KR100460747B1 - 인체포진 바이러스의 프로브, 이를 이용한 인체포진바이러스의 유전형 분석용 키트 및 유전형 분석방법 - Google Patents

인체포진 바이러스의 프로브, 이를 이용한 인체포진바이러스의 유전형 분석용 키트 및 유전형 분석방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100460747B1
KR100460747B1 KR10-2002-0054330A KR20020054330A KR100460747B1 KR 100460747 B1 KR100460747 B1 KR 100460747B1 KR 20020054330 A KR20020054330 A KR 20020054330A KR 100460747 B1 KR100460747 B1 KR 100460747B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
dna
nucleotide sequence
hhv
probe
Prior art date
Application number
KR10-2002-0054330A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20040022800A (ko
Inventor
김정미
이지영
윤성욱
Original Assignee
주식회사 바이오메드랩
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오메드랩 filed Critical 주식회사 바이오메드랩
Priority to KR10-2002-0054330A priority Critical patent/KR100460747B1/ko
Publication of KR20040022800A publication Critical patent/KR20040022800A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100460747B1 publication Critical patent/KR100460747B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 인체포진 바이러스의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩을 사용하여 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석용 키트, 및 상기 프로브 또는 분석키트를 사용하여 인체포진 바이러스의 감염여부를 탐지하고 유전형을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전형 분석방법은 종래에 도말검사나 전자현미경검사에 비해 더 빠르고, 정확하게 실험 결과를 도출해 낼 수 있는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 한번의 실험으로 유전형까지 구분해 낼 수 있다.

Description

인체포진 바이러스의 프로브, 이를 이용한 인체포진 바이러스의 유전형 분석용 키트 및 유전형 분석방법{PROBE FOR DETECTING Human herpesvirus, GENOTYPING KIT AND GENOTYPING METHOD FOR Human herpes virus USING THE SAME}
[기술분야]
본 발명은 성병-관련 인체포진 바이러스 (Human herpesvirus, HHV)을 탐지 또는 유전형 분석키트 및 분석방법, 및 이에 사용되는 프로브 및 DNA 칩에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 DNA 칩을 사용하여 HHV에 속하는 바이러스인 단순포진 바이러스-1 (Herpes Simplex Virus type 1, HSV-1)과 단순포진 바이러스-2 (HSV-2)그리고 인체포진 바이러스-8 (HHV-8)에 감염된 환자의 유전형을 분석하는 유전형 분석키트 및 전기 분석키트를 사용하여 환자의 유전형을 분석함으로써, 인체포진 바이러스의 감염여부를 판별하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
성병 (Sexual Transmitted Diseases, STD)에 관련된 인체포진 바이러스(Human herpesvirus, HHV)로는 단순포진 바이러스-1 (Herpes Simplex Virus type 1, HSV-1)과 HSV-2, 및 HHV-8을 들 수 있다. HSV는 음부포진을 일으키는 원인 바이러스로서 성관계에 의해 감염되며 성기부위에 수포를 형성한다.
HSV에 의한 초기 감염은 성기부위에 수포를 형성한 후 궤양을 형성하거나 무증상 감염을 보인다. 이 후 바이러스가 신경절에 잠복함으로써 평생동안 잠복감염을 유발하게 되며, 신경절에 잠복하는 바이러스가 스트레스 등의 외부 요인에 의하여 활성화되어 성기 부위에 수포와 궤양을 다시 형성하거나 무증상으로 바이러스를 분비함으로써 재발하게 된다.
음부포진의 가장 큰 위험요인은 감염자의 약 80%가 무증상으로 감염 사실을 인식하지 못한 채 불현성 바이러스 유출에 있어 중요한 수직 및 수평 감염의 원인이 되고 있다는 점이다. 전세계적으로 4천5백만명 정도가 감염되어 있으며 1990년대에는 1970년대 말에 비해 약 32%가 증가한 것으로 알려지고 있다. 다른 STD는 점점 감소하는데 비해 음부포진은 점점 증가하는 추세로 STD에서 점점 중요한 위치를 차지하고 있다. 임산부의 산도 혹은 자궁내 HSV 감염시에 유산 혹은 사산의 가능성이 증가됨이 보고된 바 있으며 (Nahmias AJ. et al., Am. J. Obstet Gynecol 1971; 110: 825) 또한 HSV-2는 자궁경부암의 병원체일 가능성이 시사된 바 있다(Adam E. et al.,Cancer1974; 33:147-52).
HHV-8은 1994년 에이즈 환자의 카포시 육종에서 처음 발견되었으며(Chang Y. et al.,Science1994; 266:1865-69), 에이즈 환자의 카포시 육종 조직의 90% 정도에서, 에이즈 무관련 환자의 카포시 육종 조직의 50% 정도에서 검출되어 HHV-8은 카포시 육종의 원인 바이러스로 인식되고 있다. 또한 천포창 (Memar OM. et al.,Arch Dermatol1997; 133:1247-51), Castleman병 (Soulier J. et al.,Blood1995; 86:1276-80), 일차 삼출액 림프종 (primary effusion lymphoma) (Cesarman E. et al.,N Engl J Med1995; 332:1186-91), 유육종증 (Di Alberti L. et al.,Lancet1997; 350: 1655-61), 골수종 (Rettig MB. et al.,Science1997; 276:1851-54), 혈관육종 (Gyulai R. et al.,N Engl J Med1996; 22:540-41), Kikuchi병 (Huh JR. et al,Hum Pathol1998; 29:1091-96), Angiolymphoid hyperplasia with eosinophilia (ALHE)(Gyulai R. et al.,Lancet1996; 347:1837) 등의 질환과의 연관성이 보고되고 있다. 지금까지 동성연애 남성들의 성행위를 통해 전파된다고 알려져 있었으나 이성연애자의 항문 주위에서도 HHV8 DNA가 검출되었으며 (장경애 등, 대한피부과학회지 2000; 38(9):1162-1167), 소아나 코의 분비물, 침 등에서도 HHV-8이 검출된 것을 볼 때 전파에 다른 요인이 작용할 것으로 생각할 수 있다 (Blackbourn DJ. et al.,J Invest Dis1998; 177:213-16). HSV-2와 HHV-8에 감염된 환자는 에이즈에 감수성이 높으며 (Maria C. et al.,J Clin Microbiol1998; 36:848-49, Thomas FS. Et al.,Virus Res2002; 82:115-26), 이들 바이러스는 동성연애자, 직업여성, 다른 성병에 노출되었던 경험이 있던 자에게 감염의 위험이 더욱 높다.
HSV에 의한 음부포진의 진단은 대부분 임상적 특징으로 진단이 가능하였으나 여러 원인에 의해 면역기능이 저하된 환자가 증가하고 있으며 이런 환자에서 비전형적인 임상양상을 보이는 경우가 흔하게 되었다. 따라서 정확한 HSV의 진단을 위해 Tzanck 도말, 병리조직학적 검사, 전자 현미경 검사, 혈청학적 검사, 조직내 바이러스 배양, 면역형광법 및 PCR 등을 시행한다.
Tzanck 도말은 경제적이고, 임상에서 신속한 진단에 도움을 주나 판독하는 사람에 따라 결과가 달라질 수 있고, 위음성도가 비교적 높으며 (Nahass GT. et al.,JAMA1992; 268:2541-44), 병리 조직학적 검사 역시 다른 바이러스 질환과의 구분이 힘들다는 단점이 있다.
전자 현미경 검사로는 판독자의 경험 정도에 따라 민감도와 특이도에 큰 차이가 있으며 감염된 HSV의 type을 구별할 수 없다 (Solomon AR. et al.,J Am Acad Dermatol1988; 18:218-21). 바이러스 배양은 세포병성 효과 (cytopathic effect)를 보려면 배양 후 7일 이후에나 가능하므로 판독이 늦은 단점으로 인하여 환자의 진료에 큰 도움을 주지 못한다.
HSV의 유전형을 구별할 수 있는 검사로는 항체를 이용한 면역형광법 또는 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)등이 있다. 면역형광법은 민감도와 특이도가 비교적 높고 바이러스 형을 구분할 수 있는 장점이 있으나 형광 현미경이 필요하고 조직을 얼리거나 고정해야 하는 단점이 있다 (Solomon AR. et al.,J Am Acad Dermatol1988; 18:218-21). 이에 반해 PCR은 종래의 단점들을 보완하고 매우 높은 특이성과 감수성으로, 빠르고 정확한 결과 도출을 가능하게 하였다. HSV-1과 HSV-2는 임상적 증세나 감염의 경로, 재발율 등의 예후가 각각 다르기 때문에 정확한 진단과 치료를 위해 감염된 HSV형의 감별이 필요하다. 지금까지는임상에서 많은 시간과 경비 소요를 이유로 정확한 감별을 시행하지 않았으나 최근 헤르페스 바이러스의 감염에 대한 새로운 항바이러스 제제의 계속되는 개발로 인해 치료에 효과적인 예민한 약제의 선택이 필요하게 되었다 (De Clercq E. et al.,J Infect Dis1980; 141:563-74). 이에 따라 HSV의 존재뿐만 아니라 유전형을 확인하는 기법들에 관한 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.
따라서, 인체포진 바이러스의 감염여부와 그 유전형을 간단하고, 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라 높은 특이도와 민감도를 갖는 인체포진 바이러스의 진단 방법 및 키트, 이에 사용되는 프로브 및 DNA 칩을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다. 또한, 상기 진단키트, 이에 사용되는 프로브 및 DNA 칩은 STD를 일으키는 HHV의 세가지 유형을 높은 특이도 및 민감도로 분석하여 HHV 감염여부와 유전형을 더욱 정확하게 진단할 수 있어야 한다.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 높은 특이도 및 민감도로 HHV 감염여부와 유전형을 더욱 정확하게 진단하기 위해서, HHV의 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 신규 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 프로브를 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석용 DNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 프로브를 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 프로브를 이용한 인체포진 바이러스의 탐지또는 유전형 분석방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일례에 따른 프라이머를 이용하여 HHV를 증폭한 사진이다.
도 3은 서열번호 23 및 24에 나타난 종래의 프라이머를 이용하여 HHV를 증폭한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일례에 따른 프라이머를 이용하여 HHV DNA를 증폭한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일례에 따른 프라이머를 이용하여 HHV DNA를 증폭한 사진이다.
도 6a는 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩으로 HSV-1 DNA를 분석한 결과이고, 도 6b는 HSV-2 DNA를 분석한 결과이고, 도 6c는 HHV-8 DNA를 분석한 결과이고, 도 6d는 β-글로빈을 분석한 결과를 나타내는 사진으로 HHV가 검출되지 않은 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 나타내는 모식도이다.
도 8a는 HSV-1을 분석한 결과를 나타내는 사진이고 도 8b는 HHV-8을 분석한 결과를 나타내는 사진이고, 도 8c는 β-글로빈을 분석한 결과 사진으로 HHV가 검출되지 않은 결과를 나타낸다.
도 9a, 9b, 9c는 본 발명의 일례에 따른 DNA 칩으로 임상시료를 분석한 결과를 나타내는 것으로서, 도 9a는 HSV-1에 감염된 시료로 분석되었고, 도 9b는 HSV-2에 감염된 시료로 분석되었고, 도 9c는 HHV-8에 감염된 시료로 분석되었고, 도 9d는 HHV가 검출되지 않은 결과를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되며, 인체포진 바이러스의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는, 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석용 DNA 칩에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 상기 인체포진 바이러스의 탐지용 DNA 칩, (b) 인체포진 바이러스의 시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및 (c) 상기 DNA 칩과 하이브리드되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 인체포진 바이러스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트를 포함하는 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 인체포진 바이러스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 인체포진 바이러스의 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트와 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 11의 염기서열 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 인체포진 바이러스 DNA 증폭용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명자들은 간단한 방법으로 환자의 유전형을 분석하여 인체포진 바이러스 (HHV)의 감염여부를 진단하고, 감염된 HHV의 종류를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 확립하고자 연구 노력한 결과, HHV의 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브 및 이를 포함하는 DNA 칩을 개발하였다. 또한, HHV의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 DNA 칩, 시료로부터 채취한 DNA를 PCR방법으로 증폭시키기 위한 프라이머 및 상기 DNA 칩과 하이브리디제이션되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 HHV의 유전형 분석키트를 제작하였고, 전기 분석키트를 사용하여 환자의 시료에서 채취한 DNA의 유전형을 분석함으로써, HHV의 감염여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 HHV의 타입을 판별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
이하에서 본 발명을 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 인체포진 바이러스의 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하는 프로브에 관한 것이며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것이다. 상기 프로브는 인체포진 바이러스의 DNA 또는 RNA와 하이브리드 가능하다.
본 발명은 인체포진 바이러스의 DNA 염기서열, 바람직하게는 HHV의 당단백질 H DNA와 상보적으로 결합하는 염기서열을 프로브로 제공한다. 본 발명의 프로브는 서열목록 서열번호 1 내지 9에 기재된 염기서열을 포함한다. 하기 표 1중 서열번호 3, 6에서 서열중 진하게 밑줄 그어 부분은 프로브 기능을 위해 적합한 형태를 제공하기 위해서 부가된 서열이다.
HHV 프로브
SEQ ID NO. HHV 유형 서열
1 1 5'-ACCTACCTGGGGATCTCAACAGGCC-3’
2 1 5'-GTACCTACCTGGGGATCTCAACAG-3’
3 1 5'-TGTACCTACCTGGGGATCTCAACAG-3’
4 1 5'-CCAAGACTGACACATTAAAAAACACAGAAT -3’
5 1 5'-ATCCCAAGACTGACACATTAAAAAACACAGAAT -3’
6 1 5'-AACCAAGACTGACACATTAAAAAACACAGGTT-3’
7 2 5'-GTACCGACCCGGAGTCCGTAGCAG-3’
8 8 5'-CAGAATTGCTCCACGCGCTGCACCT-3
9 8 5'-GAATTGCTCCACGCGCTGCACCTCG-3’
10 β-글로빈 5'-TGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCG -3’
또한 본 발명은 인체포진 바이러스의 DNA증폭용 프라이머를 제공하고자 한다. 본 발명은 서열번호 11 및 20에 나타난 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 HHVDNA의 증폭을 위한 프라이머를 제공한다. 이하 표 2에서 본 발명을 프라이머를 나타내었다.
PCR 프라이머
SEQ ID NO. HHV 유형 서열
11 1,2 (정방향) 5'-GTCGTCCAGATGCCCAC-3’
12 1,2 (역방향) 5'-ATCACGCATCTGCACAAC-3’
13 1,2 (정방향) 5'-GTCGTCCAGACGCCCACGG-3’
14 1,2 (역방향) 5'-ATCACGCACCTGCACAACGC-3’
15 1 (정방향) 5'-AGCTGATAGCCCAGCGCG-3’
16 1 (역방향) 5'-GCTTTTTGGCCCACTCGC-3’
17 8 (정방향) 5'-AGTCGTCCGCTCTGACG-3’
18 8 (역방향) 5'-TAATCTTTGAACAGTTAATCGC-3’
19 8 (정방향) 5'-GTCGTCCGCTCTGACGCGG-3’
20 8 (역방향) 5'-ATCTTTGAACAGTTAATCGCCGG-3’
21 β-글로빈 (BG)(정방향) 5'-ATACAAGTCAGGGCAGAG-3'
22 β-글로빈 (BG) (역방향) 5'-CTTAAACCTGTCTTGTAACC-3'
23 1,2,8 (정방향) 5'-GTGGTGGACTTTGCCAGCCTGTACCC-3'
24 1,2,8 (역방향) 5'-TAAACATGGAGTCCGTGTCGCCGTAGATGA-3'
본 발명은 HSV-1 및 HSV-2 DNA를 증폭하기 위한 프라이머로서 서열번호 11 및 12에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 또는 서열번호 13 및 14에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍을 제공한다. 또한, 본 발명은 HHV-8 DNA를 증폭하기 위한 프라이머로서 서열번호 17 및 18에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 또는 서열번호 19 및 20에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍을 제공한다.
상기 표 2에서, 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머쌍은 HSV-1 DNA 증폭용 프라이머이고, 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머쌍은 HSV-1 및 HSV-2를 모두 증폭가능한 프라이머이고, 상기 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머쌍과 서열번호 19 및 20으로 이루어진 프라이머쌍은 HHV-8 DNA 증폭용 프라이머이다. 시료중 HHV의 유형에 따라 상기 프라이머쌍을 하나 또는 둘 이상 선택하여 조합하여 사용할 수 있으며 어느 유형의 HHV가 포함되어 있는지 불명확한 경우에는 세 가지 유형의 HHV를 모두 증폭 가능하도록 프라이머를 조합하여 사용할 수 있다. 예컨대, HSV-1과 2 DNA를 증폭가능한 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머쌍 또는 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머쌍을 선택하고, 이와 조합하여 HHV-8 DNA를 증폭가능한 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머쌍 또는 서열번호 19 및 20으로 이루어진 프라이머쌍을 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머쌍과 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머쌍을 사용하여 세가지 유형의 HHV DNA를 증폭하거나, 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머쌍과 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머쌍을 사용하여 증폭할 수 있다.
서열번호 23 및 24로 이루어진 프라이머쌍은 기존에 알려진 HSV-1, 2, 및 HHV-8의 DNA를 모두 증폭가능한 프라이머쌍이다 (Journal of Clinical Microbiology(2000) 38(9):3274-3279). 이에 대한 PCR 결과는 도 3에 나타내었으며 본발명의 프라이머는 서열번호 23 및 24로 이루어진 프라이머쌍에 비해 같은 양의 DNA를 양적으로 많이 증폭시킨다. 도 2와 도3, 또는 도 4와 도 3의 증폭된 PCR 밴드(band)의 세기를 비교함으로써 알 수 있다.
HHV 유형에 따른 프라이머 및 프로브의 선택 및 조합을 하기 표 3에 정리하여 표시하였다.
HHV 유형 프라이머 SEQ ID NO 프로브 SEQ ID NO
HSV-1 11 및 12, 또는 13 및 14 1,2,3
15 및 16 4,5,6
HSV-2 11 및 12, 또는 13 및 14 7
HHV-8 17 및 18, 또는 19 및 20 8, 9
HSV-1의 유전형 분석용인 경우에는, 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머쌍으로 증폭한 시료 DNA는 상기 표 1에 나타난 서열번호 4, 5 및 6에 나타난 염기서열을 갖는 프로브를 사용할 수 있고, 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머쌍 또는 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머쌍으로 증폭한 시료 DNA는 상기 표 1에 나타난 서열번호 1 내지 3에 나타난 염기서열을 갖는 하나 이상의 프로브를 사용할 수 있다. HSV-2의 유전형 분석용인 경우에는 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머쌍 또는 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머쌍으로 증폭한 시료 DNA는 상기 표 1에 나타난 서열번호 7에 나타난 염기서열을 갖는 하나 이상의 프로브를 사용할 수 있다. 또한 HHV-8의 유전형 분석용인 경우에는, 상기 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머쌍 또는 서열번호 19 및 20으로 이루어진 프라이머쌍으로 증폭한 시료 DNA는 상기 표 1에 나타낸 서열번호 8 및/또는 서열번호 9에 나타난 염기서열을 갖는 프로브를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 인체포진 바이러스의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 마이크로 어레이, 바람직하게는 DNA칩이다. 본 발명의 일례에서, 상기 DNA칩은 본 발명의 기술분야 전문가가 용이하게 조합가능한 모든 프로브 서열 세트를 포함하는 DNA 칩도 포함한다. 본 발명에 따른 DNA 칩은 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함한다.
또한, 본 발명의 DNA칩은 상기 인체포진 바이러스에 대한 프로브외에도 클라미디아 트라코마스, 임균, 매독균(Treponema pallidum), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 인유두종 바이러스(Human Papillomavirus) 등을 검출할 수 있는 DNA 프로브를 동시에 하나의 슬라이드에 고정시켜 하나의 DNA 칩을 제조할 수 있다. 하나의 슬라이드에 여러 가지 박테리아 또는 바이러스의 DNA 프로브를 고정화시켰을 경우, 한번의 실험으로 어떤 박테리아 또는 바이러스가 시료에 존재하는 지를 쉽게 검출할 수 있게 된다. 또한, 위에서 언급한 박테리아 또는 바이러스 외에 다른 여러 가지 박테리아, 바이러스의 DNA 프로브를 하나의 슬라이드에 올려놓게 될 경우, 마찬가지로 한번의 실험으로 시료를 정확히 분석할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 상기 DNA칩은 전체적인 위치 마커 및 하이브리드화 반응에 대한 대조군으로서 기준마커를 추가로 포함할 수 있다. 기준마커의 예로는 β-글로빈, 액틴, 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 기준마커가 β-글로빈인 경우에는 바람직하게는 서열번호 10에 나타난 염기서열을 가지며, 이의 증폭을 위한 프라이머로는 서열번호 21의 염기서열 및 서열번호 22의 염기서열을 갖는 β-글로빈 DNA 증폭용 프라이머일 수 있다.
한편, 상기 인체포진 바이러스의 유전형 분석키트에 포함된 DNA 칩의 제조방법은 인체포진 바이러스의 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5'말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제조하는 공정; 제조된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시키는 공정; 및, 전기 DNA 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시키는 공정을 포함한다.
상기 고체의 표면에서 프로브 DNA와 알데히드의 결합은 이 분야에서 알려진 방법 즉, 37℃의 온도 및 70%의 습도 조건하에서 아민과 알데히드의 시프염기반응 (Schiffs base reaction)을 통해 수행될 수 있다. 상기 알데히드의 환원은 NaBH4와 같은 환원제를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 고체의 표면에 존재하는 알데히드와 반응하는 프로브 DNA의 농도는 100-300 pmol/L이 바람직하다. 이 외 범위로 사용하는 경우 상기 프로브 DNA가 고체 표면에 알데히드와의 결합이 이루어지지 않을 수 있다.
상기 고체는 유리, 실리콘 이산화물, 플라스틱 또는 세라믹으로부터 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 DNA 칩 및 그의 제조방법을 공정별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제 1공정: 프로브의 제조
인체포진 바이러스의 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열의 5'-말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제조한다. 이때, 프로브는 인체포진 바이러스 DNA의 염기서열, 바람직하게는 인체포진 바이러스의 당단백질 H의 DNA와 상보적으로결합하는 염기서열을 갖도록 설계 및 합성되고, 합성된 염기서열이 고체의 표면에 결 합될 수 있도록 염기서열의 5'말단에 아민기를 결합시켜서 프로브를 제조한다.
제 2공정: 프로브의 고정화
상기 제조된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시킨다: 이때, 고체는 특별히 제한되는 것은 아니나, 유리인 것이 바람직하고, 고체 표면의 알데히드는 이 분야에서 알려진 방법, 즉 프로브의 5’말단에 결합된 아민과 30 내지 40℃, 70 내지 100%의 습도조건에서 시프염기반응 (Schiffs base reaction)을 수행하여 고체 표면에 프로브를 결합시킨다. 이때, 프로브의 농도는 100 내지 300 pmole/l가 바람직하고, 가장 바람직하게는 200 pmole/l이다. 또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 β-글로빈 프로브을 부착한다.
제 3공정: DNA 칩의 제조
상기 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시켜서, DNA 칩을 제조한다. 이때, 알데히드의 환원조건이 특별히 제한되는 것은 아니나, NaBH4등의 환원제를 사용함이 바람직하다.
본 발명은 인체포진 바이러스의 탐지용 또는 유전형 분석키트에 관한 것이며, 바람직하게는 상기 서열번호 1 내지 9의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는 DNA 칩을 포함하는 것이다. 본 발명의 구체적인 일례에서,
(a) 상기 인체포진 바이러스의 탐지용 DNA 칩, (b) 인체포진 바이러스의 시료 DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 및 (c) 상기 DNA 칩과 하이브리드되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지용 키트를 제공한다.
상기 표지수단은 이 기술분야의 숙련된 자에게 알려져 있는 여러 가지 표지물들이 본 발명에 사용될 수 있으며, 그 예로는 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드를 사용할 수 있다. 상기 표지수단은 인체포진 바이러스에 대한 표지 유전자를 첨가하여 PCR 반응을 이용하여 증폭 및 표지증폭과정에서 유전자를 표지할 수 있다. 또한, 일반적인 표지수단인 비오틴-결합물질을 이용하여 표지할 수 있다. 상기 비오틴-결합물질은 예를 들어, 스트렙타비딘-R-피코에리스린(streptavidine-R-phycoerythrin)을 포함한다. Cy5를 이용하여 표지할 경우, 표지된 반응물을 검출할 때 추가적인 반응 없이 직접 콘포칼 레이저 스캐너와 같은 분석기를 이용하여 형광신호를 분석할 수 있어 효율적이며 비오틴-결합물질을 이용하여 표지하는 경우에 비해 더 민감한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 상기 인체포진 바이러스의 프로브 및 증폭용 프라이머를 이용하여 인체포진 바이러스를 탐지 또는 유전형 분석방법에 관한 것이다.
본 발명의 일례에서, (a) 인체포진 바이러스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 인체포진 바이러스의 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트와 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 일례에서,
(a) 인체포진 바이러스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 인체포진 바이러스 시료 DNA를 증폭하는 단계;
(b) 서열번호 1의 염기서열 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 단독 프로브 또는 2종 이상의 프로브 세트를 포함하는 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
(c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석방법을 제공한다.
상기 프라이머는 서열번호 11 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 인체포진 바이러스 증폭용 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 그 예는 상기 표 2에 표시하였다.
또한 본 발명은 상기 인체포진 바이러스의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 마이크로 어레이, 바람직하게는 DNA칩을 사용할 수 있으며, 상기 DNA칩은 β-글로빈, 액틴, 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 위치 마커로 추가로 포함할 수 있으며, 위치마커는 상기 DNA 칩에서 사용한 것을 사용할 수 있다. 상기 검출은 표지수단을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기에 열거한 표지수단을 사용할 수 있다.
본 발명의 일례에서, 시료 DNA의 증폭은 통상의 PCR 반응으로 수행할 수 있다. 즉, 전변성, 변성, 프라이머 결합, 및 사슬연장단계로 이루어진 PCR 반응으로 시료 DNA를 증폭할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일예에서, 상기 인체포진 바이러스 프라이머 및 β-글로빈 프라이머, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 표지물질, 그리고 Taq 폴리머라제를 포함하고, 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 PCR 서머싸이클러에 넣고, 94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 45 ~ 60 ℃에서 45초 ~ 1분간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 20 ~ 45초간 연장(extension)과정을 30 ~ 35회 반복 후 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, 표지분자가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득한다.
이하, 본 발명의 인체포진 바이러스의 분석키트를 이용한 인체포진 바이러스 검출방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제 1공정: 시료의 수득 및 증폭
검사할 시료를 증폭시켜서 Cy5(Cyanine 5)을 포함하는 증폭시료를 수득한다: 이때, 증폭된 시료가 Cy5을 함유하기 위하여 Cy5-dUTP를 사용한 PCR을 통하여 증폭시료를 수득한다.
제 2공정: 하이브리디제이션 반응
전기 증폭시료를 DNA 칩에 적용하여, 프로브와 하이브리디제이션 반응을 수행한다.
제 3공정: 검출
프로브와 하이브리디제이션된 DNA를 표지수단으로 표지하고, 이를 검출하여, 인체포진 바이러스의 감염여부를 판단한다. 검출방법은 상기 각각의 표시수단의 검출방법에 따라 수행하며, 예컨대 검출수단으로 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner)로 스캐닝하여 읽을 수 있다.
본 발명의 DNA 칩을 이용한 HHV의 유전형 분석키트 및 분석방법을 사용하여, HHV의 감염여부를 진단할 경우, 신속하고 간단하며 정확하게 HHV 감염여부 및 유전형을 검출할 수 있으므로, STD를 일으키는 HHV의 정확한 진단, 이로 인한 음부포진 또는 카포시 육종등의 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 프로브의 종류 및 개수가 특별히 제한되는 것은 아니므로, HHV로부터 유도된 염기서열을 갖는 프로브를 이용한 DNA 칩 및 전기 DNA 칩을 이용한 각종 분석키트 또한 본 발명의 범주에 속한다.
실시예 1: 프로브의 제조
HSV-1, HSV-2 및 HHV-8의 유전형 검출을 위하여 사용된 각 HHV 유전형에 특이적인 프로브와 β-글로빈에 특이적인 프로브는 5'말단에 아민 (amine)기가 포함되도록 작제하였다. 각 프로브의 염기서열은 표 1 및 서열번호 1 내지 10에 나타냈다.
실시예 2: DNA 칩의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 각각의 프로브를 3X SSC (0.05 M 소디움 시트레이트, 0.45 M NaCl (pH 7.0)에 200 pmol/l가 되도록 용해시키고, 알데히드기가 결합된 슬라이드 (silylated slide, CSS-100, CEL, Houston, TX, USA) 표면에 어레이어 (GMS 417 Arrayer, TaKaRa, Japan)를 이용하여 크기 150 m, 간격 300 m으로 스파팅 (spotting)한 다음 37℃, 습도 70% 이상의 조건에서 4시간 이상 시프염기반응 (Schiff base reaction)을 수행하였다. 이어서, 0.2% (w/v) 소디움 도디실설페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액으로 슬라이드를 세척하고, 3차 증류수로 세척한 다음, NaBH4용액 (2 g NaBH4, 150 ml phosphate buffered saline (PBS), 50 ml ethanol)에 40분 동안 침지하여 아민이 결합되지 않은 알데히드를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고, 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다.
또한 상기 고체의 표면에 전체적인 위치 마커 및 하이브리디제이션 반응에 대한 대조군 역할을 하는 β-글로빈을 부착하였다.
본 발명의 일례에 따른 DNA 칩의 배치도를 도 1 및 도 7에 나타냈다. 도 1은 DNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 나타내는 모식도로서, 표시된 번호는 각각의 프로브를 나타내고, (○)는 시료와 결합할 수 있는 프로브가 결합된 부위를 나타내며, (●)는 반응이 일어난 것인지를 확인하기 위한 배경마커이며 동시에 프로브의 위치를 나타내기 위한 기준마커를 나타낸다.
실시예 3: 시료의 수득
사람의 조직 또는 포진의 수포액 (lesion)등이 HHV에 감염되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 먼저 전기 조직에서 DNA를 추출하고, 정제하였다. 전기 정제된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 21 및 22를 갖는 β-글로빈 프라이머 (β-globin primer)를 이용하여 PCR을 수행하며, β-글로빈 유전자가 증폭된 DNA를 선별하여 검색시료로서 사용하였다. 임상시료는 대한민국 서울시 은평구 녹번동 5번지에 소재하는 국립보건원 (Korean National Institute of Health, KNIH)에서 제공받았다.
또한 검색시료의 HSV-1과 HSV-2 양성 대조군으로, 국립보건원에서 구입한 표준 바이러스 (HSV-1 (F strain); HSV-2 (G strain))를 RPMI 1640 배지에 키운 Vero cell에 배양한 후 추출 및 정제하여 사용하였다. 아울러, 대한민국 대전시 유성구 구성동에 소재하는 한국과학기술원 (Korea Advanced Institute of Science and Technology, KAIST)에서 기증받은 Bcbl-1 세포주 (body cavity based lymphoma) 에서 추출 및 정제된 HHV-8 DNA를 양성 대조군으로 사용하였다.
3-1: β-글로빈 시료의 수득
β-글로빈의 최적 PCR 확립을 위한 구성과 조건은 다음과 같다. 2X PCR 완충용액 (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3), 0.1 ㎍의 DNA, 2 mM MgCl2, 서열번호 11과 서열번호 12의 25 pmol의 β-글로빈 프라이머, 각 50 μM의 dNTP mixture (TaKaRa), 0.05 nM의 Cy5-dUTP (NEN, USA) 및 2 유니트 Taq 폴리머라제 (2 unitTaqpolymerase, TaKaRa, Japan)를 포함하고 경우에 따라 첨가물로 BSA 및 DMSO등을 사용하여 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러 (thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성 (denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성 (denaturation), 50℃에서 2분간 프라이머 결합 (primer annealing), 72℃에서 30초간 연장 (extension)과정을 5회 반복한 뒤 94℃에서 1분간 변성, 50℃에서 2분간 프라이머 결합, 72℃에서 15초간 연장과정을 35회 반복한다. 그 후 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
3-2: HHV 시료의 수득(서열번호 13, 14, 17 및 18 또는 11, 12, 17 및 18 의 프라이머 사용)
HHV의 최적 PCR 증폭 반응을 위해서, 서열번호 13, 14, 및 서열번호 17 및 18을 프라이머로 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다: 1 x PCR 완충용액 (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3), 0.1 ㎍의 DNA, 2 mM MgCl2, 각 25 pmol의 프라이머, 100 μM의 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (TaKaRa), 5%의 Dimethyl suloxide (DMSO), 0.05 nM의 Cy5-dUTP (NEN, USA) 및 2.5 유니트 Taq 폴리머라제(TaKaRa, Japan)를 포함하는 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러 (thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성 (denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성 (denaturation), 58℃에서 45초간 프라이머 결합 (primer annealing), 72℃에서 30초간 연장 (extension)과정을 35회 반복 후 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다. 이에 대한 결과는 도 2 에 나타내었다.
상기 정제된 HSV-1, -2, HHV-8 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11, 12, 및 서열번호 17 및 18을 프라이머로 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다: 1 x PCR 완충용액 (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3), 0.1 ㎍의 DNA, 2 mM MgCl2, 각 25 pmol의 프라이머, 100 μM의 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (TaKaRa), 5%의 Dimethyl suloxide (DMSO), 0.05 nM의 Cy5-dUTP (NEN, USA) 및 2.5 유니트 Taq 폴리머라제(TaKaRa, Japan)를 포함하는 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러 (thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성 (denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성 (denaturation), 58℃에서 45초간 프라이머 결합 (primer annealing), 72℃에서 30초간 연장 (extension)과정을 35회 반복한 뒤 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다. 이에 대한 PCR 결과는 도 4에 나타내었다.
3-3: HHV 시료의 수득( 서열번호 15 및 16, 17 및 18 프라이머 사용)
HSV-1과 HHV-8의 PCR 증폭을 위하여 서열번호 13, 14, 및 서열번호 17 및 18을 프라이머로 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 1 x PCR 완충용액 (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3), 0.1 ㎍의 DNA, 1.5 mM MgCl2, 각 10 pmol의 프라이머, 100 μM의 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (TaKaRa), 0.05 nM의 Cy5-dUTP (NEN, USA) 및 2 유니트 Taq 폴리머라제(TaKaRa, Japan)를 포함하는 50 ㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러 (thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성 (denaturation)후, 94℃에서 1분간 변성 (denaturation), 55℃에서 45초간 프라이머 결합 (primer annealing), 72℃에서 30초간 연장 (extension)과정을 35회 반복한 뒤 72℃에서 2분간 더 연장 반응을 하여, Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다. PCR 결과는 도 5에 나타내었다.
3-4: 임상 시료의 수득
전기 수득한 수포액 또는 조직의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 17, 서열번호 18을 갖는 염기서열을 프라이머로 사용하며, 실시예 3-2과 동일한 방법으로 Cy5가 결합된 증폭된 DNA시료를 수득하였다.
실시예 4: DNA 칩을 사용한 감염여부의 확인
상기 실시예 2에서 제조한 DNA 칩에 실시예 3에서 수득한 증폭된 시료를 적용하여, 하이브리디제이션 반응을 다음과 같이 수행하였다. 이때, 하이브리디제이션 반응실 (Hybridization reaction chamber)로 100 ㎕ 용량의 커버슬립 (cover slip, GRACE Bio-Labs, USA, PC4L-1.0)을 사용하였다.
표준 바이러스 DNA의 경우 또는 임상시료 DNA의 경우, HHV 증폭산물 15 ㎕와, β-글로빈 증폭산물 5 ㎕의 혼합물을 반응시료로서 사용하였다.전기 반응시료에 3 N 수산화나트륨 (NaOH) 수용액을 10% (v/v) 첨가하여 실온에서 5분간 변성시키고, 1 M Tris-HCl (pH 7.4)을 5% (v/v) 첨가하여 중화시켰다. 그런 후에, 상기 결과물에 3 N 염산을 10% (v/v) 첨가한 후, 얼음에서 5분간 방치하였다. 이어서, 하이브리디제이션 용액 (6X 식염수-소디움 포스페이트-EDTA 완충액 (SSPE, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)과 0.05% 소디움 도데실 설페이트 (SDS)를 사용하여 45℃에서 실릴화된 슬라이드 (silylated slide)에 고정된 프로브와 2시간 동안 반응시키고, 3X SSPE로 2분, 1X SSPE로 2분간 DNA 칩을 세척하여 실온에서 공기 건조하거나 스핀 건조기 (spin dryer)를 사용하여 건조하였다. 이를 콘포칼 레이저 스캐너 (confocal laser scanner, GSI Lumonics, Germany)를 이용하여 형광신호를 분석하였다 (excitation 650 nm, emission 668 nm).
상기 3-2 실시예에서 서열번호 13, 14, 17 및 18의 프라이머를 사용하여 얻은 HHV 시료를 이용하여 분석한 결과를 도 6a, 6b, 6c, 6d에 나타냈다. 도 6a는 HSV-1을 분석한 결과를 나타내는 사진이고 도 6b는 HSV-2를 분석한 결과를 나타내는 사진이며 도 6c는 HHV-8을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 6d는 β-글로빈을 분석한 결과 사진으로 HHV이 검출되지 않은 결과를 나타낸다. 도 6a 내지 6d에서 보듯이, 각 DNA의 증폭산물로부터 기인한 하이브리디제이션 신호가 다른 심각한 교차-하이브리디제이션 (cross-hybridization) 없이 제 위치의 프로브에서만 각각 깨끗하게 나타남을 확인할 수 있었다.
상기 3-3 실시예에서 서열번호 15, 16, 17 및 18의 프라이머 사용하여 얻는 HHV 시료를 이용하여 분석한 결과를 도 8a, 8b, 8c에 나타내었다. 도 8a는 HSV-1을 분석한 결과를 나타내는 사진이고 도 8b는 HHV-8을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 8c는 β-글로빈을 분석한 결과 사진으로 HHV이 검출되지 않은 결과를 나타낸다.
실시예 5: DNA 칩을 사용한 임상시료의 진단결과의 확인
상기 실시예 3-4에서 수득한 임상시료에 대하여 실시예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 HHV의 유전형 분석실험을 수행하였다. 분석한 결과를 도 9a, 9b 9c에 나타내었다. 그 결과 도 9a는 HSV-1에 감염된 샘플로 분석되었고, 도 9b는 HSV-2에 감염된 샘플로 분석되었고, 도 9c는 HHV-8에 감염된 샘플로 분석되었고, 도 9d는 HHV가 검출되지 않은 결과를 나타낸다.
분석실험 결과, 발명의 유전형 분석키트는 손쉽게 HHV를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 감염된 HHV의 유전형을 판별할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 DNA 칩을 사용하여 HHV 감염의 진단과 정확한 치료로 인한 포진의 재발 또는 에이즈의 예방에 기여할 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 DNA 칩을 이용한 HHV의 유전형 분석키트 및 분석방법을 사용하여,HHV의 감염여부를 진단할 경우, 신속하고 간단하며 정확하게 HHV 감염여부 및 유전형을 검출할 수 있으므로, STD를 일으키는 HHV의 정확한 진단, 이로 인한 음부포진 또는 카포시 육종등의 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.
<110> BIOMEDLAB <120> PROBE FOR DETECTING Human herpesvirus, GENOTYPING KIT AND GENOTYPING METHOD FOR Human herpes virus USING THE SAME <130> DPP2002-1913 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1 Probe <400> 1 acctacctgg ggatctcaac aggcc 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1 Probe <400> 2 gtacctacct ggggatctca aca 23 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1 Probe <400> 3 tgtacctacc tggggatctc aacag 25 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1 Probe <400> 4 ccaagactga cacattaaaa aacacagaat 30 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1 Probe <400> 5 atcccaagac tgacacatta aaaaacacag aat 33 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1 Probe <400> 6 aaccaagact gacacattaa aaaacacagg tt 32 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-2 Probe <400> 7 gtaccgaccc ggagtccgta gcag 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HHV-8 Probe <400> 8 cagaattgct ccacgcgctg cacct 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HHV-8 Probe <400> 9 gaattgctcc acgcgctgca cctcg 25 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-globin Probe <400> 10 tgcacctgac tcctgaggag aagtctgccg 30 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for HSV-1 and HSV-2 <400> 11 gtcgtccaga tgcccac 17 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward Primer for HSV-1 and HSV-2 <400> 12 atcacgcatc tgcacaac 18 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for HSV-1 and HSV-2 <400> 13 gtcgtccaga cgcccacgg 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward Primer for HSV-1 and HSV-2 <400> 14 atcacgcacc tgcacaacgc 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for HSV-1 <400> 15 agctgatagc ccagcgcg 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward Primer for HSV-1 <400> 16 gctttttggc ccactcgc 18 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for HHV-8 <400> 17 agtcgtccgc tctgacg 17 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward Primer for HHV-8 <400> 18 taatctttga acagttaatc gc 22 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for HHV-8 <400> 19 gtcgtccgct ctgacgcgg 19 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward Primer for HHV-8 <400> 20 atctttgaac agttaatcgc cgg 23 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for beta-globin <400> 21 atacaagtca gggcagag 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward Primer for beta-globin <400> 22 cttaaacctg tcttgtaacc 20 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Known Forward Primer for HSV-1, HSV-2, and HHV-8 <400> 23 gtggtggact ttgccagcct gtaccc 26 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Known Backward Primer for HSV-1, HSV-2 and HHV-8 <400> 24 taaacatgga gtccgtgtcg ccgtagatga 30

Claims (18)

  1. 서열번호 1 내지 9에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 상기 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되며, 인체포진 바이러스(Human Herpes Virus, HHV)의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브.
  2. 서열번호 11 내지 서열번호 20에 나타난 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 인체포진 바이러스(Human Herpes Virus, HHV) DNA의 증폭을 위한 프라이머.
  3. 서열번호 11 및 서열번호 12에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 또는 서열번호 13 및 서열번호 14에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍인 HSV-1 및 HSV-2 DNA를 증폭하기 위한 프라이머.
  4. 서열번호 17 및 서열번호 18에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 또는 서열번호 19 및 서열번호 20에 나타난 염기서열을 갖는 HHV-8 DNA를 증폭하기 위한 프라이머.
  5. 서열번호 1 내지 서열번호 9에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HHV 프로브를 포함하는, 인체포진 바이러스(Human Herpes Virus, HHV)의 탐지 또는 유전형 분석용 DNA 칩.
  6. 제 5 항에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 HSV-1의 프로브, 서열번호 7의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드을 갖는 HSV-2의 프로브, 및 서열번호 8 및 9의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 HHV-8의 프로브를 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석용 DNA 칩.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 DNA칩은 β-글로빈, 액틴, 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 기준마커 프로브를 추가로 포함하는 DNA 칩.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 β-글로빈 프로브는 서열번호 10에 나타난 염기서열을 갖는 것인 DNA 칩.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 프로브 DNA의 5'말단 아민기가 칩 고체표면의 알데히드기와 시프염기반응으로 고정화되는 것인 DNA칩.
  10. (a) 제 5항 내지 9항중 어느 한항에 따른 인체포진 바이러스(Human Herpes Virus, HHV)의 탐지 또는 유전형 분석용 DNA 칩, (b) 시료 HHV DNA를 PCR 방법으로 증폭시키기 위한 프라이머 세트, 및 (c) 상기 DNA 칩과 하이브리드되는 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석용 키트.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석용 키트.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 11 및 12에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 서열번호 13 및 14에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 서열번호 15 및 16에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 서열번호 17 및 18에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 19 및 20에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1쌍 이상의 프라이머쌍을 포함하는 것인 키트.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 11 및 12에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 13 및 14에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍으로 이루어지는 군에서 선택된 HSV-1 및 HSV-2 DNA를 증폭하기 위한 프라이머쌍과,
    서열번호 17 및 18에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 19 및 20에 나타난 염기서열을 갖는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 HHV-8 DNA를 증폭하기 위한 프라이머쌍를 포함하는 키트.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 21의 염기서열 내지 서열번호 22의 염기서열을 갖는 β-글로빈 DNA 증폭용 프라이머쌍을 포함하는 키트.
  15. (a) 인체포진 바이러스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 시료의 DNA를 증폭하는 단계;
    (b) 서열번호 1 내지 9에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HHV 프로브를 포함하는 DNA 칩에 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
    (c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 11 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 HHV DNA 증폭용 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 검출은 유전자가 Cy5로 표지된 경우 콘포칼 레이저 스캐너를 이용하여 형광신호를 분석함을 특징으로 하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석방법.
  18. (a) 인체포진 바이러스의 DNA 증폭용 프라이머를 이용하여 시료 DNA를 증폭하는 단계;
    (b) 서열번호 1 내지 9에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 HHV 프로브와 상기 증폭된 DNA를 하이브리드시키는 단계; 및
    (c) 상기 프로브와 하이브리화된 반응물을 검출하는 단계를 포함하는 인체포진 바이러스의 탐지 또는 유전형 분석방법.
KR10-2002-0054330A 2002-09-09 2002-09-09 인체포진 바이러스의 프로브, 이를 이용한 인체포진바이러스의 유전형 분석용 키트 및 유전형 분석방법 KR100460747B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0054330A KR100460747B1 (ko) 2002-09-09 2002-09-09 인체포진 바이러스의 프로브, 이를 이용한 인체포진바이러스의 유전형 분석용 키트 및 유전형 분석방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0054330A KR100460747B1 (ko) 2002-09-09 2002-09-09 인체포진 바이러스의 프로브, 이를 이용한 인체포진바이러스의 유전형 분석용 키트 및 유전형 분석방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20040022800A KR20040022800A (ko) 2004-03-18
KR100460747B1 true KR100460747B1 (ko) 2004-12-08

Family

ID=37326517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2002-0054330A KR100460747B1 (ko) 2002-09-09 2002-09-09 인체포진 바이러스의 프로브, 이를 이용한 인체포진바이러스의 유전형 분석용 키트 및 유전형 분석방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100460747B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MD3299G2 (ro) * 2006-09-28 2007-11-30 Институт Генетики, Физиологии И Защиты Растений Академии Наук Молдовы Primer oligonucleotidic pentru depistarea ADN-ului virusului herpes de tip 1

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR870007427A (ko) * 1986-01-10 1987-08-19 알버트 피. 할루인 증폭 및 하이브리드화로 바이러스를 검출하는 방법
JPH07203996A (ja) * 1994-01-17 1995-08-08 Toyobo Co Ltd ヒト単純疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途
JPH07250699A (ja) * 1994-03-11 1995-10-03 Toyobo Co Ltd ヒトヘルペスウイルスを分別検出する方法およびその試薬
US5545520A (en) * 1989-08-18 1996-08-13 Institute Pasteur Nucleic acid fragments and diagnostic reagents derived from the HHV6/SIE genome and procedures for diagnosing HHV6 infections
US5846706A (en) * 1995-04-25 1998-12-08 Health Research Inc. Rapid and sensitive detection of herpes simplex virus
WO2002034953A2 (en) * 2000-10-24 2002-05-02 Vigen Laboratories, Inc. Detection and quantification of human herpes viruses

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR870007427A (ko) * 1986-01-10 1987-08-19 알버트 피. 할루인 증폭 및 하이브리드화로 바이러스를 검출하는 방법
US5545520A (en) * 1989-08-18 1996-08-13 Institute Pasteur Nucleic acid fragments and diagnostic reagents derived from the HHV6/SIE genome and procedures for diagnosing HHV6 infections
JPH07203996A (ja) * 1994-01-17 1995-08-08 Toyobo Co Ltd ヒト単純疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途
JPH07250699A (ja) * 1994-03-11 1995-10-03 Toyobo Co Ltd ヒトヘルペスウイルスを分別検出する方法およびその試薬
US5846706A (en) * 1995-04-25 1998-12-08 Health Research Inc. Rapid and sensitive detection of herpes simplex virus
WO2002034953A2 (en) * 2000-10-24 2002-05-02 Vigen Laboratories, Inc. Detection and quantification of human herpes viruses

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040022800A (ko) 2004-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100452163B1 (ko) 인유두종 바이러스의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석키트
TWI410491B (zh) 眼睛與中樞神經系統之細菌、黴菌、寄生蟲及病毒感染之新穎同步檢測及鑑別方法
KR100382703B1 (ko) 인유두종바이러스의 유전형 진단키트 및 상기 진단키트의제조방법
JP2651483B2 (ja) ポリメラーゼ連鎖反応によるヒト乳頭腫ウイルスの検出
US20120004113A1 (en) Dna chip, kit for detecting or genotyping bacteria causing sexually transmitted diseases, genotyping antibacterial drug resistance and detecting or genotyping method using the same
RU2410441C2 (ru) Наборы и способ детектирования папилломавируса человека с помощью набора олигонуклеотидных гранул
KR20070112781A (ko) Ｈｐｖ를 검출하기 위한 방법, 프로브, 프라이머 및 키트
JP2905283B2 (ja) ヒトパピロマウイルスの検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチド
US8455632B2 (en) Primer set and probe for detection of human papillomavirus
JP2003529376A (ja) Ｐｎａプローブを使用するヒトパピローマウイルスの検出およびタイピング
KR100517275B1 (ko) 인유두종 바이러스의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석프로브 및 이를 포함하는 바이오칩
KR101623489B1 (ko) 성인성 질환의 원인균 탐지용 고감도 프로브 및 이를 포함하는 키트
KR100460747B1 (ko) 인체포진 바이러스의 프로브, 이를 이용한 인체포진바이러스의 유전형 분석용 키트 및 유전형 분석방법
KR101335483B1 (ko) 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법
KR101451780B1 (ko) 인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 ρνα 프로브,키트 및 방법
JP5898831B2 (ja) ヒトパピローマウイルスの検出
KR20130125046A (ko) 고위험군 인유두종바이러스 유전자 분석용 키트 및 그 분석방법
US6818397B1 (en) Methods for detecting and differentiating enteroviruses and the primers and probes therefor
KR101196930B1 (ko) 인체유두종바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 인체유두종바이러스의 검출방법
KR100532664B1 (ko) 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브, 이를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 키트, 및 이를 이용한 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법
KR100904772B1 (ko) 유전자칩, 이를 이용한 돼지콜레라 바이러스 또는소바이러스성설사증 바이러스 유전자의 검사방법 및 그를포함하는 진단키트
KR20090118777A (ko) 인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 ρνα 프로브,키트 및 방법
KR100532666B1 (ko) 매독 트레포네마 탐지용 프로브, 이를 포함하는 매독트레포네마 탐지용 키트, 및 이를 이용한 매독트레포네마의 탐지방법
KR20110072039A (ko) 개 파보바이러스 유전자형 감별진단용 ｐｎａ 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법
KR20080107199A (ko) 닭의 마렉병과 백혈병/육종의 감별진단을 위한 탐침,마이크로어레이 및 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121112

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131122

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141124

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151124

Year of fee payment: 12

LAPS Lapse due to unpaid annual fee