 생존율은 최고 20㎍/mL처리시에도 유의할만한 변화를 나타내지 않았다. 따라서 이 농도 범위에서 각 화합물들의 독성이 없는 것으로 생각되어 이 농도 범위에서 실험을 실시하였다.

3. B16F10 멜라노마 세포내의 티로시나아제 활성도 및 멜라닌 생성량 측정 결과

각 화합물들이 B16F10 멜라노마 세포의 티로신 활성도 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 밝히기 위하여 각 화합물들을 농도별(2.5, 5, 10, 20㎍/mL)로 처리한 후 티로시나아제 활성도 및 멜라닌 생성량을 측정하였다. 그 결과 포지티브 콘트롤인 arbutin의 결과에는 미치지 못했으나 모든 화합물들이 농도가 증가함에 따라 티 로시나아제 활성도와 멜라닌 생성량을 더 감소시켰다. 따라서 모든 화합물들이 B16F10 멜라노마 세포의 고유 멜라닌화를 어느 정도 억제하는 것으로 판단된다(도 10, 표 1, 도 11, 표 2).

[표 1] B16F10 멜라노마 세포에서 티로시나아제 활성에 대한 각 화합물의 억제 효과

[표 2] B16F10 멜라노마 세포에서 멜라닌 합성에 대한 각 화합물의 억제 효과

4. α- MSH 에 의한 티로시나아제 활성 및 과생성 멜라닌에 미치는 영향

각 화합물들이 B16F10 멜라노마 세포의 고유 멜라닌화 억제에 관여한다는 것을 도 10 및 도 11의 결과를 통하여 알게 되었다. 이를 더욱 분명하게 확인하고 외부자극에 의해 유발된 B16F10 멜라노마 세포의 과색소침착에 각 화합물들이 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 α-MSH를 외부자극제로 사용하였다. α-MSH는 세 포내에 cAMP 레벨을 높여 티로시나아제의 발현 및 활성을 유도하고 결과적으로 멜라닌 생성을 촉진하는 약물로 알려져 있다(31, 36).

따라서 외부자극제와 동시에 각 화합물들을 농도별(2.5, 5, 10 ,20㎍/mL)로 처리한 후, 화합물들이 B16F10 멜라노마 세포의 과멜라닌화에 미치는 영향을 관찰하였다. 그 결과 화합물들은 α-MSH에 의해 유도된 티로시나아제 활성과 과생성멜라닌을 유의성있게 감소시켰다(도 12, 표 3, 도 13, 표 4 참조).

[표 3] B16F10 멜라노마 세포에서 100nM α-MSH의 처리의 존재하에서 티로시나아제에 대한 화합물들의 억제효과

[표 4] B16F10 멜라노마 세포에서 100nM α-MSH의 처리의 존재하에서 멜라닌 함량에 대한 화합물들의 억제효과

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 목초액 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물은 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 가지며 피부에 적용한 경우 뛰어난 피부 미백 효능을 발휘한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (4)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 목초액(wood vineger) 추출물로부터 분리한 프탈산(phthalic acid) 또는 2-메톡시히드로퀴논(2-methoxyhydroquinone)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.

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