KR100882340B1 - Cosmetic composition comprising pterins stabilized in nanoliposome and manufacturing method thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 테리딘이 나노리포좀의 유효성분으로 포함된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 테리딘이 나노리포좀으로 봉입되어, 안정성 있고 피부투과도가 높아지게 되므로, 이에 의해 테리딘의 미백효과, 항산화효과 및 자외선에 의한 피부 손상 방지 효과를 향상시킬 수 있다.The present invention relates to a cosmetic composition containing a nanoliposome and a method for preparing the same, and more particularly, to a cosmetic composition, characterized in that terridine is included as an active ingredient of the nanoliposome. According to the present invention, since terridine is encapsulated with nanoliposomes, the stability and skin permeability are increased, thereby improving the whitening effect, the antioxidant effect, and the prevention of skin damage by ultraviolet rays.

나노리포좀, 테리딘, 화장료 Nanoliposomes, Terridines, Cosmetics

Description

테리딘이 유효성분으로 포함된 나노리포좀 함유 화장료 조성물 및 그 제조방법{Cosmetic composition comprising pterins stabilized in nanoliposome and manufacturing method thereof} Cosmetic composition containing a terridine as an active ingredient and a method for producing the same {Cosmetic composition comprising pterins stabilized in nanoliposome and manufacturing method

도 1은 테리딘의 농도에 따른 자유 라디칼 소거능을 나타낸 그래프.1 is a graph showing the free radical scavenging ability according to the concentration of terrydin.

도 2는 HaCaT 세포에 테리딘을 농도별로 처리한 경우의 세포 생존율을 나타내는 그래프.Figure 2 is a graph showing the cell viability when treated with terridine concentration in HaCaT cells.

도 3은 B16F10 세포에 테리딘을 농도별로 처리한 경우의 세포 생존율을 나타내는 그래프.Figure 3 is a graph showing the cell survival rate when treated with terrydine concentration to B16F10 cells.

도 4는 DOPA를 기질로 한 경우의 테리딘의 버섯 티로시나아제 활성 저해능을 나타낸 그래프.4 is a graph showing the inhibitory activity of thyridin mushroom tyrosinase activity when DOPA was used as a substrate.

도 5는 티로신을 기질로 한 경우의 테리딘의 버섯 티로시나아제 활성 저해능을 나타낸 그래프.5 is a graph showing the inhibitory activity of thyridin mushroom tyrosinase activity when tyrosine is used as a substrate.

도 6은 DOPA를 기질로 한 경우의 테리딘의 멜라닌 세포내 티로시나아제 활성 저해능을 나타낸 그래프.Fig. 6 is a graph showing the inhibitory activity of teridine melanin tyrosinase activity in the case of using DOPA as a substrate.

도 7은 B16F10 세포에서의 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 발현정도를 나타낸 웨스턴 블럿 결과.Figure 7 is a Western blot showing the expression level of tyrosinase, TRP-1, TRP-2 in B16F10 cells.

도 8은 도 7에 나타난 밴드의 세기를 수치화한 그래프.FIG. 8 is a graph showing numerical values of the band intensities shown in FIG.

도 9는 인체 대상 테리딘의 미백 효과를 나타낸 그래프.9 is a graph showing the whitening effect of the human subject terridine.

도 10은 UVB 40mJ/㎠ 처리 후 시간에 따른 세포내 GSH 함량 변화를 나타낸 그래프.10 is a graph showing changes in intracellular GSH content with time after UVB 40mJ / cm 2 treatment.

도 11은 UVB 처리농도에 따른 세포내 GSH 함량을 나타낸 그래프.11 is a graph showing the intracellular GSH content according to the UVB treatment concentration.

도 12는 UVB 40mJ/㎠ 처리 후 테리딘 처리에 따른 GSH 함량을 나타낸 그래프.12 is a graph showing the GSH content according to the terridine treatment after UVB 40mJ / ㎠ treatment.

도 13은 UVB 처리 후 테리딘 처리에 따른 세포내 멜라닌 함량을 나타내는 그래프.Figure 13 is a graph showing the intracellular melanin content after treatment with terrydin UVB.

도 14는 UVB 처리 후 테리딘 처리에 따른 IL-6발현도를 나타낸 그래프.Figure 14 is a graph showing the IL-6 expression according to the terridine treatment after UVB treatment.

도 15는 UVB 처리 후 테리딘 처리에 따른 PGE2 발현도를 나타내는 그래프.15 is a graph showing the expression level of PGE 2 following terrydine treatment after UVB treatment.

도 16은 시간에 따른 BH4 제형별 피부 투과량을 비교한 그래프.16 is a graph comparing the skin permeation amount according to BH 4 formulation over time.

본 발명은 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 테리딘이 나노리포좀의 유효성분으로 포함된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cosmetic composition containing a nanoliposome and a method for producing the same, and more particularly to a cosmetic composition and a method for producing a terridine is included as an active ingredient of the nanoliposome.

테리딘은 프테린(pterin)이라고도 불리우며, 동물 등의 생체 내에 널리 분포하고 있는 물질로, 조효소의 하나인 폴산이나 비오프테린(biopterin)의 분해물이다. 화학적으로는 2-아미노산-4-히드록시(프)테리닌으로 불리며, 5위치와 6위치에 곁사슬이 달리면 여러 가지 유도체가 얻어진다. 프테린이 프테린탈(탈)아미노효소의 작용을 받으면, 2,4-디히드록시(프)테리딘이 된다. 프테린과 그 유도체는 곤충 외에도 세균에서부터 고등동물, 식물에 이르기까지 널리 분포해 있으며, 특히 고등생물에서는 방향족 아미노산 대사관련효소의 조효소의 역할을 비롯해 푸린 대사, 메탄 합성, 단백질 생합성 등에서 중요한 생리적 역할을 담당한다.Terridine, also called pterin, is a substance widely distributed in living bodies such as animals, and is a degradation product of folic acid or biopterin, which is one of coenzymes. Chemically called 2-amino acid-4-hydroxy (ph) terinine, the side chains at the 5 and 6 positions yield various derivatives. When putrin acts on putrintal (de) aminoenzyme, it becomes 2,4-dihydroxy (ph) teridine. In addition to insects, pterin and its derivatives are widely distributed from bacteria to higher animals and plants. Especially in higher organisms, pterin and its derivatives play important physiological roles in furin metabolism, methane synthesis and protein biosynthesis, as well as the coenzyme of aromatic amino acid metabolism-related enzymes. In charge.

테리딘 혹은 프테린의 용도와 관련된 선행기술로는 증가된 두개내 압력, 속발성 허혈 및 증가된 수준의 세포독성 반응성 산소종과 관련된 질환을 치료하기 위한 프테리딘 유도체의 용도(대한민국 공개특허 제10-2006-2861호), 카이나제 억제제로서의 새로운 프테리딘온(대한민국 공개특허 제10-2002-27649호), 건선 치료용 프테리딘 화합물(대한민국 공개특허 제10-2003-5207호) 및 인간 B형 간염치료제로서의 프테리딘 유도체(대한민국 등록특허 제10-343943호)가 개시된 바 있으나, 자외선에 의한 피부 노화 또는 손상 방지에 대한 연구는 시도된 바 없었다.Prior art related to the use of terrydin or pterin includes the use of pteridine derivatives for the treatment of diseases associated with increased intracranial pressure, secondary ischemia and increased levels of cytotoxic reactive oxygen species. 2006-2861), new pteridinone (Korean Patent No. 10-2002-27649) as a kinase inhibitor, pteridine compound for treating psoriasis (Korean Patent No. 10-2003-5207) and human Although a pteridine derivative (Korean Patent No. 10-343943) as a hepatitis B treatment agent has been disclosed, no studies have been conducted to prevent skin aging or damage caused by ultraviolet rays.

한편, 현재까지 다양한 피부보호제 또는 자외선차단제 등이 개발되어 사용되고 있으나, 이들 자외선에 의한 피부보호제는 과잉 색소증 치료에 국부적으로 사용될 뿐이거나, 색소세포의 변성 또는 치사를 일으키고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타내거나, 세포독성으로 인한 피부자극과 피부병, 심지어는 암 을 유발하기도 하며, 안정성이 떨어지는 등의 문제점이 있었다.On the other hand, various skin protection agents or sunscreen agents have been developed and used to date, but these skin protection agents by ultraviolet rays are only used locally for the treatment of hyperpigmentation, or they cause denaturation or lethality of pigment cells and impair cell original functions. Side effects such as, or skin irritation and skin diseases caused by cytotoxicity, even cause cancer, there was a problem such as poor stability.

또한, 기존의 미백화장품은 피부미백효과 자체에만 초점을 둠으로써, 피부에 존재하는 멜라닌의 함량이 낮은 경우에 생기는 자외선에 의한 피부의 노화 또는 손상에는 전혀 효능을 나타내지 못하여, 자외선에 의한 피부의 노화 또는 손상을 방지하고자 하는 소비자는 미백제와 함께 자외선차단제를 사용하여야 하는 불편함이 있었다.In addition, the existing whitening cosmetics focus only on the skin whitening effect itself, and thus have no effect on the aging or damage of the skin caused by UV light when the melanin content in the skin is low. Or consumers who want to prevent damage was inconvenient to use a sunscreen with a whitening agent.

그리고, 테리딘은 반응성이 매우 강하여 쉽게 산화하는 성질이 있어서, 화장료 소재로 이용할 경우 시간경과에 따라 효능을 잃게 되는 문제점이 있었다.In addition, terridine has a property of being highly oxidized and easily oxidized, and thus loses its efficacy over time when used as a cosmetic material.

따라서, 본 발명의 상기와 같은 문제점을 해결하고자 착안된 것으로서, 일부 테리딘 화합물이 우수한 피부 미백 소재 또는 자외선에 의한 피부 노화 방지 소재로 활용될 수 있음을 발견하고, 불안정한 테리딘의 피부 미백 효과 또는 자외선에 의한 피부 손상 방지 효과의 안정성 및 지속성을 도모하고, 테리딘의 피부투과성을 높이기 위한 테리딘이 유효성분으로 포함된 나노리포좀 함유 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공함을 그 목적으로 한다.Therefore, as conceived to solve the above problems of the present invention, it was found that some terridine compounds can be used as an excellent skin whitening material or anti-aging skin material by UV light, the skin whitening effect of unstable terridine or It is an object of the present invention to provide a nanoliposome-containing cosmetic composition and a method for producing the same, wherein the tertidine is included as an active ingredient to achieve stability and persistence of the skin damage prevention effect by ultraviolet rays and to enhance skin permeability of terrydine.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 테리딘이 유효성분으로 포함된 나노리포좀 함유 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a nanoliposome-containing cosmetic composition and a method for preparing the same containing terridine as an active ingredient.

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본 발명에 있어서 상기 테리딘은 (6R)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린((6R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin, 이하, 'BH4'라 한다), 세피아프테린(sepiapterin) 및 (6R)-5-메틸-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린((6R)-5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin, 이하 'Methyl-BH4'라 한다) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 의미하며, (6R)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린을 이용할 경우 가장 우수한 미백효과, 항산화효과 및 자외선에 의한 피부 노화 방지 효과를 얻을 수 있으므로 (6R)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린을 유효성분으로 포함하는 것이 가장 바람직하다.In the present invention, the terridine is (6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterrin ((6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin, hereinafter referred to as 'BH 4 '), Sepiapterin and (6R) -5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterrin ((6R) -5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin, hereinafter 'Methyl -BH 4 '), and when (6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin is used, the best whitening effect, antioxidant effect and anti-aging of the skin by UV rays Since the effect can be obtained, it is most preferable to include (6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterrin as an active ingredient.

상기 테리딘이 유효성분으로 포함된 나노리포좀 함유 화장료 조성물에 있어서, 상기 나노리포좀의 함량은 화장료 조성물에 대하여 0.02~10중량%로 할 수 있다. 나노리포좀 함량이 0.02중량% 미만일 경우에는 테리딘의 목적효과를 기대하기 어렵고, 10중량% 초과시에는 비용면에서 비효율적이다. 이때, 나노리포좀의 함량을 0.1~5중량%로 할 경우 더욱 바람직하다.In the nanoliposome-containing cosmetic composition containing the terridine as an active ingredient, the content of the nanoliposome may be 0.02 to 10% by weight based on the cosmetic composition. If the nanoliposome content is less than 0.02% by weight, it is difficult to expect the desired effect of terridine, and when it exceeds 10% by weight, it is inefficient in terms of cost. At this time, the content of the nano liposomes is more preferably 0.1 to 5% by weight.

그리고, 상기 테리딘의 함량은 상기 나노리포좀에 대하여 0.001~5중량%일 수 있다. 상기 테리딘의 함량이 상기 나노리포좀에 대하여 0.05~2중량%일 경우, 비용과 효과 측면에서 바람직하다.And, the content of the terridine may be 0.001 ~ 5% by weight based on the nanoliposomes. When the content of the terridine is 0.05 to 2% by weight relative to the nanoliposome, it is preferable in terms of cost and effect.

그리고, 상기 나노리포좀은 물이 포함된 수상부와, 인지질 및 에몰리언트제가 포함된 유상부를 혼합하여 제조될 수 있다.In addition, the nanoliposomes may be prepared by mixing an aqueous phase including water and an oil phase including phospholipids and emollients.

상기 수상부는 상기 나노리포좀을 만드는 데 있어 연속상을 형성하기 위한 부분으로, 물이 필수적으로 포함되어 있으며, 페노닙(phenonip), 메틸파라벤(methylparaben)과 같은 방부제도 상기 수상부에 포함되어질 수 있다. 이때, 물은 나노리포좀 총 중량에 대해 35~85중량%임이 바람직하다. 물의 함량이 나노리포좀 총 중량에 대해 35중량% 미만일 경우 유화가 잘 되지 않을 수 있고, 85중량% 초과시에는 입자 밀도가 저하될 수 있다.The aqueous phase is a part for forming a continuous phase in making the nanoliposomes, water is essentially included, and preservatives such as phenonip and methylparaben may be included in the aqueous phase. . At this time, the water is preferably 35 to 85% by weight relative to the total weight of nanoliposomes. If the water content is less than 35% by weight relative to the total weight of the liposomes may not emulsify well, when the content of more than 85% by weight may reduce the particle density.

나아가, 상기 수상부는 부틸렌글리콜(butylene glycol)을 더 포함할 수 있다. 부틸렌글리콜은 피부보습향상을 위해 첨가된다.Furthermore, the water phase part may further include butylene glycol. Butylene glycol is added to improve skin moisturizing.

상기 유상부는 인지질 및 에몰리언트제를 포함한다. 상기 인지질(phospholipid)은 에몰리언트제와 테리딘을 안정적으로 포접시킴으로써 안정된 지질막을 형성한다.The oily phase contains phospholipids and emollients. The phospholipid forms a stable lipid membrane by stably enclosing an emollient agent and terrydine.

상기 인지질은 난황 레시틴, 대두 레시틴, 스핑고마이엘린과 같은 천연 인지질이나, 디팔미토일포스타티딜콜린, 수첨 레시틴과 같은 합성 인지질일 수 있으며, 레시틴이 바람직하다.The phospholipid may be a natural phospholipid such as egg yolk lecithin, soybean lecithin, sphingomyelin, or synthetic phospholipid such as dipalmitoylphosphatidylcholine, hydrogenated lecithin, and lecithin is preferable.

레시틴의 친양쪽성 분자구조로 인해 유화제로서 지용성인 활성 성분을 유화시킬 수 있다. 특히, 불포화 레시틴은 피부 친화력과 침투력이 우수하고, 상대적으로 더 유연하고 변형이 용이하므로, 본 발명의 인지질로서 가장 바람직하다. 이때, 상기 인지질은 나노리포좀 총 중량에 대해 1~20중량%임이 바람직하다.The amphipathic molecular structure of lecithin allows the emulsification of the active ingredient, which is fat soluble as an emulsifier. In particular, unsaturated lecithin is most preferred as the phospholipid of the present invention because it has excellent skin affinity and penetration, relatively softer and easier to modify. In this case, the phospholipid is preferably 1 to 20% by weight based on the total weight of the nanoliposomes.

상기 에몰리언트제는 하이드로카본계 오일, 에스테르계 오일, 실리콘 오일, 동식물성 오일 및 이의 혼합물일 수 있다. 특히, 상기 인지질이 불포화 레시틴인 경우, 실리콘 오일을 이용할 때 더욱 작은 vesicle을 형성하므로, 실리콘 오일을 이용함이 바람직하다. 이때, 상기 에몰리언트제는 나노리포좀 총 중량에 대해 2~20중량%임이 바람직하다. 2중량% 미만인 경우 리포좀의 내상이 너무 적어 유화 후 안정성이 좋지 않고, 20중량% 초과시에는 과도한 내상이 형성되어 리포좀의 안정화에 바람직하지 않기 때문이다.The emollient agent may be a hydrocarbon-based oil, an ester-based oil, a silicone oil, a plant or animal oil, and a mixture thereof. In particular, when the phospholipid is unsaturated lecithin, it is preferable to use silicone oil because it forms smaller vesicles when using silicone oil. At this time, the emollient agent is preferably 2 to 20% by weight based on the total weight of the nanoliposomes. If less than 2% by weight of the liposome is too small inner phase is not good stability after emulsification, if it exceeds 20% by weight excessive internal phase is formed is not preferable for the stabilization of liposomes.

상기 유상부는 프로필렌 글리콜 또는 글리세린이 단독으로 또는 혼합되어 포함될 수 있다. 특히, 프로필렌 글리콜은 상기 인지질의 용해도를 증가시키기 때문에 상기 인지질의 용매제로 이용될 수 있고, 피부보습을 위해서도 첨가될 수 있다. 글리세린도 피부보습을 위한 성분으로서, 디프로필렌 글리콜, 부틸렌글리콜, 메틸 프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물을 글리세린과 같은 목적으로 사용할 수 있다. 이때, 상기 프로필렌 글리콜은 나노리포좀 총 중량에 대해 5~20중량%임이 바람직하고, 글리세린은 나노리포좀 총 중량에 대해 0.5~10중량%임이 바람직하다.The oily phase may be included alone or in combination with propylene glycol or glycerin. In particular, propylene glycol can be used as a solvent of the phospholipid because it increases the solubility of the phospholipid, it can also be added for skin moisturizing. Glycerin may also be used as a component for skin moisturization, such as dipropylene glycol, butylene glycol, methyl propanediol, isoprene glycol, pentylene glycol, erythritol, xylitol, sorbitol and mixtures thereof for the same purpose as glycerin. In this case, the propylene glycol is preferably 5 to 20% by weight based on the total weight of nanoliposomes, glycerin is preferably 0.5 to 10% by weight relative to the total weight of nanoliposomes.

상기 유상부는 보조계면활성제를 더 포함할 수 있다. 보조계면활성제로는 폴리솔베이트(polysorbate), PEG, 스테아레이트(stearate), 글리세릴스테아레이트, 트리세테아레스-4-포스페이트(triceteareth-4-phosphate), 포도씨유(grape seed oil, VITIS VINIFERA) 및 이의 혼합물을 이용할 수 있다. 상기 인지질로서 불포화 레시틴을 이용할 경우, 트리세테아레스-4-포스페이트와 포도씨유(VITIS VINIFERA)가 혼합된 것을 이용하는 것이 나노리포좀의 안정화 측면에서 바람직하다. 이때, 트리세테아레스-4-포스페이트의 함량은 나노리포좀 총 중량에 대해 0.1~3중량%인 것이 바람직하다. 또한, 포도씨유(VITIS VINIFERA)의 함량은 나노리포좀 총 중량에 대해 0.1~3중량%인 것이 바람직하다.The oil phase portion may further include an auxiliary surfactant. Cosurfactants include polysorbate, PEG, stearate, glyceryl stearate, triceteare-4-phosphate, grape seed oil (VITIS VINIFERA) And mixtures thereof. When unsaturated lecithin is used as the phospholipid, it is preferable to use a mixture of triceteares-4-phosphate and grape seed oil (VITIS VINIFERA) in terms of stabilization of nanoliposomes. At this time, the content of triceteares-4-phosphate is preferably 0.1 to 3% by weight based on the total weight of the nanoliposomes. In addition, the content of grape seed oil (VITIS VINIFERA) is preferably 0.1 to 3% by weight based on the total weight of the nanoliposomes.

상기 나노리포좀의 바람직한 조성은 테리딘 0.001~5중량%, 부틸렌 글리콜 2~10중량%, 불포화 레시틴 1~20중량%, 실리콘 오일 2~20중량%, 글리세린 0.5~10중량%, 프로필렌 글리콜 5~20중량%, 포도씨유(VITIS VINIFERA) 0.1~5중량%, 트리세테아레스-4-포스페이트(Triceteareth-4-Phosphate) 0.1~5중량%, 방부제 0.3~0.5중량% 및 물 35~85중량%으로 이루어진다.Preferred compositions of the nanoliposomes are terridine 0.001-5 wt%, butylene glycol 2-10 wt%, unsaturated lecithin 1-20 wt%, silicone oil 2-20 wt%, glycerin 0.5-10 wt%, propylene glycol 5 ~ 20 wt%, 0.1-5 wt% VITIS VINIFERA, 0.1-5 wt% Triceteareth-4-Phosphate, 0.3-0.5 wt% preservative, 35-85 wt% water Is done.

나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 방법을 통해 이루어질 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 성분을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저를 이용하여 제조하는 것으로, 이때 목적하는 입자 크기에 따라 압력과 횟수 등을 조절할 수 있다. 보다 바람직하게는 압력을 600~1,200bar로 설정하고, 1~5회 고압 호모게나이저를 통과하도록 하는 것이다.Preparation of the nanoliposomes can be made through methods known in the art. More preferably, the mixture containing the above components is prepared using a high pressure homogenizer, and the pressure and the number of times may be adjusted according to the desired particle size. More preferably, the pressure is set to 600 to 1,200 bar, and passes through a high pressure homogenizer 1 to 5 times.

보다 바람직하게는 본발명의 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물의 제조방법은 나노리포좀 총 중량에 대하여, 테리딘 0.001~5중량%, 물 35~85중량%, 부틸렌 글리콜 2~10중량%, 방부제 0.3~0.5중량%가 포함된 수상부를 60~70℃로 가온하며 혼합하여 상기 수상부를 유화시키는 단계와; 나노리포좀 총 중량에 대하여, 인지질 1~20중량%, 에몰리언트제 2~20중량%, 글리세린 0.5~10중량%, 프로필렌 글리콜 5~20중량%, 포도씨유(VITIS VINIFERA) 0.1~5중량%, 트리세테아레스-4-포스페이트(Triceteareth-4-Phosphate) 0.1~5중량%가 포함된 유상부를 60~70℃로 가온하며 혼합하여 상기 유상부를 유화시키는 단계와; 상기 유화된 수상부에 상기 유화된 유상부를 서서히 투입하며 60~70℃로 가온하며 교반하여 리포좀을 제조하는 단계와; 상기 제조된 리포좀을 45~55℃, 600~1,200bar의 고압 호모게나이저를 통과시켜 나노리포좀을 제조하는 단계를 포함한다.More preferably, the method for preparing a cosmetic composition containing a nanoliposome of the present invention is 0.001 to 5% by weight of terridine, 35 to 85% by weight of water, 2 to 10% by weight of butylene glycol, and a preservative based on the total weight of nanoliposomes. Emulsifying the aqueous phase by heating and mixing the aqueous phase including 0.3-0.5% by weight at 60-70 ° C .; 1-20% by weight of phospholipid, 2-20% by weight of emulsifier, 0.5-10% by weight of glycerin, 5-20% by weight of propylene glycol, 0.1-5% by weight of VITIS VINIFERA, tree Emulsifying the oil phase by heating and mixing the oil phase containing 0.1-5% by weight of Ceteareth-4-Phosphate to 60-70 ° C .; Preparing a liposome by gradually adding the emulsified oil phase to the emulsified water phase and warming and stirring at 60 to 70 ° C .; The prepared liposomes are passed through a high pressure homogenizer at 45˜55 ° C. and 600˜1,200 bar to prepare nanoliposomes.

상기와 같이 제조된 나노리포좀은 불안정한 테리딘을 안정화할 수 있으며, 100~150nm의 입도 크기를 갖고 균일하며, 피부투과도가 높고, 지속적으로 피부투과가 가능하므로, 피부 미백 효과, 항산화효과, 자외선에 의한 피부 손상 방지 효과 등 테리딘의 효과를 지속적으로 발휘할 수 있도록 한다.The nanoliposomes prepared as described above can stabilize the unstable terridine, have a particle size of 100-150 nm, are uniform, have high skin permeability, and are continuously permeable to the skin, resulting in skin whitening, antioxidant effects, and ultraviolet rays. It also helps to maintain the effects of terrydin, such as preventing skin damage.

본 발명의 화장료 조성물은 상기의 테리딘을 유효성분으로 포함하는 나노리포좀 이외에도 필요에 따라, 본 발명의 효과를 저하하지 않는 범위 내에서 화장료에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면, 수용성 성분, 분말 성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하는 것이 가능하다.The cosmetic composition of the present invention, in addition to the nanoliposomes containing the above terridine as an active ingredient, various components generally used in cosmetics, for example, water-soluble components, within the range that does not reduce the effect of the present invention, if necessary, It is possible to mix powder components, oils, surfactants, humectants, viscosity modifiers, preservatives, antioxidants, fragrances, pigments and the like.

본 발명의 상기 테리딘이 포함된 화장료 조성물은 화장품 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 스프레이, 비누 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition containing the terridine of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the cosmetic industry, for example, solutions, suspensions, pastes, gels, creams, lotions, powders, oils, powder foundations It may be formulated as emulsion foundation, wax foundation, spray, and the like, but is not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion (skin), nourishing lotion (lotion), nourishing cream, massage cream, essence, pack, spray, soap or powder.

이하, 보다 구체적인 실험예 및 실시예를 들어 본 발명에 대해 상세히 설명하지만, 본 발명이 이하 실시예로만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with more specific experimental examples and examples, but the present invention is not limited only to the following examples.

한편, 이하의 실험예에서 (6R)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린((6R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin)와 세피아프테린(sepiapterin)은 시그마사(Sigma, St.Louis, MO, U.S.A.)로부터, (6R)-5-메틸-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린은 Schircks Laboratories (Jona, Switzerland)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.On the other hand, in the following experimental example (6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin ((6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin) and sepiapterin (sepiapterin) is a sigma ( Sigma, St. Louis, MO, USA), (6R) -5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterrin was purchased from Schircks Laboratories (Jona, Switzerland) and used for experiments.

실험예Experimental Example 1. 멜라닌 합성 저해 효능 평가 1. Evaluation of melanin synthesis inhibition effect

(1) 세포배양(1) Cell culture

이하의 실험에서는 HaCaT (Human Keratinocytes cell line), B16F10 (Mouse melanoma cell line)을 사용하였고, B16F10은 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank: KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 10 % fetal bovine serum, penicillin (100 units/㎖), streptomycin(100units/㎖)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Egale's medium) 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 배지는 3~4일 간격으로 교체하고 배양용기에 90%이상 자라게 되면 계대 배양하여 사용하였다.In the following experiments, HaKaT (Human Keratinocytes cell line) and B16F10 (Mouse melanoma cell line) were used, and B16F10 was used by the Korean Cell Line Bank (KCLB). 10% fetal bovine serum, penicillin (100 units / mL) and streptomycin (100units / mL) were added to DMEM (Dulbecco's modified Egale's medium) medium at 5% CO 2 , 37 ° C. Substituted at intervals of one day and grown in more than 90% culture vessel was used by subculture.

(2) DPPH 라디칼 소거능 측정(2) DPPH radical scavenging activity measurement

메탄올에 용해시킨 0.1mM DPPH 용액 0.5㎖에 시료를 각 농도별로 희석하여 0.5㎖씩 넣어주고 잘 혼합한 다음, 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 565nm에서 흡광도를 측정하였다.      0.5 ml of 0.1mM DPPH solution dissolved in methanol was diluted to each concentration, 0.5 ml each, mixed well, and reacted at room temperature for 10 minutes. Then, the absorbance was measured at 565 nm using an ELISA reader.

BH4 및 그의 전구체인 Sepiapterin과 유도체인 Methyl-BH4의 항산화 활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 환원성을 이용하여 시료의 DPPH 라디칼 소거효과를 측정하는 Blois법을 활용하여 측정하였다.Antioxidant activity of BH 4 and its precursor Sepiapterin and its derivative, Methyl-BH 4 , was measured using the Blois method, which measures the DPPH radical scavenging effect of a sample using the reducibility of DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). It was.

도 1 및 표 1은 DPPH 분석 결과를 나타낸 것으로, 테리딘의 농도에 따른 자유 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.1 and Table 1 show the results of DPPH analysis, showing the free radical scavenging ability according to the concentration of terridine.

<표 1> 테리딘의 항산화 효능(DPPH 분석 결과)Table 1 Antioxidant efficacy of terrydine (DPPH assay)

농도(uM)Concentration (uM) 55 1010 2020 5050 QurcetinQurcetin 24.19±1.4124.19 ± 1.41 45.42±1.1545.42 ± 1.15 53.69±2.4953.69 ± 2.49 -- Methyl-BH4 Methyl-BH 4 17.79±2.5617.79 ± 2.56 34.42±4.4834.42 ± 4.48 57.94±2.5757.94 ± 2.57 73.73±4.8073.73 ± 4.80 BH4 BH 4 27.37±1.4027.37 ± 1.40 55.49±0.9855.49 ± 0.98 74.74±2.7974.74 ± 2.79 78.35±0.0578.35 ± 0.05 SepiapterinSepiapterin 2.18±2.702.18 ± 2.70 6.57±1.246.57 ± 1.24 11.35±2.1111.35 ± 2.11 19.70±3.1219.70 ± 3.12

도 1 및 표 1에서 나타난 바와 같이, Methyl-BH4와 BH4 및 세피아프테린을 농도별로 처리한 결과 농도의존적인 DPPH 라디칼 소거능을 확인할 수 있었다. Methyl-BH4는 대조군인 쿼세틴(qurcetin)과 유사한 정도의 라디칼 소거능을 보였으며, BH4의 경우 대조군인 쿼세틴보다 각각의 농도에서 모두 우수한 라디칼 소거능을 나타냄을 확인하였다. 세피아프테린의 경우 대조군보다 그 효능이 약하지만, 농도 의존적인 라디칼 소거능을 지니고 있음을 확인하였다.As shown in Figure 1 and Table 1, the concentration-dependent treatment of Methyl-BH 4 and BH 4 and sepiaphterin was confirmed the concentration-dependent DPPH radical scavenging ability. Methyl-BH 4 showed similar radical scavenging activity to quercetin (qurcetin), and it was confirmed that BH 4 showed superior radical scavenging ability at each concentration than quercetin, a control group. Sepiaphtherin was weaker than the control, but it was confirmed that it has a concentration-dependent radical scavenging ability.

(3) 세포에 대한 독성 평가(3) Toxicity Evaluation on Cells

96 well plate에 각 웰(well)당 1x105/㎖의 HaCaT세포와 B16F10 세포가 들어있는 부유액 100㎕를 넣고 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 적당한 농도(1 - 100 uM)로 희석된 시료가 첨가된 serum-free 배지에서 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT 시약을 각 well에 첨가하고, 2시간 동안 항온기에서 반응시킨 후, MTT 시약이 함유된 배지를 제거하였다. 각 well에 100㎕ acid iso-propanol (0.04N HCl in iso-propanol)을 첨가하여 30분간 교반하여 주고, ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.Into a 96 well plate, 100 μl of a suspension containing 1 × 10 5 / mL of HaCaT cells and B16F10 cells was added to each well and incubated for 24 hours. After incubation, the medium was removed and incubated for 24 hours in serum-free medium to which the sample diluted to the appropriate concentration (1-100 uM) was added. After incubation, MTT reagent was added to each well, and reacted in a thermostat for 2 hours, and then the medium containing the MTT reagent was removed. 100 μl acid iso-propanol (0.04N HCl in iso-propanol) was added to each well, stirred for 30 minutes, and the absorbance was measured at 570 nm using an ELISA reader.

도 2는 HaCaT 세포에 테리딘을 농도별로 처리한 경우의 세포 생존율을 나타내는 그래프이고, 도 3은 B16F10 세포에 테리딘을 농도별로 처리한 경우의 생존율을 나타내는 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the cell viability when treated with terrydine concentration in HaCaT cells, Figure 3 is a graph showing the survival rate when treated with terrydine concentration in B16F10 cells.

HaCaT세포와 B16F10 세포에 Methyl-BH4와 BH4 및 세피아프테린을 농도별로 처리하여 세포 증식 및 독성에 미치는 영향을 본 결과, 아무것도 처리하지 대조군과 비교할 때, 큰 세포독성을 나타내는 시료가 없음을 확인하였다.Methyl-BH 4 , BH 4, and sepiaphtherin were treated on HaCaT and B16F10 cells at different concentrations, and the results showed that the cells showed no cytotoxicity when compared to the control. Confirmed.

(4) 버섯 티로시나아제(mushroom tyrosinase) 활성 측정(4) Measurement of mushroom tyrosinase activity

40U/㎖의 버섯 티로시나아제와 농도별 각 시료 및 기질인 티로신(tyrosine)과 DOPA는 각각 50uM, 100uM이 되게 하고 최종 부피가 1㎖이 되도록 0.1 M Kpi buffer (pH 7.4)로 채워준 후 480nm에서 흡광도를 측정하였다.40U / ml of mushroom tyrosinase and each sample and substrate tyrosine and DOPA of each concentration were 50uM and 100uM, respectively, and filled with 0.1 M Kpi buffer (pH 7.4) to a final volume of 1ml at 480nm. Absorbance was measured.

티로시나아제는 멜라닌 합성 과정에서 반응속도를 결정짓는 단계에 작용하는 효소이며 멜라닌 합성의 주요 조절단계에 관여하는 효소로서, 미백 효과에 대한 일차적 효과를 보기 위하여 티로시나아제의 활성 저해능을 평가하여 보았다.Tyrosinase is an enzyme that plays a role in determining the reaction rate during melanin synthesis and is an enzyme involved in the major regulation of melanin synthesis. We evaluated the inhibitory activity of tyrosinase to see the primary effect on the whitening effect. .

도 4는 DOPA를 기질로 한 경우의 테리딘의 버섯 티로시나아제 활성 저해능을 나타낸 그래프이고, 도 5는 티로신을 기질로 한 경우의 테리딘의 버섯 티로시나아제 활성 저해능을 나타낸 그래프이다. 이때, (a)는 대조군(control), (b)는 Methyl-BH4, (c)는 BH4, (d)는 세피아프테린을 첨가한 실험군을 나타낸다.FIG. 4 is a graph showing the inhibitory activity of thyridin mushroom tyrosinase activity when DOPA was used as a substrate, and FIG. 5 is a graph showing the inhibitory activity of thyridin mushroom tyrosinase activity when tyrosine was used as the substrate. In this case, (a) is a control group (control), (b) Methyl-BH 4 , (c) BH 4 , (d) represents a test group to which sepiapterin is added.

실험결과, DOPA나 티로신, 두 가지 기질 모두 BH4>Methyl-BH4>세피아프테린의 순으로 그 저해능을 나타내었다.As a result, DOPA, tyrosine, and both substrates showed the inhibitory effect in the order of BH 4 > Methyl-BH 4 > sepiapterin.

DOPA를 기질로 사용하였을 때(도 4 참조), BH4의 경우 티로시나아제의 활성을 반응 초기 약 100초 정도 저해하는 것으로 나타났고, Methyl-BH4의 경우 약 60초 정도 효소 활성을 저해하는 것으로 나타났다.When DOPA was used as a substrate (see FIG. 4), BH 4 inhibited the activity of tyrosinase by about 100 seconds and Methyl-BH 4 inhibited enzyme activity by about 60 seconds. Appeared.

티로신을 기질로 했을 때(도 5 참조), 티로시나아제에 의한 dopachrome의 생성속도는 DOPA를 기질로 했을 때보다 느리다. 이는 비활성상태의 효소(met-티로시나아제)가 티로신과 반응하여 dead-end complex를 형성하기 때문이다. 이것은 티로신을 기질로 했을 때만 나타나는 현상이며 이것을 lag phase라고 한다. lag phase가 지난 후 효소활성에 미치는 영향은 BH4의 경우 티로시나아제의 활성을 반응 초기 약 200초정도 저해하는 것으로 나타났고 Methyl-BH4의 경우 약 100초 정도 효소 활성을 저해하는 것으로 나타났다.When tyrosine is used as a substrate (see FIG. 5), the production rate of dopachrome by tyrosinase is slower than that of DOPA. This is because an inactive enzyme (met-tyrosinase) reacts with tyrosine to form a dead-end complex. This only occurs when tyrosine is used as a substrate. This is called the lag phase. After the lag phase, BH 4 inhibited the activity of tyrosinase for about 200 seconds and Methyl-BH 4 inhibited the activity of enzyme for about 100 seconds.

이상의 결과로부터, 본 발명의 테리딘의 버섯 티로시나아제 활성 저해능이 매우 우수함을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the tertidine mushroom tyrosinase activity inhibitory ability of the present invention is very excellent.

(5) 멜라닌 세포내의 티로시나아제 활성 측정(5) Determination of tyrosinase activity in melanocytes

B16F10을 100π plate에 접종을 한 후 24시간 배양한 다음, alpha-MSH를 50 nM로 처리하여 48시간 배양하고 이를 걷어 lysate를 만들어, 20㎕씩 넣고 DOPA는 100uM이 되게 하고, 최종 부피가 1㎖가 되도록 0.1 M Kpi buffer (pH 7.4)로 채워준 후 480nm에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, 세포 lysate는 일정기간 키운 세포를 모으고 여기에 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 1 % Triton X-100 을 첨가하여 sonication을 하고 원심분리를 하여 상층액을 얻어낸 것이다.      Inoculate B16F10 on 100π plate and incubate for 24 hours, and then process with alpha-MSH at 50 nM for 48 hours, make it lysate, add 20 µl each, and make DOPA 100uM. After filling with 0.1 M Kpi buffer (pH 7.4) to measure the absorbance at 480nm. Here, the cell lysate is a collection of cells grown for a certain period of time, sonicated by adding 0.1% phosphate buffer (pH 6.0) containing 1% Triton X-100 and centrifuged to obtain a supernatant.

도 6은 DOPA를 기질로 한 경우의 테리딘의 멜라닌 세포내 티로시나아제 활성 저해능을 나타낸 그래프로, (a)는 대조군(control), (b)는 세피아프테린, (c)는 Methyl-BH4, (d)는 BH4를 첨가한 실험군을 나타낸다.Figure 6 is a graph showing the inhibitory ability of teridine melanin tyrosinase activity in the case of using DOPA as a substrate, (a) is a control, (b) sepiapterin, (c) Methyl-BH 4 , (d) represents an experimental group to which BH 4 was added.

그 결과 버섯 티로시나아제에서와 마찬가지로, 6-BH4>Methyl-BH4>세피아프테린의 순으로 그 저해능을 보였다. 그리고 세피아프테린의 경우, 버섯 티로시나아제의 경우와는 달리, lysate를 이용한 세포내 티로시나아제의 활성을 저해하는 것으로 나타났다.As a result, as in the mushroom tyrosinase, 6-BH 4 > Methyl-BH 4 > sepiaphterin showed the inhibitory effect in the order. Sepiaphterin, unlike mushroom tyrosinase, inhibited the activity of intracellular tyrosinase using lysate.

(6) 멜라닌 세포 내의 멜라닌 정량(6) Determination of melanin in melanocytes

B16F10을 6-well plate의 각 well당 1×105 cells/well로 접종하고 24시간 배양시킨 다음, 배지를 제거하고 혈청이 포함된 배지(a-MSH 50nM)를 이용하여 시료를 적당한 농도로 희석하여 각 well 에 넣어준 후 48시간 추가로 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 trypsin-EDTA 0.5㎖을 처리하여 세포를 떼어내고 PBS 0.5㎖을 첨가하여 세포를 회수한 다음, 회수된 세포는 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물(pellet)을 65℃에서 1시간 정도 건조시켰다. 여기에, 1M NaOH 수용액 100㎕를 첨가하여 65℃에서 1시간 정도 반응시켜 세포내의 멜라닌을 얻었다. 그 후 96 well plate에 위에서 얻은 lysate를 각각 100㎕씩 넣어준 후, ELISA reader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 측정하였다. 이를 다 시 각각의 lysate를 이용하여 BCA법으로 단백질 정량을 하여 단백질 양에 대한 멜라닌량을 구하고 Synthetic melanin(SIGMA, M0418)을 이용하여 표준곡선을 구하여 멜라닌의 함량을 정량하였다.Inoculate B16F10 at 1 × 10 5 cells / well for each well of a 6-well plate, incubate for 24 hours, remove the medium, and dilute the sample to the appropriate concentration using a serum-containing medium (a-MSH 50nM). After adding to each well and incubated for 48 hours. The cells were washed with PBS and treated with 0.5 ml of trypsin-EDTA to remove the cells. The cells were recovered by adding 0.5 ml of PBS. The recovered cells were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant and pellets. Was dried at 65 ° C. for 1 hour. 100 μl of a 1 M NaOH aqueous solution was added thereto, followed by reaction at 65 ° C. for about 1 hour to obtain intracellular melanin. Thereafter, 100 μl of each of the lysates obtained above was put into a 96 well plate, and the melanin content was measured by measuring absorbance at 490 nm with an ELISA reader. The lysate was used to quantify the protein by BCA method, and then the melanin content for the protein amount was obtained, and the standard curve was calculated using Synthetic melanin (SIGMA, M0418) to quantify the melanin content.

농도별로 테리딘을 처리한 후 멜라닌 함량을 측정한 결과, 모든 실험군에서 농도에 비례하여 멜라닌 합성이 저해됨이 확인되었다(표 2 참조). Methyl-BH4와 BH4의 경우, 100uM 처리시에 양성대조군인 알부틴(arbutin)과 유사한 멜라닌 합성 저해능을 나타내었다.As a result of measuring the melanin content after treatment with terridine for each concentration, it was confirmed that melanin synthesis was inhibited in proportion to the concentration in all experimental groups (see Table 2). Methyl-BH 4 and BH 4 showed melanin synthesis similar to that of arbutin, a positive control, at 100 uM treatment.

<표 2> 테리딘의 B16F10 세포내에서의 멜라닌 합성 저해능TABLE 2 The inhibitory activity of melanin synthesis in terrydin B16F10 cells

농도(uM)Concentration (uM) 5050 100100 ArbutinArbutin 10.27±4.3410.27 ± 4.34 12.62 ± 4.2912.62 ± 4.29 Methyl-BH4 Methyl-BH 4 5.58 ± 6.575.58 ± 6.57 9.19 ± 5.989.19 ± 5.98 BH4 BH 4 6.73 ± 2.536.73 ± 2.53 9.75 ± 5.839.75 ± 5.83

(7) 테리딘 처리에 따른 단백질 경향성 확인-웨스턴 블롯 분석법(7) Confirmation of protein tendency following terridine treatment-Western blot analysis

B16F10을 6-well plate의 각 웰당 1×105 cells/well로 접종하고 24시간 배양한 다음, 배지를 제거하고 혈청이 포함된 배지(a-MSH 50nM)를 이용하여 시료를 적당한 농도로 희석하여 각 웰에 넣어준 후 48시간 추가 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 trypsin-EDTA 0.5 ㎖을 처리하여 세포를 떼어내고 PBS 0.5 ㎖을 첨가하여 세포를 회수한 다음, 회수된 세포는 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물(pellet)에 RIPA buffer를 첨가하여 얼음에 30분간 방치하고 이를 원심분리하여 상등액을 얻어내어 단백질 정량 후 12% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 단백질을 전개시켜, 0.2nm pore size PVDF membrane에 transfer시켰다. 이 후 1차 항체와 peroxidase conjugated anti-goat 2차 항체를 이용하여 단백질을 표지하고 Labfrontier사의 western blot확인 시약과 Kodak (Chalon sur Saone Cedex, France) 사의 BioMax XAR 필름을 이용하여 결과를 확인하였다.Inoculate B16F10 at 1 × 10 5 cells / well for each well of a 6-well plate, incubate for 24 hours, remove the medium, and dilute the sample to an appropriate concentration using a serum-containing medium (a-MSH 50nM). After incubation for 48 hours after the addition into each well. The cells were washed with PBS and treated with 0.5 ml of trypsin-EDTA to remove the cells, and the cells were recovered by adding 0.5 ml of PBS. The recovered cells were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant and pellets. RIPA buffer was added thereto, and the mixture was left on ice for 30 minutes and centrifuged to obtain a supernatant. After protein quantification, the protein was developed using a 12% SDS-polyacrylamide gel and transferred to a 0.2 nm pore size PVDF membrane. Afterwards, the protein was labeled using a primary antibody and a peroxidase conjugated anti-goat secondary antibody, and the results were confirmed using a Western blot identification reagent from Labfrontier and a BioMax XAR film from Kodak (Chalon sur Saone Cedex, France).

도 7은 B16F10 세포에서의 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 발현에 있어서의 테리딘의 영향을 나타낸 웨스턴 블럿 검사결과이고, 도 8은 도 7에 나타난 밴드의 세기를 Calibrated densitometer(BIO-RAD, GS-800)을 이용하여 수치화한 그래프이다.FIG. 7 is a western blot test showing the effect of terrydin on tyrosinase, TRP-1, and TRP-2 expression in B16F10 cells. FIG. 8 is a Calibrated densitometer (BIO-). RAD, GS-800) to quantify the graph.

그 결과, 테리딘 처리에 의해 TRP-2의 발현정도에는 영향이 없는 것으로 나타났으나, 티로시나아제와 TRP-1의 발현에는 영향을 미침을 확인할 수 있었다. 티로시나아제의 경우 그 저해제로 알려져 있는 알부틴(arbutin)에 의해 농도 의존적으로 단백질 발현이 저해되었으며 Methyl-BH4를 처리한 것에 있어서도 농도 의존적인 단백질 발현 저해를 확인하였다. BH4를 처리하였을 때는 약하지만 단백질 발현 저해를 확인할 수 있었고, 세피아프테린의 경우도 100uM 처리시, 약하지만 단백질 발현 저해를 확인할 수 있었다. TRP-1의 경우 알부틴과 Methyl-BH4를 처리하였을 때만 그 발현저해를 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that terridine treatment had no effect on the expression level of TRP-2, but it had an effect on the expression of tyrosinase and TRP-1. In the case of tyrosinase, protein expression was inhibited in a concentration-dependent manner by arbutin, which is known as an inhibitor, and concentration-dependent inhibition of protein expression was also observed in the treatment of Methyl-BH 4 . When BH 4 was treated, weak but inhibited protein expression was confirmed, and sepiaphterin was also weak at 100 uM, but confirmed inhibited protein expression. In the case of TRP-1, the expression inhibition was confirmed only when arbutin and Methyl-BH 4 were treated.

(8) 미백효과에 대한 임상 평가(8) Clinical evaluation of the whitening effect

20대 남녀 8명을 대상으로 각 시료(50uM)를 3주 동안 양팔 안쪽에 1일 2회 도포하고 Mexameter를 이용하여 시료의 도포 전과 후의 흑화도 변화를 측정하였다. 측정은 일주일에 한번 같은 시간에 측정하여 결과를 처리하였으며 이때의 습도와 온도는 45~60 %, 26~27℃내에서 측정이 이루어졌다.For eight men and women in their twenties, each sample (50uM) was applied twice a day to the inside of both arms for three weeks, and the change in the degree of blackening before and after application of the sample was measured using a Mexameter. The measurement was performed once a week at the same time and the results were processed. At this time, humidity and temperature were measured within 45 ~ 60% and 26 ~ 27 ℃.

도 9는 인체를 대상으로 하여 테리딘에 의한 흑화도 변화를 나타낸 그래프이다. 도 9로부터 알 수 있듯이, 피시험자별 개인차가 있었으나 도포 후 미백효과가 나타남을 확인하였다. 대조군인 증류수를 제외한 모든 시료에 대하여 피부 미백 효과가 비슷한 수준으로 나타났다.9 is a graph showing changes in the degree of blackening caused by terrydin in the human body. As can be seen from Figure 9, there were individual differences for each subject, but it was confirmed that the whitening effect appeared after application. The skin whitening effect was similar for all samples except distilled water as a control.

실험예Experimental Example 2. 자외선에 의한 피부 노화 방지 효능 평가 2. Evaluation of skin anti-aging effect by UV rays

상기 실험예에서 미백 효능 및 항산화 효능이 확인된 Methyl-BH4와 BH4를 대상으로 하여 자외선에 의한 피부 노화 방지 효능을 평가하였다. 이때, 선행 실험결과 세포독성을 나타내지 않았던 50uM, 100uM을 평가농도로 설정하였다.Methyl-BH 4 and BH 4 confirmed the whitening efficacy and antioxidant efficacy in the experimental example was evaluated for the anti-aging effect of the skin by ultraviolet rays. At this time, 50uM, 100uM, which did not show the cytotoxicity in the previous experiments were set to the evaluation concentration.

(1) 자외선 처리에 의한 (1) by ultraviolet treatment 세포내Intracellular 글루타치온Glutathione (( GSHGSH ) 합성에 미치는 영향 평가Evaluation of the Impact on Synthesis

UVB 처리에 의한 세포내의 GSH 함량의 변화를 알아보기 위하여 UVB의 농도와 UVB 처리 후 배양시간에 따른 GSH 함량을 측정하였다.In order to determine the change of GSH content in the cells by UVB treatment, the concentration of UVB and the GSH content according to the culture time after UVB treatment were measured.

이를 위해, HaCaT 세포를 2×105/well의 농도로 35mm 접시에 분주하여 24시간 배양한 다음 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, PBS에 시료가 농도 별로 포함되게 하여 1㎖씩 넣어준 후 UVB(40mJ/cm2)를 쬐어 주었다. PBS를 제거한 다음, 무혈청 배지로 교환하고 시료를 농도별로 처리한 뒤 1시간동안 배양하였다. 그 다음, 플레이트(plate)에 lysis buffer(1% Triton X-100)를 300㎕씩 넣고 세포를 긁어모았다.To this end, HaCaT cells were dispensed in a 35 mm dish at a concentration of 2 × 10 5 / well, incubated for 24 hours, washed with PBS (phosphate buffered saline), and the samples were added to the PBS at a concentration of 1 ml. UVB (40mJ / cm 2 ) was exposed to. PBS was removed, exchanged with serum-free medium, and the samples were treated by concentration and incubated for 1 hour. Then, 300 μl of lysis buffer (1% Triton X-100) was added to the plate to scrape the cells.

그 후, 30분 정도 얼음에서 세포를 용해시킨 후 10,000g, 4℃에서 5분간 원심분리를 하였다. GSH 측정을 위해 세포 용해액 200㎕, 0.1% HCl 30㎕, 50% sulfosalicylic acid 30㎕를 넣어준 후 10,000g, 4℃에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 이용하여 20㎕씩 96well에 분주하였다. 여기에 혼합용액(0.1M kPi , 10mM EDTA , 4.8mM, NADPH,6units/㎖ GSH reductase 3.78mM DTNB)를 180㎕씩 넣어주고 상온에서 10분간 반응시켰다.  Thereafter, the cells were lysed on ice for about 30 minutes, and then centrifuged at 10,000 g and 4 ° C for 5 minutes. In order to measure GSH, 200 μl of cell lysate, 30 μl of 0.1% HCl, and 30 μl of 50% sulfosalicylic acid were added, and then centrifuged at 10,000 g for 4 minutes at 4 ° C., and 20 μl of the supernatant was dispensed into 96 wells. . 180 μl of a mixed solution (0.1 M kPi, 10 mM EDTA, 4.8 mM, NADPH, 6 units / ml GSH reductase 3.78 mM DTNB) was added thereto, and reacted at room temperature for 10 minutes.

GSSG 측정시, 각 시료에 2-vinylpyridine 2㎕씩 넣고 60분동안 반응시킨 후 상기 혼합용액을 넣어주었다(참고문헌 : Fructose-1,6-diphosphate attenuates prostaglandin E2 production and cyclo-oxygenase-2 expression in UVB-irradiated HaCaT keratinocytes. British Journal of Pharmacology 137, pp. 497~503, 2002).In the GSSG measurement, 2 μl of 2-vinylpyridine was added to each sample and reacted for 60 minutes, followed by adding the mixed solution (Ref .: Fructose-1,6-diphosphate attenuates prostaglandin E2 production and cyclo-oxygenase-2 expression in UVB -irradiated HaCaT keratinocytes.British Journal of Pharmacology 137, pp. 497-503, 2002).

도 10은 UVB 40mJ/㎠ 처리 후 시간 경과에 따른 세포내 GSH 함량 변화를 측정한 그래프이고, 도 11은 UVB 처리농도에 따른 세포내 GSH 함량을 나타낸 그래프이다. 그리고, 도 12는 UVB 40mJ/㎠ 처리 후 테리딘 처리에 따른 GSH 함량을 나타낸 그래프이다. 도 12에서, 'con'은 아무 것도 처리하지 않은 대조군, 'UVB'는 UVB만을 처리한 군을 나타낸다.Figure 10 is a graph measuring the change in intracellular GSH content over time after UVB 40mJ / ㎠ treatment, Figure 11 is a graph showing the intracellular GSH content according to the UVB treatment concentration. And, Figure 12 is a graph showing the GSH content according to the terridine treatment after UVB 40mJ / ㎠ treatment. In Figure 12, 'con' is a control group treated nothing, 'UVB' represents a group treated with UVB only.

도 10, 도 11로부터 UVB 30~50mJ/cm2 처리시 세포내 GSH 함량이 감소하며, GSH 함량 변화는 UVB 처리 1시간 후에 가장 많이 감소하였고, 시간이 지날수록 GSH의 양이 정상 상태로 되돌아 가는 것을 알 수 있었다. 이로부터 실험에 사용할 UVB의 양을 40mJ/cm2, 배양 시간을 1시간으로 정하였다.UVB 30-50mJ / cm 2 from FIG. 10, FIG. Intracellular GSH content decreased during treatment, and the change of GSH content decreased most after 1 hour of UVB treatment, and it was found that the amount of GSH returned to a normal state as time passed. From this, the amount of UVB to be used for the experiment was set to 40 mJ / cm 2 , the incubation time 1 hour.

도 12로부터 알 수 있듯이, UVB 40mJ/cm2 처리 후 약 10%의 GSH 함량이 감소하나, BH4와 Methyl-BH4 처리시에는 GSH의 함량이 감소하지 않고, 오히려 UVB를 처리하지 않은 정상상태(con)보다 GSH의 함량이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 BH4와 Methyl-BH4가 GSH 합성 효능이 있음을 확인할 수 있었다.As can be seen from Figure 12, after the treatment of UVB 40mJ / cm 2 GSH content of about 10% is reduced, but BH 4 and Methyl-BH 4 During the treatment, the content of GSH did not decrease, but rather, the content of GSH was increased compared to the normal state (con) without UVB treatment. From this BH 4 and Methyl-BH 4 was confirmed that the GSH synthesis efficacy.

(2) 자외선 처리에 의한 멜라닌 합성 정도에 미치는 영향 평가(2) Evaluation of the effect on melanin synthesis degree by UV treatment

B16F10 세포를 2×105/well의 농도로 35mm 접시에 분주하여 24시간 배양한 후, PBS로 세척하고 PBS 1㎖을 넣어준 후 UVB 30mJ/㎠를 쬐어주었다. 그 다음, 10% FBS가 포함된 배지에 시료를 적당 농도가 되도록 희석하여 처리한 후 48시간 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 trypsin-EDTA 0.5㎖을 처리하여 세포를 떼어내고 PBS 0.5㎖을 첨가하여 세포를 회수한 다음, 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물을 65℃에서 1시간 정도 건조시킨 다음, 1M NaOH 수용액 100㎕를 첨가하여 65℃에서 1시간 정도 반응시켜서 세포내의 멜라닌을 얻었다. 96 well plate에 상기 용해물을 100㎕씩 넣어준 후, ELISA reader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 측정하고, 상기 용해물은 BCA법으로 단백질 정량을 하여 멜라닌 양을 단백질 양으로 보정하였다(참고문헌 : 대한민국특허출원 제10-2002-0029401호).B16F10 cells were inoculated in a 35 mm dish at a concentration of 2 × 10 5 / well and incubated for 24 hours. After washing with PBS, 1 ml of PBS was added, and UVB 30mJ / cm 2 was exposed to light. Then, the sample was diluted to an appropriate concentration in a medium containing 10% FBS and treated for 48 hours. The cells were washed with PBS and treated with 0.5 ml of trypsin-EDTA to remove the cells. The cells were recovered by adding 0.5 ml of PBS. The cells were then centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant and the precipitate was maintained at 65 ° C. for about 1 hour. After drying, 100 μl of a 1 M NaOH aqueous solution was added thereto, followed by reaction at 65 ° C. for about 1 hour to obtain intracellular melanin. 100 μl of the lysate was added to a 96 well plate, and the melanin content was measured by measuring the absorbance at 490 nm using an ELISA reader. The lysate was quantified by BCA method to correct the amount of melanin by the amount of protein. Reference: Korean Patent Application No. 10-2002-0029401).

도 13은 UVB 처리 후 테리딘 처리에 따른 세포내 멜라닌 함량을 나타내는 그래프이다.Figure 13 is a graph showing the intracellular melanin content after treatment with terridine UVB.

Methyl-BH4 처리시 UVB만을 처리한 것에 비해 멜라닌 함량이 100uM에서 7% 정도 감소된 것으로 확인되었고, BH4 처리시 50uM 및 100uM에서 약 20% 정도 멜라닌 생성이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 한편, 선행 실험결과 UVB를 처리하지 않은 Methyl-BH4와 BH4자체의 멜라닌 합성 저해능을 평가한 결과, 100uM 농도에서 약 10% 정도의 멜라닌 생성이 억제된 것을 확인할 수 있었다. Methyl-BH 4 It was confirmed that the melanin content was reduced by 7% at 100uM compared with only UVB treatment, and melanin production was suppressed by about 20% at 50uM and 100uM when treated with BH 4 . On the other hand, as a result of the previous experiments evaluated the inhibition of melanin synthesis of Methyl-BH 4 and BH 4 itself without UVB treatment, It was confirmed that the melanin production of about 10% at 100uM concentration was suppressed.

이는 BH4의 경우, 시료 자체의 멜라닌 합성 저해능보다 자외선에 의해 생성되는 멜라닌 합성 저해능이 더 우수함을 확인시켜주는 결과라 할 것이다.This is the case for BH 4 The result confirms that the melanin synthesis inhibitory ability generated by ultraviolet light is superior to the melanin synthesis inhibitory activity of the sample itself.

(3) 멜라닌 합성 관련 세포 신호 전달 물질 저해 효능 평가(3) Evaluation of Cell Signaling Substance Inhibition Efficacy Related to Melanin Synthesis

HaCaT 세포를 2×105/well의 농도로 35mm 접시에 분주하여 24시간 배양한 후, PBS로 세척하고 PBS 1㎖을 넣어준 후 UVB를 쬐어주었다. 혈청이 포함되지 않은 배지에 시료를 적당 농도가 되도록 희석하여 처리한 후 24시간 배양한 다음, 세포 배양액을 이용하여 IL-6의 발현 정도를 측정하였다.HaCaT cells were inoculated in a 35 mm dish at a concentration of 2 × 10 5 / well and incubated for 24 hours. After washing with PBS, 1 ml of PBS was added and UVB was exposed. After diluting the sample to a suitable concentration in a serum-free medium and incubating for 24 hours, the expression level of IL-6 was measured using a cell culture.

IL-6의 발현 정도를 측정하기 위해, 우선, 세포배양액을 원심분리한 후 상층액 100㎕를 IL-6 Kit plate에 넣고, plate를 sealing한 후 2시간 동안 반응시킨 다음, IL-6 washing solution을 이용하여 4회 세척하였다. 그 다음, IL-6 conjugate 200㎕를 넣고 2시간 동안 반응시킨 다음, IL-6 washing solution을 이용하여 4회 세척하였다. 그 다음, substrate solution을 200㎕ 넣고 빛을 차단한 다음, 20분간 반응시킨 후 stop solution 50㎕를 넣고 405nm에서 흡광측정하였다.In order to measure the expression level of IL-6, first, after centrifuging the cell culture solution, 100 μl of the supernatant was put into the IL-6 Kit plate, the plate was sealed, and then reacted for 2 hours. Washed four times with. Then, 200 μl of IL-6 conjugate was added and reacted for 2 hours, and then washed four times using IL-6 washing solution. Subsequently, 200 μl of substrate solution was added to block light, and after reacting for 20 minutes, 50 μl of stop solution was added thereto and absorbance was measured at 405 nm.

PGE2 측정을 위해서 각 웰(well)에 시료를 100㎕씩 넣어준 다음, PGE2 conjugate를 각 웰에 50㎕씩 넣은 다음, PGE2 Antibody Solution을 각 well에 50㎕씩 넣고 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 다음, washing solution을 이용하여 3회 세척한 후, pNPP substrate를 모든 웰에 200㎕씩 넣어준 다음 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, stop solution 50㎕씩 넣어준 후 405nm에서 흡광값을 측정하였다(참고문헌 : 향나무추출물의 광손상으로부터 피부세포 보호와 자극완화 효과에 관한 연구, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 30, pp. 63~71, 2004; Ultraviolet B irradiation-enhanced interleukin (IL)-6, J Invest Dermatol. Apr, 106(4), pp.715-20, 1996).PGE 2 100 μl of sample was added to each well for measurement, and then 50 μl of PGE 2 conjugate was added to each well. Then, 50 μl of PGE 2 Antibody Solution was added to each well and allowed to react at room temperature for 2 hours. . Then, after washing three times using a washing solution, the pNPP substrate was put in 200μL each well and reacted for 1 hour at room temperature. Then, the absorbance value was measured at 405 nm after adding 50 μl of stop solution (Reference: A study on skin cell protection and irritation-releasing effect from light damage of juniper extract, J. Soc. Cosmet. 63-71, 2004; Ultraviolet B irradiation-enhanced interleukin (IL) -6, J Invest Dermatol. Apr, 106 (4), pp.715-20, 1996).

도 14는 UVB 처리 후 테리딘 처리에 따른 IL-6 발현도를 나타내는 그래프로, UVB 처리군(UVB)의 경우, UVB 처리에 의해 IL-6가 대조군(con) 대비 330%정도 증가했으며, BH4, Methyl-BH4 시료 처리를 한 경우, UVB 처리군과 대비하여 70% 정도의 IL-6 발현량이 감소된 것이 관찰되었다. 이는 UVB를 처리하지 않은 대조군과 유사한 수준이라 할 수 있다.Figure 14 is a graph showing the IL-6 expression according to the terridine treatment after UVB treatment, in the case of UVB treatment group (UVB), IL-6 increased by 330% compared to the control (con) by UVB treatment, BH 4 , When treated with Methyl-BH 4 sample, it was observed that the IL-6 expression amount was reduced by about 70% compared to the UVB treatment group. This can be said to be similar to the control group not treated with UVB.

도 15는 UVB 처리 후 테리딘 처리에 따른 PGE2 발현도를 나타내는 그래프로, PGE2 측정 결과 UVB 처리군(UVB)의 경우, 대조군(con)에 비해 약 140% 정도 PGE2가 증가하였고, BH4와 Methyl-BH4 처리시 약 60% 정도의 PGE2 감소를 확인할 수 있었으며, 그 결과, UVB를 처리하지 않은 대조군과 PGE2 함량면에서 유사한 수준임을 알 수 있었다.FIG. 15 is a graph showing the expression level of PGE 2 after terridine treatment after UVB treatment. As a result of PGE 2 measurement, in the case of UVB treated group (UVB), PGE 2 increased by about 140% compared to the control group (con), and BH 4. and when BH Methyl-4 treatment was able to identify approximately 60% of the PGE 2 decreases, and as a result, it was found in a similar sujunim surface not treated with UVB control and the PGE 2 content.

상기 실험예 1로부터는 본 발명의 테리딘의 세포무독성, 우수한 멜라닌 합성 저해 효능 및 항산화효능으로부터, 미백 효과를 확인할 수 있고, 실험예 2를 통해서는 자외선에 의한 피부 노화 방지 효능을 확인할 수 있다.From Experimental Example 1, the whitening effect can be confirmed from the cell nontoxicity, excellent melanin synthesis inhibitory effect, and antioxidant effect of the terridine of the present invention, and through Experimental Example 2, the anti-aging effect of skin by ultraviolet rays can be confirmed.

실시예 1. 테리딘을 함유하는 나노리포좀의 제조Example 1 Preparation of Nanoliposomes Containing Terridine

<표 3> 나노리포좀의 조성Table 3 Composition of Nanoliposomes

성분ingredient 중량(%)weight(%) 원료량Amount of raw material 수상부   Award BH4 BH 4 0.09180.0918 1.37g1.37 g 물water To 100To 100 1134g1134 g 부틸렌 글리콜Butylene Glycol 5.05.0 75g75 g 페노닙(phenonip)Phenonip 0.30.3 4.5g4.5 g 유상부    The upper part 레시틴lecithin 2.02.0 30g30 g 실리콘 오일Silicone oil 5.05.0 75g75 g 글리세린glycerin 1.01.0 15g15 g 프로필렌 글리콜Propylene glycol 10.010.0 150g150 g 포도씨유(VITIS VINIFERA)Grape Seed Oil (VITIS VINIFERA) 0.50.5 7.5g7.5g 트리세테아레스-4-포스페이트Triceteareth-4-phosphate 0.50.5 7.5g7.5g

BH4, 물, 부틸렌 글리콜, 페노닙(이상, '수상부'라 함)을 호모믹서를 이용하여 65℃, 1,500rpm으로 유화(수상부 유화)시키고, 레시틴, 실리콘 오일, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 포도씨유(VITIS VINIFERA), 트리세테아레스-4-포스페이트(Triceteareth-4 Phosphophate)(이상, '유상부'라 함)를 호모믹서를 이용하여 65℃, 800rpm으로 유화(유상부 유화)시켰다. 각각 별도의 용해조에서 용해된 상기 수상부 혼합물과 상기 유상부 혼합물을 혼합함에 있어, 수상부 용해조에 상기 유상부 혼합물을 서서히 투입하고, 이때 수상부는 65℃를 유지하도록 하였다. 그 다음, 호모믹서를 이용하여 전체 혼합물을 교반속도 2,800rpm으로 하여 65℃에서 25분간 가온하며 교반하여 2차 유화시켰다.BH 4 , water, butylene glycol, and phenonib (above, called 'water phase') are emulsified (emulsion in water) at 65 ° C and 1,500 rpm using a homomixer, and lecithin, silicone oil, glycerin, propylene glycol , VITIS VINIFERA and Triceteareth-4 Phosphophate (hereinafter referred to as 'oil phase') were emulsified (oil phase emulsification) at 65 ° C. and 800 rpm using a homomixer. In mixing the aqueous phase mixture and the oil phase mixture dissolved in each of the separate dissolution tanks, the oil phase mixture was slowly added to the aqueous phase dissolution tank, and the water phase portion was maintained at 65 ° C. Then, using a homomixer, the entire mixture was stirred at 2,800 rpm and warmed at 65 ° C. for 25 minutes, followed by stirring to secondary emulsification.

상기 2차 유화된 원료를 펌프를 이용하여 여과기를 통과시킨 후, cavitation하기 위해 고압 호모게나이저를 이용하였다. 이때, 냉각수를 이용하여 2차 유화된 원료의 온도를 50℃로 조절하여 고압 호모게나이저를 통과시켜 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 보조탱크에 저장한 후, 고압 호모게나이저를 이용하여 5회까지 통과시켜 나노사이즈의 리포좀을 제조하였다. 이때, 고압 호모게나이저의 원료 통과 압력은 1,000bar를 유지하였다.The secondary emulsified raw material was passed through a filter using a pump, and a high pressure homogenizer was used for cavitation. At this time, the temperature of the secondary emulsified raw material was adjusted to 50 ° C. using cooling water, and a liposome was prepared by passing a high pressure homogenizer. The prepared liposomes were stored in an auxiliary tank, and then passed up to five times using a high pressure homogenizer to prepare nano-sized liposomes. At this time, the raw material passage pressure of the high pressure homogenizer was maintained at 1,000 bar.

완성된 리포좀 중 고압 호모게나이저 3회 통과 리포좀, 고압 호모게나이저 5회 통과 리포좀을 대상으로 입도분석기(ELS-8000, OTUSKA, 일본)를 이용하여 입도 크기와 다분산지수를 분석하였다(표 4 참조).Particle size and polydispersity index were analyzed using a particle size analyzer (ELS-8000, OTUSKA, Japan) of the high-pressure homogenizer three-pass liposomes and the high-pressure homogenizer five-pass liposomes (Table 4). Reference).

<표 4> 나노리포좀의 입도크기와 다분산지수<Table 4> Particle size and polydispersity index of nanoliposomes

시료sample 입도크기 (지름, nm)Particle size (diameter, nm) 다분산지수Polydispersity index 고압 호모게나이저 3회 통과 리포좀High-pressure homogenizer three passes liposome 132.0 127.1 평균 129132.0 127.1 Average 129 1.417e-001 2.226e-0011.417e-001 2.226e-001 고압 호모게나이저 5회 통과 리포좀High-pressure homogenizer 5 passes liposome 116.1 117.6 평균 116116.1 117.6 Average 116 1.071e-001 1.14e-0011.071e-001 1.14e-001

(분석의뢰처 : 한국기초과학연구소 춘천 분소, 분석일 : 2007년 1월 15일)(Request for Analysis: Chuncheon Branch, Korea Institute of Basic Science, Analysis Date: January 15, 2007)

그 결과, 다분산지수는 2.5이내로 비교적 균질한 상태의 입자를 가짐을 확인하였으며 고압 호모게나이저 5회 통과 리포좀의 경우, 1.0~1.2의 다분산지수와 117nm의 균질한 입도크기를 가짐을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the polydispersity index had particles that were relatively homogeneous within 2.5, and that the 5-pass liposome with high pressure homogenizer had a polydispersity index of 1.0-1.2 and a homogeneous particle size of 117 nm. .

실험예 4. 인공 피부를 이용한 경피 흡수 실험 (나노리포좀 제형과 일반 제형의 경피 흡수 투과 비교) Experimental Example 4. Percutaneous Absorption Experiment Using Artificial Skin (Comparative Percutaneous Absorption Permeation between Nanoliposomal Formulation and Regular Formulation)

인공피부로 진피와 표피층이 존재하는 3차원 배양피부인 NEODERM®-ED(테고사이언스(주), 대한민국)를 구입하여 실험에 이용하였다.NEODERM ® -ED (Tegoscience Co., Ltd., Korea), which is a three-dimensional cultured skin with dermis and epidermal layers, was used for the artificial skin.

한천(agar) 고체배지상의 패드(pad) 위에 인공피부가 있는 상태로 4℃ 상태로 운반하여, 새로운 트레이(tray)에 상기 패드와 인공피부를 옮긴 후 10% FBS, 성장인자(growth factor) 및 호르몬이 포함된 DMEM 배지 13㎖을 첨가하여 72시간 배양한 다음, 핀셋을 이용하여 상기 인공피부가 배양된 트랜스웰(transwell)을 준비된 트레이에 옮겼다. 인공피부의 안정화 및 환경에의 적응을 위해 37℃, 10% CO2 (또는 5% CO2 )의 조건하에서 배양하였고, 배지 교환은 4~5일에 1회씩 실시하였다.The artificial skin is transported at 4 ° C on an agar solid medium pad, and the pad and artificial skin are transferred to a new tray, followed by 10% FBS, growth factor, and After incubating for 72 hours by adding 13 ml of hormone-containing DMEM medium, the transwell cultured with artificial skin was transferred to a prepared tray using tweezers. For stabilization of artificial skin and adaptation to the environment, culture was performed under conditions of 37 ° C. and 10% CO 2 (or 5% CO 2 ), and medium exchange was carried out once every 4 to 5 days.

안정화된 인공피부에서 배지와 패드를 제거하고 PBS(pH 7.4)로 웰(well) 부분을 세척한 다음, PBS 12㎖을 넣어준 후 1시간 동안 37℃의 C02 배양기에서 배양한 후, 인공피부 위에 <표 5>와 같이 준비된 각 시료를 400㎕씩 처리하였고, 각 시료당 3회 반복하였다.Remove the medium and pad from the stabilized artificial skin, wash the wells with PBS (pH 7.4), add 12 ml of PBS, incubate in C0 2 incubator at 37 ° C for 1 hour, and then artificial skin. Each sample prepared as shown in Table 5 above was treated with 400 μl and repeated three times for each sample.

<표 5>TABLE 5

비교예Comparative example 대조군Control PBS (대조군)PBS (Control) 비교실시예 1Comparative Example 1 일반 제형General formulation 0.0918% (2.9mM) BH4 in PBS0.0918% (2.9mM) BH 4 in PBS 실시예 1Example 1 나노리포좀(129nm) Nanoliposomes (129 nm) 0.0918% (2.9mM) BH4 함유 나노리포좀, 고압호모게나이저 3회 통과0.0918% (2.9mM) BH 4 -containing nanoliposomes, high pressure homogenizer 3 passes 실시예 2Example 2 나노리포좀(116nm)Nanoliposomes (116 nm) 0.0918% (2.9mM) BH4 함유 나노리포좀, 고압호모게나이저 5회 통과Nanoliposomes containing 0.0918% (2.9mM) BH 4 , 5 times of high pressure homogenizer

<비교예>는 실제 피부 조직내의 BH4 함량을 평가하기 위한 것으로, PBS를 시료로 한 것이고, <비교실시예 1>은 BH4를 PBS에 용해시켜 100㎎/㎠처리한 것이며 <실시예 1>과 <실시예 2>는 나노리포좀 제조과정에 있어서, 고압 호모게나이저 통과 횟수를 달리한 것으로, BH4가 100㎎/㎠가 되도록 처리하였다.<Comparative Example> is to evaluate the BH 4 content in the actual skin tissue, PBS was used as a sample, <Comparative Example 1> was treated with 100 mg / ㎠ by dissolving BH 4 in PBS <Example 1 > And <Example 2> in the manufacturing process of the liposome, the number of passages of the high-pressure homogenizer was different, BH 4 was treated to 100 mg / ㎠.

상기와 같이 시료를 처리한 후, 1, 2, 4, 6, 8, 24시간별로 12㎖의 배지를 잘 섞어준 후에 1㎖씩 채취하여 냉장보관하였으며, 다시 1㎖을 첨가하여 총 12㎖의 부피를 맞춰주었다.After treating the sample as described above, 1ml 2, 4, 6, 8, 24 hours, 12ml of medium was mixed well, 1ml each sample was collected and refrigerated, and 1ml was added to a total of 12ml I adjusted the volume.

24시간째 시료 채취 후 채취한 시료 1㎖에 내부표준물질(internal standard)로서 Methyl-BH4을 100uM이 되도록 넣어준 후 0.2㎛ membrane으로 여과한 후, HPLC를 이용하여 BH4 함량을 측정하였다.After sampling for 24 hours, Methyl-BH 4 was added to 100 uM as an internal standard, and filtered through a 0.2 µm membrane, followed by BH 4 using HPLC. The content was measured.

<표 6> HPLC 분석조건TABLE 6 HPLC Analysis Conditions

ColumnColumn Agilent ZORBAX 300 SCX   Agilent ZORBAX 300 SCX Flow rateFlow rate 1ml/min  1ml / min wavelengthwavelength 254nm  254nm oven tempoven temp off  off mobile phasemobile phase 30mM NaH2PO4 (pH 4.3)  30 mM NaH2PO4 (pH 4.3) Injection volumnInjection volumn 10㎕  10 μl Run timeRun time 30min  30min

도 16은 시간에 따른 BH4 제형별 피부 투과량을 비교한 그래프로서, 일반 제형의 경우, 시료처리 후 1~4시간 동안 대부분의 BH4가 투과되었음을 알 수 있다. 한편, 나노리포좀 제형의 경우, 116nm와 129nm 크기의 나노리포좀은 서로 유사한 투과율을 나타내었으며, 전체적인 투과 패턴이 일반 제형과 많은 차이를 나타내었다. 즉, 일반 제형은 시료처리 후 1~4시간 동안 대부분의 BH4가 투과된 반면, 나노리포좀 제형의 BH4는 시간별 일정한 투과 속도를 나타내며 24시간까지 지속적으로 투과가 이루어짐을 알 수 있었다. Figure 16 is a graph comparing the skin permeation amount of each BH 4 formulation over time, in the case of the general formulation, it can be seen that most of the BH 4 permeated for 1 to 4 hours after the sample treatment. On the other hand, in the case of nanoliposomal formulations, nanoliposomes of 116 nm and 129 nm sizes showed similar transmittances, and the overall transmission pattern showed a great difference from the general formulation. That is, the general formulation was found to be continuous transmission occurs in portrait while the most BH 4 for 1 to 4 hours after sample treatment transmission, BH 4 of nanoliposome formulation represents a time constant transmission rate up to 24 hours.

피부에서의 약물 투과에 있어서, 친수성 물질과 친유성 물질은 투과 패턴이 다른데, 친수성 물질의 경우 각질층 내의 케라틴화된 단백질 때문에 극성을 띄게 되어 각질층 세포로 직접 통과하고, 친유성 물질의 경우 세포와 세포 사이를 통하여 투과가 이루어져 각질세포들 사이의 비극성 지방층을 통과하게 된다. 이런 소재의 특성상, 일반 제형과 리포좀 제형의 투과 패턴에 차이가 나타난 것으로 사료된다. In drug permeation in the skin, hydrophilic and lipophilic substances have different permeation patterns, which are polarized by keratinized proteins in the stratum corneum and pass directly to the stratum corneum cells, and in the case of lipophilic substances, cells and cells Permeation is made through the cell and passes through the nonpolar fat layer between keratinocytes. Due to the nature of these materials, it is thought that there was a difference in the transmission patterns of the general formulation and the liposome formulation.

<표 7> 시간에 따른 BH4 제형별 피부 투과속도TABLE 7 Skin Permeation Rate of BH 4 Formulations over Time

시간대별 투과속도 Flux (ug/cm2/h)Permeation flux Flux (ug / cm 2 / h) 비교실시예 1 (일반 제형)Comparative Example 1 (General Formulation) 실시예1 (129nm)Example 1 (129 nm) 실시예2 (116nm)Example 2 (116 nm) 1hr1hr 38.3 ± 4.8 38.3 ± 4.8 17.9 ± 5.717.9 ± 5.7 23.3 ± 9.523.3 ± 9.5 2hr2hr 39.1 ± 7.939.1 ± 7.9 13.9 ± 2.013.9 ± 2.0 12.3 ± 4.212.3 ± 4.2 4hr4hr 25.6 ± 0.925.6 ± 0.9 9.9 ± 0.99.9 ± 0.9 10.1 ± 2.610.1 ± 2.6 6hr6hr -0.6 ± 10.2-0.6 ± 10.2 7.2 ± 1.07.2 ± 1.0 7.0 ± 1.57.0 ± 1.5 8hr8hr -3.2 ± 4.9-3.2 ± 4.9 4.3 ± 0.44.3 ± 0.4 4.3 ± 1.54.3 ± 1.5 24hr24hr 0.1 ± 0.20.1 ± 0.2 1.6 ± 0.31.6 ± 0.3 1.3 ± 0.4 1.3 ± 0.4

<표 8> 24시간 동안의 BH4 제형별 평균 투과속도(24시간 동안의 전체 투과속도)TABLE 8 Average Permeation Rate of BH 4 Formulations over 24 Hours (Total Permeation Rate over 24 Hours)

총 투과속도 Flux (㎍/㎠/h)Total Penetration Rate Flux (㎍ / ㎠ / h) 일반 제형General formulation 129nm129 nm 116nm116 nm 24hr24hr 5.1 ± 0.15.1 ± 0.1 4.2 ± 0.14.2 ± 0.1 4.3 ± 0.24.3 ± 0.2

상기 <표 7>과 <표 8>에서 알 수 있듯, 일반 제형과 나노리포좀 모두 시료처리 후 1~2시간 사이에 가장 높은 투과 속도를 나타내었으며, 총 24시간 동안의 평균투과속도를 측정한 결과 4~5㎍/㎠/h인 것으로 나타났다.As can be seen in Tables 7 and 8, both the general formulation and the nanoliposomes showed the highest permeation rate between 1 and 2 hours after sample treatment, and the average permeation rate was measured for a total of 24 hours. It was found to be 4-5 μg / cm 2 / h.

일반 제형의 경우에서 보듯, 시료처리 후 4시간 이내에 BH4의 대부분이 투과될 경우 테리딘의 효과가 일시적으로 발휘될 수 있을 뿐, 지속적인 효과를 나타내기 어렵고, 일시적으로 과량이 피부투과될 경우 피부를 자극하는 역효과를 발생시킬 우려도 있다.As in the case of general formulations, if the majority of BH 4 is permeated within 4 hours after sample treatment, the effect of terridine can be exerted temporarily, and it is difficult to produce a lasting effect. There is also a fear that adverse effects may be generated.

그러나, 나노리포좀의 경우에서처럼 24시간 동안 꾸준히 투과될 경우 테리딘의 효능이 지속적으로 유지될 수 있고, 피부자극 가능성도 낮아질 수 있다는 장점이 있다.However, when continuously permeated for 24 hours, as in the case of nanoliposomes, there is an advantage that the efficacy of terridine can be continuously maintained and the possibility of skin irritation can be lowered.

실험예Experimental Example 5.  5. 나노리포좀Nanoliposomes 제형의 안정성 평가 Evaluation of the stability of the formulation

테리딘 함유 나노리포좀 제형의 분산 입자 크기별 온도와 경과 시간에 따른 안정성 평가를 수행하였다.Stability evaluation according to temperature and elapsed time of dispersed particle size of the terridine-containing nanoliposome formulation was performed.

즉, 나노리포좀을 각각 4℃와 실온에서 보관하며, 입도분석기(ELS-8000, OTUSKA, 일본)를 이용하여 경과시간에 따른 입도 크기와 다분산 지수를 분석하였다(표 9 참조).That is, the nanoliposomes were stored at 4 ° C. and room temperature, respectively, and the particle size and polydispersity index were analyzed using a particle size analyzer (ELS-8000, OTUSKA, Japan) over time (see Table 9).

<표 9> 4℃에서의 입도 분석 결과Table 9 Result of particle size analysis at 4 ° C

시료sample 경과시간Elapsed time 입도 크기Particle size 다분산지수Polydispersity index 고압 호모게나이저 3회 통과 리포좀  High-pressure homogenizer three passes liposome 제조직후Right after manufacturing 129129 1.417e-0011.417e-001 1일1 day 122122 2.111e-0092.111e-009 1주1 week 131131 1.710e-0021.710e-002 1개월1 month 128128 1.091e-0011.091e-001 2개월2 months 141141 1.491e-0011.491e-001 3개월3 months 133133 1.821e-0031.821e-003 고압 호모게나이저 5회 통과 리포좀  High-pressure homogenizer 5 passes liposome 제조직후Right after manufacturing 116116 1.071e-0011.071e-001 1일1 day 109109 1.160e-0021.160e-002 1주1 week 118118 2.010e-0042.010e-004 1개월1 month 110110 1.813e-0021.813e-002 2개월2 months 116116 1.711e-0011.711e-001 3개월3 months 121121 1.511e-0091.511e-009

<표 10> 25℃에서의 입도 분석 결과Table 10 Result of particle size analysis at 25 ° C

시료sample 경과시간Elapsed time 입도 크기Particle size 다분산지수Polydispersity index 고압 호모게나이저 3회 통과 리포좀   High-pressure homogenizer three passes liposome 제조직후Right after manufacturing 129129 1.417e-0011.417e-001 1일1 day 118118 2.171e-0012.171e-001 1주1 week 124124 1.911e-0021.911e-002 1개월1 month 121121 1.172e-0011.172e-001 2개월2 months 139139 1.501e-0021.501e-002 3개월3 months 121121 1.121e-0031.121e-003 고압 호모게나이저 5회 통과 리포좀  High-pressure homogenizer 5 passes liposome 제조직후Right after manufacturing 116116 1.071e-0011.071e-001 1일1 day 112112 1.261e-0011.261e-001 1주1 week 108108 1.812e-0021.812e-002 1개월1 month 116116 1.119e-0041.119e-004 2개월2 months 107107 1.011e-0011.011e-001 3개월3 months 120120 1.709e-0091.709e-009

(분석의뢰처 : 한국기초과학연구소 춘천 분소)(Request for Analysis: Chuncheon Branch, Korea Institute of Basic Science)

그 결과, 시간의 경과에 따른 나노 입자의 뭉침이나 응집 현상은 저장기간 동안에는 관찰되지 않았다. 또한 BH4 봉입이 나노 입도의 크기 변화에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.As a result, no aggregation or aggregation of nanoparticles over time was observed during the storage period. In addition, it was found that BH 4 inclusion did not affect the size change of nanoparticle size.

본 발명의 테리딘을 유효성분으로 포함하는 나노리포좀 함유 화장료 조성물은 피부미백 또는 자외선에 의한 피부 손상 방어 효과을 갖는 기초 화장료, 다시 말하면 유연화장수(스킨), 영양화장수(밀크로션), 영양크림, 마사지크림, 엣센스, 팩 등에 첨가되어 사용되어 질 수 있다.Nanoliposome-containing cosmetic composition comprising a terridine of the present invention as an active ingredient is a basic cosmetic having a skin whitening or skin damage protection effect by UV rays, that is, softening water (skin), nutrient cream (milk lotion), nourishing cream, massage It can be added to creams, essences and packs.

이하는 본 발명의 테리딘을 유효성분으로 포함하는 나노리포좀 함유 화장료 조성물의 구체적인 제형예를 나타낸 것으로, 본 발명의 화장료 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것이 아니다.The following shows an example of the specific formulation of the nanoliposome-containing cosmetic composition comprising the terridine of the present invention as an active ingredient, the formulation comprising the cosmetic composition of the present invention is not limited thereto.

<제형예1> 유연화장수(skin toner)<Formulation Example 1> Skin Toner

성분명Ingredient Name 함량(중량%)Content (% by weight) 나노리포좀 Nanoliposomes 1One 글리세린glycerin 5.05.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 3.03.0 에탄올ethanol 5.05.0 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르Polyoxyethylene nonylphenyl ether 0.50.5 향료Spices 0.20.2 방부제antiseptic 적당량A reasonable amount 정제수Purified water to 100to 100

<제형예2> 영양화장수(밀크로션)<Formulation Example 2> Nutritional Cosmetic Water (Milk Lotion)

성분명Ingredient Name 함량(중량%)Content (% by weight) 나노리포좀 Nanoliposomes 33 글리세린glycerin 5.05.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 8.08.0 스쿠알란Squalane 10.010.0 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄(6E.0)Monooleic acid polyoxyethylene sorbitan (6E.0) 2.02.0 트리에탄올아민Triethanolamine 1.51.5 글리세릴스테아레이트Glyceryl Stearate 0.50.5 스테아릴글리시레티네이트Stearyl glycyrrhetinate 0.20.2 카르복시비닐폴리머Carboxy Vinyl Polymer 0.10.1 아르기닌Arginine 0.10.1 향료Spices 0.20.2 방부제antiseptic 적당량A reasonable amount 정제수Purified water to 100to 100

<제형예3> 영양크림(cream)Formulation Example 3 Nutrition Cream

성분명Ingredient Name 함량(중량%)Content (% by weight) 나노리포좀 Nanoliposomes 55 글리세린glycerin 5.05.0 스테아린산Stearic acid 8.08.0 스쿠알란Squalane 5.05.0 자기유화형 모노스테아린산 글리세린Self-emulsifying glycerin monostearate 2.52.5 모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄Monostearic acid polyoxyethylene sorbitan 1.51.5 프로필렌글리콜Propylene glycol 4.04.0 스테아릴글리시레티네이트Stearyl glycyrrhetinate 0.20.2 바셀린vaseline 2.02.0 산화방지제Antioxidant 적당량A reasonable amount 향료Spices 0.20.2 방부제antiseptic 적당량A reasonable amount 정제수Purified water to 100to 100

<제형예4> 에센스<Example 4> Essence

성분명Ingredient Name 함량(중량%)Content (% by weight) 나노리포좀 Nanoliposomes 55 세토스테아릴알코올Cetostearyl alcohol 0.50.5 친유형모노스테아린산글리세린Lipophilic Monostearic Acid Glycerin 1.21.2 글리세릴스테아레이트/피이지-100스테아레이트Glyceryl Stearate / Pig-100stearate 0.70.7 모노스테아린산폴리옥시에칠렌소르비탄 (20 E.O.)Monostearic acid polyoxyethylene sorbitan (20 E.O.) 1.21.2 모노스테아린산소르비탄Sorbitan monosulfate 0.30.3 유동파라핀Liquid paraffin 5.05.0 스쿠알란Squalane 5.05.0 메도폼시드오일Meadowfoam Seed Oil 2.02.0 사이크로메치콘Pyromethicone 8.08.0 디메치콘Dimethicone 2.02.0 마그네슘알루미늄실리케이트Magnesium Aluminum Silicate 0.40.4 1,3-부틸렌글리콜 1,3-butylene glycol 2.02.0 글리세린 glycerin 5.05.0 말티톨액 Maltitol liquid 1.01.0 방부제, 색소, 향료 Preservative, coloring, flavoring 적량 Quantity 정제수 Purified water 잔량 Remaining amount

<제형예5> 마사지 크림 Formulation Example 5 Massage Cream

성분명Ingredient Name 함량(중량%)Content (% by weight) 나노리포좀 Nanoliposomes 55 프로필렌글리콜 Propylene glycol 6.06.0 글리세린glycerin 4.04.0 트리에탄올아민Triethanolamine 적량Quantity 밀납Beeswax 2.02.0 토코페릴아세테이트Tocopheryl Acetate 0.10.1 폴리솔베이트 60 Polysorbate 60 3.03.0 솔비탄세스퀴올레이트Sorbitan sesquioleate 2.52.5 세테아릴알코올Cetearyl Alcohol 2.02.0 유동파라핀Liquid paraffin 30.030.0 산탄검 Xanthan Gum 0.50.5 향,방부제Incense, preservative 미량a very small amount 정제수 Purified water to 100 to 100

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의하면 나노리포좀 기술에 의해 테리딘의 안정성을 도모하고, 피부 미백 효과 또는 자외선에 의한 피부 손상 방지 효과의 지속성을 유지하고, 테리딘의 피부투과성을 높이는 한편, 피부에의 자극을 줄이면서도, 우수한 미백 효과 또는 자외선에 의한 피부 손상 방지 효과를 얻을 수 있다.As described above, according to the present invention, the stability of the terridine is achieved by the nanoliposomal technique, the skin whitening effect or the persistence of the skin damage prevention effect by ultraviolet rays is maintained, and the skin permeability of the terridine is increased while the skin While reducing the irritation to the skin, it is possible to obtain an excellent whitening effect or to prevent skin damage by ultraviolet rays.

Claims (15)

나노리포좀이 포함된 화장료 조성물에 있어서,In the cosmetic composition containing a nano liposome, 상기 나노리포좀은 테리딘이 유효성분으로 포함된 것이고,The nanoliposome is one containing terridine as an active ingredient, 상기 테리딘은 (6R)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린((6R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin), 세피아프테린(sepiapterin) 및 (6R)-5-메틸-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린((6R)-5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The terridine is (6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin ((6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin), sepiaapterin and (6R) -5- Cosmetic composition containing nanoliposomes, characterized in that any one or more selected from methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin ((6R) -5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin) . 제 1 항에 있어서,The method of claim 1, 상기 나노리포좀은 화장료 조성물에 대하여 0.02~10중량%로 포함된 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The nano liposome is a cosmetic composition comprising a nano liposome, characterized in that contained in 0.02 ~ 10% by weight relative to the cosmetic composition. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,The method according to claim 1 or 2, 상기 테리딘은 상기 나노리포좀에 대하여 0.001~5중량%로 포함된 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The terridine is a cosmetic composition comprising a nano liposome, characterized in that contained in 0.001 ~ 5% by weight relative to the nanoliposomes. 삭제delete 제 3 항에 있어서,The method of claim 3, wherein 상기 나노리포좀은 물이 포함된 수상부와, 인지질 및 에몰리언트제가 포함된 유상부를 혼합하여 제조된 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The nanoliposome is a cosmetic composition comprising a nanoliposome, characterized in that the mixture is prepared by mixing the water phase containing water, the oil phase containing a phospholipid and emollient. 제 5 항에 있어서,The method of claim 5, wherein 상기 수상부는 부틸렌글리콜이 포함된 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The water phase is a cosmetic composition comprising a nano liposome, characterized in that butylene glycol is included. 제 5 항에 있어서,The method of claim 5, wherein 상기 유상부는 프로필렌 글리콜 또는 글리세린이 단독으로 또는 혼합되어 포함된 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The oil phase portion is a cosmetic composition comprising a nano liposome, characterized in that propylene glycol or glycerin is included alone or mixed. 제 5 항에 있어서,The method of claim 5, wherein 상기 인지질은 레시틴인 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The phospholipid is a cosmetic composition comprising a nano liposomes, characterized in that lecithin. 제 8 항에 있어서,The method of claim 8, 상기 레시틴은 불포화 레시틴인 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The lecithin is a cosmetic composition comprising a nano liposome, characterized in that the unsaturated lecithin. 제 9 항에 있어서,The method of claim 9, 상기 에몰리언트제는 실리콘 오일(silicon oil)인 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The emollient agent is a cosmetic composition comprising a nano liposome, characterized in that the silicone oil (silicon oil). 제 9 항에 있어서,The method of claim 9, 상기 유상부는 보조계면활성제가 포함된 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The oil phase is a cosmetic composition comprising a nano liposomes, characterized in that it comprises an auxiliary surfactant. 제 11 항에 있어서,The method of claim 11, 상기 보조계면활성제는 트리세테아레스-4-포스페이트(triceteareth-4-phosphate)와 포도씨유(VITIS VINIFERA)가 혼합된 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The co-surfactant is a cosmetic composition comprising a nano liposomes, characterized in that triceteares-4-phosphate (triceteareth-4-phosphate) and grape seed oil (VITIS VINIFERA) is mixed. 제 5 항에 있어서,The method of claim 5, wherein 상기 나노리포좀은 테리딘 0.001~5중량%, 부틸렌 글리콜 2~10중량%, 불포화 레시틴 1~20중량%, 실리콘 오일 2~20중량%, 글리세린 0.5~10중량%, 프로필렌 글리콜 5~20중량%, 포도씨유(VITIS VINIFERA) 0.1~5중량%, 트리세테아레스-4-포스페이트(Triceteareth-4-Phosphate) 0.1~5중량%, 방부제 0.3~0.5중량% 및 물 35~85중량%으로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.The nanoliposomes are 0.001-5% by weight of terridine, 2-10% by weight of butylene glycol, 1-20% by weight of unsaturated lecithin, 2-20% by weight of silicone oil, 0.5-10% by weight of glycerine, 5-20% by weight of propylene glycol %, 0.1 to 5% by weight of VITIS VINIFERA, 0.1 to 5% by weight of Triceteare-4-Phosphate, 0.3 to 0.5% by weight of preservative, and 35 to 85% by weight of water Cosmetic composition comprising a nano liposome characterized in that. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,The method according to claim 1 or 2, 상기 화장료 조성물의 제형은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양크림, 에센스, 마사지 크림 및 팩 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물.Formulation of the cosmetic composition is a cosmetic composition comprising a nano liposome, characterized in that any one selected from flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, essence, massage cream and pack. 나노리포좀 총 중량에 대하여, (6R)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린((6R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin), 세피아프테린(sepiapterin) 및 (6R)-5-메틸-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린((6R)-5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 테리딘 0.001~5중량%, 물 35~85중량%, 부틸렌 글리콜 2~10중량%, 방부제 0.3~0.5중량%가 포함된 수상부를 60~70℃로 가온하며 혼합하여 상기 수상부를 유화시키는 단계와;(6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin ((6R) -5,6,7,8-tetrahydrobiopterin), sepiapterin and (6R) relative to the total nanoliposome weight 0.001--5% by weight of terridine, any one or more selected from -5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin ((6R) -5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin), Emulsifying the water phase part by heating and mixing the water phase part containing 35-85% by weight of water, 2-10% by weight of butylene glycol, and 0.3-0.5% by weight of preservative to 60-70 ° C; 나노리포좀 총 중량에 대하여, 인지질 1~20중량%, 에몰리언트제 2~20중량%, 글리세린 0.5~10중량%, 프로필렌 글리콜 5~20중량%, 포도씨유(VITIS VINIFERA) 0.1~5중량%, 트리세테아레스-4-포스페이트(Triceteareth-4-Phosphate) 0.1~5중량%가 포함된 유상부를 60~70℃로 가온하며 혼합하여 상기 유상부를 유화시키는 단계와;1-20% by weight of phospholipid, 2-20% by weight of emulsifier, 0.5-10% by weight of glycerin, 5-20% by weight of propylene glycol, 0.1-5% by weight of VITIS VINIFERA, tree Emulsifying the oil phase by heating and mixing the oil phase containing 0.1-5% by weight of Ceteareth-4-Phosphate to 60-70 ° C .; 상기 유화된 수상부에 상기 유화된 유상부를 서서히 투입하며 60~70℃로 가온하며 교반하여 리포좀을 제조하는 단계와;Preparing a liposome by gradually adding the emulsified oil phase to the emulsified water phase and warming and stirring at 60 to 70 ° C .; 상기 제조된 리포좀을 45~55℃, 600~1,200bar의 고압 호모게나이저를 통과시켜 나노리포좀을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노리포좀이 포함된 화장료 조성물의 제조방법.Method of producing a cosmetic composition comprising a nano-liposomes, characterized in that it comprises the step of passing the prepared liposomes 45 ~ 55 ℃, 600 ~ 1,200bar high pressure homogenizer to produce a nano liposomes.
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