KR100886276B1 - 인산 대사, 칼슘 대사, 석회화 및 비타민 ｄ 대사를조절하는 폴리펩티드 및 그것을 코딩하는 ｄｎａ - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 관한 것이다.
(a) 서열 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(b) 서열 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
(c) 서열 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 부분 서열이 상기 아미노산 서열 중 적어도 제34번째 내지 제201번째의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
(d) 서열 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 부분 서열이 (i) 상기 아미노산 서열 중 적어도 제34번째 내지 제201번째 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 해당 부분 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, (iii) 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 것인 폴리펩티드.
인산 대사, 칼슘 대사, 석회화, 비타민 D 대사, 폴리펩티드, DNA

Description

인산 대사, 칼슘 대사, 석회화 및 비타민 Ｄ 대사를 조절하는 폴리펩티드 및 그것을 코딩하는 ＤＮＡ {Polypeptides Controlling Phosphoric Acid Metabolism, Calcium Metabolism, Calcification and Vitamin D Metabolism and DNAs Encoding the Same}
본 발명은 인산 대사, 칼슘 대사, 석회화 및(또는) 비타민 D 대사를 조절하는 폴리펩티드, 동 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 동 폴리펩티드를 유효 성분으로 하는 의약 조성물, 및 동 폴리펩티드를 인식하는 항체와 동 항체를 유효 성분으로 하는 의약 조성물, 동 항체를 사용한 진단 방법과 진단용 조성물에 관한 것이다.
무기 인산(이하, 「인산」이라고 함)은 생체의 에너지 대사 및 세포의 기능 유지에 필수임과 동시에 칼슘과 협동하여 석회화 조직의 형성에 중요한 역할을 담당한다. 생체로의 인산 공급은 주로 장관에서의 흡수에 의존하고, 배설은 신장에서의 뇨중 배설과 장관에서의 분중 배설에 의한다. 인산은 생체내에서 체액, 세포내액, 석회화 조직에 유동적으로 분포하고 있다. 성인에서의 무기 인산의 흡수량과 배설량이 거의 동등하게 유지되는 것은, 인산 대사의 항상성을 유지하는 제어 기구가 존재함을 시사한다. 인산과 동일한 생체내 분포를 나타내고 혈중 농도의 항상성을 갖는 칼슘의 대사 조절은, 포유 동물에 있어서 적어도 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 1α,25-디히드록시 비타민 D3 등의 조절 인자에 의해 협조적으로 행해지고 있다고 알려져 있다.
인산의 대사 조절에 있어서는, 부갑상선 호르몬이 인산 배설을 촉진하거나, 또는 1α,25-디히드록시 비타민 D3이 장관에서의 인산 흡수를 촉진하는 것으로 알려지져 있으며, 또한 칼슘 대사와 밀접하게 관련되어 있음이 분명하다. 그러나, 인산을 주체적으로 조절하는 물질은 아직 확실하지 않다.
한편, 인산 대사의 항상성이 소실되고 혈중 무기 인산 농도가 저하되는 질환으로서는 원발성 부갑상선 기능 항진증, 유전성 저인산혈증성 곱사병, 종양성 골연화증 등을 들 수 있다.
원발성 부갑상선 기능 항진증은 부갑상선에서 부갑상선 호르몬의 과잉 생산을 특징으로 하는 질환으로, 지나치게 생산된 부갑상선 호르몬이 신장에서 무기 인산의 재흡수를 억제함으로써 인산 과잉 배설형의 저인산혈증을 나타낸다고 알려져 있다.
또한, 유전자 질환에서 기인하는 저인산혈증에는 I형 비타민 D 의존성 곱사병, II형 비타민 D 의존성 곱사병, 비타민 D 저항성 곱사병 등이 알려져 있다. I형 비타민 D 의존성 곱사병은 활성화 비타민 D 합성 효소의 유전적 기능 부전이 원인으로 발병하는 질환이고, II형 비타민 D 의존성 곱사병은 비타민 D 수용체의 유전적 기능 부전에 의한 것으로, 양자 모두 비타민 D3의 작용이 약화됨으로써 저칼슘혈증과 동시에 저인산혈증을 나타내는 것이다. 한편, 비타민 D 저항성 곱사병은, 반성 염색체성인 것과 상염색체성인 저인산혈증성 곱사병의 적어도 2종의 원인 이 상이한 병태가 존재한다고 알려져 있다.
상기 비타민 D 저항성 곱사병의 2가지 병태는, 신장으로부터의 무기 인산의 누출을 특징으로 하는 저인산혈증을 초래한다. 최근, 반성 염색체성의 저인산혈증 (X-linked hypophosphatemia: 이하 「XLH」라고 함) 환자는, X 염색체상의 PHEX로 명명된 엔도펩티다아제형 단백질을 코딩하는 유전자의 변이에 의해 유도됨이 분명해졌다. 그러나, PHEX 단백질의 기능 이상이 저인산혈증을 유도하는 기작에 대해서는 확실하지 않다. 흥미롭게도, 저인산혈증을 나타내는 자연 변이 마우스(Hyp)의 유전자 해석으로부터, 이 마우스에서는 PHEX를 코딩하는 유전자가 부분 결손되어 있는 것이 밝혀졌다. 이 마우스를 이용한 실험에 의해, PHEX 결손 마우스의 신장 기능은 정상적이라는 것과, Hyp 마우스의 체액 중에 저인산혈증을 유도하는 부갑상선 호르몬과는 상이한 액성 인자가 존재하는 것이 밝혀졌다. 상염색체성의 저인산혈증(Autosomal dominant hypophosphatemic rickets/osteomalacia: 이하 ADHR이라고 함)에 관해서는, 질환의 책임 유전자를 찾아내려는 시도가 행해졌고, 연쇄 해석에 의해 12p13 영역에 존재하는 것으로 보고되어 있다. 그러나, 상기 영역도 여전히 광범위하고, 많은 유전자가 거기에 포함되어 있어 후보 유전자를 특정하는데 이르지 못하였다.
종양성 골연화증은 종양 형성에 의해 신장으로부터의 무기 인산 배설이 증가하여 저인산혈증을 나타내고, 종양에 대한 방사선 조사나 종양의 제거를 수행함으로써 저인산혈증이 소실되는 것을 특징으로 하는 질환이다. 이 질환에 있어서도 신장에서의 인산 재흡수를 억제함으로써 저인산혈증을 유도하는 인자를 종양이 생 산한다고 생각되고 있다.
비타민 D 저항성 곱사병에 있어 추정되는 원인 분자와, 종양성 골연화증에 있어 추정되는 원인 분자가 동일한지의 여부는 확정되지 않았지만, 양자는 분명히 인산의 뇨중 배설을 촉진하는 미지의 인산 대사 인자라는 점에서 일치하고 있다. 추정되는 상기 인산 대사 조절 인자는, 종종 포스파토닌(Phosphatonin)이라는 명칭으로 불린다. 이 미지의 인산 대사 조절 인자와, 비타민 D 저항성 곱사병이나 종양성 골연화증과의 관련성에 대해서는 총설로서도 정리되어 있다(Neison, A. E., Clinical Endocrinology, 47:635-642, 1997; Drezner, M.K., Kindney Int., 57:9-18, 2000).
비타민 D 저항성 곱사병이나 종양성 골연화증의 또다른 특징은 골의 석회화 장해이다. 골의 석회화 장해는 저인산혈증에 의해 이차적으로 생성된다고도 생각할 수 있지만, 비타민 D 저항성 곱사병의 모델 마우스인 Hyp 마우스의 실험에서는, 골석회화 이상이 인산 농도에 의존하지 않고 생기는 것으로 밝혀졌고(Ecarot, B., J. Bone Miner. Res., 7:215-220, 1992; Xiao, Z. S., Am. J. Physiol., E700-E708, 1998), 상기 미지의 인산 대사 조절 인자가 직접적으로 골 조직의 석회화를 조절하는 가능성도 생각할 수 있다.
상술된 바와 같이, 인산 대사를 조절하는 미지의 인자가 존재할 가능성이 강하게 시사되는 연구 데이타가 보고되어 있지만, 추정되는 활성을 제시하는 실체를 분자적으로 밝힌 예는 없다. WO99/60017에는 신규 폴리펩티드 호르몬인 포스파토닌의 신규 폴리펩티드 서열이 개시되어 있지만, 포스파토닌의 특징인 저인산혈증 유도 활성은 개시되어 있지 않다. 지금까지 확실하지 않았던 생체 유래의 인산 대사 조절 인자가 존재한다고 생각되었다.
음식물로부터 섭취되는 비타민 D2 및 비타민 D3, 또는 피부에서 합성된 비타민 D3은 주로 간에 존재하는 비타민 D-25위치 히드록실라제에 의해 수산화되어 25-히드록시 비타민 D가 된다. 그 후, 신장의 근위 세뇨관 상피 세포에 존재하는 25-히드록시 비타민 D-1α위치 히드록실라제에 의해 수산화되어 1α,25-디히드록시 비타민 D가 된다. 이 1α,25-디히드록시 비타민 D는 혈청의 칼슘 및 인 농도를 상승시키는 생리 활성을 갖는 미네랄 조절 호르몬이고, 부갑상선 호르몬의 분비 억제, 골 흡수 촉진 등을 담당한다고도 알려져 있다. 1α,25-디히드록시 비타민 D는 생체내에서, 주로 신장이나 소장에 존재하는 24위치 히드록실라제에 의해 수산화되어 상술한 생리 활성을 갖지 않는 대사물로 변환된다. 이 점에서, 24위치 히드록실라제는 1α,25-디히드록시 비타민 D의 불활성화를 담당하는 효소라고 생각되고 있다. 한편, 24위치 히드록실라제는 25-히드록시 비타민 D에 대해서도 작용하여 24,25-디히드록시 비타민 D로 변환시킨다고 알려져 있다. 이 24,25-디히드록시 비타민 D에 대해서는 골량 증가, 연골 분화 촉진 등의 생리 작용이 보고되어 있고, 생리 활성을 갖는 비타민 D 대사물의 생성 효소로서의 일면을 갖는 것으로 시사되어 있다.
비타민 D의 활성화에 중요한 역할을 담당하는 1α위치 히드록실라제의 발현 수준을 조절하는 인자로서는, 부갑상선 호르몬(PTH), 칼시토닌, 1α,25-디히드록시 비타민 D 등이 알려져 있다. 혈중 칼슘 농도의 저하에 의해 분비가 촉진되는 PTH는 신장 근위 세뇨관 상피 세포에 존재하는 PTH 수용체에 작용하여, 세포내 cAMP의 상승을 통해 1α위치 히드록실라제 유전자의 전사를 촉진함으로써 혈중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도를 상승시킨다. 1α,25-디히드록시 비타민 D는 장관으로부터의 칼슘 흡수와 신장에서의 칼슘 재흡수를 촉진하여, 결과로서 혈중 칼슘 농도를 상승시킨다. 다른 한편으로, 1α,25-디히드록시 비타민 D는 비타민 D 수용체(VDR)와 결합하여 1α위치 히드록실라제 유전자나 PTH 유전자의 프로모터 영역에 작용하여 이들 유전자의 전사 억제를 수행한다고 보고되어 있다. 즉, 1α,25-디히드록시 비타민 D는 그의 활성화 인자인 PTH 및 1α위치 히드록실라제에 대하여 피드백 제어를 가지고 있고, 이 기구가 칼슘 대사의 항상성 유지에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다.
최근, 혈청 인산 농도의 저하가 1α위치 히드록실라제 유전자의 발현을 항진한다고 보고되었다. 인산 대사에 있어서도, 혈청 인산 농도의 저하에 따른 1α위치 히드록실라제 유전자의 발현 상승이 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도를 상승시키고, 결과로서 소장으로부터의 인산 흡수를 촉진함으로써 혈청 인산 농도를 조절하는 기구의 존재가 추측되고 있다.
24위치 히드록실라제 유전자의 발현 조절을 담당하는 인자로서는 1α,25-디히드록시 비타민 D, PTH 등을 들 수 있다. 1α,25-디히드록시 비타민 D는 비타민 D 수용체 (VDR)를 통해 24위치 히드록실라제 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 비타민 D 수용체 반응 서열에 결합함으로써 전사를 촉진하는 것이 판명되어 있다. 1α,25-디히드록시 비타민 D는 24위치 히드록실라제를 활성화하여 대사 경로의 활성화에 의한 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도의 저하를 유도한다고 생각된다. 24 위치 히드록실라제 유전자의 발현은 PTH에 의해 억제된다고 알려져 있지만, 상세한 분자 메카니즘은 분명하지 않다.
본 발명은 혈중 인산 농도 저하를 유도할 수 있는 종양 유래의 신규 인자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
종양성 골연화증에서 동정되는 종양은 생리 활성을 갖는 분비 인자를 방출시켜, 그 결과로서 혈중 인산 농도가 저하된다고 생각할 수 있다. 이 종양 유래 인자가 인산 대사의 항상성을 혼란시킨다는 것은, ① 원래 생체에서 생산되지 않는 것이 종양 특이적으로 생산되거나, ② 정상 조직에서도 생산되지만 종양에서 과잉 생산되거나, 또는 ③ 생리적인 제어를 받지 않고 종양에서 생산되는 것 중 어느 하나를 특징으로 한다고 생각된다.
본 발명자는 상술한 바와 같이 종양 유래의 저인산혈증 유도 인자가 종양성 골연화증 유래의 종양에서 특징적으로 생산된다는 추측에 기초하여, 종양에서 저인산혈증 유도 인자를 코딩하는 유전자의 전사가 상승하는 것, 또는 그 인자의 mRNA의 안정성이 상승하는 것을 예상하였다. 그래서, 종양성 골연화증 종양 환자로부터 치료 목적으로 적출된 종양 조직의 일부에서 RNA를 추출한 후, 파지 벡터 및 플라스미드 벡터를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제조하고, 종양에서 특징적으로 발현되는 유전자 단편을 스크리닝하였다. 스크리닝은 종양에서 특이적으로 발현된다고 생각되는 cDNA 단편을 선별하는 방법과 종양 유래 cDNA 라이브러리로부터 신장 근위 세뇨관 상피 세포주 유래의 cDNA 프로브와 교차반응하지 않는 cDNA 단편을 선별 하는 방법을 수행하였다. 따라서, 선택된 cDNA 단편 중에서 서열의 신규성과 종양에서의 특징적인 발현을 확인함으로써 그 범위를 더욱 국한시키고, 저인산혈증 유도 인자를 코딩할 것으로 기대되는 cDNA 단편을 복수개 얻었다. 이들 서열 정보로부터, 각각의 단편이 귀속되는 ORF를 포함하는 cDNA의 클로닝을 시도하고, 신규 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 취득하였다. 또한, 이 신규 폴리펩티드의 생물 활성을 발견하기 위해 예의 연구를 진행시켜, 이 신규 폴리펩티드가 인산 수송을 억제하는 활성을 갖는 것, 그리고 동물에서 저인산혈증을 유도함과 동시에 골 조직의 석회화를 억제하는 것을 밝히고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 하기과 같다.
(1) 하기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
(a) 서열 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(b) 서열 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
(c) 서열 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 부분 서열이 상기 아미노산 서열 중 적어도 제34번째 내지 제201번째의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
(d) 서열 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 부분 서열이 (i) 상기 아미노산 서열 중 적어도 제34번째 내지 제201번째 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 해당 부분 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, (iii) 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 것인 폴리펩티드.
(2) 하기 (e) 또는 (f)의 DNA를 포함하는 DNA.
(e) 서열 1로 표시되는 염기 서열 중 제133번째 내지 제885번째의 염기 서열, 또는 서열 3으로 표시되는 염기 서열 중 제1번째 내지 제681번째의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
(f) 서열 1 또는 3으로 표시되는 염기 서열의 전부 또는 일부의 서열을 포함하는 DNA로부터 제조된 프로브와 엄격한 조건하에서 혼성화되며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
여기에서, 엄격한 조건이란 나트륨 농도가 750 mM 이상, 바람직하게는 900 mM 이상이고, 온도가 40 ℃ 이상, 바람직하게는 42 ℃의 조건을 만족시키는 것을 말한다. 구체적으로는 6×SSC, 5×덴하르트(Denhardt), 0.5 ％ SDS, 50 ％ 포름아미드, 42 ℃의 조건을 말한다.
(3) 상기 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
(4) 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
(5) 하기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리펩티드.
(a) 서열 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(b) 서열 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
(c) 서열 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 부분 서열이 상기 아미노산 서열의 적어도 제34번째 내지 제201번째의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
(d) 서열 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 부분 서열이 (i) 상기 아미노산 서열의 적어도 제34번째 내지 제201번째의 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 해당 부분 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, (iii) 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 것인 폴리펩티드.
상기 폴리펩티드에는 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 폴리(N-비닐-피롤리돈),폴리프로필렌글리콜 호모 중합체, 폴리프로필렌옥시드와 폴리에틸렌옥시드와의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 및 폴리비닐알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질에 의해 수식된 것도 포함된다.
(6) 상기 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는 의약 조성물.
상기 의약 조성물은 생체의 칼슘 대사, 인산 대사, 석회화 또는 비타민 D 대사를 조절하기 위해서 사용할 수 있다. 또한, 상기 의약 조성물은 고인산혈증, 부 갑상선 기능 항진증, 신성 골이영양증, 이소성 석회화, 골다공증 및 고비타민 D 혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환에 효과적이다.
(7) 상기 폴리펩티드 또는 이들의 부분 단편과 반응하는 항체.
상기 항체는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 부분 단편을 항원으로 하여 동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻을 수 있다.
(8) 상기 항체를 유효 성분으로 포함하는 의약 조성물.
상기 의약 조성물은 생체의 칼슘 대사, 인산 대사, 석회화 또는 비타민 D 대사를 조절할 수 있다. 또한, 골질환에 효과적이다. 여기에서, 골질환으로서는 골다공증, 비타민 D 저항성 곱사병, 신성 골이영양증, 투석골증, 저석회화골증, 파제트병 및 종양성 골연화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 들 수 있다.
(9) 상기 항체를 포함하는, 칼슘 대사 이상, 인산 대사 이상, 석회화 이상 및 비타민 D 대사 이상 중 1종 이상의 이상을 유발하는 질환(예를 들면 신부전, 신장성 인산 누출증, 세뇨관성 산증(acidosis) 및 판코니 증후군(Fanconi's syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환)의 진단제.
(10) 상기 항체를 포함하는 골질환의 진단제. 골질환으로서는 골다공증, 비타민 D 저항성 곱사병, 신성 골이영양증, 투석골증, 저석회화골증, 파제트병 및 종양성 골연화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 들 수 있다.
(11) 서열 11로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 또는 그의 부분 단편을 포함하는, 칼슘 대사 이상, 인산 대사 이상, 석회화 이상 및 비타민 D 대사 이상 중 1 종 이상의 이상을 유발하는 질환의 진단제.
부분 단편으로서는 서열 11로 표시되는 염기 서열 중 제498번에서 제12966번까지의 서열을 갖는 것을 들 수 있고, 질환으로서는 상염색체 우성 저인산혈증성 곱사병을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 명세서는 본원 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2000-245144호, 제2000-287684호, 제2000-391077호 및 제2001-121527호의 명세서 및(또는) 도면에 기재된 내용을 포함한다.
본 명세서에 있어서 사용되는 용어에 대하여 하기와 같이 정의한다.
혈중 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도 저하 활성이란, 혈중 활성형 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도를 저하시키는 방향으로 작용하는 활성을 말한다.
저인산혈증 유도 활성이란, 혈중 인산 농도를 저하시키는 방향으로 작용하는 활성을 말한다. 혈중 인산 농도는 (i) 장관으로부터의 흡수와 뇨 및 분으로의 배설, 및 (ii) 체내에서의 세포, 또는 골 조직으로 대표되는 석회화 조직과의 출납으로 규정된다. 따라서, 본 명세서에서 말하는 저인산혈증 유도 활성은, 건강한 생체에 대하여 작용시킨 경우에 있어서 혈중 인산 농도를 저하시키는 활성을 의미하고, 반드시 병적인 저인산혈증을 일으키는 것을 의미하는 것은 아니다. 단위 조직에서는 저인산혈증 유도 활성이 장관에서의 인산 흡수 억제 활성, 신장이나 장관에서의 인산 배설 촉진 활성, 또는 세포내로의 인산 이행 촉진 활성과 동등한 경우가 있다.
또한, 본 발명에 있어서 인산 수송 억제 활성이란, 대상 세포에 작용하여 그 세포막에 존재하는 인산 수송 담체의 활성을 억제하는 것을 의미한다. 주된 대상 세포로서는 신장 세뇨관 상피 세포, 장관 상피 세포 또는 조골 세포를 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 석회화 억제 활성이란 골 조직 및 연 조직에 있어서 칼슘과 인산을 조성물로서 포함하는 결정물을 생성 또는 축적하는 과정을 억제하는 활성을 의미한다.
또한, 생체내 비타민 D 대사 조절 활성이란 생체내에 존재하는 비타민 D 및 그것으로부터 체내에서 합성되는 대사물의 절대량의 변화, 또는 존재 비율의 변화를 조절하는 효력을 말한다. 이들 비타민 D 및 그 대사물의 생체내에서의 조절은, (i) 주로 장관에서의 흡수 또는 배설과, (ii) 신장에서의 재흡수 또는 배설과, (iii) 생체내에서의 비타민 D의 합성과, (iv) 그것에 계속되는 수산화 반응을 중심으로 한 대사적 변환에 의해 규정된다. (iv)의 대사적 변환에 의해 생성된 주된 대사물로서는, 비타민 D-25-히드록실라제에 의해 비타민 D의 25위치가 수산화됨으로써 생성되는 25-히드록시 비타민 D, 25-히드록시 비타민 D-25-1α-히드록실라제에 의해 히드록시 비타민 D의 1α위치가 수산화되어 생성되는 1α,25-디히드록시 비타민 D, 또는 이들의 대사물이 24-히드록실라제에 의해 24위치에 수산기가 도입되어 생성되는 24,25-디히드록시 비타민 D 또는 1α,24,25-트리히드록시 비타민 D가 알려져 있다. 비타민 D 대사 조절 활성은, 이러한 비타민 D 대사물 생성에 관한 효소의 활성 조절, 유전자 발현, 또는 발현 단백질량의 변화를 조절하는 활성으로 나타내는 경우도 있다.
1. 인산 대사, 칼슘 대사, 석회화 및 비타민 D 대사를 조절하는 폴리펩티드를 코딩 하는 DNA
(1) DNA의 클로닝
본 발명의 DNA 중 하나인 서열 1로 표시되는 DNA는, 종양성 골연화증이 의심되는 환자로부터 적출된 종양의 일부로부터 제조된 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 의해서 얻어진 것이다.
그런데, 종양성 골연화증은 종양의 존재에 따라 저인산혈증과 골 조직의 석회화 부전에 의한 골연화증을 나타내는 질환이고, 종양을 제거하면 이들 증상이 소실되는 것을 특징으로 한다. 종양 추출물이 래트에 있어서 뇨중 인산 배설을 촉진하는 것(Popvtzer, M. M. et al., Clinical Research 29:418A, 1981)이나, 적출 종양의 마우스로의 이식 실험에 의해 저인산혈증이 유도되는 것(Miyauchi, A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab, 67:46-53, 1998)이 보고되어 있기 때문에, 종양이 전신성의 미지 인자를 생산하여 분비한다고 생각된다.
본 발명자가 사용한 종양과 관련된 병례에 대해서는, 후꾸모또 에스.(Fukumoto, S.) 등의 문헌[Bone 25:375-377, 1999]에 기재되어 있다. 이 병례는 종양을 수술적으로 적출함으로써 저인산혈증이 현저하게 회복되었다. 또한, 이 병례에서의 종양의 크기는 직경이 약 1 cm 정도로 작은 것이었다. 이러한 작은 조직으로부터 저인산혈증과 전신성 골연화증을 야기하는 활성 물질이 생산 및 분비되었다고 추측되는 것을 고려하여, 본 발명자가 제조한 종양 유래의 cDNA 라이브러리 중에 이러한 병태의 야기에 관련된 활성 물질을 코딩하는 유전자의 적어도 부분적인 단편이 다른 조직에서 유래하는 cDNA 라이브러리에 비해 고빈도로 포함되어 있다고 예상하였다. 따라서, 이 종양 유래의 활성 물질을 코딩하는 유전자의 단편 서열을 동정하는 것을 목표로 하여, 본 종양 cDNA 라이브러리에 특이적으로 많이 포함되어 있는 cDNA 단편을 차등 스크리닝(differential screening)법으로 추출하였다.
다음으로, 얻어진 cDNA 단편의 염기 서열을 동정하여 상호 비교하고, 염기 서열의 중복을 토대로 동일 유전자에서 유래한다고 생각되는 서열은 콘티그(contig)를 제작하여 분류하였다. 이와 같이 하여 얻어진 염기 서열에 대하여 미국 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(이하, 「NCBI」라고 함)이 제공하는 데이타베이스인 젠뱅크(Genbank)에 등록되어 있는 염기 서열과 상동성 검색을 실시하였다. 이러한 방법으로 본 종양 cDNA 라이브러리에 특이적으로 많이 포함되는 염기 서열로서, 서열 1로 표시되는 염기 서열의 염기 번호 1522번에서 2770번까지의 서열을 얻었다. 이 서열은 젠뱅크에 승인 번호 AC008012로 등록되어 있는 인간 12p13 BAC RPCI11-388F6 서열의 일부와 일치하였다. 이 등록 서열은 인간 염색체 서열의 12p13 영역의 부분 서열을 나타낸다고 생각되는 것이었다. 이 등록 서열내의 추정되는 유전자의 위치는 염기 서열 정보와 함께 명기되어 있지만, 서열 1로 표시되는 염기 서열의 염기 번호 1522번에서 2770번까지의 서열, 및 본 발명의 서열 1로 표시되는 염기 서열은 추정 유전자 부위로서 명기되어 있지 않다.
다음으로, 이 서열 1로 표시되는 염기 서열의 염기 번호 1522번에서 2770번까지의 염기 서열을 토대로 프로브 및 PCR용 프라이머를 설계하고, 본 종양 cDNA 라이브러리에 포함되는 연속된 염기 서열을 단리 및 동정하여 본 발명의 서열 1로 표시되는 염기 서열을 얻었다. 서열 1의 염기 서열은, 본 발명의 서열 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 분비 시그널을 갖는다고 추정되는 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(이하 「ORF」라고 함)을 가지고 있었다. 이 폴리펩티드의 아미노산 서열은 젠뱅크의 아미노산 서열 데이타베이스에 등록되어 있지 않은 것이므로 신규의 서열을 갖는 폴리펩티드라고 생각하였다. 또한, 본 발명자는 서열 1로 표시되는 염기 서열과 서열 2로 표시되는 아미노산 서열을 사용하여 검색한 결과, 이 분자의 마우스 오르토로그(mouse orthologs)라고 생각되는 서열 9로 표시되는 염기 서열과 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 동정하였다. 후술하는 바와 같이, 인간의 아미노산 서열에 따라서 제조된 재조합체 단백질이 마우스에서 활성을 나타내는 것으로부터, 서열 2로 표시되는 아미노산 서열과 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열 또는 마우스 전장 서열(Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 277(2), 494-498)과의 비교에 의해, 양자에서 보존되고 있는 아미노산 이외의 아미노산을 치환한 단백질이 본 발명의 폴리펩티드와 동등 또는 동종의 생물 활성을 갖는 것을 본 발명에 의해 쉽게 추측할 수 있게 되었다.
(2) 염기 서열의 결정
상기 (1)과 같이 하여 얻어진 DNA에 대하여 염기 서열을 결정한다. 염기 서열의 결정은 맥삼-길버트(Maxam-Gibert)의 화학 수식법, 또는 M13 파지를 이용하는 디데옥시 뉴클레오티드 쇄종결법 등의 공지된 방법에 의해 수행할 수 있지만, 통상은 자동 염기 서열 결정기(예를 들면, PERKIN-ELMER사 제조 373A DNA 시퀀서 등) 을 이용하여 서열 결정이 수행된다.
서열 1에 본 발명의 DNA의 염기 서열을, 서열 2에 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 예시하지만, 이 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 한, 상기 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 수개의 아미노산에 결실, 치환, 부가 등의 변이가 생길 수도 있다.
예를 들면, 서열 2로 표시되는 아미노산 서열로부터 1 또는 수개, 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이 결실될 수도 있고, 서열 2로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 수개, 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이 부가될 수도 있고, 또는 서열 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 수개, 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수도 있다.
또한, 치환 방법으로서는, 아미노산의 특성을 어느 정도 유지한 패밀리내에서의 보존적 치환을 수행할 수도 있다. 아미노산 측쇄의 특성으로부터 일반적으로 분류되는 패밀리는 이하의 것을 들 수 있다.
(i) 산성 아미노산 패밀리: 아스파라긴산, 글루탐산
(ii) 염기성 아미노산 패밀리: 리신, 아르기닌, 히스티딘
(iii) 비극성 아미노산 패밀리: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판
(iv) 비대전극성 아미노산 패밀리: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테 인, 세린, 트레오닌, 티로신
(v) 지방족 히드록시아미노산 패밀리: 세린, 트레오닌
(vi) 아미드 함유 아미노산 패밀리: 아스파라긴, 글루타민
(vii) 지방족 아미노산: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신
(viii) 방향족 아미노산 패밀리: 페닐알라닌, 트립토판, 티로신
(ix) 소수성 아미노산 패밀리: 류신, 이소류신, 발린
(x) 소형 아미노산 패밀리: 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글리신
치환의 예로서, 서열 2에 있어서 176번째의 Arg 및(또는) 179번째의 Arg을, 다른 아미노산, 바람직하게는 Ala, Gln 또는 Trp으로 치환하여 절단이 저해 또는 억제된 것을 들 수 있다. 또한, 서열 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, N 말단측, C 말단측 또는 양측의 아미노산이 10개 이상 결실된 것(말단 결실형)도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다. 말단 결실형의 예로서, 서열 2에 있어서 C 말단측의 20, 40, 45 또는 50개의 아미노산이 결실된 것, 및(또는) N 말단측 24 또는 33개의 아미노산이 결실된 것을 들 수 있다. 말단 결실형의 형태를 하기에 나타낸다.
N 말단측의 아미노산 결실수 C 말단측의 아미노산 결실수 서열 2로 표시되는 아미노산 서열의 위치(서열 1의 염기 번호)
N 말단측 33개 결실 없음 34-251(232-885)
N 말단측 33개 C 말단측 20개 34-231(232-825)
N 말단측 33개 C 말단측 40개 34-211(232-765)
N 말단측 33개 C 말단측 45개 34-206(232-750)
N 말단측 33개 C 말단측 50개 34-201(232-735)
N 말단측 24개 결실 없음 25-251(205-885) (서열 3의 제1번째 내지 제681번째, 서열 4에 상당)
N 말단측 24개 C 말단측 20개 25-231(205-825)
N 말단측 24개 C 말단측 40개 25-211(205-765)
N 말단측 24개 C 말단측 45개 25-206(205-750)
N 말단측 24개 C 말단측 50개 25-201(205-735)
결실 없음 C 말단측 20개 1-231(133-825)
결실 없음 C 말단측 40개 1-211(133-765)
결실 없음 C 말단측 45개 1-206(133-750)
결실 없음 C 말단측 50개 1-201(133-735)

본 발명에 있어서는, 상기 서열 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 단편(말단 결실형 부분 단편) 외에, 이들 말단 결실형 폴리펩티드에 있어서 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 변이 단편도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다. 여기에서, 상기 일람표에 있어서 서열 2로 표시되는 아미노산의 위치 번호의 뒤에 붙은 괄호내의 숫자는, 서열 1로 표시되는 염기 서열의 염기의 위치 번호이고, 이들 위치로 표시되는 염기 서열로 이루어진 DNA, 또는 이들 DNA와 엄격한 조건에서 혼성화되는 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 적어도 일부에 변이를 도입하기 위해서는, 상기 아미노산을 코딩하는 DNA의 염기 서열에 변이를 도입하는 방법이 채용된다.
DNA에 변이를 도입하기 위해서는, 쿤켈(Kunkel)법 또는 갭 듀플렉스(Gapped duplex)법 등의 공지된 방법 또는 이에 준하는 방법을 수행할 수 있다. 예를 들 면, 변이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용한 부위 특이적 돌연변이 유발법에 기초하여 변이를 도입하지만, 변이 도입용 키트(예를 들면 Mutan-K(TAKARA사 제조), Mutan-G(TAKARA사 제조), TAKARA사의 LA PCR 시험관내 돌연변이 유발 시리즈 키트 등)을 사용하여 변이를 도입할 수도 있다.
또한, 상기 본 발명의 DNA(서열 1, 3, 5, 7, 9)로부터 제조되는 프로프와 엄격한 조건하에서 혼성화되며, 저인산혈증 유도 활성, 인수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다. 프로브란 서열 1, 3, 5, 7 또는 9로 표시되는 서열 전장 또는 길이가 17 염기 이상의 연속되는 서열(부분 서열)에 대하여 상보 서열을 갖는 것을 말한다.
여기에서, 엄격한 조건이란 나트륨 농도가 750 mM 이상, 바람직하게는 900 mM 이상이고, 온도가 40 ℃ 이상, 바람직하게는 42 ℃의 조건을 만족시키는 것을 말한다. 구체적으로는 6×SSC, 5×덴하르트, 0.5 ％ SDS, 50 ％ 포름아미드, 42 ℃의 조건을 말한다. 또한, 6×SSC란 900 mM NaCl, 90 mM 시트르산나트륨을 의미한다. 덴하르트 용액이란 BSA(소혈청 알부민), 폴리비닐피롤리돈 및 피콜(Ficoll) 400을 포함하는 용액이고, 50×덴하르트는 1 ％ BSA, 1 ％ 폴리비닐피롤리돈, 1 ％ 피콜 400의 조성으로 이루어진다(5×덴하르트는 50×덴하르트의 10분의 1의 농도를 의미한다).
일단 본 발명의 DNA의 염기 서열이 결정되면, 그 후는 화학 합성에 의해 또는 결정된 상기 염기 서열로부터 합성된 프라이머를 이용한 PCR에 의해서, 본 발명 의 DNA를 얻을 수 있다.
2. 본 발명의 DNA를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조
(1) 재조합 벡터의 제조
본 발명의 재조합 벡터는 적당한 벡터에 본 발명의 DNA를 연결(삽입)함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 DNA를 삽입하기 위한 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 플라스미드 DNA, 파지 DNA 등을 들 수 있다.
플라스미드 DNA로서는 대장균 유래의 플라스미드(예를 들면 pBR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 고초균 유래의 플라스미드(예를 들면 pUB110, pTP5 등), 효모 유래의 플라스미드(예를 들면 YEp13, YEp24, YCp50 등) 등을 들 수 있고, 파지 DNA로서는 λ 파지 등을 들 수 있다. 또한, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스 등의 동물 바이러스, 또는 배큘로바이러스 등의 곤충 바이러스 벡터를 사용할 수도 있다. 또한, GST, His-태그 등이 연결된 융합 플라스미드를 사용할 수도 있다.
벡터에 본 발명의 DNA를 삽입하기 위해서는, 우선 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하고, 적당한 벡터 DNA의 제한 효소 부위 또는 멀티 클로닝 사이트에 삽입하여 벡터에 연결하는 방법 등이 사용된다.
본 발명의 DNA는 그 DNA의 기능이 발휘되도록 벡터에 삽입되는 것이 필요하다. 그래서, 본 발명의 벡터에는 프로모터, 본 발명의 DNA 이외에, 목적에 따라서 인핸서 등의 시스-작용인자, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 마커, 리보솜 결합 서열(SD 서열) 등을 연결할 수 있다. 또한, 선택 마커로서는, 예를 들면 디히드로 엽산 환원 효소 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.
(2) 형질전환체의 제조
본 발명의 형질전환체는 본 발명의 재조합 벡터를, 목적 유전자가 발현될 수 있도록 숙주 중에 도입함으로써 얻을 수 있다. 여기에서, 숙주로서는 본 발명의 DNA를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) 등의 에쉐리키아속, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 바실러스속, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등의 슈도모나스속에 속하는 세균, 또는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 등의 효모를 들 수 있다. 또한, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포 등의 동물 세포나 Sf9, Sf21 등의 곤충 세포를 이용할 수도 있다.
대장균 등의 세균을 숙주로 하는 경우에는, 본 발명의 재조합 벡터가 상기 세균 안에서 자율 복제 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 본 발명의 DNA, 전사 종결 서열에 의해 구성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있을 수도 있다. 대장균으로서는, 예를 들면 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli), JM109, HB101 등을 들 수 있고, 고초균으로서는, 예를 들면 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 프로모터는 대장균 등의 숙주 안에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있다. 예를 들면 trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균 유래 프로모터, 또는 파지에서 유래하는 T7 프로모터 등이 이용된다. tac 프로모터 등과 같이, 인위적으로 설계 개변(改變)된 프로모터를 이용할 수도 있다. 세균으로의 재조합 벡터의 도입 방법은 세균에 DNA를 도입하는 방법이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 칼슘 이온을 이용하는 방법, 전기천공법 등을 들 수 있다.
효모를 숙주로 하는 경우에는, 예를 들면 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 등을 이용할 수 있다. 이 경우, 프로모터로서는 효모 안에서 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 gal1 프로모터, gal10 프로모터, 열충격 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, AOX1 프로모터 등을 들 수 있다. 효모로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 전기천공법, 스페로플라스트(spheroplast)법, 아세트산 리튬법 등을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로 하는 경우에는, 원숭이 세포 COS-7, Vero, 챠이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 마우스 L 세포, 래트 GH3 세포, 또는 인간 FL, HEK293, HeLa 또는 Jurkat 세포 등이 이용된다. 프로모터로서 SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, β-액틴 프로모터 등이 이용되고, 또한 사람 사이토메갈로 바이러스의 초기 유전자 프로모터 등을 이용할 수도 있다. 동물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들면 전기천공법, 인산 칼슘법, 리포펙션법 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로 하는 경우에는 Sf9 세포, Sf21 세포 등이 이용된다. 곤충 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들면 인산 칼슘법, 리포펙션법, 전기천공법 등이 이용된다.
3. 저인산혈증 유도 활성을 갖는 폴리펩티드
지금까지 종양성 골연화증에서의 저인산혈증 유도 활성을 갖는 종양 생산 인자를 단리 동정하는 시도가 몇번 행해져 왔다. 그리고, 본 발명의 폴리펩티드는 종양성 골연화증의 종양이 생산하는 신규 분비 인자라는 특징을 갖는 것이 분명해졌다. 이 저인산혈증을 유도하는 인자의 추정되는 생물 활성으로서는 하기의 보고가 되어 있다.
인산의 뇨중으로의 배설 촉진 작용:
아쉰버그, 엘. 씨.(Aschinberg, L. C.) 등의 문헌[Journal of Pediatrics 91:56-60,1977], 라우, 케이.(Lau, K.) 등의 문헌[Clinical Research 27:421A, 1979], 미야우치, 에이.(Miyauchi, A.) 등의 문헌[J. Clin. Endocrinol. Metab. 67:46-53,1988)]
신장 세뇨관 상피 세포의 인산 수송 활성의 억제:
카이, 큐(Cai, Q.) 등의 문헌[N. Engl. J. Med. 330:1645-1649, 1994], 윌킨스, 쥐. 이.(Wilkins, G. E.) 등의 문헌[J. Clin. Endocrinol. Metab, 80:1628-1634, 1995], 로우, 피. 에스. 엔.(Rowe, P. S. N.) 등의 문헌[Bone 18:159-169, 1996]
25-히드록시 비타민 D-1α-히드록실라제 활성의 억제:
미야우치, 에이. 등의 문헌[J. Clin. Endocrinol. Metab. 67:46-53,1988]
특히, 신장에서의 인산 재흡수를 억제하는 활성을 직접 갖는 미지의 분자를「포스파토닌」이라고 부르는 것이 제창되어 있다(Econs, M. J. & Drezner, M. K., N. Engl. J. Med. 330:1679-1681, 1994). 이러한 생물 활성을 갖는 미지 인자의 존재가 XLH에서도 시사되어 있다. XLH 환자의 임상 소견은 종양성 골연화증 환자와 공통되어 뇨중 인산 배설이 항진된 저인산혈증을 특징으로 하고, 골 조직의 석회화부전에 의한 골연화증이나 곱사병을 나타낸다. XLH의 책임 유전자는 PHEX라는 엔도펩티다제형 단백질을 코딩하는 유전자인 것이 분명해졌다. 자연 변이 마우스인 Hyp 마우스는 XLH와 동일한 표현 형질을 나타내는 것으로 알려져 있었지만, 최근 이 마우스에서 PHEX를 코딩하는 유전자가 부분 결실되어 있다고 밝혀졌고, Hyp 마우스는 XLH의 모델로서의 타당성이 표명되었다(Strom, T. M. et al. Human Molecular Genetics 6:165-171, 1997). Hyp 마우스에서의 저인산혈증 유도 인자가 액성 인자인 것은 Hyp 마우스와 정상 마우스와의 병체 유합 실험에 의해 분명해졌다(Meyer, R. A. et al. J. Bone Miner. Res. 4:493-500, 1989). 이 실험에 있어서 정상 마우스의 혈중 인산 농도가 저하되고, 뇨중 인산 배설이 증가된 것으로부터, Hyp 마우스에 존재하는 체액성 저인산혈증 유도 인자가 정상 마우스에게 작용한 것으로 생각된다. 지금까지는, 펩티드의 절단 활성을 추측할 수 있는 PHEX와 이 미지의 저인산혈증 유도 인자와의 관련성은 밝혀지지 않았지만, PHEX가 미지의 저인산혈증 유도 인자의 활성 제어의 관계나, 종양성 골연화증에서의 저인산혈증 유도 인자와 XLH에서 확인되는 저인산혈증 유도 인자가 동일한 가능성에 대한 가설이 제창되어 있다(Drezner, M. K. Kidney Int. 57:9-18, 2000). 이 가설에 의하면, PHEX 및 저인산혈증 유도 인자가 정상으로는 동일한 세포에서 발현되고, PHEX가 저인산혈증 유도 인자에 대하여 억제적으로 작용한다. XLH 환자에 있어서는, PHEX의 기능이 저하 또는 소실되어 있기 때문에, 저인산혈증 유도 인자의 활성이 강하게 나타난다. 종양성 골연화증에 있어서는, PHEX 및 저인산혈증 유도 인자 양방이 상승하고 있지만, 결과적으로 활성형 저인산혈증 유도 인자가 양적으로 정상치보다 증가한다고 가정한다. 또한, 이 저인산혈증 유도 인자는, 신장에서의 인산 수송 담체 중 하나인 NPT2의 인산 수송 활성에 대하여 억제적으로 작용한다고 가정한다. 이러한 미지의 저인산혈증 유도 인자를 탐색하는 시도도 많이 이루어지고 있지만, 지금까지 분자의 동정에는 이르지 못하였다. 카이(Cai) 등의 연구에 의하면, 저인산혈증 유도 인자는, 분자량이 8 kDa에서 25 kDa 사이에 있다고 추측되지만(Cai, Q. et al., N. Engl. J. Med. 330:1645-1649, 1994), 로우(Rowe) 등은 후보 분자로서 56 kDa와 58 kDa의 단백질을 들고 있다. 최근, 로우 등은 WO99/60017에 430 잔기의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 종양성 골연화증의 종양 유래의 인산 대사 조절 인자로서 출원하고 있지만, 여기에서 개시되는 폴리펩티드는 원래 존재하는 단백질의 부분 서열이고, 저인산혈증 유도 활성에 관련된 생물학적 활성은 개시되어 있지 않다. 최근, MEPE라는 명칭으로 이 특허에 개시되었던 분자의 전장에 상당하는 폴리펩티드가 보고되었지만, 역시 저인산혈증을 유도하는 것과 같은 활성에 대해서는 개시되어 있지 않다(Rowe, P. S. N. et al, Genomics 67:54- 68, 2000). 또한, 이 분자와 본 발명의 폴리펩티드 사이에 서열상, 구조상 유사성은 확인되지 않는다.
상술한 바와 같이, 저인산혈증을 유도하는 활성을 갖는 생리 활성 인자의 존재가 추정되고 있지만, 지금까지 그 실체는 분명하지 않았다. 본 발명은 그 폴리펩티드로서의 실체를 밝히고, 그것을 코딩하는 유전자 서열을 밝혔다. 그리고, 이하에 기재된 바와 같이, 발명의 폴리펩티드를 생산하고, 그 생산물이 인산 대사, 칼슘 대사, 비타민 D 대사 또는 석회화와 골격 형성에 조절 인자로서 작용하여 의약 조성물로서 유용한 것을 밝혔다. 또한, 본 발명의 항체가 치료 뿐만 아니라 임상 검사, 진단에 유용한 것을 밝혔다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 유전병 진단이나 인산 대사, 칼슘 대사, 골 대사의 다형 진단에 유용한 것을 밝혔다.
본 발명의 저인산혈증 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는, 예를 들면 서열 1로 표시되는 염기 서열의 염기 번호 133번 내지 885번을 포함하는 서열을, 발현가능한 형태로 적당한 숙주 세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하고, 상기 형질전환 세포에 도입한 DNA를 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 이와 같이 생산된 폴리펩티드는, 숙주가 갖는 단백질 수식 기구에 의해 절단이나 당쇄 부가 등의 폴리펩티드쇄의 개변을 받는 경우가 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 상기 형질전환체를 배양하고 그 배양물로부터 채취함으로써 얻을 수 있다. 「배양물」이란, 배양 상청 외에 배양 세포 또는 배양균체, 또는 세포 또는 균체의 파쇄물 중 어느 하나를 의미하는 것이다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라서 행해진다.
대장균이나 효모균 등의 미생물을 숙주로서 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지는, 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하여 형질전환체의 배양을 효율적으로 수행할 수 있는 배지라면, 천연 배지와 합성 배지 중 어떤 것을 이용해도 좋다. 탄소원으로서는 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 전분 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류를 들 수 있다. 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염 또는 그 밖의 질소 포함 화합물 이외에 펩톤, 고기 추출물, 옥수수 전분 침출폐액(corn steep liquor) 등을 들 수 있다. 무기물로서는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 들 수 있다.
배양은 통상 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에 37 ℃에서 4 내지 48 시간 수행한다. 배양 기간 중 pH는 6.0 내지 8.0으로 유지한다. pH의 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 사용하여 수행한다. 배양 중에 필요에 따라서 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수도 있다.
프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우에는, 필요에 따라서 유도물질을 배지에 첨가할 수도 있다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도 가능한 T7 프로모터를 갖 는 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 IPTG 등을 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 인돌아크릴산(IAA)으로 유도 가능한 trp 프로모터를 이용한 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 IAA 등을 배지에 첨가할 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되는 RPMI1640 배지, DMEM 배지 또는 이들 배지에 소태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은 통상 5 ％ CO2 존재하에 37 ℃에서 1 내지 10일 수행한다. 배양 중에 필요에 따라서 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수도 있다. 배양 후, 본 발명의 폴리펩티드가 균체내 또는 세포내에서 생산되는 경우에는 초음파 처리, 동결 융해의 반복, 균질기 처리 등을 실시하여 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 목적하는 폴리펩티드를 채취한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드가 균체외 또는 세포외에서 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 단백질의 단리 및 정제에 이용되는 일반적인 생화학적 방법, 예를 들면 황산암모늄 침전, 겔 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 이용함으로써, 상기 배양물 중에서 본 발명의 폴리펩티드를 단리 및 정제할 수 있다.
상술된 바와 같이 XLH에 있어서 엔도펩티다제라고 생각할 수 있는 PHEX가 저인산혈증 유도 인자의 조절에 중요한 의의를 갖는 것을 생각하면, 본 발명의 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 더욱 수식, 절단되어 활성을 변화시키는 것도 생각할 수 있다. 본 발명에 있어서 CH0 ras-클론 1 세포를 숙주로서 이용하고, 발명의 폴리펩티드쇄의 C 말단에 His 6개를 연속하여 부여한 재조합체를 생산하는 클론화된 세포주를 제조하였다. 이 세포주는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라끼껭 쯔구바시 히가시 1쪼메 1반지 주오 다이 6)에 기탁하였다(수탁 번호 FERM BP-7273, 원기탁일 평성 12년 8월 11일).
이 세포주에서 본 발명의 폴리펩티드를 생산하고, 배양액에 분비된 폴리펩티드를 조사한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 크기가 다른 유전자 산물이 His-태그를 인식하는 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 검출되었다. 각각의 밴드에 상당하는 단백질을 단리하여 N 말단 아미노산 서열분석을 실시한 바, 각각 서열 4와 서열 8로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단측의 서열과 일치하였다. 전자는 시그널 서열이 제거된 후의 단백질이라고 생각되고, 후자는 엔도펩티다제 등의 효소에 의해 절단된 것으로 생각된다.
그런데, RXXR을 인식하는 단백질 분해 효소 중 하나로서 푸린(furin)이 알려져 있고, 실제로 푸린 결손 세포주에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킨 결과 단편은 검출되지 않았다. 또한, 푸린 저해 활성을 갖는 재조합체 단백질 α1-PDX를 본 발명의 폴리펩티드와 함께 발현시킨 결과, 상청 중의 절단 단편이 현저히 감소하였다.
따라서, 배양시에 푸린 결손 세포를 이용하는 것을 포함하거나, 또는 푸린 활성을 억제하는 물질을 공존시키는 것을 포함하는, 본원 폴리펩티드의 생산 방법도 본 발명에 포함된다.
카이 등은 종양성 골연화증의 종양 유래 세포를 배양한 배양 상청 중의 인 수송 억제 활성이, 투석막에 의한 분획화 방법에서 8 kDa 내지 25 kDa의 분자량 범위에 있음을 시사하고 있다. 본 발명의 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 서열 2의 잔기 번호 179번의 Arg와 180번의 Ser 사이에서 절단된 폴리펩티드로 변환됨으로써 그의 활성을 변화시킨다고도 생각할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 표 2(실시예 7)에 나타낸 바와 같이, 저인산혈증 유도 활성 중 하나의 작용 형태인 신장 근위 세뇨관 상피 세포의 인산 수송 활성을 억제하는 활성을 갖는다. 혈중에 존재하는 유리형 무기 인산의 대부분은 신장의 사구체에서 여과되지만, 그 중 80 내지 90 ％ 정도가 신장 근위 세뇨관으로 재흡수된다.
이 재흡수는 근위 세뇨관의 관강측에 존재하는 II형 Na 의존성 인산 수송체(transporter)에 의한 인산 수송에 의해 행해진다. 본 발명의 폴리펩티드가 인산 수송 활성을 억제하는 활성을 갖는다는 것은, 생체에서 인산의 뇨중 배설을 촉진하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 신장에서의 인산 재흡수의 억제, 특히 신장 근위 세뇨관 세포의 인산 수송을 억제하는 활성에 의해 저인산혈증을 유도한다고 생각할 수 있으므로, 상기 포스파토닌과 동일한 물질인 것으로 추정된다.
최근, 장관에서의 Na 의존성 인산 수송체가 동정되고, 이 수송체는 신장에 존재하는 II형의 Na 의존성 인산 수송체와 상동성이 높기 때문에 IIb형으로 명명되었다. 장관의 관강측에 존재하는 이 IIb형 Na 의존성 인산 수송체의 억제도, 신장 의 II형 Na 의존성 인산 수송체와 동일하게 본 발명의 폴리펩티드가 담당하는 것으로 생각된다. 이것도 저인산혈증 유도 활성 중 하나의 작용 형태로 생각할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생체 내에서의 활성은, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 상기 재조합체 세포를 누드 마우스의 피하에 이식하는 실험에 의해 평가하였다.
본 시험에 있어서 이식된 세포는, 누드 마우스의 피하에서 증식하여 종양을 형성한다. 이에 따라 세포가 생산되고, 분비되는 본 발명의 폴리펩티드는 마우스의 체액 중에 방출되는 것을 특징으로 하고, 상기 방출에 의해 종양성 골연화증을 모델화할 수 있다. 이 모델 실험에 있어서, 표 4(실시예 11)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포를 이식한 마우스는 본 발명의 DNA를 도입하지 않은 대조군 CHO 세포를 이식하여 종양을 형성시킨 개체, 또는 종양을 형성하지 않은 개체와 비교하여 분명한 저인산혈증을 나타내었다. 이로부터, 본 발명의 폴리펩티드는 저인산혈증 유도 활성을 가지고 있는 것이 밝혀졌다. 또한, 인산의 재흡수율도 저하되어 신장에서의 인산의 재흡수가 억제되는 것도 분명해졌다. 이로부터, 본 발명의 폴리펩티드는 종양성 골연화증에서의 저인산혈증 유도 인자라고 생각되었다.
한편, 상기 모델 실험에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 재조합체 세포를 이식한 마우스에서는 저칼슘혈증이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 저칼슘혈증 유도 인자인 것도 분명해졌다. 실시예 16에 기재된 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 CHO 세포의 누드 마우스로의 이식 시험에 있어서, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도의 지속적인 감소가 확실하였다. 또한, 실시예 19, 20에 기재된 대로, 변이 도입 폴리펩티드 또는 야생형 전장 폴리펩티드를 정상 마우스에 3회 투여함으로써 모두 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도를 감소시키는 것이 분명해졌다. 또한, 실시예 24에 기재된 대로, 본 발명의 폴리펩티드를 1회 투여한 후, 수시간 이내에 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도의 감소를 확인한 것으로부터, 이 저하 활성은 본 발명의 폴리펩티드의 주된 생리 작용 중 하나라고 생각된다.
상술한 바와 같이, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도는 1α위치 히드록실라제 및 24위치 히드록실라제에 의해 규정되어 있다. 실시예 16에 기재된 대로, 본 발명의 폴리펩티드의 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도 저하 작용은, 이들 대사 효소의 발현 변동에서 수반된 것이 분명해졌다. 또한, 실시예 24에 기재된 대로, 본 발명의 폴리펩티드를 투여 후 1 시간째에 있어서, 활성형 비타민 D 합성 효소인 1α위치 히드록실라제 유전자 전사 산물의 감소, 및 대사 효소인 24위치 히드록실라제 유전자 전사 산물의 항진을 확인하였다. 이 발현 변동 후, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도가 저하되어 가는 것으로부터, 본 발명의 폴리펩티드에 의한 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도 저하 작용은 적어도 1α위치 히드록실라제 유전자의 발현 억제 및 24위치 히드록실라제 유전자의 발현 항진이 원인인 것으로 시사되었다.
한편, 실시예 11에 기재된 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 CH0세포의 누드 마우스로의 장기간 이식 시험(이식 후 44 내지 46일째)에 있어서, 1α위치 히드록실라제 유전자의 발현은 상승되고 있었다. 이 시점에서의 마우스 혈청 중 PTH 농도는 대조군에 비하여 유의하게 상승한 것이 판명되어, 고수준의 PTH 작용에 의한 1α위치 히드록실라제 유전자의 발현 항진이 일어나는 것으로 추측된다. 그러나 흥미롭게도, PTH 존재하에서도 24위치 히드록실라제 유전자의 발현은 여전히 항진된 상태인 것으로부터, 본 발명의 폴리펩티드에 의한 24위치 히드록실라제 유전자의 발현 제어에는 PTH의 간섭이 미치지 않고 있음을 알았다. 실시예 11에 기재된 대로, 본 마우스는 심한 저인산혈증 및 곱사병 양상의 소견을 보이고 있었음에도 불구하고, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D3 농도가 상승하지 않은 원인으로서, 본 발명의 폴리펩티드에 의한 지속적인 24위치 히드록실라제 유전자의 발현 항진이 영향을 준 것으로 시사되었다.
에이. 나이키아어(A. Nykjaer) 등에 의해서 25-히드록시 비타민 D는 신장 근위 세뇨관에서 재흡수를 받는 것이 확실해졌다(Cell. Vol. 96, p507-515, 1999). 본 명세서에 기재되지 있지 않지만, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 CH0 세포의 누드 마우스로의 이식 시험에 있어서, 25-히드록시 비타민 D의 혈청농도에 현저한 변화는 확인되지 않았다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드의 작용에 의해 나트륨, 칼륨, 클로라이드 등의 주요 전해질, 주요 아미노산 또는 글루코스의 분획 배설(뇨중 농도/혈청 농도/GFR로 산출됨)에 대한 영향이 확인되지 않았던 것으로부터도, 세뇨관 재흡수 기능이 손상되지 않았음을 지지한다 (T. Shimada et al., Proc. Natl. Acad. Sci, in press). 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 25-히드록시 비타민 D의 세뇨관에서의 재흡수 저해 결과, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도 저하를 일으키지 않고 1α,25-디히드록시 비타민 D의 합성 경로에 특이적으로 작용하고 있음이 시사되었다.
종양성 골연화증에 있어서, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도는 현저하게 저하된다고 알려져 있다. 또한, 저인산혈증성 비타민 D 저항성 곱사병(XLH) 또는 그 병태 모델 마우스인 Hyp에서는 심한 혈청 인산 농도 저하에도 불구하고 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도는 정상 범위 또는 그의 약간 하한 범위이다. 또한, Hyp 마우스에서 24위치 히드록실라제 유전자의 발현은 항진된다고 알려져 있다. 이들 저인산혈증을 나타내는 병태에서는, 원래 혈청 인산 농도의 저하에 따라, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도를 상승시키기 위해 상기 1α위치 히드록실라제 유전자의 상승이 야기되겠지만, 그 제어 시스템 중 어느 하나가 손상되어 있어 정상적인 생리 반응을 할 수 없는 것이 병태의 원인 중 적어도 하나라고 생각된다. 이들 현상은 실시예 11, 19 또는 20에 기재된 마우스에서의 생리 반응과 유사하고, 본 발명의 폴리펩티드가 상술한 병태에 있어서 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D3 농도를 저하시키도록 기능하는 것이 강하게 시사된다.
본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 재조합체 세포를 이식한 마우스의 골 조직에서의 석회화 정도는, 대조군에 비하여 현저히 저하되는 것이 도 5에 나타내는 X선상으로부터 분명하다. 흉곽의 변형 등, 골격 형성에 대한 작용도 확인되었다.
즉, 본 발명의 폴리펩티드는 골 조직의 석회화의 억제 작용, 또는 골 조직으 로부터의 칼슘 및 인산의 동원을 촉진하는 작용을 갖는다고 생각할 수 있다. 이 석회화의 저하는, 혈중 인산과 칼슘 양자가 현저히 감소하였기 때문에 이차적으로 골 조직의 석회화가 억제되었다고 생각할 수도 있다.
Hyp 마우스에 있어서는, 신장의 근위 세뇨관에서의 인산 수송 활성을 억제하는 인자를 골 유래 세포가 생산한다고 생각된다(Lajeunesse, D. et al. Kidney Int. 50:1531-1538, 1996). 또한, Hyp 마우스의 조골 세포가 석회화 억제 인자를 방출한다고 보고되어 있다(Xiao, Z. S., Am. J. Physiol., E700-E708, 1998). 상술한 바와 같이, XLH와 종양성 골연화증에서는 저인산혈증과 골 조직의 석회화 부전이라는 임상 소견이 흡사하다는 것과, 이들이 단일 액성 인자에 의해 유도될 가능성이 높은 것을 생각하면, 이 Hyp 마우스 연구에서 보고된 신장의 인산 수송 억제 활성과 골석회화 억제 활성은 동일한 인자에 의해 야기되었을 가능성이 있다. 또한, Hyp 마우스의 조골 세포는, 칼슘과 인산이 정상 범위에 있는 상황에서도 골 형성의 이상을 나타낸다고 보고되어 있다(Ecarot, B. et al., J. Bone Miner. Res. 7:215-220, 1992). 본 발명의 폴리펩티드는 상기 Hyp 마우스에서 추측되는 인자와 동일한 활성을 가지고, 저인산혈증 유도 활성 이외에 칼슘이나 인산 대사를 통하지 않고 직접 골 조직의 석회화를 조절하는 작용을 갖는다고 생각된다.
본 발명을 완성시키는 과정에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 함께, 실시예 3의 표 1에 나타낸 바와 같이 덴틴(dentin) 매트릭스 단백질-1(DMP-1)이 취득되었다. 이 유전자는 치아의 상아질로서 많이 발현되고, 코딩되는 단백질은 상아질의 세포외 기질 단백질로서 상아질의 석회화 기질 형성에 중요한 역할 을 담당한다고 생각된다. 동일하게 매트릭스 세포외 인산화 단백질(MEPE)을 코딩하는 유전자를 OST190으로 취득하였다. 이 분자의 상세한 기능은 알려져 있지 않다. 또한, 동일한 오스테오폰틴을 코딩하는 유전자도 얻을 수 있다. MEPE, DMP-1, 오스테오폰틴은 RGD 모티프 서열을 갖는 인산화 단백질인 점에서 공통되고, 인산화될 수 있는 세린, 트레오닌이 풍부하고, 또한 산성 아미노산인 글루탐산이나 아스파라긴산의 함유율도 높으며, 강한 산성 단백질의 성질을 나타내는 특징을 갖는다. MEPE와 DMP-1 사이에서는 ASARM 서열로 명명된 특징적인 산성 영역이 보존되어 있고(Rowe, P. S. N. et al, Genomics 67:54-68, 2000), 양자의 생리적 또는 기능적 의의의 유사성이 시사되어 있다. 이러한 특징적인 단백질의 기능 중 하나로서, 석회화의 개시에서의 무기 칼슘염이나 인산염과의 상호 작용을 생각할 수 있다. 오스테오폰틴의 유전자 발현은 조골 세포 및 파골 세포 뿐만 아니라, 대식세포 등에서 폭넓게 보고되어 있다. 한편, DMP-1에 관해서는 최근 골 조직에서의 발현, 특히 골 세포에서의 발현이 보고되어 있다. MEPE의 유전자 발현은 골수 조직에서의 발현이나 SaOS-2라고 하는 골육종 세포에서의 발현이 알려져 있다. 이러한 석회화 조직에서 확인되는 산성 매트릭스 단백질이 본 발명의 과정에서 본 발명의 폴리펩티드와 함께 발견된 것은, 본 발명의 폴리펩티드가 갖는 작용 양식의 일면을 보인 것으로 생각된다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드가 상기 분자로 대표되는 석회화 조직에 특징적인 분자의 발현을 유도하고, 석회화나 칼슘 대사나 인 대사를 협조적으로 조절하는 가능성이나 유도된 분자가 이차적으로 석회화나 칼슘 대사나 인 대사를 조절하는 가능성을 생각할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드가 조골 세 포, 골 세포, 파골 세포에 직접 작용하여 골 대사를 제어할 수 있다고 생각되고, 골다공증으로 대표되는 대사성 골질환의 치료에 유효성을 나타낸다고 생각할 수 있다.
최근, 이소성 석회화 부위에서 조골 세포형의 표현 형질을 갖는 세포가 출현하고, 골 조직에서의 석회화 과정과 동일한 기작에 의해 석회화가 일어난다고 시사되어 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드가 이러한 석회화 세포의 출현이나 기능을 억제함으로써, 이소성 석회화의 치료에 효과적이라고도 생각할 수 있다.
본 발명에 있어서는 상기 폴리펩티드를 수식할 수도 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 폴리(N-비닐-피롤리돈), 폴리프로필렌글리콜 호모 중합체, 폴리프로필렌옥시드/에틸렌옥시드의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜 등을 적절하게 선택하여 사용한다. 수식 방법은 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면 일본 특표평 10-510980호 공보에 상세히 개시되어 있다.
4. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체
본 발명의 항체는, 상기 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 반응한다. 본 발명에 있어서 「항체」란, 항원인 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 항체 분자 전체 또는 그의 단편(예를 들면, Fab 또는 F(ab')2 단편)을 의미하고, 폴리클로날 항체일 수도 모노클로날 항체일 수도 있다.
본 발명의 항체는 통상법에 따라서 제조할 수 있고, 예를 들면 보조제와 함께 항원으로 동물을 일회 또는 수주간 간격으로 복수회 추가 면역화하는 생체내 방 법, 면역 세포를 분리하여 적당한 배양계에서 감작시키는 시험관내 방법 중 어느 하나의 방법에 의해서 제조할 수 있다. 본 발명의 항체를 생산할 수 있는 면역 세포로서는, 예를 들면 비장 세포, 편도선 세포, 림프절 세포 등을 들 수 있다.
항원으로서 사용되는 폴리펩티드는 반드시 상기 본 발명의 폴리펩티드 전체를 사용할 필요는 없고, 상기 폴리펩티드의 일부분을 항원으로서 사용할 수도 있다. 항원이 짧은 펩티드, 특히 아미노산 20 잔기 전후의 경우에는, 키홀 림펫 헤모시아닌이나 소혈청 알부민과 같은 항원성이 높은 캐리어 단백질과 화학 수식 등에 의해서 결합시켜 사용하거나, 또는 캐리어 단백질 대신에 분지 골격을 갖는 펩티드, 예를 들면 리신 코어 MAP 펩티드(Posnett et al., J. Biol. Chem. 263, 1719-1725, 1988; Lu et al., Mol. Immunol. 28. 623-630, 1991; Briand et al., J. Immunol. Methods 156, 255-265, 1992)와 공유 결합시켜 사용한다.
보조제는 예를 들면, 프로인트(Freund's) 완전 또는 불완전 보조제나 수산화알루미늄 겔 등이 이용된다. 항원을 투여하는 동물로서는 예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 양, 염소, 닭, 소, 말, 몰모트, 햄스터 등이 이용된다.
폴리클로날 항체는 이들 면역화된 동물로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고, 황산암모늄 침전, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 단백질 A 또는 G 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 면역글로불린을 정제함으로써 얻을 수 있다. 상기 동물이 닭인 경우는 계란으로부터 항체를 정제할 수 있다.
모노클로날 항체는 예를 들면 시험관내에서 감작시키거나 또는 상기 동물의 면역 세포를 배양 가능한 모세포와 융합시켜 제조한 하이브리도마(hybridoma) 세포 의 배양 상청으로부터, 또는 동 하이브리도마 세포를 동물 복강내 접종하여 얻어지는 복수개로부터 정제하여 제조할 수 있다. 모세포로서는 마우스 등의 동물 중 일반적으로 입수 가능한 주화 세포를 사용할 수 있다. 사용되는 세포주로서는 약제 선택성을 가지고, 미융합의 상태에서는 HAT 선택 배지(히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘을 포함함)에서 생존할 수 없고, 항체 생산 세포와 융합된 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들면 X63, NS-1, P3U1, X63.653, SP2/0, Y3, SKO-007, GM1500, UC729-6, HM2.0, NP4-1 세포 등을 들 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위한 구체적인 방법은 이하와 같다.
상기한 바와 같이 하여 제조한 폴리펩티드 또는 그의 단편을 항원으로서, 상기 동물에게 투여한다. 동물 1 마리당의 항원 투여량은 보조제를 사용하여 1 내지 100 ㎍이다. 면역화는 주로 정맥내, 피하, 복강내에 주입함으로써 수행된다. 또한, 면역화 간격은 특별히 한정되지 않고, 수일에서 수주간 간격, 바람직하게는 1 내지 3 주간 간격으로, 1 내지 10 회, 바람직하게는 2 내지 5 회 면역화를 수행한다. 그리고, 최종 면역일부터 1 내지 10 일 후, 바람직하게는 1 내지 4 일 후에 항체 생산 세포를 채집한다.
하이브리도마를 얻기 위해서, 항체 생산 세포와 모세포(골수종 세포)와의 세포 융합을 수행한다. 세포 융합은 혈청을 포함하지 않은 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물 세포 배양용 배지 중에서 5×106 내지 1×108 개/ml의 항체 생산 세포와 1×106 내지 2×107 개/ml의 골수종 세포를 혼합하고(항체 생산 세포와 골수종 세포 와의 세포비 5:1이 바람직함), 세포 융합 촉진제 존재를 기초로 융합 반응을 수행한다. 세포 융합 촉진제로서 평균 분자량 1000 내지 6000 달톤의 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 또한, 전기 자극(예를 들면 전기천공)을 이용한 시판중인 세포 융합 장치를 이용하여 항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합시킬 수도 있다.
다음으로, 세포 융합 처리 후의 세포로부터 목적하는 하이브리도마를 선별한다. 세포 현탁액을 예를 들면 소태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등으로 적당하게 희석한 후, 마이크로타이터 플레이트상에 5×105 개/웰 정도 접종하고, 각 웰에 선택 배지를 첨가하고, 이후 적당한 선택 배지를 교환하여 배양한다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시 후, 14 일 전후부터 배양해온 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다. 증식해 온 하이브리도마의 배양 상청 중에 본 발명의 폴리펩티드에 반응하는 항체의 존재 유무를 스크리닝한다. 하이브리도마의 스크리닝은 통상의 방법에 따를 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 하이브리도마로서 배양한 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채집하여 효소 면역 측정법, 방사성 면역 측정법 등에 의해서 스크리닝할 수 있다.
또한, 시험관내에서 감작시키거나 또는 상기 동물의 면역 세포에 EB 바이러스 등의 적당한 바이러스를 감염시켜 얻어지는 무한증식 항체 생산 세포를 배양함으로써 제조할 수도 있다.
이들 세포 공학적 방법과는 별도로, 시험관내에서 감작시키거나 또는 상기 동물의 면역 세포로부터 항체 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 반응에 의해서 증폭 추출하고, 대장균 등의 미생물에 도입하여 항체를 생산하거나, 항체를 융합 단백질로서 파지 표면에 발현시키는 등 유전 공학적 방법에 의해 얻을 수도 있다.
본 발명의 항체를 이용하고, 생체에서 본 발명의 폴리펩티드를 정량함으로써, 본 발명의 폴리펩티드의 각종 질환의 병태와의 관계를 해명할 수 있고, 또한 동 항체는 질환의 진단, 나아가서는 치료, 또한 본 발명 폴리펩티드의 효율적인 친화 정제에 이바지할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 과도하게 작용하는 것으로, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D의 저하를 일으키는 것이 주된 원인인 질환의 존재가 추정된다. 예를 들면, 저인산혈증성 비타민 D 저항성 곱사병 (XLH)에서는 심한 저인산혈증을 나타냄에도 불구하고, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D3 농도는 상승하지 않았다. 그 이유는, 비타민 D 대사 효소 유전자군의 이상이 추정되고 있지만, 이 질환에 있어서 본 발명의 폴리펩티드의 과잉 작용이 관여하고 있을 가능성이 있다. XLH의 마우스 모델인 Hyp에서는, 24위치 히드록실라제 유전자의 발현 항진이 보고되고, 본 발명의 폴리펩티드의 24위치 히드록실라제 유전자 발현 항진 작용과 일치한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 항체를 투여함으로써 비타민 D 대사를 정상화하고, 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D3 농도를 조절함으로써 본 질환을 치료할 수 있는 것이 기대된다. XLH의 유사 소견을 나타내는 질환으로서 상염색체 우성 유전성 저인산혈증 곱사병(ADHR)이 있다. 발명자들은 본 발명의 폴 리펩티드의 클로닝에 있어서, 그 염색체상의 위치로부터 본 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 ADHR의 책임 유전자일 것으로 추측하고 있었다. 최근, ADHR 책임 유전자의 해석이 이루어지고, 본 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 미스센스(missense) 변이가 원인인 것으로 보고되었다. 발명자들은 또한 이 변이가 효소적 절단에 대하여 내성을 제공한다는 것을 밝히고, 이 분자의 과잉 작용이 질환의 원인인 것을 밝혀내었다. 이 질환에 대하여, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체가 그 작용을 억제하는 것으로 질환 치료에 유용하다고 생각된다. ADHR가 골연화증이나 미네랄 대사 이상, 비타민 D 대사 이상을 나타내는 것으로부터 이러한 대사 경로가 관련된 대사성 골질환에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드가 병인 중 하나로서 작용하는 질환의 존재가 추측되고, 그와 같은 질환에 대하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체가 효과적일 것으로 기대할 수 있다. 1α,25-디히드록시 비타민 D의 작용 중 하나로서, 지방 세포로의 분화 억제가 알려져 있다. 나이가 들면서 골수 중의 지방 세포가 증가하는 것이 알려져 있지만, 골수 중에 존재하는 조골 세포, 지방 세포 및 조혈 지지 세포의 공통인 전구 세포로부터 지방 세포로의 분화가 항진된다고 생각한다. 이 과정에서 본 발명의 폴리펩티드가 과도하게 작용하여 일부 1α,25-디히드록시 비타민 D의 농도를 저감시킬 가능성이 있다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 사용함으로써 혈중 또는 일부 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도를 증가시키고, 지방 세포로의 분화를 억제하고, 골 형성능이나 조혈능의 저하를 개선할 것으로 기대할 수 있다. 또한, 비만에 대하여도 효과적일 것으로 기대된다. 이와 같이, 본 발명의 폴리펩티드가 관여하는 질환은 그 외에도 존 재할 것으로 생각된다. 이와 같은 질환은, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 조합한 ELISA로 대표되는 면역학적인 물질 정량법으로 스크리닝할 수 있다. 이로부터, 본 발명의 폴리펩티드의 생리적인 정상 범위를 설정할 수 있고, 또한 그 범위에서 일탈되는 질환군을 확실하게 할 수 있다. 이와 같이 하여 확인되는 본 발명의 폴리펩티드의 혈중 농도가 비정상적으로 높은 값을 나타내는 질환에 대하여, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 치료적으로 사용하는 것을 기대할 수 있다.
5. 의약 조성물
(1) 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물
본 발명의 폴리펩티드는 혈중 인산 농도의 상승이 바람직하지 않은 질환에 대한 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 만성 신부전에 있어서는, 신장으로부터의 인산 배설량의 감소에 의해 혈중 인산 농도의 상승이 일어난다. 고인산혈증이 신장 기능을 더욱 악화시킴과 동시에, 부갑상선에서의 부갑상선 호르몬의 분비를 촉진시켜 이차성 부갑상선 기능 항진증을 일으킨다. 본 증세는 피부의 소양을 일으킴과 함께, 신장에서의 1α,25-디히드록시 비타민 D3 합성 장해에 의한 장관으로부터의 Ca 흡수의 저하를 가져온다. 또한, 혈중 인산의 보유에 의한 부갑상선 호르몬의 과분비 상태가 골 조직으로부터의 Ca 동원을 촉진한다. 이 상태가 계속되면 신성 골이영양증의 형태 중 하나인 섬유성 골염이나 부갑상선의 과형성을 발생시킨다. 이 상태를 피하는 바람직한 방법 중 하나가 상술한 고인산혈증의 개선이지만, 현재 의료로서는 고인산혈증을 충분하게 제어할 수 없다. 본 발명의 폴리펩티드 는, 배뇨 기능이 잔존할 때까지의 만성 신부전에 있어서, 신장 근위 세뇨관 상피 세포에 존재하는 II형 Na 의존성 인산 수송체를 억제하여 뇨중으로의 인산 배설을 촉진시킴으로써, 혈중 인산을 조절하는 활성을 갖는다(인산 수송 억제 활성). 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 장관에 작용하여 신장과 같이 IIb형 Na 의존성 인산 수송체를 억제함으로써 인산의 체내로의 흡수도 저하시켜 혈중 인 농도를 조절할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 칼슘 대사와 인산 대사의 이상에 의한 질환에 대한 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 칼슘 대사 이상이란, 혈청 칼슘 농도가 임상적으로 정의되는 정상 범위를 일탈하고 있는 상태, 또는 혈청 칼슘 농도는 정상 범위이지만, 이 혈청 칼슘 농도를 유지하기 위해서 신장, 장관, 골 조직, 부갑상선의 기능이 비정상적으로 항진 또는 저하되어 있는 상태, 또는 부갑상선 호르몬, 1α,25-디히드록시 비타민 D3, 칼시토닌이라고 하는 혈청 칼슘을 조절하는 호르몬이 이상치를 나타내는 상태를 의미한다. 또한, 인산 대사 이상이란 혈청 인산 농도가 임상적으로 정의되는 정상 범위를 일탈하고 있는 상태, 또는 혈청 인산 농도는 정상 범위이지만, 신장, 장관, 골 조직에서의 인산 출납 기능이 비정상적으로 항진 또는 저하되어 있는 상태를 의미한다.
상기 이차성 부갑상선 기능 항진증에 따른 신성 골이영양증은 임상적으로 섬유성 골염 이외에 무형성골이나 그의 혼합형 등 다양한 형태를 취한다. 이차성 부갑상선 기능 항진증에 대하여 1α,25-디히드록시 비타민 D3 또는 1α-히드록시 비타민 D3 등이 부갑상선 호르몬을 억제할 목적으로 일반적으로 이용되고 있다. 부 갑상선 호르몬값이 충분하게 억제되지 않는 경우에는 1α,25-디히드록시 비타민 D3 또는 1α-히드록시 비타민 D3을 과잉량 투여하는 펄스 요법(이하, 「비타민 D 펄스 요법」이라고 함)이 수행되는 경우가 있다. 혈청의 부갑상선 호르몬의 정상 농도는 65 pg/ml 이하이지만, 이 병태에 있어서 부갑상선 호르몬의 농도가 정상치 수준일 때는, 신성 골이영양증 중 하나의 형태인 무형성골을 생성한다. 더구나, 부갑상선 호르몬 농도가 상승하면 섬유성 골염을 일으키는 상반된 병태를 나타낸다. 이러한 질환에 대한 최근의 치료 지침으로서는, 부갑상선 호르몬 농도를 130 내지 260 pg/ml 정도로 유지하는 것이 제창되어 있지만, 근본적인 대사 이상의 원인은 아직 분명하지 않다. 부갑상선 호르몬은 혈중 인산 농도의 상승에 의해 유도되고, 혈청 칼슘의 상승에 의해 억제되는 것이 알려져 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 혈중 인산 농도 및 혈중 칼슘 농도를 저하시킴으로써 부갑상선 호르몬의 기능을 변형시킬 수 있음을 추측할 수 있다. 또한, 종양성 골연화증 환자에 있어서, 1α,25-디히드록시 비타민 D3이 검출 한계 이하까지 저하되는 것이 보고되어 있고, 본 발명의 폴리펩티드가 1α,25-디히드록시 비타민 D3의 활성 조절에 관련되어 있음도 추측할 수 있다. 상기 부갑상선 호르몬의 제어 이상이나 활성 이상에 따른 신성 골이영양증에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드가 무형성골 또는 섬유성 골염 중 어느 하나에 대하여 임상적으로 유용한 의약 조성물로서 사용될 수 있다고 생각된다. 따라서, 신성 골이영양증의 섬유성 골염과 무형성골이라고 하는 상반되는 병태 중 어느 하나에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 투여가 유용한 치료 방법을 제공한다고 생각할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 이소성 석회화에 대한 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 골 조직 이외의 조직에서의 석회화는 생체 기능을 손상시킨다. 특히 심장이나 혈관의 석회화에 의한 기능 부전은 생명을 위협하는 것이다. 이 이소성 석회화의 위험 인자로서는, 혈중의 칼슘 이온과 인산 이온의 농도의 곱(이하, 「칼슘-인 곱」이라고 함)이 상승하는 것을 들 수 있다. 상기 이차성부갑상선 기능 항진증의 치료에 있어서, 고인산혈증의 상태에 대하여 비타민 D 펄스 요법을 수행할 때, 칼슘-인 곱이 상승하여 이소성 석회화를 일으키는 경우가 있다. 또한, 혈액 투석 환자에서의 심혈계의 석회화는 중대한 문제이다. 본 발명의 폴리펩티드는 표 4에 나타낸 바와 같이 혈청의 칼슘 농도와 인산 농도를 현저히 저하시키는 활성을 갖기 때문에, 여러 질환에 수반되는 이소성 석회화에 대하여 효과적일 것으로 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 대사성 골질환에 대한 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 칼슘 대사, 인산 대사, 석회화 또는 비타민 D 대사에 대하여 강력한 조절 활성을 갖는다. 칼슘 대사와 인 대사에 관련된 호르몬으로서는 칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 1α,25-디히드록시 비타민 D3이 있다. 칼시토닌은 혈청 칼슘을 저하시키는 활성을 가지고, 부갑상선 호르몬과 1α,25-디히드록시 비타민 D3은 혈청 칼슘을 상승시키는 활성을 갖는다. 부갑상선 호르몬은 뇨중으로의 인산 배설 작용을 가지고, 칼시토닌에도 동일한 활성이 있는 것이 보고되어 있다. 1α,25-디히드록시 비타민 D3은 장관으로부터의 인산 흡수를 촉진시키는 활성을 갖는다. 이와 같이, 각각의 호르몬이 혈중의 칼슘과 인산의 밸런스 유 지에 대하여 상이한 활성을 가지고 있지만, 칼시토닌 및 1α,25-디히드록시 비타민 D3은 골다공증의 치료약으로 사용되고 있다. 또한, 부갑상선 호르몬도 골다공증에 대한 치료약으로서 개발 중에 있다.
골 대사에는 골 흡수와 골 형성이라는 골 조직의 이화와 동화가 상호조절한다는 특징이 있다. 부갑상선 호르몬을 지속적으로 투여하면 골량을 감소시키지만, 간헐적으로 작용시키면 골 형성을 촉진한다고 알려져 있다. 본 발명의 폴리펩티드도 칼슘 대사와 인산 대사의 조절 작용을 가지고 있으므로, 적절한 사용 방법을 선택함으로써 골다공증을 비롯한 대사성 골질환에 대하여 효과적일 것으로 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도의 상승이 바람직하지 않은 질환 또는 상태에 대한 의약 조성물, 또는 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D에 의해서 유도되는 생리 반응이 바람직하지 않은 상태에 대한 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
1α,25-디히드록시 비타민 D는 부갑상선에 대하여 작용하여 부갑상선 호르몬(PTH)의 분비를 억제하는 것으로 알려져 있다. 그 때문에 임상적으로는 만성 신부전에서의 이차성 부갑상선 기능 항진증, 특히 혈청 중 PTH 농도가 높은 병례에 있어서, 간헐적으로 고농도의 1α,25-디히드록시 비타민 D를 투여하는 치료법이 확립되어 있다. 그러나 이 치료법의 단점으로, 이소성 석회화를 쉽게 유발한다는 점을 들 수 있다. 혈청 중 인산 농도가 높은 만성 신부전 환자에 있어서, 1α,25-디히드록시 비타민 D의 투여에 의해 골 조직 이외의 조직에서의 바람직하지 않은 석회화가 종종 확인된다. 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 수시간 이내에 빠른 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D의 저하를 촉진하는 작용을 가지므로, 1α,25-디히드록시 비타민 D의 과잉이 원인이 되는 이소성 석회화의 치료 및 예방에 유용하다.
또한, 고농도 1α,25-디히드록시 비타민 D의 간헐적 투여는 과도한 PTH 분비를 억제시키고, 골의 대사가 정지한 것과 같은 소견을 나타내는 무형성골증을 유발하는 경우가 있다. 이러한 병례에 대하여도, 본 발명의 폴리펩티드의 투여에 의해 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D를 저하시키고 부갑상선에서의 적절한 PTH 분비를 촉진하여 무형성골을 회복시킬 것으로 기대할 수 있다.
혈관의 석회화에 있어서도 1α,25-디히드록시 비타민 D가 석회화 촉진 인자로 관여한다고 보고되어 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 혈관의 석회화에 따른 병태, 예를 들면 노화에 따른 동맥 경화, 당뇨병성 혈관증, 투석 환자에 의한 심혈관계의 석회화 등에 대하여 치료적 또는 예방적으로 사용할 수 있다.
장관으로부터의 칼슘 흡수는 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D에 의해 촉진된다고 알려져 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도를 저하시킴으로써 고칼슘혈증의 조절에 사용할 수 있다. 고칼슘혈증의 원인으로서는 원발성 부갑상선 기능 항진증에 의한 PTH의 과잉 생산, 유육종증 (sarcoidosis)이나 결핵 등의 만성 육아종에 따른 고농도 1α,25-디히드록시 비타민 D, 또는 악성 종양이 생산하는 PTHrP에 의한 골 흡수 촉진 등을 들 수 있다. 1α,25-디히드록시 비타민 D 과잉 뿐만 아니라 PTH 또는 PTHrP이 주된 원인인 고칼 슘혈증에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드를 투여함으로써 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도를 저하시켜 고칼슘혈증을 개선시킬 것으로 기대할 수 있다. 특히, 유육종증이나 결핵 등의 만성 육아종 중의 활성화 대식세포는 1α위치 히드록실라제 활성을 가지고, 1α,25-디히드록시 비타민 D3을 과잉 생산한다. 본 발명의 폴리펩티드에 의해 이 1α위치 히드록실라제 활성을 직접 저하시킬 것으로 기대할 수 있다.
1α,25-디히드록시 비타민 D는 파골 세포의 분화를 촉진한다고 알려져 있고, 본 발명의 폴리펩티드 투여에 의해 골 흡수 억제가 기대된다. 시험관내에서 1α,25-디히드록시 비타민 D는 강력한 파골 세포 분화 유도 인자로서 알려져 있다. 파골 세포에 의한 과도한 골 흡수는 골다공증으로 대표되는 골 감소 질환을 초래한다. 본 발명의 폴리펩티드는 이러한 골 흡수의 촉진이 확인되는 질환에 있어서, 순간적으로 혈청 중 1α,25-디히드록시 비타민 D 농도를 저하시킴으로써, 골 대사 회전을 정상적으로 복귀시킬 것으로 기대된다. 또한, 1α,25-디히드록시 비타민 D는 시험관내에서 조골 세포의 분화를 억제한다고 보고되어 있지만, 생체내에서도 골 형성을 억제하는 인자라는 것이 비타민 D 수용체 결손 마우스의 골 이식 실험에서 시사되어 있다. 이러한 관점에서도 1α,25-디히드록시 비타민 D를 저하시킬 수 있는 본 발명의 폴리펩티드는 골량의 감소에 따른 대사성 골질환에 대하여 유용할 것으로 기대할 수 있다. 또한, 비타민 D3 대사물 중 하나인 24,25-디히드록시 비타민 D를 투여함으로써 골량의 증가를 확인하는 보고가 나와 있다. 24,25-디히드록시 비타민 D는, 25-히드록시 비타민 D를 기질로서 24위치 히드록실라제가 수산화 함으로써 합성된다. 본 발명의 폴리펩티드는 24위치 히드록실라제 유전자의 발현을 상당히 항진시키는 작용을 가지고 있기 때문에, 본 펩티드의 투여에 의해 혈중 24,25-디히드록시 비타민 D 농도를 상승시키고, 골다공증 등의 골질환, 또는 골격 형성 이상 등에 대한 골량의 증가를 기대할 수 있다.
PTH는 강력한 골 흡수 촉진 작용을 갖는다고 알려져 있지만, 이것을 간헐 투여함으로써 골 대사 회전을 자극할 수 있고, 결과적으로 골량을 증가시키는 효과를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 생리 활성으로서 1α,25-디히드록시 비타민 D의 조절 작용이나 혈청 칼슘, 혈청 인산 농도 조절 작용, 석회화 조절 작용을 갖는 것이 분명해졌지만, 본 폴리펩티드를 효과적으로 골 조직에 작용시킴으로써 골 대사 회전을 조절할 수 있다고 생각된다. 따라서, 골 대사 회전이 항진되는 폐경 후 골다공증이나 골 대사 회전이 저하되고 있는 퇴행기 골다공증에 대하여 본 폴리펩티드가 유용할 것으로 기대할 수 있다. 이러한 본 발명의 폴리펩티드가 관여하는 질환은 그 외에도 존재하는 것으로 생각된다. 이와 같은 질환은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 조합한 ELISA로 대표되는 면역학적인 물질 정량법으로 스크리닝할 수 있다.
이로부터, 본 발명의 폴리펩티드의 생리적인 정상 범위를 설정할 수 있고, 또한 그 범위에서 일탈하는 질환군을 분명히 할 수 있다. 이와 같이 하여 확인되는 본 발명의 폴리펩티드의 혈중 농도가 비정상적으로 낮은 값을 나타내는 질환에 대하여, 본 발명의 폴리펩티드를 치료적으로 사용하는 것을 기대할 수 있다.
(2) 본 발명의 항체를 포함하는 의약 조성물
본 발명의 항체는 비타민 D 저항성 곱사병이나 종양성 골연화증에 대한 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 상기 항체의 제조 방법에 의해 본 폴리펩티드의 중화 항체를 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체로서 취득할 수 있다. 항체를 의약으로서 보다 바람직하게 이용하는 방법으로서는, 인간형 항체나 인간형화 항체를 제조하는 것이 가능하다. 종양성 골연화증에서의 저인산혈증이나 골연화증의 치료 또는 개선은 본 발명의 폴리펩티드의 지나친 활성을 억제함으로써 달성할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 중화 항체를 투여함으로써 종양성 골연화증의 증상 개선을 기대할 수 있다. 또한, XLH에서의 저인산혈증 유도 인자나 석회화 억제 인자가 본 발명의 폴리펩티드와 동등하다고 생각되므로, XLH를 포함하는 비타민 D 저항성 곱사병에 대한 치료약으로도 가능하다.
본 발명의 항체는, 본 발명의 폴리펩티드가 과잉 상태로 존재하는 칼슘 대사또는 인산 대사 이상 질환이나 대사성 골질환에 대한 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 상술한 바와 같이, 만성 신부전 환자나 혈액 투석 환자는 칼슘 대사나 인산 대사의 항상성 유지 기구에 이상이 생긴 것이지만, 그 원인은 본 발명의 폴리펩티드가 과잉 생산되거나 축적된 것일 가능성이 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 골 대사를 조절하는 것으로 나타났지만, 본 발명의 폴리펩티드가 과잉 존재함으로써 생기는 대사성 골질환의 존재도 생각할 수 있다. 이 경우에 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체에 의해 병태의 치료 또는 개선을 기대할 수 있다.
본 발명의 항체를 적용할 수 있는 질환은 골다공증, 비타민 D 저항성 곱사병, 신성 골이영양증, 투석골증, 저석회화골증, 파제트병, 종양성 골연화증 등의 적어도 1종의 골질환을 들 수 있다. 이들 질환은 단독일 수도, 복합적인 것일 수도, 상기 이외의 다른 질병과 복합적인 것일 수도 있다.
(3) 투여 프로토콜
본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 유효 성분으로 포함하는 의약 조성물은, 의약적으로 허용되는 담체 또는 첨가물을 함께 포함할 수도 있다. 이러한 담체 및 첨가물의 예로서, 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 중합체, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 나트륨 카르복시메틸 전분, 펙틴, 크산탄 고무, 아라비아 고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알콜, 스테아르산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨, 락토스, 의약 첨가물로서 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물은 본 발명의 제형에 따라서 상기 물질을 단독으로 또는 이들을 조합하여 적절하게 선택한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 골질환의 예방제 또는 치료제로서 사용하는 경우에는, 사용하는 대상을 특별히 한정하지는 않는다.
본 발명의 폴리펩티드에 대해서는 생체의 칼슘 대사, 인산 대사, 석회화 또는 비타민 D 대사를 조절할 수 있는 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
본 발명의 항체에 대해서는, 상기한 대로 골다공증, 비타민 D 저항성 곱사병, 신성 골이영양증, 투석골증, 저석회화골증, 파제트병, 종양성 골연화증 등의 적어도 1종의 골질환에 대하여 치료 또는 예방을 특이 목적으로서 사용할 수 있다. 이들 질환은 단독으로도, 복합적인 것으로도, 상기 이외의 다른 질병과 복합적인 것으로도, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체 사용의 대상으로 할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 예방제 또는 치료제는, 폴리펩티드의 경우에는 경구적 또는 비경구적으로, 항체의 경우에는 비경구적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 경구적으로 투여하는 경우에는, 그것에 적용되는 정제, 과립제, 산제, 환제 등의 고형 제제, 또는 액제, 시럽제 등의 액체 제제 등으로 할 수 있다. 특히 과립제 및 산제는 캡슐제로서 단위량 투여 형태로 할 수 있고, 액체 제제의 경우에는 사용할 때 재용해되는 건조 생성물로 할 수도 있다.
이들 제형 중 경구용 고형제는 통상 이들의 조성물 중에 제제상 일반적으로 사용되는 결합제, 부형제, 활택제, 붕해제, 습윤제 등의 첨가제를 함유한다. 또한, 경구용 액체 제제는 통상 이들의 조성물 중에 제제상 일반적으로 사용되는 안정제, 완충제, 교정제(corrigent), 보존제, 방향제, 착색제 등의 첨가제를 함유한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 비경구적으로 투여하는 경우에는 주사제, 좌제 등으로 할 수 있다.
주사의 경우에는 통상 단위 투여량 앰플 또는 다투여량 용기의 상태로 제공되고, 사용할 때 적당한 담체, 예를 들면 발열 물질을 함유하지 않은 멸균수로 재용해되는 분체일 수도 있다. 이들 제형은 통상 이들의 조성물 중에 제제상 일반적으로 사용되는 유화제, 현탁제 등의 첨가제를 함유한다. 주사 방법으로서는, 예를 들면 점적 정맥내 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 피부 내 주사를 들 수 있다. 또한, 그 투여량은 투여 대상의 연령, 투여 경로, 투여 횟수에 따라 다르고, 광범위하게 변화될 수 있다.
이 경우, 본 발명의 펩티드 또는 항체의 유효량과 적절한 희석제 및 약리학적으로 사용할 수 있는 담체와의 조합으로 투여되는 유효량은, 폴리펩티드에 있어서는 1 회에 대하여 체중 1 kg 당 0.01 내지 100 ㎍, 바람직하게는 0.5 내지 20 ㎍이다. 또한, 항체에 있어서는 1 회 대하여 체중 1 kg 당 0.1 ㎍ 내지 2 mg, 바람직하게는 1 내지 500 ㎍이다.
6. 질환의 진단제
(1) 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드
본 발명의 항체는 혈중이나 뇨중에 존재하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 대사물의 검출이나 정량에 이용하여 본 발명의 폴리펩티드와 병태의 관련성을 명확히 할 수 있음과 동시에 관련 질환의 진단제로서 확립할 수 있다.
관련 질환이란, 골질환 또는 칼슘 대사 이상, 인산 대사 이상, 석회화 이상, 및 비타민 D 대사 이상 중 적어도 하나의 이상을 나타내는 질환을 의미하고, 예를 들면 골다공증, 비타민 D 저항성 곱사병, 신성 골이영양증, 투석골증, 저석회화골증, 파제트병, 신부전, 신장성 인산 누출증, 세뇨관성 산증, 판코니 증후군 등을 들 수 있다.
항체를 이용한 결합 분자의 정량 방법은 방사 면역 검정법이나 효소 면역 검정법 등에 의해 일반적으로 측정한다. 이러한 방법을 이용하여 혈중이나 뇨중의 본 발명의 폴리펩티드를 측정하는 것은, 새로운 임상 판단의 지표가 될 수 있다. 예를 들면, 곱사병 환자에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 혈중값이 정상인과 비교하여 높은 값을 나타내는 경우에는 XLH 또는 ADHR을 강하게 의심할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드의 혈중 농도의 변화에 의해 만성 신부전 환자의 이차성부갑상선 기능 항진증으로의 진전을 예상할 수 있다.
종양성 골연화증에 대해서는, 일반적으로 종양의 발견이 쉽지 않은 경우가 많지만, 본 발명의 항체를 이용함으로써 유용한 진단 방법을 확립할 수 있다. 예를 들면, 곱사병이나 골연화증의 가족력이 없는 환자에 있어서, 본 발명 폴리펩티드의 혈중 농도가 정상인과 비교하여 현저하게 높은 값을 나타낸 경우, 종양성 골연화증을 의심할 수 있다.
(2) 본 발명의 DNA
본 발명에 있어서는, 인산 대사 이상 질환이나 칼슘 대사 이상 질환 및 대사성 골질환 환자로부터 본 발명의 DNA 이상을 검출함으로써 상기 질환의 진단과 예방을 가능하게 한다.
본 발명의 DNA의 염기 서열을 젠뱅크의 염기 서열 데이타베이스 중에서 검색하면, 3개로 단편화한 상태에서 인간 12p13 BAC RPCI11-388F6(승인 번호 AC008012)의 서열과 일치한다. 이 단편화는 염색체 서열로부터 스플라이싱에 의해 본 발명의 DNA의 염기 서열이 얻어지는 것을 나타내고, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 적어도 서열 11로 표시되는 서열 중 제498번에서 제12966번까지의 서열 또는 그 일부의 단편을 포함하는 것이 명백하다.
이 영역내의 염기 치환이나 삽입이나 결실에 의해, 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 및 생리적 활성의 상승이나 저하나 소실이 발생한다. 본 발명의 폴리펩티드는 인산 대사, 칼슘 대사, 골 대사, 비타민 D 대사에 강력한 작용을 가지므로, 이 서열 11로 표시되는 염기 서열 또는 그 일부의 영역(예를 들면 제498번에서 제12966번까지의 서열)에서, 일부 염기의 치환, 삽입, 결실 등에 의한 유전자 다형성이나 변이를 분명하게 함으로써, 인산 대사 이상이나 칼슘 대사 이상을 포함하는 질환, 또는 골 대사 이상을 나타내는 질환, 비타민 D 대사 이상을 나타내는 질환의 진단 또는 예방이 가능해진다.
그런데, ADHR을 갖는 가계의 연쇄 해석이 이루어지고, 그 책임 유전자가 12p13에 존재하는 것이 보고되어 있다(Econs, M. J. et al., J. Clin. Invest. 100:2653-2657, 1997). 이 보고에 있어서, 책임 유전자가 마이크로세텔라이트 (microsatellite) 마커 D12S100과 D12S397의 18 cM의 범위에 존재하는 것이 밝혀졌다. 본 발명자는 본 발명의 DNA가 존재하는 염색체상의 위치를 이들과 비교하여 확인한 결과, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는, ADHR의 책임 유전자가 존재하는 영역과 일치하였다. 본 발명의 폴리펩티드의 생물 활성과 유전자의 염색체상의 위치로부터, 본 발명의 폴리펩티드가 ADHR의 책임 유전자에 의해 코딩된다고 생각할 수 있다. 이것은, ADHR 환자의 혈액으로부터 세포 성분을 분리하고, 이로부터 염색체 DNA를 단리하여 서열 11로 표시되는 영역의 염기 서열의 변이를 찾아냄으로써 확정할 수 있다. 따라서, 상기 염기 서열 영역을 갖는 유전자는 상염색체 우성 저인산혈증성 곱사병, 반성 염색체성 저인산혈증성 곱사병, 저인산혈증성 골증, 골다공증 등의 진단제로서 사용된다.
본 발명자가 특정한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 영역의 엑손 1과 엑손 2 사이에는, NCBI의 젠뱅크에 승인 번호 G19259로 등록되어 있는 STS 서열이 존재한다. 이 마커는 본 DNA와 유전적 형질과의 관련성을 조사하는데 있어서 매우 중요하다고 생각된다.
본 발명은 지금까지의 칼슘 대사, 인산 대사, 골 대사 및 비타민 D 대사에 대한 이해에 큰 변혁을 가져온다. 만성 신부전으로부터 혈액 투석기의 이행 지연이나 인산 대사와 칼슘 대사 관련 질환이나 대사성 골질환에 대한 새로운 치료법과 진단 방법을 제공한다. 또한, 기존의 치료 방법의 개선이나 그것을 보조하는 것으로 유용하다.
도 1은 OST311의 종양 특이성을 검토하기 위해, 종양 조직으로부터 추출한 제1 가닥 cDNA 및 대조군 골 조직으로부터 추출한 제1 가닥 cDNA를 주형으로, 서열 22, 23으로 표시되는 OST311 특이적 프라이머, 및 서열 26, 27로 표시되는 G3PDH 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 그 증폭 산물을 아가로스 전기영동으로 해석한 사진이다.
도 2는 재조합 OST311을 니켈 수지로 친화 정제한 후, 강한 양이온 교환 수지 SP-5PW로 분리 정제한 용출 분획에 대하여 웨스턴 블롯팅을 실시하여 OST311를 검출한 것을 나타내는 사진이다.
도 3A는 서열 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를, 맥벡터(MacVector) 버전 6.5.1의 계산 기능을 이용하여 펩티드 항체 제조에 적합한 부위를 예측한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3B는 서열 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를, 맥벡터 버전 6.5.1의 계산 기능을 이용하여 소수성 정도를 예측한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 CHO-OST311H 세포를 이식한 후 31 일간의 비종양형성군(avr.-로 표시된 그래프) 및 CHO-OST311H 세포 종양형성군(avr.+로 표시된 그래프)의 평균 체중의 경시 변화를 나타낸 도면이다.
도 5는 대조군 CHO ras 클론-1 세포 종양 형성 개체, CHO-OST190H 세포 종양 형성 개체, CHO-OST311H 세포 종양 형성 개체를 각각 X선 촬영하여 전신 골격을 나타낸 사진이다.
도 6은 인간 OST311 폴리펩티드와 마우스 OST311의 폴리펩티드 사이에서의 아미노산 상동성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 종양 비형성군(n=6), CHO ras 클론-1 종양형성군(n=10), CHO-OST190H 종양형성군(n=10), CHO-OST311H 종양형성군-1(n=6), CHO-OST311H 종양형성군-2(n=6)로부터 44 일째 내지 46 일째에 심장 채혈로 채취한 혈청 중의 인 농도, 칼슘 농도, 알칼리 포스파타제 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 CHO-OST311H 종양 형성 개체 및 비종양 형성 개체로부터 적출한 신장으로부터, 근위 세뇨관 상피 세포의 브러쉬보더(brush border)막을 제조하고, 나트륨ㆍ인산 공액 수송 담체(NaPi-7)의 발현량을 웨스턴 블롯팅법으로 비교한 사진이다.
도 9A는 종양 이식 후 44 일째 내지 46 일째에 도살한 마우스로부터 채취한 신장에서의 인산 수송 담체(NaPi-7, NPT-1)과 비타민 D 대사 효소(1αOHase, 24OHase)와 소장에서의 인산 수송 담체(NaPi-IIb)의 mRNA 양의 변화를 노던 블롯팅으로 검출한 사진이다.
도 9B는 종양 이식 후 44 일째 내지 46 일째에 도살한 마우스로부터 채취한 신장에서의 인산 수송 담체(NaPi-7, NPT-1)와 비타민 D 대사 효소(1αOHase, 24OHase)와 소장에서의 인산 수송 담체(NaPi-IIb)의 mRNA 양의 변화를 노던 블롯팅으로 검출한 사진이다.
도 9C는 종양 이식 후 44 일째 내지 46 일째에 도살한 마우스로부터 채취한 신장에서의 인산 수송 담체(NaPi-7, NPT-1)와 비타민 D 대사 효소(1αOHase, 24OHase)와 소장에서의 인산 수송 담체(NaPi-IIb)의 mRNA 양의 변화를 노던 블롯팅으로 검출한 사진이다.
도 10은 종양 이식 후 44 일째 내지 46 일째에 도살한 마우스로부터 채취한 대퇴골의 X선 사진이다.
도 11A는 PBS, CHO ras 클론-1 세포 및 CHO-OST311H 세포를 누드 마우스(6 주령, BALB/c, 수컷)에 이식한 후, 2 일째에 혈청의 인산 및 칼슘 농도를 비교한 도면이다.
각각의 값은 평균±표준 편차로 나타낸다. .
도 11B는 PBS, CHO ras 클론-1 세포 및 CHO-OST311H 세포를 누드 마우스(6 주령, BALB/c, 수컷)에 이식한 후, 6 일째에 혈청의 인산 및 칼슘 농도를 비교한 도면이다.
각각의 값은 평균±표준 편차로 나타낸다.
도 12는 CHO-OST311H 세포의 배양 상청을 정제하고, 용출 분획을 항 His6 항체 및 항 OST311 펩티드 항체(311-114)를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 사진이다. 좌측 패널은 311:26-251, 중앙 패널은 311:25-179, 우측 패널은 31:180-251을 각각 검출한 도면이다. 겔 사진 상부에 「*」로 기재된 분획을 정상 마우스로의 1회 투여 시험에 이용하였다.
도 13은 CHO-OST311H 세포 이식 마우스 및 종양이 없는 마우스로부터 적출한 경골 골간 말단부의 비탈회절편을 빌라누에바 골드너(Villanueva goldner) 염색한 사진이다.
도 14는 CHO-OST311H 세포 이식 마우스 및 대조군 마우스로부터 적출한 신장에서의 비타민 D 대사 효소 유전자 산물의 노던 블롯팅을 나타낸 사진이다.
도 15는, A는 CHO 생산형 재조합 OST311H 전장 단백질의 정상 마우스로의 투여 시험 1에 대한 타임 스케줄을 나타낸 도면이다. B는 각 채혈시에 있어서의 혈청 중 인산 농도를, C는 동 시점에서의 혈청 칼슘 농도를 나타낸 그래프이다.
도 16은, A는 CHO 생산형 재조합 OST311H 전장 단백질의 정상 마우스로의 투여 시험 2에 대한 타임 스케줄을 나타낸 도면이다. B는 각 채혈시에 있어서의 혈청 중 인산 농도를, C는 동 시점에서의 혈청 칼슘 농도를 나타낸 그래프이다.
도 17은 변이형 재조합체 OST311RQH를 생산하는 CHO-OST311RQH 세포 및 OST311RQH/pEAK rapid 세포의 배양 상청을 웨스턴 블롯팅에 사용하고, 상청 중 재조합체를 검출한 사진이다.
도 18은, A는 변이형 재조합체 OST311RQH의 정상 마우스로의 투여 시험에 대한 타임 스케줄을 나타낸 도면이다. B는 각 채혈시에 있어서의 혈청 중 인산 농도를, C는 동 시점에서의 혈청 칼슘 농도를 나타낸 그래프이다.
도 19는, A는 CHO-OST311RQH 세포 이식 시험의 이식 후 2 일째에서의 혈청 인산 농도를 나타낸 도면이다. B는 동 시험에서의 혈청 칼슘 농도를 나타낸 도면이다.
도 20은 CHO-OST311H 세포의 무혈청 배양 상청 중의 재조합 OST311H를 항 OST311 부분 펩티드 토끼 항혈청을 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 검출한 사진이다.
도 21은, A는 6 종류의 항 OST311 펩티드 폴리클로날 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA를 구축하고, 개개의 조합에 대한 재조합 OST311의 검출 수준을 나타낸 표이다. B는 고상화 항체로서의 311-48 항체 또는 311-180 항체를 검출용 항체로서의 311-148 항체와 조합한 ELISA 시스템을 이용하여, 정제 재조합 OST311H의 농도와 각각에 대한 측정치의 관계를 도시한 그래프이다.
도 22는, A는 재조합 OST311 단백질 또는 비히클을 마우스에게 투여한 후 1, 3, 8 시간째에 있어서의 신장 NaPi-7의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 도면이다. B는 같은 처리를 한 신장의 전체 RNA를 이용하여, NaPi-7의 발현을 노던 블롯팅으로 확인한 도면이다.
도 23은 재조합 OST311 단백질 또는 비히클을 마우스에게 투여한 후 1, 3, 8 시간 째에 있어서의 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도의 추이를 나타낸 도면이 다.
도 24는 재조합 OST311 단백질 또는 비히클을 마우스에게 투여한 후 1, 3, 8 시간 째에 있어서의 신장의 전체 RNA를 이용하여, 25-히드록시 비타민 D-1-α-히드록실라제(1αOHase) 또는, 25-히드록시 비타민 D-24-히드록실라제(24OHase) 유전자의 발현을 노던 블롯팅으로 확인한 도면이다.
도 25는 세포 이식 후 3 일째에서의 CHO-ras 클론-1 세포 이식군에서의 평균 혈청 인산 농도값을 100 ％로 한 경우, 각 군에서의 평균 혈청 인산 수준을 나타낸 도면이다.
도 26은 플라스미드 OST311/pET28에 의해 코딩되는 재조합체 His-OST311의 DNA 염기 서열과 아미노산 서열 및 플라스미드 pET22-MK-OST311에 의해 코딩되는 재조합체 MK-OST311의 DNA 염기 서열과 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 27은 리폴딩(refolding) 후의 재조합체 His-OST311를 양이온 교환 컬럼 SP-5PW(일본, 도소사)를 이용하여 HPLC 정제하였을 때의 용출 패턴을 나타낸 도면이다.
도 28은 리폴딩 후의 재조합체 MK-OST311를 양이온 교환 컬럼 SP-5PW(일본, 도소사)를 이용하여 HPLC 정제하였을 때의 용출 패턴을 나타낸 도면이다.
도 29는 PEG화한 재조합체 MK-OST311를 양이온 교환 컬럼 SP-5PW(일본, 도소사)를 이용하여 HPLC 정제하였을 때의 용출 패턴을 나타낸 도면이다.
도 30은 대장균 생산형 His-OST311 재조합체(A) 또는 PEG화 MK-OST311 재조합체(B)를 1회 투여하고 나서 8 또는 9 시간 후에 있어서의 혈청 인산 농도를 나타 낸 도면이다.
도 31은 대장균 생산형 His-OST311 재조합체를 1회 투여하고 나서 1 및 4 시간 후에 신장에서의 비타민 D 대사 효소 유전자의 발현 변화를 노던 블롯팅법으로 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 32는 대장균 생산형 His-OST311 재조합체를 1회 투여하고 나서 1, 4 및 9 시간 후에 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D3의 농도 변화를 나타내는 도면이다.
도 33은 OST311의 아미노산 174 내지 180 번째에 변이를 도입하고, 그 유전자를 pEAK 세포에서 발현시켰을 때의 세포 상청에 분비되는 변이 OST311 재조합체를 웨스턴 블롯팅으로 검출한 도면이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 의해 그 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
인간 종양성 골연화증 유래 종양 cDNA 라이브러리의 제조
액체 질소로 동결시킨 종양 조직을 5 ㎖의 ISOGEN(일본국 닛본 진(NIPPON GENE)사)액 중에서 파쇄, 현탁시킨 후, 메뉴얼에 따라 약 0.13 ㎎의 전체 RNA를 제조하였다. 이 전체 RNA 1.5 ㎕로부터 SMART cDNA 라이브러리 제조 키트(미국 클론테크(CLONTECH)사)를 사용하여 메뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다. 이하, 이 cDNA를 cDNA#2라고 표기한다. 이 cDNA#2에 EcoRI 어댑터를 부가하고, 미리 제한 효소 EcoRI로 소화한 λZAPII 파지 벡터(미국 스트라타진(STRATAGENE)사)에 삽입한 후, GigapackIII Gold 파지 패키징 키트(미국 스트라타진사)를 사용하여 메뉴얼에 따라 종양성 골연화증 종양 파지 라이브러리를 제조하였다. 얻어진 라이브러리는 독립적인 클론을 총 약 60만종 포함하고 있었다. 또한, 상기 파지 라이브러리를 대장균 XLI-Blue MRF' 균주에 감염시킨 후, 15 cm의 페트리 접시 20개에 스프레딩하여 37 ℃에서 10시간 보온함으로써 플라크를 형성시켰다. 이 플라크를 모두 SM 완충액에 추출하여 종양성 골연화증 종양 cDNA 파지 라이브러리로 하였다.
<실시예 2>
종양 cDNA의 포지티브 스크리닝의 실시
개요
종양성 골연화증의 원인 유전자는 종양의 외과적 제거로 치유할 수 있다는 점으로부터, 종양에서 특이적으로 고발현될 가능성을 시사하고 있다. 또한, 이제까지의 보고에서는 종양성 골연화증의 종양은 중배엽계, 특히 간충직 세포 유래인 경우가 많다. 따라서, 정상적인 중배엽 유래 조직 중에서는 발현이 낮고, 종양 조직중에서만 특이적으로 고발현되는 유전자군을 동정하는 것이 필요하다고 여겨졌다. 따라서, 이하에 나타낸 바와 같이 cDNA 서브트랙션(subtraction)법을 응용한 포지티브 스크리닝을 실시하였다. 종양 조직 유래 cDNA와 대조군으로서 골조직으로부터 단리한 cDNA를 서브트랙션함으로써 종양 조직에서만 특이적으로 고발현되고, 골조직 중에서는 발현되지 않는 유전자군을 농축하였다. 이 서브트랙션한 cDNA군을 프로브로 사용하여 종양 cDNA 파지 라이브러리와 혼성화함으로써 종양 특이적 발현 유전자 단편을 얻었다.
(1) 대조군 인간 골조직 cDNA의 제조
액체 질소로 동결시킨 인간 골조직을 5 ㎖의 ISOGEN(일본국 닛본 진사)액 중에서 파쇄, 현탁시킨 후, 메뉴얼에 따라 약 0.011 ㎎의 전체 RNA를 제조하였다. 이 전체 RNA 3 ㎕로부터 SMART cDNA 라이브러리 제조 키트(미국 클론테크사)를 사용하여 메뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다. 이와 같이 하여 얻어진 cDNA를 이하 cDNA#4라고 표기한다.
(2) 종양성 골연화증 종양 cDNA와 대조군 골조직 cDNA의 서브트랙션
실시예 1에 기재한 cDNA#2에서 고발현되는 유전자를 농축하기 위해 PCR-Select cDNA 서브트랙션 키트(미국 클론테크사)를 사용하여 메뉴얼에 따라 실시예 2(1)에 기재한 cDNA#4와 혼성화시킴으로써 cDNA#2로부터 cDNA#4에 포함되어 있는 유전자 단편을 뽑아냈다(서브트랙션함). 그 후, 뽑아낸 cDNA#2는 메뉴얼에 따라 PCR 증폭되어 서브트랙션을 마친 cDNA군(A)를 얻었다.
한편, 서브트랙션 키트의 성질상 혼성화의 과정이 2회로 정해진 방법에 비하여 적기 때문에, 양자에 모두 많이 존재하는 유전자는 완전히 서브트랙션되기 어렵다. 따라서, 서브트랙션을 마친 cDNA군(A)만을 프로브로서 종양성 골연화증 종양 cDNA라이브러리와 혼성화했을 경우, 완전히 서브트랙션되지 않은 유전자도 포지티브 클론으로서 얻을 수 있게 된다. 따라서, 대조군 프로브로서 실시예 2(1)에 기재한 cDNA#4로부터 cDNA#2를 동일한 방법으로 뽑아낸 후, PCR 증폭된 서브트랙션을 마친 cDNA군(B)를 제조하였다. 이 서브트랙션을 마친 cDNA군(B)와 상술한 서브트랙션을 마친 cDNA군(A)를 각각 종양 cDNA 라이브러리에 대하여 혼성화하고, 양자의 시그널을 비교함으로써 종양성 골연화증 종양에 특이적으로 포함되는 유전자 단편을 단리할 수 있게 된다.
(3) 종양 cDNA 라이브러리의 차등(differential) 혼성화
실시예 1에 기재한 종양성 골연화증 종양 cDNA 파지 라이브러리를 대장균 XLI-Blue 균주에 감염시킨 후, 15 cm 페트리 접시 1개당 3,000개의 플라크를 형성하도록 스프레딩하고 37 ℃에서 8시간 보온하였다. 그 후, Hybond N+(미국 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)사) 나일론 필터에 각 2개씩 플라크를 전사하였다. 전사한 나일론 필터를 메뉴얼에 따라 DNA 고정 처리를 행하여 실시예 2(2)에 기재한 서브트랙션을 마친 cDNA(A) 및 서브트랙션을 마친 cDNA(B)를 각각 프로브로서 스크리닝을 실시하였다.
프로브 표지, 혼성화 및 시그널 검출은 알포스 다이렉트 시스템(Alphos Direct System, 미국 아머샴 파마시아 바이오테크사)을 사용하여 메뉴얼에 따라 실시하였다. 프로브로는 실시예 2(2)에 기재한 서브트랙션을 마친 cDNA(A) 및 서브트랙션을 마친 cDNA(B)를 각각 100 ng씩 사용하여 프로토콜에 따라 형광을 표지하였다. 이 프로브를 알포스 다이렉트 시스템 부속의 혼성화 완충액 50 ㎖에 각각 첨가하고, 동시에 플라크를 전사한 8장으로 된 나일론 필터 2조를 각각 프로토콜에 따라 혼성화 및 세정하였다. 세정 후, 나일론 필터를 발광 반응에 적용하여 ECL 필름(미국 아머샴 파마시아 바이오테크사)에 2시간 노광하고, 자동 현상기(일본국 후지필름)로 현상하여 결과를 해석하였다.
그 결과, 서브트랙션을 마친 cDNA(A)를 프로브로 사용한 경우 강하게 노광하 고, 서브트랙션을 마친 cDNA(B)를 프로브로 사용한 경우 노광하지 않는 부분에 위치하는 단일 플라크를 육안으로 선택하고, 페트리 접시로부터 긁어내 0.5 ㎖의 SM 완충액에 현탁한 후, 4 ℃에서 2시간 이상 정치함으로써 파지를 추출하였다.
(4) 포지티브 클론의 염기 서열 해석
실시예 2(3)에서 얻어진 포지티브 클론을 포함한 완충 용액 0.5 ㎕를 주형으로 하고, 파지 벡터 내부 서열인 T7 프라이머(TAATACGACTCACTATAGGG) (서열 24) 및 T3 프라이머(ATTAACCCTCACTAAAGGGA) (서열 25), LA-taq 폴리머라제(일본국 다까라 슈조)를 사용하여 96 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초로 이루어지는 공정을 1 사이클로서 35 사이클의 PCR을 실시하였다. PCR 산물을 0.8 ％ 아가로스겔로 전기영동하고, 명료한 단일 밴드가 확인된 클론에 대하여 PCR 증폭 단편을 주형으로 사용하고, ABI377 DNA 시퀀서(미국 PE 어플라이드 시스템즈사)를 사용하여 서열을 결정하였다.
한편, 명료한 2개의 밴드가 확인된 경우, 밴드의 겔에 상당하는 부분으로부터 각각 QIAquick 겔 추출 키트(Gel Extraction kit)(독일, 퀴아젠(QIAGEN)사)를 사용하여 PCR 산물을 추출하고, ABI377 DNA 시퀀서에 의해 서열을 결정하였다.
종양성 골연화증 파지 라이브러리 34만 1천개의 플라크에 대하여 차등 혼성화를 행한 결과, 456개의 포지티브 플라크를 확인하고 이들 모두의 염기 서열을 결정하였다.
<실시예 3>
인간 저인산혈증 유도인자 후보 유전자의 제조
실시예 2에서 얻어진 포지티브 클론 456개의 서열 정보에 대하여, NCBI가 제공하는 염기 서열 데이타베이스인 젠뱅크에 등록되어 있는 염기 서열에 대하여 상동성을 검색하였다. 그 결과, 출현 빈도가 높은 공지 유전자로서 표 1에 기재한 유전자군을 얻을 수 있었다. 한편, 데이타베이스 검색 결과, 생물 활성이 불명확한 미지의 유전자 단편 100개의 클론이 존재하였다. 이들 미지 유전자 단편의 염기 서열 정보에 대하여 클론간의 중복을 빈도 정보로 추출하였다. 그 중에서 가장 고빈도로 중복된 유전자로서 7개의 클론이 연속하여 1개의 콘티그를 형성한 서열 OST311을 얻을 수 있었다. 이 때 얻어진 염기 서열 정보는 서열 1의 염기 번호 1522부터 2770이었다. 이 유전자 단편을 기존 데이타베이스로 검색했더니 cDNA 또는 EST로서 등록되지는 않고 게놈 서열에만 일치하였다. 해당하는 게놈 서열은 AC008012이고, 염색체 상의 12p13에 위치하는 것이 이미 보고되었다. 그러나, 얻어진 서열 내에서는 단백질을 코딩하는 영역(ORF)이 확인되지 않아 3'측 비번역 영역이라고 예상되었기 때문에, 종양성 골연화증 종양 cDNA 라이브러리로부터 cDNA의 전장 클로닝을 실시하였다. 또한, ORF의 예측에는 DNASIS-Mac 버젼 3.7의 ORF 예측 기능을 이용하였다.
클론 ID 빈도 기재
OST 131 236 덴틴(dentin) 매트릭스 단백질-1(DMP1)
OST 1 35 열충격 단백질-90(HSP90)
OST 2 13 오스테오폰틴(osteopontin)
OST 311 7 불명확/게놈 DNA 12p13
OST 1001 4 CD44 항원
OST 584 3 피브로넥틴
OST 666 3 번역 조절 종양 단백질
OST 133 2 베타 2 마이크로글로불린
OST 837 2 섬유아세포 증식 인자(FGF)
OST 562 2 안넥신Ⅱ/리포코르틴Ⅱ
OST 1002 2 시토크롬 c 옥시게나제 서브유닛
OST 1003 2 스타트민(stathmin)
OST 1004 2 불명확
OST 903 2 불명확

<실시예 4>
OST311의 전장 클로닝
실시예 3에서 얻어진 OST311의 서열에 기초하여 이하의 프라이머를 합성하고, 종양성 골연화증 종양 cDNA 라이브러리의 파지 용액을 주형으로 96 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초로 이루어지는 공정을 1 사이클로서 35 사이클의 PCR을 실시하였다.
311-U65: TTCTGTCTCGCTGTCTCCC(서열 12)
311-L344: CCCCTTCCCAGTCACATTT(서열 13)
PCR 산물을 2 ％ 아가로스겔로 전기영동하고, 예상되는 크기의 PCR 산물의 증폭을 확인한 후, MicroSpin 컬럼 S-300HR(미국 아머샴 파마시아 바이오테크사)을 사용하여 PCR 산물을 정제하였다. 얻어진 PCR 산물을 알포스 다이렉트 시스템(미국 아머샴 파마시아 바이오테크사)을 사용하여 메뉴얼에 따라 형광 표지하고, 이것을 프로브로서 2만 클론의 종양성 골연화증 종양 cDNA 라이브러리의 플라크 혼성화 를 실시하였다.
얻어진 40개의 포지티브 클론을 T7 및 T3 프라이머를 사용하여 실시예 2(4)에 기재한 요령으로 PCR 증폭하고, 얻어진 PCR 산물의 염기 서열을 기초로 프라이머 311-L296(서열 14, GGGGCATCTAACATAAATGC)을 합성하였다. 다시 311-U65(서열 12)와 311-L344(서열 13) 프라이머에서 증폭되는 PCR 산물을 프로브로서 2만 클론의 종양성 골연화증 종양 cDNA 라이브러리의 플라크 혼성화를 실시하였다. 포지티브 클론 62개에 대하여 T7과 311-L296(서열 14) 프라이머에서 증폭된 PCR 산물의 염기 서열을 결정하고, 이제까지 판명된 염기 서열과 연결하였다. 그 결과, 서열 1에 나타낸 염기 서열을 얻을 수 있었다. 이 서열 1의 염기 번호 133에 위치하는 개시 코돈으로부터 OST311의 ORF가 시작되는 것이 판명되었다. 또한, ORF의 서열을 최종적으로 확정하기 위해 이하의 프라이머를 합성하였다.
311-F1: AGCCACTCAGAGCAGGGCAC(서열 15, 염기 번호 112-131)
311-F2: GGTGGCGGCCGTCTAGAACTA(서열 16, 벡터 서열)
311-F3: TCAGTCTGGGCCGGGCGAAGA(서열 17, 염기 번호 539-559)
311-L1: CACGTTCAAGGGGTCCCGCT(서열 18, 염기 번호 689-708)
311-L3: TCTGAAATCCATGCAGAGGT(서열 19, 염기 번호 410-429)
311-L5: GGGAGGCATTGGGATAGGCTC(서열 20, 염기 번호 200-220)
311-L6: CTAGATGAACTTGGCGAAGGG(서열 21, 염기 번호 868-888)
상기 311-F2(서열 16) 및 311-L6(서열 21) 프라이머를 사용하고, 종양성 골연화증 종양 cDNA 라이브러리를 주형으로서 Pyrobest DNA 폴리머라제(일본국 다까 라슈조사)를 사용하여 96 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초로 이루어지는 공정을 1 사이클로 한 35 사이클의 PCR을 실시하였다.
이 PCR 산물을 2 ％ 아가로스겔로 전기영동했더니 약 980 염기쌍으로 이루어지는 단일한 증폭 단편이 확인되었다. 따라서, 이 증폭 단편을 상기 프라이머(서열 15 내지 21)를 사용하여 염기 서열 결정한 결과, 서열 1의 염기 번호 133에 위치하는 개시 코돈 ATG 및 염기 번호 886에 위치하는 종결 코돈 TAG에 끼워진 서열 2로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 ORF 영역을 확정하였다(서열 1).
<실시예 5>
OST311의 종양성 골연화증 종양 특이성
OST311의 종양 특이성을 검토하기 위해 종양 조직으로부터 추출한 제1 가닥 cDNA 및 대조군 골조직으로부터 추출한 제1 가닥 cDNA를 주형으로서, 하기에 나타낸 OST311 특이적 프라이머(서열 22 및 23)를 사용하여 96 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초로 이루어지는 공정을 1 사이클로 한 35 사이클의 PCR을 실시하였다. 또한, 양 반응액 중에 최종 농도가 2 ％가 되도록 DMSO를 첨가하고, 효소로는 LA-taq DNA 폴리머라제(일본국 다까라슈조사)를 사용하였다. 또한, 내부 표준으로서 G3PDH에 특이적인 프라이머(FW: ACCACAGTCCATGCCATCAC (서열 26), RV: TCCACCACCCTGTTGCTGTA(서열 27))에 의한 PCR도 동일한 조건으로 실시하였다.
311F1EcoRI: CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(서열 22)
311LHisNot: ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(서열 23)
도 1에 나타낸 바와 같이, 이들 PCR 산물을 2 ％ 아가로스겔로 전기영동했더니, OST311 프라이머를 사용한 경우, 종양 조직을 주형으로 했을 경우에만 예상되는 크기의 PCR 산물이 확인되었다. 한편, G3PDH 프라이머를 사용했을 경우에는 종양 조직, 대조군 골조직 모두 예상되는 크기의 PCR 산물이 동일한 정도로 확인되었다. 이 결과로부터 OST311이 종양 조직에 특이적으로 발현되는 것으로 확인되었다.
<실시예 6>
OST311 안정 발현 CHO 세포의 취득
(1) OST311 발현 벡터의 구축
실시예 5에 나타낸 311F1EcoRI(서열 22) 및 311LHisNot(서열 23) 프라이머를 사용하여, 종양성 골연화증 종양 cDNA 라이브러리를 주형으로서 96 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초로 이루어지는 공정을 1 사이클로 한 35 사이클의 PCR을 실시하였다. 또한, 반응액 중에 최종 농도가 2 ％가 되도록 DMSO를 첨가하고, 효소로는 LA-taq DNA 폴리머라제(일본국 다까라슈조사)를 사용하였다. 311F1EcoRI 프라이머를 코작(Kozak) 서열보다 상류에 위치하는 서열 1의 염기 번호 111에서부터 어닐링하고, 311LHisNot 프라이머를 서열 1의 염기 번호 871에서부터 어닐링하여, 양 프라이머를 이용한 PCR을 행함으로써 서열 2에 나타낸 전장 폴리펩티드를 코딩하는 영역을 증폭할 수 있다. 또한, 311LHisNot 프라이머 중에는 서열 2의 아미노산 번호 251번째에 이어서 히스티딘 잔기가 6개 부가된 후, 종결 코돈이 되는 염기 서열이 포함되어 있다. 따라서, 번역된 재조합 단백질은 C 말단에 His6 태그 서열을 갖고 있으며, 항체에 의한 재조합체의 인식이나 니켈 수지에 의한 재조합체 정제에 유용할 수 있다.
PCR 증폭 단편을 제한 효소 EcoRI 및 NotI로 소화한 후, 마찬가지로 EcoRI 및 NotI로 소화한 동물 세포 발현용 플라스미드 벡터 pcDNA3.1Zeo(미국 인비트로젠( INVITROGEN)사)와 연결하였다. 얻어진 재조합 벡터를 대장균 DH5α 균주에 유전자 도입하고, 100 ㎎/㎖의 암피실린을 포함하는 LB 배지 3 ㎖에서 배양한 후, GFX 플라스미드 정제 키트(미국 아머샴 파마시아 바이오테크사)를 사용하여 플라스미드를 정제하였다. 삽입 유전자의 서열을 통상법에 따라 결정하였는데, 이는 서열 1의 상당 부분과 일치하며 또한 종결 코돈 직전에 His6 태그 서열을 코딩하는 염기 서열이 부가되어 있는 것으로 확인되었다.
(2) OST311 안정 발현 CHO 세포의 취득
실시예 6(1)에서 제조한 OST311 ORF 부분을 삽입한 플라스미드 약 20 ㎍을 벡터 내에 있는 암피실린 내성 유전자를 한군데 절단하는 제한 효소 FspI로 소화한 후, 에탄올 침전시켜 10 ㎕의 초순수에 용해하였다. 그 후, Gene PulserII(미국 바이로 래드(Bio Rad)사)를 사용하여 전기 천공법(일렉트로포레이션; electroporation)에 의해 전량을 숙주 세포에 도입하였다. 숙주 세포로는 CHO Ras 클론-1 세포(Shirahata, S., Biosci. Biotech. Biochem, 59(2): 345-347, 1995)를 사용하였다. 75 ㎠ 배양 플라스크(미국 코닝사) 중 37 ℃, 5 ％ CO2, 습도 100 ％하에서, 10 ％ FCS가 들어간 MEMα 배지에서 배양 면적의 약 90 ％를 차지할 때까 지 CHO Ras 클론-1을 배양하였다. 그 후, 접착 세포를 트립신 처리함으로써 박리시켜 약 1×107개의 세포를 얻었다. 얻어진 세포를 0.8 ㎖의 PBS에 현탁한 후, FspI 소화한 플라스미드와 혼합하여 10분간 빙냉하였다. 플라스미드를 포함한 세포를 0.4 cm 간격의 전용 큐벳에 옮겨 전기 펄스를 0.25 kV, 975 μF의 설정치로 가한 후, 큐벳을 다시 10분간 냉각하였다. 유전자 도입 세포를 10 ％ FCS가 들어간 MEMα 배지에서 24시간 배양한 후, 최종 농도 0.5 ㎎/㎖가 되도록 제오신(미국 인비트로젠사)을 첨가하여 1주일 더 배양하였다. 그 후, 약제 내성능을 나타낸 세포를 클론화하기 위해 한계 희석법에 의해 0.2 세포/웰이 되도록 96웰 플레이트(미국 코닝사)에 다시 접종하고, 최종 농도 0.3 ㎎/㎖의 제오신 존재하에서 약 3주간 배양함으로써 약제 내성주 35개 클론을 얻었다.
(3) OST311 안정 발현 CHO 세포의 재조합체 생산의 확인
약제 내성을 나타낸 35개 클론에 대하여, 그 배양 상청 중의 재조합체 OST311의 존재를 웨스턴 블롯팅법으로 확인하였다.
회수한 배양 상청 0.2 ㎖를 울트라프리-MC M.W. 5,000 컷트 멤브레인 시스템(미국 밀리포어(MILLIPORE)사)을 이용하여 약 40 내지 50 ㎕로 농축하고, 1 M Tris-Cl pH 6.8, 5 ％ SDS, 50 ％ 글리세롤, 100 mM DTT를 포함하는 샘플 완충액을 10 ㎕ 첨가하여 95 ℃에서 5분간 가열하였다. 또한, 10 내지 20 ％ 구배의 폴리아크릴아미드 전기영동으로 배양 상청 중의 단백질을 분리하였다. 그 후, 반건식 블롯팅 장치(미국 아울 세퍼레이션 시스템즈(Owl Separation Systems)사)를 사 용하여 겔 중의 단백질을 임모빌론(Immobilon) PVDF막(미국 밀리포어사)에 전사하였다. 이 PVDF막을 TTBS 완충액(미국 시그마(Sigma)사) 중에서 1/5000 희석한 항 His(C 말단) 항체(미국 인비트로젠사)와 함께 실온에서 1시간 배양한 후, ECL 발광 시스템(미국 아머샴 파마시아 바이오테크사)을 이용하여 필름에 5분간 노광하고, 자동 현상기(일본국 후지필름사)로 현상하였다. 그 결과, 약 32 kDa 및 약 10 kDa에서 가장 강한 시그널이 확인된 클론#20을 단리하였다. 이하, #20 세포를 CHO-OST311H라고 명명하고, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소의 특허 미생물 기탁 센터(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1)에 기탁하였다 (기탁 번호 FERM BP-7273).
<실시예 7>
CHO-OST311H 배양 상청에 의한 인 수송 저해 활성의 측정
CHO-OST311H를 225 ㎠ 배양 플라스크(미국 코닝사) 중 37 ℃, 5 ％ CO2, 습도 100 ％하에서, 10 ％ FCS가 들어간 MEMα 배지에서 플라스크 면적의 약 80 ％를 차지할 때까지 증식시킨 후, 배지를 무혈청 배지 CHO-S-SFM II(미국 라이프 테크놀러지 (LIFE TECHNOLOGY)사) 30 ㎖로 바꾸어 48시간 후에 상청을 회수하였다. 부유 세포 등을 제거하기 위해 상청을 1,200 g으로 5분간 원심분리한 후, 미니스타트-플러스(Minisart-plus) 0.22 ㎛ 필터(독일 사토리우스(Sartorius)사)를 사용하여 여과하였다.
이 배양 상청을 사용하여 인간 신장 근위 세뇨관 세포주(CL-8 세포)의 인산 수송 활성에 대한 작용을 검토하였다. 인간 신장 근위 세뇨관 세포주는 10 ％의 FCS를 포함하는 DMEM 배지(라이프 테크놀러지사)를 이용하여 5 ％ CO2, 습도 100 ％하의 37 ℃에서 배양하였다. 인 수송 활성의 측정에서는, 우선 48-웰 플레이트(미국 코닝사)에 인간 신장 근위 세뇨관 세포주를 10 ％의 FCS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 개시로부터 3일째에 세포가 플레이트 바닥면의 전체를 피복할 때까지 증식시킨 시점에서, 배양액을 200 ㎕의 무혈청 배지 CHO-S-SFMII(미국 라이프 테크놀러지사)로 대체하여 20 내지 24시간 더 배양하였다. 이 상태의 세포를 이용하여 이하의 인산 수송 활성 측정 실험(실험 1과 실험 2)을 실시하였다.
(1) 실험 1:
CHO-S-SFMII 배지를 제거하고, 상술한 CH0-S-SFMII 배지에서 제조한 CHO-OST311H 세포의 배양 상청을 웰당 200 ㎕ 첨가하였다. 이 때 대조군으로서 CHO-S-SFMII를 치환하지 않은 웰 및 CHO-OST311H와 동일하게 제조한 CHO-OST190H 세포의 배양 상청을 200 ㎕ 첨가한 웰을 각각 3웰씩 준비하였다. 상술한 CHO-OST190H 세포는 CHO-OST311H 세포와 동일한 방법으로 본 발명자가 클론화한 OST190H를 발현할 수 있는 형태로 CHO Ras 클론-1에 도입하여 제조한 재조합체 세포이다. CHO-OST190H는 문헌[Rowe, P.S.N.et al, Genomics 67:54-68, 2000]에 보고되어 있는 MEPE라고 명명된 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드의 C 말단에 OST311H와 마찬가지로 His6 태그 서열을 부여한 것을 발현한다. 이 샘플 첨가 후, 26시간 CO2 배양기 내에서 더 배양한 후, 이하에 나타낸 인산 수송 활성 측정법에 의해 각 웰의 세포 의 인산 수송 활성을 측정하였다.
(2) 실험 2:
200 ㎕의 CHO-S-SFMII 중 100 ㎕를 제거하였다. 여기에 CHO Ras 클론-1 세포의 배양 상청 100 ㎕를 첨가한 웰 및 CHO-OST311H 세포 배양 상청을 100 ㎕ 첨가한 웰을 각각 3웰씩 준비하여 24시간 CO2 배양기 내에서 배양하였다. 그 후, 이하의 인산 수송 측정법에 의해 각 웰의 세포의 인산 수송 활성을 측정하였다.
인산 수송 활성 측정법:
배양 상청을 첨가하여 배양이 완료된 세포를, 인산을 포함하지 않는 완충액 (150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1.8 mM MgSO4, 10 mM HEPES pH 7.4)으로 세정한 후, 동일 용액으로 10분간 실온에서 배양하였다. 이 액체를 제거하고, 이 완충액에 방사 활성을 포함하는 KH2PO4(NEN사)를 0.105 mM가 되도록 첨가한 분석 용액을 첨가하여 실온에서 10분간 배양하였다. 배양 종료 후, 분석 용액을 제거하고 즉시 빙냉해 둔 정지 용액(150 mM 염화콜린, 1 mM CaCl2, 1.8 mM MgSO4, 10 mM HEPES pH 7.4)으로 세포를 3회 세정하였다. 이 세정액을 제거한 후, 0.2 N NaOH를 80 ㎕ 첨가하여 실온에서 10분간 배양하고 세포를 용해시켰다. 이 세포 용해액 중의 방사 활성을 측정하기 위해, 이 용해액을 ReadyCap(베크만(Beckman)사)으로 옮겨 50 ℃에서 건조시킨 후, 유리 바이알에 넣어 섬광 계수기(Wallac1410, 파마시아사)로 측정하였다. 각 분석에서의 인산 수송 활성은 배양 상청을 첨가하지 않은 대조군에서의 혼입 평균치를 100 ％로 하여 표 2에 나타내었다. CHO-OST311H 세포의 배양 상청은 유의하게 인간 신장 근위 세뇨관 상피 세포의 인산 수송 활성을 억제하였다.
신장 세뇨관 상피 세포의 인산 수송에 대한 OST311의 활성
실험 1 샘플 인산 수송 활성±SEM t-검정
상청 비첨가 100±1.9 -
CHO-OST190H 103.8±0.9 유의차 없음
CHO-OST311H 87.4±0.2 p<0.01
실험 2 인산 수송 활성±SEM t-검정
CHO 상청 첨가 100±1.5 -
CHO-OST311H 87.2±1.2 p<0.01

<실시예 8>
CHO-OST311H 배양 상청으로부터의 재조합 OST311의 부분 정제
실시예 7에 기재한 요령으로 제조한 배양 상청을 이하에 나타낸 방법으로 부분 정제하였다. 또한, 공정 1) 내지 4)는 4 ℃의 크로마토챔버(chromatochamber) 내에서 실시하였다.
1) ProBond 니켈 수지(미국 인비트로젠사)를 베드 볼륨이 3 ㎖가 되도록 1회용 폴리프로필렌 컬럼에 채워 30 ㎖의 완충액 1(표 3)로 세정, 평형화하였다.
2) 실시예 7에 기재한 요령으로 제조한 배양 상청 120 ㎖를 상기 니켈 컬럼에 자유 낙하에 의해 제공하고 재조합 OST311을 결합시켰다.
3) 표 3에 나타낸 완충액 2를 30 ㎖ 사용하여 비특이적으로 흡착되어 있는 단백질을 제거하였다.
4) 표 3에 나타낸 완충액 3을 3 ㎖씩 4회로 나누어 첨가하여 재조합 OST311을 용출시켰다. 4개의 분획을 20 ㎕씩 각각 원액 상태로 실시예 6(3)에 기재한 요 령으로 웨스턴 블롯팅에 사용하고, 항 His 항체로 OST311을 검출하였다.
그 결과, 제2 분획에 집중하여 약 32 kDa 및 약 10 kDa의 시그널이 확인되었다.
5) 상기 제2 분획을 NAP25 및 NAP10 컬럼(미국 아머샴 파마시아 바이오테크사)에 제공하고, 용매를 표 3에 나타낸 완충액 4로 치환하였다.
6) 완충액 4로 치환한 재조합 OST311을, 고속 액체 크로마토그래피(일본국 히따찌 세이사꾸쇼)를 이용하여 강양이온 교환 수지인 SP-5PW(일본국 도소사)에 1 ㎖/분의 유속으로 제공하고, 표 3에 나타낸 완충액 5를 1 ％/분의 구배로 첨가함으로써 용출하여 2 ㎖씩 분취하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이 각각의 용출 분획에 대하여 실시예 8(5)의 요령으로 웨스턴 블롯팅을 실시하여 OST311을 검출했더니, 약 280 mM NaCl에서 약 10 kDa의 시그널이 분리되고 약 400 mM NaCl에서 약 32 kDa의 시그널이 분리된 것을 확인하였다. 대응하는 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후, 은 염색 키트(일본국 다이이찌 가가꾸사)를 사용하여 염색했더니 약 10 kDa 및 약 32 kDa를 포함하는 분획의 순도가 70 ％ 이상이었다.
완충액 1 완충액 2 완충액 3 완충액 4 완충액 5
10 mM Na/Pi pH 6.5 0.5 M NaCl 10 mM Na/Pi pH 6.5 10 mM 이미다졸 0.5 M NaCl 10 mM Na/Pi pH 6.5 0.5 M 이미다졸 0.5 M NaCl 5 mM CHAPS 10 mM Na/Pi pH 6.5 5 mM CHAPS 10 mM Na/Pi pH 6.5 1 M NaCl 5 mM CHAPS
Na/Pi: 인산나트륨 완충액

<실시예 9>
부분 정제한 재조합 OST311의 N 말단 아미노산 서열 해석
실시예 8에 기재한 방법으로 얻어진 항 His 항체로 인식되는 약 10 kDa 및 약 32 kDa의 부분 정제 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후, 반건식 블롯팅 장치(미국 아울 세퍼레이션 시스템즈사)를 사용하여 겔 중의 단백질을 임모빌론 PVDF 필름(미국 밀리포어사)에 전사하였다. 이 PVDF막을 CBB 염색하여 약 10 kDa 및 약 32 kDa의 밴드를 잘라내고, 단백질 시퀀서 Model492(미국 PE 어플라이드 시스템즈사)를 사용하여 N 말단 아미노산의 서열을 결정하였다.
그 결과, 약 35 kDa 밴드의 N 말단 아미노산 서열은 서열 2의 잔기 번호 25번째의 Tyr로부터 시작되는 OST311의 서열인 것으로 판명되었고, 이러한 점으로부터 서열 2의 잔기 번호 1번째의 Met로부터 24번째의 Ala까지는 분비 시그널 서열로서 절단되어 있는 것으로 확인되었다. 한편, 약 10 kDa 밴드의 N 말단 아미노산 서열은 서열 2의 잔기 번호 180번째 Ser로부터 시작되는 OST311의 서열인 것으로 판명되었다. 이 180번째 Ser 직전에 RRXXR로 이루어지는 모티프가 존재하는 점으로부터 재조합 OST311은 CHO 세포 유래의 어느 한 프로테아제에 의해 절단되는 것으로 판명되었다.
이상의 점으로부터 CHO-OST311H 세포가 생산하는 재조합 OST311은 분비 후, 서열 2에서 잔기 번호 25번째 Tyr로부터 251번째 Ile까지의 폴리펩티드(서열 4), 잔기 번호 25번째 Tyr로부터 179번째 Arg까지의 폴리펩티드(서열 6), 및 잔기 번호 180번째 Ser로부터 251번째 Ile까지의 폴리펩티드(서열 8)의 적어도 3종류의 폴리펩티드로서 존재하는 것으로 판명되었다.
<실시예 10>
항 OST311 부분 펩티드 폴리클로날 항체의 제조
서열 2의 폴리펩티드를 Mac 벡터 버젼 6.5.1의 계산 기능을 이용하여 소수성 정도를 예측하고, 펩티드 항체 제조에 적합한 부위를 예측하였다(도 3A 및 B). 친수성 정도가 높고, 또한 당쇄 수식이나 인산화 부위가 될 수 있는 부위가 아니라는 관점에서 서열 2의 잔기 번호 48번째 Arg로부터 시작되는 20개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드의 C 말단에 합성 단계에서 시스테인 잔기를 인공적으로 부가한 311-48(서열 28), 및 잔기 번호 114번째 Arg로부터 시작되는 20개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드에 동일하게 시스테인 잔기를 부가한 311-114(서열 29)를 항원으로서 선택하여 합성하였다. 또한, 양 펩티드의 C 말단에 합성 단계에서 시스테인 잔기를 인공적으로 부가하여 캐리어 단백질(소 티로글로불린)과의 결합에 사용하였다. 캐리어 단백질과의 결합 및 토끼의 면역화는 면역 생물 연구소(군마껭 후지오까시 1091반지 1고)에 위탁하였다(기탁 번호: 1515).
311-48: RNSYHLQIHKNGHVDGAPHQC(서열 28)
311-114: RFQHQTLENGYDVYHSPQYHC(서열 29)
<실시예 11>
CHO-OST311H 세포의 누드 마우스로의 이식 시험
OST311이 종양성 골연화증의 야기 인자인가를 검증하기 위해 6주령 BALB/c 누드 마우스(수컷)에 CHO-OST311H 세포를 이식하여 종양을 형성시킴으로써, 항시적으로 종양으로부터 재조합 OST311을 분비하는 마우스 종양성 골연화증 모델을 구축 하였다. 실험 대조군으로서 CHO Ras 클론-1 세포와 실시예 7에 기재한 CHO-OST190H도 동일하게 이식 실험에 사용하였다.
(1) CH0 세포 이식
CHO-OST311H 세포와 CHO-OST190 세포를 배양 플라스크로부터 트립신 처리에 의해 분산시켜 1×108개/㎖가 되도록 PBS에 현탁하고, 이것을 누드 마우스의 양 옆구리에 0.1 ㎖씩 피하 주사하였다(2×107개/마리). 또한, 대조군으로서 동일수의 CH0 Ras 클론-1 세포를 동일한 방법으로 피하 주사하였다. 그 후, 약 1개월간 고형식 CE-2(일본국 닛본구레아사) 및 수도물을 자유 섭취시키면서 5마리씩 플라스틱 케이지에서 사육하였다. 이식하고 2주일 경과한 시점에서의 종양 형성이 확인되는 비율은 대조군이 75 ％, OST311군이 66.7 ％였다.
(2) 체중 변화의 비교
CHO-OST311H 세포를 이식하고 나서 31일간의 비종양형성군(avr.-로 표시된 그래프) 및 CHO-OST311H 세포 종양형성군(avr.+로 표시된 그래프)의 평균 체중의 경시 변화를 비교하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이 CHO-0ST311H 세포 종양형성군은 비종양형성군에 비하여 체중 증가 억제를 나타내고, 두가지 군사이에는 명확히 유의차가 확인되었다(24.1±1.5 g 대 26.7±1.0 g, p<0.001, 31일). 한편, 대조군 CHO Ras 클론-1 세포 종양형성군과 비종양형성군과의 평균 체중에 있어서, 동일한 차는 확인되지 않았다(27.0±1.8 g 대 26.7±1.0 g, 유의차 없음, 31일).
(3) 혈청의 인 및 칼슘, 및 뇨중의 인 및 칼슘의 측정
세포를 이식하고 30일 내지 40일 후, 대사 케이지에서 24시간 사육하여 뇨를 회수한 후, 에테르 마취하에서 심장 채혈 또는 안와 채혈을 실시하였다. 말초혈은 마이크로테이너(Micortainer, 미국 벡톤 디킨슨사)에 의해 혈청 분리하였다. 뇨는 용량 측정 후, 원심분리에 의해 상청을 회수하였다. 혈청과 뇨중의 인 농도 측정은 인-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸사)를, 혈청과 뇨중의 칼슘 농도 측정은 칼슘-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸사)를, 혈청과 뇨중의 크레아티닌 농도 측정은 CRE-EN 카이노스(KAINOS, 일본국 카이노스사)를 각각 사용하여 실시하였다.
실험 1:
세포 이식 후 34일째에, 비종양형성군, CHO Ras 클론-1 세포 종양형성군, CHO-OST190H 세포 종양형성군, 및 CHO-OST311H 세포 종양형성군의 혈청 인산 농도를 측정하였다.
실험 2:
세포 이식 후 44일 내지 46일째에 종양 비형성군과 CHO-OST311H 세포 종양형성군에서의 혈청 및 뇨중의 인산 농도, 칼슘 농도, 크레아티닌 농도를 측정하였다. 신장의 인산 및 칼슘 분획 배설은 인산 또는 칼슘의 클리어런스(clearance)를 크레아티닌 클리어런스로 나누어 구하였다.
측정 결과를 이하의 표 4에 나타내었다.
세포 이식 마우스에서 혈청과 뇨중의 인산 및 칼슘 동향 (실험 1)
군 개체수 혈청 인산 농도±SEM(mg/dl) t-검정
종양없는 마우스 7 8.17±0.60 -
CHO ras 클론-1 4 8.50±0.38 유의차 없음
CHO-OST190H 4 9.49±0.52 유의차 없음
CHO-OST311H 9 4.39±0.23 p<0.001

세포 이식 마우스에서 혈청과 뇨중의 인산 및 칼슘 동향 (실험 2)
군 종양없음 CHO-OST311H t-검정
개체수 4 6 -
혈청 인산 농도±SEM(mg/dl) 8.29±0.59 4.25±0.15 p<0.001
신장에서의 인산 분획 배설 0.23±0.02 0.44±0.06 p<0.05
혈청 Ca 농도±SEM(mg/dl) 6.72±0.27 4.61±0.19 p<0.001
신장에서의 칼슘 분획 배설 0.0040±0.0006 0.0059±0.0010 유의차 없음

(4) 전신 골격의 X선 촬영
CHO-OST311H 세포 이식 후, 종양 형성이 확인되는 개체는 비종양형성 개체 또는 대조군 CHO Ras 클론-1 이식 개체에 비하여 현저한 체격 이상과 보행 기능 이상을 드러낸 점으로부터 골격 이상이 예상되었다. 따라서, 대조군 CH0 Ras 클론-1 세포 이식군, CHO-OST190H 세포 이식군, CHO-OST311H 세포 이식군으로부터 종양 형성이 확인되는 개체를 무작위로 추출하여 X선 촬영 장치 μFX-100(일본국 후지필름사)을 사용하여 메뉴얼에 따라 X선 촬영을 실시하였다. X선 촬영은 관전압 25 kV, 관전류 0.1 mA, 조사(照射) 시간 10초로 행하여 전용 이미징 플레이트에 노광하고, BAS2000(일본국 후지필름사)을 사용하여 화상 해석을 행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 CHO-OST311H 이식 개체에 있어서 골조직의 X선 휘도의 감퇴가 전신에서 확인되었고, 석회화의 저하가 확인되었다. 또한, 흉곽의 변형 등의 골격 이상도 확인되었다.
(5) 혈청의 인 및 칼슘 농도, 및 알칼리성 포스파타제 활성의 측정
세포를 이식하고 44일과 46일째에 심장으로부터 채혈하여 얻어진 혈청을 -20 ℃에서 일단 보존한 후, 일제히 해동하여 각 혈청에 포함되는 인 농도, 칼슘 농도를 다시 측정함과 동시에, 알칼리성 포스파타제 활성에 대해서도 측정하였다. 인 농도의 측정은 인-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸사)를, 칼슘 농도의 측정은 칼슘-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸사)를, 알칼리성 포스파타제 활성의 측정은 칼슘알칼리성 포스파 B-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸사)를 각각 사용하여 실시하였다. 결과를 종양 비형성군(n=6), CHO 종양형성군(n=10), CHO-OST190H 세포 종양군(n= 10) 및 CHO-OST311H 종양군(n=6×2)으로 분류하였다. CHO-OST311H군은 44일째에 도살한 군(CHO-OST311H-1: n=6)과 46일째에 도살한 군(CHO-OST311-2: n=6)의 2가지로 분류하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이 CHO-OST311H 종양군에 있어서, 혈청의 인 농도 저하(도 7A), 혈청의 칼슘 저하(도 7B) 및 혈청의 알칼리성 포스파타제 활성 상승(도 7C)과 같이 모두 유의한 변화가 확인되었다.
(6) 신장 근위 세뇨관 상의 나트륨ㆍ인산 공액 수송 담체(NaPi-7)의 발현
i) 근위 세뇨관 상피 세포의 브러쉬보더막(이하, BBM이라고 함)의 제조
CHO-OST311H 종양형성 개체 및 비종양형성 개체로부터 디에틸에테르 마취하에서 신장을 적출하여 중앙부를 관모양으로 절단하여 이등분하였다(실험 1: CHO-OST311H 종양형성 개체 6가지 예, 비종양형성 개체 4가지 예, 실험 2: CHO-OST311H 종양형성 개체 6가지 예, 비종양형성 개체 2가지 예). 각각의 개체로부터 적출한 0.5개분의 신장을 사용하여 케슬러(Kessler)등이 보고한 프로토콜에 따라 BBM을 제조하였다 (Biochem. Biophys. Acta. 506, pp.136-154).
신장을 3 ㎖의 균질화 완충액(50 mM 만니톨, 2 mM Tris/HEPES pH 7.5) 중에서 유리제 균질기를 이용하여 1,300 rpm으로 2분간 파쇄 현탁하여 균질한 신장 추출액을 얻었다. 여기에 최종 농도가 10 mM이 되도록 CaCl2를 첨가하여 4 ℃에서 15분간 교반한 후, 4,900 g으로 15분간 4 ℃에서 원심분리하였다. 얻어진 상청을 킴와이프(Kimwipe)로 여과한 후, 16,200 g으로 60분간 4 ℃에서 더 원심분리함으로써 BBM을 많이 포함하는 분획을 침전시켰다. 이 침전물을 5 ㎖의 현탁 완충액(50 mM 만니톨, 2 mM Tris/HEPES pH 7.5) 중에 분산시킨 후, 다시 16,200 g으로 60분간 4 ℃에서 원심분리하였다. 이 조작을 2회 반복한 후, 0.1 ㎖의 현탁 완충액에 용해하였다. 얻어진 용액을 정해진 방법에 따라 단백질 농도 정량을 실시했더니 3 내지 4 ㎎/㎖였다.
ii) BBM 단백질의 웨스턴 블롯팅
상술한 바와 같이 개개의 마우스로부터 제조한 BBM 단백질을 각각 10 ㎍/㎕가 되도록 현탁 완충액으로 희석하고, 1 M Tris-Cl pH 6.8, 5 ％ SDS, 50 ％ 글리세롤, 100 mM DTT를 포함하는 샘플 완충액을 2.5 ㎕ 첨가하여 95 ℃에서 5분간 가열한 후, 10 내지 20 ％ 구배의 폴리아크릴아미드 전기영동으로 BBM 용액 중의 단백질을 분리하였다. 그 후, 반건식 블롯팅 장치(미국 아울 세퍼레이션 시스템즈사)를 사용하여 겔 중의 단백질을 임모빌론 PVDF막(미국 밀리포어사)에 전사하였 다. 이 PVDF막을 TTBS 완충액(미국 시그마사) 중에 1/2000으로 희석한 항 NaPi-7 폴리클로날 항체와 실온에서 3시간 배양하였다. 본 항체는 기린 비루 가부시키가이샤의 의약 탐색 연구소 내에서 마우스 NaPi-7의 C 말단 부위에 상당하는 합성 펩티드 (LALPAHHNATRL)를 정해진 방법에 따라 토끼를 면역화시켜 얻어진 폴리클로날 항체이다. 이 항체와의 반응 후, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)와 결합시킨 항토끼 IgG 2차 항체(덴마크 다코(DAKO)사)와 배양하고, ECL 발광 시스템(미국 아머샴 파마시아 바이오테크사)을 이용하여 밴드를 검출하였다.
환원 조건하에서 본 항체에 의해 약 80 kDa, 약 35 kDa, 및 약 170 내지 200 kDa의 고분자 스미어(smear) 밴드가 확인되었다(도 8). 이 밴드 패턴은 다쯔미(Tatsumi) 등이 문헌[J. Biol. Chem. Vol. 273, pp28568-28575, 1998]에 보고한 사례와 일치하며, 또한 마우스 또는 래트의 식사중 인산 섭취량에 따라 이들 밴드가 한결같이 변화하는 것이 이미 확인된 점으로부터, NaPi-7 유래의 폴리펩티드인 것으로 판명되었다. 도 8에 나타낸 바와 같이 CHO-OST311H 종양형성 개체로부터 제조한 BBM 단백질에 포함되는 NaPi-7의 시그널은 상술한 단편 모두에 있어서(화살표로 나타낸 밴드) 비종양형성 개체로부터 제조한 그것과 비교하여 현저히 감쇠되어 있었다. 이 결과는 독립적으로 실시한 실험 1 및 2에서 재현되었다. 한편, 이들 BBM 단백질을 10 내지 20 ％ 구배의 폴리아크릴아미드 전기영동으로 분리한 후, CBB 염색한 결과, 각각의 BBM 단백질이 한결같이 염색된 점으로부터 웨스턴 블롯팅에서의 시그널 감쇠는 NaPi-7에 특이적인 것으로 판명되었다(도 8). 이 사실로부터 OST311 단백질은 신장의 근위 세뇨관 세포에 작용하여 NaPi-7의 발 현량을 단백질 수준에서 하향 조절함으로써, 저인산혈증을 야기하는 것이라고 추측된다.
(7) 신장 및 소장에서의 인산 수송 담체와 비타민 D 대사 효소의 mRNA의 변동 해석
i) 전체 RNA의 제조
세포 이식 후 44일 내지 46일째에 도살한 마우스로부터 소장과 신장을 적출하였다. 신장은 드라이아이스로 급속히 냉동하였다. 동결한 신장은 -80 ℃의 초저온 냉동기 안에서 사용시까지 동결 보존하였다. 동결된 신장 1개를 ISOGEN(일본국 닛본 진사) 5 ㎖에 용해하여 메뉴얼에 따라 전체 RNA를 제조하였다. 제조한 전체 RNA 15 ㎍을 통상법에 따라 아가로스 농도 1 ％의 포름알데히드 함유 변성 겔로 전기영동하고, 모세관 전사법에 따라 하룻밤 Hybond-N+(미국 아머샴 파마시아사)에 전사하였다. 전사된 필터를 스트라타링커(Stratalinker, 미국 스트라타진사)로 UV를 조사하고, 전사된 RNA를 고정하여 2XSSC로 세정한 후, 풍건하여 사용시까지 실온에서 보존하였다. 소장은 생리 식염수로 내용물을 세정 제거하고, 반전시킨 후, 표본으로서 소장 상피를 긁어내 액체 질소로 급속히 냉동하였다. 동결한 소장 상피는 -80 ℃의 초저온 냉동기 중에서 사용시까지 동결 보존하였다. 동결된 소장 상피를 ISOGEN(일본국 닛본 진사) 5 ㎖에 용해하여 메뉴얼에 따라 전체 RNA를 제조하였다. 제조한 전체 RNA 20 ㎍을 통상법에 따라 아가로스 농도 1 ％의 포름알데히드 함유 변성 겔로 전기영동하고, 모세관 전사법에 의해 하룻밤 Hybond-N+(미국 아머샴 파마시아사)에 전사하였다. 전사된 필터를 스트라타링커(미국 스트라타진 사)로 UV를 조사하고, 전사된 RNA를 고정하여 2XSSC로 세정한 후, 풍건하여 사용시까지 실온에서 보존하였다.
ii) 프로브용 주형 DNA의 제조
개체 번호 1의 마우스로부터 제조한 전체 RNA 5 ㎍을 사용하여 20 ㎕의 반응액 중(50 mM Tris(pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 25 g/㎖(dT)18, 2.5 mM dNTP, MMLV 역전사 효소(일본국 도요보) 200 유닛)에서 37 ℃로 1시간 cDNA를 합성시킨 후, 70 ℃에서 15분간 처리하여 효소를 불활성화시켰다. 합성된 cDNA는 5배로 희석하여 이하의 반응에 사용하였다.
젠뱅크(미국 NCBI)에 등록되어 있는 서열로부터 이하의 프라이머를 합성하고, PCR 반응에 사용하였다.
마우스 GAPDH cDNA 취득용 합성 프라이머
mGAPDHFW TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC(서열 30)
mGAPDHRV CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC(서열 31)
마우스 Npt-1 cDNA 취득용 합성 프라이머
mNPt1FW GTAAAGAACCCTGTGTATTCC(서열 32)
mNpt1RV CTGCCTTAAGAAATCCATAAT(서열 33)
마우스 NaPi-7 cDNA 취득용 합성 프라이머
mNaPi7FW GAGGAATCACAGTCTCATTC(서열 34)
nNaPi7RV CTTGGGGAGGTGCCCGGGAC(서열 35)
마우스 NaPi-2b cDNA 취득용 합성 프라이머
mNaPi2bFW TCCCTCTTAGAAGACAATACA(서열 36)
mNaPi2bRV GTGTTTAAAGGCAGTATTACA(서열 37)
마우스 비타민 D1α 히드록실라제 cDNA 취득용 합성 프라이머
m1aOHaseFW CAGACAGAGACATCCGTGTAG(서열 38)
m1aOHaseRV CCACATGGTCCAGGTTCAGTC(서열 39)
마우스 비타민 D24 히드록실라제 cDNA 취득용 합성 프라이머
m240HaseFW GACGGTGAGACTCGGAACGT(서열 40)
m24OHaseRV TCCGGAAAATCTGGCCATAC(서열 41)
TakaLa LA-Taq(일본국 다까라슈조)의 메뉴얼에 따라 반응액을 제조하고, 50 ㎖ 반응액 중에 상기 cDNA 1 ㎕ 및 프라이머 각 10 pmol을 첨가하여 94 ℃에서 1분간 보온한 후, 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분의 배양을 1 사이클로서 40 사이클 증폭하고, 0.8 ％ 아가로스겔 전기영동으로 증폭 밴드를 분리하고, 진클린II(미국 Bio101사)를 사용하여 목적하는 단편을 회수하였다. GAPDH에 대해서는 본 조작에서 얻어진 단편을 주형으로서 메가프라이머 라벨링 키트(미국 아머샴 파마시아사)를 사용하여 32P 표지 프로브를 제조하고, 이하의 혼성화에 사용하였다. 다른 유전자에 대해서는 취득한 PCR 단편을 pGEM-T 벡터(Megaprimer Labeling kit, 미국 프로메가 (Promega)사)에 삽입하여 대장균 DH5α에 도입하였다. T7(서열 42) 및 SP6 프라이머(서열 43)를 각 10 pmol 첨가한 PCR 반응액에 형질전환 대 장균을 첨가하여 94 ℃에서 10분간 보온한 후, 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분을 1 사이클로서 40 사이클 증폭하였다. 반응액을 0.8 ％ 아가로스겔 전기영동으로 증폭 밴드를 분리하고 진클린II(미국 Bio101)로써 목적하는 단편을 추출하였다.
T7 TAATACGACTCACTATAGGG(서열 42)
SP6 GATTTAGGTGACACTATAG(서열 43)
이상의 조작에 의해 얻어진 증폭 단편의 염기 서열은 ABI377 DNA 시퀀서(미국 PE 어플라이드 시스템즈사)를 사용하여 결정하여, 각각 목적하는 단편을 취득한 것을 확인하였다. 이와 같이 하여 얻어진 DNA 단편을 메가프라이머 라벨링 키트(미국 아머샴 파마시아)를 사용하여 32P 표지하고, 이하의 혼성화에서 프로브로서 사용하였다.
iii) 혼성화
혼성화는 ExpressHyb 혼성화 용액(미국 클론테크사) 또는 Perfecthyb 혼성화 용액(일본국 도요보)을 사용하여 메뉴얼에 따라 실시하였다. 혼성화 및 세정 종료 후, 이미징 플레이트(일본국 후지필름사)에 30분 내지 하룻밤 노광하고, BAS2000 이미지 분석기(일본국 후지필름사)로 해석하였다(도 9A 내지 C). 아울러 목적하는 밴드의 시그널 강도를 측정하였다. 각각의 유전자의 시그널 강도를 GAPDH의 시그널 강도로 보정한 후, 비종양형성군(개체 번호 1 내지 4)과 종양형성군(개체 번호 5 내지 10)의 평균치 비율을 구하였다. 이하의 표 5에 그 값을 기재하였다. CHO- OST311H 종양 형성에 따라 신장의 I형 인산 수송 담체(NPT-1)는 크게 변동하지 않았지만, 신장의 II형 인산 수송 담체인 NaPi-7의 mRNA는 현저히 감소하였다. 또한, 소장의 인산 수송 담체인 NaPi-IIb의 mRNA도 현저한 감소가 확인되었다. 한편, 신장의 비타민 D 대사 효소에 대해서는 25-히드록시 비타민 D-1-α-히드록실라제(1αOHase)와 25-히드록시 비타민 D-24-히드록실라제(24OHase)의 mRNA가 모두 상승하였다.
비종양형성군에 대한 종양형성군의 각 mRNA 비율(종양형성군/비종양형성군)
NPT-1 0.88
NaPi-7 0.50
NaPi-2b 0.23
비타민 D1α 히드록실라제 3.90
비타민 D24 히드록실라제 1.94

(8) 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D 농도의 측정
종양 이식 후 44일째 및 46일째에 채취한 대조군 마우스의 혈청과 OST311H군 마우스의 혈청을 각 개체로부터 등량씩 채취하여 총량 0.5 ㎖로서 미쯔비시 가가꾸 BCL에 제출하고, 혈청에 포함된 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도를 임상 검사와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 대조군과 OST311군의 혈청 중 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도는 각각 28.0 pg/㎖와 23.9 pg/㎖였다. 상술한 바와 같이 저인산혈증, 저칼슘혈증이 확인되었음에도 불구하고, 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도가 상승하지 않은 것은 확실히 OST311에 의한 작용 결과로서 비타민 D 대사가 영향을 받은 것을 보여주는 것이다.
(9) 대퇴골의 X선 촬영
비종양형성 마우스와 CHO Ras 클론-1, CHO-OST190H, CHO-OST311H를 이식한 마우스를 이식 후 44일째에서 46일째에 도살하여 대퇴골을 채취하고, 4 ％의 중성 포르말린으로 3일간 고정하였다. 그 후, 골 주위의 연조직을 제거하고, 각 군으로부터 2개체를 무작위로 추출하여 X선 촬영 장치 μFX-100(일본국 후지필름사)을 사용하여 관전압 25 kV, 관전류 0.1 mA, 조사 시간 5초로 X선을 조사하고, 이미징 플레이트를 노광하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. CHO-OST311H군에서 피질골의 골양골(骨梁骨)의 감소가 확인되었다.
<실시예 12>
OST311의 염기 서열 상동성과 게놈 영역의 해석
서열 2로 표시되는 아미노산 서열 및 서열 1로 표시되는 염기 서열의 적어도 일부를 사용하여 OST311에 상당하는 분자를 종을 초월하여 검색할 수 있다. 서열 1의 일부 염기 서열을 이용하여 마우스의 게놈 서열 데이타베이스를 검색함으로써, 젠뱅크에 기탁 번호 AC0 15538로 등록되어 있는 마우스의 6번 염색체 서열 중에서 OST311과 상동성이 높은 서열을 발견하였다. 이 서열로부터 얻어진 마우스 OST311의 부분 폴리펩티드의 아미노산 서열을 서열 10에, cDNA의 부분 서열에 상당하는 염기 서열을 서열 9에 나타내었다. 인간 OST311 폴리펩티드와 마우스 OST311의 폴리펩티드 사이에서의 아미노산 상동성을 비교한 결과를 도 6에 나타내었다. 실시예 11에 나타낸 바와 같이, 인간의 아미노산 서열을 갖는 OST311 폴리펩티드는 마우스에 있어서 명확한 생물 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들은 도 6에 나타낸 아미노산 서열에서 상동성이 낮은 영역의 아미노산을 치환 또는 불활성시키거나, 또는 아미노산을 삽입하더라도 활성의 유지가 용이함을 나타낸다.
서열 1에 나타낸 염기 서열을, 데이타베이스에서 일치하는 영역이 확인된 인간 12p13 BAC RPCI11-388F6(기탁 번호 AC008012)과 조합하여 OST311가 코딩되는 영역의 서열을 동정하였다. 서열 11에 OST311의 유전자 근방의 염기 서열을 나타내었다. 서열 11의 염기 번호 498번에서부터 502번에 TATAA 박스가 있다. 서열 11의 염기 번호 1713번으로부터 본 발명자가 동정한 cDNA 서열(서열 1)과 일치하는 서열이 출현하여 2057번까지 계속된다. 이어서, 서열 1에 나타낸 염기 서열과 일치하는 부분은 서열 11의 염기 번호 8732번에서부터 8833번까지이다. 이것은 엑손 2라고 생각된다. 또한, 마지막으로 나타나는 서열 1에 나타낸 염기 서열과 일치하는 부분은, 서열 11의 염기 번호 10644번에서 시작하여 서열 11의 염기 번호 12966번이 서열 1의 염기 서열과 일치하는 말미이다. 이 서열 11의 염기 번호 498번으로부터 염기 번호 12966번까지의 서열은 OST311을 코딩하는 유전자의 적어도 일부라고 생각된다. 또한, 엑손 1과 엑손 2 사이에는 젠뱅크에 기탁 번호 G19259로 등록되어 있는 STS 서열이 존재하는 것으로 판명되었다. OST311은 12p13 영역에 있지만, 문헌[Econs, M. J. et al., J. Clin. Invest, 100: 2653-2657, 1997]에 따르면, 상염색체성의 비타민 D 저항성 곱사병(ADHR)의 책임 유전자는, 연쇄 해석 결과 12p13의 마이크로세텔라이트 마커인 D12S100과 D12S397 사이의 18 cM 내(특히 D12S314와 D12S397 사이의 약 10 cM)에 존재하는 것으로 추정되었다. 본 발명자는 OST311의 유전자와 상기 마이크로세텔라이트 마커의 12번 염색체 상의 물리적 위치 를 조사하였다. 그 결과, D12S100 및 D12S314가 4602 내지 6129 kb이고, OST311이 8958 내지 9129 kb이며, D12S397이 16280 내지 16537 kb라는 결과를 얻었다. 이들 결과와 OST311이 갖는 강력한 인 대사 조절 활성을 고려하면, OST311이 ADHR의 책임 유전자라는 것을 알 수 있다.
<실시예 13>
CHO-OST311H 세포의 누드 마우스로의 단기 이식 시험
CHO-OST311H 세포를 누드 마우스(6주령, BALB/c, 수컷)의 등쪽 피하에 이식하고, 2일 후 및 6일 후의 혈청의 인산 및 칼슘 농도를 측정하여 재조합 OST311이 단기간에 제공하는 영향에 대하여 검토하였다. 실험 대조군으로서 CHO Ras 클론-1 세포를 마찬가지로 이식 실험에 사용하였다.
(1) CH0 세포 이식
실시예 11의 (1)에 기재한 방법과 동일하게 CHO-OST311H 세포 및 CHO Ras 클론-1 세포를 2×107개씩 누드 마우스에 피하 이식하였다(n=6씩). 또한, 동일 용량의 PBS를 동일하게 피하 이식하였다(n=6). 각 군의 6마리씩을 플라스틱 케이지에서 사육하면서 고형식 CE-2(일본국 닛본구레아사) 및 수도물을 자유 섭취시켰다. 이식하고 6일간 경과한 시점에서 현저한 종양 형성은 확인되지 않았다.
(2) 세포 이식 후 2일째의 혈청의 인 및 칼슘 농도 측정
세포 이식한 다음날, 에테르 마취하에서 안와 채혈을 실시하였다. 말초혈은 마이크로테이너(미국 벡톤 디킨슨사)에 의해 혈청 분리하였다. 혈청의 인 농도 측 정은 인-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸사)를, 혈청의 칼슘 농도 측정은 칼슘-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸사)를 각각 사용하여 실시하였다. 도 11A에 나타낸 바와 같이, PBS 투여군 및 CHO Ras 클론-1 세포 이식군에 비하여 CHO-OST311H 세포 이식군은 전체 예에 있어서 혈청 인산 농도의 유의한 저하가 확인되었다. 한편, 혈청 칼슘 농도에 있어서는 변화가 확인되지 않았다. 이들의 결과로부터 OST311은 투여 2일 후에 혈청의 인산 농도만을 저하시키는 것으로 밝혀졌다.
(3) 세포 이식 후 6일째의 혈청의 인 및 칼슘 농도 측정
세포 이식 후 6일째에 에테르 마취하에서 심장 채혈을 실시하였다. 상술한 바와 같이, 각 군의 혈청의 인산 및 칼슘 농도를 각각 측정하였다. 도 11B에 나타낸 바와 같이, 이식 후 2일째와 마찬가지로 PBS 투여군 및 CHO Ras 클론-1 세포 이식군에 비하여 CHO-OST311H 세포 이식군은 전체 예에 있어서 혈청 인산 농도의 유의한 저하가 확인되었다. 한편, CHO-OST311H 세포 이식군은 전체 예에 있어서 혈청 칼슘 농도의 약간의 저하가 확인되었다.
<실시예 14>
재조합체 OST311의 정제
CHO-OST311H 세포를 225 ㎠ 배양 플라스크(미국 코닝사) 중 37 ℃, 5 ％ CO2, 습도 100 ％하에서, 10 ％ FCS가 들어간 MEMα 배지에서 플라스크 면적의 약 80 ％를 차지할 때까지 증식시킨 후, 배지를 무혈청 배지 CHO-S-SFMII(미국 라이프 테크놀러지사) 50 ㎖로 대체하여 48시간 후에 상청을 회수하였다. 이 요령으로 얻 어진 총 1,000 ㎖의 배양 상청을 이용하여 이하의 방법으로 재조합 OST311을 정제하였다.
배양 상청 1000 ㎖를 16,200 g으로 15분간 4 ℃에서 원심분리하여 부유 세포를 제거한 후, 상청을 내경 30 mm×길이 200 mm의 유리 컬럼에 패킹한 SP-세파로스(sepharose) FF(미국 아머샴 파마시아사)에 제공하고, 그 무첨가 분획을 금속 킬레이트 수지인 탈론 슈퍼플로우(Talon Superflow)(미국 클론테크사)에 흡착시켰다. 비특이적인 흡착물을 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.6) 및 0.3 M NaCl로 이루어지는 세정 완충액으로 제거한 후, 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.7) 및 0.2 M 이미다졸로 용출하였다. 도 12의 우측 패널에는 항 His6 항체(미국 인비트로젠사)를 사용하여 이 용출 분획을 검출한 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타내었다. 이 분획에는 실시예 9에 기재한 아미노산 잔기 180번 Ser로부터 251번 Ile로 이루어지는 부분 폴리펩티드(서열 8)가 포함되어 있다. 한편, 상술한 SP-세파로스 FF에 흡착된 배양 상청 중에 포함되는 단백질은 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.7) 및 0 내지 0.7 M까지의 NaCl 농도 구배를 사용하여 용출시켰다. 도 12의 왼쪽 패널에는 항 His6 항체(미국 인비트로젠사)를 사용하여 검출한 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타내었다. 약 0.3 M NaCl에서 용출되는 상기 분획에는 실시예 9에 기재한 아미노산 잔기 25번 Tyr로부터 251번 Ile로 이루어지는 부분 폴리펩티드(서열 4)가 포함되어 있다. 또한, 도 12의 중앙 패널에는 실시예 10에 기재한 OST311 부분 펩티드(서열 29)를 사용하여 제조한 폴리클로날 항체(311-114)에 의해 검출한 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타내었다. 약 0.4 M NaCl의 농도에서 용출되는 상기 분획에는 실시예 9에 기재한 아미노산 잔기 25번 Tyr로부터 179번 Arg로 이루어지는 부분 폴리펩티드(서열 6)가 포함되어 있다. 이와 같이 하여 3종류의 OST311 부분 펩티드, 즉 서열 4(이하, 311:25-251이라고 함), 서열 6(이하, 311:25-179라고 함), 서열 8(이하, 311:180-251이라고 함)을 포함하는 분획은 정제 분리된 후, 한외분자량 10,000의 VIVASPIN 컬럼(미국 사토리우스(Sartorius)사)을 이용하여 농축하고, 1 ㎖의 5 mM HEPES(pH 6.9) 및 0.1 M NaCl로 이루어지는 용매로 대체하였다.
<실시예 15>
골비탈염 절편의 조직학적 검토
실시예 11에서 제조한 CHO-OST311H 세포 이식 마우스와 종양없는 마우스의 도살시, 우측 대퇴골과 경골을 그 무릎 관절에 결합한 상태로 적출하였다. 또한, 경골 골간부와 대퇴골 골간부에서 절단하여, 바로 빙냉해 둔 중성 포르말린 중에 보존하여 비탈염 표본을 제조하였다. 이하에 비탈염 표본의 제조 방법을 기재하였다.
골조직을 빌라누에바 골 염색액(Villanueva bone stain)으로 3 내지 7일간 예비염색하였다. 알콜 탈수열에서 탈수 후 아세톤으로 치환하고, 아세톤ㆍ단량체, 단량체를 통과한 후에 수지 임베딩(embedding)를 행하였다. 수지는 임베딩용 메타크릴산 메틸(MMA) 수지를 사용하고, 수지 내에 조직이 충분히 임베딩되도록 적절하게 MMA를 추가하면서 약 35 ℃의 항온기에 넣어 완전 중합시켰다. 여기서 사용한 임베딩용 MMA는 MMA 단량체(일본국 와꼬 쥰야꾸 고교사) 100 ㎖에 대하여 MMA 중합체(일본국 와꼬 쥰야꾸 고교사) 40 g을 첨가하여 완전 용해시킨 후, 벤졸 퍼옥시드(일본국 나까라이테스크사)를 1 g의 비율로 첨가하여 완전 용해시킨 것이다. 표본은 경골에 대하여 제조하기로 하고, 경골의 해면골을 관찰할 수 있도록 전액 단면에서 트리밍(trimming)을 행한 후 경조직용 마이크로톰(microtome; RM2065형 슈퍼컷, 라이카사 제조)을 사용하여 두께 4 ㎛의 전액 단면 표본을 제조하였다. 후염색으로서 빌라누에바 골드너 염색을 실시하였다. 이와 같이 하여 얻어진 표본은 크실렌 투철(透徹) 후에 클리어 시일(CLEAR SEAL, 일본국 마루토사) 및 원 라이트(ONE LIGHT, 일본국 마루토사)를 사용하여 밀봉하였다.
표본의 현미경 관찰상을 도 13에 나타내었다. CHO-OST311H 종양 마우스에서는 대조군에 비하여 성장판 폭의 증대가 확인되었다. 또한 골간 말단부에서 현저한 골증대와 석회화 영역의 감소가 확인되었다. 섬유성 골수염의 소견은 확인되지 않았으며, CHO-OST311H 종양 마우스로부터 채취한 골은 전형적인 골연화증의 소견을 드러냈다.
<실시예 16>
CHO-OST311H 세포 이식 후 조기의 비타민 D 대사의 검토
OST311의 비타민 D 대사에 미치는 영향을 검토하기 위해, 실시예 13에 기재한 방법과 동일하게 CHO-OST311H 세포의 누드 마우스(6주령, BALB/c, 수컷)로의 이식 시험을 실시하였다. 실험 대조군으로서 CHO Ras 클론-1 세포를 동일하게 이식한 군 및 세포 현탁액과 동일 용량의 PBS를 투여한 군의 2군을 설치하여 비교에 사용하였다. 각 군은 6마리의 마우스로 구성되며, 각 군마다 마우스를 플라스틱 케이지에서 사육하면서 수도물 및 1.03 ％의 무기 인산 및 1.18 ％의 칼슘을 포함한 고형식 CE2(일본국 닛본구레아사)를 자유 섭취시켰다. 이식 후, 1, 2, 3, 6일째의 혈청 1,25-히드록시 비타민 D 농도의 변동 및 비타민 D 대사 효소군의 발현 변화를 검토하였다.
(1) 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D 농도의 측정
세포 이식 후 1, 2, 3, 6일째에 PBS 투여군, CHO-Ras 클론-1 세포 이식군 및 CHO-OST311H 세포 이식군의 마우스로부터 에테르 마취하에 심장 채혈을 실시하고, 마이크로테이너(미국 벡톤 디키슨사)를 사용하여 혈청을 분리하였다. 각 군마다 개개의 마우스로부터 얻어진 혈청을 등량씩 혼합하여 총량을 0.25 ㎖로 하고, 여기에 포함되는 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도를 1,25(OH)2D RIA 키트 "TFB"(일본국 TFB사)를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 PBS 투여군, CHO-Ras 클론-1 세포 이식군에 비하여 CHO-OST311H 세포 이식군에서, 이식 후 1일째에 이미 1,25-디히드록시 비타민 D 농도의 유의한 저하가 확인되었다. 이 저하 작용은 이식 후 2, 3, 6일째에도 확인되었다. 이 결과는 종양성 골연화증에서의 현저한 임상 소견 중 하나인 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D 농도의 저하와 일치하였다.
세포 이식 마우스에서 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도
이식 후 일수 1 2 3 6
PBS 투여군 (pmol/L) n=5 338 164.3 164.5 273.7
CHO-ras 클론-1 이식군 (pmol/L) n=6 271.9 178.3 182.9 184.6
CHO-OST311 이식군 (pmol/L) n=6 46.7 36.3 34.5 49.1

(2) 신장에서의 비타민 D 대사 효소 유전자의 발현 해석
상술한 1,25-디히드록시 비타민 D3 저하 작용이, 신장에서 발현되는 25-히드록시 비타민 D-1-α-히드록실라제(1αOHase) 또는 25-히드록시 비타민 D-24-히드록실라제(24OHase) 유전자의 변동에 기인하는가를 검토하기 위해, 이식 후 3일째의 PBS 투여군, CHO-Ras 클론-1 세포 이식군 및 CHO-OST311H 세포 이식군으로부터 각각 3마리 또는 4마리의 마우스를 무작위로 추출하여 신장을 적출한 후, 실시예 11(7)에 기재한 순서에 따라 전체 RNA를 제조하고, 상기 기재한 프로브를 사용하여 노던 블롯팅을 실시하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. PBS 투여군, CHO-Ras 클론-1 세포 이식군에 비하여 CHO-OST311H 세포 이식군에서 1αOHase 유전자의 mRNA 발현 수준이 현저히 감쇠되는 것으로 확인되었다. 이것은 OST311이 직접적 또는 간접적으로 본 유전자의 발현을 억제함으로써, 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D의 생합성을 억제할 가능성을 시사한다. 한편, 24OHase 유전자의 mRNA 발현 수준은 PBS 투여군, CHO-Ras 클론-1 세포 이식군에 비하여 CHO-OST311H 세포 이식군에서 유의하게 항진되었다. 이것은 OST311이 직접적 또는 간접적으로 본 유전자의 발현을 항진시킴으로써, 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D의 불활성화를 촉진할 가능성을 시사한다.
실시예 11(8)에서, 이식 후 44, 46일째의 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D 농도는 대조군과 비교하여 유의한 차이가 확인되지 않았다. 또한, 1αOHase의 mRNA 발현량이 증가 경향에 있었던 점이 본 실시예에서의 결과와 상이하다. 그 차이를 설명하는 적어도 하나의 가능성으로서 실시예 17에 기재한 혈청중 부갑상선 호르몬 의 영향을 생각할 수 있다.
<실시예 17>
CHO-OST311H 세포 이식 후 조기의 혈청중 부갑상선 호르몬 농도의 검토
실시예 11, 13 및 16에 기재한 CHO 세포 이식 후 1, 2, 3, 6, 45일째의 각 마우스 혈청을 등량씩 혼화하여 0.15 ㎖로 하고, 래트 PTH IRMA 키트(닛본 메디-피직스(Medi-Physics)사)를 사용하여 메뉴얼에 따라 혈청 부갑상선 호르몬 농도를 측정하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, CHO-OST311 이식군에서 유의한 혈청 부갑상선 호르몬의 상승이 확인되었고, 그 차이는 이식 후 45일째에 현저하였다.
세포 이식 마우스에서 부갑상선 호르몬의 농도
이식 후 일수 1 2 3 6 45
PBS 투여군 (pg/ml) n=5 45.2 23.8 28.2 19.7 141.9
CHO-ras 클론-1 이식군 (pg/ml) n=6 15.8 26.6 15.7 13.8 240.4
CHO-OST311 이식군 (pg/ml) n=6 13.8 20.6 44 57.8 3211.7
1종양없는 마우스(n=6)를 이용한 측정치.2n=10.3n=12.

<실시예 18>
CHO 생산형 재조합 OST311H 전장 단백질의 정상 마우스로의 투여 시험
CHO 생산형 재조합 OST311H 전장 단백질의 정상 마우스(BALB/c, 수컷, 6주령)로의 작용을 검토하기 위해, 실시예 14의 (1)에 나타낸 정제법에 의해 아미노산 잔기 25번째 Tyr로부터 251번째 Ile(서열 4)의 C 말단에 히스티딘 태그를 부여한 폴리펩티드를 부분 정제하였다. 이 정제 분획을 정상 마우스의 복강내로 1회당 0.1 ㎖씩 투여하였다. 이 정제 분획 중에는 웨스턴 블롯팅으로 얻어진 형광 강도로부터 대략 0.15 내지 0.75 ㎍의 재조합 OST311이 포함된다고 추정되었다. 대조군으로는 실시예 14와 마찬가지로 용매(5 mM HEPES 완충액/0.1 M NaCl pH=7.0)를 0.1 ㎖씩 복강내에 투여하였다. OST311 투여군 및 대조군은 각각 5마리의 마우스로 구성되며, 각 군마다 마우스를 플라스틱 케이지에서 사육하면서 수도물 및 1.03 ％의 무기 인산 및 1.18 ％의 칼슘을 포함한 고형식 CE2(일본국 닛본구레아사)를 자유 섭취시켰다.
[시험 1]
시험의 개략적인 내용을 도 15의 A에 나타내었다. 1회째 복강내 투여로부터 계산하여 5, 10, 23, 28, 33시간 후에 추가 투여를 행하여 총 6회의 복강내 투여를 실시하였다. 그 후, 1회째 복강내 투여로부터 계산하여 36, 47, 71시간 후에 유리제 모세관을 사용하여 안와로부터 채혈하고, 마이크로테이너(미국 벡톤 디킨슨사)를 사용하여 혈청을 분리하였다.
얻어진 혈청 중의 인산 및 칼슘 농도를 인-테스트 와꼬 또는 칼슘-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸)를 사용하여 메뉴얼에 따라 결정하였다. 그 결과, 도 15의 B에 나타낸 바와 같이 1회 투여로부터 36시간 후의 OST311 투여군에서, 유의한 혈중 인 저하 작용을 확인하였다(t-검정 **p<0.001, *p<0.01). 또한, 이 작용은 그 후 11시간 경과 후에도 유지되었다(1회 투여로부터 47시간 후). 한편, 1회 투여 71시간 후(최종 투여 후 38시간 후)에는 본 활성이 소실되었다. 또한, 모든 시간에 있 어서 혈중 칼슘 농도에는 유의한 변화가 확인되지 않았다(도 15의 C).
[시험 2]
시험의 개략적인 내용을 도 16의 A에 나타내었다. 1회째 복강내 투여로부터 계산하여 5, 11시간 후에 추가 투여를 행하여 총 3회의 복강 투여를 실시하였다. 그 후, 1회째 복강내 투여로부터 계산하여 13, 24시간 후에 유리제 모세관을 사용하여 안와로부터 채혈하고, 마이크로테이너(미국 벡톤 디킨슨사)를 사용하여 혈청을 분리하였다. 얻어진 혈청 중의 인산 및 칼슘 농도를 인-테스트 와꼬 및 칼슘-테스트 와꼬를 각각 사용하여 메뉴얼에 따라 측정하였다. 그 결과, 도 16의 B에 나타낸 바와 같이 13시간 후의 OST311 투여군에서 유의한 혈청 인산 농도의 저하 작용을 확인하였다(t-검정 **p<0.05, *p<0.01). 또한, 이 작용은 그 후 11시간 경과 후에도 유지되었다. 또한, 모든 시간에 있어서 혈중 칼슘 농도에는 유의한 변화가 확인되지 않았다(도 16의 C).
시험 1 및 2의 결과로부터, CHO 생산형 재조합 OST311 단백질의 전장 분획이 복강내 투여에 의해 정상 마우스에 저인산혈증을 야기하고, 또한 그 혈청 인산 농도의 저하 작용은 1회 투여후 13시간 후에 확인되며, 또한 그 활성은 투여 중지 후 적어도 11시간은 지속되는 것으로 판명되었다.
<실시예 19>
OST311로의 아미노산 변이 도입
실시예 9에 기재한 바와 같이, CHO-OST311H 세포에 의해 생산되는 재조합 OST311의 일부는 생산 과정에 있어서 아미노산 잔기 25번째 Tyr로부터 179번째 Arg까지의 서열을 갖는 폴리펩티드(서열 6), 및 아미노산 잔기 180번째 Ser로부터 251번째 Ile까지의 서열을 갖는 폴리펩티드(서열 8)로 절단되는 것으로 판명되었다.
이 절단은 아미노산 잔기 180번째 Ser 직전에 있는 RXXR 또는 RRXXR 서열로 이루어지는 모티프를 인식하는 프로테아제에 의한 것일 가능성을 생각할 수 있다. 전장형 재조합체를 생체내에 투여했을 때에도 그 절단 또는 그에 유사한 분해를 받을 가능성을 생각할 수 있다. 따라서, 아미노산 잔기 176번째의 Arg 및 아미노산 잔기 179번째의 Arg 두가지를 Gln로 치환할 수 있는 서열을 코딩하는 변이 도입 유전자 OST311RQ를 제조하였다.
(1) OST311/pCAGGS 플라스미드의 제조
OST311H/pcDNA3.1 플라스미드를 주형으로서 311F1EcoRI(서열 22) 및 311LNot (서열 44)를 프라이머에 사용하고, LA Taq 폴리머라제(일본국 다까라슈조사)에 의한 PCR을 행하였다. 반응은 94 ℃에서 1분간 보온한 후, 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분을 1 사이클로서 25 사이클 실시하였다. 반응 종료 후, PCR 산물의 말단을 T4 DNA 폴리머라제(스위스 로슈(Roche)사)에 의해 평활화하고, 페놀/클로로포름 처리에 의해 효소를 불활성화시켰다. DNA를 에탄올 침전시킨 후, 폴리뉴클레오티드키나제(스위스 로슈사)에 의해 DNA 말단의 인산화를 행하였다. 0.8 ％ 아가로스겔 전기영동에 의해 목적하는 DNA 단편을 분리하고, 진클린II(미국 Bio101사)를 사용하여 회수하였다. 플라스미드 벡터 pCAGGS(Niwa H, et al., Gene. 1991 Dec 15; 108(2): 193-9.)를 EcoRI로 소화하고, Klenow 단편(스위스 로 슈사)을 사용하여 말단의 평활화를 행하였다. 이어서, 소 소장의 알칼리성 포스파타제(일본국 다까라슈조사)를 사용하여 DNA 말단의 탈인산화를 행하고, 0.8 ％ 아가로스겔 전기영동에 의해 목적하는 DNA 단편을 분리하고, 진클린II(미국 Bio101사)를 사용하여 회수하였다. DNA 라이게이션(ligation) 키트 버젼 2(일본국 다까라슈조사)를 사용하여 메뉴얼에 따라 얻어진 OST311 cDNA와 pCAGGS 플라스미드 소화물을 결합시켰다. 이것을 대장균 DH5α에 도입하여 클론화하고, 목적하는 플라스미드를 취득하였다. 이 플라스미드 DNA를 OST311RQH 유전자의 제조에 사용하였다.
311LNot: ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(서열 44)
(2) OST311RQH 유전자의 제조
이하의 프라이머를 합성하였다.
OST311ME1: ATGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGG(서열 45)
OST311HNt: ATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGATGAACTTGGCGAAGGG(서열 46)
OST311RQF: ATACCACGGCAGCACACCCAGAGCGCCGAG(서열 47)
OST311RQR: CTCGGCGCTCTGGGTGTGCTGCCGTGGTAT(서열 48)
OST311ME1은 OST311의 개시 메티오닌을 포함하는 부분의 순방향 프라이머이고, OST311HNt는 OST311의 3' 말단에 6개의 히스티딘을 부가하는 역방향 프라이머이며, OST311RQF 및 OST311RQR은 각각 OST311 cDNA의 코딩 영역 중 527번째 및 536번째의 구아닌(서열 1의 659번째 및 668번째의 구아닌에 상당)을 아데닌으로 치환함으로써 아미노산 번호 176번째 및 179번째의 아르기닌을 글루타민으로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. pfu DNA 폴리머라제(미국 프로메가사)를 사용하여 메뉴얼에 따라 2종류의 반응액을 20 ㎕ 제조하였다. 한편으로는 프라이머로서 OST311ME1, OST311RQR을 최종 농도 0.2 μM으로 사용하고, 주형으로는 실시예 6의 (1)에 기재한 OST311 발현 벡터 10 ng을 사용하였다. 94 ℃에서 1분간 보온한 후, 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분을 1 사이클로서 25 사이클 PCR 반응을 실시하였다. 또 한편으로는 프라이머로서 OST311RQF, OST311HNt를 최종 농도 0.2 μM으로 사용하고, 주형으로는 OST311/pCAGGS 플라스미드 10 ng을 사용하였다. 94 ℃에서 1분간 보온한 후, 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분을 1 사이클로서 35 사이클 PCR 반응을 실시하였다. 상기 2종류의 반응물을 각각 10배로 희석하고, 각각 1 ㎕을 LA Taq 폴리머라제(일본국 다까라슈조사) 메뉴얼에 따라 제조한 반응액 50 ㎕에 첨가하였다. LA Taq 폴리머라제(일본국 다까라슈조사)를 사용하고, 프라이머로서 OST311ME1, OST311HNt를 최종 농도 0.2 μM으로 사용하여 94 ℃에서 1분간 보온한 후, 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분을 1 사이클로서 25 사이클 PCR 반응을 실시하고, 72 ℃에서 7분간 더 보온하였다. 얻어진 반응 생성물을 페놀/클로로포름으로 처리하여 단백질을 제거하고 에탄올 침전을 행한 후, EcoRI 및 NotI로 소화하여 2 ％ 아가로스겔 전기영동에 의해 약 800 bp의 DNA 단편을 분리하고, 진클린II(미국 Bio101사)를 사용하여 회수하였다. 얻어진 DNA 단편을 플라스미드 pEAK8(미국 엣지바이오 시스템사)에 분자내 리보솜 유입 부위(IRES) 및 증강형 녹색 형광 단백질(EGFP)을 연결함으로써 제조한 벡터 IRES-EGFP-pEAK8의 EcoRI 및 NotI 부위에 삽입함으로써 OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8 플라스미드를 얻었다. 통상법에 따라 플라스미드 DNA를 제조하여 ABI3700 형광 DNA 시퀀서(미국 PE 어플라이드 시스템즈사)에 의해 염기 서열을 결정하고, 목적하는 R176Q 및 R179Q의 변이가 도입되고 또한 C 말단에 히스티딘 태그를 코딩하는 것을 확인하였다. 이 유전자로 코딩되는 폴리펩티드를 이하 OST311RQH라고 한다.
(3) CHO 안정 발현 세포의 취득
트랜스펙탐(Transfectam, 미국 프로메가사)을 사용하여 메뉴얼에 따라 CH0-Ras 클론-1세포에 OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8 플라스미드를 도입하였다. 5 ㎍/mL 퓨로마이신, 10 ％ FCS를 포함하는 MEMα 배지에서 약제 내성 세포를 선택하고, FACS 벤티지(vantage)(미국 벡톤 디킨슨사)에 의해 GFP(녹색 형광 단백질)의 발광 강도가 강한 세포를 선별하여 클론화하였다. 클론화한 세포가 조밀해진 시점에서 혈청을 포함하지 않는 DF(DMEM/F-12) 배지로 치환하여 2일 후에 상청을 회수하였다. 회수한 상청 50 ㎕을 96웰 컨버터블 여과 장치(미국 라이프테크오리엔탈 (Lifetechoriental)사)를 이용하여 임모빌론 P 필터(미국 밀리포어사)에 흡착시켰다. 제조한 필터를 TBS, TTBS로 세정한 후, 블로케이스(Blockace, 일본국 다이이찌 세야꾸사)로 1시간 실온에서 블로킹하였다. 블로킹 후, 블로케이스에서 5,000배로 희석한 HRP 표지 항 His6 모노클로날 항체(미국 인비트로젠사)와 1시간 반응시켰다. 반응 후 TTBS, TBS로 세정하고, ECL(미국 아머샴 파마시아사)을 사용하여 메뉴얼에 따라 시그널을 검출하였다. 이 시그널 강도를 기초로 고발현 클론 CHO-OST311RQH를 선택하였다.
(4) OST311RQHpEAK rapid 배양 상청의 제조
pEAK rapid 세포(미국 엣지바이오 시스템즈사)를 조직 배양용 플라스크(225 ㎠ 미국 코닝사) 20개에 접종하였다. 이 세포에 pEAK 시스템 메뉴얼(미국 엣지 바이오 시스템즈사)에 따라 OST311RQH/IRES-GFP/pEAK8 플라스미드 0.48 ㎎을 인산칼슘법으로 트랜스펙션(transfection)하였다. 4시간 정치 후, 플라스크 1개당 50 mL의 혈청 무함유 MEMα 배지로 치환한 후, 2일간 37 ℃에서 배양하여 그 상청을 회수하였다.
(5) 재조합 OST311RQH의 발현 확인
상술한 CHO-OST311RQH 세포 클론 2종류 및 pEAK rapid 세포를 이용한 일과성 발현의 배양 상청 각 10 ㎕를 실시예 6의 (3)에 기재한 요령으로 웨스턴 블롯팅에 사용하여 배양 상청 중의 재조합 OST311RQH의 존재를 검토하였다. 검출 항체로는 항 His(C 말단) 항체(미국 인비트로젠사)를 사용하였다. 그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 모든 배양 상청 중에서 실시예 6의 (3)에 기재한 약 32 kDa의 밴드와 동일 위치에 존재하는 강한 시그널을 확인하였다. 또한, 모든 배양 상청 중에서 CHO-OST311H 배양 상청 중에 존재하는 약 10 kDa의 시그널은 웨스턴 블롯팅에서 확인할 수 없었다. 이러한 점으로부터 R176Q 및 R179Q의 변이를 도입함으로써 이 위치에서 발생한다고 추정되는 폴리펩티드의 절단이 저해 또는 경감되며, 그 결과 아미노산 번호 180번째 Ser로부터 251번째 Ile까지의 서열을 갖는 폴리펩티드(서열 8)의 존재비가 현저히 감소한 것이라고 추측된다.
<실시예 20>
재조합 OST311RQH의 정상 마우스로의 투여 시험
실시예 19의 (5)에서 제조한 배양 상청 500 ㎖로부터 실시예 14의 (1)에 기재한 방법에 준하여 약 2.8 ㎍/㎖의 재조합 OST311RQH 단백질을 포함하는 정제 분획을 얻었다. 이 정제 분획을 정상 마우스(BALB/c, 수컷, 6주령)의 복강내로 1회당 0.1 ㎖씩 연속 투여하고, 혈청의 인산, 칼슘 및 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도를 측정하였다. 대조군에 있어서는 용매(5 mM HEPES 완충액/0.1 M NaCl pH=7.0)를 0.1 ㎖씩 동일하게 복강내로 투여하였다. OST311RQH 투여군 및 대조군은 각각 6마리의 마우스로 구성되며, 각 군마다 마우스를 플라스틱 케이지에서 사육하면서 수도물 및 1.03 ％의 무기 인산 및 1.18 ％의 칼슘을 포함한 고형식 CE2(일본국 닛본구레아사)를 자유 섭취시켰다.
시험 프로토콜을 도 18의 A에 나타내었다. 1회 투여 개시로부터 5, 10, 24, 29, 34시간 후에 추가 투여를 실시하여 총 6회 연속 투여하였다. 도중에 1회 투여로부터 24시간 후(4회째 투여 직전)에 유리제 모세관을 이용하여 안와 채혈을 실시하고, 1회 투여로부터 48시간 후에 에테르 마취하에서 심장 채혈을 행하였다.
(1) 혈청의 인산 및 칼슘 농도 측정
1회 투여 후 24시간째 및 48시간째의 혈청으로부터 실시예 14의 (3)에 기재한 방법으로 혈청 인산을 측정하였다. 그 결과, 도 18의 B에 나타낸 바와 같이 모든 채혈 시간에 있어서 OST311RQH 투여군은 유의한 저인산혈증을 나타내었다(t-검정 **p<0.01, *p<0.05). 한편, 혈청 칼슘 농도에 유의한 변동은 확인되지 않았다(도 18의 C).
(2) 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D 농도의 측정
1회 투여 후 48시간째에 개개의 마우스로부터 채취한 혈청을 등량씩 각군 마다 혼화하고, 실시예 16의 (1)에 기재한 방법으로 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도를 측정하였다. 그 결과, 대조군이 244.7 pmol/L을 나타낸 데 비하여, OST311RQH 투여군은 24.6 pmol/L로 현저한 저하를 나타내었다.
<실시예 21>
CHO-OST311RQH 세포 이식 시험
실시예 19의 (3)에서 수립한 OST311RQH 안정 발현 세포 CHO-OST311RQH의 누드 마우스(7주령, BALB/c-누드, 수컷, n=8)로의 이식 시험을 실시예 13에 기재한 방법과 동일하게 실시하였다. 대조군으로서 CHO Ras 클론-1 세포를 동일하게 이식하였다(n=6). 각 군마다 마우스를 플라스틱 케이지에서 사육하면서 수도물 및 1.03 ％의 무기 인산 및 1.18 ％의 칼슘을 포함한 고형식 CE2(일본국 닛본구레아사)를 자유 섭취시켰다.
세포 이식 후 2일째에 유리제 모세관을 이용하여 안와 채혈을 실시하고, 실시예 14의 (3)에 기재한 방법과 동일하게 혈청의 인산 및 칼슘 농도를 측정하였다. 도 19의 A에 나타낸 바와 같이, CHO-OST311RQH 세포 이식군에 있어서 유의한 혈청 인산의 저하를 확인하였다(t-검정 *p<0.001). 한편, 혈청 칼슘 농도에 유의한 변화는 확인되지 않았다(도 19의 B).
<실시예 22>
항 OST311 부분 펩티드 폴리클로날 항체의 제조 (2)
실시예 10에 기재한 요령으로 OST311의 부분 펩티드 4종류를 더 제조하였다(서열 49에서 52). 이들을 항원으로 하여 토끼를 면역화시키고, 얻어진 항혈청을 이용하여 실시예 6의 (3)에 기재한 방법에 준하여 웨스턴 블롯팅을 실시하고, CHO-OST311H 세포의 무혈청 배양 상청 중의 재조합 OST311H를 검출하였다. 항체 반응은 각각의 펩티드에 대한 항혈청을 TTBS로 250배 희석한 액체 중 4 ℃에서 하룻밤 진탕시켜 행하였다. 세정 후, 여기에 알칼리성 포스파타제 표지 염소 항토끼 항체 (덴마크 다코사)를 결합시킨 후, 알칼리성 포스파타제 발색 키트(미국 바이오-래드사)를 사용하여 재조합 OST311을 검출하였다(도 20).
부분 펩티드
311-148: GMNPPPYSQFLSRRNEC(서열 49)
311-170: CNTPIPRRHTR(서열 50)
311-180: SAEDDSERDPLNVLKC(서열 51)
311-210: LPSAEDNSPMASDC(서열 52)
<실시예 23>
OST311 단백질 검출용 ELISA 시스템의 구축
(1) 항 OST311 부분 펩티드 토끼 항혈청으로부터의 항체 정제
이코노-팩(Econo-Pac) 1회용 크로마토그래피 컬럼(미국, 바이로-래드사)에 단백질 A 세파로스 4FF(미국 아머샴 파마시아사)를 슬러리로 3 ㎖ 충전하고, 10 ㎖ 의 0.1 M 글리신 염산 완충액(pH 3.3) 및 20 ㎖의 PBS를 사용하여 세정하였다. 실시예 10에 기재한 2종류 및 실시예 22에 기재한 4종류의 토끼 항혈청을 각각 800 내지 900 ㎕ 첨가하고, 항체 분획을 수지에 흡착시켰다. 컬럼을 9 ㎖의 PBS로 세정하여 불순물을 제거한 후, 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.3)를 1 ㎖씩 첨가함으로써 IgG 용출 분획을 얻었다. 용출시 각 분획에 10 ㎕의 중화 완충액(1 M Tris)을 수시로 첨가하여 용액을 중화하였다. 용출 분획 중에 포함되는 항체 농도를 280 nm의 흡광도로 측정함으로써 결정하고(흡광 계수: 1.34(㎎/㎖)-1ㆍ(cm)-1로서 산출), 몇가지 분획을 함께 NAP25 컬럼에 적용하여 50 mM 탄산수소나트륨 용액으로 치환하였다. 그 결과, 각각의 펩티드 항혈청으로부터 5 내지 15 ㎎의 항체를 얻을 수 있었다(이 폴리클로날 항체를 이하 각각 311-48 항체, 311-114 항체, 311-148 항체, 311-170 항체, 311-180 항체, 311-210 항체라고 함).
(2) 항 OST311IgG의 바이오틴화
상술한 6종류의 항 OST311 펩티드 폴리클로날 항체 모두에 대하여 50 mM 탄산수소나트륨 용액으로 1 ㎎/㎖가 되도록 희석한 후, 각각 1 ㎎의 항체와 10 ㎕의 디메틸포름아미드에 용해한 바이오틴-AC5-Osu(일본국 도진 가가꾸) 용액(1.82 ㎍/㎖)을 4 ℃에서 2시간 전도 혼화하였다. 그 후, 혼합액을 NAP10 컬럼에 적용하여 미반응의 바이오틴-AC5-Osu를 제거함과 동시에, 용매를 PBS로 치환하여 6종류의 바이오틴화 항 OST311 펩티드 폴리클로날 항체를 얻었다.
(3) 항 OST 펩티드 토끼 폴리클로날 항체를 이용한 샌드위치 ELISA법에 의한 OST311 발현 세포 배양 상청 중의 OST311 검출
6종류의 고상화용 항 OST311 펩티드 폴리클로날 항체에 대하여 상술한 6종류의 바이오틴화 항체를 검출용으로서 조합시킴으로써 샌드위치 ELISA 시스템을 구축하고, OST311 발현 세포 배양 상청 중의 OST311 단백질의 검출을 검토하였다.
상술한 단백질 A 정제에 의해 얻어진 고상화용 항 OST311 펩티드 폴리클로날 항체 6종을 50 mM 탄산수소나트륨 용액으로 10 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96웰 ELISA용 플레이트 Maxisorp(미국 누크(Nunc)사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 1시간 정치함으로써 IgG를 고상화하였다. 그 후, 반응액을 제거하고, TBS 중 슈퍼블록(Superblock) 블로킹 완충액(미국 피어스(PIERCE)사)를 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 10분간 블로킹하였다. 용액을 제거한 후, 실시예 19의 (5)에 기재한 OST311RQH/pEAK rapid 배양 상청, 또는 대조군으로서 MEMα 배지를 1 웰당 50 ㎕씩 첨가하여 실온에서 1시간 정치함으로써 고상화 항체와 결합시켰다. 항체 반응 후, TTBS로 3회 세정하고, 10 ％ 블로케이스(일본국 다이닛본 세야꾸사)를 포함하는 TTBS로 10 ㎍/㎖로 희석한 상기 바이오틴화 항 OST311 항체 6종(311-48, 311-114, 311-148, 311-170, 311-180, 311-210)을 각각 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 30분간 정치하고 2차 항체 반응을 행하였다. 각 웰을 TTBS로 3회 세정한 후, 10 ％ 블로케이스를 포함하는 TTBS로 10,000배로 희석한 HRP 표지 스트렙타비딘(덴마크 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30분간 정치하여 바이오틴화 항체와 결합시켰다. 각 웰을 TTBS로 3회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 5분간 발색시킨 후, 0.5 M 황산 용액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 측정은 96웰 플레이트용의 흡광도 측정 장치 MTP-300(일본국 코로나 덴끼사)을 이용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 나눈 값을 구하였다. 대조군으로서 MEMα만을 첨가한 경우의 450 nm/570 nm의 값은 모두 0.02 이하였다. 한편, 도 21의 A에 나타낸 바와 같이 311-48 항체를 고상화하여 311-180 항체로 검출하는 조합, 또는 311-180 항체로 고상화하여 311-148 항체로 검출하는 조합에서는 대조군에 비해 유의한 배양 상청 중의 OST311RQH를 검출할 수 있었다. 또한, 예를 들면 311-48 항체를 고상화하여 311-148 항체로 검출하는 조합을 사용한 경우에는, 두 항체의 항원 부위가 OST311 단백질의 실시예 9에 기재한 절단 후의 N 말단측 부분 펩티드(서열 6)에 포함되기 때문에, 전장 폴리펩티드를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그 N 말단 부분 폴리펩티드 단편도 검출할 수 있다고 예상된다. 한편, 311-210 항체를 고상화하여 311-180 항체로 검출하면, 전장 뿐만 아니라 실시예 9에 기재한 절단 후의 C 말단측 부분 펩티드(서열 8)를 검출할 수 있다고 예상된다. 따라서, 이들의 조합을 복합적으로 이용함으로써 생체 시료 등의 검체 중의 OST311 전장 폴리펩티드와 부분 폴리펩티드의 절대량 측정과 존재비의 식별이 가능해진다.
(4) 항 OST311 펩티드 토끼 폴리클로날 항체를 이용한 샌드위치 ELISA법에 의한 재조합 OST311 단백질 농도의 정량
상술한 ELISA 시스템에 대하여 고상화 항체로서 311-48 항체 또는 311-180 항체를, 검출용 항체로서 311-148 항체를 사용한 조합으로 1, 0.67, 0.33, 0.1, 0.067, 0.033 및 0.01 ㎍/㎖의 희석 계열로 이루어지는 정제 재조합 OST311H의 검 출을 검토하였다. 그 결과, 도 21의 B에 나타낸 바와 같이, 0.1 내지 1 ㎍/㎖의 범위 내에서 양호한 1차 회귀 직선을 얻을 수 있었던 점으로부터(311-48: R2=0.990, 311-180: R2=0.996), 적어도 이 농도 범위에서의 재조합 OST311H를 검출할 수 있는 것으로 판명되었다.
<실시예 24>
재조합 OST311 단백질의 1회 투여에 의한 영향의 검토
CHO 생산형 재조합 OST311H 전장 단백질의 정상 마우스 (BALB/c, 수컷, 6주령)에 대한 단기 작용을 검토하기 위해, 정제된 재조합 OST311H 전장 단백질을 꼬리 정맥내에 1 마리당 5.0 ㎍/0.1 ml씩 1회 투여하였다. 대조군으로는 용매 (PBS)를 0.1 ml씩 꼬리 정맥내에 투여하였다. 투여한 후 1, 3, 8 시간 째에 심장 채혈 및 해부를 실시하고, 혈청의 인산, 칼슘 및 비타민 D의 농도를 측정한 후, 신장 근위 세뇨관상 나트륨ㆍ인산 공액 수송체의 발현량을 해석하였다. OST311 투여군 및 대조군은 각각 6 마리의 마우스로 구성되고, 수도물 및 1.03 ％의 무기 인산 및 1.18 ％의 칼슘을 포함한 고형식 CE2(닛본구레아사, 일본)을 자유 섭취시켰다.
(1) 혈청 인산 농도의 경시 변화
하기 표 8에 기재한 대로, OST311 단백질을 1회 투여한 후, 1, 3 시간 째에는 혈청 인산 농도에 현저한 차이가 확인되지 않았던 것에 비해 투여 후 8 시간에는 현저한 저하가 확인되었다. 이 결과에서 OST311의 작용에 의한 혈청 인산 농도의 저하는 3 시간에서 8 시간을 필요로 하는 것이 분명해졌다. 한편, 어느 시간에 서도 혈청 칼슘 농도의 변화는 확인되지 않았다.
혈청 인산 농도
시간 1 3 8
비히클 투여군 (mg/dL) 9.82±0.61 9.99±0.20 9.55±0.29
OST311 투여군 (mg/dL) 9.61±0.51 9.96±0.39 7.82±0.27
t-검정 p>0.5 p>0.5 p<0.005

(2) 신장 근위 세뇨관상 나트륨ㆍ인산 공액 수송체의 발현
실시예 11의 (6)에 기재된 방법에 따라, 투여 후 1, 3, 8 시간째에 신장을 각 군마다 혼합하여 근위 세뇨관의 브러쉬보더막(BBM)을 제조하였다. 얻어진 BBM 중의 나트륨ㆍ인산 공액 수송체(NaPi7) 단백질의 존재비를 웨스턴 블롯팅법에 의해 해석하였다. 도 22의 A에 기재한 대로, 투여 후 1, 3 시간째에 NaPi7의 발현량은 비히클 투여군과 동등한 것에 비해, 투여 후 8 시간째에 OST311 투여군의 NaPi7은 비히클 투여군에 비하여 유의하게 저하되고 있는 것이 분명해졌다. 한편, 이 NaPi7 단백질의 감소가 RNA의 전사 조절에 의한 것인지를 검토하기 위해 실시예 11(7)의 순서에 따라 각각의 마우스에서 적출된 신장에서 전체 RNA를 제조하고 동 기재된 프로브를 사용하여 노던 블롯팅을 실시하였다. 그 결과, 도 22의 B에 기재된 대로 투여 후 1, 3 시간째에 NaPi7의 mRNA량은 비히클 투여군과 동등한 것에 비해, 투여 후 8 시간째에 OST311 투여군의 NaPi7은 비히클 투여군에 비하여 유의하게 저하되고 있는 것이 분명해졌다. 이상의 결과에서 재조합 OST311 단백질의 직접 또는 간접 작용에 의한 혈청 인산 농도의 저하와 신장 근위 세뇨관상 나트륨ㆍ 인산 공액 수송체의 하향조절은 양쪽의 변동 시간과 상관성이 있고, 또한 이 단백질 수준에서의 하향조절에 기여하는 적어도 하나의 요인으로 NaPi-7의 mRNA 전사 수준에서의 억제가 발생되고 있는 것이 분명해졌다.
(3) 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도의 경시 변화
투여 후 1, 3, 8 시간째에 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도를 실시예 16의 (1)에 기재된 방법으로 측정하였다. 도 23에 기재한 대로 OST311 투여군에서 투여 후 3 시간에 이미 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도의 유의한 저하가 확인되었고, 8 시간째에는 보다 더 감소됨이 확인되었다.
(4) 비타민 D 대사 효소 유전자군의 발현 변화
혈청 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도 저하가 신장에서 발현되는 25-히드록시 비타민 D-1-α-히드록실라제(1αOHase) 또는 25-히드록시 비타민 D-24-히드록실라제(240Hase) 유전자의 변동에 기인하는지의 여부를 해명하기 위해, 투여 후 1, 3, 8 시간째에 신장에서 실시예 11 (7)에 기재한 순서에 따라 전체 RNA를 제조하고 동 기재된 프로브를 사용하여 노던 블롯팅을 실시하였다. 도 24에 기재한 대로, 투여 1 시간 후에 이미 1αOHase 유전자의 mRNA량 감소 및 24OHase 유전자의 mRNA량 증가가 확인되었고, 그 경향은 투여 후 8 시간부터 현저해진 것이 분명해졌다. 도 24에서, "비히클"은 20 mM 인산 완충액(pH 6.7) 및 0.3 M NaCl을 포함하는 재조합 OST311 단백질 용매를 의미한다.
이러한 결과로부터 OST311은 신장에서 발현되는 25-히드록시 비타민 D-1α-히드록실라제(1αOHase) 또는 25-히드록시 비타민 D-24-히드록실라제(24OHase) 유 전자의 발현을 조절함으로써 혈청의 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도를 저하시키는 것이 판명되었다.
<실시예 25>
OST311 C 말단 결실체의 활성 검토
(1) OST311 C 말단 결실체 발현계의 구축
이하의 프라이머를 합성하였다.
OST311R693 ATGCGGCCGCTATCGACCGCCCCTGACCACCCC(서열 53)
OST311R633 ATGCGGCCGCTACGGGAGCTCCTGTGAACAGGA(서열 54)
OST311R618 ATGCGGCCGCTCAACAGGAGGCCGGGGCCGGGGT(서열 55)
OST311R603 ATGCGGCCGCTCACGGGGTCATCCGGGCCCGGGG(서열 56)
OST311R693, OST311R633, OST311R618, OST311R603은 OST311의 3' 말단에서 각각 20, 40, 45, 50개의 아미노산 잔기를 결실시켜 종결 코돈 및 NotI 인식 서열을 도입하는 역방향 프라이머이다. 이러한 역방향 프라이머와 실시예 19에 기재된 OST311의 개시 메티오닌 및 EcoRI 인식 서열을 포함하는 순방향 프라이머 OST311ME1(서열 45)를 최종 농도 0.2 μM이 되도록 혼합하고, Pyrobest DNA 폴리머라제(일본국, 다까라 주조사)를 사용하여 실시예 19의 (2)에 기재된 OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8 플라스미드 DNA 100 ng를 주형으로 94 ℃에서 1 분 동안 보온한 후, 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분으로 이루어진 공정을 1 사이클로서 25 사이클의 PCR 반응을 실시하였다. 얻어진 반응 생성물을 페놀/클로로포름 처리하여 단백질을 제거하고, 에탄올 침전을 행한 후, EcoRI 및 NotI으로 소화시켜 2 ％ 아가로스겔 전기영동에 의해서 각 DNA 단편을 분리하고, 진클린 Ⅱ(미국, Bio 101사)을 사용하여 회수하였다. 얻어진 DNA 단편을 EcoRI 및 NotI으로 소화시킨 pEAK8 벡터 (미국, 엣지 바이오시스템즈사)와 연결함으로써 pPKOST311-△C20, -△C40, -△C45, -△C50 플라스미드를 얻었다. 정해진 방법에 따라서 플라스미드 DNA를 제조 후, ABI3700 형광 DNA 시퀀서 (미국, PE 어플라이드 바이오시스템즈사)에 의해서 염기 서열을 결정하고 OST311RQH 유전자의 3' 말단에서 목적한 대로의 염기쌍이 결실되어 있는 것을 확인하였다.
(2) CHO 안정 발현 세포의 취득
트랜스펙탐(미국, 프로메가사)을 사용하여 메뉴얼에 따라 CHO ras 클론-1 세포에 pPKOST311-△C20, -△C40, -△C45, -△C50 플라스미드 DNA를 각각 도입하고 5 ㎍/ml 퓨로마이신, 10％ FSC를 포함하는 MEMα 배지로 약제내성을 나타내는 CHO-OST311RQ-△C20, -△C40, -△C45, -△C50 세포를 취득하였다. 이들 세포를 각각 24웰 플레이트에 접종하고 5 ㎍/ml 퓨로마이신, 10 ％ FSC를 포함하는 MEMα 배지로 완전히 조밀한 상태까지 배양한 후, 무혈청 DF(DMEM/F-12) 배지로 교환하고, 3일 후에 상청을 회수하였다. 얻어진 배양 상청을 실시예 22에 기재된 OST311 특이적 폴리클로날 항체 311-148 또는 311-180을 사용한 웨스턴 블롯팅법을 수행하여 예상되는 분자량에 상당하는 위치에서 목적한 단백질 발현을 확인하였다.
C) OST311 C 말단 결실체 발현 CHO 세포의 이식 시험
상술한 20, 40, 45 및 50 잔기 결실체를 발현하는 CHO 세포를, 실시예 13에 기재한 방법과 동일하게 누드 마우스 (6주령, BALB/c-누드, 수컷, 각 군당 6 마리) 에 피하 이식하였다. 대조군으로 전장 OST311RQH를 발현하는 CHO 세포 및 CHO ras 클론-1 세포를 각각 피하 이식하였다 (n=6). 각 군마다 마우스를 플라스틱 케이지에서 사육하면서 수도물 및 고형식 CE2(닛본구레아사, 일본국)를 자유 섭취시켰다.
세포 이식 후 3 일째에 심장 채혈을 실시하여, 실시예 20에 기재된 것과 동일한 방법으로 혈청의 인산 및 칼슘 농도, 및 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도를 측정하였다. 도 25에 나타낸 바와 같이, CHO-OST311RQ-△C20, -△C40, -△C45, -△C50 세포 이식군 모두에서 전장 폴리펩티드를 발현하는 세포 이식군과 동등하게 유의한 혈청 인산 농도 저하가 확인되었다 (t-검정, **p<0.001). 또한, CHO-OST311RQ -△C40, -△C45, -△C50 세포 이식군에서 혈청의 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도도 현저한 저하가 확인되었다 (CH0-ras 클론-1 이식군의 평균 혈청 농도를 100 ％로 한 경우, 전장: 3.1 ％, △C40: 9.4 ％, △C45: 10.0 ％, △C50: 68.1 ％). 이러한 결과로부터, OST311 단백질의 C 말단에서 적어도 50개의 아미노산이 결실되더라도 혈청의 인 농도 저하 활성 또는 혈청의 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도 저하 활성은 유지되는 것이 확인되었다.
<실시예 26>
OST311 N 말단 결실체의 활성 검토
(1) OST311 N 말단의 9개 아미노산 결실체 발현계의 구축
이하의 올리고 DNA를 합성하였다.
OST311SGFW:
aattccaccATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCTCTGGGTCTGTGCTTGTGCAGCGTCTGCAGCATGAGCGTCCTgcatGC(서열 57)
OST311SGRV:
aattGCatgcAGGACGCTCATGCTGCAGACGCTGCACAAGGCACAGACCCAGAGCCTGAGGCGGGCCCCCAACATggtgg(서열 58)
OST311SGFW는 OST311의 개시 메티오닌으로부터 서열 2의 24번째 Ala까지의 아미노산 잔기로 구성되는 시그널 펩티드 부분을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 올리고 DNA이고, 그 5' 말단에 EcoRI 인식 서열을 포함한다. OST311SGRV는 OST311SGFW의 상보쇄이고, 그 5' 말단에 EcoRI 인식 서열을 포함한다. 또한 OST311SGFW의 3'측 및 OST311SGRV의 5'측에는 제한 효소 SphI의 인식 부위가 도입되어 있다. 이 SphI 인식 부위 도입에 의해 시그널 펩티드 서열내의 23 번째 Arg가 His로 치환된다. 상술한 올리고 DNA끼리 정해진 방법에 따라서 어닐링시킴으로써 양 말단부에 EcoRI 인식 서열과, 시그널 펩티드내 23번째 아미노산 잔기에 상당하는 위치에 SphI 인식 서열을 포함하여, OST311의 개시 메티오닌으로부터 시작되는, 1개의 잔기가 치환된 시그널 펩티드의 전장을 코딩하는 이중가닥 DNA 단편이 수득된다. 이 DNA 단편을 EcoRI으로 소화한 pEAK8 벡터(미국, 엣지 바이오시스템즈사)에 삽입하여 동 벡터내에 존재하는 EF1 프로모터와 상술한 DNA 단편이 순방향으로 되어 있는 플라스미드 DNA를 선택하고, 이를 플라스미드 pPKFGSG로 하였다.
다음에 이하의 프라이머를 합성하였다.
OST311dN9 ATATGCATGCCTCCAGCTGGGGTGGCCTGATCCAC(서열 59)
OST311dN9는 5'말단에 SphI 인식 부위를 포함하여, 서열 2의 24 번째 Ala 잔기 뒤쪽에 동 34번째 Ser 잔기 이후의 아미노산 서열이 계속되도록 설계된 순방향 프라이머이다. 본 프라이머와, NotI 인식 서열을 포함하고, C 말단 부분에 히스티딘 잔기 6 개가 부가되었으며, 그 뒤쪽에 종결 코돈이 위치하도록 설계된 프라이머 OST311HNt(실시예 19, 서열 46)을 역방향 프라이머로서 조합하여, 실시예 19의 (2)에 기재된 OST311RQH/IRES-EGFP/pEAK8 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하여 실시예 25(1)에 기재된 요령으로 PCR 증폭을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 SphI 및 NotI으로 소화시킨 후, 동일하게 SphI 및 NotI으로 소화한 상기 플라스미드 벡터 pPKFGSG에 정해진 방법에 따라서 삽입하였다. 얻어진 플라스미드 OST311△N9-pPKFGSG를 ABI3700 형광 DNA 시퀀서(미국, PE 어플라이드 바이오시스템즈사)를 이용하여 염기 서열을 결정한 결과, 삽입된 유전자 서열은 OST311RQH 유전자의 개시 메티오닌으로부터 24번째 Ala까지의 시그널 펩티드를 포함하고 (단, 23번째 Arg는 His로 치환), 이어서 25번째 Tyr에서 33번째 Gly까지의 9개 아미노산 잔기에 상당하는 유전자 서열만을 결실하였으며, 34번째 Ser에서 히스티딘 태그를 포함하는 종결 코돈까지의 전체 서열을 코딩하고 있음을 확인하였다.
(2) CHO 안정 발현 세포의 취득
트랜스펙탐(미국, 프로메가사)를 사용하여 메뉴얼에 따라서 CHO ras 클론-1 세포에 OST311△N9-pPKFGSG 플라스미드 DNA를 도입하여, 5 ㎍/ml 퓨로마이신, 10 ％ FSC를 포함하는 MEMα 배지로 약제내성을 나타내는 CHO-OST311RQ-△N9 세포를 취득하였다. 얻어진 세포에서 실시예 25에 기재된 요령으로 배양 상청을 회수하 고, 실시예 22에 기재된 OST311 특이적 폴리클로날 항체 311-148, 또는 새롭게 서열 2의 237번째 Gly에서 251번째 Ile까지의 부분 폴리펩티드를 토끼에 면역화하여 얻어진 폴리클로날 항체 311-237을 사용한 웨스턴 블롯팅법에 의해 예상되는 분자량에 상당하는 위치에서 목적 단백질의 발현을 확인하였다. 여기에서, 서열 2의 23번째 Arg를 His로 치환한 OST311 시그널 펩티드가 적절하게 기능하여 OST311 재조합 단백질을 분비시키는 것과, 적어도 25 번째 Tyr에서 33 번째 Gly를 제거하여도 분비 후에 배양 상청 중에 어느 정도 안정적으로 재조합 단백질이 존재할 수 있다는 것이 판명되었다.
(3) OST311 N 말단 9개 아미노산 결실체 발현 CHO 세포의 이식 시험
상술한 CHO-OST311RQ-△N9 세포를 실시예 13에 기재한 방법과 동일하게 누드 마우스(8 주령, BALB/c-누드, 수컷, 각 군당 6마리)에 피하 이식하였다. 대조군으로서 전장 OST311RQH를 발현하는 CHO 세포 및 CHO ras 클론-1 세포를 각각 동일하게 피하 이식하였다 (n=6). 각 군마다 마우스를 플라스틱 케이지에서 사육하면서 수도물 및 고형식 CE2(닛본구레아사, 일본국)을 자유 섭취시켰다.
세포 이식 후 4 일째에 유리제 모세관을 사용하여 안와 채혈을 실시하여 실시예 20에 기재된 요령으로 혈청의 인산 농도를 측정하였더니, CHO-OST311RQ-△N9 세포 이식군에서 전장 재조합체 발현 세포 이식군과 동등하게 유의한 혈청 인산 농도 저하가 확인되었다 (CHO-ras 클론-1군: 6.85±0.12 mg/dL, CHO-OST311RQH군: 3.91±0.23 mg/dL(p<0.001, CHO-ras 클론-1 군에 대해), CHO-OST311RQ-△N9군: 4.33±0.15 mg/dL(p<0.001, CHO-ras 클론-1 군에 대해)). 이 결과로부터, 적어도 서열 2의 25번째 Tyr에서 33번째 Gly를 포함하는 9개 아미노산 잔기를 제거해도 OST311의 생리 활성이 손상되지 않는 것이 판명되었다.
<실시예 27>
대장균 생산형 OST311 재조합체의 검토
(1) OST311 대장균 발현 벡터 OST311/pET3a의 구축
이하의 프라이머를 합성하였다.
OST311N: TGTATCCCAATGCCTCCCCACTG (서열 60)
OST311Bm: ATGGATCCCTAGATGAACTTGGCGAAGGG (서열 61)
실시예 19에서 제조된 OST311/pCAGGS 플라스미드를 주형으로 하고 OST311N(서열 60) 및 OST311Bm(서열 61)을 프라이머로서, pfu DNA 폴리머라제(미국, 프로메가사)를 사용하여 PCR을 행하였다. 반응은 94 ℃에서 1 분간 보온한 후, 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분을 1 사이클로서 35 사이클 실시하였다. 반응 종료 후, 페놀/클로로포름 처리에 의해 효소를 불활성화시킨 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하였다. 이 DNA를 BamHI으로 소화하고 목적한 OST311 cDNA 단편을 2 ％ 아가로스겔 전기영동으로 분리한 후, 진클린 Ⅱ(미국, BIO 101사)를 이용하여 회수하였다. 한편, 플라스미드 벡터 pET3a(미국, 노바젠(Novagen)사)를 NdeI로 소화하고 Klenow 단편(스위스, 로슈사)를 사용하여 말단의 평활화를 행하였다. 또한 이것을 BamHI으로 소화한 후, 목적한 플라스미드 DNA 단편을 0.8 ％ 아가로스겔 전기영동으로 분리하여, 진클린 Ⅱ(미국, BIO 101사)를 사용하여 회수하였다. 이와 같이 하여 얻어진 OST311 cDNA 단편과 플라스미드 pET3a 소화물을 DNA 라이게이션 키트 버젼 2(일본국, 다까라 주조사)를 이용하여 연결하였다. 이것을 대장균 DH5α에 도입함으로써 클론화하여 플라스미드를 추출하였다. 플라스미드의 염기 서열을 확인하고, pET3a에 OST311 cDNA가 목적했던대로 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 이것을 OST311/pET3a로 하였다.
(2) OST311 대장균 발현 벡터 OST311/pET28의 구축
이하의 프라이머를 합성하였다.
OST311Nd: ATCATATGTATCCCAATGCCTCCCCACTG(서열 62)
OST311Not: ATGCGGCCGCCTAGATGAACTTGGCGAAGGG(서열 63)
OST311/pET3a 플라스미드를 주형으로 OST311Nd(서열 62) 및 OST311Not(서열 63)을 프라이머로서 LA Taq(일본국, 다까라 주조사)를 사용하여 PCR을 행하였다. 반응은 94 ℃에서 1분 동안 보온한 후, 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분을 1 사이클로서 35 사이클 실시하였다. 반응 종료 후, 페놀/클로로포름 처리에 의해 효소를 불활성화시켰다. 증폭된 DNA 단편을 에탄올 침전으로 회수하였다. 이것을 NdeI와 NotI으로 소화한 후, 목적한 OST311 cDNA 단편을 2 ％ 아가로스겔 전기영동으로 분리하고 진클린 Ⅱ(미국, BIO 101사)를 사용하여 회수하였다. 한편, 플라스미드 벡터 pET28(미국, 노바젠사)를 NdeI와 NotI으로 소화하고, 또한 소의 소장 알칼리성 포스파타제(일본국, 다까라 주조사)를 사용하여 탈인산화를 행하였다. 이것을 0.8 ％ 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하고 목적한 플라스미드 단편을 진클린 Ⅱ(미국, BIO 101사)를 사용하여 회수하였다. 이와 같이 하여 얻은 OST311 cDNA 및 pET28 플라스미드 소화물을 DNA 라이게이션 키트 버젼 2(일본국, 다까라 주조사)를 사용하여 연결하고 대장균 DH5α에 도입함으로써 클로닝하여 플라스미드를 추출하였다. 플라스미드의 염기 서열을 확인하고, N 말단측에 His-태그 서열을 부가한 재조합체 OST311이 발현되도록 OST311 cDNA가 pET28에 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 이것을 OST311/pET28로 하였다. 이 벡터에 의해 코딩되는 재조합체 His-OST311의 염기 서열과 아미노산 서열을 도 26에 나타내었다.
(3) 재조합체 His-OST311의 대장균에서의 발현과 제조
플라스미드 OST311/pET28을 대장균 BL21(DE3) 코돈 플러스(Codon Plus) RP(미국, 스트라타진사)에 도입하여, 형질전환시킨 클론을 취득하였다. 얻어진 대장균 클론을 10 mg의 카나마이신(미국, 시그마사)를 포함하는 100 ml의 LB 배지에 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 균체액을 1 L의 LB 배지에 A600=0.1이 되도록 접종하고 3 L 용량의 사까구찌(Sakaguchi) 플라스크를 이용하여 37 ℃에서 진탕 배양을 행하였다. 경시적으로 배양액의 흡광도를 측정하고 A600=0.6 내지 1.0이 되는 시점에서 이소프로필-1-티오-β-갈락토시드(IPTG)(일본국, 와코 쥰야꾸)를 1 mM가 되도록 첨가하고 4 시간 후에 원심분리(770O g로 15분)에 의해 집균하였다. 모은 균체를 20 ml의 1 mM DTT를 포함하는 0.1 M 트리스염산 완충액(pH 7.5) 중에 현탁하고 프렌치프레스를 사용하여 균체를 파쇄하였다. 이 파쇄액을 원심분리(770O g로 15분)하고 이어서 침전 분획을 15 ml의 0.1 M 트리스염산 완충액(pH 7.5)으로 현탁하고, DNaseI(스위스, 로슈사)를 0.1 mg/mL이 되도록 첨가하여, 4 ℃에서 1 시간 진탕하였다. 그 후, 원심분리(23400 g로 15분)하고 침전 분 획을 봉입체(Inclusion body)로서 회수하였다. 얻어진 봉입체를 10 ml의 0.75 M 요소 및 1 ％ 트리톤(Triton)-X를 포함하는 20 mM 트리스염산 완충액(pH 8)에 현탁하여, 원심분리(23400 g로 15분)에 의해 침전물을 회수하는 세정 조작을 실시하였다. 또한, 이 세정 조작을 2회 반복하였다.
세정된 봉입체를 5 ml의 변성제 용액(1 mM DTT 및 6 M 염산 구아니딘을 포함하는 50 mM 인산 완충액(pH 8))에 현탁하여, 37 ℃에서 1 시간 진탕함으로써 가용화하였다. 불용물을 원심분리(23400 g로 15분)에 의해 침전시켜 제거한 후, 6M 염산 구아니딘을 포함하는 50 mM 인산 완충액(pH 6)으로 평형화하였다. 이 가용화 샘플을 Ni-NTA 아가로스(독일, 퀴아젠사)가 충전된 컬럼에 제공하고, 6 M 염산구아니딘을 포함하는 50 mM 인산 완충액(pH 6)으로 세정하였다. 컬럼에 흡착된 단백질을 500 mM 이미다졸(일본국, 나카라이테스크사) 및 6 M 염산 구아니딘을 포함하는 50 mM 인산 완충액(pH 4.5)으로 용출시켜 변성 His-OST311을 정제하였다. 정제된 샘플의 280 nm에서 자외 흡광도로부터 농도를 구하고 최종 농도가 2 mg/ml가 되도록 6 M 염산 구아니딘을 포함하는 50 mM 인산 완충액(pH 6)을 첨가하여 변성 His-OST311 용액을 제조하였다. 이 샘플에 최종 농도가 1 mM이 되도록 환원제 시스테인을 첨가하고 0.6 M 염산 구아니딘, 0.1 ％ 트윈(Tween) 20을 포함하는 20 mM 인산 완충액 (pH 6)으로 100 배 희석하여 리폴딩(refolding)을 개시하고 4 ℃에서 3일 이상 배양하였다.
이 리폴딩 용액을 0.1 M 아세트산 완충액(pH 4.8)에 대하여 4 ℃에서 투석하였다. 투석액을 한외여과막을 사용하여 약 10 배로 농축하여, 양이온 교환 컬럼 SP-5 PW(일본국, 도소사)를 이용하여 HPLC로 정제하였다. 단백질의 용출에는 10 ％ 글리세롤을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 6)을 사용하고, 0.5 M에서 2 M까지의 NaCl 직선 농도 구배로 용출시켰다. 이 용출 패턴을 도 27에 나타낸다. 용출된 2종의 단백질 피크 중, 보다 낮은 염 농도에서 용출된 피크에 His-OST311이 포함되어 있음을 SDS-PAGE 분석 및 질량 분석으로부터 알 수 있었다. 이와 같이 하여 약 1 L의 배양균체로부터 최종 정제물인 His-OST311을 약 0.6 mg 제조할 수 있었다.
(4) MK-OST311 발현 벡터 pET22b-MK-OST311의 구축
이하의 프라이머를 합성하였다.
OST311MK1: gaattcatatgaaatacccgaacgcttccccgctgctgggctccagctg(서열 64)
OST311MK2: cccaagcttgcggccgcctagatgaacttggc(서열 65)
상술된 His-OST311 발현 플라스미드 OST311/pET28를 주형으로 OST311 MK1(서열 64)과 OST311MK2(서열 65)를 프라이머로 사용하여 PCR을 행함으로써 목적한 서열을 증폭하였다. 이 조작에 의해 얻어진 OST311 cDNA는 개시 코돈(ATG)의 뒤쪽에 계속되는 27개의 염기가 대장균형 코돈으로 변환되어 있다. 이 PCR 산물을 QIAquick PCR 정제 키트(독일, 퀴아젠사)로 정제하고 제한 효소 NdeI(일본국, 다까라 주조사)와 NotI(일본국, 다까라 주조사)를 사용하여 37 ℃에서 1 시간 소화하였다. 소화물을 아가로스 전기영동으로 분리 후, QIAquick PCR 정제 키트(독일, 퀴아젠사)로 정제하였다. 이 DNA 단편을 제한 효소 NdeI와 NotI으로 37 ℃에서 1 시간 소화하고 아가로스 전기영동으로 분리 정제한 플라스미드 벡터 pET22b(미국, 노 바젠사)에 DNA 라이게이션 키트 버젼 2(일본국, 다까라 주조사)를 이용하여 16 ℃에서 15 분간 연결하였다. 이것을 대장균 JM109(일본국, 다까라 주조사)에 도입하여 클론화하고 정해진 방법에 따라서 플라스미드를 추출하였다. 얻어진 플라스미드의 염기 서열을 결정하고 목적대로 취득된 OST311 cDNA가 pET22b 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 이것을 pET22-MK-OST311로 하였다. 이 벡터에 의해 코딩되는 재조합체 MK-OST311의 염기 서열과 아미노산 서열을 도 26에 나타내었다.
(5) MK-OST311의 대장균에서의 발현과 제조
플라스미드 pET22-MK-OST311을 대장균 BL21(DE3) 코돈 플러스 RP(미국, 스트라타진사)에 도입하여 형질전환시킨 클론을 취득하였다. 얻어진 대장균 클론을 10 mg의 암피실린을 포함하는 100 ml의 LB 배지에 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 균체액을 1 L의 LB 배지에 A600=0.1이 되도록 접종하고 3 L 용량의 사까구찌 플라스크를 이용하여 37 ℃에서 진탕 배양하였다. 이 균체액에 IPTG를 첨가함으로써 재조합체의 발현을 유도하고 상술한 His-OST311 제조법과 동일한 방법으로 봉입체를 제조하였다.
세정된 봉입체를 5 ml의 변성제 용액(1 mM DTT 및 6 M 염산 구아니딘을 포함하는 50 mM 인산 완충액 (pH 8))에 현탁하여, 37 ℃에서 1 시간 진탕함으로써 가용화하였다. 이것을 변성제 용액으로 2배 희석하고, 또한 0.6 M 염산 구아니딘 및 0.1 ％ 트윈 20을 포함하는 20 mM 인산 완충액 (pH 6)을 이용하여 100 배로 희석하여 리폴딩을 개시하고 4 ℃에서 3일 이상 배양하였다. 산화제의 첨가 및 pH 7 이 상의 조건하에서는 단백질의 침전이 생기고 리폴딩 효율이 현저하게 저하되는 것을 분명히 알 수 있었다. 이 리폴딩 용액을 0.1 M 아세트산 완충액(pH 4.8)에 대하여 4 ℃에서 투석하였다. 한외여과막을 사용하여 투석액을 약 10배로 농축하고, 양이온 교환 컬럼 SP-5 PW(일본국, 도소사)를 이용하여 HPLC로 정제하였다. 단백질의 용출에는 10 ％ 글리세롤을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 6)을 이용하고, 0.5 M에서 2 M까지의 NaCl 직선 농도 구배로 용출시켰다. 도 28에 나타낸 바와 같이 단백질의 용출 피크는 2종류가 있고, 보다 낮은 염농도에서 용출된 피크에 MK-OST311이 포함되어 있음을 SDS-PAGE 분석 및 질량 분석으로부터 분명히 알 수 있었다. 약 1 L의 플라스크 배양 균체로부터 최종 정제물인 MK-OST311을 약 0.6 mg 정제할 수 있었다.
(6) MK-OST311의 PEG화
이온 교환 컬럼으로 정제된 10 ml의 MK-OST311(0.05 mg/ml)을 10 ％ 아세트산을 사용하여 pH 4.8로 조정하였다. 이 용액에 10 mM 아세트산 완충액(pH 4.8)에 용해된 분자량 20000의 활성화 PEG(미국, 쉐어워터(Sharewater)사) 25 mg를 얼음 중에서 교반하면서 첨가하였다. 15 분 후에 10 mM 아세트산 완충액(pH 4.8)에 용해된 1 M 수소화시아노붕소나트륨(일본국, 나카라이테스크사)를 최종 농도 15 mM이 되도록 첨가하고, 4 ℃에서 16 시간 교반하였다. 이 반응으로 PEG화된 OST311을 양이온 교환 컬럼 SP-5 PW(일본국, 도소사)를 사용하여 HPLC로 정제하였다. 단백질의 용출에는 10 ％ 글리세롤을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 6)을 사용하고, 0.5 M에서 2 M까지의 NaCl 직선 농도 구배로 용출시켰다. PEG화된 MK-OST311은 도 29에 나타낸 바와 같이 MK-OST311 보다 낮은 이온 강도측에서 단일 피크로 용출되었다.
(7) His-OST311 재조합체의 활성 검토
정제 His-OST311 재조합체의 생물 활성을 검토하기 위해, 실시예 24에 기재된 요령으로 재조합 단백질을 정상 마우스(5주령, BALB/c, 수컷, 각 군당 6 마리)에 한마리당 4.5 ㎍/0.1 m1씩 꼬리 정맥 내 1회 투여하고, 9 시간 후의 혈청 인산 및 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도를 실시예 20에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정하였다. 또한, 양성 대조군으로서 동 용량의 CHO-OST311H 세포 유래 정제 재조합체를, 또한 비히클군으로서 20 mM 인산 완충액(pH 6.9) 및 0.3 M NaCl로 이루어지는 용매를 0.1 ml씩 꼬리 정맥 내 1회 투여하였다.
도 30의 A에 나타낸 바와 같이, 투여로부터 9 시간 후의 His-OST311 투여군에서 비히클 투여군에 비하여 유의한 혈청의 인 저하 작용을 확인하였다. 또한, 그 저하 정도는 CHO 유래 재조합체 투여군과 동등하였다. 한편, 투여로부터 9 시간 후의 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도에 대해서도 도 32에 나타낸 바와 같이 His-OST311 투여군에 있어서 현저한 저하가 확인되었다.
실시예 24의 (3) 및 (4)에 기재한 바와 같이, CHO 세포 유래의 OST311 단백질을 1회 투여하고 4 시간 후에 유의한 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도 저하가 확인되었고, 이에 앞서서 투여 후 1 시간 째에 신장에서 25-히드록시 비타민 D-1-α-히드록실라제(1αOHase)의 발현 저하 및 25-히드록시 비타민 D-24-히드록실라제(24OHase)의 발현 항진이 확인되었다. 따라서, BALB/c 마우스(5주령, 수컷)에 1 마리당 4.5 ㎍/0.1 ml씩 His-OST311을 꼬리 정맥 내 1회 투여하고 1 및 4 시간 후에 적출된 신장에서 1αOHase 유전자 및 24OHase 유전자의 발현 변화를 노던 블롯팅법으로 해석하였다. 양성 대조군으로서 동 용량의 CHO-OST311H 세포 유래 정제 재조합체를, 또한 비히클군으로서 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.3 M NaCl로 이루어지는 용매를 0.1 ml씩 꼬리 정맥내 1회 투여하였다. 도 31에 나타낸 바와 같이, His-OST311은 CHO 유래 재조합체와 동일하게 투여 후 1 시간 째에 이미 1αOHase 유전자의 발현 저하 및 240Hase 유전자의 발현 항진을 나타냈고, CHO 유래 재조합체와 동등한 비타민 D 대사 효소 유전자 발현의 조절 활성을 갖고 있는 것이 판명되었다. 또한, 도 32에 나타낸 바와 같이, 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D3 농도 변화는 재조합체 투여 후 4 시간 째에 감소 경향을 나타내며, 8 시간 째에는 보다 현저한 저하가 확인되었으며, 실시예 24의 (3)에서 나탄낸 CHO 유래 재조합체 투여 시험으로 확인된 경시 변화의 형태와 거의 일치하고 있음이 판명되었다.
이상의 결과로부터, 대장균에서 생산된 재조합체 His-OST311은 적어도 혈청인 저하 활성 및 비타민 D 대사 조절 활성에 대해서는 CHO-OST311H 세포를 생산하는 분비형 재조합체와 동등한 생물 활성을 갖고 있는 것이 판명되었다.
(8) PEG화 MK-OST311의 활성 검토
PEG화 MK-OST311의 생물 활성을 실시예 24에 기재한 요령으로 정상 마우스(5주령, BALB/c, 수컷, 각 군당 8마리)에 한마리당 5.0 ㎍/0.1 ml씩 꼬리 정맥내 1회 투여하고 9 시간 후의 혈청 인산 농도를 실시예 20에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정하였다. 비히클군으로는 20 mM PB(pH 6.0), 10 ％ 글리세롤, 1 M NaCl 및 0.1 ％ 트윈 20을 포함하는 용매를 0.1 ml씩 꼬리 정맥내 1회 투여하였다. 투여 후 8 시간 째에서 유리제 모세관을 이용하여 안와 채혈을 실시하고, 얻어진 혈청중의 무기 인산 농도를 측정하였다. 도 30의 B에 나타낸 바와 같이, PEG화 MK-OST311 투여군에 있어서, 비히클 투여군에 비하여 유의한 혈청의 인 저하 작용을 확인하였다. 이 결과로부터, 대장균 생산형 재조합체를 PEG화하더라도 그 생물 활성은 저해되지 않음이 판명되었다.
<실시예 28>
절단 부분에의 아미노산 변이 도입
실시예 9에 기재된 바와 같이, OST311은 서열 2의 아미노산 잔기 179번째의 Arg와 180번째의 Ser의 사이에서 절단되는 것으로 판명되어 있다. 한편, 실시예 19에 기재한 바와 같이, OST311의 아미노산 잔기 176번째의 Arg 및 아미노산 잔기 179번째의 Arg의 양쪽을 동시에 Gln으로 치환하면 이 절단이 저해됨이 확인되어 있다. 이러한 사실은 이 절단이 인접하는 RXXR 또는 RRXXR 서열을 포함하는 모티프를 인식하는 프로테아제에 의한 것일 가능성을 시사한다. 또한, 서열 4로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 전장형 재조합체를 생체내에 투여했을 때에도 상술한 또는 그에 유사한 절단을 할 가능성을 생각할 수 있다. 따라서, 서열 2의 아미노산 잔기 175번째로부터 180번째까지의 각 잔기를 각각 Ala, Gln 또는 Trp로 치환함으로써, CHO 세포에서 각 변이 재조합체의 발현 분비 패턴에 어떠한 영향을 주는가를 검토하였다.
(1) 절단 부분 변이 도입 OST311 유전자의 제조
이하의 프라이머를 합성하였다.
pyh23PA1F AACACCCCCATAGCACGGCGGCACA(서열 66)
pyh23PA1R TGTGCCGCCGTGCTATGGGGGTGTT(서열 67)
pyh23RA1F ACCCCCATACCAGCGCGGCACACCCG(서열 68)
pyh23RA1R CGGGTGTGCCGCGCTGGTATGGGGGT(서열 69)
pyh23RA2F CCCATACCACGGGCGCACACCCGGAG(서열 70)
pyh23RA2R CTCCGGGTGTGCGCCCGTGGTATGGG(서열 71)
pyh23HA1F ATACCACGGCGGGCCACCCGGAGCGC(서열 72)
pyh23HA1R GCGCTCCGGGTGGCCCGCCGTGGTAT(서열 73)
pyh23TA1F CCACGGCGGCACGCCCGGAGCGCCG(서열 74)
pyh23TA1R CGGCGCTCCGGGCGTGCCGCCGTGG(서열 75)
pyh23RA3F CGGCGGCACACCGCGAGCGCCGAGGA(서열 76)
pyh23RA3R TCCTCGGCGCTCGCGGTGTGCCGCCG(서열77)
pyh23SA1F CGGCACACCCGGGCCGCCGAGGACGA(서열 78)
pyh23SA1R TCGTCCTCGGCGGCCCGGGTGTGCCG(서열 79)
pyh23RKQ1F ACCCCCATACCACAGCGGCACACCCG(서열 80)
pyh23RKQ1R CGGGTGTGCCGCTGTGGTATGGGGGT(서열 81)
pyh23RKQ2F CCCATACCACGGCAGCACACCCGGAG(서열 82)
pyh23RKQ2R CTCCGGGTGTGCTGCCGTGGTATGGG(서열 83)
pyh23RKQ3F CGGCGGCACACCCAGAGCGCCGAGGA(서열 84)
pyh23RKQ3R TCCTCGGCGCTCTGGGTGTGCCGCCG(서열 85)
pyh23RWF CGGCGGCACACCTGGAGCGCCGAGG(서열 86)
pyh23RWR CCTCGGCGCTCCAGGTGTGCCGCCG(서열 87)
pyh23PA1F 및 pyh23PA1R은 OST311 cDNA(서열 1)의 652번째의 시토신을 구아닌으로 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 174번째의 Pro를 Ala로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 P174A라고 한다.
pyh23RA1F 및 pyh23RA1R은 OST311 cDNA(서열 1)의 655번째의 시토신을 구아닌으로, 656번째의 구아닌을 시토신으로 각각 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 175번째의 Arg를 Ala로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 R175A라고 한다.
pyh23RA2F 및 pyh23RA2R은 OST311 cDNA(서열 1)의 658번째의 시토신을 구아닌으로, 659번째의 구아닌을 시토신으로 각각 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 176번째의 Arg를 Ala로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 R176A라고 한다.
pyh23HA1F 및 pyh23HA1R은 OST311 cDNA(서열 1)의 661번째의 시토신을 구아닌으로, 662번째의 아데닌을 시토신으로 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 177번째의 His를 Ala로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 H177A라고 한다.
pyh23TA1F 및 pyh23TA1R은 OST311 cDNA(서열 1)의 664번째의 아데닌을 구아 닌으로 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 178번째의 Thr을 Ala로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 T178A라고 한다.
pyh23RA3F 및 pyh23RA3R은 OST311 cDNA(서열 1)의 667번째의 시토신을 구아닌으로, 668번째의 구아닌을 시토신으로 각각 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 179번째의 Arg를 Ala로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 R179A라고 한다.
pyh23SA1F 및 pyh23SA1R은 OST311 cDNA(서열 1)의 670번째의 아데닌을 구아닌으로, 671번째의 구아닌을 시토신으로 각각 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 180번째의 Ser을 Ala로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 S180A라고 한다.
pyh23RKQ1F 및 pyh23RKQ1R은 OST311 cDNA(서열 1)의 656번째의 구아닌을 아데닌으로 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 175번째의 Arg를 Gln으로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 R175Q라고 한다.
pyh23RKQ2F 및 pyh23RKQ2R은 OST311 cDNA(서열 1)의 659번째의 구아닌을 아데닌으로 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 176번째의 Arg를 Gln으로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 R176Q라고 한다.
pyh23RKQ3F 및 pyh23RKQ3R은 OST311 cDNA(서열 1)의 668번째의 구아닌을 아 데닌으로 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 179번째의 Arg를 Gln으로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 R179Q라고 한다.
pyh23RWF 및 pyh23RWR은 OST311 cDNA(서열 1)의 667번째의 시토신을 티민으로 치환함으로써 서열 2로 표시되는 아미노산 잔기 179번째의 Arg를 Trp로 치환하기 위한 변이 도입용의 순방향 및 역방향 프라이머이다. 이하, 본 변이를 R179W라고 한다.
(1)-1 OST311P174AH 유전자의 제조
Pyrobest DNA 폴리머라제(일본국, 다까라 주조사)를 이용하여 메뉴얼에 따라서 2종의 반응액을 100 ㎕ 제조하였다. 한편으로는 프라이머로서 OST311ME1(서열 45), pyh23PA1F(서열 66)을 최종 농도 0.2 μM 사용하고, 다른 한편으로는 프라이머로서 pyh23RA1R(서열 67), OST311HNt(서열 46)을 최종 농도 0.2 μM 사용하였다. 각각의 반응액에 실시예 19의 (1)에 기재된 OST311/pCAGGS 플라스미드 10 ng를 주형으로 첨가하고, 94 ℃에서 1 분간 보온한 후, 94 ℃에서 20 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분을 1 사이클로서 40 사이클의 PCR 반응을 실시하였다. 이들 2종 반응액을 각각 10배로 희석하고, 각각의 1 ㎕을 Pyrobest DNA 폴리머라제(일본국, 다까라 주조사) 메뉴얼에 따라서 제조된 반응액 100 ㎕에 첨가하였다. 이 용액에 프라이머로서 OST311ME1(서열 45), OST311HNt(서열 46)을 최종 농도 0.2μ M이 되도록 첨가하고, 94 ℃에서 1분간 보온한 후, 94 ℃에서 20초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분 30초를 1 사이클로서 30 사이클의 PCR 반응을 실시하고, 또한 72 ℃에서 7분간 보온하였다. 얻어진 반응 생성물을 진클린 Ⅱ(미국, BIO 101사)를 이용하여 메뉴얼에 따라서 회수하였다. 그 후 EcoRI 및 NotI으로 소화하고 2 ％ 아가로스겔 전기영동에 의해서 약 800 bp의 DNA 단편을 분리한 후, 진클린 Ⅱ(미국, Bio 101사)를 이용하여 회수하였다. 얻어진 DNA 단편을 pEAK8 벡터(미국엣지바이오사)의 EcoRI 및 NotI 부위에 삽입함으로써 플라스미드 OST311P174AH-pEAK8을 얻었다. 정해진 방법에 따라서 플라스미드 DNA를 제조하여, ABI 3700 형광 DNA 시퀀서 (미국, PE 어플라이드 시스템즈사)에 의해서 염기 서열을 결정하고 목적한 P174H의 변이가 도입된 것을 확인하였다. 또한 C 말단에 히스티딘 태그가 부가된 것을 확인하였다. P174A의 변이가 도입된 변이 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 OST311P174AH라고 한다.
(1)-2 OST311R175AH 유전자의 제조
pyh23RA1F(서열 68), pyh23RA1R(서열 69) 프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(1)-3 OST311R176AH 유전자의 제조
pyh23RA2F(서열 70), pyh23RA2R(서열 71) 프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(1)-4 OST311H177AH 유전자의 제조
pyh23HA1F(서열 72), pyh23HA1R(서열 73) 프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(1)-5 OST311T178AH 유전자의 제조
pyh23TA1F(서열 74), pyh23TA1R(서열 75) 프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(1)-6 OST311R179AH 유전자의 제조
pyh23RA3F(서열 76), pyh23RA3R(서열 77) 프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(1)-7 OST311S180AH 유전자의 제조
pyh23SA1F(서열 78), pyh23SA1R(서열 79) 프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(1)-8 OST311R175QH 유전자의 제조
pyh23RKQ1F(서열 80), pyh23RKQ1R(서열 81) 프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(1)-9 OST311R176QH 유전자의 제조
pyh23RKQ2F(서열 82), pyh23RKQ2R(서열 83) 프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(1)-10 OST311R179QH 유전자의 제조
pyh23RKQ3F(서열 84), pyh23RKQ3R(서열 85)프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(1)-11 OST311R179WH 유전자의 제조
pyh23RWF(서열 86), pyh23RWR(서열 87) 프라이머를 사용하여 (1)-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
(2) 절단 부분 변이 도입 OST311 유전자의 일과성 발현과 배양 상청 제조
pEAK rapid 세포(미국, 엣지 바이오 시스템)을 12웰 플레이트에 접종하였다. 이 세포에, pEAK 시스템 메뉴얼(미국, 엣지 바이오시스템즈사)에 따라 상기 11종의 변이 OST311 발현 플라스미드를 인산 칼슘법으로 트랜스펙션하였다. 4 시간 정치한 후, 1.5 ml의 무혈청 MEMα 배지로 교환하고, 2일간 37 ℃에서 배양하여 상청을 회수하였다.
(3) 절단 부분 변이 도입 OST311 유전자의 발현 확인
수득된 배양 상청을 실시예 6의 (3)에 기재된 요령으로 웨스턴 블롯팅을 수행하고 배양 상청의 절단 부분 변이 도입 OST311 재조합체의 존재를 검토하였다. 검출 항체로는 실시예 22에 기재된 OST311 특이적 폴리클로날 항체 311-148을 사용하였다. 그 결과, 도 33에 나타낸 바와 같이, 아미노산 잔기 174번째에서 180번째까지의 치환체 중, P174A, R175A, R175Q, H177A, T178A 및 S180A의 변이가 도입된 OST311 재조합체에서 16 kDa 부근에 야생형과 동일한, 서열 6으로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 분해산물이 확인되었지만, R176A, R179A, R176Q, R179Q 또는 R179W의 변이가 도입된 OST311 재조합체의 어느 것에서도 분해산물을 확인할 수 없었다. 이들의 결과로부터, 아미노산 잔기 179번째 Arg와 180번째 Ser의 사이에서 발생되는 절단에 있어 아미노산 잔기 176번째 Arg 및 179번째 Arg가 특히 중요한 역할을 하는 것으로 시사되었다. 즉, 양 잔기를 적어도 Ala, Gln 또는 Trp 중 어느 아미노산으로 치환해도 절단이 저해되거나 또는 억제받기 때문에 전장 폴리펩티드의 생산을 촉진하는 것이 기대된다.
<실시예 29>
실시예 6에 나타낸 바와 같이, OST311을 CHO 세포나 COS 세포에서 발현시킨 경우에 얻어지는 재조합체 산물은 실시예 9에서 나타낸 바와 같이 RXXR 모티프의 직후인 179번째의 아르기닌과 180번째 세린 사이에서 절단되는 것을 얻을 수 있다. 실시예 18에서 나타낸 바와 같이, OST311 단백질의 저인산혈증 유도 활성은 이 부위의 절단을 받지 않았던 전장 단백질에서 유지되고 있는 것이 분명해졌다. 또한, RXXR 모티프가 이 절단에 관여하고 있는 것은 실시예 19 및 실시예 28에 나타낸 변이 도입 시험에서 분명하다. 재조합체 OST311을 양호하게 생산 취득하기 위해서 이 절단을 회피하는 것은 중요한 과제이고, 실시예 28에 기재된 RXXR 모티프에 변이를 도입하는 것은 하나의 유효한 방법이다. RXXR 모티프를 인식하는 단백질 분해 효소 중 하나로서, 푸린이 알려져 있다. 이 효소는 트랜스골지 영역에 위치하여 단백질이 합성된 후 분비에 이르는 과정에서 RXXR 모티프를 인식하여 단백질을 절단한다고 생각된다.
(1) OST311 절단에의 푸린의 관여
푸린이 결손되어 있는 LoVo 세포에 OST311/pCAGGS 플라스미드를 트랜스펙탐(미국, 프로메가사)를 사용하여 도입하고, 48 시간 배양한 후, 일과성 발현에 의해 배양액 중에 분비된 OST311 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 311-148 항체를 이용하여 해석하였더니 절단 단편은 검출되지 않았다. 이 때부터 OST311의 생산시에 확인되었던 절단에 푸린이 관여함이 시사되었다.
(2) OST311의 절단의 회피
상기 결과로부터, 푸린 활성을 저해하는 것이 179번째의 알기닌과 180번째의 세린 사이에서 절단되지 않은 OST311의 생산성 향상에 유효한 것으로 상정되었다. 따라서, Lovo 세포와 같이 푸린 활성을 갖지 않은 숙주로 OST311을 발현시키는 것, 또는 푸린의 조해제를 첨가함으로써 푸린 활성을 억제시킨 상황에서 OST311을 발현시키는 것을 생각할 수 있다. 따라서, CHO-OST311H 세포의 푸린 활성을 억제하는 목적으로, α1-안티트립신 포틀랜드(α1-PDX)를 벤자넷(Benjannet S) 등이 보고하고 있는 방법(J Biol Chem 272:26210-8, 1997)에 준하여 일과성 발현시켜 배양 상청을 회수하였더니, 재조합체 산물 중의 전장 폴리펩티드의 존재 비율이 대조군의 비유전자도입 CHO-OST311H 세포 상청 중에서의 비율에 비하여 증가되었다. 이로부터 푸린 활성을 억제하는 물질을 외래적 또는 내인적으로 작용시킴으로써 OST311의 전장 단백질 생산 효율을 상승시킬 수 있다고 생각되었다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전문이 본 명세서에 참고로 도입된다.
본 발명에 의해, 인산 대사, 칼슘 대사 및(또는) 석회화를 조절하는 폴리펩티드, 동 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 동 폴리펩티드를 유효 성분으로 하는 의약 조성물, 및 동 폴리펩티드를 인식하는 항체와 동 항체를 유효 성분으로 하는 의약 조성물, 동 항체를 사용한 진단 방법과 진단용 조성물이 제공된다.
<서열 목록 프리 텍스트>
서열 12: 합성 DNA
서열 13: 합성 DNA
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서열 15: 합성 DNA
서열 16: 합성 DNA
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서열 28: 합성 펩티드
서열 29: 합성 펩티드
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<110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> DNA encoding a polypeptide regulating phosphate metabolism, 　　　calcium metabolism and calcification. <130> PH-1268PCT <140> <141> <150> JP2000-245144 <151> 2000-08-11 <150> JP2000-287864 <151> 2000-09-21 <150> JP2000-391027 <151> 2000-12-22 <150> JP2001-121527 <151> 2001-04-19 <160> 87 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2770 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (133)..(885) <400> 1 gaatccagtc taggatcctc acaccagcta cttgcaaggg agaaggaaaa ggccagtaag 60 gcctgggcca ggagagtccc gacaggagtg tcaggtttca atctcagcac cagccactca 120 gagcagggca cg atg ttg ggg gcc cgc ctc agg ctc tgg gtc tgt gcc ttg 171 　　　　　　　Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu 　　　　　　　　1　　　　　　　 5　　　　　　　　　10 tgc agc gtc tgc agc atg agc gtc ctc aga gcc tat ccc aat gcc tcc　 219 Cys Ser Val Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser 　　 15　　　　　　　　　20　　　　　　　　　25 cca ctg ctc ggc tcc agc tgg ggt ggc ctg atc cac ctg tac aca gcc　 267 Pro Leu Leu Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala 30　　　　　　　　　35　　　　　　　　　40　　　　　　　　　45 aca gcc agg aac agc tac cac ctg cag atc cac aag aat ggc cat gtg　 315 Thr Ala Arg Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val 　　　　　　　　 50　　　　　　　　　55　　　　　　　　　60 gat ggc gca ccc cat cag acc atc tac agt gcc ctg atg atc aga tca　 363 Asp Gly Ala Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser 　　　　　　 65　　　　　　　　　70　　　　　　　　　75 gag gat gct ggc ttt gtg gtg att aca ggt gtg atg agc aga aga tac　 411 Glu Asp Ala Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr 　　　　 80　　　　　　　　　85　　　　　　　　　90 ctc tgc atg gat ttc aga ggc aac att ttt gga tca cac tat ttc gac　 459 Leu Cys Met Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp 　　 95　　　　　　　　 100　　　　　　　　 105 ccg gag aac tgc agg ttc caa cac cag acg ctg gaa aac ggg tac gac　 507 Pro Glu Asn Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp 110　　　　　　　　 115　　　　　　　　 120　　　　　　　　 125 gtc tac cac tct cct cag tat cac ttc ctg gtc agt ctg ggc cgg gcg　 555 Val Tyr His Ser Pro Gln Tyr 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Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly 　　　　　　225　　　　　　　　 230　　　　　　　　 235 gga acg ggc ccg gaa ggc tgc cgc ccc ttc gcc aag ttc atc　　　　　 885 Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 　　　　240　　　　　　　　 245　　　　　　　　 250 tagggtcgct ggaagggcac cctctttaac ccatccctca gcaaacgcag ctcttcccaa 945 ggaccaggtc ccttgacgtt ccgaggatgg gaaaggtgac aggggcatgt atggaatttg 1005 ctgcttctct ggggtccctt ccacaggagg tcctgtgaga accaaccttt gaggcccaag 1065 tcatggggtt tcaccgcctt cctcactcca tatagaacac ctttcccaat aggaaacccc 1125 aacaggtaaa ctagaaattt ccccttcatg aaggtagaga gaaggggtct ctcccaacat 1185 atttctcttc cttgtgcctc tcctctttat cacttttaag cataaaaaaa aaaaaaaaaa 1245 aaaaaaaaaa aaaaagcagt gggttcctga gctcaagact ttgaaggtgt agggaagagg 1305 aaatcggaga tcccagaagc ttctccactg ccctatgcat ttatgttaga tgccccgatc 1365 ccactggcat ttgagtgtgc aaaccttgac attaacagct gaatggggca agttgatgaa 1425 aacactactt tcaagccttc gttcttcctt gagcatctct ggggaagagc tgtcaaaaga 1485 ctggtggtag gctggtgaaa acttgacagc tagacttgat gcttgctgaa atgaggcagg 1545 aatcataata gaaaactcag cctccctaca gggtgagcac cttctgtctc gctgtctccc 1605 tctgtgcagc cacagccaga gggcccagaa tggccccact ctgttcccaa gcagttcatg 1665 atacagcctc accttttggc cccatctctg gtttttgaaa atttggtcta aggaataaat 1725 agcttttaca ctggctcacg aaaatctgcc ctgctagaat ttgcttttca aaatggaaat 1785 aaattccaac tctcctaaga ggcatttaat taaggctcta cttccaggtt gagtaggaat 1845 ccattctgaa caaactacaa aaatgtgact gggaaggggg ctttgagaga ctgggactgc 1905 tctgggttag gttttctgtg gactgaaaaa tcgtgtcctt ttctctaaat gaagtggcat 1965 caaggactca gggggaaaga aatcagggga catgttatag aagttatgaa aagacaacca 2025 catggtcagg ctcttgtctg tggtctctag ggctctgcag cagcagtggc tcttcgatta 2085 gttaaaactc tcctaggctg acacatctgg gtctcaatcc ccttggaaat tcttggtgca 2145 ttaaatgaag ccttacccca ttactgcggt tcttcctgta agggggctcc attttcctcc 2205 ctctctttaa atgaccacct aaaggacagt atattaacaa gcaaagtcga ttcaacaaca 2265 gcttcttccc agtcactttt ttttttctca ctgccatcac atactaacct tatactttga 2325 tctattcttt ttggttatga gagaaatgtt gggcaactgt ttttacctga tggttttaag 2385 ctgaacttga aggactggtt cctattctga aacagtaaaa ctatgtataa tagtatatag 2445 ccatgcatgg caaatatttt aatatttctg ttttcatttc ctgttggaaa tattatcctg 2505 cataatagct attggaggct cctcagtgaa agatcccaaa aggattttgg tggaaaacta 2565 gttgtaatct cacaaactca acactaccat caggggtttt ctttatggca aagccaaaat 2625 agctcctaca atttcttata tccctcgtca tgtggcagta tttatttatt tatttggaag 2685 tttgcctatc cttctatatt tatagatatt tataaaaatg taaccccttt ttcctttctt 2745 ctgtttaaaa taaaaataaa attta　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 2770 <210> 2 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val 　1　　　　　　　 5　　　　　　　　　10　　　　　　　　　15 Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu 　　　　　　 20　　　　　　　　　25　　　　　　　　　30 Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg 　　　　 35　　　　　　　　　40　　　　　　　　　45 Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala 　　 50　　　　　　　　　55　　　　　　　　　60 Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala 65　　　　　　　　　70　　　　　　　　　75　　　　　　　　　80 Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met 　　　　　　　　 85　　　　　　　　　90　　　　　　　　　95 Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn 　　　　　　100　　　　　　　　 105　　　　　　　　 110 Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His 　　　　115　　　　　　　　 120　　　　　　　　 125 Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala 　　130　　　　　　　　 135　　　　　　　　 140 Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg 145　　　　　　　　 150　　　　　　　　 155　　　　　　　　 160 Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg 　　　　　　　　165　　　　　　　　 170　　　　　　　　 175 His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val 　　　　　　180　　　　　　　　 185　　　　　　　　 190 Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln 　　　　195　　　　　　　　 200　　　　　　　　 205 Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu 　　210　　　　　　　　 215　　　　　　　　 220 Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly 225　　　　　　　　 230　　　　　　　　 235　　　　　　　　 240 Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 　　　　　　　　245　　　　　　　　 250 <210> 3 <211> 684 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(684) <400> 3 tat ccc aat gcc tcc cca ctg ctc ggc tcc agc tgg ggt ggc ctg atc　 48 Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile 　1　　　　　　　 5　　　　　　　　　10　　　　　　　　　15 cac ctg tac aca gcc aca gcc agg aac agc tac cac ctg cag atc cac　 96 His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His 　　　　　　 20　　　　　　　　　25　　　　　　　　　30 aag aat ggc cat gtg gat ggc gca ccc cat cag acc atc tac agt gcc　 144 Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala 　　　　 35　　　　　　　　　40　　　　　　　　　45 ctg atg atc aga tca gag gat gct ggc ttt gtg gtg att aca ggt gtg　 192 Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val 　　 50　　　　　　　　　55　　　　　　　　　60 atg agc aga aga tac ctc tgc atg gat ttc aga ggc aac att ttt gga　 240 Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly 65　　　　　　　　　70　　　　　　　　　75　　　　　　　　　80 tca cac tat ttc gac ccg gag aac tgc agg ttc caa cac cag acg ctg　 288 Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu 　　　　　　　　 85　　　　　　　　　90　　　　　　　　　95 gaa aac ggg tac gac gtc tac cac tct cct cag tat cac ttc ctg gtc　 336 Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val 　　　　　　100　　　　　　　　 105　　　　　　　　 110 agt ctg ggc cgg gcg aag aga gcc ttc ctg cca ggc atg aac cca ccc　 384 Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro 　　　　115　　　　　　　　 120　　　　　　　　 125 ccg tac tcc cag ttc ctg tcc cgg agg aac gag atc ccc cta att cac　 432 Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His 　　130　　　　　　　　 135　　　　　　　　 140 ttc aac acc ccc ata cca cgg cgg cac acc cgg agc gcc gag gac gac　 480 Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp 145　　　　　　　　 150　　　　　　　　 155　　　　　　　　 160 tcg gag cgg gac ccc ctg aac gtg ctg aag ccc cgg gcc cgg atg acc　 528 Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr 　　　　　　　　165　　　　　　　　 170　　　　　　　　 175 ccg gcc ccg gcc tcc tgt tca cag gag ctc ccg agc gcc gag gac aac　 576 Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn 　　　　　　180　　　　　　　　 185　　　　　　　　 190 agc ccg atg gcc agt gac cca tta ggg gtg gtc agg ggc ggt cga gtg　 624 Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val 　　　　195　　　　　　　　 200　　　　　　　　 205 aac acg cac gct ggg gga acg ggc ccg gaa ggc tgc cgc ccc ttc gcc　 672 Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala 　　210　　　　　　　　 215　　　　　　　　 220 aag ttc atc tag　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 684 Lys Phe Ile 225 <210> 4 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile 　1　　　　　　　 5　　　　　　　　　10　　　　　　　　　15 His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His 　　　　　　 20　　　　　　　　　25　　　　　　　　　30 Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala 　　　　 35　　　　　　　　　40　　　　　　　　　45 Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val Val Ile Thr Gly 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215　　　　　　　　 220 Lys Phe Ile 225 <210> 5 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(465) <400> 5 tat ccc aat gcc tcc cca ctg ctc ggc tcc agc tgg ggt ggc ctg atc　 48 Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile 　1　　　　　　　 5　　　　　　　　　10　　　　　　　　　15 cac ctg tac aca gcc aca gcc agg aac agc tac cac ctg cag atc cac　 96 His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His 　　　　　　 20　　　　　　　　　25　　　　　　　　　30 aag aat ggc cat gtg gat ggc gca ccc cat cag acc atc tac agt gcc　 144 Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala 　　　　 35　　　　　　　　　40　　　　　　　　　45 ctg atg atc aga tca gag gat gct ggc ttt gtg gtg att aca ggt gtg　 192 Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val 　　 50　　　　　　　　　55　　　　　　　　　60 atg agc aga aga tac ctc tgc atg gat ttc aga ggc aac att ttt gga　 240 Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly 65　　　　　　　　　70　　　　　　　　　75　　　　　　　　　80 tca cac tat ttc gac ccg gag aac tgc agg ttc caa cac cag 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His Val Asp Gly Ala Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala 　　　　 35　　　　　　　　　40　　　　　　　　　45 Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val 　　 50　　　　　　　　　55　　　　　　　　　60 Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly 65　　　　　　　　　70　　　　　　　　　75　　　　　　　　　80 Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu 　　　　　　　　 85　　　　　　　　　90　　　　　　　　　95 Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val 　　　　　　100　　　　　　　　 105　　　　　　　　 110 Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro 　　　　115　　　　　　　　 120　　　　　　　　 125 Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His 　　130　　　　　　　　 135　　　　　　　　 140 Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg His Thr Arg 145　　　　　　　　 150　　　　　　　　 155 <210> 7 <211> 219 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(216) <400> 7 agc gcc gag gac gac tcg gag cgg gac ccc ctg aac gtg ctg aag ccc　 48 Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro 　1　　　　　　　 5　　　　　　　　　10　　　　　　　　　15 cgg gcc cgg atg acc ccg gcc ccg gcc tcc tgt tca cag gag ctc ccg　 96 Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro 　　　　　　 20　　　　　　　　　25　　　　　　　　　30 agc gcc gag gac aac agc ccg atg gcc agt gac cca tta ggg gtg gtc　 144 Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Val 　　　　 35　　　　　　　　　40　　　　　　　　　45 agg ggc ggt cga gtg aac acg cac gct ggg gga acg ggc ccg gaa ggc　 192 Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly 　　 50　　　　　　　　　55　　　　　　　　　60 tgc cgc ccc ttc gcc aag ttc atc tag　　　　　　　　　　　　　　　 219 Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 65　　　　　　　　　70 <210> 8 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro 　1　　　　　　　 5　　　　　　　　　10　　　　　　　　　15 Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro 　　　　　　 20　　　　　　　　　25　　　　　　　　　30 Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Val 　　　　 35　　　　　　　　　40　　　　　　　　　45 Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly 　　 50　　　　　　　　　55　　　　　　　　　60 Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 65　　　　　　　　　70 <210> 9 <211> 543 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(540) <400> 9 gcc ctg atg att aca tca gag gac gcc ggc tct gtg gtg ata aca gga　 48 Ala Leu Met Ile Thr Ser Glu Asp Ala Gly Ser Val Val Ile Thr Gly 　1　　　　　　　 5　　　　　　　　　10　　　　　　　　　15 gcc atg act cga agg ttc ctt tgt atg gat ctc cac ggc aac att ttt　 96 Ala Met Thr Arg Arg Phe Leu Cys Met Asp Leu His Gly Asn Ile Phe 　　　　　　 20　　　　　　　　　25　　　　　　　　　30 gga tcg ctt cac ttc agc cca gag aat tgc aag ttc cgc cag tgg acg　 144 Gly Ser Leu His Phe Ser Pro Glu Asn Cys Lys Phe Arg Gln Trp Thr 　　　　 35　　　　　　　　　40　　　　　　　　　45 ctg gag aat ggc tat gac gtc tac ttg tcg cag aag cat cac tac ctg　 192 Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr Leu Ser Gln Lys His His Tyr Leu 　　 50　　　　　　　　　55　　　　　　　　　60 gtg agc ctg ggc cgc gcc aag cgc atc ttc cag ccg ggc acc aac ccg　 240 Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ile Phe Gln Pro Gly Thr Asn Pro 65　　　　　　　　　70　　　　　　　　　75　　　　　　　　　80 ccg ccc ttc tcc cag ttc ctg gct cgc agg aac gag gtc ccg ctg ctg　 288 Pro Pro Phe Ser Gln Phe Leu Ala Arg Arg Asn Glu Val Pro Leu Leu 　　　　　　　　 85　　　　　　　　　90　　　　　　　　　95 cat ttc tac act gtt cgc cca cgg cgc cac acg cgc agc gcc gag gac　 336 His Phe Tyr Thr Val Arg Pro Arg Arg His Thr Arg Ser Ala Glu Asp 　　　　　　100　　　　　　　　 105　　　　　　　　 110 cca ccg gag cgc gac cca ctg aac gtg ctc aag ccg cgg ccc cgc gcc　 384 Pro Pro Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro Arg Pro Arg Ala 　　　　115　　　　　　　　 120　　　　　　　　 125 acg cct gtg cct gta tcc tgc tct cgc gag ctg ccg agc gca gag gaa　 432 Thr Pro Val Pro Val Ser Cys Ser Arg Glu Leu Pro Ser Ala Glu Glu 　　130　　　　　　　　 135　　　　　　　　 140 ggt ggc ccc gca gcc agc gat cct ctg ggg gtg ctg cgc aga ggc cgt　 480 Gly Gly Pro Ala Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Leu Arg Arg Gly Arg 145　　　　　　　　 150　　　　　　　　 155　　　　　　　　 160 gga gat gct cgc ggg ggc gcg gga ggc gcg gat agg tgt cgc ccc ttt　 528 Gly Asp Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asp Arg Cys Arg Pro Phe 　　　　　　　　165　　　　　　　　 170　　　　　　　　 175 ccc agg ttc gtc 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Asp Pro Leu Gly Val Leu Arg Arg Gly Arg 145　　　　　　　　 150　　　　　　　　 155　　　　　　　　 160 Gly Asp Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asp Arg Cys Arg Pro Phe 　　　　　　　　165　　　　　　　　 170　　　　　　　　 175 Pro Arg Phe Val 　　　　　　180 <210> 11 <211> 13200 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ggctctcatg gctttagctc taacatgttg tatgggtttg gacaccttga aaagtgctta 60 ggaggtcttg gggccagacc tggattcaaa tccaacctct tccacatgtt acctttctat 120 ctctaggcaa gttacttaaa ctgtgtgcat agatcagttt cctgatctat ataaagaaaa 180 taacagcatc tcctcaaaga gttattctga agatgaaatg ggttactaca agtaaagcac 240 ttagagcagt aagtggaaca gtaagctctc catgagcgtt agttcttgct gtgattcttt 300 ggagaagcag cctagggaag gagaagacct tgtcctggct ctaccattta tttgctttgt 360 gcctttggac atggaaacac taagatttcc atttcttcat gtaaagtatt aaaatcttga 420 taatgcatgg agtgcctatc tcacagagtg gcagtgaggt tcaaataagc taatagatgt 480 gaaaatgctt tgtaaactat aaaaaaaaac tgtacaaatg tagggtaaca aatgccatct 540 ctttctgtct atacctgtaa gcttgcactc attttgtatt atagttactt atttttatct 600 gcctcctgca ttagatttga gctcctcaag ataggaatca catcttgctg tctcctatat 660 caacctgtac atgagtctag cttgatgcct gtacatggca tatactcagt acagggaaac 720 tggaagaata gcaaactcct tgtgtgtttt ttcgggtgtg tgttccagta gcttgctccc 780 ctttagactg tatgtgccag gactattcca cccgacatca ggtgtagctt cccagagggc 840 tcactgtgaa cagcatctgc aggcaggcat ccaacaccaa gctgagcact catgtacaga 900 cactaaatgt ggggacaccc tgtcctgagg ctcggatccc cagtgctcag ccagcagctg 960 ttccaatccc catgaggtct ctgaatgagt ctccttacta ctggagagac tactagttta 1020 gttgccctcg atagtccaaa ctagggaaat tgagaaattg aaccttggca tattcagtga 1080 agtccagact aaggaagctg agaaactgaa ccttggcatg ttcactgacc tcaaggcctt 1140 acttcttttt cttccatttc aaaatcttcc caaaatggca actttggctt ttgtgcccct 1200 gctcctagct cccatctttc atgaagtggg tgttcttaga ggatgccatc tgcctgatgg 1260 tgtcatgtat ctctatatcc tgcaagctac ccaccaaatc ctgctcacag attaagcact 1320 ggatacatac ttgctgattg gaatttaaag aaaaccaaaa taagtaaact cgacaggaga 1380 ttaattgcct aggagtcggt tgactgcttg actgaagctg gatttttttt gggaaccgct 1440 ggctgccttc acatttcctg atggaagtgg gacaggtcaa cagacagccc agagtggcag 1500 ataacttttg cccacacgtc attcattttt tggagcgttg gcttgaaatt gaggggtgtg 1560 tgtgtctgga accgacgtgc cttccgtgcg cctccggggt ctttgcactt tctttcaatg 1620 ggctgattac aacacagagg atgtggacag tggagttttt cctgtttgat gtcacactgc 1680 taccctttaa aagtctgacg gcaaaaagga gggaatccag tctaggatcc tcacaccagc 1740 tacttgcaag ggagaaggaa aaggccagta aggcctgggc caggagagtc ccgacaggag 1800 tgtcaggttt caatctcagc accagccact cagagcaggg cacgatgttg ggggcccgcc 1860 tcaggctctg ggtctgtgcc ttgtgcagcg tctgcagcat gagcgtcctc agagcctatc 1920 ccaatgcctc cccactgctc ggctccagct ggggtggcct gatccacctg tacacagcca 1980 cagccaggaa cagctaccac ctgcagatcc acaagaatgg ccatgtggat ggcgcacccc 2040 atcagaccat ctacagtgag tagggcttca ggctgggaag aaggggagca cccttgttgt 2100 ccatctacag gaggcttggg gaggttgggg actagactgg agggctaatc caaccctcct 2160 agctttctgc ccaggaacca cttattgtct ttgtgtgtgt gtgtgtttgt gtgtgtgtgt 2220 gtgtgcgtgt gtatttaaaa cttaggggaa gattctgtca ctctcctaat tagcatttgc 2280 tggtttttct caatatgaat aatttttatt tcaactaaaa cccttcccac agtaggagcc 2340 atgttccctt tgccccgtca aaagattgaa aaaatgtaca gaaagaaagg caaggagtct 2400 aagagaaaaa gaagccaggc agatcaacag acactaagtt tcagctcatg gactttggac 2460 tgggttaact agggaggttg taaagattcc tgggtcatac ccagattgtt atagataaat 2520 ctgggggctc tttccaactc tggccttata aaaattcttg gaaaaatgta ttaaagacag 2580 actgtccatg tatgttgtct tggtgagaat ggccaagtat acaacccatc cacccattca 2640 tttgtccatg catccatcca tccatccatc catccatcca tccatccatc catccatcca 2700 tccaacaggt ttaatgggtg tttcagacac ccaggtaccc aggtacccag tatgagttgg 2760 tgattcttct ctgtggaact gaaaggtgtc cagtcagtag caagtcaagc tagttagaaa 2820 cttattggca acatgagaca actggaatgt ttttaaagat caggtttgtg gagaattgga 2880 tcacaatcca caataatcaa tccattagca atgattcaaa tgagggtccc tttgtgtgca 2940 cctatataag gggtaatgtg gtgaaagcag ggatagatat tgaaaaagac tggatcttct 3000 attttaagaa aacgtgagaa aacacctcaa agcatacaga aaaatgcaaa ctgatccaat 3060 atagctcaaa ttaaaggaaa gaaaaattag ttagacaatc tctaactaaa gaaaacatag 3120 gaattatgat ttgcccttta ttgttgtaat aaataaatta attatttttg ctgtgacctt 3180 gctgtgtgtg aggcatttat tcttctaggc tccaaaggtc cttaaacctg gttgcaagat 3240 atacaacatg caaaattaag ttgcaagata tataacatgc gaaattgaca gtttaacctc 3300 ttcaagtact aaatgcatat tgacaggaga taaaaggaga gaggaaagtt ctctccgaat 3360 accaaacagg ttccagaact ccagagaata tagtaagact caggagtcaa catcttggaa 3420 accaagtttg agtctcatgg caaaaatttc aattaaatct ggatacactt gatgcacccg 3480 aagtgttgtt cattttattc aatggatatt taataggatc taccatgtgc ctggcattct 3540 accaagcgct gtggctgaaa actaagacac aacccttcaa ggacctcatg gtctgtcgtc 3600 ctaccttgtc agccagctca ctaccagact ttcaggaaat gcaattttgc atgtctcatg 3660 gaggggacac ccttactcta attcaagact atatgtgggc caggtgtggt ggctcacgcc 3720 tgtaatccca gcactctggg aggccgaggc aggcagatca cgaggtcagg agattgagac 3780 catcctggct aacacagtga aaccccatct ctactaaaaa tacaaaaaat tagccaggcg 3840 tggtggcagg cgcctgtagt cccagctact tgggaggctg aggcaggaga atggcgtgaa 3900 cccgggaggc agagcttgca gtgagccgag attgcgccac tgcactccag cctgggtgac 3960 agagcgagac tccatctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagactat atgtgattta 4020 aaatgcagaa tagtagatta tggtaaatta ttttgattct cttagatgga aagggctgca 4080 tccaactaga gaatgtttat acaacttgtc tcgaatcctg gaatcccgtt gctgaaagga 4140 actccttaaa gacgtttctt cctgaacaag aattagggta gaacagaaca ggccggctac 4200 ggtggggagt gagtgtgaag agtcaacctc ctgggctggc agtctgaact tagacctttt 4260 ccttgaaagc ccacctcgta tcaggcccca agggatcact gagtgctagt tagagtgaat 4320 taaaatgact gagaagcagc aaaataaatt gaactgactt cagattttta aaaatagaaa 4380 tgtgattttg tttccttaga cataggcact agctaaacat tgcatcttta aagagttaaa 4440 catgaatgcg gggaggggaa cttcgggtca gggtagtggg agggagatct acttttccta 4500 gtctatgtag ataacttttt gtactgttca atgagttgtc atgtgtatta tgggaaaaaa 4560 aaagtgcagg aaaaaattac acactacaat taaaagttac ccaaaagagg ccagatgcgg 4620 tggctcacgc gtataatctc agcactttgg gaggccgagg tgggaggatc acttgaagtc 4680 aggggttcga gaccagtctg gccaacatgg ggaaaccctg tctctactaa aaatacaaaa 4740 attagtgggg tgtggtgcct gcctgtagtc acagctactt gggaggctga ggcagaagaa 4800 tcgcttgtac cccagaggtg gagcttgcag tgagctgaga tcgcaccact gtgctccagc 4860 ctgggtgaca gagtgagact ccgtctcaaa aaaaaaacgt tacccaaaag aaagaggaaa 4920 gattaatgca tgtagataag aagcacaact aattaaatgt ctggtgaagg atttgtaatg 4980 acctcatcag tgactgttaa gcaatgtttt tacactgatg gaaacctaaa atgtgagggg 5040 tattttttcc cctcctaatt atccatttct attgaattct ggtttatctt attactttgc 5100 tgtaagaaat tcttaagagt tgagtgcaca acccatcttt gggtcactgg acttgacaaa 5160 atgaagttat ctcctgccta ccagattctt caagctccct taggactcac aagcgctgct 5220 gccaggtacc cctctggtgt ccttatcacc cgttccatga acaaggccat cctctgactc 5280 ccctttatcc ttattatatg gaaacagcaa gagagagatg cttattgtcc ctggtaatat 5340 catttcctag atcctgctat tttcacttcc tccatcttcc ccataggaac tatctttatt 5400 gaagctgaat taccgctgag ctccttcagc ctttttcata cgtttttctt ttgaggtgct 5460 caaagcactt cactgctatc atcttattta tcacttactg gccacaagag tagaatggag 5520 tagataattt tctacttcta taagcagagg ttgaagcaaa gtggtaatag taaaaattac 5580 tagcacttag gaagtgcttt ctaaaggata aaaacattat ctcattatgt cttcaagatg 5640 accaaatgag gtaaatgttt ctgctgtcct cattttatat 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tttatgttag atgccccgat cccactggca tttgagtgtg 11580 caaaccttga cattaacagc tgaatggggc aagttgatga aaacactact ttcaagcctt 11640 cgttcttcct tgagcatctc tggggaagag ctgtcaaaag actggtggta ggctggtgaa 11700 aacttgacag ctagacttga tgcttgctga aatgaggcag gaatcataat agaaaactca 11760 gcctccctac agggtgagca ccttctgtct cgctgtctcc ctctgtgcag ccacagccag 11820 agggcccaga atggccccac tctgttccca agcagttcat gatacagcct caccttttgg 11880 ccccatctct ggtttttgaa aatttggtct aaggaataaa tagcttttac actggctcac 11940 gaaaatctgc cctgctagaa tttgcttttc aaaatggaaa taaattccaa ctctcctaag 12000 aggcatttaa ttaaggctct acttccaggt tgagtaggaa tccattctga acaaactaca 12060 aaaatgtgac tgggaagggg gctttgagag actgggactg ctctgggtta ggttttctgt 12120 ggactgaaaa atcgtgtcct tttctctaaa tgaagtggca tcaaggactc agggggaaag 12180 aaatcagggg acatgttata gaagttatga aaagacaacc acatggtcag gctcttgtct 12240 gtggtctcta gggctctgca gcagcagtgg ctcttcgatt agttaaaact ctcctaggct 12300 gacacatctg ggtctcaatc cccttggaaa ttcttggtgc attaaatgaa gccttacccc 12360 attactgcgg 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Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 59 atatgcatgc ctccagctgg ggtggcctga tccac 35 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 60 tgtatcccaa tgcctcccca ctg 23 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 61 atggatccct agatgaactt ggcgaaggg 29 <210> 62 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 62 atcatatgta tcccaatgcc tccccactg 29 <210> 63 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 63 atgcggccgc ctagatgaac ttggcgaagg g 31 <210> 64 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 64 gaattcatat gaaatacccg aacgcttccc cgctgctggg ctccagctg 49 <210> 65 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 65 cccaagcttg cggccgccta gatgaacttg gc 32 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 66 aacaccccca tagcacggcg gcaca 25 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 67 tgtgccgccg tgctatgggg gtgtt 25 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 68 acccccatac cagcgcggca cacccg 26 <210> 69 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 69 cgggtgtgcc gcgctggtat gggggt 26 <210> 70 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 70 cccataccac gggcgcacac ccggag 26 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 71 ctccgggtgt gcgcccgtgg tatggg 26 <210> 72 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 72 ataccacggc gggccacccg gagcgc 26 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 73 gcgctccggg tggcccgccg tggtat 26 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 74 ccacggcggc acgcccggag cgccg 25 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 75 cggcgctccg ggcgtgccgc cgtgg 25 <210> 76 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 76 cggcggcaca ccgcgagcgc cgagga 26 <210> 77 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 77 tcctcggcgc tcgcggtgtg ccgccg 26 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 78 cggcacaccc gggccgccga ggacga 26 <210> 79 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 79 tcgtcctcgg cggcccgggt gtgccg 26 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 80 acccccatac cacagcggca cacccg 26 <210> 81 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 81 cgggtgtgcc gctgtggtat gggggt 26 <210> 82 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 82 cccataccac ggcagcacac ccggag 26 <210> 83 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 83 ctccgggtgt gctgccgtgg tatggg 26 <210> 84 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 84 cggcggcaca cccagagcgc cgagga 26 <210> 85 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 85 tcctcggcgc tctgggtgtg ccgccg 26 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 86 cggcggcaca cctggagcgc cgagg 25 <210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 87 cctcggcgct ccaggtgtgc cgccg 25 38 <210> 88 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ser 20 25 30 Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser Tyr 35 40 45 His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala Pro His Gln 50 55 60 Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val 65 70 75 80 Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met Asp Phe Arg 85 90 95 Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn Cys Arg Phe 100 105 110 Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His Ser Pro Gln 115 120 125 Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala Phe Leu Pro 130 135 140 Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn Glu 145 150 155 160 Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg His Thr Arg 165 170 175 Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro 180 185 190 Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro 195 200 205 Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Val 210 215 220 Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly 225 230 235 240 Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 245 <210> 89 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Met Lys Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ser Trp Gly Gly 1 5 10 15 Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser Tyr His Leu Gln 20 25 30 Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala Pro His Gln Thr Ile Tyr 35 40 45 Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val Val Ile Thr 50 55 60 Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met Asp Phe Arg Gly Asn Ile 65 70 75 80 Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn Cys Arg Phe Gln His Gln 85 90 95 Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His Ser Pro Gln Tyr His Phe 100 105 110 Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala Phe Leu Pro Gly Met Asn 115 120 125 Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn Glu Ile Pro Leu 130 135 140 Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg His Thr Arg Ser Ala Glu 145 150 155 160 Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro Arg Ala Arg 165 170 175 Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser Ala Glu 180 185 190 Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly 195 200 205 Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys Arg Pro 210 215 220 Phe Ala Lys Phe Ile 225

Claims (22)

  1. 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
    서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서, 176번째의 아르기닌 또는 179번째의 아르기닌, 또는 이들 모두가 알라닌, 글루타민 또는 트립토판으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서, 상기 아미노산 서열의 제25번째 내지 제201번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
    서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서, C 말단으로부터 50개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단으로부터 33개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단으로부터 33개 이하의 아미노산이 결실되고 C 말단으로부터 50개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 88로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 89로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는
    서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서, C 말단에 6개의 히스티딘이 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드
    로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
  2. 서열 1로 표시되는 염기 서열 중 제133번째 내지 제885번째의 염기 서열, 또는 서열 3으로 표시되는 염기 서열 중 제1번째 내지 제681번째의 염기 서열로 이루어지는 DNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제3항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
  5. 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
    서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서, 176번째의 아르기닌 또는 179번째의 아르기닌, 또는 이들 모두가 알라닌, 글루타민 또는 트립토판으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서, 상기 아미노산 서열의 제25번째 내지 제201번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
    서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서, C 말단으로부터 50개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단으로부터 33개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단으로부터 33개 이하의 아미노산이 결실되고 C 말단으로부터 50개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 88로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드,
    서열 번호 89로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는
    서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열에서, C 말단에 6개의 히스티딘이 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 저인산혈증 유도 활성, 인산 수송 억제 활성, 석회화 억제 활성 또는 생체내 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 폴리펩티드
    로부터 선택되는 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 폴리(N-비닐-피롤리돈), 폴리프로필렌글리콜 호모 중합체, 폴리프로필렌옥시드와 폴리에틸렌옥시드와의 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 및 폴리비닐알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질에 의해 수식된 폴리펩티드.
  7. 제5항 또는 제6항에 기재된 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하며, 고인산혈증, 부갑상선 기능 항진증, 신성 골이영양증(腎性骨異榮養症), 이소성 석회화(異所性石灰化), 골다공증 및 고비타민 D 혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환에 유효한 의약 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제5항 또는 제6항에 기재된 폴리펩티드와 반응하는 항체.
  11. 제5항 또는 제6항에 기재된 폴리펩티드를 항원으로 하여 인간을 제외한 동물을 면역화시키는 단계를 포함하는, 상기 폴리펩티드와 반응하는 항체의 제조 방법.
  12. 제10항에 기재된 항체를 유효 성분으로 포함하며, 골다공증, 비타민 D 저항성 곱사병, 신성 골이영양증, 투석골증, 저석회화골증, 파제트병(Paget's disease), 종양성 골연화증, 상염색체 우성 저인산혈증성 곱사병(Autosomal dominant hypophosphatemic rickets: ADHR) 및 X 염색체 우성 저인산혈증성 곱사병(X-linked hypophosphatemia: XLH)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환에 유효한 의약 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제10항에 기재된 항체를 포함하는, 신부전, 신장성 인산 누출증, 세뇨관성 산증 (acidosis) 및 판코니 증후군(Fanconi's syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환에 대한 진단제.
  17. 삭제
  18. 제10항에 기재된 항체를 포함하는, 골다공증, 비타민 D 저항성 곱사병, 신성 골이영양증, 투석골증, 저석회화골증, 파제트병, 종양성 골연화증, 상염색체 우성 저인산혈증성 곱사병 및 X 염색체 우성 저인산혈증성 곱사병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환에 대한 진단제.
  19. 삭제
  20. 서열 11로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 또는 서열 11로 표시되는 염기 서열 중 제498번에서 제12966번까지의 서열을 갖는 DNA를 함유하는, 상염색체 우성 저인산혈증성 곱사병에 대한 진단제.
  21. 삭제
  22. 삭제
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